【発明の詳細な説明】
ベーキングにおける分枝酵素の使用
発明の分野
本発明は、分枝酵素を含むパン改質又はドー改質組成物、並びに該組成物及び
／又は前記酵素の使用により生産されるドー及び／又はベーキングした製品を調
製する方法に関する。
発明の背景
パン製造工程においては、パンのドーにパン改質及び／又はドー改質添加物を
加えることが知られている。その添加物の作用は、とりわけ、パンの生地、容量
、芳香及び新鮮さの改善並びにドーの機械加工処理性の改善である。
近年、ドー及び／又はパン改質剤としていくつかの酵素、特にドー内に大量に
存在する構成物に作用する酵素が用いられている。これらの酵素の例は、アミラ
ーゼ、プロテアーゼ及びセルラーゼの群内に見い出される。
キシラナーゼのようなペントサナーゼは、パン及びベーキングした製品の調製
において、特にパン及び他のベーキング製品の体積を増加させ、抗非新鮮（抗ス
テーリング）能（anti-staling potential）を改良するための使用のためにかな
りの重要性を占めている。
例えば、EP 396 162，EP 493 850及びEP 487 122は、各々、任意に他の酵素と
組み合わせてキシラナーゼを含むパン改質物、ディープフローズンドー及び脂肪
無含有ペースト状混合物に関する。WO91／18977は、ベーキング活性の増加した
ペントサナーゼ含有調製物を調製する方法を開示する。
EP 687 414は、ローフ（loaf）体積を増加させ、芳香を改良するためのシクロ
デキストリングルカノトランスフェラーゼの使用を開示する。
より長期間、新鮮さを保持することができ、これにより非新鮮化（ステーリン
グ）に対する耐性を増加させることができるパンの調製のための方法を開発する
ことにかなりの注目が集まっている。抗ステーリング剤として用いるための種々
のデンプン改質酵素が示唆されている。JP62−79745及びJP62−79746においては
、熱安定性β−アミラーゼが、ベーキング製品に抗ステーリング効果を与えるの
に役立つものとして記載されており、EP 412 607は抗ステーリング剤としての熱
安定性α−１，４−エキソグルカナーゼ又はα−１，６−エンドグルカナーゼ（
例えばプルラナーゼ、アミログルコシダーゼ又はβ−アミラーゼ）の使用を記載
し、そしてEP 494 233は、抗ステーリング剤としての熱安定性マルトジェニック
α−アミラーゼの使用を記載する。
分枝酵素（又は１，４−α−グルカン分枝酵素、EC.2.4.1.18)は、デンプン及
び同様のグルカンのα−１，６−枝の形成に関連するトランスフェラーゼである
。その酵素はいくつかの植物及び微生物源から単離されており、いくつかのクロ
ーン化された分枝酵素が開示されている。より詳しくは、Zevenhuizen(1964，Bi
ochem．Biophys．Acta 81，608-611)は、アルテロバクタ・グロビホルミス（Art hrobacter globiformis
）から単離された分枝酵素を；US 4,454,161はバチルス
・メガテリウム（Bacillus megaterium）からの分枝酵素を；Walker及びBuilder
(1977，Eur．J．Biochem．20，246-253)はストレプトコッカス・ミチス（Strept ococcus mitis
）からの分枝酵素を；Steiner及びPreiss（1977，J．Bacteriol．
129，246-253）はサルモネラ・タイフィムリウム（Salmonella typhimuri um
）からの分枝酵素を；Fredrick，J．（1978，Thermal Biol．3，1-4）は藻類
シアニジウム・カルダリウム（Cyanidium caldarium）からの分枝酵素を；Boyer
及びPreiss(1977，Biochemistry，16，3693-3699)は大腸菌からの分枝酵素を；B
aeckerら(1986，J．Biol．Chem．261，8738-8743)は大腸菌分枝酵素をコードす
る遺伝子を;Kiel，J．A．K．Wら(1992，J．DNA Sequencing and mapping，3，22
1-232)はバチルス・カルドリチクス（Bacillus caldolyticus）分枝酵素をコー
ドする遺伝子を；Takata，H.ら（1994，Appl．Environm．Microbiol．60，3096-
3104）はバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
分枝酵素をコードする遺伝子を；そしてKielら(1989，Gene 78，9-17)はシネコ
コッカス（Synechococcus）種からの分枝酵素をコードする遺伝子を開示する。
GB 2095681は、バチルスからの分枝酵素を生産するための方法及びその酵素の
使用により改質された食物製品を調製する方法を開示する。それには、その酵素
が特定の食物製品、例えばパンの貯蔵寿命を改善するのに役立ち得ることが言及
される。
EP 418 945は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermop hilus
）から単離され、クローン化された熱安定性分枝酵素を開示する。その酵
素はデンプン様材料、例えばデンプン、アミロース、アミロペクチン、デキスト
リン、及び他のポリグルコース材料の改質に、前記材料に更なる枝分れを導入す
ることにより役立つと言及される。その酵素は、改質されたデンプン様材料を含
む食物又は飼料製品の生産のために役立ち得ると言及されているが、このような
使用の利点は記載され又は指摘されていない。
本発明の目的は、ドーの質の酵素的改質を達成するための新規アプローチ及び
／又はそれから調製されたベーキング製品を提供する
ことである。
発明の簡単な記載
従って、第１の態様において、本発明は、有効量の分枝酵素を含むパン改質及
び／又はドー改質組成物に関する。
本文脈において、用語“パン改質組成物”及び“ドー改質組成物”は、酵素構
成物に加えて、ドー及び／又はベーキング製品の特性を改善するためにベーキン
グに慣用的に用いられる他の物質を含み得る独立した組成物であることを意図す
る。これらの構成物の例は後で示す。
用語“有効量”は、関心のパラメータに測定可能な効果を与えるのに十分であ
る酵素の量を示すことを意図する。例えばそれは、本発明により改良された特性
の少くとも１つ、特にステーリングに寄与すると信じられる特性の少くとも１つ
の検出可能な変化を生ずる量である（以下の発明の詳細な記載の第１段落を参照
のこと）。
第２の態様において、本発明は、ベーキング製品のステーリングを防止又は削
減する方法であって、ドー作製過程において、有効量の分枝酵素をドー又はドー
成分に加え、そして生じたドーを適切な条件下でベーキングにかけることを含む
方法に関する。
本明細書に用いる場合、本発明の方法により改質されるべきドー及び／又はド
ーから調製されたベーキング製品の特性は、分枝酵素の作用により改質され得る
いずれかの特性を含む。重要な例は、ベーキング製品の、体積の増加、（抗ステ
ーリングに関する）新鮮さの改善並びに構造及び柔らかさの改善；並びに感覚刺
激の質の改善である。また、重要なのはドー安定性の増加（即ち、より粘着性の
あるドー）であり、それによりドーの機械加工処理性を改善する。機械加工処理
性の改善は工業的に処理されるべきドーに関して特に
重要である。もちろん、改善された特性は、本発明によるDGTaseの添加なしに調
製されたドー及び／又はベーキング製品との比較により評価することができる。
なお更なる態様において、本発明は、各々本発明により生産されたドー及びベ
ーキング製品に、並びに有効量の本明細書に定義される分枝酵素又は本発明のパ
ン改質又はドー改質組成物を含むプレミックスに関する。
本文脈において、用語“プレミックス”とは、その慣用的な意味において、即
ち工業的なパンベーキングプラント／施設ばかりでなく小売のパン屋においても
用いられ得る、通常フラワーを含むベーキング剤の混合物として理解されること
を意図する。
最後の態様において、本発明は、ドー及び／又はドーから調製されたベーキン
グ製品の１又は複数の特性を改善するため、例えば（１）ベーキング製品、特に
パンのステーリングを防止又は削減するため；（２）ベーキング製品のローフ（
loaf）体積を増加させるため；及び（３）ベーキング製品の感覚刺激の質を改善
するための、本明細書に定義される分枝酵素の使用に関する。
発明の詳細な記載
文献によれば、保存の間のパンのステーリングは、パン粉の硬化、パン粉の弾
力性の喪失、スライス能力の減少、嗜好性の減少及び芳香性の減少に関すると記
載されている。これらの変化は全てパン内に存在するデンプン画分の特性により
引きおこされると信じられる。本発明により達成されるデンプン画分の改質によ
り、ベーキング製品のステーリングを実質的に減少させることができるであろう
と予想される。
本発明の使用によるデンプン画分の改質は、ベーキング製品の体
積を増加させ、感覚刺激の質、例えば芳香、口当たり、嗜好性、味及びパンの皮
の色を改善する。
好ましくは、本発明に用いるべき分枝酵素は３〜７の範囲のpHで活性であり、
好ましくは５〜７の範囲の至適pHである。その酵素は、ドー調製及び／又はベー
キング過程の間、活性であり得、酵素は両方の過程のステップの間じゅう活性で
あることが好ましい。好ましくは、酵素は45℃超、より好ましくは55℃超、例え
ば45〜90℃、より好ましくは55〜90℃の範囲で最適な活性を有する。その酵素は
ベーキング過程の間不活性化されることが好ましい。
上述の特性に加えて、いくつかの酸化剤がドー内に存在するので、分枝酵素は
実質的に酸化安定性を有することが要求され得る。
本発明に用いられるべき分枝酵素の源は、問題の酵素が上述の特性を有する限
り重大ではない。これにより、分枝酵素は、いずれかの源、例えば哺乳動物、植
物及び微生物（例えば細菌又は真菌）源のものであり得る。本発明の使用に考慮
される分枝酵素の特定の例は、“発明の背景”セクションに記載される分枝酵素
、特にEP 418945に記載される酵素である。
分枝酵素は、いずれかの適切な技術を用いることにより、特に当該技術で周知
の組換えDNA技術を用いることにより、問題の生物から得ることができる。組換
えDNA技術の使用は、通常、酵素の発現を許容する条件下で、培養培地中で、問
題の酵素をコードするDNA配列を発現し、それを運ぶことができる組換えDNAベク
ターで形質転換された宿主細胞を培養し、そしてその培養物から酵素を回収する
ことを含む。DNA配列は、ゲノム、cDNA又は合成源のもの、又はこれらのいずれ
かの混合物であり得、そして当該技術で周知の方法に従って単離し、又は合成す
ることができる。酵素は、それを自然に生産する生物又はその関連部分から抽出
することもできる。
分枝酵素は他の酵素と一緒に用いた時に好ましい結果を得ることができること
が考えられる。これにより、本発明のパン−及び／又はドー−改質組成物は、１
又は複数の更なる酵素を含み得る。同様に、これらの更なる酵素は、本発明の方
法において分枝酵素と一緒に加えることができる。このような更なる酵素の例は
、セルラーゼ；グリコシルトランスフェラーゼ、特に４−α−グルカノトランス
フェラーゼ（DGTaseとしても知られる）；ヘミセルラーゼ、例えばペントサナー
ゼ、例えばキシラナーゼ（ドーの伸張性を増加させるペントサンの部分的加水分
解に役立つ）；リパーゼ（ドー又はドー構成物中に存在する脂質を改質してドー
を軟化するのに役立つ）；オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ；ペル
オキシダーゼ（ドーのコンシステンシーを改質するのに役立つ）；プロテアーゼ
（特に強力コムギ粉を用いる場合、グルテンの軟弱化に役立つ）；ペプチダーゼ
；トランスグルタミナーゼ及び／又はデンプン分解酵素、特に、いずれのα−１
，４−エンド活性もないデンプン分解酵素、例えばα−１，４−エンドグルカナ
ーゼ及び／又はα−１，６−エンドグルカナーゼ、例えばβ−アミラーゼ、アミ
ログルコシダーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、シクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼ（CGTase）等である。
他の酵素構成物は、いずれかの源、例えば哺乳動物及び植物、並びに好ましく
は微生物（例えば細菌又は真菌）源のものであり得る。酵素は、上述のように、
当該技術で用いられる慣用的な技術により得ることができる。
本発明に用いるために考えられるDGTaseの特定の例は、Takahaら（J．Biol．C
hem．vol.268，1391-1396，1993）により記載されるジャガイモDGTaseである。
該引用文献は、大腸菌及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）宿主に
おける酵素の組換え生産も開
示する。
ックアミラーゼ、Gist-brocades N．V.から市販される抗ステーリング剤Staling
ase(TM)、Grindsted Productsから市販されるGrin
Novo Nordisk A/Sから市販されるグルコースオキシダーゼ、並びに
も特に関心がある。
トランスグルタミナーゼは、EP 492 406に記載されるように用いることができ
る。
本発明に用いる酵素は、問題の使用に適したいずれかの形態、例えば乾燥粉末
又は粒子、特に非ダスト粒子、液体、特に安定化液、又は保護された酵素の形態
であり得る。粒子は、例えば、US 4,106,991及びUS 4,661,452（両方Novo Indus
tri A/S）に開示されるように生産することができ、任意に、当該技術で周知の
方法によりコートすることができる。液体酵素調製物は、例えば、栄養物摂取的
に許容される安定剤、例えば糖、糖アルコール又は他のポリオール、乳酸又は他
の有機酸を、確立された方法に従って加えることにより安定化することができる
。保護された酵素は、EP 238 216に開示される方法に従って調製することができ
る。
通常、プレミックス又はフラワーに含有させるために、酵素は乾燥産物、例え
ば非ダスト化粒子の形態であることが有利であり、液体と共に含まれるためには
、液体形態が有利である。
他の酵素構成物に加えて、又はそれらに加えて、ドー改質及び／又はパン改質
組成物は、慣用的に用いられるベーキング剤、例えば１又は複数の次の構成物：
ミルク粉末（パン皮色を与える）、グル
テン（薄力小麦粉の気体保持力を改善する）、乳化剤（ドーの伸張性及びある程
度、生じたパンのコンシステンシーを改善する）、粒状脂肪（ドーの軟化及びパ
ンのコンシステンシーのため）、オキシダント（例えばアスコルビン酸、臭素酸
カリウム、ヨウ素酸カリウム又は過硫酸アンモニウム；グルテン構造を強化する
ため）、アミノ酸（例えばシステイン）、糖、及び塩（例えば塩化ナトリウム、
酢酸カルシウム、硫酸ナトリウム又は硫酸カルシウム；ドーを堅く引きしめる）
、フラワー又はデンプンを含み得る。これらの構成物は、本発明の方法に従って
ドーに直接加えることもできる。
適切な乳化剤の例は、モノ−又はジ−グリセリド、モノ−又はジ−グリセリド
のジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロール
エステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ポ
リオキシエチレンステアレート、リン脂質及びレシチンである。
本発明のパン改質及び／又はドー改質組成物は、典型的には、0.01〜５％、特
に0.1〜３％に相当する量でドー内に含まれる。
任意に上述の他の酵素と組み合わせた分枝酵素が、ドー及び／又はベーキング
製品の調製のために用いられる本発明の方法によれば、酵素は、ドーを作る混合
物に、又はドーを作るいずれかの成分、例えばフラワーに添加することができる
。あるいは、酵素は、上述のドー改質及び／又はパン改質組成物の構成物として
、フラワーもしくは他のドー成分に、又はドーを作る混合物に直接加えることが
できる。
本発明の方法に用いる酵素の投与量は、問題のドーの性質及び組成に、並びに
用いる酵素の性質に適合されるべきである。通常、酵素調製物は、フラワー１kg
当り0.01〜1000mgの酵素タンパク質、好ましくはフラワー１kg当り0.1〜100mgの
酵素タンパク質、より好
ましくはフラワー１kg当り0.1〜10mgの酵素タンパク質に相当する量で加えられ
る。
酵素活性に関して、ベーキング製品の要求されるフラワー又はクラスト色の改
質を発揮するための、任意に他の酵素と組み合わせた所定の分枝酵素の適切な投
与量は問題の酵素及び酵素基質によるであろう。当業者は、当該技術で周知の方
法に基づいて適切な酵素単位投与量を決定することができる。
１又は複数の更なる酵素活性が本発明の方法に従って加えられる場合、これら
の活性は別個に、又は分枝酵素と一緒に、任意に本発明のパン改質及び／又はド
ー改質組成物の構成物として添加することができる。他の酵素活性は上述の酵素
のいずれかであり得、確立されたベーキングの実施に従って投与することができ
る。
上述のように、上述の他の酵素と任意に組み合わせた分枝酵素は、ドー成分の
いずれかの混合物に、ドーに、又はドー内に含まれる成分のいずれかに添加され
る。換言すれば、酵素はドー調製のいずれかのステップにおいて加えることがで
き、そして適切なら、１，２又はそれ超のステップで加えることができる。
ドー及び／又はベーキングの取扱いは、問題のドー及び／又はベーキング製品
のためにいずれかの適切な様式で、典型的には、ドーを練る、ドーを１又は複数
のプルーフ処理にかける、及び適切な条件、即ち、適切な温度で十分な時間、産
物をベーキングするステップにおいて行われる。例えば、ドーは、通常のストレ
ートのドープロセス、ソー（sour）のドープロセス、オーバーナイトドー方法、
低温長時間発酵法、凍結ドー法、Chorleywood Breadプロセス、又はSponge及びD
oughプロセスを用いることにより調製することができる。
本発明の方法により調製したドー及び／又はベーキング製品は、
通常、任意に他の型のミール又はフラワー、例えばコーンフラワー、ライムギミ
ール、ライムギフラワー、オートフラワーもしくはミール、大豆フラワー、モロ
コシ属ミールもしくはフラワー、又はジャガイモミールもしくはフラワーと組み
合わせた、コムギミール又はフラワーに基づく。
本文脈において、用語“ベーキング製品”は、ソフトな又はクリスプな特徴の
ドーから調製されたいずれかの製品を含むことを意図する。本発明により有利に
生産され得るホワイト、ライト又はダークタイプのいずれかのベーキング製品の
例は、パン（特に精白粉で作った、全粒小麦粉の又はライ麦のパン）、典型的に
はローフ（loaves）又はロールパン、フランスパン（French baguette-type bre
ad）、ピータパン、タコス、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クリスプブレッ
ド等である。
本発明のドーは、上述の型のいずれかであり得、新鮮な、凍結した又は予めベ
ーキングしたものであり得る。凍結されたドーの調製は、K．Kulp及びK．Lorenz
(“Frozen and Refrigerated Doughs and Batters”）により記載される。
先の開示から、本発明のドーは、通常、ふくらまされたドー又はふくらませら
れるべきドーてある。ドーは、種々の方法により、例えば重炭酸ナトリウム等を
加えることにより、又は（ドーを発酵させる）パン種を加えることによりふくら
ませられ得るが、適切な酵母培養物、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ(S accharomyces cerevisiae
)(ベーカーのイースト)の培養物を加えることによりド
ーをふくらませるのが好ましい。市販のＳ．セレビシアエ株のいずれかを用いる
ことができる。
上述のように、本発明は、更に、ドー及び／又はドーから作られたベーキング
製品のための、例えばフラワー組成物の形態における
、プレミックスであって、分枝酵素及び任意に先に記載される他の酵素を含むプ
レミックスに関する。プレミックスは、関連酵素又はその酵素を含む本発明のパ
ン改質及び／又はドー改質組成物を含む酵素調製物を、適切な担体、例えばフラ
ワー、デンプン、糖又は塩と混合することにより調製することができる。プレミ
ックスは、他のドー改質及び／又はパン改質添加物、例えばいずれかの添加物、
例えば上述の酵素を含み得る。
本発明の使用により達成される改質を決定するのに用いることができる技術を
以下に記載する。上述の感覚刺激の質は、ベーキング工業において十分に確立さ
れた手順を用いて評価することができ、それは、例えばトレインドテースト−テ
スターズのパネルの使用であり得る。
材料及び方法
分枝酵素活性の測定
分枝酵素活性は、EP 418 945に記載されるように測定することができる。
パンの調製
本発明によれば、DGTaseを加える効果は、以下のようにドー及びパンにおいて
テストすることができる。
ホワイトブレットは以下の基本的レシピから調製することができる。
基本レシピ
コムギ粉 100％
塩 1.5％
酵母（新鮮） 5.0％
糖 1.5％
水 58％パンの調製
手順：
１．ドーの混合（スパイラルミキサー）
625RPMで３分
1250RPMで3.5分
混合時間は、用いるテスト条件下で最適なドーコンシステンシーを得るように
、当業者のパン業者により決定され、調節される。
２．第１のプルーフ：室温（約22℃）で15分、クロスでおおう。
３．スケーリング及び成形；
４．最後のプルーフ：32℃−82％RH、55分；
５．ベーキング235℃、ロールについて22分、ローフについて35分。
ドー及びベーキング製品の評価
ドー及びベーキング製品を以下の通り評価することができる。
ローフの特定体積：４つのローフの体積の平均値は伝統的なナタネ法（rape s
eed method）を用いて測定する。その特定体積は、パン１ｇ当りの体積mlとして
計算する。（酵素を含まない）対照の特定体積を100として定義する。相対特定
体積指数を次のように計算する。
ドーの粘着性及びクラム（Crumb）構造は、以下のスケールに従って目で見て
評価することができる。
ドーの粘着性： ほぼ液体 １
かなり粘着性 ２
粘着性 ３
正常 ４
乾燥 ５
クラム構造： 極めて乏しい １
乏しい ２
不均一 ３
均一／良好 ４
極めて良好 ５
ベーキング製品のステーリング特性は、例えばベーキング後１，３，７及び９
日目に、パンで決定する。ステールネス及び生地の評価は、AACC法74−09に従っ
て行うことができる。
パンクラムの柔らかさ及び弾力性の決定のための原理は以下の通りである。
１．パンのスライスを、生地分析機で一定の速度で圧縮し、ｇで圧縮のための
力を測定する。
２．クラムの柔らかさを、25％圧縮の力として測定する。
３．40％圧縮の力（Ｐ２）、及び30秒、40％圧縮で一定に維持した後の力を測
定し、その比（Ｐ３／Ｐ２）をクラムの弾力性とする。
【手続補正書】
【提出日】平成１０年１１月１０日（１９９８．１１．１０）
【補正内容】
明細書を以下の通り補正する。
明細書第５頁第１行目の「DGTase」を『分枝酵素』に補正する。
明細書第12頁第18行目の「DGTase」を『分枝酵素』に補正する。
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ
，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，
ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ
Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ
，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，
ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ
Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ
，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，
ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ