JP5890665B2 - ポリペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、ポリペプチド(詳細にはアミラーゼポリペプチド)およびこれらをコードする核酸、ならびに食品を製造する際の非マルトース生成エキソアミラーゼとしてのそれらの使用に関する。本発明のアミラーゼは、より有益な品質を有するように操作されている。具体的には、本発明のアミラーゼは、変化したエキソ特異性および/または変化した熱安定性を示す。特に、本ポリペプチドは、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性(特にグルカン1,4−α−マルトテトラヒドロラーゼ(EC3.2.1.60)活性)を有するポリペプチドに由来する。
改善されたアミラーゼは、ベーキング(baking)などの所定のプロセスに固有の問題を改善できる。アミロペクチンの結晶化は、ベーキングから数日後にデンプン顆粒中で発生するが、これはパンの堅さ増加をもたらし、パンの硬化(staling)を引き起こす。パンが硬化すると、パンはクラム(crumb)の柔らかさやクラムの水分を失う。結果として、クラムの弾性が低下し、パンは革のようなクラスト(crust)になる。
本発明者らは、本発明によって、特許請求の範囲に記載したPS4改変体ポリペプチドを提供する。本発明者らは、特許請求の範囲に記載した食品添加物、食品、ベーカリー製品、改善剤組成物、動物用飼料を含む飼料製品としてのPS4改変体ポリペプチドの使用、およびそれらに含まれるPS4改変体ポリペプチドの使用をさらに提供する。本発明者らは、特許請求の範囲に記載したPS4改変体ポリペプチドをコードする核酸、およびそれらに関連する核酸を提供する。当該のPS4改変体ポリペプチドを生成する方法ならびに本発明の他の態様もまた特許請求の範囲に記載されている。
配列番号1は、Pseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列に由来するPS4参照配列を示している。配列番号2は、PSac−D34配列;11の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号3は、PSac−D20配列;13の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号4は、PSac−D14配列;14の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号5は、Pseudomonas saccharophilia由来グルカン1,4−α−マルトテトラヒドロラーゼ前駆物質(EC3.2.1.60)(G4−アミラーゼ)(マルトテトラオース生成アミラーゼ)(エキソ−マルトテトラヒドロラーゼ)(マルトテトラオース生成エキソアミラーゼ)を示している。SWISS−PROTアクセッション番号P22963。配列番号6は、マルトテトラヒドロラーゼ(EC番号=3.2.1.60)をコードするP.saccharophilia mta遺伝子を示している。GenBankアクセッション番号X16732。配列番号7は、Pseudomonas stuzeriマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列に由来するPS4参照配列を示している。配列番号8は、PStu−D34配列;9つの置換を伴うPseudomonas stuzeriマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号9は、PStu−D20配列;11の置換を伴うPseudomonas stuzeri由来マルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号10は、PStu−D14配列;12の置換を伴うPseudomonas stuzeri由来マルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号11は、Pseudomonas stuzeri(Pseudomonas perfectomarina)グルカン1,4−α−マルトテトラヒドロラーゼ前駆物質(EC3.2.1.60)(G4−アミラーゼ)(マルトテトラオース生成アミラーゼ)(エキソ−マルトテトラヒドロラーゼ)(マルトテトラオース生成エキソアミラーゼ)を示している。SWISS−PROTアクセッション番号P13507。配列番号12は、P.stuzeriマルトテトラオース生成アミラーゼ(amyP)遺伝子、完全コドンを示している。GenBankアクセッション番号M24516。配列番号13は、pMD55配列;11の置換(G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179TおよびG121F)を伴うPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号13は、pMD55配列;11の置換(G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179TおよびG121F)およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号13は、pMD55配列;11の置換(G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179TおよびG121F)を伴うPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号13は、pMD55配列;11の置換(G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179TおよびG121F)およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号14は、PMD96配列;N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、H307LおよびS334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号15は、SSM381配列;33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号16は、SSM279B1配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157M、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号17は、SSM237P2配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号18は、33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号19は、SSM325F3配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号20は、pMD129配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、229P、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号21は、SSM341A9配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号22は、SSM341G11配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303D、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号23は、SSM350B11配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号24は、SSM350C12配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306G、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号25は、SSM332Q4配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号26は、SSM365B4配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316S、および334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号27は、SSM365F4配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316Pおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号28は、SSM360C7配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334Pおよび353Tでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能であるPS4改変体ポリペプチドであって、配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して121、161、223、146、157、158、198、229、303、306、309、316、353、26、70、145、188、272、339からなる群から選択される1つ以上の位置でのアミノ酸突然変異を含む、PS4改変体ポリペプチド。
(項目2)
前記PS4改変体ポリペプチドが、121F、121Y、121W、161A、223E、223K、146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T、26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択されるアミノ酸突然変異を含む、項目1に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目3)
前記PS4改変体ポリペプチドが、33位、34位、121位、134位、141位、157位、161位、178位、179位、223位、307位および334位からなる群から選択される1つ以上の突然変異であって、好ましくは33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pからなる群から選択される突然変異をさらに含む、項目1または項目2に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目4)
前記PS4改変体ポリペプチドが、以下の突然変異:
(a)33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;
(b)33Y、34N、121F、134R、141P、157M、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;
(c)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;
(d)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、307Lおよび334P;
(e)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334P;
(f)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、229P、307Lおよび334P;
(g)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334P;
(h)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303D、307Lおよび334P;
(i)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334P;
(j)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306G、307Lおよび334P;
(k)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334P;
(l)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316S、および334P;
(m)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316Pおよび334P;
(n)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334Pおよび353T
(の各々を含む、項目1、項目2または項目3のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目5)
前記PS4改変体ポリペプチドが、以下の突然変異:
(a)N26E、N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P;
(b)N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P;
(c)N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P;
(d)N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188H、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339E;
(e)N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188S、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339E;
(f)N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339A;
(g)N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339E
の各々を含む、項目1〜項目4のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目6)
前記PS4改変体ポリペプチドが、87位における突然変異であって、好ましくは87Sであり、より好ましくはG87Sである突然変異をさらに含む、項目1〜項目5のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目7)
前記親ポリペプチドが、非マルトース生成エキソアミラーゼ、好ましくはグルカン1,4−α−マルトテトラヒドロラーゼ(EC3.2.1.60)を含む、項目1〜項目6のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目8)
前記親ポリペプチドが、シュードモナス種、好ましくはPseudomonas saccharophiliaもしくはPseudomonas stuzeriであるか、またはシュードモナス種から、好ましくはPseudomonas saccharophiliaもしくはPseudomonas stuzeriから誘導可能である、項目1〜項目7のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目9)
前記親ポリペプチドが、配列番号1もしくは配列番号5に示した配列を有するPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ由来の非マルトース生成エキソアミラーゼである、項目1〜項目8のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目10)
配列番号1または配列番号5と少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を有する、項目1〜項目9のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目11)
前記親ポリペプチドが、配列番号7もしくは配列番号11に示した配列を有するPseudomonas stuzeri由来の非マルトース生成エキソアミラーゼである、項目1〜項目8のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目12)
配列番号7または配列番号11と少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を有する、項目1〜項目8または項目11のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目13)
本明細書、項目または図面に記載の配列を含む、項目1〜項目12のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目14)
PSac−D34(配列番号2)、PSac−D20(配列番号3)、PSac−D14(配列番号4)、PStu−D34(配列番号8)、PStu−D20(配列番号9)、PStu−D14(配列番号10)、pMD55(配列番号13)、pMD96(配列番号14)、SSM381(配列番号15)、SSM279 B1(配列番号16)、SSM237P2(配列番号17)、配列番号18、SSM325F3(配列番号19)、pMD129(配列番号20)、SSM341A9(配列番号21)、SSM341G11(配列番号22)、SSM350B11(配列番号23)、SSM350C12(配列番号24)、SSM332Q4(配列番号25)、SSM365B4(配列番号26)、SSM365F4(配列番号27)およびSSM360C7(配列番号28)、SSM219B3、SAS1401L10、SAS1387D16bf、pMD236、pMD237bf、SAS1379O13およびSAS1379O9からなる群から選択される配列を含む、項目1〜項目13のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目15)
前記PS4改変体ポリペプチドが、同一条件下で試験した場合に前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して高い熱安定性を有する、項目1〜項目14のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目16)
半減期(t1/2)であって、好ましくは60℃における半減期が、前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して、15%以上、好ましくは50%以上、最も好ましくは100%以上増加している、項目1〜項目15のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目17)
同一条件下で試験した場合に前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して高いエキソ特異性を有する、項目1〜項目16のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目18)
前記PS4改変体ポリペプチドが、前記親ポリペプチドもしくは前記野生型ポリペプチドと比較して、10%以上、好ましくは20%以上、好ましくは50%以上のエキソ特異性を有する、項目1〜項目17のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
(項目19)
項目1〜項目18のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドの少なくとも20個の残基のフラグメントを含むポリペプチドであって、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチド。
(項目20)
項目1〜項目19のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド配列の1つ以上の残基での突然変異によって該PS4改変体ポリペプチドから誘導可能であるポリペプチドであって、該PS4改変体ポリペプチドの前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較してより高い熱安定性もしくはより高いエキソ特異性またはその両方を有するポリペプチド。
(項目21)
項目1〜項目20のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドの、食品または飼料添加物としての使用。
(項目22)
デンプンを処理するためのプロセスであって、該デンプンを項目1〜項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドと接触させる工程と、該ポリペプチドに該デンプンから1種以上の直鎖状生成物を生成させる工程とを包含するプロセス。
(項目23)
食品または飼料製品を調製する際の項目1〜項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
(項目24)
食品または飼料製品を調製するプロセスであって、項目1〜項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドを食品の成分または飼料の成分と混合する工程を包含するプロセス。
(項目25)
該食品が生地もしくは生地製品、好ましくは加工された生地製品を含む、項目23に記載の使用、または項目24に記載のプロセス。
(項目26)
該食品がベーカリー製品である、項目21〜項目25のいずれか1項に記載の使用またはプロセス。
(項目27)
ベーカリー製品を製造するためのプロセスであって:(a)デンプン媒質を提供する工程と;(b)該デンプン媒質に項目1〜項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドを添加する工程と;(c)ベーカリー製品を製造するために工程(b)の間または工程(b)の後に該デンプン媒質に熱を加える工程と、を包含するプロセス。
(項目28)
項目23〜項目27のいずれか1項に記載のプロセスによって得られる食品、飼料製品、生地製品またはベーカリー製品。
(項目29)
生地のための改善剤組成物であって、項目1〜項目20のいずれか1項に記載のポリペプチド、および少なくとも1種のさらなる生地成分もしくは生地添加物を含有する、改善剤組成物。
(項目30)
粉および項目1〜項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドを含有する組成物。
(項目31)
生地製品において、該生地製品の硬化を遅延もしくは減少させ、好ましくは有害な老化を遅延もしくは減少させるための、項目1〜項目30のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドの使用。
(項目32)
項目1〜項目31のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドと、Novamyl、またはマルトース生成αアミラーゼ活性を有するNovamylの改変体、ホモログ、または突然変異体との組み合わせ。
(項目33)
項目1〜項目32のいずれか1項に記載の用途のための項目32に記載の組み合わせの使用。
(項目34)
項目32に記載の組み合わせを用いた処理によって製造された食品または飼料製品。
(項目35)
項目1〜項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドをコード可能である核酸。
(項目36)
配列番号6または配列番号12と少なくとも75%同一である核酸配列を有する、項目35に記載の核酸。
(項目37)
非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコード可能である、項目35または項目36に記載の核酸の少なくとも60残基のフラグメントを含む核酸。
(項目38)
親配列から誘導可能である核酸配列であって、該親配列が非マルトース生成エキソアミラーゼをコード可能であり、該核酸配列は、該核酸が配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して特定された位置における以下の突然変異:(a)121F、121Y、121W、161A、223E、223K;(b)146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T;および(c)26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eの1つ以上をコードするように1つ以上の残基において置換を含む、核酸配列。
(項目39)
1つ以上のヌクレオチド残基の置換によって非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする親配列から誘導される、項目35〜項目38のいずれか1項に記載のPS4核酸配列。
(項目40)
項目35〜項目39のいずれか1項に記載のPS4核酸を含むプラスミド。
(項目41)
項目35〜項目40のいずれか1項に記載のPS4核酸を含む発現ベクター、または項目1〜項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現可能である発現ベクター。
(項目42)
項目40に記載のプラスミドまたは項目41に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは該プラスミドまたは該発現ベクターを用いて形質転換されている宿主細胞。
(項目43)
項目1〜項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現可能である細胞。
(項目44)
細菌細胞、真菌細胞または酵母細胞である、項目42に記載の宿主細胞、または項目43に記載の細胞。
(項目45)
PS4改変体ポリペプチドを発現する方法であって、項目42、項目43または項目44に記載の宿主細胞もしくは細胞を得る工程と、該細胞もしくは該宿主細胞から該ポリペプチドを発現させる工程と、および必要に応じて該ポリペプチドを精製する工程と、を包含する方法。
(項目46)
非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内に、(配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して)(a)121F、121Y、121W、161A、223E、223K;(b)146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T;および(c)26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択されるアミノ酸置換を導入する工程によってポリペプチドの配列を変化させる方法。
(項目47)
配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して(a)121F、121Y、121W、161A、223E、223K;(b)146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T;および(c)26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択される置換を導入する工程によって非マルトース生成エキソアミラーゼの配列を変化させる方法。
(項目48)
非マルトース生成エキソアミラーゼの配列が非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を変化させる工程によって変化させられる、項目46または47に記載の方法。
(項目49)
PS4改変体ポリペプチドを製造する方法であって、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内にアミノ酸置換を導入する工程であって、該アミノ酸置換が配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して(a)121F、121Y、121W、161A、223E、223K;(b)146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T;および(c)26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択される工程を包含する方法。
(項目50)
前記親ポリペプチドをコードする核酸の配列が前記アミノ酸置換を導入するように変化させられる、項目48または49に記載の方法。
(項目51)
非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする核酸配列を変化させる方法であって、配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して(a)121F、121Y、121W、161A、223E、223K;(b)146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T;および(c)26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを該配列に導入する工程を、包含する方法。
(項目52)
ポリペプチドの熱安定性、もしくはエキソ特異性、またはその両方を増加させる方法であって、項目44〜項目51のいずれか1項に記載の工程を包含する方法。
(項目53)
前記ポリペプチドが単離されるかもしくは精製される、または単離されかつ精製される、項目44〜項目52のいずれか1項に記載の方法。
(項目54)
項目44〜項目53のいずれか1項に記載の方法によって得られ得るポリペプチド。
(項目55)
項目44〜項目54のいずれか1項に記載の方法によって得られたポリペプチド。
(項目56)
実質的に、添付の図面を参考として上述しそして添付の図面に示した通りである、PS4改変体ポリペプチド、使用、プロセス、食品、飼料製品、生地製品、ベーカリー製品、改善剤組成物、組成物、核酸、ベクターもしくは宿主細胞。
以下の説明および実施例では、文脈が他のことを指示しない限り、PS4改変体ポリペプチドの用量は、粉のppm(100万分の1g)で示される。例えば、表2に使用した「1 D34」は、重量/重量ベースでpSac−D34の1ppmを指示している。好ましくは、酵素の量は、Bradford(1976,A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein−dye binding.Anal.Biochem.72:248−254)に記載されたアッセイを用いて、標準物質としてウシ血清アルブミン(BSA)を用いて測定した活性アッセイに基づいて純粋酵素タンパク質の当量として決定される。
(i)置換が数字および文字(例えば141P)を含む場合は、これは[番号付けシステムにしたがった位置/置換アミノ酸]を意味する。したがって、例えば、141位における1つのアミノ酸のプロリンへの置換は141Pと指定される;
(ii)置換が文字、数字および文字(例えばA141P)を含む場合は、これは[元のアミノ酸/番号付けシステムにしたがった位置/置換アミノ酸]を意味する。したがって、例えば、141位におけるアラニンのプロリンによる置換はA141Pと指定される。
by Edward Harlow,David Lane,Ed Harlow(1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0−87969−544−7);Antibodies:A Laboratory Manual by Ed Harlow(編集),David Lane(編集)(1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0−87969−314−2),1855,Lars−Inge Larsson“Immunocytochemistry:Theory and Practice”,CRC Press inc.,Baca Raton,Florida,1988,ISBN 0−8493−6078−1,John D.Pound(編集);“Immunochemical Protocols,vol 80”,in the series:“Methods in Molecular Biology”,Humana Press,Totowa,New Jersey,1998,ISBN 0−89603−493−3,Handbook of Drug Screening,Ramakrishna Seethala,Prabhavathi B.Fernandes(編集)(2001,New York,NY,Marcel Dekker,ISBN 0−8247−0562−9);ならびにLab Ref:A Handbook of Recipes,Reagents,and Other Reference Tools for Use at the Bench,Edited
Jane Roskams and Linda Rodgers,2002,Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN 0−87969−630−3を参照されたい。これらの全記載は各々、参考として本明細書中に援用される。
本発明者らは、親酵素と比較して変化した特性、好ましくは変化したエキソ特異性もしくは変化した熱安定性、またはその両方を達成する1つ以上の位置で置換を有する非マルトース生成エキソアミラーゼを提供する。
本発明者らは、非マルトース生成エキソアミラーゼ配列内にアミノ酸置換を含む配列変化を伴うPS4改変体ポリペプチドを提供する。アミノ酸置換は、配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して、26位、70位、121位、145位、146位、157位、158位、161位、188位、198位、223位、229位、272位、303位、306位、309位、316位、339位および353位のうちの任意の1つ以上の位置に存在し得る。
saccharophiliaまたはPseudomonas stuzeriから誘導可能である。
saccharophilia非マルトース生成エキソアミラーゼを含む可能性がある。他の実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号11に示した配列を有するPseudomonas stuzeri由来の非マルトース生成エキソアミラーゼを含んでいるか、またはSWISS−PROTアクセッション番号P13507を有するPseudomonas stuzeri非マルトース生成エキソアミラーゼを含んでいる。
親ポリペプチドが野生型配列を含む実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは野生型配列であって、121位、161位および223位のうちの任意の1つ以上の位置における突然変異、好ましくは121F、121Y、121W、161A、223Eもしくは223K、より好ましくはG121F、G121Y、G121W、S161A、G223EもしくはG223Kの突然変異を有する配列を、含み得る。
PS4改変体ポリペプチドは、野生型配列、または121位、161位および223位などの1つ以上の位置での置換を伴うすでに突然変異した配列のような野生型配列の改変体である変異体配列を含んでいてもよい。
PS4改変体ポリペプチドは、146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位および353位のような1つ以上の位置における置換を有する、野生型配列または野生型配列の改変体である変異体配列(例えば、121位、161位および223位のうちの1つ以上の位置における突然変異を有するPS4改変体ポリペプチドを含む、既に変異した配列)を含み得る。
PS4改変体ポリペプチドは、26位、70位、145位、188位、272位および339位のような1つ以上の位置における置換を有する、野生型配列または野生型配列の改変体である変異体配列(例えば、121位、161位、223位、146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位および353位のうちの1つ以上の位置における突然変異を有するPS4改変体ポリペプチドを含む、既に変異した配列)を含み得る。
(33位、34位、121位、134位、141位、157位、178位、179位、223位、307位および/または334位との組み合わせ)
一部の実施形態では、親配列は、33位、34位、121位、134位、141位、157位、178位、179位、223位、307位および334位のうちの1つ以上の位置、好ましくは全部の位置での突然変異を含んでいる(したがって、PS4改変体ポリペプチドは関連の対応する突然変異を含む)。
PS4改変体ポリペプチドは、121位、161位および/または223位のいずれかにおける突然変異と組み合わせて33、34、121、134、141、157、178、179、223、307および334位のいずれかにおける突然変異をさらに含み得る。従って、本発明者らは、以下の任意の組み合わせを含むPS4改変体ポリペプチドを開示する:(a)残基33位、34位、121位、134位、141位、157位、178位、179位、223位、307位および334位における任意の1つ以上の突然変異、好ましくはN33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307LおよびS334P;(b)121位、161位もしくは223位における任意の1つ以上の突然変異、好ましくは121F、121Y、121W、161A、223Eもしくは223K、より好ましくは121F、161Aもしくは223E位、および(c)146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位もしくは353位における任意の1つ以上の突然変異、好ましくは146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Qもしくは353T、より好ましくは146G、157M、158T、198W、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316Pもしくは353Tの。
(a)および(b)の全部における突然変異が含まれる実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは、便利にも、配列pMD96(配列番号14)を含むPseudomonas saccharophilia非マルトース酵素配列から誘導可能である。
さらに、他の位置(例えば134位、141位、157位、223位、307位および334位のうちの任意の1つ以上の位置)における突然変異を含む親配列もまた使用され得る。必要に応じて、これらは33位および34位の一方または両方における突然変異を含み得る。
PS4改変体は、Pseudomonas saccharophilia非マルトース生成親酵素配列PSac−D20(配列番号3)に基づいていてよい。
PS4改変体は、Pseudomonas saccharophilia非マルトース生成親酵素配列PSac−D14(配列番号4)に基づいていてよい。
PS4改変体は、Pseudomonas saccharophilia非マルトース生成親酵素配列pMD55(配列番号13)に基づいていてよい。
一部の実施形態では、PS4改変体は、好ましくは以下の配列番号7に示したように、Pseudomonas stuzeri非マルトース生成酵素配列から誘導される。
本発明者らはまた、PS4改変体ポリペプチド配列における変化に対応する配列、またはこの変化をコードする配列を有するPS4核酸であって、本明細書に記載した目的のためにそのようなポリペプチドを作製する際に使用するためのPS4核酸を、さらに記載する。従って、本発明者らは、本明細書に記載した任意のポリペプチド配列をコードできる核酸を提供する。
本明細書において番号によって言及するすべての位置は、以下に示すPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ参照配列(配列番号1)の番号に関連する:
PS4改変体ポリペプチドは、「親酵素」、「親ポリペプチド」または「親配列」として知られる別の配列から誘導されるか、またはそれらの改変体である。
US60/485,413,60/485,539および60/485,616;PCT/US2004/021723およびPCT/US2004/021739;US10/886,905および10/866,903;US60/608,919;US60/612,407;US60/485,539;PCT/IB2004/002487;US10/886,023;US10/886,505,US10/886,527およびUS10/886,504;US10/947,612。
親酵素は、本明細書に記載したPS4改変体配列を生成するためにアミノ酸レベルまたは核酸レベルで改変できる。従って、本発明者らは非マルトース生成エキソアミラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列内に1つ以上の対応するコドン変化を導入する工程によるPS4改変体ポリペプチドの生成を提供する。
PS4改変体ポリペプチドは、一般にアミラーゼ活性を含んでいる。
本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドは、好ましくは非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を示すポリペプチド(またはその改変体)から誘導される。好ましくは、これらの親酵素は、非マルトース生成エキソアミラーゼ自体である。非常に好ましい実施形態では、PS4改変体ポリペプチド自体も、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を示す。
以下のシステムは、本明細書に記載した方法および組成物によって使用するために適切な非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドを性質決定するために使用される。このシステムは、例えば、本明細書に記載したPS4親ポリペプチドもしくは改変体ポリペプチドを性質決定するために使用できる。
本明細書に記載したPS4改変体は、好ましくは、それらの親酵素と比較した場合に、改善された熱安定性、改善されたpH安定性、または改善されたエキソ特異性などのうちの任意の1つ以上の改善された特性を有する。
好ましくは、PS4改変体ポリペプチドは、熱安定性である;好ましくは、PS4改変体ポリペプチドはその親酵素より高い熱安定性を有する。
一部の非マルトース生成エキソアミラーゼは、ある程度のエンドアミラーゼ活性を有する可能性があることは公知である。一部の場合には、エンドアミラーゼ活性は分枝状デキストリンの蓄積に起因して粘着性もしくはゴム状のクラムを生成することによって最終パン製品の品質に有害な影響を及ぼす可能性があるので、このタイプの活性を減少させるか、または排除する必要がある。
PS4改変体ポリペプチド、核酸、宿主細胞、発現ベクターなどは、アミラーゼを使用できる任意の用途において使用できる。特に、それらは任意の非マルトース生成エキソアミラーゼにの代わりに使用できる。それらは、単独であるか、他の公知のアミラーゼまたは非マルトース生成エキソアミラーゼと組み合わせられるかにかかわらず、アミラーゼまたは非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を補充するために使用できる。
本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸は、食品として、または食品の調製において使用できる。特に、それらは食品添加物として食品に添加できる。用語「食品」は、調製された食品、ならびに粉などの食品のための成分を含むことが意図されている。好ましい態様では、食品はヒトが消費するためのものである。食品は、使用および/または適用様式および/または投与様式に依存して、溶液もしくは固体の形態であってもよい。
本発明者らは、デンプンゲルなどのデンプン媒質の硬化を遅延させることのできるPS4改変体タンパク質の使用について記載する。PS4改変体ポリペプチドは、特別にはデンプンの有害な老化を遅延させることができる。
本明細書に記載した非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するPS4改変体ポリペプチドの硬化防止作用を評価するために、クラムの堅さは、Instron 4301万能食品テクスチャー分析装置または当技術分野において公知である類似の装置によって、ベーキングの1、3および7日後に測定できる。
本発明者らは、食品、特にデンプン製品の調製におけるPS4改変体ポリペプチドの使用を提供する。本方法は、PS4改変体ポリペプチドなどの非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素をデンプン媒質へ添加することによってデンプン製品を形成する工程を含んでいる。デンプン媒質が生地である場合は、生地は粉、水、PS4改変体ポリペプチドである非マルトース生成エキソアミラーゼおよび必要に応じて他の考えられる成分および添加物を一緒に混合することによって調製される。
本発明者らは、パン改善剤組成物および生地改善剤組成物を含む改善剤組成物について記載する。これらは、必要に応じてさらなる成分と、もしくはさらなる酵素、またはその両方と一緒に、PS4改変体ポリペプチドを含んでいる。
生地は、粉、水、PS4改変体ポリペプチド(上述したような)を含む生地改善剤組成物ならびに必要に応じて他の成分および添加物を混合する工程によって調製できる。
ベーキング製品の特性をさらに改善し、ベーキング製品に際立った品質を付与するために、さらなる生地成分および/または生地添加物を生地の中に組み込むことができる。典型的には、そのようなさらなる添加される成分は、塩、穀物、脂肪および油、糖もしくは甘味料、食物繊維などの生地成分、粉乳、グルテン大豆もしくは卵などのタンパク質源ならびに乳化剤、他の酵素、親水コロイド、フレーバー剤、酸化剤、ミネラルおよびビタミンなどの生地添加物を含むことができる。
PS4改変体ポリペプチドに加えて、1つ以上の別の酵素を使用できる、例えば食品、生地調製物、食材またはデンプン組成物に添加することができる。
PS4改変体は、マルトースおよび高マルトースシロップを製造するために適切である。そのような生成物は、マルトースの低吸湿性、低粘性、良好な熱安定性およびマイルドで甘すぎない味のために、所定の菓子類の製造においては相当に関心が高い。マルトースシロップを製造する工業プロセスは、デンプンを液化する工程、次にマルトース産生酵素および必要に応じてアミロペクチン内の1.6分岐点を開裂する酵素(例えばα−1.6−アミログルコシダーゼ)を用いる糖化する工程を含んでいる。
1つの実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは、耐性デンプンを分解できる。
PS4改変体ポリペプチドを使用するために適切な動物用飼料は、特定の動物群の特異的な必要を満たすように、そして動物が代謝できる形態で必要な炭水化物、脂肪、タンパク質および他の栄養素を提供するように、調製することができる。
PS4改変体ポリペプチドは、単独でまたは食品成分などの他の成分と組み合わせてのいずれかで、PS4改変体ポリペプチドの飼料への間接的もしくは直接的適用によって動物が消費するための飼料中に使用できる。
使用されるPS4改変体ポリペプチドの最適な量は、処理される飼料および/または飼料とPS4改変体ポリペプチドとを接触させる方法および/または意図されるその使用に依存するであろう。PS4改変体ポリペプチドの量は、飼料の摂取後および摂取中に耐性デンプンを実質的に分解するために効果的である十分な量でなければならない。
本発明者らは、PS4改変体ポリペプチドとアミラーゼ(特にマルトース生成アミラーゼ)との組み合わせを特に開示する。マルトース生成αアミラーゼ(グルカン1,4−α−マルトヒドロラーゼ、E.C.3.2.1.133)は、アミロースおよびアミロペクチンをα立体配置にあるマルトースへ加水分解することができる。
a limit dextrin,the limit dextrin,and use of the limit dextrin.DenmarkおよびWO95/10627号が含まれる。これは、さらに米国特許第4,598,048号および第4,604,355号に記載されている。これらの文書は各々参考として本明細書に援用され、その中に記載された任意のNovamylポリペプチドは、本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドのいずれかと組み合わせて使用できる。
本発明は、PS4改変体核酸を利用するが、そのようなPS4改変体核酸のアミノ酸配列は本明細書に記載した方法および組成物に含まれる。
上述したように、本発明者らは、本明細書に記載した特異的な特性を有するPS4改変体酵素をコードするヌクレオチド配列を開示する。
本明細書に記載した特定の特性を有する酵素(例、PS4改変体ポリペプチド)または親酵素などの改変のために適切な酵素のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記酵素を産生する任意の細胞もしくは生物から同定および/または単離および/または精製することができる。ヌクレオチド配列を同定および/または単離および/または精製するための様々な方法は、当技術分野において周知である。例えば、適切な配列が同定および/または単離および/または精製されると、PCR増幅技術を使用して、より多くの配列を調製することができる。
本発明者らは、酵素の任意のアミノ酸配列の改変体、ホモログおよび誘導体または例えばPS4改変体ポリペプチドもしくはPS4改変体核酸などの酵素をコードする任意のヌクレオチド配列の使用についてさらに記載する。文脈が他のことを指示しない限り、用語「PS4改変体核酸」は、以下に記載する核酸実体の各々を含むと見なさなければならず、そして用語「PS4改変体ポリペプチド」は、同様に以下に記載するポリペプチドもしくはアミノ酸実体の各々を含むと見なさなければならない。
conservation” J.Theor.Biol.119;205−218)。保存的置換は、例えば、一般に容認されたアミノ酸のベン図分類について記載している以下の表にしたがって作製できる。
本発明者らは、PS4改変体の核酸配列に相補的である配列またはPS4改変体配列もしくはそれに相補的である配列のいずれかへハイブリダイズすることができる配列についてさらに記載する。
酵素をコードするヌクレオチド配列か、または酵素をコードすると推定されるヌクレオチド配列が単離されると、酵素を調製するためにその配列を突然変異させることが所望され得る。したがって、PS4改変体配列は、親配列から調製できる。突然変異は合成オリゴヌクレオチドを用いて導入できる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含有している。
PS4ポリヌクレオチドおよびPS4核酸は、合成および天然両方の起源のDNAおよびRNAを含んでいてよい。そのDNAもしくはRNAは、改変もしくは未改変のデオキシヌクレオチドもしくはジデオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチドあるいはそれらのアナログを含有し得る。PS4核酸は一本鎖もしくは二本鎖DNAもしくはRNA、RNA/DNAヘテロ二本鎖またはRNA/DNAコポリマーとして存在することができ、ここで、用語「コポリマー」は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含む単一核酸鎖を意味する。PS4核酸は、いっそう発現を増加させるように最適化されたコドンでさえあってもよい。
PS4核酸は、当該宿主細胞内で活性な転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントへ作動可能に連結させることができる。PS4核酸は、さらに例えばSchwanniomyces occidentalis由来のグルコアミラーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子接合型遺伝子およびAspergillus oryzae由来のTAKA−アミラーゼに由来するシグナル配列などのシグナル配列を含む融合タンパク質をさらにコードできる。または、PS4核酸は、膜結合ドメインを含む融合タンパク質をコードすることができる。
PS4核酸は、発現ベクターを用いて宿主生物において所望のレベルで発現させることができる。
発現ベクターは、典型的には、例えば選択された宿主生物内でのベクターの自律複製を許容するエレメント、および選択目的のための1つ以上の表現型によって検出可能なマーカーなどのクローニングベクターの構成成分を含んでいる。発現ベクターは、通常はプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、ならびに必要に応じて、リプレッサー遺伝子または1つ以上のアクチベーター遺伝子をコードする制御ヌクレオチド配列を含んでいる。さらに、発現ベクターは、ペルオキシソームなどの宿主細胞オルガネラまたは特定宿主細胞区画へPS4改変体ポリペプチドを標的化できるアミノ酸配列をコードする配列を含んでいてよい。そのような標的化配列としては、配列SKLが挙げられるが、それに限定されない。本明細書の文脈では、用語「発現シグナル」は、上記の制御配列、リプレッサー配列もしくはアクチベーター配列のいずれかを含んでいる。制御配列の指示下で発現させるために、PS4改変体ポリペプチドの核酸配列は発現に関して適正な方法で制御配列と作動可能に連結している。
ベクター内では、PS4改変体ポリペプチドをコードする核酸配列は適切なプロモーター配列と作動可能に結合している。プロモーターは、選択された宿主生物内で転写活性を有する任意のDNA配列であってよく、そして宿主生物に同種または異種である遺伝子から誘導することができる。
細菌宿主内でPS4核酸などの改変ヌクレオチド配列の転写を指示するために適切なプロモーターの例としては、E.coliのlacオペロンのプロモーター、Streptomyces coelicolorアガラーゼ(agarase)遺伝子dagAプロモーター、Bacillus licheniformisαアミラーゼ遺伝子(amyL)のプロモーター、Bacillus stearothermophilusマルトース生成アミラーゼ遺伝子(amyM)のプロモーター、Bacillus amyloliquefaciensαアミラーゼ遺伝子(amyQ)のプロモーター、Bacillus subtilisのxylAおよびxylB遺伝子のプロモーターならびにP170プロモーターを含むラクトコッカス種(Lactococcus sp.)由来のプロモーターが挙げられる。PS4改変体ポリペプチドをコードする遺伝子がE.coliなどの細菌種中で発現させられる場合は、適切なプロモーターは、例えばT7プロモーターおよびファージλプロモーターを含むバクテリオファージプロモーターから選択できる。
真菌種中で転写させるために有用なプロモーターの例は、Aspergillus oryzaeのTAKAアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus niger中性αアミラーゼ、Aspergillus niger酸安定性αアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiリパーゼ、Aspergillus oryzaeアルカリプロテアーゼ、Aspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼまたはAspergillus nidulansアセトアミダーゼをコードする遺伝子から誘導されるプロモーターである。
酵母種において発現させるために適切なプロモーターの例としては、Saccharomyces cerevisiaeのGal 1およびGal 10プロモーターならびにPichia pastorisのAOX1もしくはAOX2プロモーターが含まれるが、それらに限定されない。
(I)細菌宿主生物
適切な細菌宿主生物の例は、Bacillus subtilis、Bacillus
licheniformis、Bacillus lentus、Bacillus brevis、Bacillus stearothermophilus、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus coagulans、Bacillus lautus、Bacillus megateriumおよびBacillus thuringiensisを含むバシラス種、Streptomyces murinusなどのストレプトミセス種、Lactococcus lactisなどのラクトコッカス種を含む乳酸菌種、Lactobacillus reuteriを含むラクトバシラス種、リューコノストック(Leuconostoc)種、ペジオコッカス(Pediococcus)種および連鎖球菌種などのグラム陽性細菌種である。または、E.coliを含む腸内細菌属またはシュードモナス属に属するグラム陰性細菌種の菌株もまた宿主生物として選択できる。
適切な酵母宿主生物は、ピチア種、ハンセヌラ種もしくはクリュイベロミセス(Kluyveromyces)種、Yarrowinia種またはSaccharomyces
cerevisiaeを含むサッカロミセス種もしくは例えばS.Pombe種などのシゾサッカロミセス種(Schizosaccharomyces)に属する種などのバイオ技術的に重要な酵母種から選択できる。
糸状菌の中で特に適切な宿主生物としては、アスペルギルス種、例えばAspergillus niger、Aspergillus oryzae、Aspergillus tubigensis、Aspergillus awamoriまたはAspergillus nidulansが含まれる。または、フザリウム(Fusarium)種、例えばFusarium oxysporumまたはRhizomucor mieheiなどのリゾムコール種の菌株を宿主生物として使用できる。その他の適切な菌株には、サーモミセス(Thermomyces)種およびムコール(Mucor)種が含まれる。
ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、PS4改変体ポリペプチド、フラグメント、ホモログ、改変体もしくはそれらの誘導体などのポリペプチドを発現するために使用できる。宿主細胞は、タンパク質の発現を可能にする適切な条件下で培養できる。ポリペプチドの発現は、それらが継続的に産生されるように構成的であってもよく、または発現を開始するための刺激を必要とするように誘導性であってもよい。誘導性発現の場合には、タンパク質産生は、必要なときに、例えばデキサメタゾンもしくはIPTGのような培養培地へのインデューサー物質の添加によって開始できる。
Pseudomonas saccharophiliaをLB培地上で一晩増殖させ、標準方法によって染色体DNAを単離した(Sambrook J,1989)。プライマーP1およびP2(表3参照)を用いるPCRによって、PS4オープンリーディングフレーム(Zhouら,1989)を含有する2190bpフラグメントをP.saccharophilia染色体DNAから増幅させた。生じたフラグメントはプライマーP3およびP4を用いるネステッドPCRにおけるテンプレートとして使用し、そのシグナル配列を使用せずにPS4のオープンリーディングフレームを増幅させ、遺伝子の5’末端にNcoI部位を、そして3’末端にBamHI部位を導入した。PS4を細胞内発現させるために、NcoI部位と一緒に、N末端メチオニンについてのコドンを導入した。1605bpフラグメントをpCRBLUNT TOPO(Invitrogen)内にクローン化し、構築物の完全性を配列決定によって分析した。P32プロモーターおよびctgaseシグナル配列の制御下でPS4を発現させるために、E.coliバシラス シャトルベクターpDP66K(Penningaら,1996)を改変した。生じたプラスミドのpCSmtaをBacillus subtilis内へ形質転換させた。
2つの方法によって(2段階PCRに基づく方法、またはQuick Exchange(QE)法のいずれかによって)mta遺伝子内に突然変異を導入した。便宜性のために、mta遺伝子を3つの部分に分割した;PvuI−FspIフラグメント、FspI−PstIフラグメントおよびPstI−AspIフラグメント、以下ではさらに各々フラグメント1、2および3と呼ぶ。
PS4改変体を、QuickChange(登録商標)多重部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を下記のように一部の変更を加えて製造業者のプロトコールにしたがって使用して生成した。
3mlのLB(22g/lのLennox L Broth Base、Sigma)+抗生物質(0.05μg/mlのカナマイシン、Sigma)を10mlのFalcon試験管中で接種する。
(PCRミックス:)
2.5μlの10× QuickChange(登録商標)Multi反応バッファー
0.75μlのQuickSolution
Xμlのプライマー
プライマー長28〜35bp → 10pmol
プライマー長24〜27bp → 7pmol
プライマー長20〜23bp → 5pmol
1μlのdNTPミックス
Xμlのds−DNAテンプレート(200ng)
1μlのQuickChange(登録商標)Multi酵素混合物(2.5単位/μl)(PfuTurbo(登録商標)DNAポリメラーゼ)
XμlのdH2O(25μlの最終容量まで)
全構成成分をピペッティングによって混合し、反応混合物を短時間で遠心沈殿する。
35サイクルの変性(96℃/1分間)
プライマーのアニーリング(62.8℃/1分間)
伸長(65℃/15分間)
その後4℃で保持する。
1.2μlのDpnI制限酵素(10単位/μl)を各増幅反応液に加え、ピペッティングによって混合し、混合物液を遠心沈殿させる。
1.氷上でXL10−Goldを解凍する。事前に冷却したFalcon試験管へ1回の突然変異誘発反応につき45μlの細胞を分取する。
pPD77のために使用されるベクター系は、pCRbluntTOPOII(invitrogen)に基づいている。ゼオシン(zeocin)耐性カセットは、pm1I、393bpフラグメントによって取り除かれている。次に、pCCベクター(P32−ssCGTase−PS4−tt)由来の発現カセットが、ベクター内に挿入されている。
関連する突然変異(MSDMによって作製された)を含有するプラスミドを、制限酵素Nco1およびHindIII(Biolabs)を用いて切断する:
3μgのプラスミドDNA、Xμlの10×バッファー2、10単位のNco1、20単位のHindIII、37℃、2時間のインキュベーション。
1μlのベクター
5μlのT4 DNAライゲーションバッファー(濃度2倍)
1μlのdH2O
1μlのT4 DNAリガーゼ
5分間/RTでライゲーションする。
Bacillus subtilis(菌株DB104A;Smithら,1988;Gene 70,351−361)を、以下のプロトコールにしたがって突然変異pCS−プラスミドを用いて形質転換させた。
2×SMM 1リットルに付き:342gのスクロース(1M);4.72gのマレイン酸ナトリウム(0.04M);8:12gのMgCl2、6H2O(0.04M);濃NaOHを用いてpH6.5にする。50ml部分に分配し、10分間にわたりオートクレーブ滅菌にかける。
寒天 4%のDifco最小寒天。15分間にわたりオートクレーブ滅菌する。
250mlのコハク酸ナトリウム
50mlのカザミノ酸
25mlの酵母抽出液
50mlのリン酸バッファー
15mlのグルコース
10mlのMgCl2
100mlの溶融寒天
適切な抗生物質を加える:クロラムフェニコールおよびテトラサイクリン、5μg/ml;エリスロマイシン、1μg/ml。カナマイシン上の選択はDM3培地中では問題が生じる(250μg/mlの濃度が必要になることがある)。
1.全試験を通して洗剤無含有プラスチックまたはガラス製品を使用する。
1.450μlのPEGをマイクロチューブへ移す。
攪拌フラスコ内の基質は以下のとおりに調製した:
(Betamylアッセイ)
1Betamyl単位は、1分間に付き0.0351mMのPNPがアッセイミックス中の過剰なαグルコシダーゼによって放出され得るように、1分間に付き0.0351mMのPNP結合マルトペンタオースを分解させる活性であると定義されている。アッセイミックスは、Megazyme(アイルランド)の25μlの酵素サンプルおよび25μlのBetamyl基質(Glc5−PNPおよびa−グルコシダーゼ)(1バイアルを10mlの水に溶解させた)とともに50μlの50mMのクエン酸ナトリウム、5mMのCaCl2(pH6.5)を含有していた。アッセイミックスを40℃で30分間インキュベートし、次に150μlの4% Trisを加えて停止させた。ELISAリーダーを用いて420nmでの吸光度を測定し、Betamyl活性を活性=A420*d(アッセイ対象の酵素サンプル1mlあたりBetamyl単位)に基づいて計算した。
エンドアミラーゼアッセイは、製造業者(Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB)によるPhadebasアッセイ実行と同一であった。
エキソ特異性は、エキソアミラーゼ活性対Phadebas活性の比率を使用して評価した。
PSac−D14改変体、PSac−D20改変体およびPSac−D34改変体について、本発明者らはBradford(1976;Anal.Biochem.72,248)に従って測定した精製タンパク質1μgにつき10Betamyl単位の平均比活性を見いだした。この比活性を、適用試験に使用する用量を計算するために活性に基づいて使用した。
t1/2は、規定加熱条件下でその間に酵素活性の半分が不活化される時間(単位:分間)である。酵素の半減期を決定するために、サンプルを60℃〜90℃の一定温度で1〜10分間にわたり加熱した。半減期は、残留Betamylアッセイに基づいて計算した。
生地は30.0℃のファリノグラフ内で作製した。10.00gの改善(reform)した粉を計量し、ファリノグラフ内に加えた;1分間混合した後、捏ね上げバット(kneading vat)の穴を通して無菌ピペットを用いて参照物質/サンプル(参照物質=バッファーもしくは水、サンプル=酵素+バッファーもしくは水)を加える。30秒後、同様に捏ね上げバットの穴を通して、粉を辺縁からこすり落とす。サンプルを7分間捏ねる。
モデルのパンクラム(bread crumb)は、実施例8にしたがって調製して測定する。表2に示したように、PS4改変体は、示差走査熱量測定によって測定すると、コントロールと比較してベーキング後にアミロペクチン老化の強い減少を示す。PS4改変体は、明白な用量作用を示す。
ベーキング試験を、米国式トーストのための標準白パンのスポンジおよび生地のレシピを用いて実施した。スポンジ生地はSisco Mills(USA)の1,600gの粉「All Purpose Classic」、950gの水、40gの大豆油および32gのドライイーストから調製する。スポンジを、Hobartスパイラル・ミキサーを用いて低速で1分間、続いて速度2で3分間混合した。スポンジは引き続いて35℃、85% RHで2.5時間、次に5℃で0.5時間にわたり発酵させる。
試験前速度:2mm/s
試験速度:2mm/s
試験後速度:10mm/s
破壊試験間隔:1%
間隔:40%
力:0.098N
時間:5.00秒間
カウント:5
ロードセル:5kg
トリガータイプ:自動−0.01N
堅さの測定値は、PS4改変体ポリペプチドが第1日から第7日の堅さの発達を有意に減少させることを示しており、そして酵素用量の増加に伴ってより高い作用を示す。
デニッシュ・ロールを2,000gのデニッシュ用改善粉(Cerealia)、120gの圧搾イースト、32gの塩、および32gのスクロースをベースとする生地から調製する。事前の水の最適化に従って生地に水を加える。
(表9.野生型PSac−cc1と比較したPsac改変体の生化学的特性)
N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、L178F、A179Tでのアミノ酸突然変異を有するpMD55と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。上記の実施例12および表9も参照されたい。
N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD96と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。上記の実施例12および表9も参照されたい。
N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223E、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD85と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。上記の実施例12および表9も参照されたい。
N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121D、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD3と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121W、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD44と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121H、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD43aと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121M、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD41aと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121A、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD74aと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121Y、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD73aと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD3と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223K、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM173F6と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223V、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD49aと名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223K、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM171G11と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223R、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM173B6と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM381と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。
33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM279B1と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。
33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM237P2と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。
33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM325F3と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。
33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM341A9と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。
33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM350B11と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。
33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM332Q4と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。
33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316S、および334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM365B4と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。
33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334P、および353Tでのアミノ酸突然変異を有するSSM360C7と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。
N26E、N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223E、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM219B3と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223A、S229P、H307L、A309P、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSAS1401L10と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSAS1387D16bfと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188H、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339Eでのアミノ酸突然変異を有するpMD236と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。
N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188S、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339Eでのアミノ酸突然変異を有するpMD237bfと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。
N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339Aでのアミノ酸突然変異を有するSAS1379O13と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。
N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339Eでのアミノ酸突然変異を有するSAS1379O9と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。
以下では、本発明のさらなる態様および実施形態を以下の番号付けした段落に記載する;本発明はこれらの態様を含むと理解されたい。
(a)121位における突然変異、好ましくは121D、より好ましくはG121D;
(b)178位における突然変異、好ましくは178F、より好ましくはL178F;
(c)179位における突然変異、好ましくは179T、より好ましくはA179T;および/または
(d)87位における突然変異、好ましくは87S、より好ましくはG87Sを含むPS4改変体ポリペプチド。
(a)121位における突然変異、好ましくは121D、より好ましくはG121D;
(b)178位における突然変異、好ましくは178F、より好ましくはL178F;
(c)179位における突然変異、好ましくは179T、より好ましくはA179T;および/または
(d)87位における突然変異、好ましくは87S、より好ましくはG87Sを含むPS4改変体ポリペプチド。
(a)121位における突然変異、好ましくは121D、より好ましくはG121D;
(b)178位における突然変異、好ましくは178F、より好ましくはL178F;
(c)179位における突然変異、好ましくは179T、より好ましくはA179T;および/または
(d)87位における突然変異、好ましくは87S、より好ましくはG87Sを含むPS4改変体ポリペプチド。
(a)33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号15を有する;
(b)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号16を有する;
(c)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号17を有する;
(d)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号18を有する;
(e)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号19を有する;
(f)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、229P、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号20を有する;
(g)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号21を有する;
(h)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303D、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号22を有する;
(i)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号23を有する;
(j)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306G、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号24を有する;
(k)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号25を有する;
(l)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316S、および334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号26を有する;
(m)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316P、および334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号27を有する;
(n)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334Pおよび353Tの突然変異を含み、好ましくは配列番号28を有する;
PS4改変体ポリペプチド。
(配列番号1)
Pseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列に由来するPS4参照配列。
Pseudomonas saccharophilia由来グルカン1,4−α−マルトテトラヒドロラーゼ前駆物質(EC3.2.1.60)(G4−アミラーゼ)(マルトテトラオース生成アミラーゼ)(エキソ−マルトテトラヒドロラーゼ)(マルトテトラオース生成エキソアミラーゼ)。SWISS−PROTアクセッション番号P22963。
Pseudomonas stuzeri(Pseudomonas perfectomarina)由来グルカン1,4−α−マルトテトラヒドロラーゼ前駆物質(EC3.2.1.60)(G4−アミラーゼ)(マルトテトラオース生成アミラーゼ)(エキソ−マルトテトラヒドロラーゼ)(マルトテトラオース生成エキソアミラーゼ)。SWISS−PROTアクセッション番号P13507。
pMD55配列;11の置換(G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179TおよびG121F)およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
PMD96配列;N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、H307LおよびS334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM381配列;33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM279B1配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157M、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM237P2配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM325F3配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
pMD129配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、229P、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM341A9配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM341G11配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303D、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM350B11配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM350C12配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306G、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM332Q4配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM365B4配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316Sおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM365F4;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316Pおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
SSM360C7;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334Pおよび353Tでの突然変異を有するPseudomonas saccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Claims (45)
- 非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能であるPS4改変体ポリペプチドであって、配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照してそれぞれの位置における121Fおよび146Gからなる群から選択されるアミノ酸突然変異を含み、該ポリペプチドが、該PS4改変体ポリペプチドの該親ポリペプチドと比較して高い熱安定性を有し、該親ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含み、該PS4改変体ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、PS4改変体ポリペプチド。
- 前記PS4改変体ポリペプチドが、以下の突然変異:
(a)33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;
(b)33Y、34N、121F、134R、141P、157M、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;
(c)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;
(d)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、307Lおよび334P;
(e)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334P;
(f)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、229P、307Lおよび334P;
(g)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334P;
(h)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303D、307Lおよび334P;
(i)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334P;
(j)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306G、307Lおよび334P;
(k)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334P;
(l)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316S、および334P;
(m)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316Pおよび334P;
(n)33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334Pおよび353T
の組み合わせから選択される突然変異の組み合わせを含む、請求項1に記載のPS4改変体ポリペプチド。 - 前記PS4改変体ポリペプチドが、以下の突然変異:
(a)N26E、N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P;
(b)N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P;
(c)N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P;
(d)N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188H、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339E;
(e)N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188S、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339E;
(f)N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339A;
(g)N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339E
の組み合わせから選択される突然変異の組み合わせを含む、請求項1〜請求項2のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。 - 前記PS4改変体ポリペプチドが、87位における突然変異をさらに含む、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
- 前記PS4改変体ポリペプチドが、突然変異87Sをさらに含む、請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
- 前記PS4改変体ポリペプチドが、G87Sである突然変異をさらに含む、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
- SSM381(配列番号15)、SAS1401 L10(配列番号56)、SAS1387D16 bf(配列番号57)、pMD236(配列番号58)、pMD237 bf(配列番号59)、SAS1379 O13(配列番号60)およびSAS1379 O9(配列番号61)からなる群から選択される配列を含む、請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
- デンプン結合ドメインを欠失する請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドであって、該デンプン結合ドメインが、配列番号1に示したPseudomonas saccharophilia配列の位置の番号付けを参照して429位の後のアミノ酸に対応する、PS4改変体ポリペプチド。
- 80℃における半減期(t1/2)が、前記親ポリペプチドと比較して、15%以上増加している、請求項1〜請求項8のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
- 80℃における半減期(t1/2)が、前記親ポリペプチドと比較して、50%以上増加している、請求項1〜請求項9のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
- 80℃における半減期(t1/2)が、前記親ポリペプチドと比較して、100%以上増加している、請求項1〜請求項10のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。
- 請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド配列の1つ以上の残基での突然変異によって該PS4改変体ポリペプチドから誘導可能であるポリペプチドであって、該PS4改変体ポリペプチドの前記親ポリペプチドと比較してより高い熱安定性を有するポリペプチド。
- 請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドの、食品または飼料添加物としての使用。
- デンプンを処理するための方法であって、該デンプンを請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のポリペプチドと接触させる工程と、該ポリペプチドに該デンプンから1種以上の直鎖状生成物を生成させる工程とを包含する方法。
- 食品または飼料製品を調製する際の請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
- 食品または飼料製品を調製する方法であって、請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のポリペプチドを食品の成分または飼料の成分と混合する工程を包含する方法。
- 前記食品が生地もしくは生地製品を含む、請求項15に記載の使用、または請求項16に記載の方法。
- 前記食品が加工された生地製品を含む、請求項15に記載の使用または請求項16に記載の方法。
- 前記食品がベーカリー製品である、請求項13〜請求項17のいずれか1項に記載の使用または方法。
- ベーカリー製品を製造するための方法であって:(a)デンプン媒質を提供する工程と;(b)該デンプン媒質に請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のポリペプチドを添加する工程と;(c)ベーカリー製品を製造するために工程(b)の間または工程(b)の後に該デンプン媒質に熱を加える工程と、を包含する方法。
- 生地のための改善剤組成物であって、請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のポリペプチド、および少なくとも1種のさらなる生地成分もしくは生地添加物を含有する、改善剤組成物。
- 粉および請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のポリペプチドを含有する組成物。
- 生地製品において、該生地製品の硬化を遅延もしくは減少させるための、請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドの使用。
- 生地製品において、該生地製品の有害な老化を減少させるための、請求項1〜12のいずれか1項に記載のPS改変体ポリペプチドの使用。
- 請求項1〜請求項24のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドと、Bacillus由来のマルトース生成α−アミラーゼ、またはマルトース生成αアミラーゼ活性を有するその改変体、ホモログ、もしくは突然変異体との組み合わせ製品。
- 請求項13〜請求項20、請求項23および請求項24のいずれか1項に記載の方法または使用における請求項25に記載の組み合わせ製品の使用。
- 請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 親配列から誘導可能である核酸であって、該親配列が非マルトース生成エキソアミラーゼをコードし、該核酸は、配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照してそれぞれの位置における121Fおよび146Gからなる群から選択される突然変異をコードし、該核酸によってコードされる該ポリペプチドが、該親配列によってコードされる親ポリペプチドと比較して高い熱安定性を有し、該親ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含み、該核酸によってコードされる該ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、核酸。
- 1つ以上のヌクレオチド残基の置換によって非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする親配列から誘導される、請求項27〜請求項28のいずれか1項に記載のPS4核酸。
- 請求項27〜請求項29のいずれか1項に記載のPS4核酸を含むプラスミド。
- 請求項27〜請求項30のいずれか1項に記載のPS4核酸を含むか、または請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現する発現ベクター。
- 請求項30に記載のプラスミドまたは請求項31に記載の発現ベクターを含む細胞。
- 請求項30に記載のプラスミドまたは請求項31に記載の発現ベクターを用いて形質転換された細胞。
- 請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現する細胞。
- 細菌細胞、真菌細胞または酵母細胞である、請求項32、請求項33または請求項34に記載の細胞。
- PS4改変体ポリペプチドを発現する方法であって、請求項32、請求項33、請求項34または請求項35に記載の細胞を得る工程と、該細胞から該ポリペプチドを発現させる工程と、を包含する方法。
- 前記ポリペプチドを精製する工程をさらに包含する、請求項36に記載の方法。
- 非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内に、配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して、それぞれの位置における121Fおよび146Gからなる群から選択されるアミノ酸置換を導入する工程によってポリペプチドの配列を変化させる方法であって、該変化させたポリペプチドが、該親ポリペプチドと比較して高い熱安定性を有し、該親ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含み、該変化させたポリペプチドは、配列番号15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
- 前記ポリペプチドが非マルトース生成エキソアミラーゼである、請求項38に記載の方法。
- 前記非マルトース生成エキソアミラーゼの配列が非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を変化させる工程によって変化させられる、請求項38または39に記載の方法。
- PS4改変体ポリペプチドを製造する方法であって、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内にアミノ酸置換を導入する工程であって、該アミノ酸置換が配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照してそれぞれの位置における121Fおよび146Gからなる群から選択され、該製造されたPS4ポリペプチドが、該親ポリペプチドと比較して高い熱安定性を有し、該親ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含み、該PS4改変体ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
- 前記親ポリペプチドをコードする核酸の配列が前記アミノ酸置換を導入するように変化させられる、請求項40または41に記載の方法。
- 非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする核酸配列を変化させる方法であって、配列番号1に示したPseudomonas saccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して、それぞれの位置における121Fおよび146Gからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを該配列に導入する工程を、包含し、該核酸によってコードされる該ポリペプチドが、親ポリペプチドと比較して高い熱安定性を有し、該親ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含み、該核酸によってコードされる該ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
- ポリペプチドの熱安定性を増加させる方法であって、請求項36〜請求項43のいずれか1項に記載の工程を包含する方法。
- 前記ポリペプチドが単離されるかもしくは精製される、または単離されかつ精製される、請求項36〜請求項44のいずれか1項に記載の方法。
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