CN104357424A - 多肽 - Google Patents

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CN104357424A CN201410136270.5A CN201410136270A CN104357424A CN 104357424 A CN104357424 A CN 104357424A CN 201410136270 A CN201410136270 A CN 201410136270A CN 104357424 A CN104357424 A CN 104357424A
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卡斯珀·T·伯格
帕特里克·M·F·德克斯
卡罗尔·菲奥里西
吉斯伯特·格里茨
安贾·H·凯利特－史密斯
卡斯滕·M·克拉夫
刘巍
安德鲁·肖
鲍·S·索伦森
夏洛特·R·索达尔
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DuPont Nutrition Biosciences ApS
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Danisco US Inc
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Abstract

我们描述了一种可源自具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的亲本多肽的PS4变体多肽,其中所述PS4变体多肽参照如SEQ ID NO:1所示嗜糖假单胞菌外切型淀粉酶序列的位置编号在选自：121,161,223,146,157,158,198,229,303,306,309,316,353,26,70,145,188,272,339的一个或多个位置上包含氨基酸突变。

Description

多肽
本申请是申请号为200580029996.8，申请日为2005年7月7日，发明名称为“多肽”的中国专利申请的分案申请。
参考2003年7月7日提交的美国临时申请系列号60/485,413,60/485,539和60/485,616。还参考2004年7月7日提交并指定美国的国际申请PCT/US2004/021723和PCT/US2004/021739(申请人:GenencorInternational,Inc)。还参考全都在2004年7月7日提交的美国实用新型申请系列号10/886,905和10/866,903。
还参考US临时申请系列号60/608,919(2004年7月7日提交为美国实用新型申请系列号10/887,056,但在2004年9月15日转为临时申请)。还参考2004年9月22日提交的美国临时申请系列号60/612,407。
另外参考2003年7月7日提交的美国申请系列号60/485,539。还参考2004年7月7日提交并指定美国的国际申请PCT/IB2004/002487(申请人:Danisco A/S)。还参考2004年7月7日提交的美国实用新型申请系列号10/886,023。
还参考全部都在2004年7月7日提交的美国实用新型申请系列号10/886,505,10/886,527和10/886,504。还参考2004年9月22日提交的美国实用新型申请系列号10/947,612。
特此将在前申请、在本申请和在前申请每一篇中引用或参考的每篇文件，包括在每个在前申请的审批过程期间(“申请和论文引用的文件”),以及在每一个在前申请和论文中和在任何申请和论文引用的文件中所引用或提及的任何生产商的说明书或产品目录并入本文作为参考。另外，特此将在本文中引用的所有文件，以及在本文中引用的文件中所有引用的文件或参考文献，以及在本文或在特此并入本文的任何文件中引用或提及的任何生产商的说明书或产品目录并入本文作为参考。可以将并入本文作为参考的文件或其中的任何教导用于本发明的实践中。通过参考并入本文的文件并被承认为现有技术。
技术领域
本发明涉及多肽,特别是淀粉酶多肽和编码这些的核酸,以及它们作为非产麦芽糖外切型淀粉酶在生产食品产品中的用途。已经对本发明的淀粉酶进行了工程化设计以便具有更有益的品质。具体地，本发明的淀粉酶显示改变的外切特异性和/或改变的热稳定性。特别地,所述多肽源自具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性,特别地,葡聚糖1,4-α-麦芽糖四水解酶（glucan1,4-alpha-maltotetrahydrolase）(EC3.2.1.60)活性的多肽。
背景技术
改进的淀粉酶可以改善在某些加工过程,如烘焙中固有的问题。烘焙后数天在淀粉颗粒中发生支链淀粉的结晶，其导致面包硬度提高并导致面包陈化（staling）。当面包陈化时，面包丧失面包心（crumb）软度和面包心水分。结果，面包心弹性变小，并且面包形成皮革似的面包皮（crust）。
支链淀粉侧链的酶水解(例如,通过淀粉酶)可以减少结晶并提高抗陈化性。结晶依赖于支链淀粉侧链的长度:侧链越长,结晶越严重。大多数淀粉颗粒由两种聚合物的混合物组成:支链淀粉和直链淀粉,其中大约75%是支链淀粉。支链淀粉是极大的，分枝的分子，其由通过（1-4）连接连接的α-D-吡喃葡糖苷基单位组成,其中通过α-D-(1-6)连接附着以形成分枝。直链淀粉是具有少数α-D-(1-6)分枝的(1-4)连接的α-D-吡喃葡糖苷基单位的线性链。
含淀粉的面包产品如白面包、由筛制的（bolted）黑麦粉和小麦粉（wheatflower）制得的面包和面包卷的烘焙通过在从180℃到250℃范围的烤箱温度烘焙面包生面团持续大约15到60分钟来实现。在烘焙过程中在外部生面团层上迅速升高（steep）的温度梯度(200→120℃)占上风，在那里形成烘焙过的产品的面包皮。不过,由于蒸气,在烘焙过程结束时面包心中的温度只有大约100℃。在大约85℃的温度以上,可以发生酶失活并且酶将没有抗陈化的特性。因而，只有热稳定淀粉酶能够在烘焙过程中有效地改变淀粉。
通过产生粘性的面包心，所述粘性的面包心由于分枝糊精聚集而带来,内淀粉酶活性可以负面影响最后面包产品的质量。优选外切型淀粉酶活性,因为它实现所需的淀粉修饰，所需的淀粉修饰导致陈化延迟，并伴随较少的与内淀粉酶活性相关联的负效应。内淀粉酶活性的减弱能够导致更大的外切特异性,所述外切特异性能够减少分枝的糊精并产生更高质量的面包。
发明内容
根据本发明,我们提供如权利要求中所述的PS4变体多肽。我们进一步提供这种PS4变体多肽的用途，包括如权利要求中所述在食品添加剂、食品产品、面包产品、改良剂组合物、饲料产品包括动物饲料等中和作为这些的用途。我们提供在权利要求中所述的编码和涉及PS4变体多肽的核酸。在权利要求中还列出了生产这些PS4变体多肽的方法，以及本发明的其它方面。
序列表
SEQ ID NO:1显示源自嗜糖假单胞菌（Pseudomonas saccharophila）麦芽糖四水解酶氨基酸序列的PS4参照序列。SEQ ID NO:2显示PSac-D34序列;具有11个取代和缺失了淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:3显示PSac-D20序列;具有13个取代和缺失了淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ IDNO:4显示PSac–D14序列;具有14个取代和缺失了淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列.SEQ ID NO:5显示嗜糖假单胞菌葡聚糖1,4-α-麦芽糖四水解酶前体(EC3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(形成麦芽四糖（maltotetraose）的淀粉酶)(外切型麦芽糖四水解酶)(形成麦芽四糖的外切型淀粉酶)。SWISS-PROT编号P22963。SEQ ID NO:6显示编码麦芽四水解酶(EC号=3.2.1.60)的嗜糖假单胞菌mta基因。GenBank编号X16732。SEQID NO:7显示源自施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）麦芽糖四水解酶氨基酸序列的PS4参照序列。SEQ ID NO:8显示PStu-D34序列;具有9个取代的施氏假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:9显示PStu-D20序列；具有11个取代的施氏假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:10显示PStu-D14序列;具有12个取代的施氏假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:11显示施氏假单胞菌(全海假单胞菌Pseudomonas perfectomarina)葡聚糖1,4-α-麦芽糖四水解酶前体(EC3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(形成麦芽四糖的淀粉酶)(外切型麦芽糖四水解酶)(形成麦芽四糖的外切型淀粉酶)。SWISS-PROT编号P13507。SEQ ID NO:12显示施氏假单胞菌形成麦芽四糖的淀粉酶(amyP)基因,完整编码序列（cds）。GenBank编号M24516。SEQ ID NO:13显示pMD55序列;具有11个取代(G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,N33Y,D34N,L178F,A179T和G121F)的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:13显示pMD55序列;具有11个取代(G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,N33Y,D34N,L178F,A179T和G121F)和缺失淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:14显示PMD96序列:在N33Y,D34N,G121F,G134R,A141P,I157L,S161A,L178F,A179T,G223E,H307L和S334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:15显示SSM381序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,146G,157L,161A,178F,179T,223E,307L和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:16显示SSM279B1序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157M,161A,178F,179T,223E,307L和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:17显示SSM237P2序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,158T,161A,178F,179T,223E,307L和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:18显示在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,198W,223E,307L和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:19显示SSM325F3序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,229P,307L和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:20显示pMD129序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,198W,223E,229P,307L和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:21显示SSM341A9序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,303E,307L和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:22显示SSM341G11序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,303D,307L和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:23显示SSM350B11序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,306T,307L和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:24显示SSM350C12序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,306G,307L和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQID NO:25显示SSM332Q4序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,309P,307L和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:26显示SSM365B4序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,316S,和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQID NO:27显示SSM365F4:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,316P和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQ ID NO:28显示SSM360C7:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,334P和353T上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。
具体实施方式
在下列描述和实施例中，除非上下文另外规定，PS4变体多肽的剂量以每百万面粉中的部分/（微克每克）来给出。例如,表2中所用的“1D34”表示基于重量/重量的每百万中的1部分pSac-D34。优选地，利用Bradford(1976,A rapid and sensitive method for the quantification of microorganism quantitiesof protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal.Biochem.72:248-254)中所述的测定，基于作为以牛血清白蛋白（BSA）为标准测量的纯酶蛋白的等同物的活性测定来确定酶数量或量。
在描述通过本文生产或预期为本文所包括的不同PS4变体多肽变体中，将采用下列命名法以易于参照:
(i)在取代包括数字和字母时,例如,141P,则这指[根据编号系统的位置/取代氨基酸]。因此,例如,在位置141上氨基酸取代成脯氨酸表示为141P;
(ii)当取代包括字母时，数字和字母,例如,A141P,则这指[最初氨基酸/根据编号系统的位置/取代氨基酸]。因此,例如,在位置141上以脯氨酸取代丙氨酸表示为A141P。
在特定位置上可能有两种或多种取代物时，这将通过邻接的字母来表示，其可以任选地由斜线标记“/”来分隔,例如,G303ED或G303E/D。当在一定位置上的相关氨基酸能够由任何氨基酸取代时，这通过[根据编号系统的位置/X]来表示,例如,121X。
多个突变可以通过由斜线标记“/”分隔来表示，例如A141P/G223A代表在位置141和223上的突变，分别以脯氨酸取代丙氨酸和以丙氨酸取代甘氨酸。
除非另外指定,本文所用的全部技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton,等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,2D ED.,John Wiley and Sons,New York(1994),和Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)向本领域技术人员提供本发明中所用到的许多术语的通用辞典。尽管可以将与本文所述那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料用于本发明的实践或测试中，还是描述了优选的方法和材料。数字范围包括定义范围的数字。除非另外指定,分别地，核酸以5'到3'方向从左到右书写;氨基酸序列以氨基到羧基方向从左到右书写。
除非另外指定,本发明的实践将采用，化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学常规技术，其在本领域普通技术人员的能力之内。这些技术在文献中得以解释。见,例如,J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Books1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel,F.M.等人(1995and periodicsupplements;Current Protocols in Molecular Biology,ch.9,13,and16,JohnWiley&Sons,New York,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn,1996,DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons;J.M.Polakand James O’D.McGee,1990,In Situ Hybridization:Principles and Practice;Oxford University Press;M.J.Gait(Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach,Irl Press;D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg,1992,Methodsof Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNAMethods in Enzymology,Academic Press;Using Antibodies:A LaboratoryManual:Portable Protocol NO.I by Edward Harlow,David Lane,Ed Harlow(1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN0-87969-544-7);Antibodies:A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor),David Lane(Editor)(1988,ColdSpring Harbor Laboratory Press,ISBN0-87969-314-2),1855,Lars-Inge Larsson“Immunocytochemistry:Theory and Practice”,CRC Press inc.,Baca Raton,Florida,1988,ISBN0-8493-6078-1,John D.Pound(ed);“ImmunochemicalProtocols,vol80”,in the series:“Method in Molecular Biology”,Humana Press,Totowa,New Jersey,1998,ISBN0-89603-493-3,Handbook of Drug Screening,edited by Ramakrishna seethala,Prabhavathi B.Fernandes(2001,New York,NY,Marcel Dekker,ISBN0-8247-0562-9);和Lab Ref:A Handbook of Recipes,Reagents,and Other Reference Tools for Use at the Bench,Edited Jane Roskamsand Linda Rodgers,2002,Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN0-87969-630-3。将这些一般性文本的每一篇都并入本文作为参考。
将本文中参考的所有专利和公开出版物，包括这些专利和公开出版物中公开的所有序列都并入本文作为参考。
PS4变体多肽
我们提供在一个或多个位置上具有取代的非产麦芽糖外切型淀粉酶，其带来相对于亲本酶的改变的特性，优选改变的外切特异性或改变的热稳定性，或二者都有。
我们进一步提供组合物,包括含有具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的多肽的食品添加剂、食品、烘焙产品、改良剂组合物、饲料产品包括动物饲料等，以及制备和利用这些多肽和组合物的方法。我们提供这些组合物如在制备去污剂、作为甜味剂、糖浆等中的其它用途。所述组合物包括多肽与至少一种其它组分。特别地，我们提供包含所述多肽的食品或饲料添加剂。
通过包括多个突变这些多肽和核酸区别于它们的亲本序列，并且为了方便称作“PS4变体多肽”。换句话说，PS4变体多肽或核酸的序列在多个位置或残基上有别于其亲本。在优选的实施方案中,突变包含氨基酸取代，即，一个氨基酸残基改变成另一个。PS4变体多肽在亲本序列的一个或多个位置上包含多个氨基酸残基性质的变化。
本文所用的术语“变体”应当用来意指可源自亲本分子的分子。变体包括多肽以及核酸。变体包括在一个或多个位置上的取代、插入、颠换和倒位等等。变体还包括截短。变体包括亲本分子的同源和功能性衍生物。变体包括与能够杂交本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。
PS4变体多肽的取代
我们提供具有序列改变化的PS4变体多肽，所述多肽包含非产麦芽糖外切型淀粉酶序列中的氨基酸取代。相对于SEQ ID NO:1中所示的嗜糖假单胞菌（Pseudomonas saccharophilia）外切型淀粉酶序列的位置编号，氨基酸取代可以是在位置26,70,121,145,146,157,158,161,188,198,223,229,272,303,306,309,316,339和353的其中一个或多个上。
氨基酸突变可以是在选自下组的一个或多个位置上:(a)位置121,161,223;(b)位置146,157,158,198,229,303,306,309,316,353;和(c)位置26,70,145,188,272,339;以及(a)、(b)和(c)的任意组合。
氨基酸取代可以包含对121F,121Y,121W,161A,223E,223K的改变。或者，或此外，氨基酸取代可以包含对146G,146M,157M,158T,158A,158S,198W,198F,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P,316K,316Q,353T的改变。还或者，或此外，氨基酸取代可以包含对26E,70D,1145D,188S,188T,188H,272Q,339A,339E的改变。
这些变体多肽在本文中称为“PS4变体多肽”。还公开了编码这些变体多肽的核酸并且为了方便将称作“PS4变体核酸”。PS4变体多肽和核酸将在下面更详细地描述。
“亲本”序列,即，PS4变体多肽和核酸以其为基础的序列,优选是具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的多肽。应当相应地解释术语“亲本酶”和“亲本多肽”，并用来意指PS4变体多肽以其为基础的酶和多肽。下面对它们作更详细地描述。
在特别优选的实施方案中,亲本序列是非产麦芽糖外切型淀粉酶,优选细菌非产麦芽糖外切型淀粉酶。在高度优选的实施方案中,亲本序列包含葡聚糖1,4-α-麦芽糖四水解酶（麦芽糖四水解酶）(EC3.2.1.60)。优选地，亲本序列可源自假单胞菌属菌种,例如嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌。
在一些实施方案中,亲本多肽包含,或与例如,来自假单胞菌属的种（spp.）的野生型非产麦芽糖外切型淀粉酶序列同源。
因而,亲本多肽可以包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的嗜糖假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶。在其它优选的实施方案中,亲本多肽包含具有如SEQ ID NO:11所示序列的来自施氏假单胞菌的非产麦芽糖外切型淀粉酶,或具有SWISS-PROT编号P13507的施氏假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶。
在另一方面,亲本多肽可以是任何野生型序列的变体，也就是说，亲本多肽可以自身进行工程化改造，或包含PS4变体多肽。
不过,对于熟练读者将会显而易见的是尽管PS4变体多肽可以通过突变已经突变过的序列而衍生，但有可能通过起始自野生型序列(或事实上任何合适的序列)，鉴定起始序列与所需变体之间的差异，以及将需要的突变导入起始序列中以便获得所需的变体来构建这些变体多肽。
涉及、优选与如SEQ ID NO:1所示的嗜糖假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶序列或与如SEQ ID NO:11所示序列的施氏假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶具有序列或功能同源性的蛋白质和核酸在本文中称作“PS4家族”成员。下面进一步详细地披露适用于生成PS4变体多肽和核酸的“PS4家族”非产麦芽糖外切型淀粉酶的例子。
本文描述的PS4变体多肽优选保留亲本多肽的特征，并且另外优选具有其它有益特性，例如，增强的活性或热稳定性、或pH耐受性、或任意组合(优选全部)。下面对这进行更详细的描述。
这里描述的PS4取代突变体可以用作任意合适的目的。它们可以优选用于适于亲本酶的目的。特定地，它们可以用于任何使用外切型麦芽糖四水解酶的应用中。在高度优选的实施方案中,它们具有较高热稳定性，或较高外切型淀粉酶活性或较高pH稳定性，或任意组合的额外优点。PS4变体多肽和核酸的适当用途的例子包括食品生产，特别是烘焙，以及食物生产；下面更详细地列出其它例子。
除了上面给出的那些位置之外，PS4变体多肽可以包含一个或多个其它突变。除了已经给出那些的之外还可以有一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个或更多的突变优选取代。还可以在一个或多个其它位置上包括其它突变,如缺失、插入、取代、颠换、转换和倒位。此外，PS4变体不必在列出的位置上具有全部取代。事实上，它们可以缺失一个，两个，三个，四个，或五个取代，即，野生型氨基酸残基存在于这些位置上。
基于野生型序列的PS4变体多肽
在亲本多肽包含野生型序列的实施方案中,PS4变体多肽可以包含野生型序列，但是在位置121,161和223,优选121F,121Y,121W,161A,223E或223K,更加优选G121F,G121Y,G121W,S161A,G223E或G223K的一个或多个上具有突变。
PS4变体多肽可以包含野生型序列,或在前段落中给出的序列，但是在位置146,157,158,198,229,303,306,309,316或353,优选146G,146M,157M,158T,158A,158S,198W,198F,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P,316K,316Q或353T,更加优选146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T的一个或多个上具有突变。
PS4变体多肽可以包含野生型序列,或在前两段中给出的序列，但是在位置26,70,145,188,272或339,优选26E,26D,70D,145D,188S,188T,188H,272Q,339A或339E,更加优选N26E,N26D,G70D,N145D,G188S,G188T,G188H,H272Q,W339A或W339E的一个或多个上具有突变。
通常，位置的任意组合,取代和特定突变可以任意方式和以任意数目组合以产生本文公开的PS4变体多肽。
因而,我们公开了基于野生型PS4亲本序列的PS4变体多肽,优选地，具有如SEQ ID NO:1所示序列的嗜糖假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶。因而,PS4变体多肽可以包含SEQ ID NO:1中所示的序列，但是在上面给出的位置上具有任何一种或多种突变。PS4变体多肽还可以基于如下面SEQID NO:7所示的野生型施氏假单胞菌非产麦芽糖酶序列，但是在上面给出的位置上具有任何一种或多种突变。
尽管PS4变体多肽可以基于野生型PS4亲本序列,在优选的实施方案中PS4变体多肽是基于野生型PS4亲本序列的工程化改造（或突变的）版本。因而,在这些实施方案中,亲本序列包含已经突变的PS4序列。如下面更加详细地描述的，可以重新或通过一次或多次突变碱基序列制备这些序列。
位置121,161和/或223
PS4变体多肽可以包含野生型序列,或作为野生型序列变体的突变序列，如在又一个位置如121,161和223上具有取代的已经突变的序列。
因而,在相应一个或多个位置上的一个或多个目标突变一般可以与位置121,161或223中的一个、两个或所有位置上的单个其它突变有益地组合。
位置121取代,在存在时,优选选自下组:121F,121Y,121W,121H,121A,121M,121G,121S,121T,121D,121E,121L,121K和121V。优选地，位置121取代是121F,121Y或121W。位置161取代,在存在时,优选是161A,更加优选S161A。当位置161被突变时,在位置160上的其它突变也可以存在,优选160D,更加优选E160D。
位置223取代,在存在时,优选选自下组:223K,223E,223V,223R,223A,223P和223D。更加优选地，223取代是223E或223K。在特别优选的实施方案中,其它一个或多个取代选自下组:G121F,G121Y,G121W,161A,223E和223K。
在特别优选的实施方案中,PS4变体多肽至少包含三个下列的取代121F/Y/W,161A,223E/K。可以包括如下面所给出的其它突变。
位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353
PS4变体多肽可以包含野生型序列,或作为野生型序列变体的突变体序列,如已经突变了的序列–包括在位置121,161和223中的一个或多个上具有突变的PS4变体多肽。在另一个位置如位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353上具有取代。
位置26,70,145,188,272和339
PS4变体多肽可以包含野生型序列，或作为野生型序列变体的突变体序列,如已经突变了的序列—包括在位置121,161,223,146,157,158,198,229,303,306,309,316和353中的一个或多个上具有突变的PS4变体多肽…在另一个位置如26,70,145,188,272和339上具有取代。
因而,在相应一个或多个位置上的一个或多个目标突变一般可以与位置26,70,145,188,272和339中的一个、两个或所有位置上的单个其它突变有益地组合。
PS4变体多肽可以在位置26上包含取代,优选26E或26E。更加优选地，位置26取代包含N26E或N26D。最优选地，位置26取代包含N26E。
PS4变体多肽可以在位置70上包含取代,优选70D。更加优选地，位置26取代包含G70D。
PS4变体多肽可以在位置145上包含取代,优选145D。更加优选地，位置145取代包含N145D。
PS4变体多肽可以在位置188上包含取代,优选188S,188T或188H。更加优选地，位置188取代包含G188S,G188T或G188H。最优选地，位置188取代包含G188S或G188H。
PS4变体多肽可以在位置272上包含取代,优选272Q。更加优选地，位置272取代包含H272Q。
PS4变体多肽可以在位置W339A上包含取代,优选339A或339E。更加优选地，位置339取代包含W339A或W339E。
基于变体序列的PS4变体多肽
与位置33,34,121,134,141,157,178,179,223,307和/或334的组合
在一些实施方案中,亲本序列在位置33,34,121,134,141,157,178,179,223,307和334中的一个或多个，优选全部位置上包含突变(因此PS4变体多肽也将包含有关相应的突变)。
在这些实施方案中,突变优选为:N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P中的一个或多个，优选全部。
在这些实施方案中,PS4变体多肽可以便利地衍生自包含序列PSac-D34(SEQ ID NO:2)的嗜糖假单胞菌非产麦芽糖酶序列。
与位置33,34,121,134,141,157,178,179,223,307和334,121,161和/或223的组合
PS4变体多肽可以进一步包含位置33,34,121,134,141,157,178,179,223,307和334中任一个上的突变，组合以位置121,161和/或223中任一个上的突变。因而,我们公开了包含以下的任意组合的PS4变体多肽:(a)在残基33,34,121,134,141,157,178,179,223,307和334上的任意一个或多个突变,优选N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;(b)在位置121,161或223上的任意一个或多个突变,优选121F,121Y,121W,161A,223E或223K,更加优选121F,161A或223E,和(c)在位置146,157,158,198,229,303,306,309,316或353上的任意一个或多个突变,优选146G,146M,157M,158T,158A,158S,198W,198F,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P,316K,316Q或353T,更加优选146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T。
在一些优选的实施方案中,我们提供这样的PS4变体多肽，其包含上面(a)中给出的所有下列突变，组合以上面(c)中给出的一个或多个突变。在其它优选的实施方案中,我们提供这样的PS4变体多肽，其包含上面(a)中给出的所有下列突变，组合以上面(b)中给出的所有突变，组合以上面(c)中给出的任一个或多个突变。
基于pMD96的PS4变体多肽
在包括所有(a)和(b)中突变的实施方案中，PS4变体多肽可以便利地衍生自包含序列pMD96(SEQ ID NO:14)的嗜糖假单胞菌非产麦芽糖酶序列。
因而,我们具体地提供了实施例12到20中给出的PS4变体多肽,其具有序列SEQ ID NO:15-28。如实施例中所示，与其亲本相比每一种这些多肽都具有一种或多种改进的特性。
其它组合
另外,还可以使用在其它位置,例如,134,141,157,223,307和334中的任一个或多个上包含突变的亲本序列。任选地,这些可以包括位置33和34中的一个或两个上的突变。
因而,亲本序列可以包含在选自下组:134,141,157,223,307,334的位置上的一个或多个突变,和任选地33和34(因此当然PS4变体多肽也将包含有关的相应突变)。
在一些实施方案中,亲本多肽包含取代位置134上的精氨酸，位置141上的脯氨酸和位置334上的脯氨酸,例如,G134R,A141P和S334P。
在另外的实施方案中,亲本多肽进一步包含位置121上的突变。亲本多肽可以进一步包含位置178上的突变。它可以进一步包含位置179上的突变。它还可以进一步包含位置87上的突变。各自特别优选的取代优选为121D,更加优选G121D,优选178F,更加优选L178F,优选179T,更加优选A179T和优选87S,更加优选G87S。
这些位置上的残基可以被许多残基所取代,例如I157V或I157N或G223L或G223I或G223S或G223T或H307I或H307V或D34G或D34A或D34S或D34T或A179V。不过,亲本多肽优选包含取代I157L,G223A,H307L,L178F和A179T(任选地N33Y,D34N)。
在高度优选的实施方案中,PS4变体多肽包含位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353中的任一个或多个位置上的取代,优选146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T,以及一个或多个下列取代:G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,N33Y和D34N,以及L178F和A179T中的一个或两个。
基于PSac-D20的PS4变体多肽
PS4变体可以基于嗜糖假单胞菌非产麦芽糖亲本酶序列PSac-D20(SEQ ID NO:3)。
在这种实施方案中,PS4变体多肽包含位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353中的任一个或多个位置上的取代,优选146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T,以及一个或多个下列取代:G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,N33Y,D34N和G121D,以及L178F和A179T中的一个或两个。
基于PSac-D14的PS4变体多肽
PS4变体可以基于嗜糖假单胞菌非产麦芽糖亲本酶序列PSac-D14(SEQ ID NO:4)。
在这种实施方案中,因此PS4变体多肽包含位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353中的任一个或多个位置上的取代,优选146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T,以及一个或多个下列取代:G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,N33Y,D34N,G121D和G87S,以及L178F和A179T中的一个或两个。
基于pMD55的PS4变体多肽
PS4变体可以基于嗜糖假单胞菌非产麦芽糖亲本酶序列pMD55(SEQID NO:13).
在这种实施方案中,PS4变体多肽包含位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353中的任一个或多个位置上的取代,优选146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T,以及一个或多个下列取代:G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,N33Y,D34N,G121F和G87S,以及L178F和A179T中的一个或两个。PS4变体多肽可以衍生自具有这种取代的亲本多肽。
基于施氏假单胞菌亲本多肽的PS4变体多肽
在一些实施方案中,PS4变体源自施氏假单胞菌非产麦芽糖酶序列,优选如下面SEQ ID NO:7所示。
因此,PS4变体多肽可以衍生自序列PStu-D34(SEQ ID NO:8)。我们进一步公开了基于施氏假单胞菌非产麦芽糖酶序列并包括G121和/或G87取代的PS4变体多肽。这些可以包含下列取代:G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,N33Y,D34N和G121D,以及L178F和A179T中的一个或两个,以及包含下列取代的PS4变体多肽:G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,N33Y,D34N,G121D和G87S,以及L178F和A179T中的一个或两个。
所以,PS4变体多肽可以源自施氏假单胞菌非产麦芽糖酶亲本序列,所述亲本序列具有序列PStu-D20(SEQ ID NO:9),其包含G121D，或具有序列PStu-D14(SEQ ID NO:10),其进一步包含G87S。
PS4变体核酸
我们还描述了具有对应于或编码PS4变体多肽序列中变化的序列的PS4核酸,用于为了这里描述的目的来生产这些多肽。因而,我们提供能够编码本文中给出的任意多肽序列的核酸。
技术人员将会意识到核酸序列与多肽序列之间的关系，特别是，遗传密码以及这种密码的简并性，并且将能够毫不困难地构建这些PS4核酸。例如,他将会意识到对于PS4变体多肽序列中的每个氨基酸取代,都可以有一个或多个密码子编码取代氨基酸。因此,将会显而易见的是，取决于该特定氨基酸残基的遗传密码简并性，对应于该PS4变体多肽序列可以生成一种或多种PS4核酸序列。另外,当PS4变体多肽包含一种以上的取代时,例如A141P/G223A,对应的PS4核酸可以包含分别编码两种氨基酸变化的密码子的成对组合。
PS4变体核酸序列可以衍生自编码上述任意亲本多肽的亲本核酸。特别地，亲本核酸可以包含野生型序列,例如,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12。所以PS4变体核酸可以包含编码野生型非产麦芽糖外切型淀粉酶的核酸,但其在相应的位置上编码另一种氨基酸而非野生型氨基酸残基。PS4变体核酸序列还可以包含具有一个或多个突变的野生型序列,例如,其编码上述归于“组合”之下的亲本多肽。
将会理解的是与特定PS4变体核酸序列不同，但涉及这些的核酸序列，也将可用于本文所述的方法和组合物，如PS4变体核酸序列的变体、同源物、衍生物或片段，或其能够杂交的补体或序列。除非本文另外规定，术语“PS4变体核酸”应当用来包括上面列出的这些实体的每一种。
可以通过多种本领域已知若干技术中的任一种来制成氨基酸序列和核酸序列中的突变。通过任一种已知诱变技术可以轻易制成变体序列,例如,利用PCR以适当的寡核苷酸引物进行的定点诱变，5′添加突变，错配引物突变等。或者，或此外，PS4变体核酸序列可以重新制备。
在特别优选的实施方案中,如实施例中所说明的，通过使用适当引物的PCR(聚合酶链式反应)将突变引入亲本序列。如所述的，所以有可能通过将任意所需的氨基酸取代导入优选具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的亲本多肽中来改变多肽序列,如在氨基酸或核酸水平上导入嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌外切型淀粉酶序列。我们介绍了通过改变编码非产麦芽糖外切型淀粉酶的核酸序列来改变非产麦芽糖外切型淀粉酶序列的方法。
不过,当然将会理解的是PS4变体多肽并不需要实际上源自野生型多肽或核酸序列，例如，通过一步步的突变。相反，一旦确定了PS4变体多肽的序列，技术人员就能够轻易地通过本文已知的方法，例如，使用合适的寡核苷酸引物和PCR，由野生型制成具有所有突变的序列。事实上，可以通过，例如，肽合成方法来从头制成具有其所有突变的PS4变体多肽。
不过,通常PS4变体多肽和/或核酸衍生自或可以衍生自“前体”序列。本文所用的术语“前体”意指在根据本文所述方法修饰的酶和这里所描述的组合物之前的酶。所以前体包括用来产生经修饰的酶的酶。因而,前体可以是通过本文中其它任何地方所述的诱变进行修饰的酶。同样地，前体可以是野生型酶,变体野生型酶或已经突变过的酶。
可以通过本领域已知的任何方法来产生PS4变体多肽和核酸。具体地，它们可以由表达系统进行表达，所述表达系统性质上可以是体外或体内的。具体地，我们介绍了含有PS4核酸序列的质粒和表达载体，优选能够表达PS4变体多肽。还公开了包含以及优选用这些PS4核酸、质粒和载体转化的细胞和宿主细胞，并且应当清楚这些也包括在本文中。
在优选的实施方案中,将PS4变体多肽序列以分离的形式用作食品添加剂。术语“分离的”意指该序列至少基本上不含一种其它组分，所述其它组分在自然界中与该序列天然相关联并在自然中发现。在一方面，优选该序列为纯化的形式。术语“纯化的”意指该序列处于相对纯的状态—例如至少大约90%纯,或至少大约95%纯或至少大约98%纯。
位置编号
本文中通过编号提及的所有位置都参照下面所示的嗜糖假单胞菌外切型淀粉酶参照序列(SEQ ID NO:1)的编号:
该参照序列源自具有SWISS-PROT编号P22963的嗜糖假单胞菌序列，但没有信号序列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA。
C-末端淀粉结合结构域EGGLVNVNFR CDNGVTQMGDSVYAVGNVSQ LGNWSPASAV RLTDTSSYPT WKGSIALPDGQNVEWKCLIR NEADATLVRQ WQSGGNNQVQ AAAGASTSGS F可以任选地舍弃。或者，也可以包括它。
在本说明书的上下文中采用PS4外切型淀粉酶中氨基酸残基位置的特定编号方法。在这一方面，通过各种已知外切型淀粉酶的氨基酸序列比对有可能清楚地将外切型淀粉酶氨基酸位置编号指定到任何外切型淀粉酶中的任何氨基酸残基位置，所述任何外切型淀粉酶的氨基酸序列是已知的。利用这种起源自例如获自嗜糖假单胞菌的外切型淀粉酶氨基酸序列的编号系统，与多种其它已知的外切型淀粉酶氨基酸序列比对，有可能清楚地指出外切型淀粉酶中氨基酸残基的位置。
所以，所述编号系统，即使它可以使用特异性序列作为基本参照点，也能够应用于所有相关的同源序列。例如,所述位置编号方法可以应用于来自其它假单胞菌属菌种的同源序列，或来自其它细菌的同源序列。优选，这种同源序列与上述参照序列SEQ ID NO:1、或具有SWISS-PROT编号P22963或P13507的序列，优选与所有这些序列具有60%或更大的同源性,例如70%或更大,80%或更大,90%或更大或95%或更大的同源性。可以利用公知的比对程序和本文所述的杂交方法确定蛋白质之间的序列同源性。这些同源性序列,以及下面所述的功能性等同物，将在本文中称作“PS4家族”。
另外，如上所述，用于本文中的编号系统参照于参照序列SEQ ID NO:1,其源自具有SWISS-PROT编号P22963的假单胞菌属序列,但没有信号序列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA。这种信号序列位于参照序列的N端并且由21个氨基酸残基组成。因此,将可以轻易鉴定包含信号序列的相应序列中待突变或取代的特定残基，或事实上，相应的序列包含任何其它N-或C-端延伸或缺失。关于N端添加或缺失，所需的是用插入或缺失的残基数目来偏移位置编号。例如,SEQ ID NO:1中的位置1对应于具有信号序列的序列的位置22。
亲本酶/多肽
PS4变体多肽源自于称为“亲本酶”,“亲本多肽”或“亲本序列”的另一种序列，或是其变体。
本文所用的术语“亲本酶”意指具有与所得变体，即PS4变体多肽或核酸相近似，优选最近似的化学结构的酶。亲本酶可以是前体酶(即实际上被突变的酶)或者可以从头制备它。亲本酶可以是野生型酶,或者它可以是包含一个或多个突变的野生型酶。
本文所用的术语“前体”意指在被修饰以产生酶的酶之前的酶。因而,前体可以是通过诱变来修饰的酶。同样地,前体可以是野生型酶、变体野生型酶或已经突变了的酶。
术语“野生型”是被技术人员理解的技术术语并且意指一种表型，它具有天然发生的菌种大多数成员的特征并且与突变体表型明显不同。因而,在本文中，野生型酶是在相关菌种的大多数成员中天然发现的酶的形式。通常，就序列同源性而言与本文所述变体多肽相关的相关野生型酶是关系最近的对应野生型酶。不过，当特定野生型序列被用作生产本文所述变体PS4多肽的基础时，这将是对应的野生型序列，而不论就序列同源性而言是否存在另一种关系更近的野生型序列。
亲本酶优选是优选显示非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的多肽。优选地，亲本酶是非产麦芽糖外切型淀粉酶本身。例如,亲本酶可以是嗜糖假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶,如具有SWISS-PROT编号P22963的多肽,或施氏假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶,如具有SWISS-PROT编号P13507的多肽。
PS4家族的其它成员可以用作亲本酶;一般这种“PS4家族成员”将与这两种酶中的任一种类似、同源、或在功能上等同，并且可以通过标准方法，如利用探针进行的合适文库的杂交筛选，或通过基因组序列分析来进行鉴定。
特定地,这两种酶中任一种的功能性等同物，以及“PS4家族”的其它成员也可以用作生成如本文所述的PS4变体多肽的起点或亲本多肽。
蛋白质的“功能性等同物”意指共有该蛋白质的一种或多种，优选基本上所有的功能的东西。优选地，这些功能是生物学功能,优选酶学功能,如淀粉酶活性,优选非产麦芽糖外切型淀粉酶活性。关于亲本酶,术语“功能性等同物”优选意指与亲本分子具有相似或相同功能的分子。亲本分子可以是嗜糖假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶或施氏假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶或获自其它来源的多肽。
关于作为嗜糖假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶,如具有SWISS-PROT编号P22963的多肽,或施氏假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶,如具有SWISS-PROT编号P13507的多肽的亲本酶，术语“功能性等同物”意指所述功能性等同物可以获自其它来源。在功能上等同的酶可以具有不同的氨基酸序列但将具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性。确定功能性的测定的例子在本文中进行介绍并且是本领域技术人员已知的。
在高度优选的实施方案中,功能性等同物将具有与上面提及的嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶的任一种，优选两种的序列同源性。所述功能性等同物还可以与SEQ ID NOs:1-14所示任何序列,优选SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7或二者具有序列同源性。在这些序列之间的序列同源性为优选至少60%,优选65%或更大,优选75%或更大,优选80%或更大,优选85%或更大,优选90%或更大,优选95%或更大。这些序列同源性可以通过本领域已知的多种计算机程序中的任一种生成，例如BLAST或FASTA,等等。用于实施这种比对的合适计算机程序是GCG WisconsinBestfit软件包(University of Wisconsin,U.S.A;Devereux等人,1984,NuceicAcids Research12:387)。用于进行序列比较的其它软件的例子包括，但不限于，BLAST软件包(见Ausubel等人,1999ibid–18章),FASTA(Atschul等人,1990,J.Mol.Biol.,403-410)和GENEWORKS系列比较工具组。BLAST和FASTA都可以用于脱机和网上搜索(见Ausubel等人,1999ibid,7-58到7-60页)。不过优选使用GCG Bestfit程序。
在其它实施方案中,所述功能性等同物将能够特异性杂交到上面给出的任一种序列上。确定一个序列是否能够杂交到另一个的方法是本领域已知的，并且描述于例如Sambrook,等(同上)和Ausubel,F.M.等人(同上)中。在高度优选的实施方案中,功能性等同物将能够在严格条件下杂交,例如65℃和0.1xSSC{1xSSC=0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠pH7.0}。
例如,与嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶具有序列同源性的功能性等同物适合用作亲本酶。这些序列可以在任何一个或多个位置上不同于嗜糖假单胞菌序列。另外,来自假单胞菌属（Pseudomonasspp）其它菌株的非产麦芽糖外切型淀粉酶,如ATCC17686,也可以用作亲本多肽。PS4变体多肽残基可以插入到这些亲本序列的任一个中以生成变体PS4多肽序列。
将会理解的是当需要PS4变体多肽另外包含一个或多个上面列出的突变时，相应的突变可以在假单胞菌属（Pseudomonas spp）非产麦芽糖外切型淀粉酶的功能性等同物,以及“PS4家族”其它成员的核酸序列中制得，以便它们可以用作生成如本文所述的PS4变体多肽的起点或亲本多肽。
具体包括在术语“PS4变体多肽”内的是下列文件公开的多肽:
US60/485,413,60/485,539和60/485,616;PCT/US2004/021723和PCT/US2004/021739;US10/886,905和10/866,903;US60/608,919;US60/612,407;US60/485,539;PCT/IB2004/002487;US10/886,023;US10/886,505,US10/886,527和US10/886,504;US10/947,612。
这些多肽适用于本文所述的应用，特别是，作为食品添加剂,如所述来处理淀粉，以制备食品产品，制作烘焙产品，用于配制改良剂组合物，用于组合的配制等等。
亲本序列的修饰
可以在氨基酸水平或核酸水平上修饰亲本酶以生成本文所述的PS4变体序列。所以我们通过将一种或多种相应的密码子变化导入编码非产麦芽糖外切型淀粉酶多肽的核苷酸序列中来生成PS4变体多肽。
核酸编号应当优选参照如SEQ ID NO:6所示的嗜糖假单胞菌外切型淀粉酶核苷酸序列的位置编号。备选地，或此外，可以参照具有GenBank编号X16732的序列。在优选的实施方案中,核酸编号应当参照如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。不过,对于氨基酸残基编号，这种序列的残基编号仅仅是为了参考的目的而使用。特别地，将会理解的是可以在任何PS4家族核酸序列中制成以上密码子改变。例如,可以对嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶核酸序列(例如,X16732,SEQ ID NO:6或M24516,SEQ ID NO:12)制作序列改变。
亲本酶可以包含“完全”酶,即,具有它的自然发生的（或突变的）完整长度,或者它可以包含其截断形式。源自这些的PS4变体可以相应如此进行截断，或是“全长的”。截断可以在N末端，或C末端，优选C末端。亲本酶或PS4变体可以缺乏一个或多个部分，如亚序列,信号序列,结构域或部分,无论是具有活性或不具活性的等。例如,如上所述，亲本酶或PS4变体多肽可以缺乏信号序列。备选地，或此外，亲本酶或PS4变体可以缺乏一个或多个催化或结合结构域。
在高度优选的实施方案中,亲本酶或PS4变体可以缺乏存在于非产麦芽糖外切型淀粉酶中的一个或多个结构域,如淀粉结合结构域。例如,相对于如SEQ ID NO:1所示的嗜糖假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶的编号，PS4多肽可以只具有多至位置429的序列。要注意这是PS4变体pSac-d34,pSac-D20和pSac-D14的情况。
在其它实施方案中,亲本酶或PS4变体可以包含“完全”酶,即,具有它的自然发生的（或突变的）完整长度,以及在N末端或C末端上的一个或多个额外的氨基酸序列。例如,亲本酶或PS4变体多肽可以包含在C末端或N末端上的单一额外氨基酸残基,例如,M,A,G,等。优选地，额外的氨基酸残基存在于N末端上。当包括一个或多个额外残基时，位置编号将通过增加长度而偏移。
淀粉酶
PS4变体多肽一般包含淀粉酶活性。
以其正常意义来使用术语“淀粉酶”—例如除其它之外能够催化淀粉降解的酶等等。特别地它们是能够切割淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。
淀粉酶是分类为水解酶的淀粉降解酶，其切割淀粉中的α-D-(1→4)O-糖苷键。一般，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1,α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶(glucanglucanohydrolase)被定义为以随机方式切割淀粉分子内α-D-(1→4)O-糖苷键的进行内切作用的酶。相反地，进行外切作用淀粉水解酶,如β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2,α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶),以及一些产物特异性淀粉酶如产麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)由底物的非还原性末端切割淀粉分子。β-淀粉酶,α-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.20,α-D-葡萄糖苷葡糖水解酶),葡萄糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3,α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶),和产物特异性淀粉酶能够由淀粉产生特异性长度的麦芽糖寡糖。
非产麦芽糖外切型淀粉酶
本文中所述的PS4变体多肽源自优选显示非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的多肽(或是其变体)。优选地，这些亲本酶本身是非产麦芽糖外切型淀粉酶。在高度优选的实施方案中PS4变体多肽本身也显示非产麦芽糖外切型淀粉酶活性。
在高度优选的实施方案中,本文中所用的术语“非产麦芽糖外切型淀粉酶”应当用来意指如根据本文中所述产品测定方法所分析的、该酶开始并不将淀粉降解为实质量的麦芽糖。
在高度优选的实施方案中,非产麦芽糖外切型淀粉酶包含外切麦芽糖四水解酶。外切型麦芽糖四水解酶（exo-maltotetrahydrolase）(E.C.3.2.1.60)更正式地称为葡聚糖1,4-α-麦芽糖四水解酶。这种酶水解淀粉多糖中的1,4-α-D-糖苷键从而由非还原性链末端去除连续性麦芽四糖（maltotetraose）残基。
在美国专利号6,667,065中详细描述了非产麦芽糖外切型淀粉酶,特此并入作为参考。
非产麦芽糖外切型淀粉酶活性测定
利用下列系统表征具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的多肽，其适于根据本文所述的方法和组合物的应用。这种系统可以例如用于表征本文所述的PS4亲本或变体多肽。
通过起始背景信息的方式，蜡质(waxy)玉米支链淀粉(WAXILYS200，由Roquette,法国获得)是具有极高支链淀粉含量（高于90%）的淀粉。将20mg/ml的蜡质玉米淀粉在50mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸),2mM氯化钙,pH6.0中煮沸3分钟并且随后于50℃温育并在半小时内使用。
一个单位的非产麦芽糖外切型淀粉酶被定义为这样的酶量，当在试管中于50℃温育时，其每分钟释放等同于1μmol还原性糖的水解产物，所述试管具有4ml如上所述制备的在50mM MES,2mM氯化钙,pH6.0中的10mg/ml蜡质玉米淀粉。利用麦芽糖作为标准并且利用Bernfeld,MethodsEnzymol.,(1954),1,149-158的二硝基水杨酸方法或本领域已知的用于量化还原性糖的另一种方法来测量还原性糖。
通过在试管中于50℃将0.7单位的非产麦芽糖外切型淀粉酶温育15或300分钟来测定非产麦芽糖外切型淀粉酶的水解产物模式，所述试管具有4ml如上所述制备的缓冲液中的10mg/ml蜡质玉米淀粉。通过将试管浸入沸水浴中3分钟终止反应。
通过阴离子交换HPLC对水解产物进行分析和量化，所述HPLC利用Dionex PA100柱，以醋酸钠，氢氧化钠和水作为洗脱液，进行脉冲安培计检测，并以从葡萄糖到麦芽七糖的已知线性麦芽糖寡糖作为标准。用于maltooctaose到maltodecaose的反应因子是对于麦芽七糖发现的反应因子。
优选地，PS4变体多肽具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性，从而如果0.7单位量的所述非产麦芽糖外切型淀粉酶在50℃的温度下于pH6.0在4ml的10mg预煮沸蜡质玉米淀粉每ml缓冲溶液中温育15分钟的话，所述缓冲溶液包含50mM2-(N-吗啉代)乙烷磺酸和2mM氯化钙，那么该酶将产生这样的水解产物，其将由一种或多种含两个到十个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽糖寡糖和任选的葡萄糖组成；从而至少60%,优选至少70%,更加优选至少80%和最优选至少85%重量比的所述水解产物将由从三个到十个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽糖寡糖组成，优选由从四个到八个D-吡喃葡糖基单位组成的线性麦芽糖寡糖组成。
为了易于参考，并且为了本发明的目的，0.7单位量的非产麦芽糖外切型淀粉酶在50℃的温度下于pH6.0在4ml的每ml缓冲溶液中10mg预煮沸蜡质玉米淀粉温育15分钟，所述缓冲溶液包含50mM2-(N-吗啉代)乙烷磺酸和2mM氯化钙的特征可以称为“蜡质玉米淀粉温育试验”。
因而,换句话说,优选的是非产麦芽糖外切型淀粉酶的PS4变体多肽的特征是在蜡质玉米淀粉温育试验中具有产生水解产物的能力，所述水解产物将由一种或多种从两个到十个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽糖寡糖和任选的葡萄糖组成；从而至少60%,优选至少70%,更加优选至少80%和最优选至少85%重量比的所述水解产物将由从三个到十个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽糖寡糖组成，优选由从四个到八个D-吡喃葡糖基单位组成的线性麦芽糖寡糖组成。
在淀粉温育试验中的水解产物可以包括一种或多种从两个到十个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽糖寡糖和任选的葡萄糖。在淀粉温育试验中的水解产物还可以其它的水解产物。然而，从三个到十个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽糖寡糖的重量百分比量是基于水解产物的量，所述水解产物由一种或多种从两个到十个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽糖寡糖和任选的葡萄糖组成。换句话说，从三个到十个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽糖寡糖的重量百分比量不是基于除了一种或多种从两个到十个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽糖寡糖和葡萄糖之外的水解产物的量。
水解产物可以通过任何合适的方法进行分析。例如，水解产物可以通过阴离子交换HPLC进行分析，所述HPLC利用Dionex PA100柱，进行脉冲安培计检测，并以，例如，从葡萄糖到麦芽七糖（maltoheptaose）的已知线性麦芽糖寡糖作为标准。
为了易于参考，并且为了本发明的目的，利用阴离子交换HPLC分析水解产物，所述HPLC利用Dionex PA100柱，进行脉冲安培计检测，并以从葡萄糖到麦芽七糖的已知线性麦芽糖寡糖作为标准的特征可以称作“通过阴离子交换进行分析”。当然，如刚才所示，其它分析性技术、以及其它特异性阴离子交换技术将足够。
因而,换句话说,优选的PS4变体多肽是具有非产麦芽糖外切型淀粉酶的多肽，从而它在蜡质玉米淀粉温育试验中具有产生水解产物的能力，所述水解产物将由一种或多种从两个到十个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽糖寡糖和任选的葡萄糖组成，所述水解产物能够通过阴离子交换进行分析；从而至少60%,优选至少70%,更加优选至少80%和最优选至少85%重量比的所述水解产物将由从三个到十个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽糖寡糖组成，优选由从四个到八个D-吡喃葡糖基单位组成的线性麦芽糖寡糖组成。
本文所用的术语“线性麦芽糖寡糖”以正常意义使用，意指通过α-(1→4)键连接的2-10个单位的α-D-吡喃葡萄糖。
在高度优选的实施方案中,当与亲本多肽比较时，优选当在相同条件下试验时，本文所述的PS4多肽具有改善的外切型淀粉酶活性,优选非产麦芽糖外切型淀粉酶活性。特别地，在高度优选的实施方案中,优选当在蜡质玉米淀粉试验中测量时，与其亲本比较，PS4变体多肽具有10%或更多,优选20%或更多,优选50%或更多的外切型淀粉酶活性。
可以通过任何合适的方法来分析水解产物。例如，水解产物可以通过阴离子交换HPLC进行分析，所述HPLC利用Dionex PA100柱，进行脉冲安培计检测，并以，例如，从葡萄糖到麦芽七糖的已知线性麦芽糖寡糖作为标准。
以正常的意义来使用本文所用的术语“线性麦芽糖寡糖”，意指通过α-(1→4)键连接的2-20个单位的α-D-吡喃葡萄糖。
改进的特性
当与其亲本酶相比时，本文所述的PS4变体优选具有改进的特性,如任何一种或多种改进的热稳定性,改进的pH稳定性,或改进的外切特异性。
特别地,PS4变体多肽在位置303上具有突变,例如,303E,303D,306T和306G具有提高的外切特异性。在位置146,157,158,198,229,(优选198和229二者),309,316,316和353中任意位置上具有突变的那些,例如,146G,157M,158T,198W,229P,(198W,229P),309P,316S,316P和353T显示改进的热稳定性。
不希望被任何特定理论所束缚，我们相信在特定位置上的突变对于包含这种突变的多肽的特性具有个别和累积的效应。
热稳定性和pH稳定性
优选地，PS4变体多肽是热稳定的;优选地，它比它的亲本酶具有更高的热稳定性。
所以我们提供当在相同条件下与亲本多肽或野生型多肽相比具有较高热稳定性的PS4变体多肽。具体地,我们提供在位置121,145,146,157,158,188,198,223,229,316,353中的任一个或多个上包含突变的PS4变体多肽,更加优选突变121A,121D,121F,121H,121M,121W,121Y,145D,146G,157M,158T,188H,188S,198W,223A,223E,223K,223R,223V,229P,316P,316S,353T中的任一种或多种。
在小麦和其它谷类中支链淀粉中的外部侧链处于DP12-19的范围中。因而,例如，通过所述具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的PS4变体多肽进行的支链淀粉侧链的酶水解，能够显著减少它们的结晶化趋势。
用于烘焙目的的小麦和其它谷类中的淀粉以淀粉颗粒的形式存在，其一般耐受淀粉酶的酶促攻击。因而淀粉修饰主要局限于受损的淀粉并且在生面团加工和初始烘焙过程中进展非常缓慢，直到在大约60C凝胶化作用起始。作为其结果只有具有高度热稳定性的淀粉酶才能够在烘焙过程中有效地修饰淀粉。并且一般来说淀粉酶的效力随着热稳定性的提高而提高。那是因为热稳定性越高则能够在烘焙过程中持续越长的有效作用时间，并且因而它将提供越好的抗陈化作用。
因此,当在其加工成食品产品的任何阶段加入到淀粉中时，例如，在烘焙成面包之前、之中或之后，本文所述的PS4变体多肽的使用都能够延迟或阻止或延缓凝陈（retrogradation）。下面更详细地公开这种用途。
本文所用的术语“热稳定的”涉及该酶在暴露于升高的温度后保留活性的能力。优选地，PS4变体多肽能够在从大约55℃到大约80℃或更高的温度上降解淀粉。适当地，该酶在暴露于高达大约95℃的温度后保留其活性。
通过其自身半寿期来测量诸如非产麦芽糖外切型淀粉酶的酶的热稳定性。因而,优选在从55℃到大约95℃的升高温度，优选在大约80℃，本文所述的PS4变体多肽相对于亲本酶具有延长了优选10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%,200%或更长的半寿期。
如本文所用,半寿期(t1/2)是在定义的热条件下一半酶活性被灭活所持续的时间(以分钟表示)。在优选的实施方案中,于80℃测定半寿期。优选地，将样品于80℃或更高温度上加热1-10分钟。随后通过本文所述的任何方法，通过测量残余淀粉酶活性来计算半寿期。优选地，如实施例中更详细描述的那样进行半寿期测定。
优选地，本文所述的PS4变体在烘焙期间是活性的并且在淀粉颗粒胶凝作用之中和之后水解淀粉，所述胶凝作用起始于大约55℃的温度。非产麦芽糖外切型淀粉酶越是热稳定则它具有活性的时间就越长并且因而它将提供越好的抗陈化作用。不过,在大约85℃温度以上的烘焙期间，可以发生酶失活。如果这发生了，非产麦芽糖外切型淀粉酶可以逐渐失活从而在烘焙过程后于最后的面包中基本上没有活性。所以优选地适于上述用途的非产麦芽糖外切型淀粉酶具有50℃以上98℃以下的优化温度。
本文所述的PS4变体的热稳定性可以通过利用蛋白质工程设计来进行改进以变得更加热稳定并且因而更加适合本文所述的用途；所以我们包括PS4变体的用途，所述PS4变体通过蛋白质工程设计进行了修饰以变得更加热稳定。
优选地，PS4变体多肽是pH稳定的;更加优选地，它比其同源亲本多肽具有更高的pH稳定性。本文所用的术语“pH稳定的”涉及该酶在广泛范围的pH上保留活性的能力。优选地，PS4变体多肽能够在从大约5到大约10.5的pH上降解淀粉。在一个实施方案中，可以通过测量酶在特异性pH条件中的半寿期来测定pH稳定性的程度。在另一个实施方案中,可以通过测量酶在特异性pH条件中的活性和特异性活性来测定pH稳定性的程度。特异性pH条件可以是从pH5到pH10.5的任何pH。
因而,当在相同条件下与亲本多肽相比时PS4变体多肽可以具有更长的半寿期，或更高的活性（根据测定）。当在相同pH条件下与其亲本多肽相比时PS4变体多肽可以具有10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%,200%或更长的半寿期。备选地，或此外，当在相同pH条件下与亲本多肽相比时它们可以具有这种更高的活性。
外切特异性
已知一些非产麦芽糖外切型淀粉酶可以具有某种程度的内淀粉酶活性。在一些情况下，这种类型的活性可能需要减弱或消除，因为内淀粉酶活性有可能通过产生由于分枝糊精聚集而带来粘性的面包心，负面影响最终面包产品的质量。
我们提供PS4变体多肽，当在相同条件下试验时与亲本多肽或野生型多肽相比其具有更高的外切特异性。具体地，我们提供PS4变体多肽，其在位置26,70,121,145,161,223,223,303,306,309,339,339中的任一个或多个上包含突变，更加优选突变26E,70D,121A,121D,121H,121M,121W,121Y,145D,161A,223A,223E,223K,223R,223V,303D,303E,306G,306T,309P,339A,339E的任何一种或多种。
通过测定总淀粉酶活性与总内淀粉酶活性的比率来有用地测量外切特异性。这种比率在本文中称作“外切特异性指数”。在优选的实施方案中,如果一种酶具有20或更高的外切特异性指数，即，它的总淀粉酶活性(包括外切型淀粉酶活性)比其内淀粉酶活性大20倍或更多，则该酶被认为是外切型淀粉酶。在高度优选的实施方案中，外切型淀粉酶的外切特异性指数是30或更高,40或更高,50或更高,60或更高,70或更高,80或更高,90或更高,或100或更高。在高度优选的实施方案中,外切特异性指数是150或更高,200或更高,300或更高,400或更高,500或更高或600或更高。
总淀粉酶活性和内淀粉酶活性可以通过本领域已知的任何方法进行测量。例如，总淀粉酶活性可以通过测定由淀粉底物中释放的还原性末端总数来进行测量。或者，在实施例中更详细地了介绍Betamyl测定的使用,并且为了方便，在实施例中测定的淀粉酶活性在表格中以术语“Betamyl单位”进行描述。
内淀粉酶活性可以使用Phadebas试剂盒(Pharmacia and Upjohn)进行测定。这使用蓝色标记的交联淀粉(标记以偶氮染料);只有淀粉分子中的内部切割才释放标记，而外部切割并不释放标记。可以通过分光光度测定法来测量染料的释放。因此，Phadebas试剂盒测量内淀粉酶活性,并且为了方便，这种测定的结果（在实施例中描述的）在本文中称作“Phadebas单位”。
所以，在高度优选的实施方案中,外切特异性指数以术语Betamyl单位/Phadebas单位表示，也称作“B/Phad”。
外切特异性还可以根据现有技术，例如，在我们的国际专利公开号WO99/50399中介绍的方法进行测定。这通过内淀粉酶活性与外切型淀粉酶活性之间比率的方式测量外切特异性。因而,在优选的方法，本文所述的PS4变体将具有小于0.5内淀粉酶单位(EAU)每单位的外切型淀粉酶活性。优选适合于根据本发明的用途的非产麦芽糖外切型淀粉酶具有小于0.05EAU每单位的外切型淀粉酶活性并且更加优选小于0.01EAU每单位的外切型淀粉酶活性。
本文所述的PS4变体将优选具有外切特异性，例如，通过如上所述外切特异性指数所测量的，这与它们是外切型淀粉酶是一致的。另外，当与它们所衍生的亲本酶或多肽相比，它们优选具有更高或增强的外切特异性。因而,例如,优选在相同条件下，当与它们的亲本多肽相比时，PS4变体多肽可以具有10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%,200%或更高的外切特异性指数。优选在相同条件下，当与它们的亲本多肽相比时，它们可以具有1.5x或更高,2x或更高,5x或更高,10x或更高,50x或更高,100x或更高。
PS4变体多肽和核酸的用途
PS4变体多肽,核酸,宿主细胞，表达载体等可以用于可以使用淀粉酶的任何应用中。特别地,它们可以用来取代任何非产麦芽糖外切型淀粉酶。它们可以用来补充淀粉酶或非产麦芽糖外切型淀粉酶活性,无论是单独或组合以其它已知的淀粉酶或非产麦芽糖外切型淀粉酶。
本文所述的PS4变体序列可以用在食品工业中的各种应用中—如在烘焙或饮料产品中，它们还可以用于其它应用中，如药物组合物，或甚至用于化学工业中。特别地,PS4变体多肽和核酸可用于各种工业应用中，包括烘焙(如WO99/50399中所公开的)和面粉标准化(体积增加或改良)中。它们可以用来由淀粉和其它底物生产麦芽四糖。
所以我们介绍了制备食品产品的方法，该方法包括:(a)获得非产麦芽糖外切型淀粉酶;(b)在本文给出的非产麦芽糖外切型淀粉酶的任何一个或多个位置上导入突变;(c)将得到的多肽与食品成分相混合。
PS4变体多肽可以用来提高烘焙产品如面包的体积。尽管不希望被任何特定理论所束缚，我们相信这缘自作为外切型淀粉酶缩短直链淀粉分子的结果加热(如烘焙)过程中生面团粘性的降低。这使得由发酵生成的二氧化碳能够以较小的阻碍提高面包的体积。
因而,当与未进行过这种处理，或以亲本多肽处理的产品相比，包含PS4变体多肽或用其处理的食品的体积增大。换句话说，该食品具有更大体积的空气/食品体积。备选地，或此外，用PS4变体多肽处理的食品具有更低的密度，或重量（或质量）／体积比。在特别优选的实施方案中,使用PS4变体多肽提高面包的体积。体积提高或膨胀是有益的，因为它减小了食品的粘性或淀粉质（starchiness）。轻质食品是消费者所优选的，并且提高了消费者的体验。在优选的实施方案中,使用PS4变体多肽将体积提高了10%,20%,30%40%,50%或更多。
在实施例中详细介绍了使用PS4变体多肽提高食品的体积。
食品用途
本文所述的PS4变体多肽和核酸可以用作食品，或用于食品的制备中。特别地,它们可以添加到食品中，即，作为食品添加剂。术语“食品”意欲包括制备好的食品，以及食品的成分，如面粉。在优选的方法，所述食品用于人消费。根据用途和/或应用模式和/或施用模式，所述食品可以是溶液的形式或作为固体。
PS4变体多肽和核酸可以用作食品成分。本文所用的术语“食品成分”包括可以添加到功能性食品或食物（foodstuff）中的制品，并且包括可以低水平在多种产品中使用的制品，所述产品需要，例如，酸化或乳化。根据用途和/或应用模式和/或施用模式，所述食品成分可以是溶液的形式或作为固体。
本文公开的PS4变体多肽和核酸可以是食品成分，或可以添加到食品成分中。本文公开的PS4变体多肽和核酸可以是功能性食品，或可以添加到功能性食品中。本文所用的术语“功能性食品”意指能够不仅提供营养作用和/或味道满足，还能够向消费者递送有益效果的食品。尽管没有功能性食品的法律定义，但是对此领域有兴趣的大多数团体认同它们是具有特定健康作用而出售的食品。
PS4变体多肽还可以用在食品产品或食物的生产中。典型的食物包括乳制品，肉制品，家禽产品，鱼产品和生面团产品。生面团产品可以是任何加工过的生面团产品，包括煎，油炸，烤，烘焙，蒸和煮的生面团，如蒸馒头和米饼。在高度优选的实施方案中,所述食品产品是和烘焙产品（bakery product）。
优选地，食物是烘焙产品。典型的烘焙(烘焙过的)产品包括面包—如面包块、面包卷、小面包、比萨饼基等、面粉糕饼（pastry）、脆饼干(pretzel)、玉米粉饼(tortilla)、蛋糕(cake)、饼干(cookies)、饼干（biscuits）、krackers等。
所以我们描述了改进包含非产麦芽糖外切型淀粉酶的食品添加剂的方法，该方法包括在本文中给出的非产麦芽糖外切型淀粉酶的任何一个或多个位置上导入突变。可以使用相同的方法来改进食品成分，或食品添加剂，食品，或食物。
凝陈/陈化
我们描述了PS4变体蛋白质的用途，其能够延迟淀粉介质、如淀粉凝胶的陈化。PS4变体多肽尤其能够延迟淀粉的有害凝陈。
大多数淀粉颗粒由两种聚合物的混合物组成：基本上线性的直链淀粉和高度分枝的支链淀粉。支链淀粉是非常大的分枝分子，其由通过(1-4)连接连接的α-D-吡喃葡糖基单位的链组成，其中所述链通过α-D-(1-6连接连接以形成分枝。支链淀粉存在于所有的天然淀粉中，构成大多数普通淀粉的大约75%。直链淀粉基本上是具有少数α-D-(1-6)分枝的(1-4)连接的α-D-吡喃葡糖基单位的线性链。大多数淀粉包含大约25%直链淀粉。
在水存在下加热的淀粉颗粒经历了称作胶凝作用(gelatinisation)的有序-无序的相转变，其中液体被膨胀的颗粒所吸收。胶凝作用温度对于不同的淀粉有所不同。在新鲜烘焙面包冷却后直链淀粉级分在几小时内凝陈形成网络。这种过程是有益的，因为它产生了所需的面包心结构，具有低硬度和提高的切片特性。在烘焙后的几天，支链淀粉的结晶化作用更加逐渐地发生在胶凝化的淀粉颗粒中。在这一过程中据信支链淀粉加强了将淀粉颗粒包埋于其中的直链淀粉网络。这种加强导致面包心的硬度提高。这种加强是面包陈化的主要原因之一。
已知烘焙产品的质量在贮藏过程中逐渐恶化。作为淀粉重结晶作用（也称作凝陈）的结果，面包心的持水能力得以改变，该能力对感官感觉和饮食特性至关重要。面包心失去了柔软性和弹性并变得坚硬和易碎。面包心硬度的提高通常被用作面包陈化过程的测量。
支链淀粉的有害凝陈速率依赖于支链淀粉侧链的长度。因而,例如,通过具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的PS4变体多肽进行的支链淀粉侧链的酶促水解,能够显著地减弱它们的结晶化趋势。
因此,当在其加工成食品的任何阶段加入到淀粉中时，例如，在烘焙成面包之前、之中或之后，本文所述的PS4变体多肽的使用都能够延迟或阻止或延缓凝陈。下面更详细地公开这种用途。
所以我们介绍一种提高非产麦芽糖外切型淀粉酶阻止生面团产品陈化，优选有害凝陈的能力的方法，该方法包括在本文给出的非产麦芽糖外切型淀粉酶的任何一个或多个位置上导入突变。
凝陈(包括陈化在内)测量的测定
为了评估本文所述的具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的PS4变体多肽的抗陈化作用，可以通过Instron4301通用食品结构分析仪（Instron4301Universal Food Texture Analyzer）或本领域已知的类似装备在烘焙后1,3和7天测量面包心硬度。
本领域传统上使用的并且用来评估具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的PS4变体多肽对于淀粉凝陈的效应的另一种方法是基于DSC(差示扫描量热法)。这里，对面包心中的凝陈支链淀粉或来自用或不用酶（对照）烘焙的模式系统生面团的面包心的熔化焓值进行测量。在所述实施例中应用的DSC装备是Mettler-Toledo DSC820，从20到95℃以10℃每分钟的温度梯度运行。为了制备样品称取10-20mg的面包心并转移入Mettler-Toledo铝盘中，随后将其密封。
用在所述实施例中的模式系统生面团包含标准小麦面粉和优化量的水或缓冲液，所述缓冲液具有或没有非产麦芽糖PS4变体外切型淀粉酶。将它们分别混合在10或50g Brabender淀粉测定记录仪中6或7分钟。将生面团样品置于带盖玻璃试管(15*0.8cm)中。将这些试管在水溶中进行烘焙处理，所述水浴起始在33℃上温育30分钟，后接从33到95℃以1.1℃每分钟的梯度加热，最后在95℃上温育5分钟。随后，在DSC分析前将试管于20℃保存在自动调温器中。
在优选的实施方案中,与对照相比，本文所述的PS4变体具有减小的融化焓值。在高度优选的实施方案中,PS4变体融化焓值降低10%或更大。
优选地，当与对照相比时，它们的融化焓值降低20%或更大,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或更大。
DSC(J/g)
对照 2,29
0,5D34 1,91
1D34 1,54
2D34 1,14
表2
上表2显示在保存7天后以不同剂量的PSac-D34制备的模式生面团系统的DSC值。对0.5,1和2部分每百万(或微克每克)面粉进行测试。
淀粉产品的制备
我们提供了PS4变体多肽在制备食品，特别是淀粉产品中的用途。该方法包括通过向淀粉介质中加入非产麦芽糖外切型淀粉酶如PS4变体多肽来形成淀粉产品。如果淀粉介质是生面团，那么通过将面粉，水，作为PS4变体多肽的非产麦芽糖外切型淀粉酶和任选的其它可能成分和添加剂混合在一起来制备生面团。
术语“淀粉”应当用来意指淀粉本身及其组分，特别是支链淀粉。术语“淀粉介质”意指任何合适的包含淀粉的介质。术语“淀粉产品”意指任何包含或基于或源自淀粉的产品。优选地，淀粉产品包含或基于或源自获自小麦面粉的淀粉。本文所用的术语“面粉”是小麦或其它谷物的精磨粉的同义词。不过,优选地，该术语意指获自小麦本身而非获自其它谷物的面粉。因而,除非另外明确表示，提及本文所用的“小麦面粉”优选意指涉及小麦面粉本身以及当存在于介质，如生面团中的小麦面粉。
优选的面粉是小麦面粉或黑麦面粉或小麦和黑麦面粉的混合物。不过,也要求包含源自其它类型谷类，如例如源自大米，玉米，大麦和高粱的面粉的生面团。优选地，淀粉产品是烘焙产品。更加优选地，淀粉产品是面包产品。还要更加优选地，淀粉产品是烘焙的含淀粉面包产品。术语“烘焙的含淀粉面包产品”指任何基于生面团的烘焙产品，所述生面团可以通过在生面团形成条件下混合面粉，水和发酵剂而获得。当然可以将其它组分加入到生面团混合物中。
因而,如果淀粉产品是烘焙的含淀粉面包产品,那么加工过程包括以任何合适的顺序在生面团形成条件下混合面粉，水和发酵剂，并进一步任选地以预混合料的形式添加PS4变体多肽。所述发酵剂可以是化学发酵剂如小苏打或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）(面包酵母)的任何菌株。
PS4变体非产麦芽糖外切型淀粉酶可以与包括水或生面团混合物的任何生面团组分或与任何添加剂或添加剂混合物一起添加。可以通过烘焙工业或任何其它制造基于面粉生面团产品的工业中通用的常规生面团制备方法来制备生面团。
一般通过在180到250℃的烤箱温度下烘焙面包生面团持续大约15到60分钟来完成含淀粉面包产品如例如白面包,由筛过的黑麦面粉和小麦面粉制得的面包、面包卷等等的烘焙。在烘焙过程中，在生面团外层迅速上升的温度梯度(200→120℃)占优势，在所述外层形成了烘焙产品的特征性硬壳。不过，由于蒸气生成所造成的热消耗，在烘焙过程结束时面包心中的温度仅有接近100℃。
所以我们介绍一种制作面包产品的方法，包括:(a)提供淀粉介质;(b)向淀粉介质中加入本文中所述的PS4变体多肽;和(c)在步骤(b)之中或之后加热淀粉介质以生产面包产品。我们还介绍了一种制作面包产品的方法，包括向淀粉介质中添加所述的PS4变体多肽。
非产麦芽糖外切型淀粉酶PS4变体多肽可以作为液体制品或作为干粉状组合物来添加，所述组合物可以作为单一活性组分包含该酶，也可以混合以一种或多种其它生面团组分或生面团添加剂。
改良的组合物
我们介绍了改良的组合物，其包括面包改良组合物和生面团改良组合物。这些包含PS4变体多肽,任选地与其它组分，或其它酶，或两者在一起。
我们还提供这种面包和生面团改良组合物在烘焙中的用途。在又一方面，我们提供获自面包改良组合物和生面团改良组合物的烘焙产品或生面团。在另一方面,我们介绍了获自面包改良组合物和生面团改良组合物的使用的烘焙产品或生面团。
生面团制品
可以通过混合面粉,水,包含PS4变体多肽(如上所述)的生面团改良组合物和任选的其它组分和添加剂来制备生面团。
生面团改良组合物可与任何生面团组分包括面粉，水或任选的其它组分或添加剂一起加入。生面团改良组合物可以在面粉或水或任选的其它组分和添加剂之前加入。生面团改良组合物可以在面粉或水或任选的其它组分和添加剂之后加入。可以通过烘焙工业或任何其它制造基于面粉生面团产品的工业中通用的常规生面团制备方法来制备生面团。
生面团改良组合物可以作为液体制品或作为干粉状组合物的形式来添加，所述干粉状组合物可以作为单一活性组分包含该组合物，或混合以一种或多种其它生面团成分或添加剂包含该组合物。
添加的PS4变体多肽非产麦芽糖外切型淀粉酶的量在正常情况下是这样的量，其导致在最终的生面团中存在每kg面粉50到100,000单位,优选每kg面粉100到50,000单位。优选地，所述量是每kg面粉200到20,000单位。或者,以这样的量加入PS4变体多肽非产麦芽糖外切型淀粉酶，所述量导致在最终的生面团中存在基于面粉的0.02-50ppm的酶(每kg面粉0.02-50mg酶),优选0.2-10ppm。
在本文中,如下文所述，1单位的非产麦芽糖外切型淀粉酶被定义为当在试管中在50mM MES,2mM氯化钙,pH6.0中与4ml的10mg/ml蜡质玉米淀粉一起于50℃温育时每分钟释放等同于1μmol还原性糖的水解产物的酶量。
本文所述的生面团一般包含小麦粗粉(meal)或小麦面粉和/或其它类型的粗粉,面粉或淀粉如玉蜀黍（corn）面粉,玉蜀黍淀粉,玉米（maize）面粉,米粉,黑麦粗粉,黑麦面粉,燕麦面粉,燕麦粗粉,大豆面粉,高粱粗粉，高粱面粉,马铃薯粗粉,马铃薯面粉或马铃薯淀粉。生面团可以是新鲜的，冷冻的，或部分烘焙的。
生面团可以是发酵的生面团或要进行发酵的生面团。生面团可以以各种方式进行发酵，如通过加入化学发酵剂，例如，小苏打或通过加入酵素(发酵的生面团),但是优选通过加入合适的酵母培养物来发酵生面团，如酿酒酵母(面包酵母),例如商业上现有的酿酒酵母菌株。
生面团可以包含脂肪或颗粒状脂肪或起酥油。生面团可以进一步包含另外的乳化剂如甘油一酯或甘油二酯，脂肪酸的糖酯，脂肪酸的聚甘油酯，甘油一酯的乳酸酯，甘油一酯的乙酸酯，聚氧乙烯硬脂酸酯（polyoxethylenestearates）,或溶血卵磷脂。
我们还描述了包含面粉与本文所述组合在一起的预混合物。所述预混合物可以包含其它生面团改良和/或面包改良添加剂,例如本文提及的任何添加剂,包括酶。
其它生面团添加剂或成分
为了进一步改良烘焙产品的特性并给予烘焙产品独特品性，可以将其它生面团成分和/或生面团添加剂掺入生面团中。一般，这种另外加入的组分可以包括生面团成分如盐,谷物,脂肪和油，糖或甜味剂（sweeteber）,膳食纤维,蛋白质源如奶粉，谷蛋白、大豆或鸡蛋以及生面团添加剂如乳化剂,其它酶,水状胶质,调味剂,氧化剂,矿物质和维生素。
乳化剂可以用作生面团强化剂和面包心软化剂。作为生面团强化剂,乳化剂可以提供对于静止时间的耐受性以及对于发面过程中震击的耐受性。另外，生面团强化剂将提高给定生面团对于发酵时间变化的耐受性。大多数生面团强化剂还提高了烤箱弹性，其意味着从发面的到烘焙的商品体积的增长。最后，生面团强化剂将乳化存在于食谱混合物中的任何脂肪。
合适的乳化剂包括卵磷脂,聚氧乙烯硬脂酸酯,可食用脂肪酸甘油单酯和甘油二酯，可食用脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的乙酸酯，可食用脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的乳酸酯，可食用脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯，可食用脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的二乙酰基酒石酸酯，可食用脂肪酸的蔗糖酯,硬脂酸钠-2-乳酸酯（sodium stearoyl-2-lactylate）,和硬脂酸钙-2-乳酸酯。
可以将其它生面团添加剂或成分与任何生面团成分包括面粉,水或任选的其它成分或添加剂,或生面团改良组合物一起添加。其它的生面团添加剂或成分可以在面粉,水，任选的其它成分和添加剂或生面团改良组合物之前加入。其它的生面团添加剂或成分可以在面粉,水，任选的其它成分和添加剂或生面团改良组合物之后加入。
其它生面团添加剂或成分可以便利地为液体制品。不过,其它生面团添加剂或成分可以便利地为干燥组合物的形式。
优选其它生面团添加剂或成分至少是生面团的面粉组分重量的1%。更加优选地，其它生面团添加剂或成分是至少2%,优选至少3%,优选至少4%,优选至少5%,优选至少6%。如果添加剂是脂肪，那么一般脂肪可以以从1到5%,一般为1到3%,更一般为大约2%的量存在。
其它酶
除了PS4变体多肽,可以使用一种或多种其它的酶，例如添加到食品,生面团制品,食物或淀粉组合物中。
可以添加到生面团中的其它酶包括氧化还原酶,水解酶,如脂肪酶和酯酶以及糖苷酶如淀粉酶,支链淀粉酶,和木聚糖酶。氧化还原酶,如例如葡萄糖氧化酶和已糖氧化酶，可以用于生面团强化和烘焙产品的体积控制，并且可以添加木聚糖酶和其它半纤维素酶以改良生面团处理特性,面包心柔软度和面包体积。脂肪酶可用作生面团强化剂和面包心软化剂而α-淀粉酶和其它淀粉水解酶可以并入生面团中以控制面包体积并进一步减小面包心硬度。
可以使用的其它酶可以选自纤维素酶，半纤维素酶，淀粉降解酶,蛋白酶,脂氧合酶。
有用的氧化还原酶的例子包括氧化酶如麦芽糖氧化酶，葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4),糖类氧化酶,甘油氧化酶,吡喃糖氧化酶,半乳糖氧化酶(EC1.1.3.10)和已糖氧化酶(EC1.1.3.5)。
在淀粉降解酶中,淀粉酶是特别有用的生面团改良添加剂。α-淀粉酶将淀粉裂解成糊精，糊精可以通过β-淀粉酶进一步裂解成麦芽糖。可以加到生面团组合物中的其它有用的淀粉降解酶包括葡萄糖淀粉酶和支链淀粉酶。
优选地，其它的酶至少是木聚糖酶和/或至少是淀粉酶。本文所用的术语“木聚糖酶”指水解木糖苷连接的木聚糖酶(EC3.2.1.32)。
本文所用的术语“淀粉酶”指淀粉酶如α-淀粉酶(EC3.2.1.1),β-淀粉酶(EC3.2.1.2)和γ-淀粉酶(EC3.2.1.3)。
可以将其它酶与任何生面团成分包括面粉,水或任选的其它成分或添加剂,或生面团改良组合物一起添加。其它的酶可以在面粉,水，和任选的其它成分和添加剂或生面团改良组合物之前加入。其它的酶可以在面粉,水，和任选的其它成分和添加剂或生面团改良组合物之后加入。其它酶可以便利地为液体制品。不过,其它酶可以便利地为干燥组合物的形式。
生面团改良组合物的一些酶能够在生面团条件下以这样的程度彼此相互作用，其中对于面粉生面团的流变学和/或可机械加工特性(machineability)和/或通过酶由生面团制成的产品的品质的改良作用不仅是累积的，而且所述作用还是协同性的。
关于由生面团制成的产品（最终产品）的改良，可以发现对于面包心结构来说，组合导致基本上协同性的作用。另外，对于烘焙产品的特定体积，可以发现协同性的作用。
其它酶可以是能够水解羧酸酯键以释放羧酸酯的脂肪酶(EC3.1.1)。脂肪酶的例子包括但不限于三酰基甘油脂肪酶(EC3.1.1.3),半乳糖脂肪酶(EC3.1.1.26),磷脂酶A1(EC3.1.1.32,磷脂酶A2(EC3.1.1.4)和脂蛋白脂肪酶A2(EC3.1.1.34)。
其它用途
PS4变体适于麦芽糖和高度麦芽糖浆的生产。因为低吸湿性，低粘性，良好的热稳定性和温和的并不太甜的麦芽糖口味，这些产品在某些糖果的生产中相当令人感兴趣。生产麦芽糖浆的工业方法包括使淀粉液化，随后用麦芽糖产生酶，并任选地用切割支链淀粉中1.6-分枝点的酶，例如α-1.6-淀粉葡萄糖苷酶进行糖化作用。
本文所述的PS4变体可以加入并且因而变为去污剂组合物中的组分。所述去污剂组合物可以例如制成手洗或机洗去污剂组合物，其包括适于玷污织物预处理的洗涤添加剂组合物和加入冲洗剂的（rinse added）漂洗附加织物软化剂组合物，或制成去污剂组合物用于一般性的家庭硬表面清洗操作，或配制用于手工或机器洗碗操作。在具体的方法，我们描述了包含PS4变体的去污剂添加剂。所述去污剂添加剂以及去污剂组合物可以包含一种或多种其它的酶，如蛋白酶，脂肪酶，角质酶，淀粉酶，糖酶，纤维素酶，果胶酶,甘露聚糖酶,阿拉伯糖酶,半乳聚糖酶,木聚糖酶,氧化酶,例如,虫漆酶,和/或过氧化物酶。一般选定的酶的特性应当与选择的去污剂相容，(即,最佳pH,与其它酶学和非酶学成分的相容性，等等),并且一个或多个酶应当以有效量存在。
PS4变体还可以用在由淀粉强化的废纸和纸板生产木质纤维素材料,如纸浆,纸和纸板的生产中，特别是当重新制浆发生于高于7的pH上时以及当淀粉酶可以通过强化淀粉的降解而促进废料的分解时。PS4变体可以在由淀粉涂布的印刷纸生产造纸纸浆的方法中特别有用。该方法可以如WO95/14807中所述的那样来进行，包括下列步骤：a)分解纸来产生纸浆,b)用淀粉-降解酶在步骤a)之前，之中或之后进行处理,和c)在步骤a)和b)之后由纸浆分离墨水颗粒。PS4变体还可以在修饰淀粉中非常有用，其中将酶学修饰的淀粉与碱性填充物如碳酸钙，高岭土和粘土一起用于造纸。用本文所述的PS4变体有可能在填充物存在时修饰淀粉，因而允许更简单的整合过程。PS4变体还可以在纺织品脱浆中非常有用。在纺织品加工工业中，传统上将淀粉酶用作脱浆过程中的辅助剂以促进除去包含淀粉的浆糊，其在纺织过程中充当纺纱上的保护性涂层。在纺织后完全去除浆糊涂层对于确保在随后操作中的最优结果是重要，其中对织品进行冲洗，漂白和染色。酶促淀粉分解是优选的，因为它并不涉及对于纤维材料的任何有害作用。当对包含纤维素的织物或纺织品进行脱浆时，PS4变体可以单独使用或组合以纤维素酶使用。
PS4变体还可以是用于由淀粉生产甜味剂的选择的淀粉酶。将淀粉转变成果糖糖浆的“传统”方法在正常情况下由三个连续的酶促操作组成，即，液化过程，后接糖化过程和异构化过程。在液化过程中，在5.5和6.2之间的pH值上和95-160℃的温度下用大约2小时的时间通过淀粉酶将淀粉降解成糊精。为了确保在这些条件下优化的酶稳定性，加入1mM的钙(40ppm游离的钙离子)。在液化过程后通过加入葡萄糖淀粉酶和去分枝酶，如异淀粉酶或支链淀粉酶将糊精转变成葡萄糖。在此步骤之前将pH减小到低于4.5的值，维持高温(95℃以上),并使得液化淀粉酶活性变性。将温度降低到60℃,并加入葡萄糖淀粉酶和去分枝酶。糖化过程进行24-72小时。
饲料应用
在一个实施方案中,PS4变体多肽能够降解耐受性淀粉（resistantstarch）。
本文所用的术语‘降解’涉及耐受性淀粉部分或完全水解或降解成葡萄糖和/或寡糖-如麦芽糖和/或糊精。
PS4变体多肽可以降解没有被动物淀粉酶完全降解的残余耐受性淀粉。通过实施例的方式，PS4变体多肽可以用来辅助动物淀粉酶(例如胰淀粉酶)增强耐受性淀粉的降解。胰α-淀粉酶由动物在消化系统分泌。胰α-淀粉酶降解饲料中的淀粉。不过，淀粉的一部分，耐受性淀粉，并未被胰α-淀粉酶完全降解并且因此在小肠内未被吸收(见耐受性淀粉的定义)。在一些实施方案中PS4变体多肽能够辅助胰α-淀粉酶在消化系统中降解淀粉并由此提高动物的淀粉利用。
酶降解耐受淀粉的能力可以通过Megazyme International Ireland Ltd.开发和公开的方法进行分析，所述方法用于测量样品的耐受性淀粉，溶解的淀粉和总淀粉含量(Resistant Starch测定Procedure,AOAC Method2002.02,AACC Method32-40)。
因此,PS4变体多肽可以为了有益的目的由动物摄取，并且因此可以掺入到动物饲料中。
所以我们公开了PS4变体多肽作为组分用于含有淀粉的饲料中的用途，或用于饲料改良组合物，其中PS4变体多肽能够降解耐受性淀粉。我们还公开了含有淀粉和PS4变体多肽的饲料。我们进一步公开了降解饲料中耐受性淀粉的方法，包括将所述耐受性淀粉与PS4变体多肽相接触。
我们进一步描述了PS4变体多肽在制备含有淀粉的饲料中的用途，来降解耐受性淀粉。另外,我们公开了PS4变体多肽在制备饲料中的用途以提高所述饲料的热量值。我们公开了酶在制备饲料中的用途以提高动物性能。在另外的实施方案中,我们描述了制备饲料的方法，包括混合淀粉和PS4变体多肽酶。
通过实施例的方式，包含PS4变体多肽并且能够降解耐受性淀粉的组分的使用是有益的，因为在动物中淀粉和/或淀粉降解产物的降解有明显提高。另外，这种使用是有益的，因为动物的淀粉和/或淀粉降解产物的消化性有明显提高。另外，这种使用是有益的，因为它提供了增强动物由饲料得到能量的效率的方法。另外，这种使用是有益的，因为它提供了增强耐受性淀粉生物利用率的方法。
动物饲料
可以配制适合使用PS4变体多肽的动物饲料以满足特定动物群的特异性需要并且以能够被动物代谢的形式提供必需的糖，脂肪，蛋白质和其它营养成分。
优选地，所述动物饲料是猪或家禽的饲料。
本文所用的术语“猪”涉及非反刍动物的杂食动物如猪（pigs）,肥猪（hogs）或公猪（boars）。一般，猪饲料包括大约50%的糖，大约20%的蛋白质和大约5%的脂肪。高能量猪饲料的例子是基于玉蜀黍的，其经常组合以饲料添加剂例如，蛋白质,矿物质,维生素和氨基酸如赖氨酸和色氨酸。猪饲料的例子包括动物蛋白质产品,海产品,奶产品,谷物产品和植物蛋白质产品,其全部都可以进一步包含天然调味料，人工调味料，小和大的矿物质，动物脂肪，植物脂肪，维生素，防腐剂或药物如抗生素。
所要理解的是在本说明书，包括随附的权利要求书中，当提及‘猪饲料’时这种提法意指包括“转变（transition）”或“起始(starter)”饲料(用来使幼猪断奶)和“最终(finishing)”或“生长(grower)”饲料(在转变期后使用用于猪生长到适于市售的年龄和/或大小)。
本文所用的术语‘家禽’涉及禽类如小鸡，肉仔鸡,母鸡,公鸡,阉鸡,火鸡,鸭,猎禽,小母鸡或雏鸡。家禽饲料可以称为"完全"饲料，因为它们包含所有的蛋白质,能量,维生素,矿物质,和其它对于正常生长，禽蛋生产，和鸟类健康所必需的营养成分。不过,家禽饲料可以进一步包含维生素,矿物质或药物如球虫抑制药(例如莫能星钠,拉沙里菌素,安普罗铵,沙利霉素,和磺胺喹噁啉)和/或抗生素(例如青霉素,杆菌肽,氯四环素,和氧四环素)。
留作肉食生产的幼鸡或肉仔鸡，火鸡和鸭与留作禽蛋生产的小母鸡饲养方式不同。肉仔鸡，鸭和火鸡具有更大的躯体并且比产蛋型鸡增重更快。所以，用具有较高蛋白质和能量水平的饲料饲养这些鸟类。
所要理解的是当在本说明书，包括随附的权利要求书中提及‘家禽饲料’时，这种提法意指包括"起始(starter)"饲料(孵化后),"最终(finisher)",“生长(grower)”或"发育(developer)"饲料(从6-8周龄直到达到屠宰大小)和"下蛋母鸡(layer)"饲料(在产蛋期间喂饲)。
关于，例如，肉食生产，奶生产，禽蛋生产，繁殖和对应激的反应，可以配制动物饲料以满足动物的营养需要。此外，配制动物饲料以提高肥料质量。
在优选的方面动物饲料包含原材料如豆类，例如豌豆或大豆或谷物，例如小麦，玉蜀黍（玉米）,黑麦或大麦。合适地，所述原材料可以是马铃薯。
饲料原料
通过PS4变体多肽单独或组合以其它成分，如食品成分，间接或直接用于饲料，PS4变体多肽可以用在饲料中供动物食用。
典型的食品成分可以包括任何一种或多种添加剂如动物或植物脂肪,天然或合成的调味料,抗氧化剂,粘度调节剂,香精油,和/或香料,染料和/或着色剂,维生素,矿物质,天然和/或非天然的氨基酸,营养物,其它酶(包括遗传操作的酶),结合剂如瓜耳树胶（guar gum）或黄胶(xanthum gum),缓冲剂,乳化剂,滑润剂,佐剂,悬浮剂，防腐剂，涂布剂或溶解剂等等。
应用方法的例子包括,但不限于,以包含PS4变体多肽的材料涂布饲料,通过将PS4变体多肽与饲料混合而直接应用,将PS4变体多肽喷到饲料表面或将饲料浸入PS4变体多肽制品中。
优选通过将它与饲料混合或通过喷到饲料颗粒上供动物食用来应用PS4变体多肽。或者,PS4变体多肽可以通过注射或翻转包括在饲料的乳剂中,或在固体产品的内部。
PS4变体多肽可以应用来点缀,涂布和/或浸入饲料中。还可以使用与其它成分的混合物并且可以分别，同时或按顺序使用。可以将螯合剂，结合剂,乳化剂和其它添加剂如小和大的矿物质,氨基酸,维生素,动物脂肪,植物脂肪,防腐剂,调味料,着色剂类似地同时应用于饲料(混合物的形式或分开使用)或按顺序应用。
PS4变体多肽的量
所用PS4变体多肽的优化量将依赖于要处理的饲料和/或将饲料与PS4变体多肽相接触的方法和/或对于它的预期用途。PS4变体多肽的量应当是足够的量，以便在摄取后和在饲料的消化期间，有效地基本上降解耐受性淀粉。
有益地,PS4变体多肽在饲料摄取用于动物食用后和在饲料消化期间将保持有效直到获得饲料更加完全的消化，即释放出饲料的增多热量值。
淀粉酶组合
我们特别公开了PS4变体多肽与淀粉酶,特别是,产麦芽糖淀粉酶的组合。产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1,4-a-麦芽糖水解酶,E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构型的麦芽糖。
来自杆菌属（Bacillus）的产麦芽糖α-淀粉酶(EP120693)是商业上现有的，商品名Novamyl(Novo Nordisk A/S,丹麦)，并且作为抗陈化剂广泛用于烘焙工业，这是由于其减弱淀粉凝陈的能力。Novamyl在国际专利公开号WO91/04669中进行了详细描述。产麦芽糖α-淀粉酶Novamyl与环糊精葡聚糖转移酶(CGTases)共有几种特征,包括序列同源性(Henrissat B,Bairoch A;Biochem.J.,316,695-696(1996))和转糖基产品的形成(Christophersen,C.,等人,1997,Starch,vol.50,No.1,39-45)。
在高度优选的实施方案中,我们公开了包含PS4变体多肽和Novamyl或它的任何变体的组合。这些组合可以用于食品生产，如烘焙。Novamyl可以特别地包含Novamyl1500MG。
其它介绍Novamyl及其用途的文件包括Christophersen,C.,Pedersen,S.,and Christensen,T.,(1993)Method for Production of maltose an a limitdextrin,the limit dextrin,and use of the limit dextrin.Denmark,和WO95/10627。它在美国专利号4,598,048和美国专利号4,604,355中得以进一步描述。特此将这些文件的每一篇并入作为参考，并且可以将其中所述的任何Novamyl多肽用于与本文所述任何PS4变体多肽的组合。
Novamyl的变体,同源物和突变体可以用于所述组合，条件是它们保留α淀粉酶活性。例如,美国专利号6,162,628中公开的任何Novamyl变体,都可以用于与本文所述的PS4变体多肽的组合，特此将所述专利号的全部内容并入作为参考。特别地,在该文件中所述的任何多肽,特别是US6,162,628的SEQ ID NO:1在对应于Q13,I16,D17,N26,N28,P29,A30,S32,Y33,G34,L35,K40,M45,P73,V74,D76N77,D79,N86,R95,N99,I100,H103,Q119,N120,N131,S141,T142,A148,N152,A163,H169,N171,G172,I174,N176,N187,F188,A192,Q201,N203,H220,N234,G236,Q247,K249,D261,N266,L268,R272,N275,N276,V279,N280,V281,D285,N287,F297,Q299,N305,K316,N320,L321,N327,A341,N342,A348,Q365,N371,N375,M378,G397,A381,F389,N401,A403,K425,N436,S442,N454,N468,N474,S479,A483,A486,V487,S493,T494,S495,A496,S497,A498,Q500,N507,I510,N513,K520,Q526,A555,A564,S573,N575,Q581,S583,F586,K589,N595,G618,N621,Q624,A629,F636,K645,N664和/或T681的任何一个或多个位置上的变体都可以使用。
氨基酸序列
本发明使用PS4变体核酸,并且这种PS4变体核酸的氨基酸序列被本文所述的方法和组合物所包括。
本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
氨基酸序列可以由合适的来源制备/分离，或者它可以合成性制成或者它可以通过使用DNA重组技术制备。
本文所述的PS4变体酶可以结合其它酶使用。因而我们进一步公开了酶的组合，其中所述组合包含本文所述的PS4变体多肽酶和另一种酶,其本身可以是另一种PS4变体多肽酶。
PS4变体核苷酸序列
如上所述,我们公开了编码具有所述具体特性的PS4变体酶的核苷酸序列。
本文所用的术语“核苷酸序列”或“核酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列,及其变体,同源物,片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组起源的，其可以是双链或单链的，无论其代表有义链或反义链。
本文所用的术语"核苷酸序列"包括基因组DNA,cDNA,合成DNA,和RNA。优选它意指DNA,更加优选编码PS4变体多肽的cDNA序列。
一般,利用重组DNA技术(即重组DNA)制备PS4变体核苷酸序列。不过,在备选的实施方案中,核苷酸序列可以全部或部分利用本领域公知的化学方法合成(见Caruthers MH等人,(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23和Horn T等人,(1980)Nuc Acids Res Symp Ser225-232)。
核酸序列的制备
从产生所述酶的任何细胞或有机体中，可鉴定和/或分离和/或纯化编码具有如文中所定义的特定特性的酶（例如，PS4变体多肽）或适于修饰的酶，如亲本酶的核苷酸序列。在本领域中，用于鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的各种方法是众所周知的。例如，一旦已经鉴定和/或分离和/或纯化了合适的序列，可利用PCR扩增技术来制备更多的序列。
通过另外的实例，利用来自产生该酶的生物的染色体DNA或信使RNA，可构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果酶的氨基酸序列或酶的部分氨基酸序列是已知的，可合成标记寡核苷酸探针并用于在从有机体制备的基因组文库中鉴定编码酶的克隆。或者，将包含与另一种已知的酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴定编码酶的克隆。在后一种情况中，可使用低严谨度的杂交和洗涤条件。
或者，通过将基因组DNA片段插入表达载体例如质粒中、用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌、和随后将转化的细菌铺在含有酶底物(即麦芽糖)的琼脂平板上、由此鉴定表达酶的克隆，来鉴定编码酶的克隆。
还在另外的选择中，通过已建立的标准方法，如根据Beucage S.L等((1981)Tetrahedron Letters22,p1859-1869)或Matthes等((1984)EMBO J.3,p801-805)所述的氨基磷酸盐（phosphoroamidite）法可合成制备编码酶的核苷酸序列。例如，在氨基磷酸盐法中，在例如自动DNA合成仪中合成寡核苷酸、纯化、退火，并连接和克隆在合适的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组和合成来源，混合的合成和cDNA来源、混合的基因组和cDNA来源、根据标准技术通过连接合成来源、基因组来源或cDNA来源(视情况而定)的片段而制备。每个连接片段对应于全部核苷酸序列的各个部分。也可通过聚合酶链式反应(PCR)，使用特异性引物，来制备DNA序列，例如在美国专利4,683,202中或在Saiki R K等人(Science(1988)239,pp487-491)所述。
变体/同源物/衍生物
我们进一步描述了酶的任何氨基酸序列或编码这种酶的任何核苷酸序列，如PS4变体多肽或PS4变体核酸的变体，同源物和衍生物的用途。除非本文另外指定，术语“PS4变体核酸”应当用来包括下面所述的每种核酸实体，而术语“PS4变体多肽”应当同样地用来包括下面所述的每种多肽或氨基酸实体。
在本文中，术语“同源物”意指与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有某种同源性的实体。本文中，术语“同源性”与“同一性”等同。
在本文中，规定同源性序列包括可以是至少75，80，85或90%同一，优选至少95%、96%、97%、98%或99%相同于目标序列的氨基酸序列。一般，同源物将包括例如与目标氨基酸相同的活性位点等等。尽管也可根据相似性(即，具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)来判断同源性，但在本发明的上下文中优选用序列同一性来表示同源性。
在本文中，规定同源性序列包括是至少75，80，85或90%同一，优选至少95%、96%、97%、98%或99%同一于编码PS4变体多肽酶的核苷酸序列(如PS4变体核酸)。通常，同源物将包括与目标序列编码活性位点的相同的序列等等。尽管也可根据相似性(即，具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)来判断同源性，但在本发明的上下文中优选用序列同一性来表示同源性。
可以通过肉眼或更多地借助于可方便获得的序列比较程序，实施同源性比较。这些商业上可获得的计算机程序可计算两个或更多序列之间的%同源性。
可对连续序列计算%同源性，即，将一条序列与另一条序列比对，并将一条序列中的每个氨基酸直接与另一条序列中相应的氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这称为“无缺口（ungapped）”比对。通常，仅仅对于数目相对较少的残基进行所述的无缺口比对。
尽管这是非常简单和一致的方法，但它未能考虑到一些情况：例如当进行全序列对比时，在一对在其它方面完全相同的序列对中的一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法对齐，因此可能导致极大地降低%同源性。因此，将大多数序列比较方法设计成可得到最佳对比结果，所述的对比考虑了可能的插入和缺失而不对总同源性分数过度罚分。通过在序列比对中插入“空位”来使局部同源性尽力最大化，可实现上述目的。
然而，这些更复杂的方法对存在于比对中的每个缺口给予“空位罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的空位的序列对比（这表明在两种被对比序列之间的较高相关性）与具有许多空位的序列比对相比，可获得较高分。通常使用“远交空位代价”来对存在空位付出相对较高代价以及对空位中每个随后残基处以较小罚分。这是最普遍用到的空位计分系统。高空位罚分自然得到具有较少空位的最佳对比。大多数对比程序允许空位罚分被改变。然而，当使用这种软件用于序列比较时，优选使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时，用于氨基酸序列的默认空位罚分是：空位是-12，每个延长是-4。
因此最大%同源性的计算首先需要产生最佳比对并考虑到空位罚分。用于实施所述对比的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit程序包(Devereux等,1984Nuc.Acids Research12p387)。可进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于，BLAST程序包(参见Ausubel等,1999Short Protocolsin Molecular Biology,4th Ed–Chapter18)、FASTA(Altschul等,1990J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS系列比较工具。BLAST和FASTA都可用于脱机和联机检索(参见Ausubel等.,1999,Short Protocols in Molecular Biology,pages7-58to7-60)。
然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。被称为BLAST2Sequences的新工具，也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMSMicrobiol Lett1999174(2):247-50;FEMS Microbiol Lett1999177(1):187-8and tatianancbi.nlm.nih.gov)。
尽管可根据同一性测量最终的%同源性，比对过程本身通常不以“全或无”的配对比较为基础。相反，通常使用分等级的相似性计分矩阵，其中根据化学相似性或进化距离对每个成对比较进行计分。通常用到的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵——BLAST程序系列的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公众默认值或用户符号比较表(如果提供的话)，具体详情参见用户手册。对于一些应用，对GCG程序包而言优选使用公众默认值，或对其它软件而言，优选使用默认矩阵例如BLOSUM62。
或者，使用在DNASISTM(Hitachi Software)中的多重对比特征，根据类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988),Gene73(1),237-244)的算法，来计算百分比同源性。
一旦软件产生最佳对比结果，有可能来计算%同源性，优选是%序列同一性。通常软件作为序列比较的一部分进行此操作，并得到数值结果。
序列也可具有产生沉默突变并导致功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。根据氨基酸性质(例如极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或残基的两亲性质)的相似性，可进行有意的氨基酸取代，因此这可用于将氨基酸分成功能性的组。可仅基于氨基酸的侧链特性将氨基酸分成组。然而，更有用的是也包括了突变数据。因此，出于结构原因，衍生的氨基酸组很可能是保守的。可以维恩图(Livingstone C.D.和Barton G.J.(1993)"Proteinsequence alignments:a strategy for the hierarchical analysis of residueconservation"Comput.Appl Biosci.9:745-756)(Taylor W.R.(1986)"Theclassification of amino acid conservation"J.Theor.Biol.119;205-218)的形式描述这些氨基酸组。例如根据描述了公认的维恩图氨基酸分组的下表，可制备保守性取代。
我们进一步公开了包含同源性取代的序列(本文所用的取代和替换都指存在的氨基酸残基与另一种残基进行互换)，其可发生相似对相似的取代，例如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等等。也可存在非同源取代，即从一个种类的残基到另一种类的残基，或者涉及包含非天然氨基酸，例如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸以及苯基甘氨酸。
变体氨基酸序列可以包括可插入序列的任何两种氨基酸残基之间的合适间隔子基团，包括烷基例如甲基、乙基或丙基，此外还有氨基酸间隔子例如甘氨酸或β-丙氨酸残基。本领域技术人员非常清楚另外形式的变体，其涉及以类肽形式存在的一种或多种氨基酸残基。为了消除疑惑，“类肽形式”用于指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基在残基的氮原子上而不是α-碳上。类肽形式的肽的制备方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人的“PNAS(1992)89(20),9367-9371”和Horwell DC的“Trends Biotechnol.(1995)13(4),132-134”。
本文所述的，并且适用于本文所述方法和组合物的核酸序列（如PS4变体核酸）可以在其中包括合成或修饰的核苷酸。本领域中对寡核苷酸的许多不同种类的修饰是已知的。这些修饰包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'端和/或5'端添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本发明目的，可以理解的是本文描述的核苷酸序列可通过本领域中任何有效的方法进行修饰。可实施所述的修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。
我们进一步描述了与本文给出序列或任何衍生物、片段或其衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段是互补的，则该序列可用作探针来鉴定其它生物中的相似编码序列等等。
可以多种方法获得与PS4变体序列不是100%同源的多核苷酸。例如通过探测由大量个体(例如来自不同群体的个体)制备的DNA文库，可得到本文所述序列的其它变体。此外，可获得其它同源物，并且所述的同源物及其片段通常能与本文序列表中所示的序列选择性杂交。通过探测由来自其它物种的基因组DNA所制备的cDNA文库，并且在中度至高度严谨的条件下，用包含所附序列表中的任何一条序列的全部或部分的探针，探测所述的文库可获得所述的序列。类似的考虑用于获得本文所述多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位变体。
使用简并PCR也可获得变体和菌株/物种同源物，所述简并PCR使用设计来靶向编码变体和同源物中保守性氨基酸序列的引物。例如对来自几个变体/同源物的氨基酸序列进行比对，可预测保守序列。使用本领域已知的计算机软件可实施序列比对。例如GCG Wisconsin PileUp程序被普遍地使用。
简并PCR中用到的引物含有一种或多种简并位点，并且将在与用靶向已知序列的单序列引物来克隆序列相比，更低的严谨条件下使用。
或者，通过特征化序列的定点诱变，可获得所述的多核苷酸。这在例如需要沉默密码子序列改变，来优化表达多核苷酸序列的特定宿主细胞的密码子偏爱性时是有用的。可需要其它的序列突变来导入限制性内切酶识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
诸如本文中所述的PS4变体核酸的多核苷酸（核苷酸序列）可用于生产引物如PCR引物，用于可替换的扩增反应的引物，探针，如使用放射性的或非放射性的标记，通过传统方法用有展示作用的标记标记的探针，或可将多核苷酸克隆入载体。这种引物、探针及其它片段将是至少15、优选是至少20、例如至少25、30或40核苷酸长度，并且也落入术语多核苷酸的范围内。
可通过重组法、合成法或通过本领域技术人员可利用的任何方法，生产多核苷酸，如DNA多核苷酸和探针。它们也可通过标准技术克隆。通常，可通过合成方法生产引物，包括一次合成一个核苷酸来逐步制备预期的核酸序列。使用自动化技术用于完成引物生产的技术是本领域中易于得到的。
通常使用重组法例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术，生产更长的多核苷酸。可将引物设计成含有合适的限制性内切酶识别位点以便将扩增的DNA克隆入合适的克隆载体。优选地，变体序列等等至少与本文所示序列同样有生物学活性。
如本文所用的“生物学活性”指具有与天然存在的序列相似的结构功能(但不必达到相同的程度)、和/或相似的调节功能(但不必达到相同的程度)、和/或相似的生物化学功能(但不必达到相同的程度)的序列。
杂交
我们进一步描述了与PS4变体的核酸序列，或能与PS4变体序列或与其互补序列杂交的序列互补的序列。
如本文所用的术语“杂交”包括“将核酸链与互补链通过碱基配对连接的过程”以及如在聚合酶链式反应(PCR)技术中实施的扩增过程。所以，我们公开了能够杂交到与本文所示序列，或其任何衍生物，片段或其衍生物互补的序列上的核苷酸序列的用途。
术语“变体”也包括与能杂交本文所示的核苷酸序列的序列互补的序列。
优选地，术语“变体”包括与在严谨条件下(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC=0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0})能杂交本文所示的核苷酸序列的序列互补的序列。更加优选地，术语“变体”包括与在高度严谨条件下(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC=0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0})能杂交本文所示的核苷酸序列的序列互补的序列。
我们进一步公开了能够与PS4变体的核苷酸序列(包括与本文所示的序列互补的序列)杂交的核苷酸序列，以及与能够与PS4变体的核苷酸序列(包括与本文所示的序列互补的序列)杂交的序列互补的核苷酸序列。我们进一步描述了在中等到最高严谨的条件下，能与本文所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。
在优选的方面中，我们公开了在严谨条件下(例如50℃和0.2xSSC)，能与PS4变体核酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。更优选地，核苷酸序列在高严谨条件下(如65℃、0.1xSSC)，能与PS4变体的核苷酸序列或其互补序列杂交。
定点诱变
一旦分离了编码酶的核苷酸序列，或鉴定了推定的编码酶的核苷酸序列，需要对序列进行突变以便制备酶。因此，可以由亲本序列制备PS4变体序列。可以利用合成性寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸包含所需突变位点两侧的核苷酸序列。
在Morinaga等人,(Biotechnology(1984)2,p646-649)中公开了合适的方法。将突变导入编码酶的核苷酸序列中的另一种方法在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989),180,p147-151)中作了描述。在Sarkar andSommer(Bio技术(1990),8,p404-407–“The megaprimer method of sitedirected mutagenesis”)中描述了另外的方法。
在一方面用于本文所述的方法和组合物的序列是重组序列即－利用重组DNA技术制备的序列。这些重组DNA技术在本领域普通技术人员的能力范围之内。这种技术在文献,例如,J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Books1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press.中进行了解释。
在一方面用于本文所述的方法和组合物的序列是合成性序列—即通过体外化学或酶促合成制备的序列。它包括,但不限于,用宿主生物—如甲基营养酵母毕赤酵母属（Pichia）和汉森酵母属（Hansenula）的最佳密码子用法制成的序列。
用于本文所述的方法和组合物中的核苷酸序列可以掺入重组可复制载体中。所述载体可以用来在和/或由相容的宿主细胞中和以酶的形式复制和表达所述核苷酸序列。使用控制序列如调控序列来控制表达。宿主重组细胞通过核苷酸序列的表达而产生的酶，可以是分泌性的或可包含于细胞内，这取决于使用的序列和/或载体。编码序列可设计成具有信号序列，所述信号序列可指导物质编码序列穿过特定的原核或真核细胞膜分泌。
PS4核酸和多肽的表达
PS4核酸和多肽可以包括合成性和天然来源的DNA和RNA，所述DNA和RNA可以包含经修饰的或未经修饰的脱氧或双脱氧核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。PS4核酸可以作为单链或双链DNA或RNA,RNA/DNA异源双链核酸分子或RNA/DNA共聚合物存在,其中术语“共聚合物”指包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的单一核酸链。PS4核酸甚至可以进行密码子优化以进一步增强表达。
本文所用的术语“合成的”,被定义为通过体外化学或酶学合成生产的东西。它包括但不限于用对于宿主生物最佳的密码子用法制成的PS4核酸，所述宿主生物如甲基营养酵母毕赤酵母属（Pichia）和汉森酵母属（Hansenula）。
可以将本文所述的核苷酸,例如变体PS4多核苷酸掺入重组可复制载体中。可以用所述载体来在相容性宿主细胞中复制核酸。可以将包含所述多核苷酸序列的载体转化入合适的宿主细胞中。合适的宿主可以包括细菌、酵母、昆虫和真菌细胞。
术语“转化的细胞”包括通过使用重组DNA技术转化的细胞。所述转化一般通过将一种或多种核苷酸序列插入待转化细胞中而发生。插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列(即对于待转化细胞来说非天然的序列)。此外，或备选地，所述插入核苷酸序列可以是同源核苷酸序列(即对于待转化细胞来说天然的序列)—从而使细胞接受一个或多个除了已经存在于其中的核苷酸序列之外的拷贝。
因而在另外的实施方案中,通过将多核苷酸导入可复制载体中，将载体导入相容的宿主细胞中，和在引起载体复制的条件下生长所述宿主细胞，我们提供制备PS4变体多肽和多核苷酸的方法。可以由宿主细胞中回收载体。
表达构建体
可以将PS4核酸可操作性地连接到在目标宿主细胞中具有活性的转录和翻译调控元件上。PS4核酸还可以编码包含信号序列的融合蛋白,如，例如,来自Schwanniomyces occidentalis的葡萄糖淀粉酶基因、来自酿酒酵母的α-因子酵母交配型基因和来自米曲霉（Aspergillus oryzae）的TAKA-淀粉酶的信号序列。或者，PS4核酸可以编码包含膜结合结构域的融合蛋白。
表达载体
可以利用表达载体在期望水平上于宿主生物中表达PS4核酸。
包含PS4核酸的表达载体可以是能够在选定宿主生物中表达编码PS4核酸的基因的任何载体，载体的选择将取决于要将其导入的宿主细胞。因而，载体可以是自主复制载体，即作为游离型实体存在的载体，其复制独立于染色体复制之外，如质粒，噬菌体或游离型元件，小染色体或人工染色体。或者，载体可以是当导入宿主细胞时，整合入宿主细胞基因组中并与染色体一起复制的载体。
表达载体的组成
表达载体一般包括克隆载体的组分，如，例如，允许载体在选定的宿主生物中自主复制的元件和一种或多种用于选择目的的表型上可检测的标记。表达载体在正常情况下包含控制核苷酸序列，其编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号、以及任选地，阻遏子基因或一种或多种激活子基因。此外，表达载体可以包含编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列能够将PS4变体多肽靶向到宿主细胞细胞器上，如过氧化物酶体，或靶向到特定的宿主细胞区域上。这种靶向序列包括但不限于序列SKL。在本文中，术语“表达信号”包括任一种以上控制序列，阻遏子或激活子序列。为了在控制序列的指导下表达，将PS4变体多肽的核苷酸序列以对于表达正确的方式可操作性地连接到控制序列上。
优选地，将载体中的核苷酸可操作性地连接到控制序列上，所述控制序列能够提供宿主细胞的编码序列的表达，即所述载体是表达载体。术语“可操作性地连接”意指本文所述的组分处于这样的关系，即允许它们以其希望的方式发挥功能。“可操作性地连接”到编码序列上的调控序列是以这样的方式连接的，即使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下得以实现。
可以例如通过加入另外的转录调控元件来修饰控制序列，以使得由控制序列指导的转录水平对于转录调节剂更加具有响应性。控制序列可以特别包含启动子。
启动子
在载体中,编码变体PS4多肽的核酸序列可操作性地与合适的启动子序列相组合。启动子可以是在选择的宿主生物中具有转录活性的任何DNA序列并且可以源自与宿主生物同源或异源的基因。
细菌启动子
用于指导修饰核苷酸序列,如PS4核酸，在细菌宿主中转录的合适启动子的例子包括大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣型芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草杆菌(Bacillussubtilis)xylA和xylB基因的启动子和来源于乳球菌(Lactococcus sp.)的启动子，包括P170启动子。当编码PS4变体多肽的基因在细菌物种如大肠杆菌中表达时，可以从例如噬菌体启动子包括T7启动子和噬菌体λ启动子中选择合适的启动子。
真菌启动子
对于在真菌物种中转录，有用的启动子的实例是来源于编码以下酶的基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶。
酵母启动子
用于在酵母种中表达的合适启动子的实例包括但不限于酿酒酵母的Gal1和Gal10启动子以及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)AOX1或AOX2启动子。
宿主生物
(I)细菌宿主生物
合适的细菌宿主生物的实例是革兰氏阳性细菌种，如芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌（Bacillusalkalophilus）、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacilus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；链霉菌属(Streptomyces)种，例如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；乳酸细菌种，包括乳球菌属(Lactococcus spp.)例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，乳杆菌属(Lactobacillus spp.)包括路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌属(Leuconostoc spp.)；片球菌属(Pediococcusspp.)和链球菌(Streptococcus spp.)。或者，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)包括大肠杆菌或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌种的菌株作为宿主生物。
(II)酵母宿主生物
合适的酵母宿主生物可以选自生物技术相关的酵母种，例如但不限于酵母种如毕赤酵母、汉逊酵母或克鲁维酵母属、Yarrowinia属的种或酵母属种包括酿酒酵母或属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的种例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)的种。
优选使用甲基营养酵母种巴斯德毕赤酵母的菌株作为宿主生物。优选所述宿主生物是汉逊酵母属菌种。
(III)真菌宿主生物
在丝状真菌中合适的宿主生物包括曲霉属菌种，例如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。或者，可以使用镰孢属(Fusarium)物种例如尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)的菌株或根粘菌属(Rhizomucor)物种例如Rhizomucor miehei的菌株作为宿主生物。其它合适的菌株包括嗜热霉属(Thermomyces)和毛霉属(Mucor)物种。
蛋白质表达和纯化
可以将包含多核苷酸的宿主细胞用来表达多肽，如变体PS4多肽,及其片段，同源物，变体或衍生物。宿主细胞可以在合适的条件下进行培养，所述条件允许蛋白质的表达。多肽的表达可以是组成性的，从而它们得以不断地生产,或可诱导的，需要刺激以起始表达。在可诱导表达的情况下，当需要通过，例如，添加诱导剂物质，例如例如地塞米松或IPTG到培养基中时，可以起始蛋白质生产。
可以通过多种本领域已知的技术将多肽从宿主细胞中提取出来，包括酶学的，化学的和/或渗透性裂解和物理裂解。还可以在体外无细胞系统,如TnTTM(Promega)兔网状细胞系统中重组生产多肽。
实施例
实施例1.PS4的克隆
将嗜糖假单胞菌过夜生长在LB培养基上并通过标准方法(Sambrook J,1989)分离染色体DNA。利用引物P1和P2(见表3)通过PCR由嗜糖假单胞菌染色体DNA扩增包含PS4开放阅读框的2190bp片段(Zhou等人,1989)。将得到的片段在巢式PCR中用作模板，所述巢式PCR用引物P3和P4，扩增没有其信号序列的PS4的开放阅读框并且在基因的5'端导入NcoI位点并在3'端导入BamHI位点。与NcoI位点一起导入N末端蛋氨酸的密码子，允许PS4的细胞内表达。将1605bp片段克隆入pCRBLUNT TOPO(Invitrogen)并通过测序分析构建体的完整性。修饰大肠杆菌芽孢杆菌穿梭载体pDP66K(Penninga等人,1996)以允许PS4在P32启动子和ctg酶信号序列控制下表达。将得到的质粒，pCSmta转化入枯草芽孢杆菌中。
制成第二个表达构建体，其中去除了PS4的淀粉结合结构域。在使用引物P3和P6(表3)对pCSmta的PCR中,生成了截短形式的mta基因。pCSmta中的全长mta基因与所述截短形式交换，这产生了质粒pCSmta-SBD。
实施例2.PS4的定点诱变
通过两种方法将突变导入mta基因中。可以通过基于二步PCR的方法，或通过Quick Exchange方法(QE)。为了方便将mta基因分成三部分;PvuI-FspI片段,a FspI-PstI片段和PstI-AspI片段,进一步分别称为片段1,2和3。
在基于二步PCR的方法中,利用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)导入突变。用编码链的诱变引物(表4)加上下面的链上的下游引物(2R或3R，表3)实施第一次PCR。将反应产物与编码链上的上游引物一起用作第二次PCR中的引物。将后一个反应的产物克隆入pCRBLUNT topo(Invitrogen)中并且在测序后将片段与pCSmta中对应的片段相交换。
利用Quick Exchange方法(Stratagene),在包含mta基因、或mta基因的部分的质粒上使用两条互补引物在PCR中将突变导入。
为此目的构建了一组便利的质粒，包含3SDM质粒和3pCSΔ质粒。SDM质粒每一个都携带如上所述的mta基因的片段之一，其中通过QE导入所需的突变。通过测序确证后，将片段克隆入对应的受体pCSΔ质粒中。pCSΔ质粒是来自pCSmta的无活性衍生物。通过由SDM质粒克隆相应的片段来保留活性，使得筛选易于进行。
表3.用在克隆mta基因中的引物，和用在以二步PCR方法构建定点突变体中的标准引物
表4:用于在mta中导入定点突变的引物
表5.SDM和pCSΔ质粒的特征
质粒 特征/构建
SDM1 pBlueSK+480bp SalI-StuI片段mta
SDM2 pBlueSK+572bp SacII-PstI片段mta
SDM3 pBlueSK+471bp SalI-StuI片段mta
pCSΔ1 以Klenow填充入的FseI位点---->mta中的移码
pCSΔ2 用'无用DNA'替换的mta的FspI-PstI片段
pCSΔ3 用'无用DNA'替换的mta的PstI-AspI片段
实施例3.多个SDM
利用Multi Site Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene)根据生产商的方案，如所述进行一些改进，生成PS4变体。
步骤1:突变体链合成反应(PCR)
接种3ml.LB(22g/l Lennox L Broth Base,Sigma)+抗生素(0,05μg/ml卡那霉素,Sigma)于10ml Falcon试管中。
-于37℃温育,约200rpm.
-通过离心沉淀细胞(5000rpm/5分钟)
-倒掉培养基
-利用QIAGEN Plasmid Mini Purification Protocol制备ds-DNA模板
1.用于热循环的突变体链合成反应制备如下:
PCR混合物:
通过抽吸混合所有组分并短暂离心沉淀反应混合物。
2.利用下列参数循环反应:
35个变性循环(96℃/1分钟)
引物退火(62,8℃/1分钟)
延伸(65℃/15分钟)
随后保持于4℃
在将PCR管放置在机器中之前将PCR机器盖预热至105℃并将板预热至95℃(eppendorf热循环仪)。
步骤2:Dpn I消化
1.加入2μl Dpn I限制酶(10U/μl)至每个扩增反应中，通过抽吸混合并离心沉淀混合物。
2.于37℃温育～3hr。
步骤3:超感受态细胞的转化
1.将XL10-Gold细胞在冰上解冻。等分45μl细胞/每个诱变反应到预冷的Falcon试管中。
2.打开水浴(42℃)并将盛有NZY+液体培养基的试管置于水浴中预热。
3.添加2μlβ-巯基乙醇混合物至每个试管中。轻轻旋转并轻叩并于冰上温育10分钟,每2分钟旋转一次。
4.添加1,5μl Dpn I-处理的DNA至每等份的细胞中，旋转混合并于冰上温育30分钟。
5.于42℃水浴中热脉冲30秒并置于冰上2分钟。
6.添加0.5ml预热的NZY+液体培养基至每个试管中并于37℃于225-250rpm摇动温育1hr。
7.将200μl每种转化反应物铺平板于LB板上(33,6g/l Lennox L Agar,Sigma)，所述LB板包含1%淀粉和0,05μg/ml卡那霉素。
8.将转化板于37℃温育过夜。
表6.pPD77d14的引物表:
表7.pPD77d20的引物表:
表8.pPD77d34的引物表:
基于pPD77的载体系统
用于pPD77的载体系统基于pCRbluntTOPOII(invitrogen)。zeocin抗性盒已经被pmlI所去除，去除了393bp的片段。随后将来自pCC载体(P32-ssCGTase-PS4-tt)的表达盒插入到载体中。
PS4变体连接入pCCMini
用限制酶Nco1和Hind III(Biolabs)切割包含相关突变的质粒(通过MSDM生成):3μg质粒DNA,Xμl10x缓冲液2,10单位Nco1,20单位HindIII,于37℃温育2h。
将消化产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳。将1293bp大小的片段(PS4基因)从凝胶中切出并利用Qiagen凝胶纯化试剂盒进行纯化。
随后用限制酶Nco1和Hind III切割载体pCCMini,并且随后将消化产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳。将3569bp大小的片段从凝胶中切出并利用Qiagen凝胶纯化试剂盒进行纯化。
连接:使用快速DNA连接试剂盒(Roche)
使用与载体相比双倍量的插入片段
例如2μl插入片段(PS4基因)
1μl载体
5μl T4DNA连接缓冲液2x浓度
1μl dH2O
1μl T4DNA连接酶
连接5分钟/室温
根据生产商的方案(Invitrogen)将连接产物转化入One Shot TOPO感受态细胞中。每次转化使用5μl连接产物。
将50μl转化混合物铺平板到LB平板(33,6g/l Lennox L Agar,Sigma)上，所述平板包含1%淀粉和0,05μg/ml卡那霉素。通过在淀粉平板上的晕环形成可以识别包含插入片段(PS4变体)的载体。
实施例4.转化入枯草芽胞杆菌中(原生质体转化)
根据下列方案用突变的pCS-质粒来转化枯草芽胞杆菌(菌株DB104A;Smith等人1988;Gene70,351-361)。
A.原生质体形成和转化的培养基
2XSMM每升:342g蔗糖(1M);4.72g马来酸钠(0.04M);8:12gMgC12,6H20(0.04M);pH6.5用浓NaOH。分装在50-ml份中并高压灭菌10分钟。
4x YT(1/2NaCl)每100ml2g酵母提取物+3.2g胰蛋白胨+0.5g NaCl。SMMP混合等体积的2x SMM和4x YT。
PEG于25ml1x SMM中的10g聚乙二醇6000(BDH)或8000(Sigma)(高压灭菌10分钟.)。
B.铺平板/再生的培养基
琼脂 4%Difco基本琼脂。高压灭菌15分钟。
琥珀酸钠270g/1(1M),用HCl调pH至7.3，高压灭菌15分钟。
磷酸盐缓冲液每100ml3.5g K2HPO4+1.5g KH2PO4，高压灭菌15分钟。
250ml琥珀酸钠
50ml酪蛋白氨基酸
25ml酵母提取物
50ml磷酸盐缓冲液
15ml葡萄糖
10ml MgCl2
100ml熔化的琼脂
添加合适的抗生素:氯霉素和四环素,5ug/ml;刺桐素,l ug/ml。在卡那霉素上的选择在DM3培养基中有问题:可能需要250ug/ml的浓度。
C.原生质体的制备
1.整个过程中使用无去污剂的塑料或玻璃器皿。
2.从单一菌落接种10ml的2x YT培养基在100-ml烧瓶中。在摇床上于25-30℃生长过夜培养物(200转/分钟)。
3.将过夜培养物用100ml新鲜的2x YT培养基稀释20倍(250-ml烧瓶)并在摇床中(200-250转/分钟)于37℃生长直到OD600=0.4-0.5(大约2h)。
4.通过离心收获细胞(9000g,20分钟,4℃).
5.用吸液管除去上清液并将细胞重悬于5ml的SMMP+5mg溶菌酶中,无菌过滤。
6.于37℃在水浴摇床中(100转/分钟)温育。
30分钟后并在其后以15分钟的间隔,通过显微镜检查25μl样品。继续温育直到99%的细胞被原生质化(球状外形)。通过离心收获原生质体(4000g,20分钟,室温)并吸掉上清液。将沉淀物轻轻重悬于1-2ml的SMMP中。
原生质体现在可以使用。（可以将等份(例如0.15ml)冷冻在-80℃以便将来使用(不需要添加甘油)。尽管这可能导致转化能力的一些减弱，但用冷冻的原生质体每μg的DNA可以获得106转化子）。
D.转化
1.将450μl的PEG转移到微量试管中。
2.将1-10μl的DNA(0.2μg)与150μl原生质体混合并将混合物加入到盛有PEG的微量试管中。立即，但轻轻地混合。
3.于室温放置2分钟,随后加入1.5ml的SMMP并混合。
4.通过微离心(10分钟,13.000转/分钟(10-12.000g))收获原生质体并倒出上清液。用薄纸除去剩余的小滴。
加入300ul的SMMP(不要振荡)并于37℃在水浴摇床中(100转/分钟)温育60-90分钟以允许抗生素抗性标记物的表达。(在水浴的摇晃活动过程中原生质体得以充分重悬。)在1x SSM中进行合适的稀释并将0.1ml铺在DM3平板上。
实施例5.在摇瓶中发酵PS4变体
如下制备摇瓶底物:
成分 %(w/v)
水 -
酵母提取物 2
大豆粉 2
NaCl 0.5
磷酸氢二钾 0.5
防沫剂 0.05
在高压灭菌前用4N硫酸或氢氧化钠将底物调节至pH6.8。将100ml的底物置于带一个档板的500ml烧瓶中并高压灭菌30分钟。随后，加入6ml的无菌葡萄糖浆。通过混合一个体积的50%w/v葡萄糖与一个体积的水，随后高压灭菌20分钟，来制备葡萄糖浆。
用变体接种摇瓶并在温箱中于35℃/180rpm温育24小时。温育后通过离心(10.000x g10分钟)从液体培养基中分离细胞，最后，通过0,2μm微滤制备无细胞的上清液。将无细胞的上清液用于测定和应用试验。
实施例6.淀粉酶测定
Betamyl测定
一个Betamyl单位被定义为每1分钟降解0,0351mmole的PNP偶联麦芽戊糖的活性，从而通过在测定混合物中的过量α-葡萄糖苷酶每1分钟可以释放0,0351mmole的PNP。测定混合物包含50μl50mM柠檬酸钠,5mM CaCl2,pH6,5，和25μl酶样品以及来自Megazyme,Ireland的25μlBetamyl底物(Glc5-PNP和α-葡萄糖苷酶)(1瓶，溶于10ml水中)。将测定混合物于40℃温育30分钟并随后通过加入150μl4%Tris进行终止。利用ELISA读取器测量420nm上的吸光度，并基于活性=A420*以Betamyl单位的d/ml测定的酶样品来计算Betamyl活性。
内淀粉酶测定
内淀粉酶测定与根据生产商(Pharmacia&Upjohn Diagnostics AB)运行的Phadebas测定相同。
外切特异性
利用外切型淀粉酶活性与Phadebas活性的比率来评估外切特异性。
特异性活性
对于PSac-D14,PSac-D20和PSac-D34变体，根据Bradford(1976;Anal.Biochem.72,248)所测量的，我们发现了每微克纯化蛋白质10Betamyl单位的平均特异性活性。基于活性使用这种特异性活性来计算用于应用试验中的剂量。
实施例7.半寿期测定
t1/2被定义为在限定的热条件下半数酶活性失活的时间（分钟）。为了测定酶的半寿期，将样品在60℃到90℃的恒温下加热1-10分钟。基于残余Betamyl测定来计算半寿期。
过程:在Eppendorf瓶中,将1000μl缓冲液在60℃或更高的温度下预热至少10分钟。在热温箱(来自Eppendorf的Termomixer设备)中在Eppendorf瓶的持续混合(800rpm)下将100μl样品加到预热的缓冲液中后启动加热处理。在温育0,2,4,6,8和9分钟后，通过将45μl样品转移到于20℃平衡过的1000μl缓冲液并于1500rpm20℃温育一分钟来终止处理。用Betamyl测定来测量残余活性。
计算:t1/2的计算是基于残余Betamyl活性对温育时间的log10斜率(the base-10logarithm)进行的。将t1/2计算为斜率/0.301=t1/2。
实施例8.模式系统烘焙试验
于30.0℃在淀粉测定记录仪中制作生面团。称出10.00g改造过的面粉并加在淀粉测定记录仪中;1分钟后用无菌吸液管通过捏合桶（kneadingvat）的孔加入混合参照/样品(参照=缓冲液或水,样品=酶+缓冲液或水)。30秒后将面粉从边缘刮除-也是通过捏合桶的孔。将样品揉捏7分钟。
在最后参照运行之前在淀粉测定记录仪上进行用缓冲液或水的试验。对于参照FU应当是400,如果它不是，这应当用，例如，液体的量进行调节。在将参照/样品填充到小玻璃试管(大约4.5cm长)之前，用抹刀移去参照/样品并置入手中(戴一次性手套)，所述小玻璃试管放在NMR管中并塞上瓶塞。对于每个生面团制作7管。
当制备了所有的样品时，将试管置于（可程控）33℃水浴中（无塞）25分钟，此后将水浴于33℃放置5分钟,随后在56分钟内加热到98℃(1.1℃每分钟)并最后于96℃放置5分钟。
将试管于20.0℃保存在热餐具柜中。于第1，3和7天利用Bruker NMS120Minispec NMR分析仪通过质子NMR测量面包心（crumb）的固体含量，如图2中对于用0,05,1和2ppm PSacD34制备的面包心样品所示。随着时间固体含量增长降低表示支链淀粉凝陈的减弱。于20.0℃保存在热餐具柜中7天后，称出10-20mg的面包心样品并置于40μl铝标准DSC瓶帽中并保持在20℃。
将所述瓶帽在Mettler Toledo DSC820仪器上用于进行差示扫描量热法。作为参数，使用20-95℃的热循环，每分钟10℃加热，和气体/流动:N2/80ml每分钟。对结果进行分析并以J/g计算凝陈支链淀粉的融化焓。
实施例9.抗陈化作用
制备模式面包心并根据实施例8进行测量。如表2中所示，与对照相比，如通过差示扫描量热法所测量的，在烘焙后PS4变体显示支链淀粉凝陈的强烈减弱。PS4变体显示清楚的剂量效应。
实施例10.烘焙试验中的硬度效应
用标准的白面包海绵状物（sponge）和美国吐司生面团配方进行烘焙试验。由1600g来自Sisco Mills,USA的"全能经典型"面粉,950g水,40g大豆油和32g干酵母制备海绵状物生面团。在Hobart螺旋式混合器上以低速将海绵状物混合1分钟并随后以2速混合3分钟。随后将海绵状物于35℃,85%RH发酵2,5小时，随后于5℃0,5小时。
此后将400g面粉,4g的干酵母,40g盐,2,4g的丙酸钙,240g高果糖玉米糖浆(Isosweet),5g乳化剂PANODAN205,5g酶活性大豆粉,30g无活性大豆粉,220g水和30g抗坏血酸溶液(由4g抗坏血酸溶于500g水中制备)加入到海绵状物中。将得到的生面团在Diosna混合器上以低速混合1分钟并随后以2速混合6分钟。此后将生面团于环境温度放置5分钟,随后称取550g生面团块,放置5分钟并且随后在Glimek压面机上对于以每侧1:4,2:4,3:15,4:12和10的设置进行压面，并转移到烘焙模中。于43℃、90%RH发面60分钟后将生面团于218℃烘焙29分钟。
用TA-XT2结构分析仪测量硬度和弹性。利用来自Stable MicroSystems,UK的结构分析仪通过分析面包片来测量软度、粘性和弹性。使用下列设置：
预试验速度:2mm/s
试验速度:2mm/s
试验后速度:10mm/s
破裂试验距离:1%
距离:40%
力:0.098N
时间:5.00sec
计数:5
测压元件:5kg
触发型:Auto–0.01N
硬度测量显示从第1天到第7天PS4变体多肽显著减弱了硬度发展并且随着酶剂量的提高显示更高效果。
实施例11.丹麦面包卷体积的控制
基于2000g丹麦改良面粉(来自Cerealia),120g压缩酵母,32g盐,和32g蔗糖由生面团制备丹麦面包卷。根据先前的水优化添加水至生面团。
将生面团在Diosna混合器(于低速2分钟和高速5分钟)中混合。在混合物将生面团温度保持在26℃。称取1350g生面团并于30℃放置在加热箱中10分钟。在Fortuna铸模上铸型面包卷并于34℃和85%相对湿度下发面45分钟。随后将面包卷在Bago2烤箱中于250℃烘焙18分钟，在最初13秒加蒸气。在烘焙后，称重和测量体积之前，将面包卷冷却25分钟。
对面包卷评估面包皮外观,面包心同质性,面包皮的帽化（capping）,ausbund和特定的体积(用油菜籽置换方法测量体积)。
基于这些标准发现PS4变体提高特定体积并且改善了丹麦面包卷的品质参数。因而PS4变体能够控制烘焙产品的体积。
实施例12.结果
表9.与野生型PSac-cc1相比PSac-变体的生化特性
序列pPD77d40,pMD55,pMD85,pMD96,pMD86和pMD109具有第五栏中突变的残基以及嗜糖假单胞菌野生型背景中缺失的淀粉结合结构域(SEQ ID NO:1)。可以用这种信息以直接的方式来构建它们的序列。
在下列小节中介绍各个位置上个别突变的详细效应。
具有突变121F的PS4变体多肽的增强的热稳定性
对在N33Y,D34N,G121F,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,L178F,A179T上具有氨基酸突变的命名为pMD55的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表中所示这种多肽显示提高的热稳定性。还见实施例12和上表9。
具有突变161A的PS4变体多肽的提高的外切特异性
对在N33Y,D34N,G121F,G134R,A141P,I157L,S161A,L178F,A179T,G223E,H307L,S334P上具有氨基酸突变的命名为pMD96的PS4变体多肽测试外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的外切特异性。还见实施例12和上表9。
具有突变223E的PS4变体多肽的提高的外切特异性
对在N33Y,D34N,G121F,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223E,H307L,S334P上具有氨基酸突变的命名为pMD85的PS4变体多肽测试外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的外切特异性。还见实施例12和上表9。
实施例13.具有突变121D的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对在N33Y D34N G134R A141P I157L L178F A179T G121D H307LS334P上具有氨基酸突变的命名为pMD3的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
实施例14.具有突变121W的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对在N33Y D34N G134R A141P I157L L178F A179T G121W H307LS334P上具有氨基酸突变的命名为pMD44的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
实施例15.具有突变121H的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对在N33Y D34N G134R A141P I157L L178F A179T G121H H307LS334P上具有氨基酸突变的命名为pMD43的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
实施例16.具有突变121M的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对在N33Y D34N G134R A141P I157L L178F A179T G121M H307LS334P上具有氨基酸突变的命名为pMD41的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
实施例17.具有突变121A的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对在N33Y D34N G134R A141P I157L L178F A179T G121A H307LS334P上具有氨基酸突变的命名为pMD74a的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
实施例18.具有突变121Y的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对在N33Y D34N G134R A141P I157L L178F A179T G121Y H307LS334P上具有氨基酸突变的命名为pMD73a的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
实施例19.具有突变223A的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对在N33Y D34N G121D G134R A141P I157L L178F A179T G223AH307L S334P上具有氨基酸突变的命名为pMD3的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
实施例20.具有突变223K的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对N33Y D34N G121D G134R A141P I157L L178F A179T G223KH307L S334P上具有氨基酸突变的命名为SSM173F6的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
实施例21.具有突变223V的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对在N33Y D34N G121D G134R A141P I157L L178F A179T G223VH307L S334P上具有氨基酸突变的命名为pMD49的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
实施例22.具有突变223E的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对在N33Y D34N G121D G134R A141P I157L L178F A179T G223EH307L S334P上具有氨基酸突变的命名为SSM171G11的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
实施例23.具有突变G223R的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对在N33Y D34N G121D G134R A141P I157L L178F A179T G223RH307L S334P上具有氨基酸突变的命名为SSM173B6的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
实施例24.具有突变Y146G的PS4变体多肽的提高的热稳定性
对在33Y,34N,121F,134R,141P,146G,157L,161A,178F,179T,223E,307L和334P上具有氨基酸突变的命名为SSM381的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性。
SEQ ID NO: 标识符 突变 主链 t1/2-80 t1/2-85
15 SSM381 Y146G pMD96 20 2.6
14 PMD96 6.0 1.4
实施例25.具有突变157M的PS4变体多肽的提高的热稳定性
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157M,161A,178F,179T,223E,307L和334P上具有氨基酸突变的命名为SSM279B1的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性。
SEQ ID NO: 标识 突变 主链 t1/2-80
16 PMD140 L157M PMD96 7,6
13 PMD96 6,0
实施例26.具有突变158T的PS4变体多肽的提高的热稳定性
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,158T,161A,178F,179T,223E,307L和334P上具有氨基酸突变的命名为SSM237P2的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性。
SEQ ID NO: 标识符 突变 主链 t1/2-80
17 PMD130 G158T PMD96 8,0
13 PMD96 6,0
实施例27.具有突变198W和/或229P的PS4变体多肽的提高的热稳定性
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,229P,307L和334P上具有氨基酸突变的命名为SSM325F3的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性。
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,198W,223E,229P,307L和334P上具有氨基酸突变的命名为pMD129的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性。
实施例28.具有突变G303E或G303D的PS4变体多肽的提高的外切特异性
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,303E,307L和334P上具有氨基酸突变的命名为SSM341A9的PS4变体多肽测试外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的外切特异性。
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,303D,307L和334P上具有氨基酸突变的命名为SSM341G11的PS4变体多肽测试外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的外切特异性。
SEQ ID NO: 标识符 突变 主链 Betamyl/Phadebas
21 SSM341A9 G303E pMD96 256
22 SSM341G11 G303D pMD96 230
14 pMD96 179
实施例29.具有突变H306T或H306G的PS4变体多肽的提高的外切特异性
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,306T,307L和334P上具有氨基酸突变的命名为SSM350B11的PS4变体多肽测试外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的外切特异性。
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,306G,307L和334P上具有氨基酸突变的命名为SSM350C12的PS4变体多肽测试外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的外切特异性。
SEQ ID NO: 标识符 突变 主链 Betamyl/Phadebas
23 SSM350B11 H306T pMD96 271
24 SSM350C12 H306G pMD96 195
14 pMD96 179
实施例30.具有突变A309P的PS4变体多肽的提高的外切特异性
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,309P,307L和334P上具有氨基酸突变的命名为SSM332Q4的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性。
SEQ ID NO: 标识符 突变 主链 t1/2-80 t1/2-85
25 SSM332Q4 A309P pMD96 7.5 2,5
14 PMD96 6.0 1.4
实施例31.具有突变R316S或R316P的PS4变体多肽的提高的热稳定性
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,316S,和334P上具有氨基酸突变的命名为SSM365B4的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性。
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,316P和334P上具有氨基酸突变的命名为SSM365F4的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性。
SEQ ID NO: 标识符 突变 主链 t1/2-80 t1/2-t1/2-85
26 SSM365B4 R316S pMD96 7.5 2.5
27 SSM365F4 R316P pMD96 7.1 2.0
14 PMD96 6.0 1.4
实施例32.具有突变R353T的PS4变体多肽的提高的热稳定性
对在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,334P和353T上具有氨基酸突变的命名为SSM360C7的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性。
SEQ ID NO: 标识符 突变 主链 t1/2-80 t1/2-85
28 SSM360C7 R353T pMD96 5.6 2.6
14 PMD96 6.0 1.4
实施例33.具有突变26E的PS4变体多肽的提高的外切特异性
对在N26E N33Y D34N G121F G134R A141P I157L L178F A179TG223A H307L S334P上具有氨基酸突变的命名为SSM219B3的PS4变体多肽测试外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的外切特异性。
在用PD-10柱(来自Amersham Biosciences)进行样品的凝胶过滤之后，根据实施例8测定半寿期t1/2-85，所述凝胶过滤使用50mM柠檬酸钠,5mM CaCl2,pH6.5缓冲液。
实施例34.具有突变70D的PS4变体多肽的提高的外切特异性
对在N33Y D34N G70D G121F G134R A141P Y146G I157L G158TS161A L178F A179T G223E S229P H307L A309P S334P上具有氨基酸突变的命名为SAS1401L10的PS4变体多肽测试外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的外切特异性。
在用PD-10柱(来自Amersham Biosciences)进行样品的凝胶过滤之后，根据实施例8测定半寿期t1/2-85，所述凝胶过滤使用50mM柠檬酸钠,5mM CaCl2,pH6.5缓冲液。
实施例35.具有突变145D的PS4变体多肽的提高的热稳定性和外切特异性
对在N33Y D34N G121F G134R A141P N145D Y146G I157L G158TS161A L178F A179T G223E S229P H307L A309P S334P上具有氨基酸突变的命名为SAS1387D16bf的PS4变体多肽测试热稳定性和外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性和提高的外切特异性。
在用PD-10柱(来自Amersham Biosciences)进行样品的凝胶过滤之后，根据实施例8测定半寿期t1/2-85，所述PD-10柱使用50mM柠檬酸钠,5mM CaCl2,pH6.5缓冲液。
实施例36.具有突变188H的PS4变体多肽的提高的热稳定性
对在N33Y D34N G70D G121F G134R A141P N145D Y146G I157LG158T S161A L178F A179T G188H G223E S229P H307L A309P S334PW339E上具有氨基酸突变的命名为pMD236的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性。
在用PD-10柱(来自Amersham Biosciences)进行样品的凝胶过滤之后，根据实施例8测定半寿期t1/2-85，所述凝胶过滤使用50mM柠檬酸钠,5mMCaCl2,pH6.5缓冲液。
实施例37.具有突变188S的PS4变体多肽的提高的热稳定性
对在N33Y D34N G70D G121F G134R A141P N145D Y146G I157LG158T S161A L178F A179T G188S G223E S229P H307L A309P S334PW339E上具有氨基酸突变的命名为pMD237bf的PS4变体多肽测试热稳定性。如下表所示这种多肽显示提高的热稳定性。
在用PD-10柱(来自Amersham Biosciences)进行样品的凝胶过滤之后，根据实施例8测定半寿期t1/2-85，所述凝胶过滤使用50mM柠檬酸钠,5mM CaCl2,pH6.5缓冲液。
实施例38.具有突变339A的PS4变体多肽的提高的外切特异性
对在N33Y D34N G121F G134R A141P Y146G I157L G158T S161AL178F A179T G223E S229P H307L A309P S334P W339A上具有氨基酸突变的命名为SAS1379O13的PS4变体多肽测试外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的外切特异性。
在用PD-10柱(来自Amersham Biosciences)进行样品的凝胶过滤之后，根据实施例8测定半寿期t1/2-85，所述凝胶过滤使用50mM柠檬酸钠,5mM CaCl2,pH6.5缓冲液。
实施例39.具有突变339E的PS4变体多肽的提高的外切特异性
对在N33Y D34N G121F G134R A141P Y146G I157L G158T S161AL178F A179T G223E S229P H307L A309P S334P W339E上具有氨基酸突变的命名为SAS1379O9的PS4变体多肽测试外切特异性。如下表所示这种多肽显示提高的外切特异性。
在用PD-10柱(来自Amersham Biosciences)进行样品的凝胶过滤之后，根据实施例8测定半寿期t1/2-85，所述凝胶过滤使用50mM柠檬酸钠,5mM CaCl2,pH6.5缓冲液。
其它方面
现在下列编号的段落中给出本发明的其它方面和实施方案；所要理解的是本发明包括这些方面:
段落A1.一种可源自具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的亲本多肽的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽相对于如SEQ ID NO:1所示嗜糖假单胞菌外切型淀粉酶序列的位置编号在位置121上包含氨基酸突变。
段落A2.根据段落A1的PS4变体多肽,其中位置121上的突变包含取代121F,121Y和/或121W,优选G121F,G121Y和/或G121W。
段落A3.根据段落A1或A2的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自:161和223组的位置上进一步包含一个或多个其它突变。
段落A4.根据段落A3的PS4变体多肽,其中所述一个或多个进一步的突变选自下组突变:161A,223E和223K,更加优选S161A,G223E和/或G223K。
段落A5.根据前述任一段落A的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自下组的位置上包含突变:121,161;121,223。
段落A6.根据段落A5的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自下组的位置上包含突变:121F/Y/W,161A;121F/Y/W,223E/K。
段落A7.根据前述任一段落A的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自下组的位置上包含突变:121,161和223。
段落A8.根据前述任一段落A的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽包含突变121F/Y/W,161A,223E/K。
段落A9.根据前述任一段落A的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽进一步包含选自下组位置的一个或多个突变,优选全部突变:134,141,157,223,307,334。
段落A10.根据前述任一段落A的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在位置33和34中任一个或两者中进一步包含突变。
段落A11.根据段落A10的PS4变体多肽，其中PS4变体多肽进一步包含选自下组的一个或多个取代,优选全部取代：G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,以及任选地N33Y和D34N中的一个或两个。
段落A12.根据前述任一段落A的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽进一步包含:
(a)位置121上的突变,优选121D,更加优选G121D;
(b)位置178上的突变,优选178F,更加优选L178F;
(c)位置179上的突变,优选179T,更加优选A179T;和/或
(d)位置87上的突变,优选87S,更加优选G87S。
段落B1.一种可源自具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的亲本多肽的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽参照如SEQ ID NO:1所示嗜糖假单胞菌外切型淀粉酶序列的位置编号在位置161上包含氨基酸突变。
段落B2.根据段落B1的PS4变体多肽,其中位置161上的突变包含取代161A,优选S161A。
段落B3.根据段落B1或B2的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自下组:121和223的位置上进一步包含一个或多个进一步的突变。
段落B4.根据段落B3的PS4变体多肽,其中所述一个或多个进一步的突变选自下组突变:121F,121Y,121W,223E和223K,更加优选G121F,G121Y,G121W,G223E和/或G223K。
段落B5.根据前述任一段落B的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自下组:121,161;161,223的位置上包含突变。
段落B6.根据段落B5的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自:121F/Y/W,161A;161A,223E/K的位置上包含突变。
段落B7.根据前述任一段落B的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自下组:121,161和223的位置上包含突变。
段落B8.根据前述任一段落B的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽包含突变121F/Y/W,161A,223E/K。
段落B9.根据前述任一段落B的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽进一步包含选自下组位置的一个或多个突变,优选全部突变:134,141,157,223,307,334。
段落B10.根据前述任一段落B的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在位置33和34的一个或两个上进一步包含突变。
段落B11.根据段落B10的PS4变体多肽，其中PS4变体多肽进一步包含选自下组的一个或多个取代,优选全部取代:G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,和任选地N33Y和D34N的一个或两个。
段落B12.根据前述任一段落B的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽进一步包含:
(a)位置121上的突变,优选121D,更加优选G121D;
(b)位置178上的突变,优选178F,更加优选L178F;
(c)位置179上的突变,优选179T,更加优选A179T;和/或
(d)位置87上的突变,优选87S,更加优选G87S。
段落C1.一种可源自具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的亲本多肽的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽参照如SEQ ID NO:1所示嗜糖假单胞菌外切型淀粉酶序列的位置编号在位置223上包含氨基酸突变。
段落C2.根据段落C1的PS4变体多肽,其中位置223上的突变包含取代223E和/或223K,优选G223E和/或G223K。
段落C3.根据段落C1或C2的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自下组:121和161的位置上进一步包含一个或多个进一步的突变。
段落C4.根据段落C3的PS4变体多肽,其中所述一个或多个进一步的突变选自下组:121F,121Y,121W和161A,更加优选G121F,G121Y,G121W和/或S161A。
段落C5.根据前述任一段落C的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自下组的位置上包含突变:121,223;161,223。
段落C6.根据段落C5的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自下组的位置上包含突变:121F/Y/W,223E/K;161A,223E/K。
段落C7.根据前述任一段落C的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在选自下组的位置上包含突变:121,161和223。
段落C8.根据前述任一段落C的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽包含突变121F/Y/W,161A,223E/K。
段落C9.根据前述任一段落C的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽进一步包含选自下组位置的一个或多个突变,优选全部突变:134,141,157,223,307,334。
段落C10.根据前述任一段落C的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽在位置33和34的一个或两个中进一步包含突变。
段落C11.根据段落C10的PS4变体多肽，其中PS4变体多肽进一步包含选自下组的一个或多个取代,优选全部取代:G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,和任选地N33Y和D34N的一个或两个。
段落C12.根据前述任一段落C的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽进一步包含:
(a)位置121上的突变,优选121D,更加优选G121D;
(b)位置178上的突变,优选178F,更加优选L178F;
(c)位置179上的突变,优选179T,更加优选A179T;和/或
(d)位置87上的突变,优选87S,更加优选G87S。
段落D1.一种可源自具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的亲本多肽的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽参照如SEQ ID NO:1所示嗜糖假单胞菌外切型淀粉酶序列的位置编号在选自下组的一个或多个位置上包含氨基酸突变：146,157,158,198,229,303,306,309,316和353。
段落D2.根据段落D1的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽包含选自下组的氨基酸突变:146G,146M,157M,158T,158A,158S,198W,198F,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P,316K,316Q和353T。
段落D3.根据段落D1的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽包含氨基酸突变146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T。
段落D4.根据段落D1的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽进一步包含选自下组位置的一个或多个突变：33,34,121,134,141,157,161,178,179,223,307和334，优选选自下组:33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L和334P。
段落D5.根据段落D1的PS4变体多肽,其中PS4变体多肽包含每一种下列突变:
(a)33Y,34N,121F,134R,141P,146G,157L,161A,178F,179T,223E,307L和334P,优选具有序列SEQ ID NO:15;
(b)33Y,34N,121F,134R,141P,157M,161A,178F,179T,223E,307L和334P,优选具有序列SEQ ID NO:16;
(c)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,158T,161A,178F,179T,223E,307L和334P,优选具有序列SEQ ID NO:17;
(d)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,198W,223E,307L和334P,优选具有序列SEQ ID NO:18;
(e)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,229P,307L和334P,优选具有序列SEQ ID NO:19;
(f)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,198W,223E,229P,307L和334P,优选具有序列SEQ ID NO:20;
(g)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,303E,307L和334P,优选具有序列SEQ ID NO:21;
(h)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,303D,307L和334P,优选具有序列SEQ ID NO:22;
(i)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,306T,307L和334P,优选具有序列SEQ ID NO:23;
(j)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,306G,307L和334P,优选具有序列SEQ ID NO:24;
(k)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,309P,307L和334P,优选具有序列SEQ ID NO:25;
(l)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,316S,和334P,优选具有序列SEQ ID NO:26;
(m)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,316P和334P,优选具有序列SEQ ID NO:27;和,
(n)33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,334P和353T,优选具有序列SEQ ID NO:28.
段落13.根据前述任一段落的PS4变体多肽,其中所述亲本多肽包含非产麦芽糖外切型淀粉酶,优选葡聚糖1,4-α-麦芽糖四水解酶(EC3.2.1.60)。
段落14.根据前述任一段落的PS4变体多肽,其中所述亲本多肽是或可源自假单胞菌属菌种,优选嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌。
段落15.根据前述任一段落的PS4变体多肽,其中所述亲本多肽是具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的序列的来自嗜糖假单胞菌外切型淀粉酶的非产麦芽糖外切型淀粉酶。
段落16.根据A1到A12,B1到B12,C1到C12,D1到D5,13和14任一段落的PS4变体多肽,其中具有如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11所示的序列的亲本多肽是来自施氏假单胞菌的非产麦芽糖外切型淀粉酶。
段落17.根据前述任一段落的PS4变体多肽,其包含说明书，段落或附图中所给出的序列。
段落18.根据前述任一段落的PS4变体多肽,其中当在相同条件下测试时与亲本多肽或野生型多肽相比PS4变体多肽具有较高的热稳定性。
段落19.根据前述任一段落的PS4变体多肽,其中半寿期(t1/2),优选在60℃,相对于亲本多肽或野生型多肽提高了15%或更多,优选50%或更多,最优选100%或更多。
段落20.根据前述任一段落的PS4变体多肽,其中当在相同条件下测试时与亲本多肽或野生型多肽相比PS4变体多肽具有较高的外切特异性。
段落21.根据前述任一段落的PS4变体多肽,其中与亲本多肽或野生型多肽相比PS4变体多肽具有10%或更高,优选20%或更高,优选50%或更高的外切特异性。
段落22.在前述任一段落中给出的PS4变体多肽作为食品添加剂的用途。
段落23.一种处理淀粉的方法，包括将淀粉与段落A1到A12,B1到B12,C1到C12,D1到D5和13到21任一段所给出的PS4变体多肽相接触，并允许所述多肽使淀粉生成一种或多种线性产品。
段落24.段落A1到A12,B1到B12,C1到C12,D1到D5和13到21任一段所给出的PS4变体多肽在制备食品产品中的用途。
段落25.一种制备食品产品的方法，包括将段落A1到A12,B1到B12,C1到C12,D1到D5和13到21任一段所给出的多肽产品与食品成分相混合。
段落26.根据段落24的用途，或根据段落25的方法,其中所述食品产品包含生面团或生面团产品,优选加工过的生面团产品。
段落27.根据段落24到26的任一段的用途或方法，其中所述食品产品是烘焙产品。
段落28.一种制作烘焙产品的方法，包括:(a)提供淀粉介质;(b)向淀粉介质中添加段落A1到A12,B1到B12,C1到C12,D1到D5和13到21任一段所给出的PS4变体多肽;和(c)在步骤(b)之中或之后加热淀粉介质以生产烘焙产品。
段落29.根据段落24到28的任一段的方法获得的食品产品,生面团产品或烘焙产品。
段落30.一种用于生面团的改良剂组合物,其中所述改良剂组合物包含段落A1到A12,B1到B12,C1到C12,D1到D5和13到21任一段所给出的PS4变体多肽,和至少一种另外的生面团成分或生面团添加剂。
段落31.包含面粉和如段落1-21中任一段所给出的PS4变体多肽的组合物。
段落32.段落A1到A12,B1到B12,C1到C12,D1到D5和13到21任一段所给出的PS4变体多肽，在生面团产品中以延迟或减弱生面团产品的陈化，优选有害凝陈的用途。
段落33.如前述任一段落所给出的PS4变体多肽与Novamyl，或其具有产麦芽糖α-淀粉酶活性的变体、同源物、或突变体的组合。
段落34.根据段落33的组合的用途，用于根据前述任一段落的应用。
段落35.用根据段落34的组合处理所生产的食品产品。
段落36.包含根据段落A1到A12,B1到B12,C1到C12,D1到D5和13到21任一段的PS4变体多肽的食品添加剂。
参考文献
Penninga,D.,van der Veen,B.A.,Knegtel,R.M.,van Hijum,S.A.,Rozeboom,H.J.,Kalk,K.H.,Dijkstra,B.W.,Dijkhuizen,L.(1996).The rawstarch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacilluscirculans strain251.J.Biol.Chem.271,32777-32784.
Sambrook J,F.E.M.T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edn.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY.
Zhou,J.H.,Baba,T.,Takano,T.,Kobayashi,S.,Arai,Y.(1989).Nucleotidesequence of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas saccharophila.FEBS Lett.255,37-41.
特此将本文中提及的每篇申请和专利，和在以上申请和专利中引用或提及的每篇文件，包括在每篇申请和专利的审批过程中的文件(“申请所引用的文件”)，和在每一篇申请和专利中以及在申请和专利申请引用的任何文件中引用或提及的任何生产商的说明书或产品目录并入本文作为参考。另外，特此将本文中引用的所有文件，以及本文中引用的文件中引用或提及的所有文件，以及在本文中引用或提及的任何生产商说明书或产品目录并入本文作为参考。
对本领域技术人员显而易见的是，不脱离本发明的范围和精神下，可对本发明所述的方法和系统进行各种修饰和改变。尽管通过具体优选实施方案描述了本发明，应当理解的是所要求保护的发明不应该不正当地被限制于所述的具体实施方案。事实上，用于实施本发明所述方式的各种修饰(对于分子生物学或相关领域的技术人员是显而易见的)，意味着落入下列权利要求的范围内。
序列表
SEQ ID NO:1
PS4参照序列,源自嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列.
SEQ ID NO:2
PSac-D34序列;具有11个取代和缺失了淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列.
SEQ ID NO:3
PSac-D20序列;具有13个取代和缺失了淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列
SEQ ID NO:4
PSac–D14序列;具有14个取代和缺失了淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。
SEQ ID NO:5
嗜糖假单胞菌葡聚糖1,4-α-麦芽糖四水解酶前体(EC3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(形成麦芽四糖的淀粉酶)(外切型麦芽糖四水解酶)(形成麦芽四糖的外切型淀粉酶).SWISS-PROT编号P22963。
SEQ ID NO:6
编码麦芽四水解酶(EC number=3.2.1.60)的嗜糖假单胞菌mta基因.GenBank编号X16732。
SEQ ID NO:7
PS4参照序列,源自施氏假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。
SEQ ID NO:8
PStu-D34序列;具有9个取代的施氏假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列
SEQ ID NO:9
PStu-D20序列;具有11个取代的施氏假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。
SEQ ID NO:10
PStu-D14序列;具有12个取代的施氏假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。
SEQ ID NO:11
施氏假单胞菌（全海假单胞菌，Pseudomonas perfectomarina)。葡聚糖1,4-α-麦芽糖四水解酶前体(EC3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(形成麦芽四糖的淀粉酶)(外切型麦芽糖四水解酶)(形成麦芽四糖的外切型淀粉酶)。
SWISS-PROT编号P13507.
SEQ ID NO:12
施氏假单胞菌形成麦芽四糖的淀粉酶(amyP)基因,完整编码序列。GenBank编号M24516。
SEQ ID NO:13
pMD55序列;具有11个取代(G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,N33Y,D34N,L178F,A179T和G121F)并缺失了淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。
SEQ ID NO:14
PMD96序列:在N33Y,D34N,G121F,G134R,A141P,I157L,S161A,L178F,A179T,G223E,H307L和S334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列.
DQAGKSPAGVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPYNWYNILRQQASTIAADGFSAIWMPVPWRDFSSWTDGGKSGGGE
GYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRFYPDKEINLPAGQRFWRNDCPDPGNYPNDCDD
GDRFLGGEADLNTGHPQIYGMFRDEFTNLRSGYGAGGFRFDFVRGYAPERVDSWMSDSADSSFCVGELWKEPSEYP
SWDWRNTASWQQIIKDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSVADWKHGLNGNPDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGG
QHLWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYWPHMYDWGYGDFIRQLIQVRRTAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGSQ
QTLVVALNSDLANPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGSGDGGGNDGG
SEQ ID NO:15
SSM381序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,146G,157L,161A,178F,179T,223E,307L和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列
DQAGKSPAGVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPYNWYNILRQQASTIAADGFSAIWMPVPWRDFSSWTDGGKSGGGE
GYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRFYPDKEINLPAGQRFWRNDCPDPGNGPNDCDD
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SWDWRNTASWQQIIKDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSVADWKHGLNGNPDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGG
QHLWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYWPHMYDWGYGDFIRQLIQVRRTAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGSQ
QTLVVALNSDLANPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGSGDGGGNDGG
SEQ ID NO:16
SSM279B1序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157M,161A,178F,179T,223E,307L和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列.
DQAGKSPAGVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPYNWYNILRQQASTIAADGFSAIWMPVPWRDFSSWTDGGKSGGGE
GYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRFYPDKEINLPAGQRFWRNDCPDPGNYPNDCDD
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QTLVVALNSDLANPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGSGDGGGNDGG
SEQ ID NO:17
SSM237P2序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,158T,161A,178F,179T,223E,307L和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。
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SEQ ID NO:18
在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,198W,223E,307L和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。
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SEQ ID NO:20
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SSM341A9序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,303E,307L和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列
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SSM341G11序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,303D,307L和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列
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SSM350B11序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,306T,307L和334P具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列
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SSM350C12序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,306G,307L和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列
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SSM332Q4序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,309P,307L和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列
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SSM365B4序列:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,316S,和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列
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SEQ ID NO:27
SSM365F4:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,316P和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列
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SEQ ID NO:28
SSM360C7:在33Y,34N,121F,134R,141P,157L,161A,178F,179T,223E,307L,334P和353T上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列
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Claims (24)

1.一种非产麦芽糖外切型淀粉酶变体，其在对应于SEQ ID NO：1的位置121、146、157、161、223、229、272、303和309或在亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶的对等位置含有至少一个氨基酸取代，其中亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7或8。
2.一种通过在具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的亲本多肽中引入至少一个氨基酸取代获得的PS4变体多肽，其中氨基酸取代选自参照SEQ IDNO：1的位置编号的121F、121Y、146G、157M、161A、223E、229P、272Q、303E和309P。
3.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶缺少淀粉结合结构域。
4.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶是SEQ ID NO：1或5。
5.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中变体包含参照SEQ ID NO：1的位置编号的一个或多个下述取代：121F、121Y、146G、157M、161A、223E、229P、272Q、303E和309P。
6.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中变体选自下组：PSac-D34(SEQ ID NO:2)、PSac-D20(SEQ IDNO:3)、PSac-D14(SEQ ID NO:4)、PStu-D34(SEQ ID NO:8)、PStu-D20(SEQID NO:9)、PStu-D14(SEQ ID NO:10)、pMD55(SEQ ID NO:13)、pMD96(SEQID NO:14)、SSM381(SEQ ID NO:15)、SSM279B1(SEQ ID NO:16)、SSM237P2(SEQ ID NO:17)、SEQ ID NO:18、SSM325F3(SEQ ID NO:19)、pMD129(SEQ ID NO:20)、SSM341A9(SEQ ID NO:21)、SSM341G11(SEQID NO:22)、SSM350B11(SEQ ID NO:23)、SSM350C12(SEQ ID NO:24)、SSM332Q4(SEQ ID NO:25)、SSM365B4(SEQ ID NO:26)、SSM365F4(SEQ ID NO:27)和SSM360C7(SEQ ID NO:28)、SSM219B3、SAS1401L10、SAS1387D16bf、pMD236、pMD237bf、SAS1379O13和SAS1379O9。
7.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶选自获自假单胞菌属，优选嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌的非产麦芽糖外切型淀粉酶。
8.如权利要求7所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶获自嗜糖假单胞菌。
9.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中，与亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶相比，非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽显示增加的热稳定性。
10.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中，与亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶相比，非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽显示增加的特异性活性。
11.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中，与亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶相比，非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽既显示增加的热稳定性又显示增加的特异性活性。
12.一种多核苷酸，其编码权利要求1到11任一项所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。
13.一种载体，其包含权利要求12所述的多核苷酸。
14.一种宿主细胞，其包含权利要求13所述的载体。
15.如权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。
16.一种酶组合物，其包含权利要求1到11任一项所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。
17.如权利要求16所述的酶组合物，其包含Novamyl。
18.如权利要求16或17所述的酶组合物，其中酶组合物用于生面团产品以延迟或减弱生面团产品的陈化。
19.一种在宿主细胞中生产非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽的方法，其包括在适于表达和生产非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽的条件下培养权利要求14或权利要求15所述的宿主细胞并生产非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。
20.如权利要求19所述的方法，其进一步包括从培养物回收非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。
21.一种制作烘焙产品的方法，其包括：(a)提供淀粉介质；(b)向所述淀粉介质中添加权利要求1-11任一项所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽；和(c)在步骤(b)之中或之后加热所述淀粉介质以生产烘焙产品。
22.一种通过权利要求21所述的方法获得的食品产品、饲料产品、生面团产品或烘焙产品。
23.一种组合物，其包含面粉和权利要求1-11任一项所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。
24.一种食品产品、饲料产品、生面团产品或烘焙产品，其包含权利要求1-11任一项所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。
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