KR101336659B1 - 폴리펩타이드 - Google Patents

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KR101336659B1
KR101336659B1 KR1020077000151A KR20077000151A KR101336659B1 KR 101336659 B1 KR101336659 B1 KR 101336659B1 KR 1020077000151 A KR1020077000151 A KR 1020077000151A KR 20077000151 A KR20077000151 A KR 20077000151A KR 101336659 B1 KR101336659 B1 KR 101336659B1
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패트릭 엠 에프 데르큭스
캐롤 피오레시
기이스베르트 게리트세
안야 헤민겐 켈레트-스미스
카르스텐 마티아스 크라그흐
웨이 리우
앤드류 쇼
보 스판게 소렌센
샬를로트 레프달 토우달
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다니스코 유에스 인크.
듀폰 뉴트리션 바이오사이언시즈 에이피에스
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Abstract

본 발명자는 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라제 서열의 위치 번호를 참고로 121, 161, 223, 146, 157, 158, 198, 229, 3O3, 306, 309, 316, 353, 26, 7O, 145, 188, 272, 339로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 모폴리펩타이드로부터 유도 가능한 PS4 변이 폴리펩타이드를 기술한다.

Description

폴리펩타이드{Polypeptide}
2003년 7월 7일 출원된 미국 임시 출원 제60/485,413호, 제60/485,539호 및 제60/,485,616호를 참고하였다. 또한 2004년 7월 7일 출원되고 미국을 지정한 국제출원 PCT/US2004/021723 및 PCT/US2004/021739호(출원인: 제넨코 인터내셔날 인코포레이티드)를 참고하였다. 또한 2004년 7월 7일 출원된 미국 실용신안 출원 제10/886,905호 및 제10/886,905호를 참고하였다.
또한 미국 임시 출원 제60/608,919호(2004년 7월 7일 미국 실용신안 출원 제10/887,056호로 출원되었으나 2004년 9월 15일 임시 출원으로 전환됨)를 참고하였다. 또한 2004년 9월 22일 출원된 미국 임시 출원 제60/612,407호를 참고하였다.
또한 2003년 7월 7일 출원된 미국 출원 제60/485,539호를 참고하였다. 또한 2004년 7월 7일 출원되고 미국을 지정한 국제출원 PCT/IB2004/002487를 참고하였다. 또한 2004년 7월 7일 출원된 미국 실용신안 출원 제10/886,023호를 참고하였다.
또한 2004년 7월 7일 출원된 미국 실용신안 출원 제10/886,505호, 제10/886,527호 및 제10/886,504호를 참고하였다. 또한 2004년 9월 22일 출원된 미국 실용신안 출원 제10/947,612호를 참고하였다.
종전 출원 및 각각의 본 출원과 종전 출원에서 인용되거나 참고된 각 문헌("출원 및 인용 문헌") 및 각각의 종전 출원 및 출원 및 인용 문헌에서 인용되거나 언급된 제품의 제조사 지침서 또는 카달로그는 참고문헌에 포함된다. 더욱이 본 명세서에 인용된 모든 문헌 및 본 명세서에 인용된 문헌 내에서 인용된 문헌 또는 참고문헌 및 본 명세서 또는 본 명세서에 포함된 문헌 내에서 인용되거나 언급된 제품의 제조사 지침서 또는 카달로그는 참고문헌에 포함된다. 본 명세서 내에 참고문헌으로 포함된 문헌 또는 지침은 본 발명의 실행에 이용된다. 본 명세서 내에 참고문헌으로 포함된 문헌은 선행기술로 인정되지 않는다.
본 발명은 폴리펩타이드, 특히 아밀라제 폴리펩타이드 및 이를 인코드하는 핵산 및 식품 제조시 넌-말토제닉 엑소아밀라제로서의 그의 이용에 관한 것이다. 본 발명의 아밀라제는 더욱 유익한 품질을 지니도록 설계되었다. 특히 본 발명의 아밀라제는 변경된 엑소특이성(exospecificity) 및/또는 변경된 열안정성을 나타낸다. 특히 본 폴리펩타이드는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성, 특히 1,4-알파-말토테트라하이드롤라제(maltotetrahydrolase)(EC 3.2.1.60) 활성을 지닌 폴리펩타이 드로부터 유도된다.
개선된 아밀라제는 베이킹과 같은 특정 공정에서의 고유의 문제점을 개선시킬 수 있다. 아밀로펙틴의 결정화는 베이킹 후 전분 입자 시기에서 발생하고 이는 증가된 빵의 견고성을 유도하고 빵 부패를 유발한다. 빵이 부패시 빵은 빵 속(crumb) 연도(softness) 및 빵 속 수분을 상실한다. 그 결과 빵 속은 덜 탄력적이 되고 빵은 질긴 빵 껍질(crust)로 발달된다.
아밀로펙틴 측쇄의 효소적 가수분해(예를 들어 아밀라제에 의한)는 결정화를 감소시키고 부패-방지를 증가시킬 수 있다. 결정화는 아밀로펙틴 측쇄의 길이에 따라 달라진다: 측쇄가 길수록 결정화가 더 커진다. 대부분의 전분 입자는 2개의 폴리머 혼합물로 구성된다: 아밀로펙틴 및 아밀로스, 이중 약 75%가 아밀로펙틴이다. 아밀로펙틴은 (1-4) 결합에 의해 결합된 α-D-글루코피라노실 단위로 구성된 매우 큰 분지된 분자이고, 사슬은 α-D-(1-6) 결합에 의해 부착되어 분지를 형성한다. 아밀로스는 적은 α-D-(1-6) 사슬을 지닌 (1-4) 결합된 α-D-글루코피라노실 단위의 선형 사슬이다.
백색 빵과 같은 곡물 가루 빵 제품의 베이킹시 빵은 체질된(bolted) 호밀 가 루 및 밀가루로 이루어지고 롤은 180∼250℃의 오븐 온도 범위에서 15∼60분간 빵 반죽을 베이킹함으로서 달성된다. 베이킹 공정 동안 가파른 온도 기울기(200→120℃)는 베이크된 제품의 빵 껍질이 나타나는 외부 반죽층으로 보급된다. 그러나 증기로 인해 빵 속의 온도는 베이킹 공정 종료시 약 100℃ 정도이다. 약 85℃의 온도 이상에서 효소 불활성화가 발생할 수 있고 효소는 부패-방지 특성을 지니질 않을 것이다. 따라서 열안정적인 아밀라제만이 베이킹시 전분을 효과적으로 변형시킬 수 있다.
엔도아밀라제 활성은 분지된 덱스트린의 축적으로 인해 끈적거리거나 점착성의 빵 속을 제조함으로서 최종 빵 제품의 품질에 악영향을 미칠 수 있다. 엑소아밀라제 활성은 엔도아밀라제 활성과 관련한 부정적 효과가 적고 부패의 지연을 유도하는 전분의 바람직한 변형을 달성할 수 있기 때문에 엑소아밀라제 활성이 바람직하다. 엔도아밀라제 활성의 감소는 더 큰 엑소특이성을 유도할 수 있고 이는 분지된 덱스트린을 감소시키고 더 높은 품질의 빵을 제조할 수 있다.
발명의 요약
본 발명자는 본 발명에 따라 청구범위에 나타난 바와 같이 PS4 변이 폴리펩타이드를 제공한다. 또한 본 발명자는 청구범위에 나타난 바와 같이 식품 첨가제, 식품, 베이커리 제품, 식품첨가물 조성물, 동물 사료를 포함한 사료 제품 등에 포함된 이러한 PS4 변이 폴리펩타이드의 이용을 제공한다. 본 발명자는 청구범위에 나타난 바와 같이 PS4 변이 폴리펩타이드를 인코드하고 이에 관련된 핵산을 제공한다. 이러한 PS4 변이 폴리펩타이드의 제조 방법뿐만 아니라 본 발명의 다른 관점도 청구범위에 나타나 있다.
서열목록
서열번호: 1은 슈도모나스 사카로필라(Pseudomonas saccharophila) 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열 유래의 PS4 참고 서열을 나타낸다. 서열번호: 2는 PSac-D34 서열; 전분 결합 도메인의 11개 치환 및 결실을 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 3은 PSac-D20 서열; 전분 결합 도메인의 13개 치환 및 결실을 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 4는 PSac-D14 서열; 전분 결합 도메인의 14개 치환 및 결실을 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 5는 슈도모나스 사카로필라 글루칸 1,4-알파-말토테트라하이드롤라제 전구체(EC 3.2.1.60)(G4-아밀라제)(말토테트라오스-형성 아밀라제)(엑소-말토테트라하이드롤라제)(말토테트라오스-형성 엑소-아밀라제)를 나타낸다. SWISS-PROT 수납 번호 P22963/ 서열번호: 6은 말토테트라하이드롤라제(EC 번호=3.2.1.60)을 인코드하는 슈도모나스 사카로필라 mta 유전자를 나타낸다. GenBank 수납 번호 Xl 6732. 서열번호: 7은 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri) 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열 유래의 PS4 참고 서열을 나타낸다. 서열번호: 8은 PStu-D34 서열; 9개 치환을 지닌 슈도모나스 스투트제리 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 9는 PStu-D20 서열; 11개 치환을 지닌 슈도모나스 스투트제리 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 10은 PStu-D14 서열; 12개 치환을 지닌 슈도모나스 스투트제리 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 11은 슈도모나스 스투트제리(슈도모나스 페르펙토마리나(Pseudomonas perfectomarina)를 나타낸다. 글루칸 1,4-알파-말토테트라하이드롤라제 전구체(EC 3.2.1.60)(G4-아밀라제)(말토테트라오스-형성 아밀라제)(엑소-말토테트라하이드롤라제)(말토테트라오스-형성 엑소-아밀라제). SWISS-PROT 수납 번호 P13507. 서열번호: 12는 슈도모나스 스투트제리 말토테트라오스-형성 아밀라제(amyP) 유전자, 완전 CDs를 나타낸다. GenBank 수납 번호 M24516. 서열번호: 13은 pMD55 서열; 11개 치환(G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, L178F, A179T 및 G121F)을 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제를 나타낸다. 서열번호: 13은 pMD55 서열; 11개 치환(G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, L178F, A179T 및 G121F) 및 전분 결합 도메인의 결실을 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제를 나타낸다. 서열번호: 13은 pMD55 서열; 11개 치환(G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, L178F, A179T 및 G121F)을 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제를 나타낸다. 서열번호: 13은 pMD55 서열; 11개 치환(G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, L178F, A179T 및 G121F) 및 전분 결합 도메인의 결실을 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제를 나타낸다. 서열번호: 14는 PMD96 서열; N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, H307L 및 S334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 15는 SSM 381 서열: 33Y, 34N5 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 16은 SSM279 Bl 서열; 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157M, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 17은 SSM237 P2 서열; 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L5 158T, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 18은 33Y, 34N5 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 198W, 223E, 307L 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 19는 SSM325 F3 서열; 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307L 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 20은 pMD129 서열; 33Y, 34N, 121F,, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 198W, 223E, 229P, 307L 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라 제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 21은 SSM341 A9 서열; 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 303E, 307L 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 22는 SSM341 Gl 1 서열; 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 3O3D, 307L 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 23은 SSM350 Bl 1 서열; 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 306T, 307L 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 24는 SSM35O C12 서열; 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 306G, 307L 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 25는 SSM332 Q4 서열; 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 309P, 307L 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 26은 SSM365 B4 서열; 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 316S 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 27은 SSM365 F4: 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 316P 및 334P에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 28은 SSM360 C7: 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 334P 및 353T에서의 돌연변이를 지닌 슈도모나스 사카로필라 말토테트라하이드롤라제 아미노산 서열을 나타낸다.
하기 설명 및 실시예에서 문맥이 다른 경우를 언급하지 않는 한 PS4 변이 폴리펩타이드의 용량은 밀가루의 ppm(part per million)(그램 당 마이크로그램)으로 제공된다. 예를 들어 표 2에서 사용된 "1 D34"은 중량 당 중량을 기반으로 pSac-D34의 100만분의 1을 나타낸다. 바람직하게는 효소 정량 및 함량은 Bradford (1976, A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254)에 기술된 분석방법을 이용하여 표준물질로서 우혈청 알부민(BSA)으로 측정된 정제 단백질의 등량으로 활성 분석방법에 기반하여 측정된다.
제조되거나 본 출원서에 의해 포함되는 것으로 판단되는 다른 PS4 변이 폴리펩타이드 변이체의 설명시 하기 명명법이 표기를 용이하게 하기 위해 채택될 것이다:
(ⅰ) 치환이 141P와 같이 수와 문자를 포함한 경우 이는 [번호 체계에 따른 위치/치환된 아미노산]으로 표기된다. 따라서 예를 들어 141번 위치에서 아미노산의 프롤린으로의 치환은 141P로 지정된다;
(ⅱ) 치환이 A141P와 같이 문자, 숫자 및 문자를 포함하는 경우 이는 [본래 아미노산/번호 체계에 따른 위치/치환된 아미노산]으로 표기된다. 따라서 예를 들어 141번 위치에서 알라닌의 프롤린으로의 치환은 A141P로 지정된다.
2 이상의 가능한 치환체가 특정 위치에서 가능한 경우 이는 연속 문자로 명명될 것이고 이는 선택적으로는 슬래쉬 마크 "/"로 구분된다 즉, G303ED 또는 G303E/D. 어떠한 위치에서의 관련 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있는 경우 이는 [번호 체계에 따른 위치/X] 즉, 121X로 지정된다.
다수의 돌연변이는 슬래쉬 마크 "/"로 구분함으로서 지정된다. 즉, A141P/G223A는 141번 및 223번 위치에서 각각 알라닌을 프롤린으로, 글리신을 알라닌으로 치환함을 나타낸다.
여기서 다른 경우를 한정하지 않는 한 여기서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. Singleton, et al, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994) 및 Hale & Marham, THE 185 HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)는 본 발명에서 사용되는 많은 용어의 일반 사전 중의 하나의 기술을 제공한다. 여기서 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있으나 바람직한 방법 및 물질은 기술된다. 숫자 범위는 범위를 한정하는 수를 포괄한다. 다른 경우를 나타내지 않는 한 핵산은 5'에서 3' 방향으로 좌측에서 우측으로 기록되고; 아미노산은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 기록된다.
본 발명의 실행은 다른 경우를 나타내지 않는 한 당업자의 능력 내에 있는 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 설명된다. 예를 들어 J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation 200 and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using 205 Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson "Immunocytochemistry: Theory and Practice", CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, 210 ISBN 0-8493-6078-1 , John D. Pound (ed); "Immunochemical Protocols, vol 80", in the series: "Methods in Molecular Biology", Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); and Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the 215 Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3 참조. 이들 일반적 문헌 각각은 참고문헌에 포함된다.
여기서 참고된 이러한 특허 및 논문 내에 개시된 모든 서열을 포함한 모든 특허 및 공보는 참고문헌에 명백히 포함된다.
PS4 변이 폴리펩타이드
본 발명자는 모효소 대비 변경된 특성, 특히 변경된 엑소특이성 또는 변경된 열안정성 또는 이 둘 모두에 영향을 미치는 하나 이상의 위치에서의 치환을 지닌 넌-말토제닉 엑소아밀라제를 제공한다.
또한 본 발명자는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 폴리펩타이드를 포함한 식품 첨가제, 식품, 베이커리 제품, 식품첨가물 조성물, 동물 사료를 포함한 사료 제품 등을 포함한 조성물뿐만 아니라 이러한 폴리펩타이드 및 조성물의 제조 및 이용 방법을 제공한다. 본 발명자는 세제, 감미료, 시럽 등의 제조시 이러한 조성물의 이용을 제공한다. 본 조성물은 적어도 하나 이상의 다른 성분을 포함한다. 특히 본 발명자는 상기 폴리펩타이드를 포함한 식품 또는 사료 첨가제를 제공한다.
이러한 폴리펩타이드 및 핵산은 많은 돌연변이를 포함시킴으로서 모서열과 다르고 편의상 "PS4 변이 폴리펩타이드"로 알려진다. 즉, PS4 변이 폴리펩타이드 또는 핵산의 서열은 많은 위치 또는 잔기에서 그의 모서열과 다르다. 바람직한 실시태양에서 돌연변이는 아미노산 치환 즉, 하나의 아미노산 잔기의 다른 것으로의 변화를 포함한다. 즉, PS4 변이 폴리펩타이드는 모서열의 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기의 성질의 많은 변화를 포함한다.
여기서 사용된 "변이체"라는 용어는 모분자로부터 유도 가능한 분자를 의미하게 된다. 변이체는 폴리펩타이드뿐만 아니라 핵산을 포함한다. 변이체는 하나 이상의 위치에서 다른 사건 중 치환, 삽입, 전위 및 역위를 포함한다. 또한 변이체는 절단을 포함한다. 변이체는 모분자의 상동체 및 기능적 유도체를 포함한다. 변이체는 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
PS4 변이 폴리펩타이드의 치환
본 발명자는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 서열 내 아미노산 치환을 포함한 서열 변경을 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드를 제공한다. 아미노산 치환은 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라 엑소아미라제 서열의 위치 번호를 참고로 26, 70, 121, 145, 146, 157, 158, 161, 188, 198, 223, 229, 272, 303, 306, 309, 316, 339 및 353 위치의 하나 이상에서 이루어진다.
아미노산 돌연변이는 (a) 121, 161, 223 위치; (b) 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316, 353 위치; 및 (c) 26, 70, 145, 188, 272, 339 위치; 및 (a), (b) 및 (c)의 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 이루어진다.
아미노산 치환은 121F, 121Y, 121W, 161A, 223E, 223K에서의 변화를 포함한다. 대안으로 또는 이에 더하여 아미노산 치환은 146G, 146M, 157M, 158T, 158A, 158S, 198W, 198F, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P, 316K, 316Q, 353T로의 변화를 포함한다. 또한 대안으로 또는 이에 더하여 아미노산 치환은 26E, 70D, 145D, 188S, 188T, 188H, 272Q, 339A, 339E로의 변화를 포함한다.
이러한 변이 폴리펩타이드는 본 명세서에서 "PS4 변이 폴리펩타이드"로 표기된다. 또한 이러한 변이 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산이 개시되고 편의상 "PS4 변이 핵산"으로 표기될 것이다. PS4 변이 폴리펩타이드 및 핵산은 하기에 더욱 상세히 기술될 것이다.
"모" 서열 즉, PS4 변이 폴리펩타이드 및 핵산의 기반인 서열은 바람직하게는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 폴리펩타이드이다. 따라서 "모효소" 및 "모폴리펩타이드"라는 용어는 PS4 변이 폴리펩타이드의 기반이 되는 효소 또는 폴리펩타이드로 해석되고 이를 의미하여야 한다. 이는 하기에 더욱 상세히 설명된다.
특히 바람직한 실시태양에서 모서열은 넌-말토제닉 엑소아밀라제 효소, 바람직하게는 박테리아 넌-말토제닉 엑소아밀라제 효소이다. 매우 바람직한 실시태양에서 모서열은 글루칸 1,4-알파-말토테트라하이드롤라제(EC 3.2.1.60)을 포함한다. 바람직하게는 모서열은 슈도모나스종 예를 들어 슈도모나스 사카로필라 또는 슈도모나스 스투트제리로부터 유도 가능하다.
일부 실시태양에서 모폴리펩타이드는 슈도모나스종으로부터의 야생형 넌-말토제닉 엑소아밀라제 서열을 포함하거나 이에 상동적이다.
따라서 모폴리펩타이드는 서열번호: 1에 나타난 서열을 지닌 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 엑소아밀라제를 포함한다. 다른 바람직한 실시태양에서 모폴리펩타이드는 서열번호: 11에 나타난 서열을 지닌 슈도모나스 스투트제리 유래의 넌-말토제닉 엑소아밀라제 또는 SWISS-PROT 수납 번호 P13507을 지닌 슈도모나스 스투트제리 넌-말토제닉 엑소아밀라제를 포함한다.
한편, 모폴리펩타이드는 어떠한 야생형 서열의 변이체이다 즉, 모폴리펩타이드는 그 자체가 설계되거나 PS4 변이 폴리펩타이드를 포함한다.
그러나 PS4 변이 폴리펩타이드가 이미 돌연변이화된 서열을 돌연변이함으로서 유도 가능하더라도 야생형 서열(또는 어떠한 적당한 서열)로부터 시작하고, 시작 서열과 원하는 변이체 사이의 차이를 확인하고 원하는 변이체를 달성하기 위해 시작 서열 내에 필요한 돌연변이를 도입시킴으로서 이러한 변이 폴리펩타이를 구축하는 것이 가능함은 당업자에게 명백할 것이다.
바람직하게는 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 엑소아밀라제 서열 또는 서열번호: 11에 나타난 서열을 지닌 슈도모나스 스투트제리 넌-말토제닉 엑소아밀라제 서열 지니거나 기능적 상동성을 지닌 단백질 및 관련 핵산은 본 명세서에서 "PS4 패밀리"의 멤버로 표기된다. PS4 변이 폴리펩타이드 및 핵산을 생성하는데 이용하기에 적당한 "PS4 패밀리" 넌-말토제닉 엑소아밀라제 효소의 예는 하기에 상세히 개시된다.
본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩타이드는 바람직하게는 모폴리펩타이드의 특징을 보유하고, 또한 바람직하게는 예를 들어 증가된 활성 또는 열안정성 또는 pH 저항성 또는 이들의 조합(바람직하게는 모두)과 같은 추가적인 유익한 특성을 지닌다. 이는 하기에 더욱 상세히 기술된다.
여기서 기술된 PS4 치환 돌연변이체는 어떠한 적당한 목적으로 이용된다. 이들은 바람직하게는 모효소가 적당한 목적에 이용된다. 특히 이들은 엑소-말토테트라하이드롤라제가 이용되는 어떠한 적용에도 이용된다. 매우 바람직한 실시태양에서 이들은 더 높은 열안정성 또는 더 높은 엑소아밀라제 활성 또는 더 높은 pH 안정성 또는 어떠한 조합의 추가 장점을 지닌다. PS4 변이 폴리펩타이드 및 핵산의 적당한 이용의 예는 식품 제조 특히 베이킹뿐만 아니라 식료품의 제조를 포함하고; 또다른 예는 하기에 상세히 나타나 있다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 상기에 나타난 이들 위치에 더하여 하나 이상의 또다른 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는 이미 나타난 것에 더하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상의 돌연변이가 존재한다. 하나 이상의 다른 위치에서 결실, 삽입, 치환, 전위, 전이 및 역위와 같은 다른 돌연변이가 포함된다. 더욱이 PS4 변이체는 기입된 위치에서의 모든 치환을 포함할 필요는 없다. 실제로 이들은 1, 2, 3, 4 또는 5 치환 분실을 지닌다 즉, 야생형 아미노산 잔기는 이러한 위치에 존재한다.
야생형 서열에 기반한 PS4 변이 폴리펩타이드
실시태양에서 모폴리펩타이드가 야생형 서열을 포함하는 경우 PS4 변이 폴리펩타이드는 야생형 서열을 포함하나 하나 이상의 121, 161 및 223 위치, 바람직하게는 121F, 121Y, 121W, 161A, 223E 또는 223K, 더욱 바람직하게는 G121F, G121Y, G121W, S161A, G223E 또는 G223K에서의 돌연변이를 지닌다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 야생형 서열 또는 전항에 나타나 있으나 하나 이상의 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 또는 353 위치, 바람직하게는 146G, 146M, 157M, 158T, 158A, 158S, 198W, 198F, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P, 316K, 316Q 또는 353T, 더욱 바람직하게는 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P 또는 353T에서의 돌연변이를 지닌 서열을 포함한다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 야생형 서열 또는 전항에 나타나 있으나 하나 이상의 26, 70, 145, 188, 272 또는 339 위치, 바람직하게는 26E, 26D, 70D, 145D, 188S, 188T, 188H, 272Q, 339A 또는 339E, 더욱 바람직하게는 N26E, N26D, G70D, N145D, G188S, G188T, G188H, H272Q, W339A 또는 W339E에서의 돌연변이를 지닌 서열을 포함한다.
일반적으로 여기에 개시된 PS4 변이 폴리펩타이드를 제조하기 위해 위치, 치환 및 특정 돌연변이의 조합은 어떠한 방식으로도 또한 어떠한 수로도 조합된다.
따라서 본 발명자는 야생형 PS4 모서열, 바람직하게는 서열번호: 1에 나타난 서열을 지닌 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 엑소아밀라제에 기반한 PS4 변이 폴리펩타이드를 개시한다. 따라서 PS4 변이 폴리펩타이드는 서열번호: 1에 나타나 있으나 상기 나타나 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 지닌 서열을 포함한다. 또한 PS4 변이 폴리펩타이드는 서열번호: 7에 나타나 있으나 상기 나타난 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 지닌 야생형 슈도모나스 스투트제리 넌-말토제닉 엑소아밀라제 서열에 기반한다.
PS4 변이 폴리펩타이드가 야생형 PS4 모서열에 기반하고 바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 야생형 PS4 모서열의 설계된(또는 돌연변이화된) 버전에 기반한다. 따라서 이러한 실시태양에서 모서열은 이미 돌연변이화된 PS4 서열을 포함한다. 이러한 서열은 하기에 더욱 상세히 기술된 바와 같이 드 노보(de novo)로 또는 기본 서열을 1회 이상 돌연변이시킴으로서 제조된다.
121, 161 및/또는 223 위치
PS4 변이 폴리펩타이드는 야생형 서열 또는 121, 161 및 223과 같은 하나 이상의 위치에서 치환을 지닌 이미 돌연변이된 서열과 같은 야생형 서열의 변이체인 돌연변이 서열을 포함한다.
따라서 일반적으로 관련 위치 또는 위치들에서의 주요 돌연변이 또는 돌연변이들은 121, 161 또는 223 위치의 하나, 둘 또는 모두에서 단일 추가 돌연변이와 유리하게 조합된다.
존재하는 121 위치 치환은 바람직하게는 121Y, 121W, 121H, 121A, 121M, 121G, 121S, 121T, 121D, 121E, 121L, 121K 및 121V로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 121 위치 치환은 121F, 121Y 또는 121W이다. 존재하는 161 위치 치환은 161A, 더욱 바람직하게는 S161A이다. 161 위치가 돌연변이되는 경우 160 위치에서의 또다른 돌연변이, 바람직하게는 160D, 더욱 바람직하게는 E160D도 존재한다.
존재하는 223 위치 치환은 바람직하게는 223K, 223E, 223V, 223R, 223A, 223P 및 223D로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 223 치환은 223E 또는 223K이다 특히 바람직한 실시태양에서 또다른 치환 또는 치환들은 G121F, G121Y, G121W, 161A, 223E 및 223K로 구성된 군으로부터 선택된다.
특히 바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 적어도 3 이상의 하기 치환 121F/Y/W, 161A, 223E/K를 포함한다. 하기에 나타난 바와 같이 다른 돌연변이도 포함된다.
146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 및 353 위치
PS4 변이 폴리펩타이드는 야생형 서열 또는 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 및 353 위치와 같은 하나 이상의 위치에서의 치환을 지닌 이미 돌연변이된 서열 - 121, 161 및 223 위치의 하나 이상에서의 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드를 포함 - 과 같은 야생형 서열의 변이체인 변이 서열을 포함한다.
26, 70, 145, 188, 272 및 339 위치
PS4 변이 폴리펩타이드는 야생형 서열 또는 26, 70, 145, 188, 272 및 339 위치와 같은 하나 이상의 위치에서의 치환을 지닌 이미 돌연변이된 서열 - 121, 161, 223, 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 및 353 위치의 하나 이상에서의 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드를 포함 - 과 같은 야생형 서열의 변이체인 변이 서열을 포함한다.
따라서 일반적으로 관련 위치 또는 위치들에서의 주요 돌연변이 또는 돌연변이들은 26, 70, 145, 188, 272 및 339 위치의 하나, 둘 또는 모두에서의 단일 추가 돌연변이와 유리하게 조합된다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 26 위치에서의 치환, 바람직하게는 26E 또는 26E를 포함한다. 더욱 바람직하게는 26 위치 치환은 N26E 또는 N26D를 포함한다. 가장 바람직하게는 26 위치 치환은 N26E를 포함한다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 70 위치에서의 치환, 바람직하게는 70D를 포함한다. 더욱 바람직하게는 26 위치 치환은 G70D를 포함한다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 145 위치에서의 치환, 바람직하게는 146D를 포함한다. 더욱 바람직하게는 145 위치 치환은 N145D를 포함한다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 188 위치에서의 치환, 바람직하게는 188S, 188T 또는 188H를 포함한다. 더욱 바람직하게는 188 위치 치환은 G188S, G188T 또는 G188H를 포함한다. 가장 바람직하게는 188 위치 치환은 G188S 또는 G188H를 포함한다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 272 위치에서의 치환, 바람직하게는 272Q를 포함한다. 더욱 바람직하게는 272 위치 치환은 H272Q를 포함한다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 W339A, 바람직하게는 339A 또는 339E 위치에서의 치환을 포함한다. 더욱 바람직하게는 339 위치 치환은 W339A 또는 W339E를 포함한다.
변이 서열에 기반한 PS4 변이 폴리펩타이드
33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 및/또는 334 위치의 조합
일부 실시태양에서 모서열은 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 및 334 위치 중의 하나 이상, 바람직하게는 전부에서의 돌연변이를 포함한다(또한 따라서 PS4 변이 폴리펩타이드는 관련된 대응 돌연변이를 포함할 것이다).
이러한 실시태양에서 돌연변이는 바람직하게는 N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L 및 S334P 중의 하나 이상, 바람직하게는 전부이다.
이러한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 서열 PSac-D34(서열번호: 2)를 포함한 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 효소 서열로부터 편리하게 유도 가능하다.
33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 및 334, 121, 161 및/또는 223 위치의 조합
PS4 변이 폴리펩타이드는 121, 161 및/또는 223 위치에서의 돌연변이와 조합된 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 및 334 위치에서의 돌연변이를 더욱 포함한다. 따라서 본 발명자는 (a) 33, 34, 121 , 134, 141 , 157, 178, 179, 223, 307 및 334 잔기, 바람직하게는 N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L 및 S334P에서의 하나 이상의 돌연변이; (b) 121, 161 또는 223 위치, 바람직하게는 121F, 121Y, 121W, 161A, 223E 또는 223K, 더욱 바람직하게는 121F, 161A 또는 223E에서의 하나 이상의 돌연변이 및 (c) 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 또는 353 위치, 바람직하게는 146G, 146M, 157M, 158T, 158A, 158S, 198W, 198F, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P, 316K, 316Q 또는 353T, 더욱 바람직하게는 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 3O3D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P 또는 353T에서의 하나 이상의 돌연변이의 어떠한 조합을 포함한 PS4 변이 폴리펩타이드를 개시한다.
일부 바람직한 실시태양에서 본 발명자는 (a) 상기 (c)에 나타난 하나 이상의 돌연변이와 조합된 상기 (a)에 나타난 하기 돌연변이의 전부를 포함한 PS4 변이 폴리펩타이드를 제공한다. 다른 바람직한 실시태양에서 본 발명자는 상기 (c)에 나타난 하나 이상의 돌연변이와 조합된 상기 (b)에 나타난 돌연변이 전부와 조합된 상기 (a)에 나타난 하기 돌연변이 전부를 포함한 PS4 변이 폴리펩타이드를 제공한다.
pMD96에 기반한 PS4 변이 폴리펩타이드
(a) 및 (b)의 전부에서의 돌연변이를 포함하는 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 서열 pMD96(서열번호: 14)를 포함한 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 효소 서열로부터 편리하게 유도 가능하다.
따라서 상세하게는 본 발명자는 서열번호: 15 내지 28의 서열을 지닌 실시예 12 내지 20에 나타난 PS4 변이 폴리펩타이드를 제공한다.
다른 조합
더욱이 예를 들어 134, 141, 157, 223, 307 및 334의 하나 이상과 같은 다른 위치에서의 돌연변이를 포함한 모서열도 이용된다. 선택적으로는 이들은 33 및 34 위치 중의 하나 또는 이 둘 모두에서의 돌연변이를 포함한다.
따라서 모서열은 134, 141, 157, 223, 307, 334 및 선택적으로는 33 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다(또한 따라서 PS4 변이 폴리펩타이드는 관련 대응 돌연변이도 포함할 것이다).
일부 실시태양에서 모폴리펩타이드는 134 위치에서의 아르기닌, 141 위치에서의 프롤린 및 334 위치에서의 프롤린 치환 즉, G134R, A141P 및 S334P를 포함한다.
또다른 실시태양에서 모폴리펩타이드는 121 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 모폴리펩타이드는 178 위치에서의 돌연변이를 더욱 포함한다. 또한 179 위치에서의 돌연변이도 포함한다. 또한 87 위치에서의 돌연변이도 포함한다. 각각 특히 바람직한 치환은 121D, 더욱 바람직하게는 G121D, 바람직하게는 178F, 더욱 바람직하게는 L178F, 바람직하게는 179T, 더욱 바람직하게는 A179T 및 바람직하게는 87S, 더욱 바람직하게는 G87S이다.
이들 위치에서의 잔기는 예를 들어 Il57V 또는 I157N 또는 G223L 또는 G223I 또는 G223S 또는 G223T 또는 H307I 또는 H307V 또는 D34G 또는 D34A 또는 D34S 또는 D34T 또는 Al79V와 같은 많은 잔기에 의해 치환된다. 그러나 모폴리펩타이드는 바람직하게는 I157L, G223A, H307L, L178F 및 A179T(선택적으로는 N33Y, D34N) 치환을 포함한다.
매우 바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 L178F 및 A179T 중의 하나 또는 모두와 함께 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 및 353 중의 하나 이상의 위치에서의 치환, 바람직하게는 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P 또는 353T 뿐만 아니라 하나 이상의 하기 치환을 포함한다: G134R, A141P, 1157L, G223A, H307L, S334P, N33Y 및 D34N.
PSac-D20에 기반한 PS4 변이 폴리펩타이드
PS4 변이체는 PSac-D20(서열번호: 3)을 포함한 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 모효소 서열에 기반한다.
이러한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 L178F 및 A179T 중의 하나 또는 모두와 함께 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 및 353 중의 하나 이상의 위치에서의 치환, 바람직하게는 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 3O3D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P 또는 353T 뿐만 아니라 하나 이상의 하기 치환을 포함한다: G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N 및 G121D.
Psac-D14에 기반한 PS4 변이 폴리펩타이드
PS4 변이체는 PSac-D14(서열번호: 4)를 포함한 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 모효소 서열에 기반한다.
따라서 이러한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 L178F 및 A179T 중의 하나 또는 모두와 함께 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 및 353 중의 하나 이상의 위치에서의 치환, 바람직하게는 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P 또는 353T 뿐만 아니라 하나 이상의 하기 치환을 포함한다: G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, G121D 및 G87S.
pMD55에 기반한 PS4 변이 폴리펩타이드
PS4 변이체는 pMD55(서열번호: 13)를 포함한 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 모효소 서열에 기반한다.
이러한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 L178F 및 A179T 중의 하나 또는 모두와 함께 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 및 353 중의 하나 이상의 위치에서의 치환, 바람직하게는 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P 또는 353T 뿐만 아니라 하나 이상의 하기 치환을 포함한다: G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, G121F 및 G87S. PS4 변이 폴리펩타이드는 이러한 치환을 지닌 모폴리펩타이드로부터 유도 가능하다.
슈도모나스 스투트제리 모폴리펩타이드에 기반한 PS4 변이 폴리펩타이드
일부 실시태양에서 PS4 변이체는 바람직하게는 하기 서열번호: 7에 나타난 슈도모나스 스투트제리 넌-말토제닉 효소 서열로부터 유도된다.
따라서 PS4 변이 폴리펩타이드는 PStu-D34(서열번호: 8)로부터 유도 가능하다. 또한 본 발명자는 슈도모나스 스투트제리 넌-말토제닉 효소에 기반하고 G121 및/또는 G87 치환을 포함한 PS4 변이 폴리펩타이드를 개시한다. 이들은 L178F 및 A179T 중의 하나 또는 모두와 함께 하기 치환을 포함한다: G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, G121D 및 G87S.
따라서 PS4 변이 폴리펩타이드는 G121D를 포함한 PStu-D20(서열번호: 9) 서열 또는 G87S를 더욱 포함한 PStu-D14(서열번호: 10) 서열을 지닌 슈도모나스 스투트제리 넌-말토제닉 효소 모서열로부터 유도된다.
PS4 변이 핵산
또한 본 발명자는 여기서 기술된 목적을 위해 이러한 폴리펩타이드의 제조시 이용하기 위한 PS4 변이 폴리펩타이드 내의 변경에 상응하거나 이를 인코드하는 서열을 지닌 PS4 핵산을 기술한다. 따라서 본 발명자는 본 명세서에 나타난 폴리펩타이드 서열을 인코드하는 것이 가능한 핵산을 제공한다.
당업자는 핵산 서열과 폴리펩타이드 서열, 특히 유전자 코드와 이러한 코드의 축퇴(degeneracy) 사이의 관계를 인식하고 있고 어려움 없이 이러한 PS4 핵산을 구축할 수 있을 것이다. 예를 들어 당업자는 PS4 변이 폴리펩타이드 서열 내 각각의 아미노산 치환을 위해 치환 아미노산을 인코드하는 하나 이상의 코돈이 존재함을 인식할 것이다. 따라서 특정 아미노산 잔기에 대한 유전자 코드의 축퇴에 따라 하나 이상의 PS4 변이 폴리펩타이드가 PS4 변이 폴리펩타이드 서열에 상응하여 생성됨이 명백할 것이다. 더욱이 PS4 변이 폴리펩타이드는 예를 들어 A141P/G223A와 같은 하나 이상의 치환을 포함하고, 상응하는 PS4 핵산은 각각 2개 아미노산 변화를 인코드하는 코돈의 이원 조합을 포함한다.
PS4 변이 핵산 서열은 상기 기술된 모폴리펩타이드를 인코드하는 모 핵산으로부터 유도 가능하다. 특히 모 핵산은 야생형 서열 즉, 서열번호: 6 또는 서열번호: 12를 포함한다. 따라서 PS4 변이 핵산은 야생형 넌-말토제닉 엑소아밀라제를 인코드하나 야생형 아미노산 잔기 대신 관련 위치에서 또다른 아미노산을 인코드하는 핵산을 포함한다. 또한 PS4 변이 핵산 서열은 하나 이상의 돌연변이를 지닌 즉, 상기 "조합" 하에 기술된 모폴리펩타이드를 인코드하는 야생형 서열을 포함한다.
특정 PS4 변이 핵산 서열과 동일하지 않으나 이에 관련된 핵산 서열도 여기서 기술된 방법 및 PS4 변이 핵산 서열의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편 또는 상보체 또는 이에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열과 같은 조성물에 유용함이 이해될 것이다. 문맥상 다른 경우를 나타내지 않는 한 "PS4 변이 핵산"이라는 용어는 상기 기입된 이들 실재 각각을 포함해야 한다.
아미노산 서열 및 핵산 서열 내 돌연변이는 당분야에 알려진 바와 같이 많은 긴술에 의해 이루어진다. 변이 서열은 예를 들어 적당한 올리고뉴클레오타이드 프라이머로의 PCR을 이용한 자리-지정 돌연변이, 5' 첨가 돌연변이, 불일치 프라이머 돌연변이 등과 같은 알려진 기술을 이용하여 용이하게 제조된다. 대안으로 또는 이에 더하여 PS4 변이 핵산 서열은 새로(de novo) 제조된다.
특히 바람직한 실시태양에서 돌연변이는 실시예에 나타난 바와 같이 적당한 프라이머를 이용한 PCR(중합효소 연쇄 반응)에 의해 모서열 내로 도입된다. 따라서 기술된 바와 같이 아미노산 또는 핵산 수준에서 바람직하게는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 슈도모나스 사카로필라 또는 슈도모나스 스투트제리 엑소아밀라제 서열과 같은 모폴리펩타이드 내로 원하는 아미노산 치환을 도입시킴으로서 폴리펩타이드 서열을 변경시키는 것이 가능하다. 본 발명자는 넌-말토제닉 엑소아밀라제의 서열이 넌-말토제닉 엑소아밀라제를 인코드하는 핵산의 서열을 변경시킴으로서 변경되는 방법을 기술한다.
그러나 PS4 변이 폴리펩타이드가 예를 들어 단계적 돌연변이에 의해 야생형 폴리펩타이드 또는 핵산 서열로부터 실질적으로 유도될 필요는 없음이 인식될 것이다. 오히려 PS4 변이 폴리펩타이드 서열이 수립되면 당업자는 적당한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 PCR을 이용하는 것과 같은 당분야에 알려진 수단을 통해 모든 돌연변이를 지닌 야생형으로부터 이러한 서열을 용이하게 제조할 수 있다. 실제로 PS4 변이 폴리펩타이드는 펩타이드 합성 방법론과 같은 것을 통해 그의 모든 돌연변이를 지니도록 새로 제조될 수 있다.
그러나 일반적으로 PS4 변이 폴리펩타이드 및/또는 핵산은 "전구체" 서열로부터 유도되거나 유도 가능하다. 여기서 사용된 "전구체"라는 용어는 여기서 기술된 방법 및 조성물에 따라 변형된 효소에 앞서는 효소이다. 따라서 전구체는 변형된 효소를 제조하는데 이용되는 포함한다. 따라서 전구체는 본 명세서에 기술된 돌연변이유발에 의해 변형되는 효소이다. 유사하게는 전구체는 야생형 효소, 변이 야생형 효소 또는 이미 돌연변이된 효소이다.
PS4 변이 폴리펩타이드 및 핵산은 당분야에 알려진 수단에 의해 제조된다. 상세하게는 이들은 시험관 내 또는 생체 내인 발현 시스템으로부터 자연적으로 발현된다. 상세하게는 본 발명자는 PS4 변이 핵산을 포함하고 바람직하게는 PS4 변이 폴리펩타이드를 발현하는 것이 가능한 플라스미드 및 발현 벡터를 기술한다. 이러한 PS4 핵산, 플라스미드 및 벡터를 포함하고 바람직하게는 이들로 형질전환되는 세포 및 숙주 세포도 개시되고 이들도 본 명세서 내에 포함됨이 명백해져야 한다.
바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드 서열은 분리된 형태로 식품 첨가제로 이용된다. "분리된"이라는 용어는 서열이 자연적으로 자연과 관련되고 자연 내에서 발견되는 서열을 지닌 적어도 하나 이상의 다른 성분을 실질적으로 지니지 않음을 의미한다. 하나의 관점에서 바람직하게는 서열은 정제된 형태이다. "정제된"이라는 용어는 서열이 매우 순수한 상태임을 의미한다 - 즉, 적어도 약 90% 이상의 순도 또는 적어도 약 95% 이상의 순도 또는 적어도 약 98% 이상의 순도.
위치 번호
번호로 본 명세서에 나타난 모든 위치는 하기에 나타난 슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라제 참고 서열(서열번호: 1)의 번호를 나타낸다:
Figure 112007000695933-pct00001
참고 서열은 SWISS-PROT 수납 번호 P22963를 지니나 신호 서열 MSHILRAAVLAAVLLPFPALA을 지니지 않은 슈도모나스 사카로필라 서열로부터 유도된다.
C-말단 전분 결합 도메인 EGGLVNVNFR CDNGVTQMGD SVYAVGNVSQ LGNWSPASAV RLTDTSSYPT WKGSIALPDG QNVEWKCLIR NEADATLVRQ WQSGGNNQVQ AAAGASTSGS F는 선택적으로 무시된다. 대안으로 이는 포함된다.
본 명세서의 문맥에서 PS4 엑소아밀라제 효소 내 아미노산 잔기 위치의 특정 번호가 이용된다. 이에 대해 다양한 알려진 엑소아밀라제의 아미노산 서열의 정렬에 의해 아미노산 서열이 알려진 엑소아밀라제 아미노산 위치 번호를 어떠한 엑소아밀라제 효소 내 아미노산 잔기 위치에 명백하게 할당하는 것이 가능하다. 많은 다른 알려진 엑소아밀라제의 아미노선 서열과 정렬된, 슈도모나스 사카로필라로부터 수득된 엑소아밀라제의 아미노산 서열로부터 기원한 이러한 번호 체계를 이용하여 엑소아밀라제 내 아미노산 잔기의 위치를 명백하게 나타내는 것이 가능하다.
따라서 기본 참고 포인트로서 특정 서열을 이용하더라도 번호 체계는 모든 관련 상동성 서열에 적용 가능하다. 예를 들어 위치 번호는 다른 슈도모나스종 유래의 상동성 서열 또는 다른 박테리아 유래의 상동성 서열에 적용된다. 바람직하게는 이러한 상동체는 상기 서열번호: 1의 참고서열 또는 SWISS-PROT 수납 번호 P22963 또는 P13507 또는 바람직하게는 이들 서열 모두에 대해 60% 이상의 상동성, 예를 들어 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 상동성을 지닌다. 단백질간의 서열 상동성은 잘 알려진 정렬 프로그램 및 여기에 기술된 하이브리디제이션 기술을 이용하여 확인된다. 이러한 상동성 서열뿐만 아니라 하기 기술된 기능적 동등물은 본 명세서 내에 "PS4 패밀리"로 표기될 것이다.
더욱이 상기 주지된 바와 같이 본 명세서 내에 사용된 번호 체계는 SWISS-PROT 수납 번호 P22963를 지닌 슈도모나스 사카로필라 서열로부터 유래하나 신호 서열 MSHILRAAVLAAVLLPFPALA을 지니지 않은 참고 서열 서열번호: 1을 참고한다. 이러한 신호 서열은 참고 서열의 N 말단에 위치하고 21개 아미노산 잔기로 구성된다. 따라서 신호 서열을 포함한 대응 서열 또는 실제로 다른 N- 또는 C-말단 연장 또는 결실을 포함한 대응 서열 내에서 돌연변이되거나 치환되는 특정 잔기를 확인하는 것은 일반적일 것이다. N-말단 첨가 또는 결실에 관해서는 필요한 모든 것은 삽입되거나 결실되는 잔기 번호에 의해 위치 번호를 차감하는 것이다. 예를 들어 서열번호: 1 내의 위치 1은 신호 서열을 지닌 서열 내 위치 22에 상응한다.
모효소/폴리펩타이드
PS4 변이 폴리펩타이드는 "모효소", "모폴리펩타이드" 또는 "모서열"로 알려진 다른 서열로부터 유도되거나 그의 변이체이다.
본 명세서 내에 사용된 "모효소"라는 용어는 수득되는 변이체 즉, PS4 변이 폴리펩타이드 또는 핵산에 대해 밀접한, 바람직하게는 가장 밀접한 화학적 구조를 지닌 효소를 의미한다. 모효소는 전구체 효소(즉, 실질적으로 돌연변이되는 효소)이거나 새로 제조된다. 모효소는 야생형 효소이거나 하나 이상의 돌연변이를 지닌 야생형 효소이다.
여기서 사용된 "전구체"라는 용어는 효소를 제조하기 위해 변형되는 효소를 앞서는 효소를 의미한다. 따라서 전구체는 돌연변이유발에 의해 변형되는 효소이다. 유사하게는 전구체는 야생형 효소, 변이 야생형 효소 또는 이미 돌연변이된 효소이다.
"야생형"이라는 용어는 당업자에 의해 당분야에서 이해되는 용어이고 자연 발생적이고 돌연변이의 표현형과 대비되는 종 멤버 대부분의 특성인 표현형을 의미한다. 따라서 본 문맥내에서 야생형 효소는 관련 종의 대부분의 멤버에서 자연적으로 발견되는 효소의 형태이다. 일반적으로 여기서 기술된 변이 폴리펩타이드와 관련된 관련 야생형 효소는 서열 상동성의 측면에서 대응 야생형 효소와 가장 밀접하게 관련된다. 그러나 여기서 기술된 바와 같이 특정 야생형 서열이 변이 PS4 폴리펩타이드를 제조하기 위한 기초로 이용되는 경우 아미노산 서열 상동성의 측면에서 더욱 밀접하게 관련된 또다른 야생형 서열의 존재에 관계없이 대응 야생형 서열이 될 것이다.
모효소는 바람직하게는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 나타내는 폴리펩타이드이다. 바람직하게는 모효소는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 그 자체이다. 예를 들어 모효소는 SWISS-PROT 수납 번호 P22963을 지닌 폴리펩타이드와 같은 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 엑소아밀라제 또는 SWISS-PROT 수납 번호 P13507를 지닌 폴리펩타이드와 같은 슈도모나스 수투트제리 넌-말토제닉 엑소아밀라제이다.
PS4 패밀리의 또다른 멤버도 모효소로 이용되고; 이러한 "PS4 패밀리 멤버"는 일반적으로 이들 두 효소와 유사하거나 상동적이거나 기능적으로 동등하고, 프로브를 이용한 적당한 라이브러리의 하이브리디제이션 선별과 같은 표준 방법 또는 게놈 서열 분석에 의해 확인된다.
특히 이들 두 효소의 기능적 동등물뿐만 아니라 "PS4 패밀리"의 다른 멤버는 여기서 기술된 PS4 변이 폴리펩타이드의 생성을 위한 시작 포인트 또는 모폴리펩타이드로서 이용된다.
단백질의 "기능적 동등물"은 하나 이상, 바람직하게는 모든 단백질 기능을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는 이러한 기능은 생물학적 기능, 바람직하게는 아밀라제 활성, 바람직하게는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성과 같은 효소 기능이다. 모효소와 관련하여 "기능적 동등물"이라는 용어는 바람직하게는 모분자와 유사하거나 동일한 기능을 지닌 분자를 의미한다. 모분자는 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 엑소아밀라제 또는 슈도모나스 스투트제리 넌-말토제닉 엑소아밀라제 또는 다른 원천으로부터 수득된 폴리펩타이드이다.
SWISS-PROT 수납 번호 P22963을 지닌 폴리펩타이드와 같은 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 엑소아밀라제 또는 SWISS-PROT 수납 번호 P13507를 지닌 폴리펩타이드와 같은 슈도모나스 수투트제리 넌-말토제닉 엑소아밀라제인 모효소와 관련한 "기능적 동등물"이라는 용어는 기능적 동등물이 다른 원천으로부터 수득될 수 있음을 의미한다. 기능적으로 동등한 효소는 다른 아미노산 서열을 지니나 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닐 것이다. 기능성을 측정하는 분석방법의 예는 여기에 기술되고 당업자에 알려져 있다.
매우 바람직한 실시태양에서 기능적 동등물은 상기 기술된 슈도모나스 사카로필라 및 슈도모나스 수투트제리 또는 넌-말토제닉 엑소아밀라제, 바람직하게는 이 둘 모두에 대한 서열 상동성을 지닐 것이다. 또한 기능적 동등물은 서열번호: 1 내지 14, 바람직하게는 서열번호: 1 또는 서열번호: 7 또는 이 둘 모두에 나타난 서열과의 서열 상동성을 지닌다. 이러한 서열간의 서열 상동성은 적어도 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상이다. 이러한 서열 상동성은 BLAST 또는 FASTA 등과 같은 당분야에 알려진 많은 컴퓨터 프로그램에 의해 생성된다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestflt 팩키지(University of Wisconsin, U.S.A; Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Research 12:387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨이의 예는 BLAST 팩키지(Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18), FASTA (Atschul et al, 1990, J. MoI. Biol., 403-410) 및 GENEWORKS suite of comparison tools을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. BLAST 및 FASTA은 모두 오프라인 및 온라인 검색에 유용하다(Ausubel et al, 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60 참조). 그러나 GCG Bestfit 프로그램을 이용하는 것이 바람직하다.
또다른 실시태양에서 기능적 동등물은 상기에 나타난 서열에 특이적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능할 것이다. 하나의 서열이 또다른 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한지 여부를 측정하는 방법은 당분야에 알려져 있고, 예를 들어 Sambrook, et al (상동) 및 Ausubel, F. M. et al. (상동)에 기술되어 있다. 매우 바람직한 실시태양에서 기능적 동등물은 스트린전트 조건 즉, 65℃ 및 O.lxSSC {lxSSC = 0.15M NaCl, 0.015M Na3 구연산염 pH 7.0} 하에서 하이브리다이즈하는 것이 가능할 것이다.
예를 들어 슈도모나스 사카로필라 및 슈도모나스 스투트제리 넌-말토제닉 엑소아밀라제에 대해 서열 상동성을 지닌 기능적 동등물은 모효소로 이용하기에 적당하다. 이러한 서열은 하나 이상의 위치에서 슈도모나스 사카로필라와 다르다. 더욱이 ATCCl 7686와 같은 슈도모나스종의 다른 균주 유래의 넌-말토제닉 엑소아밀라제도 모폴리펩타이드로 이용된다. PS4 변이 폴리펩타이드 잔기는 이들 모서열에 삽입되어 변이 PS4 폴리펩타이드 서열을 생성하게 된다.
상기 나타난 바와 같이 PS4 변이 폴리펩타이드의 생성을 위해 시작 포인트 또는 모폴리펩타이드로서 이용되기 위해 PS4 변이 폴리펩타이드가 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 것이 바람직한 경우 대응 돌연변이는 슈도모나스종 넌-말토제닉 엑소아밀라제뿐만 아니라 "PS4 패밀리"의 다른 멤버의 기능적 동등물의 핵산 서열 내에서 이루어짐이 이해될 것이다.
"PS4 변이 폴리펩타이드"라는 용어는 하기 개시된 폴리펩타이드에 상세하게는 포함된다:
미국 특허출원 60/485,413, 60/485,539 및 60/485,616; PCT/US2004/021723 및 PCT/US2004/021739; 미국 특허출원 10/886,905 및 10/866,903; 미국 특허출원 60/608,919; 미국 특허출원 60/612,407; 미국 특허출원 60/485,539; PCT/IB2004/002487; 미국 특허출원 10/886,023; 미국 특허출원 10/886,505, 미국 특허출원 10/886,527 및 미국 특허출원 10/886,504; 미국 특허출원 10/947,612.
이러한 폴리펩타이드는 여기서 기술된 특허출원에, 특히 식품 첨가로서 이용하기에, 여기서 기술된 전분을 처리하기 위해, 식품을 제조하기 위해, 베이커리 제품을 제조하기 위해, 식품첨가물 조성물의 포뮬레이션을 위해, 조합의 포뮬레이션을 위해 적당하다.
모서열의 변형
모효소는 여기서 기술된 PS4 변이 서열을 생성하기 위해 아미노산 수준 또는 핵산 수준에서 변형된다. 따라서 본 발명자는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 대응 코돈 변화를 도입함으로서 PS4 변이 폴리펩타이드의 생성을 제공한다.
핵산 번호는 바람직하게는 서열번호: 6에 나타난 슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라제 뉴클레오타이드 서열의 위치 번호를 참고해야 한다. 대안으로 또는 이에 더하여 GenBank 수납 번호 Xl6732를 지닌 서열을 참고한다. 바람직한 실시태양에서 핵산 번호는 서열번호: 6에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 참고해야 한다. 그러나 아미노산 잔기 번호와 유사하게 이들 서열의 잔기 서열은 참고 목적으로만 이용된다. 특히 상기 코돈 변화가 어떠한 PS4 패밀리 핵산 서열 내에서도 이루어질 수 있음이 인식될 것이다. 예를 들어 서열 변화는 슈도모나스 사카로필라 또는 슈도모나스 스투트제리 넌-말토제닉 엑소아밀라제 핵산 서열(즉, Xl6732, 서열번호: 6 또는 M24516, 서열번호: 12)에서 이루어질 것이다.
모효소는 자연적으로 발생하는 바와 같이(또는 돌연변이되는 바와 같이) "완전한" 효소 즉, 전체 길이를 포함하거나 그의 절단 형태를 포함한다. 따라서 이들로부터 유래한 PS4 변이체는 절단되거나 "전체-길이"이다. 절단은 N-말단 또는 C-말단, 바람직하게는 C-말단에서 이루어진다. 모효소 또는 PS4 변이체는 활성적이거나 그렇지 않은 하위서열, 신호 서열, 도메인 또는 모이어티와 같은 하나 이상의 부분이 결여되어 있다. 예를 들어 상기 기술된 바와 같이 모효소 또는 PS4 변이 폴리펩타이드는 신호 서열이 결여되어 있다. 대안으로 또는 이에 더하여 모효소 또는 PS4 변이체는 하나 이상의 촉매 또는 결합 도메인이 결여되어 있다.
매우 바람직한 실시태양에서 모효소 또는 PS4 변이체는 전분 결합 도메인과 같은 넌-말토제닉 엑소아밀라제 내에 존재하는 하나 이상의 도메인이 결여되어 있다. 예를 들어 PS4 폴리펩타이드는 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라 넌-말토제닉 엑소아밀라제의 번호와 비교시 429 위치까지의 서열만을 지닌다. 이는 PS4 변이 pSac-d34, pSac-D20 및 pSac-D14에 대한 경우임이 주지된다.
다른 실시태양에서 모효소 또는 PS4 변이체는 N 말단 또는 C 말단에서의 하나 이상의 추가적 아미노산 서열과 함께 자연 내에서 발생하는 바와 같은(또는 돌연변이되는 바와 같은) "완전한" 효소 즉 전체 길이를 포함한다. 예를 들어 모효소 또는 PS4 변이 폴리펩타이드는 C 말단 또는 N 말단에서 단일 추가 아미노산 잔기 즉, M, A, G 등을 포함한다. 바람직하게는 추가적 아미노산 잔기는 N 말단에 존재한다. 하나 이상의 추가적 잔기가 포함되는 경우 위치 번호는 추가 길이에 의해 차감될 것이다.
아밀라제
PS4 변이 폴리펩타이드는 일반적으로 아밀라제 활성을 포함한다.
"아밀라제"라는 용어는 일반적인 의미 - 즉 특히 전분 분해를 촉매할 수 있는 효소 -로 사용된다. 특히 이들은 전분 내 α-D-(1→4) O-글리코시드 결합을 분열시킬 수 있는 가수분해효소이다.
아밀라제는 가수분해효소로 분류되고 전분 내 α-D-(1→4) O-글리코시드 결합을 분열시키는 전분-분해 효소이다. 일반적으로 α-아밀라제(E.C. 3.2.1.1, α-D-(1→4)-글루칸 글루카노하이드롤라제)는 전분 분자 내에서 무작위 형태로 α-D-(1→4) O-글리코시드 결합을 분열시키는 엔도-작용 효소로 정의된다. 이와는 대조적으로 β-아밀라제(E.C. 3.2.1.2, α-D-(1→4)-글루칸 말토테트라하이드롤라제)와 같은 엑소-작용 아밀라제 효소 및 일부 생성물-특이적 아밀라제 유사 말토제닉 알파-아밀라제(E.C. 3.2.1.133)는 기질의 바-환원성 말단으로부터 전분 분자를 분열시킨다. β-아밀라제, α-글루코시다제(E.C. 3.2.1.20, α-D-글루코시드 글루코하이드롤라제), 글루코아밀라제(E.C. 3.2.1.3, α-D-(1→4)-글루칸 글루코하이드롤라제) 및 생성물-특이적 아밀라제는 전분으로부터 특정 길이의 말토-올리고당을 생성할 수 있다.
넌-말토제닉 엑소아밀라제
본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩타이드는 바람직하게는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 폴리펩타이드로부터 유도된다(또는 그의 변이체임). 바람직하게는 이들 모효소는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 자체이다. 또한 매우 바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드 자체는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 나타낸다.
매우 바람직한 실시태양에서 본 명세서 내에 사용된 "넌-말토제닉 엑소아밀라제 효소"라는 용어는 본 명세서에 기술된 바와 같이 생성물 측정 절차에 따라 분석시 효소가 실질적인 함량의 말토오스로 전분을 초기에 분해하지 않음 의미해야 한다.
매우 바람직한 실시태양에서 넌-말토제닉 엑소아밀라제는 엑소-말토테트라하이드롤라제를 포함한다. 엑소-말토테트라하이드롤라제(E.C.3.2.1.60)는 정식으로는 글루칸 1,4-알파-말토테트라하이드롤라제로 더 많이 알려져 있다. 이러한 효소는 비-환원성 사슬 말단으로부터 성공적인 말토테트라오스 잔기를 제거하기 위해 전분성 다당류 내 1,4-알파-D-글루코시드 결합을 가수분해한다.
넌-말토제닉 엑소아밀라제는 참고문헌에 포함된 미국 특허 제6,667,065호에 상세히 기술되어 있다.
넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성의 분석방법
하기 시스템은 여기에 기술된 방법 및 조성물에 따라 이용하기에 적당한 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 폴리펩타이드를 특성화하는데 이용된다. 이러한 시스템은 예를 들어 여기에 기술된 PS4 모폴리펩타이드 또는 변이 폴리펩타이드를 특성화하는데 이용된다.
시초의 배경 정보에 의해 왁스성 옥수수 아밀로펙틴(프랑스 Roquette사의 WAXILYS 200로서 수득 가능)은 매운 높은 아밀로펙틴 함량(90% 이상)을 지닌 전분이다. 20 mg/ml의 왁스성 옥수수 전분을 50 mM MES(2-(N-모폴리노)에탄술폰산), 2 mM 염화칼슘, pH 6.0의 완충액 내에서 3분간 끓이고 50℃에서 인큐베이트시키고 30분 이내에 사용한다.
넌-말토제닉 엑소아밀라제의 하나의 단위는 상기 기술된 바와 같이 제조된 50 mM MES, 2 mM 염화칼슘, pH 6.0 내의 10 mg/ml 왁스성 옥수수 전분 4 ml가 포함된 시험관 내 50℃에서 인큐베이트시 분당 환원당의 1 μmol에 등가인 가수분해 산물을 방출하는 효소의 함량으로 정의된다. 환원당은 표준물질로서 말토오스를 이용하고 Bernfeld, Methods Enzymol, (1954), 1, 149-158의 디니트로실리실산 방법 또는 환원당을 정량화하는 당분야에 알려진 방법을 이용하여 측정된다.
넌-말토제닉 엑소아밀라제의 가수분해 산물 패턴은 상기 기술된 바와 같이 제조된 완충액 내에 10 mg/ml 왁스성 옥수수 전분 4 ml가 포함된 시험관 내 50℃에서의 15 또는 300분간 넌-말토제닉 엑소아밀라제의 0.7 단위를 인큐베이트시킴으로서 측정된다. 반응은 비등수조 내에서 3분간 시험관을 침지시킴으로서 정지된다.
가수분해 산물은 펄스된 전류 측정으로 표준물질로서 글루코스부터 말토헵타오스까지의 알려진 선형 말토올리고당을 사용하고 용출액으로 아세트산나트륨, 수산화나트륨 및 물을 사용하는 Dionex PA 100 컬럼을 이용한 음이온 교환 HPLC에 의해 분석되고 정량화된다. 말토옥타오스 내지 말토데카오스에 사용된 반응 인자는 말토헵타오스에 대해 발견된 반응 인자이다.
바람직하게는 PS4 변이 폴리펩타이드는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지녀서 상기 넌-말토제닉 엑소아밀라제의 0.7 단위 함량이 50 mM MES(2-(N-모폴리노)에탄술폰산) 및 2 mM 염화칼슘을 함유한 완충액 ml 당 10 mg의 미리 끓인 왁스성 옥수수 전분 수용액 4 ml 내에서 pH 6.0의 50℃ 온도로 15분간 인큐베이트되면 효소는 2 내지 10의 D-글루코피라노실 단위의 하나 이상의 선형 말토-올리고당 및 선택적으로는 글루코스로 구성된 가수분해 산물(들)을 산출하고; 상기 가수분해 산물의 적어도 60 중량%, 바람직하게는 적어도 70 중량%, 더욱 바람직하게는 80 중량% 및 가장 바람직하게는 적어도 85 중량%는 3 내지 10의 D-글루코피라노실 단위의 선형 말토올리고당, 바람직하게는 4 내지 8의 D-글루코피라노실 단위로 구성된 선형 말토올리고당으로 구성되게 된다.
참고를 용이하게 하고 본 목적을 위해 50 mM MES(2-(N-모폴리노)에탄술폰산) 및 2 mM 염화칼슘을 함유한 완충액 ml 당 10 mg의 미리 끓인 왁스성 옥수수 전분 수용액 4 ml 내에서 넌-말토제닉 엑소아밀라제의 0.7 단위 함량을 pH 6.0의 50℃ 온도로 15분간 인큐베이트시키는 특징은 "왁스성 옥수수 전분 인큐베이션 시험"으로 표기된다.
따라서 대안으로 표기시 넌-말토제닉 엑소아밀라제인 바람직한 PS4 변이 폴리펩타이드는 왁스성 옥수수 전분 인큐베이션 시험시 2 내지 10의 D-글루코피라노실 단위의 하나 이상의 선형 말토-올리고당 및 선택적으로는 글루코스로 구성된 가수분해 산물(들)을 산출하는 능력을 지님을 특징으로 하여; 상기 가수분해 산물(들)의 적어도 60 중량%, 바람직하게는 적어도 70 중량%, 더욱 바람직하게는 80 중량% 및 가장 바람직하게는 적어도 85 중량%는 3 내지 10의 D-글루코피라노실 단위의 선형 말토올리고당, 바람직하게는 4 내지 8의 D-글루코피라노실 단위로 구성된 선형 말토올리고당으로 구성되게 된다.
왁스성 옥수수 전분 인큐베이션 시험의 가수분해 산물은 2 내지 10의 D-글루코피라노실 단위의 하나 이상의 선형 말토-올리고당 및 선택적으로는 글루코스를 포함한다. 또한 왁스성 옥수수 전분 인큐베이션 시험의 가수분해 산물은 다른 가수분해 산물을 포함한다. 그럼에도 불구하고 3 내지 10의 D-글루코피라노실 단위의 선형 말토올리고당의 중량% 함량은 2 내지 10의 D-글루코피라노실 단위의 하나 이상의 선형 말토-올리고당 및 선택적으로는 글루코스로 구성된 가수분해 산물 함량에 기반한다. 즉, 3 내지 10의 D-글루코피라노실 단위의 선형 말토올리고당의 중량% 함량은 2 내지 10의 D-글루코피라노실 단위의 하나 이상의 선형 말토-올리고당 및 글루코스 이외의 가수분해 산물 함량에 기반하지 않는다.
가수분해 산물은 어떠한 적당한 수단에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어 가수분해 산물은 펄스된 전류 측정으로 예를 들어 표준물질로서 글루코스부터 말토헵타오스까지의 알려진 선형 말토올리고당을 사용하는 Dionex PA 100 컬럼을 이용한 음이온 교환 HPLC에 의해 분석된다.
참고를 용이하게 하고 본 목적을 위해 펄스된 전류 측정으로 예를 들어 표준물질로서 글루코스부터 말토헵타오스까지의 알려진 선형 말토올리고당을 사용하는 Dionex PA 100 컬럼을 이용한 음이온 교환 HPLC을 이용하는 가수분해 산물 분석 특징은 "음이온 교환에 의한 분석"으로 표기될 수 있다. 물론 다른 분석 기술뿐만 아니라 다른 특정 음이온 교환 기술도 충족된다.
따라서 대안으로 표기시 바람직한 PS4 변이 폴리펩타이드는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 것이어서 왁스성 옥수수 전분 인큐베이션 시험시 2 내지 10의 D-글루코피라노실 단위의 하나 이상의 선형 말토-올리고당 및 선택적으로는 글루코스로 구성된 가수분해 산물(들)을 산출하는 능력을 지니고, 상기 가수분해 산물은 음이온 교환에 의해 분석되는 것이 가능하며; 상기 가수분해 산물(들)의 적어도 60 중량%, 바람직하게는 적어도 70 중량%, 더욱 바람직하게는 80 중량% 및 가장 바람직하게는 적어도 85 중량%는 3 내지 10의 D-글루코피라노실 단위의 선형 말토올리고당, 바람직하게는 4 내지 8의 D-글루코피라노실 단위로 구성된 선형 말토올리고당으로 구성되게 된다.
여기서 사용된 "선형 말토-올리고당"이라는 용어는 α-(1→4)결합에 의해 결합된 α-D-글루코피라노스의 2-10 단위를 의미하는 일반적인 의미로 사용된다.
매우 바람직한 실시태양에서 여기서 사용된 PS4 폴리펩타이드는 모폴리펩타이드와 비교시, 바람직하게는 동일한 조건 하에서 시험시 개선된 엑소아밀라제 활성, 바람직하게는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌다. 특히 매우 바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 그의 부모와 비교시, 바람직하게는 왁스성 옥수수 전분 시험으로 측정시 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상의 엑소아밀라제 활성을 지닌다.
가수분해 산물은 어떠한 적당한 수단에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어 가수분해 산물은 펄스된 전류 측정으로 예를 들어 표준물질로서 글루코스부터 말토헵타오스까지의 알려진 선형 말토올리고당을 사용하는 Dionex PA 100 컬럼을 이용한 음이온 교환 HPLC에 의해 분석된다.
여기서 사용된 "선형 말토-올리고당"이라는 용어는 α-(1→4)결합에 의해 결합된 α-D-글루코피라노스의 2-10 단위를 의미하는 일반적인 의미로 사용된다.
개선된 특성
여기서 기술된 PS4 변이체는 바람직하게는 모효소와 비교시 개선된 열안정성, 개선된 pH 안정성 또는 개선된 엑소-특이성 중의 하나 이상과 같은 개선된 특성을 지닌다.
특히 예를 들어 303E, 3O3D, 306T 및 306G와 같이 303 위치에서 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드는 증가된 엑소-특이성을 지닌다. 예를 들어 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, (198W, 229P), 309P, 316S, 316P 및 353T와 같이 146, 157, 158, 198, 229(바람직하게는 198 및 229 모두), 309, 316, 316 및 353의 어떠한 위치에서의 돌연변이를 지닌 것은 개선된 열안정성을 나타낸다.
어떠한 특정 이론에 구속됨이 없이 본 발명자는 특정 위치에서의 돌연변이는 이러한 돌연변이를 포함한 폴리펩타이드의 특성 상에 개별적 및 집합적 효과를 지니는 것으로 판단한다.
열안정성 및 pH 안정성
바람직하게는 PS4 변이 폴리펩타이드는 열안정적이고; 바람직하게는 모효소보다 더 높은 열안정성을 지닌다.
따라서 본 발명자는 동일한 조건 하에서 시험시 모폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교시 더 높은 열안정성을 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드를 제공한다. 더욱 상세하게는 본 발명자는 하나 이상의 121, 145, 146, 157, 158, 188, 198, 223, 229, 316, 353 위치에서의 돌연변이, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 l21A, 121D, 121F, 121H, 121M, 121W, 121Y, 145D, 146G, 157M, 158T, 188H, 188S, 198W, 223A, 223E, 223K, 223R, 223V, 229P, 316P, 316S, 353T의 돌연변이를 포함한 PS4 변이 폴리펩타이드를 제공한다.
밀 및 다른 곡물에서 아밀로펙틴 내 외부 측쇄는 DP 12-19의 범위이다. 따라서 예를 들어 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 여기서 기술된 PS4 변이 폴리펩타이드에 의한 아밀로펙틴 측쇄의 효소적 가수분해는 그의 결정화 경향을 현저히 감소시킬 수 있다.
베이킹 목적으로 사용되는 밀 및 다른 곡물 내 전분은 일반적으로 아밀라제에 의한 효소적 공격에 저항적인 전분 입자의 형태로 존재한다. 따라서 전분 변형은 주로 전분을 손상시키는데 제한적이고 약 60℃에서 젤라틴화를 시작하기 전까지 반죽 처리 및 초기 베이킹 동안 매우 느리게 진행된다. 그 결과로 높은 정도의 열안정성을 지닌 아밀로스만이 베이킹 동안 전분을 효과적으로 변형시킬 수 있다. 또한 일반적으로 아밀로스의 효율은 열안정성의 증가와 함께 증가된다. 이는 효소가 더욱 열안정적일수록 베이킹 동안 더 오랜 시간 활성적일 수 있으므로 더욱 높은 부패방지 효과를 제공할 것이기 때문이다.
따라서 식품으로의 처리 단계 즉, 빵으로의 베이킹 동안 또는 그 후의 어떠한 단계에서도 전분에 첨가시 여기서 사용된 PS4 변이 폴리펩타이드의 이용은 퇴보를 지연시키거나 저해하거나 감소시킬 수 있다. 이러한 이용은 하기 더욱 상세하게 기술된다.
여기서 사용된 "열안정적"이라는 용어는 효소의 증가된 온도에 노출 후 활성을 보유하는 능력에 관한 것이다. 바람직하게는 PS4 변이 폴리펩타이드는 약 55℃ 내지 약 80℃ 이상까지의 온도에서 전분을 분해하는 것이 가능하다. 적당하게는 효소는 약 95℃의 온도에 노출 후 그의 활성을 보유한다.
넌-말토제닉 엑소아밀라제와 같은 효소의 열안정성은 그의 반감기에 의해 측정된다. 따라서 여기서 사용된 PS4 변이 폴리펩타이드는 바람직하게는 55℃ 내지 약 95℃ 이상까지, 바람직하게는 모효소 대비 약 80℃의 증가된 온도에서 바람직하게는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상까지 연장된 반감기를 지닌다.
여기서 사용된 반감기(t1/2)는 효소 활성 반이 한정된 가열 조건하에서 불활성화되는 동안의 시간(분)이다. 바람직한 실시태양에서 반감기는 80℃에서 분석된다. 바람직하게는 표본은 80℃ 이상에서 1∼10분간 가열된다. 이후 반감기 수치는 여기서 기술된 어떠한 방법에 의해 잔여 아밀라제 활성을 측정함으로서 계산된다. 바람직하게는 반감기 분석은 실시예에 더욱 상세히 기술된 바와 같이 수행된다.
바람직하게는 여기서 기술된 PS4 변이체는 베이킹 동안 활성적이고 약 55℃의 온도에서 시작되는 전분 입자의 젤라틴화 동안 및 그 후 전분을 가수분해시킨다. 넌-말토제닉 엑소아밀라제가 더욱 열안정적일수록 이는 더 긴 길게 활성적일 수 있고 따라서 더 많은 부패방지 효과를 제공할 것이다. 그러나 약 85℃의 상기 온도에서의 베이킹 동안 효소 불활성화가 발생할 수 있다. 이러한 현상이 발생하면 넌-말토제닉 엑소아밀라제는 점진적으로 불활성화되어 최종 빵에서의 베이킹 공정 후 실질적으로 어떠한 활성도 존재하지 않는다. 따라서 우선적으로는 여기서 기술된 바와 같이 이용하기에 적당한 넌-말토제닉 엑소아밀라제는 50℃ 이상 및 98℃ 이하의 최적 온도를 지닌다.
여기서 기술된 PS4 변이체의 열안정성은 더욱 열안정적이 되도록 설계되어 여기서 기술된 바와 같은 이용에 더욱 적당하게된 단백질을 이용함으로서 개선될 수 있고; 본 발명자는 단백질 설계에 의해 더욱 열안정적이 되도록 변형된 PS4 변이체의 이용을 포함시킨다.
바람직하게는 PS4 변이 폴리펩타이드는 pH 안정적이고; 더욱 바람직하게는 동족 모폴리펩타이드 보다 더 높은 pH 안정성을 지닌다. 여기서 사용된 "pH 안정적"이라는 용어는 광범위한 pH에서 활성을 보유하는 효소의 능력에 관한 것이다. 바람직하게는 PS4 변이 폴리펩타이드는 약 5∼10.5의 pH에서 전분을 분해하는 것이 가능하다. 하나의 실시태양에서 pH 안정성 정도는 특정 pH 조건에서의 효소 반감기를 측정함으로서 분석된다. 또다른 실시태양에서 pH 안정성 정도는 특정 pH 조건에서의 효소의 활성 또는 특정 활성을 측정함으로서 분석된다. 특정 pH 조건은 pH 5 내지 pH 10.5의 어떠한 pH도 된다.
따라서 PS4 변이 폴리펩타이드는 동일한 조건 하에서 모폴리펩타이드와 비교시 더 긴 반감기 또는 더 높은 활성을 지닌다(분석방법에 따라 다르게). PS4 변이 폴리펩타이드는 동일한 pH 조건 하에서 모폴리펩타이드와 비교시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 더 긴 반감기를 지닌다. 대안으로 또는 이에 더하여 이들은 동일한 pH 조건 하에서 모폴리펩타이드와 비교시 이러한 더 높은 활성을 지닌다.
엑소-특이성
일부 넌-말토제닉 엑소아밀라제가 어느 정도 엔도아밀라제 활성을 지닐 수 있음은 알려져 있다. 일부의 경우 엔도아밀라제 활성이 분지된 덱스트린의 축적으로 인해 끈적거리거나 점착성의 빵 속을 제조함으로서 다수의 최종 빵 제품에 부정적인 효과를 미칠 수 있기 때문에 이러한 형태의 활성은 감소되거나 제거될 필요가 있다.
본 발명자는 동일한 조건 하에서 시험시 모폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교시 더 높은 엑소-특이성을 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드를 제공한다. 더욱 상세하게는 본 발명자는 하나 이상의 26, 70, 121, 145, 161, 223, 223, 303, 306, 309, 339, 339 위치에서의 돌연변이, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 26E, 70D, 121A, 121D, 121H, 121M, 121W, 121Y, 145D, 161A, 223A, 223E, 223K, 223R, 223V, 3O3D, 303E, 306G, 306T, 309P, 339A, 339E 돌연변이를 포함한 PS4 변이 폴리펩타이드를 제공한다.
엑소-특이성은 일반적으로 총 엔도아밀라제 활성에 대한 총 아밀라제의 비율을 측정함으로서 측정될 수 있다. 이러한 비율은 본 명세서에서 "엑소-특이성 지수"로 표기된다. 바람직한 실시태양에서 효소는 20 이상의 엑소-특이성 지수를 지닌 경우 즉, 그의 총 아밀라제 활성(엑소-아밀라제 활성을 포함)가 그의 엔도아밀라제 활성보다 20배 이상 더 높은 경우 엑소아밀라제로 판단된다. 매우 바람직한 실시태양에서 엑소아밀라제의 엑소-특이성 지수는 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상 또는 100 이상이다. 매우 바람직한 실시태양에서 엑소-특이성 지수는 150 이상, 200 이상, 300 이상, 400 이상, 500 이상, 600 이상이다.
총 아밀라제 활성 및 엔도아밀라제 활성은 당분야에 알려진 수단에 의해 측정된다. 예를 들어 총 아밀라제 활성은 전분 기질로부터 방출된 환원 결과물의 총 수를 분석함으로서 측정된다. 대안으로 Betamyl 분석의 이용은 실시예에서 더욱 상세히 기술되어 있고 편의상 실시예에서 분석된 아밀라제 활성은 표에서 "Betamyl 단위"라는 표현으로 기술된다.
엔도아밀라제 활성은 Phadebas 키트(Pharmacia and Upjohn)를 이용하여 분석된다. 이는 청색 표지된 교차결합된 전분(아조(azo) 염료로 표지됨)을 이용하고; 전분 분자내 내부 절단만이 표지를 방출하고 외부 절단은 그렇지 않다. 염료의 방출은 분광광도계로 측정된다. 따라서 Phadebas 키트는 엔도아밀라제 활성을 측정하고, 편의상 그 결과로서 분석(실시예에 기술됨)은 본 명세서 내에 "Phadebas 단위"로 표기된다.
따라서 매우 바람직한 실시태양에서 엑소-특이성 지수는 "B/Phad"로도 표기되는 Betamyl 단위/Phadebas 단위 형식으로 표기된다.
또한 엑소-특이성은 예를 들어 본 발명자의 국제출원 공보 WO99/50399와 같은 당분야에 기술된 방법에 따라 분석된다. 이는 엑소아밀라제 활성에 대한 엔도아밀라제 활성의 비율로서 엑소-특이성을 측정한다. 따라서 바람직한 관점에서 여기서 기술된 PS4 변이체는 엑소아밀라제 활성 단위 당 0.5 이하의 엔도아밀라제 단위(EAU)를 지닐 것이다. 바람직하게는 본 발명에 따른 이용에 적당한 넌-말토제닉 엑소아밀라제는 엑소아밀라제 활성 단위 당 0.05 EAU 이하, 더욱 바람직하게는 엑소아밀라제 활성 단위 당 0.01 EAU를 지닌다.
여기서 기술된 PS4 변이체는 바람직하게는 예를 들어 상기 기술된 바와 같이 엑소아밀라제와 일치한 엑소-특이성 지수에 의해 측정된 엑소특이성을 지닐 것이다. 더욱이 이들은 바람직하게는 유도된 모효소 또는 모폴리펩타이드와 비교시 더 높거나 증가된 엑소특이성을 지닌다. 따라서 예를 들어 PS4 변이 폴리펩타이드는 바람직하게는 동일한 조건 하에서 모폴리펩타이드와 비교시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 더 높은 엑소-특이성 지수를 지닌다. 이들은 바람직하게는 동일한 조건 하에서 그의 모폴리펩타이드와 비교시 1.5x 이상, 2x 이상, 5x 이상, 10x 이상, 50x 이상, 100x 이상을 지닌다.
PS4 변이 폴리펩타이드 및 핵산의 이용
PS4 변이 폴리펩타이드, 핵산, 숙주 세포, 발현 벡터 등은 아밀라제가 사용되는 어떠한 적용에도 이용된다. 특히 이들은 넌-말토제닉 엑소아밀라제로서 적당하게 이용된다. 이들은 단독으로 또는 알려진 다른 아밀라제 또는 넌-말토제닉 엑소아밀라제와 결합되어 아말리제 또는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 보충하는데 이용된다.
여기서 기술된 PS4 변이체 서열은 베이커리 및 음료 제품과 같은 다양한 식품 산업에 이용되고 또한 약학 조성물 또는 화학 산업과 같은 다른 적용에도 이용된다. 특히 PS4 변이 폴리펩타이드 및 핵산은 베이킹(WO 99/50399) 및 밀가로 표준화(부피 강화 또는 개선)을 포함한 다양한 산업적 적용에 유용하다. 이들은 전분 및 다른 기질로부터 말토테트라오스를 생성시키는데 이용된다.
따라서 본 발명자는 (a) 넌-말토제닉 엑소아밀라제를 수득하는 단계; (b) 본 명세서에 나타난 넌-말토제닉 엑소아밀라제의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 도입시키는 단계; (c) 수득된 폴리펩타이드를 식품 성분과 혼합시키는 단계를 포함한 식품의 제조 방법을 기술한다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 빵과 같은 베이커리 제품의 부피를 증가시키는데 이용된다. 어떠한 특정 이론에 구속됨이 없이 본 발명자는 이러한 현상이 아밀로스 분자를 단축시키는 엑소아밀라제의 결과로서 가열 동안의 반죽 점도의 감소로부터 유래하는 것으로 판단한다. 이는 발효에 의해 생성된 이산화탄소가 더 적은 장애로 빵 크기를 증가시킬 수 있게 한다.
따라서 PS4 변이 폴리펩타이드를 포함하거나 이로 처리된 식품 제품은 상기와 같이 처리되지 않거나 모폴리펩타이드로 처리된 생성물과 비교시 부피가 팽창된다. 즉, 식품은 식품 제품의 부피 당 더 큰 공기 부피를 지닌다. 대안으로 또는 이에 더하여 PS4 변이 폴리펩타이드로 처리된 식품은 부피 비율 당 더 낮은 밀도 또는 중량(또는 질량)을 지닌다. 특히 바람직한 실시태야에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 부피를 증가시키는데 이용된다. 부피 증가 또는 팽창은 식품의 점착성 또는 녹말질을 감소시키기 때문에 유익하다. 경량의 식품은 소비자에게 선호되고 고객 경험이 증가된다. 바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드의 이용은 10%, 20%, 30% 40%, 50% 이상까지 부피를 증가시킨다.
식품 부피를 증가시키기 위한 PS4 변이 폴리펩타이드의 이용은 실시예에 상세히 기술된다.
식품 이용
여기서 사용된 PS4 변이 폴리펩타이드 및 핵산은 식품으로서 또는 식품 제조에 이용된다. 특히 이들은 식품에 즉 식품 첨가물로서 첨가된다. "식품"이라는 용어는 제조된 식품뿐만 아니라 밀가루와 같은 식품 성분 모두를 포함한다. 바람직한 관점에서 식품은 인간 소비용이다. 식품은 용액 또는 고형 형태이다 - 이용 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라 달라짐.
PS4 변이 폴리펩타이드 및 핵산은 식품 성분으로 이용된다. 여기서 사용된 "식품 성분"이라는 용어는 기능성 식품 또는 식료품이거나 이에 첨가될 수 있는 포뮬레이션을 포함하고 산성화 또는 유화 등에 필요한 다양한 제품 내 낮은 수준에서 이용될 수 있는 포뮬레이션을 포함한다. 식품 성분은 용액 또는 고형 형태이다 - 이용 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라 달라짐.
여기서 사용된 PS4 변이 폴리펩타이드 및 핵산은 식품 보충물이거나 이에 첨가된다. 여기서 개시된 PS4 변이 폴리펩타이드 및 핵산은 기능성 식품이거나 이에 첨가된다. 여기서 사용된 "기능성 식품"이라는 용어는 영양적 효과 및/또는 미감 만족을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 소비자에게 더욱 유익한 효과를 전달할 수 있는 식품을 의미한다. 기능성 식품의 법적인 정의는 존재하지 않으나 이러한 분야의 대부분은 이들이 특정 건강 효과를 지닌 것으로 판매도 식품으로 동의한다.
또한 PS4 변이 폴리펩타이드는 식품 또는 식료품의 제조에 이용된다. 일반적인 식료품은 유제품, 육제품, 가금류 제품, 반죽 제품을 포함한다. 반죽 제품은 찐빵 및 쌀케이크와 같이 튀기거나, 깊게 튀기거나 로스트하거나 굽거나 찌거나 끓인 반죽을 포함한 어떠한 가공된 반죽 제품이다. 매우 바람직한 실시태양에서 식품은 베이커리 제품이다.
바람직하게는 식료품은 베이커리 제품이다. 일반적인 베이커리(베이크된) 제품은 로프(loaf), 롤, 번즈(buns), 피자 베이스 등-과 같은 빵, 페스트리(pastry), 프렛젤(pretzel), 토르티야(tortillas), 케이크, 쿠키, 비스킷, 크랙커 등을 포함한다.
따라서 본 발명자는 본 명세서에 나타난 넌-말토제닉 엑소아밀라제의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 도입시키는 단계를 포함한, 넌-말토제닉 엑소아밀라제를 포함한 식품 첨가제의 변형 방법을 기술한다. 동일한 방법은 식품 성분, 식품 보충물, 식품 또는 식료품을 변형시키는데 이용될 수 있다.
퇴화(retrogradation)/부패
본 발명자는 전분 겔과 같은 전분 매질의 부패를 지연시키는 것이 가능한 PS4 변이 단백질의 이용을 기술한다. 특히 PS4 변이 폴리펩타이드는 전분의 해로운 퇴화를 지연시키는 것이 가능하다.
대부분의 전분 입자는 2개의 폴리머 혼합물로 구성된다: 필수적으로는 선형 아밀로스 및 높게 분지된 아밀로펙틴. 아밀로펙틴은 (1-4)결합에 의해 결합된 α-D-글루코피라노실 단위의 사슬로 구성되고, 사슬이 α-D-(1-6) 결합에 의해 부착되어 분지를 형성하는 매우 크고 분재된 분자이다. 아밀로펙틴은 대두분의 일반적인 전분의 약 75%를 구성하는 모든 천연 전분 내에 존재한다. 아밀로스는 본질적으로는 α-D-(1-6) 결합을 거의 지니지 않는 (1-4)결합된 α-글루코피라노실 단위의 선형 사슬이다. 대부분의 전분은 약 25%의 아밀로스를 포함한다.
물 존재하에 가열된 전분 입자는 젤라틴화로 불리는 질서-무질서 상 변화가 진행되고 입자를 팽창시킴으로서 액체가 채취된다. 젤라틴화 온도는 전분에 따라 달라진다. 신선하게 베이크된 빵의 냉각후 시간 내 아밀로스 분획은 퇴화되어 네트워크를 전개한다. 이러한 과정은 낮은 정도의 견고성 및 개선된 슬라이싱 특성을 지닌 바람직한 빵 속 구조를 생성한다는 점에서 유익하다. 아밀로펙틴의 더욱 점진적인 결정화는 베이킹 후 날짜동안 젤라틴화된 전분 입자 내에서 발생한다. 이러한 과정에서 아밀로펙틴은 전분 입자가 함몰되는 아밀로스 네트워크를 강화시키는 것으로 판단된다. 이러한 강화는 빵 속의 증가된 견고성을 유도한다. 이러한 강화는 빵 부패의 주원인 중의 하나이다.
다수의 베이크 제품이 전분 재결정화(퇴화로도 불림)의 결과로 저장 동안 점진적으로 악화되고, 빵 속의 수분-보유 능력이 감각수용성 및 식이 상의 중요한 관련성으로 변화되는 것으로 알려져 있다. 빵 속은 연도 및 탄력성을 상실하고 딱딱하고 푸석푸석해진다. 빵 속 견고성의 증가는 빵의 부패 과정의 치수로 종종 이용된다.
아밀로펙틴의 해로운 퇴화의 속도는 아밀로펙틴의 측쇄 길이에 따라 달라진다. 따라서 예를 들어 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드로의 아밀로펙틴 측쇄의 효소적 가수분해는 그의 결정화 경향을 현저히 감소시킬 수 있다.
따라서 식품으로의 처리 즉, 빵으로의 베이킹 동안 또는 그 후의 어떠한 단계에서 첨가시 여기서 사용된 PS4 변이 폴리펩타이드의 이용은 퇴화를 지연시키거나 저해하거나 감소시킬 수 있다. 이러한 이용은 하기에 더욱 상세히 기술된다.
따라서 본 발명자는 본 명세서에 나타난 넌-말토제닉 엑소아밀라제의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 도입시키는 단계를 포함한, 반죽 제품의 부패, 바람직하게는 해로운 퇴화를 방지하기 위한 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성의 개선 방법을 기술한다.
퇴화(부패 포함)의 측정 분석방법
여기서 기술된 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 부패방지 효과를 조사하기 위해 빵 속 견고성은 베이킹 1일, 3일 및 7일 후 Instron 4301 Universal Food Texture Analyzer 또는 당분야에 알려진 유사한 장비에 의해 측정될 수 있다.
당분야에서 통상적으로 이용되고 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 전분 퇴화에 대한 효과를 조사하는 또다른 방법은 DSC(차별적 스캐닝 열량측정법)에 기반한다. 여기서 효소로 또는 효소 없이(대조군) 베이크된 모델 시스템 반죽으로부터의 빵 속 내 퇴화된 아밀로펙틴의 용융 엔탈피가 측정된다. 기술된 실시예에서 적용된 DSC 장비는 20∼95℃에서의 분 당 10℃의 온도 기울기로 작동되는 Mettler-Toledo DSC 820이다. 표본의 제조시 빵 속의 10∼20 mg이 측량되고 Mettler-Toledo 알루미늄 팬으로 옮겨진 후 밀폐하여 밀봉된다.
기술된 실시예에서 이용된 모델 시스템 반죽은 표준 밀가루 및 최적 함량의 넌-말토제닉 PS4 변이 엑소아밀라제를 지니거나 지니지 않는 물 또는 완충액을 포함한다. 이들은 각각 6 또는 7분간 10 또는 50 g Brabender Farinograph 내에서 혼합된다. 반죽 표본은 뚜껑이 있는 유리 시험관(15*0.8 cm)에 놓인다. 이들 시험관은 33℃에서의 30분 인큐베이션으로 시작된 후 분당 1.1℃의 기울기로 33℃부터 95℃까지 가열시켜 최종적으로는 95℃에서 인큐베이션되는 수조 내에서의 베이킹 공정 후 이 진행된다. 이후 시험관은 DSC 분석 전에 20℃에서 자동 온도 조절된다.
바람직한 실시태양에서 여기서 기술된 PS4 변이체는 대조군과 비교시 감소된 용융 엔탈피를 지닌다. 매우 바람직한 실시태양에서 PS4 변이체는 10% 이상의 감소된 용융 엔탈피를 지닌다. 바람직하게는 이들은 대조군과 비교시 20% 이상, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 감소된 용융 엔탈피를 지닌다.
Figure 112007000695933-pct00002
상기 표 2는 저장 7일 후 PSac-D34의 다른 용량으로 제조된 모델 반죽 시스템의 DSC 수치를 나타낸다. 0.5, 1 및 2 ppm(또는 그램 당 마이크로그램)의 밀가루가 시험된다.
전분 생성물의 제조
본 발명자는 식품 특히 전분 생성물의 제조시 PS4 변이 폴리펩타이드의 이용을 제공한다. 본 방법은 전분 매질에 PS4 변이 폴리펩타이드와 같은 넌-말토제닉 엑소아밀라제 효소를 첨가함으로서 전분 생성물을 형성하는 단계를 포함한다. 전분 매질이 반죽인 경우 반죽은 밀가루, 물, PS4 변이 폴리펩타이드인 넌-말토제닉 엑소아밀라제 및 선택적으로는 가능한 성분 및 첨가제를 함께 혼합함으로서 제조된다.
"전분"이라는 용어는 전분 그 자체 또는 그의 성분 특히 아밀로펙틴을 의미해야 한다. "전분 매질"이라는 용어는 전분을 포함한 어떠한 적당한 매질을 의미한다. "전분 생성물"이라는 용어는 전분을 포함하거나 이를 기반으로 하거나 이로부터 유래된 생성물을 의미한다. 바람직하게는 전분 생성물은 밀가루로부터 수득된 전분을 포함하거나 이를 기반으로 하거나 이로부터 유래된다. 여기서 사용된 "밀가루"라는 용어는 미세하게-분쇄된 밀 또는 다른 곡물 가루의 동의어이다. 그러나 바람직하게는 다른 곡물이 아닌 밀 자체로부터 수득된 가루를 의미한다. 따라서 특별히 표기하지 않는 한 여기서 사용된 "밀가루" 표기는 밀가루 자체뿐만 아니라 반죽과 같은 매질 내 존재하는 밀가루에 대한 표기를 의미한다.
바람직한 밀가루는 밀가루 또는 호밀 가루 또는 밀과 호밀 가루의 혼합물이다. 그러나 쌀, 옥수수, 보리 및 수수와 같은 다른 형태의 곡류로부터 유래된 가루를 포함한 반죽도 포함된다. 바람직하게는 전분 생성물은 베이커리 제품이다. 더욱 바람직하게는 전분 생성물은 빵 제품이다. 더욱 더 바람직하게는 전분 생성물은 베이크된 곡식 가루 빵 제품이다. "베이크된 곡식 가루 빵 제품"이라는 반죽 형성 조건 하에서 가루, 물 및 발효제를 혼합함으로서 수득 가능한 반죽에 기반한 베이크된 제품을 나타낸다. 또다른 성분도 물론 반죽 혼합물에 첨가될 수 있다.
따라서 전분 생성물이 베이크된 곡식 가루 빵 제품인 경우 본 공정은 반죽 형성 조건 하에서 밀가루, 물 및 발효제를 적당한 순서로 혼합하는 단계 및 선택적으로는 프리믹스(premix) 형태로 PS4 변이 폴리펩타이드를 첨가하는 단계를 포함한다. 발효제는 중탄산나트륨과 같은 화학적 발효제 또는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)(베이커 효모)의 어떠한 균주이다.
PS4 변이 넌-말토제닉 엑소아밀라제는 물을 포함한 반죽 성분 또는 반죽 성분 혼합물 또는 어떠한 첨가제 또는 어떠한 혼합물과도 함께 첨가될 수 있다. 반죽은 베이킹 산업 또는 밀가루 반죽 기반 제품의 어떠한 다른 제조 산업에서 일반적인 통상의 반죽 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.
밀 빵, 체질된 호밀 가루 및 밀가루로 제조된 빵, 롤 등과 같은 곡식 가루 빵 제품의 베이킹은 일반적으로 약 15∼60분간 180∼250℃의 온도 범위의 오븐에서 빵 반죽을 베이킹함으로서 달성된다. 베이킹 공정 동안 가파른 온도 기울기(200→120℃)는 베이크된 제품의 특징적 빵 껍질이 생성되는 외부 반죽층에 보급된다. 그러나 증기 생성으로 인한 가열 소모에 의해 빵 속 온도는 베이킹 공정의 종료시 단지 100℃에 가깝다.
따라서 본 발명자는 (a) 전분 매질을 제공하는 단계; (b) 본 명세서 내에 기술된 PS4 변이 폴리펩타이드를 전분 매질에 첨가하는 단계; 및 (c) 단계 (b) 동안 또는 그 후 전분 매질에 열을 가하여 빵 제품을 제조하는 단계를 포함한 빵 제품의 제조 방법을 기술한다. 또한 본 발명자는 여기서 기술된 PS4 변이 폴리펩타이드를 전분 매질에 첨가하는 단계를 포함한 빵 제품의 제조 방법을 기술한다.
넌-말토제닉 엑소아밀라제 PS4 변이 폴리펩타이드는 단독 활성 성분으로서의 효소 또는 하나 이상의 추가적인 반죽 성분 또는 반죽 첨가제를 지닌 혼합물을 포함한 액체 제제로서 또는 건조 밀가루 형태의 조성물로서 첨가될 수 있다.
개선 조성물
본 발명자는 빵 개선 조성물 및 반죽 개선 조성물을 포함한 개선제 조성물을 기술한다. 이들은 PS4 변이 폴리펩타이드, 선택적으로는 다른 성분 또는 다른 효소 또는 이 둘 모두를 포함한다.
또한 본 발명자는 베이킹 시 빵 및 반죽 개선 조성물의 이용을 제공한다. 또다른 관점에서 본 발명자는 빵 개선 조성물 또는 반죽 개선 조성물로부터 수득되는 베이크된 제품 또는 반죽을 제공한다. 또다른 관점에서 본 발명자는 빵 개선 조성물 또는 반죽 개선 조성물의 이용으로부터 수득되는 베이크된 제품 또는 반죽을 기술한다.
반죽 제조
반죽은 밀가루, 물, PS4 변이 폴리펩타이드(상기 기술된)를 포함한 반죽 개선 조성물 및 선택적으로는 다른 성분 및 첨가제를 혼합함으로서 제조된다.
반죽 개선 조성물은 밀가루, 물 또는 선택적인 다른 성분 또는 첨가제를 포함한 반죽과 함께 첨가될 수 있다. 반죽 개선 조성물은 밀가루 또는 물 또는 선택적인 다른 성분 또는 첨가제 이전에 첨가될 수 있다. 반죽은 베이킹 산업 또는 밀가루 반죽 기반 제품의 또다른 제조 산업에서 일반적인 통상의 반죽 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.
반죽 개선 조성물은 단독 활성 성분으로서의 조성물 또는 하나 이상의 추가적인 반죽 성분 또는 반죽 첨가제를 지닌 혼합물을 포함한 액체 제제로서 또는 건조 밀가루 형태의 조성물로서 첨가될 수 있다.
첨가되는 PS4 변이 폴리펩타이드 넌-말토제닉 엑소아밀라제의 함량은 일반적으로 밀가루 kg 당 50∼100,000 단위, 바람직하게는 밀가루 kg 당 100∼50,000 단위의 완성된 반죽의 존재를 유발하는 함량이다. 바람직하게는 본 함량은 밀가루 kg 당 200∼20,000 단위의 범위이다. 대안으로 PS4 변이 폴리펩타이드 넌-말토제닉 엑소아밀라제는 0.02∼50 ppm, 바람직하게는 0.2∼10 ppm의 효소 기반 밀가루의 완성된 반죽(밀가루 kg 당 0.02∼50 mg 효소)의 존재를 유발하는 함량으로 첨가된다.
본 문맥에서 넌-말토제닉 엑소아밀라제의 1 단위는 이하 기술된 바와 같이 50 mM MES, 2 mM 염화칼슘, pH 6.0 내의 10 mg/ml의 왁스성 옥수수 전분 4 ml를 포함한 시험관 내에서 50℃에서 인큐베이트시 분당 환원당 1 μmol과 동등한 가수분해 산물을 방출하는 효소 함량으로 정의된다.
여기서 기술된 반죽은 일반적으로 밀 거친 밀가루 또는 밀가루 및/또는 다른 형태의 거친 밀가루, 밀가루 또는 옥수수 밀가루, 옥수수 전분, 옥수수 가루, 쌀가루, 호밀 거친 가루, 호밀 가루, 귀리 가루, 귀리 거친 가루, 콩가루, 사탕수수 거친 가루, 사탕수수 가루, 감자 거친 가루, 감자 가루 또는 감자 전분과 같은 전분을 포함한다. 반죽은 신선하거나 동결되거나 부분-베이크된 것이다.
반죽은 발효된 반죽 또는 발효되는 반죽이다. 반죽은 화학적 발효제 즉, 중탄산나트륨을 첨가하거나 발효소를 첨가(반죽 발효)하는 것과 같은 다양한 방법으로 발효되나 사카로마이세스 세레비시에(베이커 효모) 배양액 즉 사카로마이세스 세레비시에의 통상적으로 이용 가능한 균주와 같은 적당한 효모 배양액을 첨가함으로서 반죽을 발효시키는 것이 바람직하다.
반죽은 입자화된 지방 또는 쇼트닝과 같은 지방을 포함한다. 반죽은 모노- 또는 디글리세라이드, 지방산의 당 에스테르, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 모노글리세라이드의 젖산 에스테르, 모노글리세라이드의 아세트산 에스테르, 폴리옥스에틸렌 스테아레이트 또는 리소레시틴과 같은 유화제를 더욱 포함한다.
또한 본 발명자는 여기서 기술된 조합과 함께 밀가루를 포함한 프리-믹스를 기술한다. 프리-믹스는 따른 반죽-개선 및/또는 빵-개선 첨가제 즉, 여기서 기술된 효소를 포함한 어떠한 첨가제를 포함한다.
또다른 반죽 첨가제 또는 성분
베이크된 제품의 특성을 더욱 개선시키고 베이크된 제품에 특정한 품질을 부가하기 위해 또다른 반죽 성분 및/또는 반죽 첨가제는 반죽 내에 포함된다. 일반적으로 이러한 추가로 첨가된 성분은 염, 곡물, 지방 및 오일, 당 또는 감미료, 식이 섬유, 우유 분말과 같은 단백질원, 글루텐 대두 또는 계란 및 유화제, 다른 효소, 하이드로콜로이드(hydrocolloid), 향미제, 산화제, 미네랄 및 비타민과 같은 반죽 첨가제를 포함한다.
유화제는 반죽 강화제 및 빵 속 연화제로서 유용하다. 반죽 강화제로서 유화제는 휴지 시간에 대한 내성 및 가공보강 동안의 충격에 대한 내성을 제공한다. 더욱이 반죽 강화제는 발효 시간에서의 변화에 대한 제공된 반죽 내성을 개선시킬 것이다. 또한 대부분의 반죽 강화제는 가공보강된 제품에서부터 베이크된 제품까지의 부피 내 증가를 의미하는 오븐 스프링(oven spring)을 개선시킨다. 최종적으로는 반죽 강화제는 조리법 혼합물 내에 존재하는 어떠한 지방도 유화시킬 것이다.
적당한 유화제는 레시틴, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 식용 지방산의 모노- 및 디글리세라이드, 식용 지방산의 모노- 및 디글리세라이드의 아세트산 에스테르, 식용 지방산의 모노- 및 디글리세라이드의 젖산 에스테르, 식용 지방산의 모노- 및 디글리세라이드의 구연산 에스테르, 식용 지방산의 모노- 및 디글리세라이드의 다아세틸 타르타르산 에스테르, 식용 지방산의 슈크로스 에스테르, 소듐 스테아로일-2-락틸레이트 및 칼슘 스테아로일-2-락틸레이트를 포함한다.
또다른 반죽 첨가제 또는 성분은 밀가루, 물 또는 선택적인 다른 성분 또는 첨가제 또는 반죽 개선 조성물을 포함한 어떠한 반죽 성분과도 함께 첨가될 수 있다. 또다른 반죽 첨가제 또는 성분은 밀가루, 물, 선택적인 다른 성분 및 첨가제 또는 반죽 개선 조성물 이전에 첨가될 수 있다. 또다른 반죽 첨가제 또는 성분은 밀가루, 물, 선택적인 다른 성분 및 첨가제 또는 반죽 개선 조성물 이후에 첨가될 수 있다.
또다른 반죽 첨가제 또는 성분은 편리하게는 액체 제제이다. 그러나 또다른 반죽 첨가제 또는 성분은 편리하게는 건조 조성물 형태이다.
바람직하게는 또다른 반죽 첨가제 또는 성분은 반죽의 밀가루 성분의 적어도 1% 중량% 이상이다. 더욱 바람직하게는 또다른 반죽 첨가제 또는 성분은 적어도 2% 이상, 바람직하게는 적어도 3% 이상, 바람직하게는 4% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 바람직하게는 6% 이상이다. 첨가제가 지방인 경우 일반적으로 지방은 1∼5%, 일반적으로는 1∼3%, 더욱 일반적으로는 약 2%의 함량으로 존재한다.
또다른 효소
PS4 변이 폴리펩타이드에 더하여 하나 이상의 또다른 효소가 식품, 반죽 제제, 식료품 또는 전분 조성물에 첨가되는 것과 같이 이용된다.
반죽에 첨가되는 또다른 효소는 산화환원효소, 리파제 및 에스테라제와 같은 가수분해효소뿐만 아니라 글리코시다제 유사 α-아밀라제, 풀룰라나제 및 자일라나제를 포함한다. 글루코스 산화효소 및 헥소오스 산화효소와 같은 산화환원효소는 베이크된 제품 부피의 반죽 강화 및 조절을 위해 이용될 수 있고 자일라나제 및 다른 헤미셀룰로스는 반죽 조작 특성, 빵 속 연도 및 빵 부피를 개선시키기 위해 첨가된다. 리파제는 반죽 강화제 및 빵 속 연화제로서 유용하고 α-아밀라제 및 다른 아밀로스분해 효소는 반죽 내에 포함되어 빵 부피를 조절하고 빵 속 견고성을 더욱 감소시킨다.
이용되는 또다른 효소는 셀룰라나제, 헤미셀룰라나제, 전분 분해 효소, 프로테아제, 리폭시게나제로 구성된 군으로부터 선택된다.
유용한 산화환원효소의 예는 말토오스 산화 효소, 글루코스 산화효소(EC 1.1.3.4), 탄수화물 산화효소, 글리세롤 산화효소, 피라노스 산화효소, 갈락토스 산화효소(EC 1.1.3.10) 및 헥소오스 산화효소(EC 1.1.3.5)를 포함한다.
전분 분해 효소 중 아밀라제는 반죽 개선 첨가제로서 특히 유용하다. α-아밀라제는 전분을 β-아밀라제에 의해 말토오스로 더욱 분해되는 덱스트린으로 분해한다. 반죽 조성물에 첨가되는 다른 유용한 전분 분해 효소는 글루코아말라제 및 풀룰라나제를 포함한다.
바람직하게는 또다른 효소는 적어도 하나 이상의 자일라나제 및/또는 적어도 하나 이상의 아밀라제이다. 여기서 사용된 "자일라나제"라는 용어는 자일로스 결합을 가수분해하는 자일라나제(EC 3.2.1.32)를 나타낸다.
여기서 사용된 "아밀라제"라는 용어는 α-아밀라제(EC 3.2.1.1), β-아밀라제(EC 3.2.1.2) 및 γ-아밀라제(EC 3.2.1.3)와 같은 아밀라제를 나타낸다.
또다른 효소는 밀가루, 물 또는 선택적인 다른 성분 또는 첨가제 또는 반죽 개선 조성물을 포함한 어떠한 반죽 성분과도 함께 첨가될 수 있다. 또다른 효소는 밀가루, 물, 선택적인 다른 성분 및 첨가제 또는 반죽 개선 조성물 이전에 첨가될 수 있다. 또다른 효소는 편리하게는 액체 제제이다. 그러나 조성물은 편리하게는 건조 조성물 형태이다.
반죽 개선 조성물의 일부 효소는 밀가루 반죽 및/또는 본 효소에 의해 반죽으로부터 제조된 많은 제품의 유동학적 및/또는 기계능 특성 상의 개선이 부가적일 뿐만 아니라 상승 작용적인 정도의 반죽 조건 하에서 서로 상호작용하는 것이 가능하다.
반죽으로부터 제조된 제품(완성 제품)의 개선과 관련하여 조합이 빵 속 구조와 관련한 실질적인 상승 효과를 유발하는 것으로 발견된다. 또한 베이크된 제품의 비용적과 관련하여 상승 효과가 발견된다.
또다른 효소는 카르복실 에스테르 결합을 가수분해하여 탄수화물을 방출시키는 것이 가능한 리파제(EC 3.1.1)이다. 리파제의 예는 트리트리글리세라이드 리파제 활성(E.C. 3.1.1.3), 갈락토리파제(EC 3.1.1.26), 포스포리파제 Al EC 3.1.1.32), 포스포리파제 A2(EC 3.1.1.4) 및 리포단백질 리파제 A2 (EC 3.1.1.34)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
다른 용도
PS4 변이체는 말토오스 및 높은 말토오스 시럽의 제조에 적당하다. 이러한 생성물은 말토오스의 낮은 흡습성, 낮은 점도, 우수한 열 안정성 및 연하나 너무 달지 않은 미감으로 인해 특정 과자의 제조시 매우 중요하다. 말토오스 시럽의 산업적 제조 방법은 전분의 액화후 말토오스 제조 효소로의 당화 및 알파-1.6-아밀로글루코시다제의 경우 선택적으로는 아밀로펙틴 내 1.6-분지 포인트를 분열하는 효소를 포함한다.
여기서 기술된 PS4 변이체가 첨가되어 세제 조성물의 성분이 된다. 세제 조성물은 예를 들어 염색 직물의 전처리에 적당한 세탁 첨가 조성물 및 린스 첨가 직물 유연제 조성물을 포함한 손세탁 또는 기계세탁 세제 조성물로 포뮬레이트되거나 일반적인 주택의 견고한 표면 청소 작업에 사용되는 세제 조성물로 포뮤레이트되거나 손세척 또는 기계세척 설거지 작업용으로 포뮬레이트된다. 특정한 관점에서 본 발명자는 PS4 변이체를 포함한 세제 첨가제를 기술한다. 세제 조성물뿐만 아니라 세제 첨가제도 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 카르보하이드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 만나나제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 산화효소 즉 락카제 및 과산화효소와 같은 하나 이상의 다른 효소를 포함한다. 일반적으로 선택된 효소(들)의 특성은 선택된 세제에 적합해야 하고(즉, pH-최적조건, 다른 효소 및 비-효소 성분과의 적합성), 효소(들)는 유효량으로 존재하여야 한다.
또는 PS4 변이체는 특히 pH 7 이상에서 펄프 재생이 발생하고 아밀라제가 강화 전분의 분해를 통해 폐기물의 분해를 촉진시킬 수 있는 전분 강화 폐지 및 판지로부터의 펄프, 종이 및 판지와 같은 목질섬유소 물질의 제조에 이용된다. PS4 변이체는 특히 전분-코팅된 인쇄 종이로부터의 제지 펄프의 제조 공정에 유용하다. 본 공정은 하기 단계: a) 종이를 분해하여 펄프를 생성하는 단계, b) 단계 a) 전, 그 동안 또는 그 후 전분-분해 효소로 처리하는 단계, 및 c) 단계 a) 및 b) 이후 펄프로부터 잉크 입자를 분리하는 단계를 포함하고 WO 95/14807에 기술된 바와 같이 수행된다. 또한 PS4 변이체는 효소적으로 변형된 전분이 탄산칼슘, 카올린 및 점토와 같은 알칼리성 충전재와 함께 제지에 이용되는 전분 변형에 매우 유용하다. 여기서 기술된 PS4 변이체로 충전재의 존재 하에 전분을 변형시켜 더욱 간단한 일괄 공정을 가능하게 할 수 있게 된다. 또한 PS4 변이체는 직물 발호(desizing)에 매우 유용하다. 직물 처리 산업에서 아밀라제는 통상적으로 발호 공정에 보조제로 이용되어 직조 동안 직물 방사 상의 보호 코팅으로 작용하는 전분-함유 사이즈(size)의 제거를 촉진시킨다. 직조 후 사이즈 코팅의 완전한 제거는 직물이 세탁되고 표백되고 염색되는 이후의 공정에서 최적 결과를 보증하기 위해 중요하다. 효소적 전분 분해는 섬유 물질 상에 어떠한 해로운 효과를 포함하지 않기 때문에 바람직하다. PS4 변이체는 셀룰로스-함유 직물 또는 섬유의 발호시 단독으로 또는 셀룰로스와 결합하여 이용된다.
또한 PS4 변이체는 일반적으로 3가지 연속 효소적 공정 즉, 액화 공정, 당화 공정 및 이성화 공정으로 구성된 전분의 프럭토스 시럽으로의 전환을 위한 전분 A "통상적" 공정으로부터 감미료의 제조에 선택된 아밀라제이다. 액화 공정동안 전분은 5.5와 6.2 사이의 pH 수치 및 95∼160℃의 온도에서 약 2시간 동안 아밀라제에 의해 덱스트린으로 분해된다. 이들 조건 하에서 최적 효소 안정성을 확보하기 위해 1 mM의 칼슘이 첨가된다(40 ppm 자유 칼슘 이온). 액화 공정 후 덱스트린은 글루코아밀라제 및 이소아밀라제 또는 풀룰라나제와 같은 탈분지(debranching)효소의 첨가에 의해 덱스트로스로 전환된다. 이러한 단계 전에 고온(95℃ 이상)을 유지하면서 pH는 4.5 이하의 수치로 감소되고, 액화 아밀라제 활성은 변성된다. 온도는 60℃로 감소되고 글루코아밀라제 및 탈분지효소가 첨가된다. 당화 공정은 24∼72시간 동안 진행된다.
사료 적용
하나의 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 저항성 전분을 분해하는 것이 가능하다.
여기서 사용된 "분해"라는 용어는 저항성 전분의 글루코스 및/또는 올리고당 - 말토오스 및/또는 덱스트린과 같은 -으로의 부분적 또는 완전한 가수분해 또는 분해에 관한 것이다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 동물 아밀라제에 의해 완전히 분해되지 않은 잔여 저항성 전분을 분해한다. 예로서 PS4 변이 폴리펩타이드는 저항성 전분 분해의 개선시 동물의 아밀라제(즉, 췌장 아밀라제)를 돕는데 이용된다. 췌장 α-아밀라제는 사료 내 전분을 분해한다. 그러나 일부의 전분인 저항성 전분은 췌장 α-아밀라제에 의해 충분히 분해되지 않고 따라서 소장 내에서 흡수되지 않는다(저항성 전분의 정의 참조). 일부의 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩타이드는 소화계 내에서의 전분 분해시 췌장 α-아밀라제를 원조할 수 있어서 동물에 의한 전분 이용을 증가시킨다.
저항성 전분을 분해시키는 효소의 능력은 예를 들어 표본의 저항성 전분, 용해 전분 및 총 전분 함량을 측정하기 위한 Megazyme International Ireland Ltd.에 의해 개발되고 개시된 방법으로 분석된다(Resistant Starch Assay Procedure, AOAC Method 2002.02, AACC Method 32-40).
따라서 PS4 변이 폴리펩타이드는 유익한 목적으로 동물에 의해 소화되고 따라서 동물 사료 내에 포함된다.
따라서 본 발명자는 PS4 변이 폴리펩타이드가 저항성 전분을 분해하는 것이 가능한, 전분을 포함한 사료에 사용하거나 사료 개선 조성물에 사용하기 위한 성분으로서 PS4 변이 폴리펩타이드의 이용을 개시한다. 또한 본 발명자는 상기 저항성 전분을 PS4 변이 폴리펩타이드에 접촉시키는 단계를 포함한 사료 내 저항성 전분의 분해 방법을 개시한다.
또한 본 발명자는 저항성 전분을 분해하기 위한 전분을 포함한 사료의 제조시 PS4 변이 폴리펩타이드의 이용을 기술한다. 더욱이 본 발명자는 상기 사료의 열량 수치를 개선시키기 위한 사료의 제조시 PS4 변이 폴리펩타이드의 이용을 개시한다. 본 발명자는 동물 활동도를 개선시키기 위한 사료의 제조시 효소의 이용을 개시한다. 또다른 실시태양에서 본 발명자는 전분과 PS4 변이 폴리펩타이드 효소를 혼합하는 단계를 포함한 사료 제조 방법을 개시한다.
예로서 저항성 전분을 분해하는 것이 가능한 PS4 변이 폴리펩타이드를 포함한 성분의 이용은 동물 내 전분 및/또는 전분 분해 산물의 분해의 현저한 증가가 존재하기 때문에 유리하다. 더욱이 이러한 이용은 동물에 의한 전분 및/또는 전분 분해 산물의 소화력의 현저한 증가가 존재하기 때문에 유리하다. 더욱이 이러한 이용은 동물에 의한 사료로부터의 에너지 유도 효율을 증가시키는 수단을 제공하기 때문에 유리하다. 더욱이 이러한 이용은 저항성 전분의 생체 이용율을 증가시키는 수단을 제공하기 때문에 유리하다.
동물 사료
PS4 변이 폴리펩타이드가 이용에 적당한 동물 사료는 특정 동물군의 특정한 요구에 부합하고 동물에 의해 대사될 수 있는 형태로 필수적인 탄수화물, 지방, 단백질 및 다른 영양소를 제공하도록 포뮬레이트된다.
바람직하게는 동물 사료는 돼지 또는 가금류용 사료이다.
여기서 사용된 "돼지"라는 용어는 새끼 돼지(pig), 사육 돼지(hog) 또는 수퇘지와 같은 비-반추 잡식성 동물을 나타낸다. 일반적으로 돼지 사료는 약 50% 탄수화물, 약 20% 단백질 및 약 5% 지방을 포함한다. 고에너지 돼지 사료의 예는 단백질, 미네랄, 비타민 및 리신 및 트립토판과 같은 아미노산과 같은 사료 보충물과 조합된 옥수수에 기반한다. 돼지 사료의 예는 천연 향미제, 인공 향미제, 미량 및 대량 광물질, 동물성 지방, 식물성 지방, 비타민, 방부제 또는 항생제와 같은 약물을 더욱 포함하는 동물 단백질 제품, 해양 제품, 유제품, 곡물 제품 및 식물 단백질 제품을 포함한다.
수반된 청구항을 포함한 본 명세서에서 '돼지 사료'에 관하여 이루어진 표기에 있어서 이러한 표기는 "변환" 또는 "출발" 사료(어린 돼지에 사용되는) 및 "완성" 또는 "성장" 사료(시장에 적당한 연령 및/또는 크기로의 돼지의 성장 변환 단계 후 사용되는)를 포함하게 되는 것으로 이해된다.
여기서 사용된 '가금류'라는 용어는 닭, 영계, 암탉, 수탉, 식용 수탉, 칠면조, 오리, 투계, 암평아리 또는 병아리와 같은 가름류에 관한 것이다. 가금류 사료는 모든 단백질, 에너지원, 비타민, 미네랄 및 적당한 생장, 산란 및 조류 건강에 필수적인 다른 영양소를 포함하기 때문에 "완전한" 사료를 나타낸다. 그러나 가금류 사료는 비타민, 미네랄 또는 항콕시듐제(coccidiostat)(예를 들어 모넨신 나트륨, 라실로시드(Lasalocid), 암프롤륨(Amprolium), 살리노마이신(Salinomycin) 및 술파퀴녹살린(Sulfaquinoxaline)과 같은) 및/또는 항생제(예를 들어 페니실린, 바시트라신(Bacitracin), 클롤테트라사이클린(Chlortetracycline) 및 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline)과 같은)와 같은 약물을 더욱 포함한다.
육류 생산을 위해 가둬둔 어린 닭 또는 영계, 칠면조 및 오리는 산란용으로 비축된 암평아리로부터 차별적으로 사육되었다. 영계, 오리 및 칠면조는 산란 타입의 닭보다 더 큰 몸통을 지니고 더 빠르게 체중이 증가한다. 따라서 이들 조류는 더 높은 단백질 및 에너지 수준을 지닌 식이로 사육된다.
수반된 청구항을 포함한 본 명세서에서 '돼지 사료'에 관하여 이루어진 표기에 있어서 이러한 표기는 "출발" 사료(부화-후),"완성", "성장" 또는 "발달" 사료(도살 크기에 도달할 때까지 6∼8주령) 및 "레이어(layer)" 사료(산란동안)를 포함하게 되는 것으로 이해된다.
동물 사료는 예를 들어 육류 생산, 우유 생산, 산란, 번식 및 스트레스 반응 등에 관한 동물의 영양적 요구와 부합되도록 포뮬레이트된다. 더욱이 동물 사료는 비료 품질을 개선시키도록 포뮬레이트된다.
바람직한 관점에서 동물 사료는 완두콩 또는 대두와 같은 콩류 또는 밀, 옥수수, 호밀 또는 보리와 같은 곡물 등의 비가공 물질을 포함한다. 적당하게는 비가공 물질은 감자이다.
사료 물질
PS4 변이 폴리펩타이드는 단독으로 또는 식품 성분과 같은 다른 성분과 조합되어 사료에 간접적 또는 직접적인 PS4 변이 폴리펩타이드의 적용에 의해 동물 소비용 사료에 이용된다.
일반적인 식품 성분은 동물성 또는 식물성 지방, 천연 또는 합성 조미료, 항산화제, 점도 변형제, 필수 오일 및/또는 향미제, 염로 및/또는 착색제, 비타민, 미네랄 및또는 비-천연 아미노산, 영양제, 또다른 효소(유전적으로 조작된 효소 포함), 구아 검 또는 크산텀 검과 같은 결합제, 완충액, 유화제, 윤활제, 보조제, 현탁제, 방부제, 코팅제 또는 용해제 등을 포함한다.
적용 방법의 예는 PS4 변이 폴리펩타이드를 포함한 물질 내에서 사료를 코팅시키는 것, PS4 변이 폴리펩타이드를 사료와 혼합시키거나 PS4 변이 폴리펩타이드를 사료 표면에 스프레이하거나 PS4 변이 폴리펩타이드의 제제에 사료를 디핑(dipping)시키는 직접적인 적용을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
바람직하게는 PS4 변이 폴리펩타이드는 이를 사료와 혼합시키거나 동물 소비용 사료 입자 상에 스프레이시킴으로서 적용된다. 대안으로 PS4 변이 폴리펩타이드는 주입 또는 텀블링(tumbling)에 의해 사료의 에멀젼 내 또는 고형 생성물의 내부에 포함된다.
PS4 변이 폴리펩타이드는 사료를 산재시키거나 코팅시키거나 포화시키는데 적용된다. 다른 성분과의 혼합물도 사용되고 개별적으로 또는 동시에 또는 연속적으로 적용된다. 킬레이트제, 결합제, 유화제 및 미량 및 대량 미네랄, 아미노산, 비타민, 동물성 지방, 식물성 지방, 방부제, 향미제, 착색제와 같은 다른 첨가제는 사료에 동시에 적용되거나 연속적으로 적용된다.
PS4 변이 폴리펩타이드의 함량
사용되는 PS4 변이 폴리펩타이드의 최적 함량은 처리되는 사료 및/또는 사료를 PS4 변이 폴리펩타이드에 접촉시키는 방법 및/또는 이들의 의도된 용도에 따라 달라질 것이다. PS4 변이 폴리펩타이드의 함량은 사료의 섭취 후 및 소화 동안 저항성 전분을 실질적으로 분해하는데 효과적인 충분한 함량이어야 한다.
유리하게는 사료의 완전한 소화가 수득될 때 즉, 사료의 증가된 열량 수치가 방출될 때까지 PS4 변이 폴리펩타이드는 동물 소비용 사료의 섭취 및 사료의 소화 동안 효과적으로 잔존해야 한다.
아밀라제 화합물
본 발명자는 PS4 변이 폴리펩타이드와 아밀라제, 특히 말토제닉 아밀라제의 조합을 개시한다. 말토제닉 알파-아밀라제(글루칸 1,4-a-말토테트라하이드롤라제, E.C. 3.2.1.133)는 알파-형상으로 아밀로스와 아밀로펙틴을 말토오스로 가수분해시킬 수 있다.
바실러스(Bacillus) 유래의 말토제닉 알파-아밀라제(EP 120 693)는 Novamyl(Novo Nordisk A/S, 덴마크)의 상품명으로 통상적으로 이용 가능하고 전분의 퇴화를 감소시키는 그의 능력으로 인해 부패-방지제로서 베이킹 산업에 광범위하게 이용된다. Novamyl은 국제특허공보 WO 91/04660에 상세히 기술되어 있다. 말토제닉 알파-아밀라제 Novamyl은 서열 상동성(Henrissat B, Bairoch A; Biochem. J., 316, 695-696 (1996)) 및 글리코실전이반응(transglycosylation) 생성물(Christophersen, C, et al., 1997, Starch, vol. 50, No. 1, 39-45)을 포함한 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제(CGT아제)와 일부의 특성을 공유한다.
매우 바람직한 실시태양에서 본 발명자는 Novamyl 또는 그의 변이체와 함께 PS4 변이 폴리펩타이드를 포함한 화합물을 개시한다. 이러한 화합물은 베이킹과 같은 식품 제조에 유용하다. Novamyl은 특히 Novamyl 1500 MG를 포함한다.
Novamyl 및 그의 용도를 기술한 다른 문헌은 Christophersen, C, 1545 Pedersen, S., and Christensen, T., (1993) Method for production of maltose an a limit dextrin, the limit dextrin, and use of the limit dextrin. Denmark 및 WO 95/10627을 포함한다. 이들 각각의 문헌은 참고문헌으로 포함되고 이에 기술된 Novamyl 폴리펩타이드는 여기서 기술된 PS4 변이 폴리펩타이드와 조합하여 사용된다.
Novamyl의 변이체, 상동체 및 돌연변이체는 알파 아밀라제 활성을 보유한다는 조건으로 화합물에 이용된다. 예를 들어 참고문헌에 포함된 미국 특허 제6,162,628호에 개시된 Novamyl 변이체는 여기서 기술된 PS4 변이 폴리펩타이드와 조합하여 사용된다. 특히 본 출원서 내에 기술된 폴리펩타이드, 상세하게는 Q13, I16, D17, N26, N28, P29, A30, S32, Y33, G34, L35, K40, M45, P73, V74, D76 N77, D79, N86, R95, N99, I100, H103, Q119, N120, N131, S141, T142, A148, N152, A163, H169, N171, Gl72, I174, N176, N187, F188, A192, Q201, N203, H220, N234, G236, Q247, K249, D261, N266, L268, R272, N275, N276, V279, N280, V281, D285, N287, F297, Q299, N305, K316, N320, L321, N327, A341, N342, A348, Q365, N371, N375, M378, G397, A381, F389, N401, A403, K425, N436, S442, N454, N468, N474, S479, A483, A486, V487, S493, T494, S495, A496, S497, A498, Q500, N507, I510, N513, K520, Q526, A555, A564, S573, N575, Q581, S583, F586, K589, N595, G618, N621, Q624, A629, F636, K645, N664 및/또는 T681에 상응하는 하나 이상의 위치에서 미국 특허 제6,162,628의 서열번호: 1의 변이체가 이용된다.
아미노산 서열
본 발명은 PS4 변이 핵산을 이용하고 이러한 PS4 변이 핵산의 아미노산 서열은 여기서 기술된 방법 및 조성물에 포함된다.
여기서 사용된 "아미노산 서열"이라는 용어는 "폴리펩타이드" 및/또는 "단백질"이라는 용어와 동의어이다. 일부의 경우 "아미노산 서열"이라는 용어는 "펩타이드"라는 용어와 동의어이다. 일부의 경우 "아미노산 서열"은 "효소"라는 용어와 동의어이다.
아미노산 서열은 적당한 원료로부터 제조/분리되거나 합성적으로 제조되거나 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된다.
여기서 기술된 PS4 변이 효소는 다른 효소와 결합되어 이용된다. 따라서 본 발명자는 여기서 기술된 PS4 변이 폴리펩타이드 및 그 자체가 또다른 PS4 변이 폴리펩타이드 효소인 또다른 효소를 포함하는 효소의 조합을 개시한다.
PS4 변이 뉴클레오타이드 서열
상기 주지된 바와 같이 본 발명자는 여기서 기술된 특정한 성질을 지닌 PS4 변이 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열을 개시한다.
여기서 사용된 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체이다(그의 일부와 같은). 뉴클레오타이드 서열은 센스 또는 안티센스 스트랜스를 나타내는 이중-스트랜드 또는 단일-스트랜드인 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원이다.
본 출원서에서 사용된 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 RNA를 포함한다. 바람직하게는 이는 DNA, 더욱 바람직하게는 PS4 변이 폴리펩타이드를 코드하는 cDNA 서열을 의미한다.
일반적으로 PS4 변이 뉴클레오타이드 서열은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된다(즉, 재조합 DNA). 그러나 대안적 실시태양에서 뉴클레오타이드 서열은 당분야에 잘 알려진 화학적 방법을 이용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다(Caruthers MH et al(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 및 Horn T et al(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232 참조).
핵산 서열의 제조
여기서 한정된 특정 성질을 지닌 효소(즉, PS4 변이 폴리펩타이드) 또는 모효소와 같은 변형에 적당한 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 효소를 생성하는 세포 또는 생물체로부터 확인되고/또는 분리되고/또는 정제된다. 뉴클레오타이드 서열의 확인 및/또는 분리 및/또는 정제를 위한 다양한 방법이 당분야에 잘 알려져 있다. 예로서 적당한 서열이 확인되고/또는 분리되고/또는 정제되면 많은 서열을 제조하는 PCR 증폭 기술이 이용된다.
또다른 예로서 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리는 효소를 생성하는 생물체로부터의 염색체 DNA 또는 메신저 RNA를 이용하여 구축된다. 효소의 아미노산 서열 또는 효소의 아미노산 서열의 일부가 알려진 경우 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브가 합성되고 생물체로부터 제조된 게놈 라이브러리로부터 효소-인코딩 클론을 확인하는데 이용된다. 대안으로 또다른 알려진 효소 유전자에 상동적인 서열을 포함한 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 효소-인코딩 클론을 확인하는데 이용될 수 있다. 후자의 경우 낮은 스트린전시의 하이브리디제이션 및 세척 조건이 이용된다.
대안으로, 효소-인코딩 클론은 게놈 DNA의 단편을 플라스미드와 같은 발현 벡터 내에 삽입하고, 수득된 게놈 DNA로 효소-음성 박테리아를 형질전환시킨 후 형질전환된 박테리아를 효소에 대한 기질(즉, 말토오스)을 포함한 한천 플레이트에 도말하여 효소를 발현하는 클론이 확인되게 함으로서 확인될 수 있다.
또다른 대안으로 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열은 수립된 표준 방법 즉, Beucage S.L. et al(1981) Tetrahedron Letters 22, p1859-1869에 의해 기술된 포스포로아미디트(phosphoroamidite) 방법 또는 Matthes et al(1984) EMBO J. 3, p801-805에 의해 기술된 방법에 의해 합성적으로 제조된다. 포스포로아미디트 방법에서 올리고뉴클레오타이드가 합성된다 즉, 자동 DNA 합성기에서 정제되고, 어닐되고, 라이게이트되고 적당한 벡터 내에서 클론된다.
뉴클레오타이드 서열은 표준 기술에 따라 합성, 게놈 또는 cDNA 기원(적당한)의 단편을 라이게이트함으로서 제조된, 혼합된 게놈 및 합성 기원, 혼합된 합성 및 cDNA 기원 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원이다. 각각의 라이게이트된 단편은 전체 뉴클레오타이드 서열의 다양한 부분에 상응한다. 또한 DNA 서열은 예를 들어 미국특허 제4,683,202호 또는 Saiki R K et al(Science(1988) 239, pp487-491)에 기술된 바와 같이 특정 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조된다.
변이체/상동체/유도체
또한 본 발명자는 PS4 변이 폴리펩타이드 또는 PS4 변이 핵산과 같이 효소의 아미노산 서열 또는 이러한 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체 및 유도체의 이용을 기술한다. 문맥상 다른 경우를 나타내지 않는 한 "PS4 변이 핵산"이라는 용어는 하기 기술된 핵산 실재 각각을 포함해야 하고, 유사하게는 "PS4 변이 폴리펩타이드"라는 용어는 하기 기술된 폴리펩타이드 또는 아미노산 각각을 포함해야 한다.
여기서 "상동체"라는 용어는 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열과 특정한 상동성을 지닌 실재를 의미한다. 여기서 "상동성"이라는 용어는 "동일성"과 동등하다.
이러한 정황하에서 상동적 아미노산 서열은 피험 서열에 대해 적어도 92% 이상, 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로 상동체는 피험 아미노산 서열과 동일한 활성 사이트를 포함할 것이다. 상동성이 유사성(즉, 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성/기능을 지님)의 표현으로 고려될 수 있더라도 본 출원서의 정황하에서 서열 동일성의 표현으로 표시되는 것이 바람직하다.
이러한 정황하에서 상동적 뉴클레오타이드 서열은 PS4 변이 폴리펩타이드 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 75, 80, 85 또는 90% 이상, 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일반적으로 상동체는 활성 사이트를 코드하는 피험 서열과 동일한 서열을 포함할 것이다. 상동성이 유사성의 표현으로 고려될 수 있더라도 본 명세서의 정황하에서 서열 동일성의 표현으로 표시되는 것이 바람직하다.
상동성 비교는 눈으로 또는 더욱 일반적으로는 용이하게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 수단으로 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 2 이상의 서열 사이의 % 상동성을 계산할 수 있다.
% 상동성은 인접 서열에 대해 계산되고 즉, 하나의 서열은 다른 서열과 정렬되고 하나의 서열 내의 각각의 아미노산은 한번에 하나의 잔기씩 다른 서열 내의 상응하는 아미노산과 직접 비교된다. 이는 "언갭된(ungapped)" 정렬로 명명된다. 일반적으로 이러한 언갭된 정렬은 매우 적은 수의 잔기에 대해서만 수행된다.
이는 매우 단순하고 일관성 있는 방법이나 예를 들어 서열의 동일한 쌍 내에서 하나의 삽입 또는 삭제가 하기 아미노산 잔기를 정렬로부터 제거되게 하고, 따라서 전체 정렬이 수행될 때 % 상동성의 큰 감소를 잠재적으로 유발할 것임이 고려되지 못한다. 따라서 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 득점에 부당하게 패널티를 과하지 않고 가능한 삽입 및 삭제를 고려하도록 최적 정렬을 고안된다. 이는 국부적 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬 내 "갭"을 삽입함으로서 달성된다.
그러나 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬 내에 발생하는 각 갭에 "갭 패널티"를 할당하여 동일한 수의 아미노산의 경우 가능한 적은 갭을 지닌 서열 정렬이 - 2개의 비교 서열 사이의 더 높은 관련성을 반영하는 - 많은 갭을 지닌 것보다 더 높은 득점을 달성할 것이다. "친화성 갭 코스트(Affine gap cost)"는 일반적으로 갭의 존재에 대해 매우 높은 코스트 및 갭 내 각각의 하위 잔기에 대한 적은 패널티를 부과하는데 사용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 득점 시스템이다. 무론 높은 갭 패널티는 적은 갭으로 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형되는 것을 가능하게 한다. 그러나 서열 비교에 이러한 소프트웨어를 이용시 디폴트 수치를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Bestfit package를 이용시 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭에 대해 -12이고 각 확장(extension)에 대해 -4이다.
따라서 최대 % 상동성의 계산은 먼저 갭 패널티를 고려하여 최적 정렬의 생성을 요구한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit package(Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST package(Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18 참조), FASTA(Altschul et al, 1990 J MoI. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS suite of comparison tools을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. BLAST 및 FASTA 모두 오프라인 및 온라인 검색으로 이용 가능하다(Ausubel et ah, 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 내지 7-60 참조).
그러나 일부의 적용에 있어서 GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequence로 명명된 새로운 기구도 단백질 및 뉴클레오타이드 서열을 비교하는데 이용 가능하다(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조).
최종 % 상동성이 동일성의 측면에서 측정될 수 있더라도 정렬 과정 그 자체는 일반적으로 전부-또는-전무(all-or-nothing) 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신에 일반적으로 눈금이 있는 유사성 득점 매트릭스가 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반하여 각각의 이원비교(pairwise comparison)에 점수를 할당하는데 이용된다. 일반적으로 이용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다 - 프로그램 BLAST 한 벌에 대한 디폴트 매트릭스. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 수치 또는 공급되는 경우 맞춤 기호 비교를 이용한다(또다른 상세한 설명은 사용자 설명서 참조). 일부 적용을 위해 GCG 팩키지의 경우 공개 디폴트 수치를 이용하고, 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다.
대안으로, 백분율 상동성은 CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988), Gene 73(1), 237-244)와 유사한 알고리즘에 기반하여 DNASISTM(Hitachi Software) 내의 다수의 정렬 특징을 이용하여 계산된다.
소프트웨어가 최적 정렬을 생성하면 % 상동성, 바람직하게는 % 서열 동일성을 계산하는 것이 가능하다. 일반적으로 소프트웨어는 서열 비교의 일부로서 이를 수행하고 수적인 결과를 생성한다.
또한 서열은 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 물질을 유발하는 아미노산 잔기의 삭제, 삽입 또는 치환을 지닌다. 계획적인 아미노산 치환은 아미노산 특성 내의 유사성(잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성)에 기반하여 이루어지고, 따라서 기능적인 그룹에 아미노산을 함께 분류하는 것이 유용하다. 아미노산은 그의 측쇄 단독의 특성에 기반하여 함께 분류될 수있다. 그러나 돌연변이 데이터를 포함시키는 것이 유용하다. 이렇게 유래된 아미노산 세트는 구조적 원인으로 인해 보존되게 된다. 이들 세트는 벤다이어그램(Livingstone CD. and Barton GJ. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput.Appl Biosci. 9: 745-756)(Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J.Theor.Biol. 119; 205-218)의 형태로 기술될 수 있다. 보존적 치환은 예를 들어 일반적으로 수용되는 아미노산의 벤다이어그램 분류를 기술한 하기 표에 따라 이루어진다.
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또한 본 발명자는 발생하는 상동적 치환(치환 및 교체는 모두 여기서 현존하는 아미노산 잔기와 대안적 잔기의 상호교환을 의미하는데 사용됨) 즉, 염기성에 대해 염기성, 산성에 대해 산성, 극성에 대해 극성과 같은 유사성-대-유사성(like-for-like) 치환을 개시한다. 또한 한 분류의 잔기로부터 또다른 잔기 또는 오르니틴(이하 Z로 표기), 디아미노부티르산(diaminobutyric acid) 오르니틴(이하 B로 표기), 노르류신 오르니틴(이하 O로 표기), 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비자연적 아미노산의 함유물 관련 대안 잔기로 비-상동적 치환이 발생한다.
변이 아미노산 서열은 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 간격 외에 메틸기, 에틸기 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함한, 서열의 두 아미노산 잔기 사이에 삽입되는 적당한 간격(spacer) 그룹을 포함한다. 추가적인 변이의 형태는 펩토이드(peptoid) 형태로 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하고, 이는 당업자에 의해 잘 이해될 것이다. 의심의 여지를 회피하기 위해 α-탄소 치환기가 α-탄소보다는 잔기의 질소 원자 상에 있는 변이 아미노산을 나타내는데 "펩토이드 형태"가 사용된다. 펩토이드 형태 내에 펩타이드를 제조하는 방법은 예를 들어 Simon RJ et al., PNAS(1992) 89(20), 9367-9371 및 Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995) 13(4), 132-134와 같이 당분야에 알려져 있다.
여기서 기술되고 여기서 기술된 방법 및 조성물에 이용하기 적당한 뉴클레오타이드 서열(PS4 변이 핵산과 같은)은 합성적 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드로의 많은 다른 형태의 변형이 당분야에 알려져 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본 및/또는 분자의 3' 및/또는 5'말단에서의 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 첨가를 포함한다. 본 출원서의 목적을 위해 여기서 기술된 뉴클레오타이드 서열이 당분야에 유용한 어떠한 방법에 의해서도 변형됨이 이해된다. 뉴클레오타이드 서열의 생체 내 활성 또는 수명을 증가시키기 위해 이러한 변형이 수행된다.
또한 본 발명자는 여기서 제공된 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체 또는 단편의 이용을 개시한다. 서열이 그의 단편에 상보적인 경우 서열은 다른 생물체 내의 유사한 코딩 서열을 확인하는 프로브로서 사용될 수 있다.
PS4 변이체 서열에 100% 상동적이지 않은 폴리뉴클레오타이드는 많은 방법에 의해 수득된다. 여기에 기술된 서열의 다른 변이체는 예를 들어 다른 집단으로부터의 개체와 같은 광범위한 개체로부터 DNA 라이브러리를 프로브함으로서 수득된다. 더욱이 다른 상동체가 수득되고 이러한 상동체 및 그의 단편은 일반적으로 서열목록에 나타난 서열을 선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능할 것이다. 이러한 서열은 다른 종으로부터 제조된 cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA를 프로브하고, 중간 내지 높은 스트린전시 조건 하에서 첨부된 서열목록 내의 어느 한 서열의 모두 또는 일부를 포함하는 프로브로 이러한 라이브러리를 프로브함으로서 수득된다. 유사한 고려는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열의 종 상동체 및 대립유전자 변이체를 수득하는데 적용된다.
또한 변이체 및 스트레인/종 상동체는 본 발명의 서열 내에서 보존된 아미노산 서열을 인코드하는 변이체 및 상동체 내에 서열을 타겟하도록 고안된 프라이머를 이용하는 퇴화(degenerate) PCR을 이용하여 수득된다. 보존된 서열은 예를 들어 일부 변이체/상동체로부터의 아미노산 서열을 정렬시킴으로서 예측될 수 있다. 서열 정렬은 당분야에 알려진 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 GCG Wisconsin PileUp 프로그램이 광범위하게 이용된다.
퇴화 PCR에 사용되는 프라이머는 하나 이상의 퇴화 위치를 포함하고 알려진 서열에 대해 단일 서열 프라이머로 서열을 클로닝하는데 사용되는 것 보다 더 낮은 스트린전시 조건에서 사용될 것이다.
대안으로, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 특성화된 서열의 자리-지정 돌연변이유발에 의해 수득된다. 이는 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에 대해 코돈 우선권을 최적화하는데 침묵 코돈 서열 변화가 필요할 때 유용하다. 제한 폴리펩타이드 인식 사이트를 도입시키거나 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드되는 폴리펩타이드의 성질 또는 기능을 변화시키기 위해 다른 서열 변화가 바람직하다.
본 출원서에 기술된 PS4 변이 핵산과 같은 폴리뉴클레오타이드(뉴클레오타이드 서열)는 프라이머 즉, PCR 프라이머, 대안적 증폭 반응용 프라이머, 프로브 즉, 방사성 또는 비-방사성 표지를 이용한 통상적 방법에 의해 노출 표지로 표지된 프로브를 제조하는데 이용되고 또는 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내로 클론된다. 이러한 프라이머, 프로브 및 다른 단편은 적어도 15 이상, 바람직하게는 적어도 20 이상, 예를 들어 적어도 25, 30 또는 40 이상의 뉴클레오타이드 길이이고 또한 여기서 사용된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 포함된다.
DNA 폴리뉴클레오타이드 및 프로브와 같은 폴리뉴클레오타이드는 재조합적으로, 합성적으로 또는 당업자에게 유용한 어떠한 방법에 의해서도 제조된다. 또한 이들은 표준 기술에 의해 클론된다. 일반적으로 프라이머는 한 번에 하나의 뉴클레오타이드에 원하는 핵선 서열의 계단식 제조를 포함한 합성적 방법에 의해 제조될 것이다. 자동화된 기술을 이용하여 이를 달성하기 위한 기술은 당분야에서 용이하게 이용된다.
더 긴 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 재조합 방법, 예를 들어 PCR(중합효소 연쇄 반응) 클로닝 기술을 이용하여 제조될 것이다. 프라이머는 적당한 제한 효소 인식 사이트를 포함하여 증폭된 DNA가 적당한 클로닝 벡터 내로 클론될 수 있도록 고안된다.
여기서 사용된 "생물학적으로 활성적인"은 자연 발생적 서열의 유사한 구조적 기능(동일한 정도일 필요는 없음) 및/또는 유사한 조절 기능(동일한 정도일 필요는 없음) 및/또는 유사한 생화학적 기능(동일한 정도일 필요는 없음)을 지닌 서열을 나타낸다.
하이브리디제이션
또한 본 발명자는 PS4 변이체의 핵산 서열에 상보적인 서열 또는 PS4 변이체 서열 또는 그에 상보적인 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열을 개시한다.
여기서 사용된 "하이브리디제이션"이라는 용어는 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술에서 수행되는 증폭 과정뿐만 아니라 "염기 짝짓기를 통해 핵산 스트랜드를 상보적 스트랜드와 결합시키는 공정"을 포함한다. 또한 본 발명자는 여기서 제공된 서열 또는 그의 유도체, 단편에 상보적인 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열의 이용을 개시한다.
또한 "변이체"라는 용어는 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
바람직하게는 "변이체"라는 용어는 스트린전트 조건(즉, 50℃ 및 0.2xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3구연산염 pH 7.0})하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는 "변이체"라는 용어는 높은 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3구연산염 pH 7.0})하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
또한 본 발명자는 PS4 변이체의 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 PS4 변이체의 뉴클레오타이드에 하이브리다이즈할 수 있는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열(여기서 제공된 것의 상보적 서열을 포함)을 개시한다. 또한 본 발명자는 중간 내지 최대 스트린전시 조건 하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 폴리뉴클레오타이드 서열을 개시한다.
바람직한 관점에서 본 발명자는 스트린전트 조건(즉, 50℃ 및 0.2xSSC) 하에서 PS4 변이 핵산의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 개시한다. 더욱 바람직한 관점에서 본 발명자는 높은 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC) 하에서 PS4 변이체의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 개시한다.
자리-지정 돌연변이유발
효소-인코드 뉴클레오타이드 서열이 분리되거나 추정 효소-인코드 뉴클레오타이드 서열이 확인되면 효소를 제조하기 위해 본 서열을 돌연변이시키는 것이 바람직하다. 따라서 PS4 변이체 서열은 모서열로부터 제조된다. 돌연변이는 합성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 도입된다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 원하는 돌연변이 사이트에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
적당한 방법은 Morinaga et al.,(Biotechnology (1984) 2, p646-649)에 개시되어 있다. 효소-인코드 뉴클레오타이드 서열 내로 돌연변이를 도입시키는 또다른 방법은 Nelson and Long(Analytical Biochemistry (1989), 180, p147-151)에 기술되어 있다. 또다른 방법은 Sarkar and Sommer(Biotechniques (1990), 8, p404-407 - "The megaprimer method of site directed mutagenesis")에 기술되어 있다.
하나의 관점에서 여기서 기술된 방법 및 조성물에 사용되는 서열은 재조합 서열 - 즉, 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된 서열이다. 이들 재조합 DNA 기술은 당업자의 능력 내에 있다. 이러한 기술은 예를 들어 J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press와 같은 문헌에서 설명되어 있다.
하나의 관점에서 여기서 기술된 방법 및 조성물에 사용되는 서열은 합성 서열 - 시험관 내에서의 화학적 또는 효소적 합성에 의해 제조된 서열이다. 이는 숙주 생물체 - 메틸영양체성 효모 피키아(Pichia) 및 한세눌라(Hansenula)와 같은 -에 대한 최적 코돈 용법으로 제조된 서열을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
여기서 기술된 방법 및 조성물에 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 재조합 복제가능 벡터 내로 도입된다. 벡터는 효소의 형태로 적합성 숙주 세포 내 및/또는 그로부터 뉴클레오타이드 서열을 복제하고 발현하는데 사용된다. 발현은 제어 서열 즉, 조절 서열을 이용하여 조절된다. 뉴클레오타이드의 발현에 의한 숙주 재조합 세포에 의해 제조된 효소는 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 다르게 분비되거나 세포내적으로 포함된다. 코딩 서열은 특정한 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 코딩 서열 물질의 분비를 지시하는 신호 서열을 지니도록 고안될 수 있다.
PS4 핵산 및 폴리펩타이드의 발현
PS4 폴리펩타이드 및 핵산은 DNA 또는 RNA는 변형되거나 비변형된 데옥시- 또는 디데옥시-뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 그의 아날로그를 포함한 합성 및 천연 기원의 DNA 및 RNA를 포함한다. PS4 핵산은 단일- 또는 이중-스트랜드 DNA 또는 RNA, RNA/DNA 이질이중나선(heteroduplex) 또는 RNA/DNA 공중합체를 포함하고, 상기 "공중합체"라는 용어는 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드 모두를 포함한 단일 핵산 스트랜드를 나타낸다. PS4 핵산은 발현을 더욱 증가시키도록 최적화된 코돈이다.
여기서 사용된 "합성적"이라는 용어는 시험관 내에서의 화학적 또는 효소적 합성에 의해 생성된 것으로 정의된다. 이는 메틸영양체성 효모 피키아 및 한세눌라와 같은 숙주 생물체에 대해 최적 코돈 용법으로 제조된 서열 PS4 핵산을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
예를 들어 여기서 기술된 변이 PS4 폴리뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드는 재조합 복제가능 벡터 내로 도입될 수 있다. 벡터는 적합성 숙주 세포 내에서 핵산을 복제하는데 사용된다. 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한 벡터는 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된다. 적당한 숙주는 박테리아, 효모, 곤충 및 진균 세포를 포함한다.
"형질전환된 세포"라는 용어는 재조합 DNA 기술을 이용하여 형질전환된 세포를 포함한다. 일반적으로 형질전환은 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열의 형질전환되는 세포로의 삽입에 의해 발생한다. 삽입되는 뉴클레오타이드 서열은 이형성 뉴클레오타이드 서열이다(즉, 형질전환되는 세포에서는 자연적이지 않은 서열임). 더욱이 또는 이에 더하여 삽입되는 뉴클레오타이드 서열은 상동성 뉴클레오타이드 서열이다(즉, 형질전환되는 세포에서 자연적인 서열임) - 따라서 세포는 그에 이미 존재하는 뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 여분의 카피를 수용한다.
따라서 또다른 실시태양에서 본 발명자는 폴리뉴클레오타이드를 복제가능 벡터 내로 도입시키고, 상기 벡터를 적합성 숙주 세포 내로 도입시키고, 상기 숙주 세포를 벡터의 복제를 야기하는 조건 하에서 성장시킴으로서 PS4 변이 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수된다.
발현 컨스트럭트
PS4 핵산은 목적 숙주 세포에서 활성적인 전사 및 번역 조절 요소에 실시 가능하게 결합된다. 또한 PS4 핵산은 스크완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 유래의 글루코아밀라제 유전자, 사카로마이세스 세레비세이 유래의 α-인자 교배 타입 유전자 및 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래의 TAKA-아밀라제와 같은 신호 서열을 포함한 융합 단백질을 인코드한다. 대안으로 PS4 핵산은 막 결합 도메인을 포함한 융합 단백질을 인코드한다.
발현 벡터
PS4 핵산은 발현 벡터를 이용하여 숙주 생물체 내에서 원하는 수준으로 발현된다.
PS4 핵산을 포함한 발현 벡터는 선택된 숙주 생물체 내에서 PS4 핵산을 인코드하는 유전자를 발현하는 것이 가능한 어떠한 벡터도 될 수 있고 벡터의 선택은 도입되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 따라서 벡터는 자발적 복제 벡터 즉, 에피솜 실재로서 존재하고 그의 복제는 플라스미드, 박테리오파지 또는 에피솜 요소, 미니염색체 또는 인공 염색체와 같은 염색체 복제와는 독립적인 벡터이다. 대안으로 벡터는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포 게놈 내로 도입되고 염색체와 함께 복제되는 것이다.
발현 벡터의 성분
일반적으로 발현 벡터는 선택된 숙주 생물체 내에서 벡터의 자발적 복제를 가능하게 하는 요소 및 선택 목적으로 하나 이상의 표현형적으로 검출 가능한 마커와 같은 클로닝 벡터의 성분을 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 프로모터, 작동유전자, 리보솜 결합 사이트, 번역 개시 신호를 인코드하는 조절 뉴클레오타이드 서열 및 선택적으로는 억제제 유전자 또는 하나 이상의 활성제 유전자를 포함한다. 대안으로 발현 벡터는 과산화소체와 같은 숙주 세포 소기관 또는 특정 숙주 세포 구획에 PS4 변이 폴리펩타이드를 타겟시킬 수 있는 아미노산 서열을 코드하는 서열을 포함한다. 이러한 타겟팅 서열은 SKL 서열을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 본 정황하에서 '발현 신호'라는 용어는 상기 조절 서열, 억제제 또는 활성제 서열의 어느 하나를 포함한다. 조절 서열의 지시 하에서의 발현을 위해 PS4 변이 폴리펩타이드의 핵산 서열은 발현에 대한 적당한 방식으로 조절 서열에 실시 가능하게 결합된다.
바람직하게는 벡터 내 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에 의한 코딩 서열의 발현을 제공하는 것이 가능하다 즉, 벡터는 발현 벡터이다. "실시 가능하게 결합된"이라는 용어는 기술된 성분이 그의 의도된 방식으로 기능하게 하는 관계에 있음을 의미한다. 코딩 서열에 "실시 가능하게 결합된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 적합한 조건 하에서 달성되는 방식으로 라이게이트된다.
조절 서열은 예를 들어 전사 조절 서열에 의해 지시된 전사 수준을 조절제에 더욱 반응적이도록 하는 전사 조절 요소의 또다른 첨가에 의해 변형된다. 조절 서열은 특히 프로모터를 포함한다.
프로모터
벡터 내에서 변이 PS4 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산 서열은 적당한 프로모터 서열과 실시 가능하게 결합된다. 프로모터는 선택된 숙주 생물체 내에서 전사 활성을 지니는 어떠한 DNA 서열도 될 수 있고 숙주 생물체와 상동적이거나 이형적인 유전자로부터 유래할 수 있다.
박테리아 프로모터
박테리아 숙주 내에서 PS 핵산과 같은 변형된 뉴클레오타이드 서열의 전사를 지시하는 적당한 프로모터의 예는 E. coli의 lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor) 아가라제(agarase) 유전자 dagA 프로모터, 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) α-아밀라제 유전자(amyL)의 프로모터, 바실러스 스테아로테르모필러스(Bacillus stearothermophilus) 말토제닉 아밀라제 유전자(amylM)의 프로모터, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) α-아밀라제 유전자(amyQ)의 프로모터, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) xylA 및 xylB 유전자의 프로모터 및 락토코커스종(Lactococcus sp.) 유래의 프로모터 - P170 프로모터를 포함한 프로모터 유래 -를 포함한다. PS4 변이 폴리펩타이드를 인코드하는 유전자는 E. coli와 같은 박테리아종 내에서 발현되는 경우 적당한 프로모터는 예를 들어 T7 프로모터 및 파지 람다 프로모터를 포함한 박테리오파지 프로모터로부터 선택될 수 있다.
진균 프로모터
진균종 내에서의 전사의 경우 유용한 프로모터의 예는 아스퍼질러스 오리자에 TAKA 아밀라제, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르트성 단백분해효소, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 중성 α-아밀라제, 아스퍼질러스 니거 산 안정성 α-아밀라제, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제, 리조무코르 미에헤이 리파제, 아스퍼질러스 오리자에 알칼리성 프로테아제, 아스퍼질러스 오리자에 트리오스 인산염 이소머라제 또는 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 아세트아미다제를 인코드하는 유전자로부터 유래한다.
효모 프로모터
효모종 내에서의 적당한 프로모터의 예는 사카로마이세스 세레비시에의 Gal 1 및 Gal 10 프로모터 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) AOX1 또는 AOX2 프로모터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
숙주 생물체
(Ⅰ) 박테리아 숙주 생물체
적당한 박테리아 숙주 생물체의 예는 바실러스 섭틸리스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 렌터스(Bacillus lentus), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 스테아로테르모필러스, 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 라우터스(Bacillus lautus), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 및 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)를 포함한 바실러스과, 스트렙토마이세스 무리누스(Streptomyces murinus)와 같은 스트렙토마이세스종, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)와 같은 락토코커스종, 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri)를 포함한 락토바실러스종(Lactobacillus spp), 류코노스톡종(Leuconostoc spp.), 페디오코커스종(Pediococcus spp.) 및 스트렙토코커스종(Streptococcus spp.)과 같은 그람 양성 박테리아종이다. 대안으로 E. coli를 포함한 엔테로박테리아과(Enterobacteriaccae) 또는 슈도모나다과(Pseudomonadaceae)에 속하는 그람-음성 박테리아종이 숙주 생물체로 선택될 수 있다.
(Ⅱ) 효모 숙주 생물체
적당한 효모 숙주 생물체는 피키아종, 한세눌라종 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)종, 야로위니아(Yarrowinia)종 또는 사카로마이세스 세레비시에를 포함한 사카로마이세스종 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyce pombe)와 같은 스키조사카로마이세스에 속하는 종과 같으나 이에 한정적이지 않은 생물공학적으로 관련된 효모종으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는 메틸영양체성 효모 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주가 숙주 생물체로 이용된다. 바람직하게는 숙주 생물체는 한세눌라종이다.
(Ⅲ) 진균 숙주 생물체
사상 진균 중 적당한 숙주 생물체는 아스퍼질러스종 즉, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리자에, 아스퍼질러스 투비겐시스, 아스퍼질러스 아와모리 또는 아스퍼질러스 니둘란스를 포함한다. 대안으로 푸사리움(Fusarium)종 즉, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 또는 리조무코르 미에헤이와 같은 리조무코르종의 균주가 숙주 생물체로 이용될 수 있다. 다른 적당한 균주는 테르모마이세스(Thermomyces) 및 무코르(Mucor) 종을 포함한다.
단백질 발현 및 정제
폴리뉴클레오타이드를 포함한 숙주 세포는 PS4 변이 폴리펩타이드, 그의 단편, 상동체, 변이체 또는 유도체와 같은 폴리펩타이드를 발현하는데 이용된다. 숙주 세포는 단백질 발현을 가능하게 하는 적당한 조건 하에서 배양된다. 폴리펩타이드의 발현은 구성적이어서 연속적으로 생성되거나 초기 발현에 대한 자극을 요구하는 유도성이다. 유도성 발현의 경우 단백질 생성은 필요시 예를 들어 배양 배지 내의 덱사메타손(dexamethasnoe) 또는 IPTG와 같은 유도제 물질의 첨가에 의해 개시될 수 있다.
폴리펩타이드는 효소적, 화학적 및/또는 삼투성 용해 및 물리적 분열과 같은 당분야에 알려진 다양한 기술에 의해 숙주 세포로부터 추출될 수 있다. 또한 폴리펩타이드는 TnTTM(Promega) 토끼 세망세포 시스템과 같은 시험관 내 무세포 시스템에서 재조합적으로 생성된다.
(실시예 1) PS4의 클로닝
슈도모나스 사카로필라는 LB 배지 상에서 밤새 성장되고 염색체 DNA는 표준 방법(Sambrook J, 1989)에 의해 분리된다. PS4 오픈 리딩 프레임을 포함한 2190 bp 단편(Zhou et al., 1989)은 P1 및 P2를 이용한 PCR(표 3 참조)를 이용하여 슈도모나스 사카로필라 염색체 DNA로부터 증폭된다. 수득된 단편은 프라이머 P3 및 P4로의 네스티드(nested) PCR 내에서 주형으로 사용되고, 신호 서열 없이 PS4의 오픈 리딩 프레임을 증폭시키고 유전자의 5' 말단에 NcoI 사이트를 3' 말단에 BamHI 사이트를 도입시킨다. NcoI 사이트와 함께 N-말단 메티오닌의 코돈이 도입되고 PS4의 세포내 발현을 가능하게 한다. 1605 bp 단편은 pCRBLUNT TOPO (Invitrogen) 내로 클론되고 컨스트럭트의 완전체는 서열분석에 의해 분석된다. E. coli 바실러스 셔틀 벡터 pDP66K(Penninga et al, 1996)는 P32 프로모터 및 ctgase 신호 서열의 조절 하에서 PS4 의 발현을 가능하게 하도록 변형된다. 수득된 플라스미드, pCSmta는 바실러스 섭틸리스 내로 형질전환된다.
두 번째 발현 컨스트럭트는 PS4의 전분 결합 도메인이 제거되도록 제조된다. pCSmta 상에서의 프라이머 P3 및 P6(표 3)으로의 PCR시 mta 유전자의 절단된 버전이 생성된다. pCSmta 내의 전체 길이 mta 유전자는 절단된 버전으로 교환되어 플라스미드 pCSmta-SBD를 유발한다.
(실시예 2) PS4의 자리 지정 돌연변이유발
돌연변이는 2 단계 PCR 기반 방법 또는 Quick Exchange 방법(QE)과 같은 2가지 방법에 의해 mta 유전자 내로 도입된다. 편의상 mta 유전자는 3 부분으로 분열된다; PvuI-FspI 단편, FspI-PstI 단편 및 PstI-AspI 단편, 또한 각각 단편 1, 2 및 3으로도 표기됨.
2 단계 PCR 기반 방법에서 돌연변이는 Pfu DNA 중합효소(Stratagene)를 이용하여 도입된다. 첫 번째 PCR은 상에서의 코딩 스트랜드에 대한 프라이머(표 4) 및 낮은 스트랜드(2R 또는 3R 표 3) 다운스트림의 프라이머로 수행된다. 반응 생성물은 코딩 스트랜드의 업스트림 프라이머와 함께 두 번째 PCR의 프라이머로 이용된다. 최종 반응의 생성물은 pCRBLUNT topo(Invitrogen) 내로 클론되고 서열분석 후 단편은 pCSmta 내의 대응 단편과 교환된다.
Quick Exchange 방법(Stratagene)을 이용하여 돌연변이는 mta 유전자 또는 mta 유전자 일부를 포함하는 플라스미드 상에서 PCR 내 2개의 상보적 프라이머를 이용하여 도입된다.
이러한 목적을 위해 3개의 SDM 플라스미드 및 3개의 pCSΔ를 포함한 편리한 플라스미드 세트가 구축된다. SDM 플라스미드 각각은 상기 기술된 mta 유전자의 단편 1개를 포함하고, 바람직한 돌연변이는 QE에 의해 도입된다. 서열분석에 의한 증명 후 단편은 대응 수용 pCSΔ 플라스미드 내로 클론된다. pCSΔ 플라스미드는 pCSmta 유래의 불활성 유도체이다. 활성은 SDM 플라스미드 유래의 대응 단편을 클로닝함으로서 회복되고 용이한 선별을 가능하게 한다.
Figure 112007000695933-pct00004
Figure 112007000695933-pct00005
Figure 112007000695933-pct00006
(실시예 3) 멀티 SDM
PS4 변이체는 여기서 기술된 일부 변형을 지니고 제조사 프로토콜에 따라 QuickChange Multi Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)를 이용하여 생성되었다.
단계 1: 돌연변이 스트랜드 합성 반응(PCR)
접종액 3 ml. LB(22 g/l Lennox L Broth Base, Sigma) + 10 ml Falcon 튜브 내 항생제(0.05 ㎍/ml 카나마이신, Sigma)
- o/n 37℃, ca. 200 rpm으로 인큐베이트
- 원심분리로 세포를 회전(5000 rpm/5분)
- 배지를 불량화
- QIAGEN Plasmid Mini Purification Protocol을 이용하여 ds-DNA 주형을 제조
1. 열 순환을 위한 돌연변이 스트랜드 합성 반응은 하기와 같이 이루어진다:
PCR 믹스:
2.5 ㎕ 100X QuickChange Multi 반응 완충액
0.75 ㎕ QuickSolution
X ㎕ 프라이머 프라이머 길이 28-35 bp → 10 pmol
프라이머 길이 24-27 bp → 7 pmol
프라이머 길이 20-23 bp → 5 pmol
1 ㎕ dNTP 믹스
X ㎕ ds-DNA 주형(200 ng)
1 ㎕ QuickChange Multi 효소 혼합액(2.5 U/㎕)(PfuTurbo DNA 중합효소)
X ㎕ dH2O(25 ㎕의 최종 부피로)
반응 혼합물을 피펫팅하고 간단히 회전시킴으로서 모든 성분을 혼합.
2. 하기 파리미터를 이용하여 반응을 순환:
변성(96℃/1분)
프라이머 어닐링(62.8℃/1분)
신장(65℃/15분)
이후 4℃에서 유지를 35회 순환
PCR 기계 뚜껑을 105℃로 예열시키고 PCR 튜브를 기계에 놓기 전에 플레이트를 95℃로 예열시킴(eppendorf thermal cycler).
단계 2: Dpn I 분해
1. XL10-Gold 세포를 얼음 위에서 해동시킴. 미리냉각된 Falcon 시험관에 돌연변이유발 반응 당 45 ㎕ 세포를 분할.
2. 수조(42℃) 위에 올려지고 시험관을 수조 내 NZY+ 액체배지와 함께 놓고 예열시킴.
3. 각 시험관에 β-머캅토에탄올 2 ㎕를 첨가. 진탕하고 가볍게 두드린 후 얼음 위에서 10분간 인큐베이트, 2분마다 진탕함.
4. 1.5 ㎕ Dpn I-처리된 DNA를 각 세포 분할분에 첨가시키고 진탕하여 혼합하고 얼음 위에서 30분간 인큐베이트함.
5. 42℃ 수조에서 30초간 시험관을 가열-펄스시키고 2분간 얼음 위에 위치시 킴.
6. 각 시험관에 예열된 NZY+ 액체배지 0.5 ml를 첨가시키고 225-250 rmp으로 진탕하면서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이트함.
7. 1% 전분 및 0.05 ㎍/ml 카나마이신을 함유한 LB 플레이트(33.6 g/l Lennox L Agar, Sigma) 상에 200 ㎕의 형질전환 반응액을 도말함.
8. 37℃에서 밤새 형질전환 플레이트를 인큐베이트함.
Figure 112007000695933-pct00007
Figure 112007000695933-pct00008
Figure 112007000695933-pct00009
pPD77에 기반한 벡터 시스템
pPD77에 사용하기 위한 벡터 시스템은 pCRbluntTOPOII(invitrogen)에 기반한다. 제오신(zeocin) 저항성 카세트는 pmlI에 의해 제거되어 393 bp 단편이 제거되었다. pCC 벡터로부터의 발현 카세트(P32-ssCGTase-PS4-tt)는 벡터 내로 삽입되었다.
PS4 변이체의 pCCMini 내로의 라이게이션
관련 돌연변이를 포함한 플라스미드(MSDM에 의해 생성)는 제한 효소 Nco 1 및 Hind Ⅲ(Biolabs)로 절단된다:
3 ㎍ 플라스미드 DNA, X ㎕ 10x 완충액, 2, 10 단위 Nco1, 20 단위 HindⅢ,
37℃에서 2시간 동안 인큐베이션.
1% 아가로스 겔 상에서 분해 가동. 1293 bp 크기의 단편(PS4 유전자)은 겔 외부로 절단되고 Qiagen 겔 정제 키트를 이용하여 정제된다.
이후 벡터 pCCMini는 제한 효소 Nco 1 및 Hind Ⅲ로 절단된 후 분해는 1% 아가로스 겔 상에서 가동된다. 3569 bp 크기의 단편은 겔 외부로 절단되고 Qiagen 겔 정제 키트를 이용하여 정제된다.
라이게이션: Rapid DNA ligation kit(Roche)을 이용.
벡터와 비교시 2배 삽입량을 이용
즉, 2 ㎕ 삽입(PS4 유전자)
1 ㎕ 벡터
5 ㎕ T4 DNA 라이게이션 완충액 2x 농도
1 ㎕ dH2O
1 ㎕ T4 DNA 리가제
5분/상온으로 라이게이트
제조사의 프로토콜에 따라 One Shot TOPO 적합 세포 내로 라이게이션을 형질전환시킴. 형질전환 당 5 ㎕ 라이게이션을 이용.
1% 전분 및 0.05 ㎍/ml 카나마이신을 함유한 LB 플레이트(33.6 g/l Lennox L Agar, Sigma) 상에 50 ㎕ 형질전환 믹스를 도말시킴. 삽입물(PS4 변이체)을 함유한 벡터는 전분 플레이트 상에서 할로(halo) 형성에 의해 인식될 수 있다.
(실시예 4) 바실러스 섭틸리스 내로의 형질전환(원형질체 형질전환)
바실러스 섭틸리스(균주 DB104A; Smith et al. 1988; Gene 70, 351-361)는 하기 프로토콜에 따라 돌연변이된 pCS-플라스미드로 형질전환된다.
A. 원형질체화 및 형질전환용 배지
2 x SMM 리터 당: 342 g 슈크로스(1 M); 4.72 g 말레산나트륨(0.04 M); 8:12 g MgCl2,6H2O(0.04 M0); 농축 NaOH로 pH 6.5 적정. 50-ml 부분으로 분배 및 10분간 가압멸균시킴.
4 x YT(1/2 NaCl) 100 ml 당 2 g 효모 추출물 + 3.2 g 트립톤 + 0.5 g NaCl
SMMP 2 x SMM 및 4 x YT의 동일한 부피와 혼합.
PEG 25 ml 내 10g 폴리에틸렌글리콜 6000(BDH) 또는 8000(Sigma) x SMM(10분간 가압멸균)
B. 도말/재생용 배지
한천 4% Difco 최소 한천. 15분간 가압멸균
숙신산나트륨 270 g/l(1 M), HCl로의 pH 7.3. 15분간 가압멸균
인산염 완충액 100 ml 당 3.5 g K2HPO4 + 1.5 g KH2PO4. 15분간 가압멸균
MgCl2 100 ml 당 20.3 g MgCl2, 6H2O
카사미노산 5%(w/v) 용액. 15분간 가압멸균
효모 추출물 100 ml 당 10 g. 15분간 가압멸균
글루코스 20%(w/v) 용액. 15분간 가압멸균
DM3 재생 배지: 60℃에서 혼합(수조; 500-ml 병):
250 ml 숙신산나트륨
50 ml 카사미노산
25 ml 효모 추출물
50 ml 인산염 완충액
15 ml 글루코스
10 ml MgCl2
100 ml 용해된 한천
적당한 항생제를 첨가: 클로람페니콜 및 테트라사이클린, 5 ㎍/ml; 에리트로마이신, 1 ㎍/ml. 카나마이신 상에서의 선택은 DM3 배지 내에서는 의심스러움: 250 ㎍/ml의 농도가 요구됨.
C. 원형질체의 제조
1. 무-세제 플라스틱 또는 유리 용기를 이용
2. 단일 콜로니로부터 100-ml 플라스크 내에서 2 x YT 배지의 10 ml를 접종시킴. 쉐이커(200 rev/분) 내에서 25∼30℃로 밤새 배양액을 성장시킴.
3. 배양액을 신선한 2 x YT 배지의 100 ml 내(250-ml 플라스크)에서 20배로 희석시키고 쉐이커(200∼259 rev/분) 내에서 37℃로 OD600=0.4∼0.5에 도달할 때까지(약 2시간) 성장시킴.
4. 원심분리(9000g, 20분, 4℃)로 세포를 수집함
5. 피펫으로 상청액을 제거하고 5 ml의 SMMP + 5 ml 리소자임 내에 세포를 재현탁시키고 멸균 여과시킴.
6. 수조 쉐이커(100 rev/분) 내에서 37℃로 인큐베이트시킴.
30분 후 15분 간격으로 25 ㎕ 표본을 현미경으로 관찰함. 세포 99%가 원형질체화될 때까지 인큐베이션을 지속시킴. 원심분리에 의해 원형질체를 수집하고 상청액을 피펫으로 제거함. 펠렛을 1∼2 ml의 SMMP 내에 재현탁시킴.
원형질체는 사용 준비된다(일부(즉, 0.15 ml)는 이후의 사용을 위해 -80℃에서 동결될 수 있다(글리세롤 첨가는 요구되지 않음). 이는 형질전환능력의 일부 감소를 유발하나 DNA ㎍ 당 106 형질전환체가 동결 원형질체로 수득될 수 있다).
D. 형질전환
1. 450 ㎕의 PGE를 미세시험관으로 이동시킴.
2. 1∼10 ㎕의 DNA를 150 ㎕의 원형질체와 혼합시키고 혼합물을 PEG를 포함한 미세시험관에 첨가시킴. 즉시 약하게 혼합시킴.
3. 상온에서 2분간 정치시킨 후 1.5 ml의 SMMP를 첨가시키고 혼합시킴.
4. 원심분리(10분, 13,000 rev/분(10∼12,000 g)로 원형질체를 수집하고 상청액을 제거함. 잔존하는 물방울을 티슈로 제거함.
300 ㎕의 SMMP를 첨가하고(볼텍스는 하지 않음) 수조 쉐이커(100 rev/분) 내에서 37℃로 60∼90분간 인큐베이트하여 항생제 저항성 마커의 발현을 가능하게 함(원형질체는 수조의 진탕 작용에 의해 충분히 재현탁됨). 1 x SSM 내로 적당하 게 희석시키고 DM3 플레이트 상에 0.1 ml로 도말시킴.
(실시예 5) 진탕 플라스크 내 PS4 변이체의 발효
진탕 플라스크 기질은 하기와 같이 제조된다:
Figure 112007000695933-pct00010
기질은 가압멸균되기 전 4N 술폰산 또는 수산화나트륨으로 pH 6.8로 적정된다. 100 ml의 기질은 하나의 격벽을 지닌 500 ml 플라스크 내에 놓이고 30분간 가압멸균된다. 이후 6 ml의 멸균 덱스트로스 시럽이 첨가된다. 덱스트로스 시럽은 50% w/v 덱스트로스의 1 부피를 물 1 부피와 혼합시킨 후 20분간 가압멸균시킴으로서 제조된다.
진탕 플라스크는 변이체로 접종되고 인큐베이터 내에서 35℃/180 rpm에서 24시간 동안 인큐베이트된다. 인큐베이션 후 세포는 원심분리(10,000 x g로 10분 간) 액체배지로부터 분리되고 최종적으로는 상청액은 0.2 ㎛의 미세여과에 의해 세포가 존재하지 않게 된다. 무세포 상청액은 분석 및 적용 시험에 이용된다.
(실시예 6) 아밀라제 분석
Betamyl 분석
하나의 베타밀 단위는 PNP-결합된 말토펜타오스의 1분 당 0.0351 mM을 분해하여 1분 당 0.0351 mM PNP가 분석 혼합물 내 과도한 a-글루코시다제에 의해 방출될 수 있다. 분석 혼합물은 25 ㎕ 효소 표본 및 아일랜드 Megazyme의 25 ㎕ Betamyl 기질(Glc5-PNP 및 a-글루코시다제)과 함께 50 ㎕ 50 mM Na-구연산, 5 mM CaCl2, pH 6.5를 포함한다. 이들 분석 혼합물은 40℃에서 30분간 인큐베이트된 후 150 ㎕의 4% Tris를 첨가함으로서 중지된다. 420 nm에서의 흡광도는 ELISA-판독기를 이용하여 측정되고 Betamyl 활성은 분석된 효소 표본의 Betamyl 단위/ml so 활성 = A420*d에 기반하여 계산된다.
엔도-아밀라제 분석
엔도-아밀라제 분석은 제조사(Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB)에 따라 수행되는 Phadebas 분석과 동일하다.
엑소-특이성
Phadebas 활성에 대한 엑소-아밀라제 활성의 비율은 엑소-특이성을 평가하는데 이용되었다.
특이적 활성
PSac-D14, PSac-D20 및 PSac-D34 변이체의 경우 본 발명자는 Bradford(1976; Anal. Biochem. 72, 248)에 따라 측정된 정제 단백질의 마이크로그램 당 10 Betamyl 단위의 평균 특이적 활성을 발견하였다. 이러한 특이적 활성은 적용 시도에 사용된 용량을 계산하기 위해 활성에 기반하여 이용된다.
(실시예 7) 반감기 측정
t1/2는 한정된 열 조건 하에서 효소 활성의 반이 불활성화되는 시간(분)으로 정의된다. 효소 반감기를 측정하기 위해 표본은 60∼90℃의 일정 온도에서 1∼10분간 가열된다. 반감기는 잔여 Betamyl 분석에 기반하여 계산된다.
절차: 에펜도르프 바이알 내에서 1000 ㎕ 완충액에 60℃ 이상에서 적어도 10분 이상 동안 예열된다. 표본의 열 처리는 가열 인큐베이터(Eppendorf사의 Termomixer comfort) 내에서 에펜도르프 바이알의 연속적인 혼합(800 rpm) 하에서 예열된 완충액 내에 표본 100 ㎕를 첨가함으로서 시작된다. 인큐베이션 0, 2, 4, 6, 8 및 9분 후 처리는 45 ㎕의 표본을 20℃에서 평형화된 100 ㎕의 완충액 내로 옮기고 1500 rpm 및 50℃에서 1분간 인큐베이트시킴으로서 중지된다. 잔여 활성은 Betamyl 분석으로 측정된다.
계산: t1/2의 계산은 인큐베이션 시간에 대한 잔여 Betamyl 활성의 로그 10(기본-10 대수)의 기울기에 기반한다. t1/2는 기울기/0.301=t1/2로서 계산된다.
(실시예 8) 모델 시스템 베이킹 시험
반죽은 30.0℃에서 파리노그래프(Farinograph) 내에서 제조된다. 10.00 g의 개량 밀가루가 측량되고 파리노그래프 내에 첨가된다; 1분간 혼합 후 참고물질/표본(참고물질 = 완충액 또는 물, 표본 = 효소 + 완충액 또는 물)은 반죽조의 구멍을 통해 멸균 피펫으로 첨가된다. 30초 후 밀가루는 가장자리 - 또한 반죽조의 구멍을 통해 - 에서 문질러진다. 표본은 7분간 반죽된다.
완충액 또는 물로의 시험은 최종 참고물질이 수행되기 전 파리노그래프 상에서 수행된다. FU는 참고물질 상에서 400이어야하고, 그렇지 않은 경우 예를 들어 액체의 양과 조정되어야 한다. 참고물질/표본은 NMR 시험관 내에 놓이고 코르크 마개가 달린 작은 유리 시험관(약 4.5 cm의 길이) 내로 채워지기 전에 주걱으로 채취되어 손(1회용 장갑 착용)에 놓인다. 반죽 당 7개의 시험관이 준비된다.
모든 표본이 준비되면 시험관은 33℃에서(코르크 없이) 25분간 수조 내에 놓인 후(프로그램 가능) 수조는 33℃에서 5분간 정치되도록 셋팅된 후 56분간 98℃로 가열되고(분당 1.1℃) 최종적으로는 96℃에서 5분간 정치된다.
시험관은 열찬장(thermo cupboard) 내 20.0℃에서 저장된다. 빵 속의 고형 함량은 도 2의 0.05, 1 및 2 ppm PSacD34로 제조된 빵 속 표본에서 나타난 바와 같이 Bruker NMS 120 Minispec NMR 분석기를 이용한 양자 NMR에 의해 측정되었다. 시간 경과에 따른 고형 함량 내 낮은 증가는 아밀로펙틴 퇴화의 감소를 나타낸다. 열찬장 내 20.0℃에서의 7일간 저장 후 빵 속 10∼20 mg 표본이 측량되었고 40 ㎕의 알루미늄 표준 DSC 캡슐 내에 놓이고 20℃에서 유지되었다.
캡슐은 Mettler Toledo DSC 820 기구 상에서 차별적 스캐닝 열략측정에 사용된다. 파라미터로서 분당 10℃ 가열 및 분당 기체/유출: N2/80 ml로의 20∼95℃의 가열 순환이 이용된다. 결과가 분석되고 퇴화된 아밀로펙틴의 용융 엔탈피는 J/g으로 계산된다.
(실시예 9) 부패방지 효과
모델 빵 속이 제조되고 실시예 8에 따라 측정된다. 표 2에 나타난 바와 같이 PS4 변이체는 대조군과 비교시 차별적 스캐닝 열량측정으로 측정시 베이킹 후 아밀로펙틴 퇴화의 강한 감소를 나타낸다. PS4 변이체는 명백한 용량 효과를 나타낸다.
(실시예 10) 베이킹 시도시 견고성 효과
베이킹 시도는 표준 백색 빵 스펀지 및 미국 토스트용 반죽 조리법으로 수행되었다. 스펀지 반죽은 미국 Sisco Mills사의 "All Purpose Classic" 밀가루 160 g, 물 950 g, 대두유 40 g 및 건조 효모 32 g으로 제조된다. 스펀지는 Hobart 나선 믹서 상에서 1분간 저속으로 3분간 속도 2로 혼합된다. 이후 스펀지는 35℃, 85% 상대습도에서 2.5시간 동안, 5℃에서 0.5시간까지 발효된다.
이후 400 g의 밀가로, 4 g의 건조 효모, 40 g의 염, 2.4 g의 프로피온산칼슘, 240 g의 고 프럭토스 옥수스 시럽(Isosweet), 5 g의 유화제 PANODAN 205, 5 g 의 효소 활성 대두분, 30 g의 비-활성 대두분, 220 g의 물 및 30 g의 아스코르브산 용액(500 g의 물에 용해된 4 g의 아스코르브산으로부터 제조됨)이 스펀지에 첨가된다. 수득된 반죽은 Diosna 믹서 상에서 1분간 저속으로 6분간 속도 2로 혼합된다. 이후 반죽은 대기 온도에서 5분간 정치된 후 550 g의 반죽 조각이 측량되고 5분간 정치된 후 각 면에 대해 1:4, 2:4, 3:15, 4:12로 셋팅된 Glimek sheeter로 시트로 싸고 베이킹 틀로 이동된다. 43℃,90% 상대습도에서의 60분 강화 후 반죽은 218℃에서 29분간 베이크된다.
견고성 및 탄성은 TA-XT 2 질감 분석기로 측정되었다. 연도, 응집성 및 탄성은 영국 Stable Micro Systems사의 Texture Analyser를 이용한 질감 프로파일 분석에 의해 빵 조각을 분석함으로서 측정된다. 하기 셋팅이 이용되었다:
예비 시험 속도: 2 mm/초
시험 속도: 2 mm/초
후 시험 속도: 10 mm/초
파열 시험 거리: 1%
거리: 40%
힘: 0.098 N
시간: 5.00초
카운트: 5
부하 셀: 5 kg
트리거 타입: 자동 - 0.01 N
견고성 측정은 PS4 변이 폴리펩타이드가 1일부터 7일까지 견고성 발달을 유의적으로 감소시킴을 나타내고 효소 용량의 증가와 함께 더 우수한 효과를 나타낸다.
(실시예 11) 대니쉬 롤 부피의 조절
대니쉬 롤은 2000 g의 대니쉬 개량 밀가루(Cerealia), 120 g의 압축 효모, 32 g의 염 및 32 g의 슈크로스에 기반한 반죽으로 제조된다. 물은 이전의 물 최적화에 따라 반죽에 첨가된다.
반죽은 Diosna 믹서(저속으로 2분 및 고속으로 5분) 상에서 혼합된다. 혼합 후 반죽 온도는 26℃로 유지된다. 1350 g 반죽이 측량되고 30℃의 가열 캐비닛 내에서 10분간 정치된다. 롤은 Fortuna 주형 상에서 형성되고 35℃ 및 85% 상대습도에서 45분간 강화된다. 이후 롤은 처음 13초간 증기가 제공되는 250℃의 Bago 2 오븐에서 18분간 베이크된다. 베이킹 후 롤은 측량 및 부피 측정 전에 25분간 냉각된다.
롤은 빵 껍질 외형, 빵 속 균일성, 빵 껍질의 캡핑(capping), 오스번 드(ausbund) 및 비용적(평지씨 전치 방법으로 측정)에 관하여 평가된다.
이들 표준에 기반하여 PS4 변이체가 비용적을 증가시키고 대니쉬 롤의 품질 파라미터를 개선시키는 것으로 판명되었다. 따라서 PS4 변이체는 베이크된 제품의 부피를 조절할 수 있다.
Figure 112007000695933-pct00011
pPD77d40, pMD55, pMD85, pMD96, ρMD86 및 pMD109 서열은 컬럼 5에서 돌연변이된 잔기를 지니고 전분 결합 도메인은 슈도모나스 사카로필라 야생형 배경(서열번호: 1) 내에서 결실되었다.
다양한 위치에서의 개별적 돌연변이의 상세한 효과는 하기 하위섹션 내에 기술되어 있다.
121F 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성
N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, L178F, A179T에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD55로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다. 또한 실시예 12 및 표 9 참조.
Figure 112007000695933-pct00012
161A 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 엑소-특이성
N33Y, D34N, G121F, G134R, AHlP, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD96으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 엑소-특이성을 나타낸다. 또한 실시예 12 및 상기 표 9 참조.
Figure 112007000695933-pct00013
223E 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 엑소-특이성
N33Y, D34N, G121F, G134R, AHlP, I157L, L178F, A179T, G223E, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD96으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 엑소-특이성을 나타낸다. 또한 실시예 12 및 상기 표 9 참조.
Figure 112007000695933-pct00014
(실시예 13) 121D 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G121D, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD3으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00015
(실시예 14) 121W 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G121W, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD44로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00016
(실시예 15) 121H 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G121H, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD43으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00017
(실시예 16) 121M 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G121M, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD41로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00018
(실시예 17) 121A 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G121A, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD41로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00019
(실시예 18) 121Y 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G121Y, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD41로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00020
(실시예 19) 223A 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD3으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00021
(실시예 20) 223K 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223K, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM173으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00022
(실시예 21) 223V 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223V, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM173으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00023
(실시예 22) 223E 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223E, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM171로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00024
(실시예 23) G223R 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223R, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM173으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00025
(실시예 24) Y145G 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM 381로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00026
(실시예 25) 157M 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정 성
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157M, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM279로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00027
(실시예 26) 158T 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성
33Y5, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 158T, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM237로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00028
(실시예 27) 198W 및/또는 229P 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307L 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM325 F3으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다.
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 198W, 223E, 229P, 307L 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD129로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00029
(실시예 28) G303E 또는 G303D 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 엑소-특이성
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 3O3E, 307L 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM341 A9로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F5 179T, 223E, 303D, 307L 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM341 G11로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00030
(실시예 29) H306T 또는 H306G 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 엑소-특이성
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 306T, 307L 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM350 B11로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 306G, 307L 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM350 C12로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00031
(실시예 30) A309T 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 309P, 307L 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM332 Q4로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드 가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00032
(실시예 31) R316T 또는 R316T 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 316S, 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM365 B4로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다.
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 316P 및 334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM365 F4로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00033
(실시예 32) R353T 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성
33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 334P 및 353T에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM360 C7로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00034
(실시예 33) 26E 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 엑소-특이성
N26E, N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SSM219 B3으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00035
반감기 t1/2-85는 50 mM 구연산나트륨, 5 mM CaCl2, pH 6.5 완충액을 이용하여 PD-10 컬럼(Amersham Biosciences)으로 표본의 겔-여과 수행 후 실시예 8에 따라 측정된다.
(실시예 34) 70D 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 엑소-특이성
N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, G158T, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307L, A309P, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SAS1401 L10으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00036
반감기 t1/2-85는 50 mM 구연산나트륨, 5 mM CaCl2, pH 6.5 완충액을 이용하여 PD-10 컬럼(Amersham Biosciences)으로 표본의 겔-여과 수행 후 실시예 8에 따라 측정된다.
(실시예 35) 145D 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성 및 엑소-특이성
N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, N145D, Y146G, I157L, G158T, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307L, A309P, S334P에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SAS1387 D16으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성 및 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성 및 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00037
반감기 t1/2-85는 50 mM 구연산나트륨, 5 mM CaCl2, pH 6.5 완충액을 이용하여 PD-10 컬럼(Amersham Biosciences)으로 표본의 겔-여과 수행 후 실시예 8에 따라 측정된다.
(실시예 36) 188H 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성
N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, N145D, Y146G, I157L, G158T, S161A, L178F, A179T, G188H,,G223E, S229P, H307L, A309P, S334P, W339E에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD236으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00038
반감기 t1/2-85는 50 mM 구연산나트륨, 5 mM CaCl2, pH 6.5 완충액을 이용하여 PD-10 컬럼(Amersham Biosciences)으로 표본의 겔-여과 수행 후 실시예 8에 따라 측정된다.
(실시예 37) 188S 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 열안정성
N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, N145D, Y146G, I157L, G158T, S161A, L178F, A179T, G188S, G223E, S229P, H307L, A3O9P, S334P, W339E에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 pMD237로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 열안정성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 열안정성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00039
반감기 t1/2-85는 50 mM 구연산나트륨, 5 mM CaCl2, pH 6.5 완충액을 이용하여 PD-10 컬럼(Amersham Biosciences)으로 표본의 겔-여과 수행 후 실시예 8에 따라 측정된다.
(실시예 38) 339A 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 엑소-특이성
N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, G158T, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307L, A3O9P, S334P, W339A에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SAS1379 O13으로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00040
반감기 t1/2-85는 50 mM 구연산나트륨, 5 mM CaCl2, pH 6.5 완충액을 이용하여 PD-10 컬럼(Amersham Biosciences)으로 표본의 겔-여과 수행 후 실시예 8에 따라 측정된다.
(실시예 39) 339E 돌연변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩타이드의 증가된 엑소-특이성
N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, G158T, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307L, A3O9P, S334P, W339E에서의 아미노산 돌연변이를 지닌 SAS1379 O9로 지정된 PS4 변이 폴리펩타이드가 엑소-특이성에 대해 시험된다. 이러한 폴리펩타이드는 하기 표에 나타난 바와 같이 개선된 엑소-특이성을 나타낸다.
Figure 112007000695933-pct00041
또다른 관점
본 발명의 또다른 관점은 하기 번호 항에 나타나 있고; 본 발명이 이들 관점을 포함하는 것으로 이해된다.
항 A1. 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라제 서열의 위치 번호를 참고로 121 위치에서의 아미노산 돌연변이를 포함한, 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 모폴리펩타이드로부터 유도 가능한 PS4 변이 폴리펩타이드
항 A2. 항 A1에 있어서, 상기 121 위치에서의 돌연변이는 121F, 121Y 및/또는 121W, 바람직하게는 G121F, G121Y 및/또는 G121W 치환을 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 A3. 항 A1 또는 A2에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 161 및 223 으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 하나 이상의 또다른 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 A4. 항 A3에 있어서, 상기 하나 이상의 또다른 돌연변이는 161A, 223E 및 223K, 더욱 바람직하게는 S161A, G223E 및/또는 G223K로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 A5. 상기한 항 A의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121, 161; 121, 223으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 A6. 항 A5에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121F/Y/W, 161A; 121F/Y/W, 223E/K로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 A7. 상기한 항 A의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121, 161 및 223으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 A8. 상기한 항 A의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121F/Y/W, 161A, 223E/K로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 A9. 상기한 항 A의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 134, 141, 157, 223, 307, 334 위치로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상, 더욱 바람직하게는 전부의 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 A10. 상기한 항 A의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 33 및 34 위치 중의 하나 또는 모두에서의 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 A11. 항 A10에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P 및 선택적으로는 N33Y 및 D34N 중의 하나 또는 모두로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상, 더욱 바람직하게는 전부의 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 A12. 상기한 항 A의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는
(a) 121 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 121D, 더욱 바람직하게는 G121D;
(b) 178 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 178F, 더욱 바람직하게는 L178F;
(c) 179 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 179T, 더욱 바람직하게는 A179T; 및/또는
(d) 87 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 87SF, 더욱 바람직하게는 G87S를
더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B1. 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라제 서열의 위치 번호를 참고로 161 위치에서의 아미노산 돌연변이를 포함한, 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 모폴리펩타이드로부터 유도 가능한 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B2. 항 B1에 있어서, 상기 161 위치에서의 돌연변이는 161A, 바람직하게는 S161A 치환을 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B3. 항 B1 또는 항 B2에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121 및 223으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 하나 이상의 또다른 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B4. 항 B3에 있어서, 상기 하나 이상의 또다른 돌연변이는 121F, 121Y, 121W, 223E 및 223K, 더욱 바람직하게는 G121F, G121Y, G121W, G223E 및/또는 G223K로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B5. 상기한 항 B의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121, 161; 161, 223으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B6. 항 B5에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121F/Y/W, 161A; 161A, 223E/K로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B7. 상기한 항 B의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121, 161 및 223으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B8. 상기한 항 B의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121F/Y/W, 161A, 223E/K로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B9. 상기한 항 B의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 134, 141, 157, 223, 307, 334 위치로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상, 더욱 바람직하게는 전부의 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B10. 상기한 항 B의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 33 및 34 위치 중의 하나 또는 모두에서의 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B11. 항 B10에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P 및 선택적으로는 N33Y 및 D34N 중의 하나 또는 모두로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상, 더욱 바람직하게는 전부의 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 B12. 상기한 항 B의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는
(a) 121 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 121D, 더욱 바람직하게는 G121D;
(b) 178 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 178F, 더욱 바람직하게는 L178F;
(c) 179 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 179T, 더욱 바람직하게는 A179T; 및/또는
(d) 87 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 87SF, 더욱 바람직하게는 G87S를
더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C1. 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라제 서열의 위치 번호를 참고로 223 위치에서의 아미노산 돌연변이를 포함한, 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 모폴리펩타이드로부터 유도 가능한 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C2. 항 C1에 있어서, 상기 223 위치에서의 돌연변이는 223E 및/또는 223K, 바람직하게는 G223E 및/또는 G223K 치환을 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C3. 항 C1 또는 항 C2에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121 및 161로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 하나 이상의 또다른 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C4. 항 C3에 있어서, 상기 하나 이상의 또다른 돌연변이는 121F, 121Y, 121W 및 161A, 더욱 바람직하게는 G121F, G121Y, G121W 및/또는 S161A로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C5. 상기한 항 C의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121, 223; 161, 223으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함 을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C6. 항 C5에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121F/Y/W, 223E/K; 161A, 223E/K로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C7. 상기한 항 C의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121, 161 및 223으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C8. 상기한 항 C의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 121F/Y/W, 161A, 223E/K로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C9. 상기한 항 C의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 134, 141, 157, 223, 307, 334 위치로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상, 더욱 바람직하게는 전부의 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C10. 상기한 항 C의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 33 및 34 위치 중의 하나 또는 모두에서의 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C11. 항 C10에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P 및 선택적으로는 N33Y 및 D34N 중의 하나 또는 모두로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상, 더욱 바람직하게는 전부의 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 C12. 상기한 항 C의 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는
(a) 121 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 121D, 더욱 바람직하게는 G121D;
(b) 178 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 178F, 더욱 바람직하게는 L178F;
(c) 179 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 179T, 더욱 바람직하게는 A179T; 및/또는
(d) 87 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 87SF, 더욱 바람직하게는 G87S를
더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 D1. 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라제 서열의 위치 번호를 참고로 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 및 353으로 구 성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서의 아미노산 돌연변이를 포함한, 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 모폴리펩타이드로부터 유도 가능한 PS4 변이 폴리펩타이드
항 D2. 항 D1에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 146G, 146M, 157M, 158T, 158A, 158S, 198W, 198F, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P, 316K, 316Q 및 353T로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 D3. 항 D1에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P 또는 353T로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 D4. 항 D1에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 33, 34, 121, 134, 141, 157, 161, 178, 179, 223, 307 및 334 위치로 구성된 군, 바람직하게는 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
D5. 항 D1에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 하기 돌연변이 각각을 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드:
(a) 바람직하게는 서열번호: 15 서열을 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P;
(b) 바람직하게는 서열번호: 16을 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157M, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P;
(c) 바람직하게는 서열번호: 17을 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 158T, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P;
(d) 바람직하게는 서열번호: 18을 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 198W, 223E, 307L 및 334P;
(e) 바람직하게는 서열번호: 19를 지닌 33Y, 34N5 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307L 및 34P;
(f) 바람직하게는 서열번호: 20을 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 198W, 223E, 229P, 307L 및 334P;
(g) 바람직하게는 서열번호: 21을 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 303E, 307L 및 334P;
(h) 바람직하게는 서열번호: 22를 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 303D, 307L 및 334P;
(i) 바람직하게는 서열번호: 23을 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 306T, 307L 및 334P;
(j) 바람직하게는 서열번호: 24를 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 306G, 307L 및 334P;
(k) 바람직하게는 서열번호: 25를 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 309P, 307L 및 334P;
(l) 바람직하게는 서열번호: 66을 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 316S 및 334P;
(m) 바람직하게는 서열번호: 27을 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 316P 및 334P; 및
(n) 바람직하게는 서열번호: 28을 지닌 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 334P 및 353T.
항 13. 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 모폴리펩타이드는 넌-말토제닉 엑소아밀라제, 바람직하게는 글루칸 1,4-알파-말토테트라하이드롤라제(EC 3.2.1.60)를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 14. 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 모폴리펩타이드는 슈도모나스종, 바람직하게는 슈도모나스 사카로필라 또는 슈도모나스 사카로필라 스투트제리이거나 이로부터 유도 가능함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 15. 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 모폴리펩타이드는 서열번호: 1 또 는 서열번호: 5에 나타난 서열을 지닌 슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라제 유래의 넌-말토제닉 엑소아밀라제임을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 16. 항 A1 내지 항 A12, 항 B1 내지 항 B12, 항 C1 내지 항 C12, 항 13 및 항 14의 어느 한 항에 있어서, 상기 모폴리펩타이드는 서열번호: 7 또는 서열번호: 11에 나타난 서열을 지닌 슈도모나스 스투트제리 유래의 넌-말토제닉 엑소아밀라제임을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 17. 상기한 어느 한 항에 있어서, 설명, 항 및 도면에 나타난 서열을 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 18. 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 동일한 조건 하에서 시험시 모폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교시 더 높은 열안정성을 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 19. 상기한 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 60℃에서의 반감기(t1/2)가 모폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드 대비 15% 이상, 바람직하게는 50% 이상 증가됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 20. 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 동일한 조건 하에서 시험시 모폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교시 더 높은 엑소-특이성을 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 21. 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 모폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교시 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상의 엑소-특이성을 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
항 22. 상기한 어느 한 항에 나타난 PS4 변이 폴리펩타이드의 식품 첨가제로의 이용
항 23. 전분을 항 A1 내지 A12, 항 B1 내지 B12, 항 C1 내지 C12, 항 D1 내지 D5 및 항 13 내지 21의 어느 한 항에 나타난 PS4 변이 폴리펩타이드에 접촉시키는 단계 및 상기 폴리펩타이드가 상기 전분으로부터 하나 이상의 선형 생성물을 생성시키도록 하는 단계를 포함한 전분의 처리 방법
항 24. 식품 제조시 항 A1 내지 A12, 항 B1 내지 B12, 항 C1 내지 C12, 항 D1 내지 D5 및 항 13 내지 21의 어느 한 항에 나타난 PS4 변이 폴리펩타이드의 이용
항 25. 항 A1 내지 A12, 항 B1 내지 B12, 항 C1 내지 C12, 항 D1 내지 D5 및 항 13 내지 21의 어느 한 항에 나타난 폴리펩타이드를 식품 성분과 혼합시키는 단계를 포함한 식품의 제조 방법
항 26. 항 24 또는 항 25에 있어서, 상기 식품은 반죽 또는 반죽 제품, 바람직하게는 가공된 반죽 제품을 포함함을 특징으로 하는 이용 또는 방법
항 27. 항 24 내지 26에 있어서, 상기 식품은 베이커리 제품임을 특징으로 하는 이용 또는 방법
항 28. (a) 전분 매질을 제공하는 단계; (b) 항 A1 내지 A12, 항 B1 내지 B12, 항 C1 내지 C12, 항 D1 내지 D5 및 항 13 내지 21의 어느 한 항에 나타난 PS4 변이 폴리펩타이드를 상기 전분 매질에 첨가하는 단계; 및 (c) 단계 (b) 동안 또는 그 후 상기 전분 매질에 열을 가하여 베이커리 제품을 생산하는 단계를 포함한 베이커리 제품의 제조 방법
항 29. 항 24 내지 28의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 식품, 반죽 제품 또는 베이커리 제품
항 30. 항 A1 내지 A12, 항 B1 내지 B12, 항 C1 내지 C12, 항 D1 내지 D5 및 항 13 내지 21의 어느 한 항에 나타난 PS4 변이 폴리펩타이드 및 적어도 하나 이상의 또다른 반죽 성분 또는 반죽 첨가제를 포함한 반죽용 식품첨가물 조성물
항 31. 밀가루 및 항 1 내지 21의 어느 한 항에 나타난 PS4 변이 폴리펩타이드를 포함한 조성물
항 32. 반죽 제품의 부패, 바람직하게는 유해한 퇴화를 지연시키거나 감소시키기 위한 반죽 제품 내에서의 항 A1 내지 A12, 항 B1 내지 B12, 항 C1 내지 C12, 항 D1 내지 D5 및 항 13 내지 21의 어느 한 항에 나타난 PS4 변이 폴리펩타이드의 이용
항 33. 말토제닉 알파-아밀라제 활성을 지닌 노바밀(Novamyl) 또는 그의 변이체, 상동체 또는 돌연변이체와 상기한 어느 한 항에 나타난 PS4 변이 폴리펩타이드의 화합물
항 34. 상기한 어느 한 항에 따른 적용을 위한 항 33에 따른 화합물의 이용
항 35. 항 34에 따른 화합물로의 처리에 의해 제조된 식품
항 36. 항 A1 내지 A12, 항 B1 내지 B12, 항 C1 내지 C12, 항 D1 내지 D5 및 항 13 내지 21의 어느 한 항에 나타난 PS4 변이 폴리펩타이드를 포함한 식품 첨가제
참고문헌
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심사중인 출원 및 특허를 포함하여 본 출원서에 기술된 출원 및 특허 및 상기 출원 및 특허에 인용된 문헌 및 출원("출원 인용 문헌") 및 특허에 인용되거나 기술된 제품의 제조사 지침서 또는 카탈로그는 참고문헌에 포함된다. 더욱이 본 명세서에 인용된 모든 문헌 및 본 명세서에 인용된 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌 및 본 명세서 내에 인용되거나 기술된 모든 제품의 제조사 지침서가 참고문헌에 포함된다.
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SEQUENCE LISTING <110> DANISCO A/S AND GENENCOR INTERNATIONAL INC <120> POLYPEPTIDE <130> P020161WO <140> PCT/GB2005/002675 <141> 2005-07-07 <150> US 60/608,919 <151> 2004-07-07 <150> US 60/612,407 <151> 2004-09-22 <150> US 10/886,505 <151> 2004-07-07 <150> US 10/886,527 <151> 2004-07-07 <150> US 10/886,504 <151> 2004-07-07 <150> US 10/947,612 <151> 2004-09-22 <160> 55 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 530 <212> PRT <213> Pseudomonas saccharophila <400> 1 Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro 20 25 30 Asn Asp Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp 65 70 75 80 His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp 100 105 110 Val Val Pro Asn 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Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp 100 105 110 Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Phe Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn 115 120 125 Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly 130 135 140 Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Glu 145 150 155 160 Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp 165 170 175 Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe 180 185 190 Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser 195 200 205 Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Glu Pro 210 215 220 Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln 225 230 235 240 Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys His 260 265 270 Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr 275 280 285 Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly 290 295 300 Gln His Leu Trp Pro Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala 305 310 315 320 Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met 325 330 335 Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg 340 345 350 Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly 355 360 365 Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val 370 375 380 Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly 385 390 395 400 Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp 405 410 415 Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly 420 425 <210> 26 <211> 429 <212> PRT <213> Pseudomonas saccharophila <400> 26 Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro 20 25 30 Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp 65 70 75 80 His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp 100 105 110 Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Phe Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn 115 120 125 Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly 130 135 140 Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Glu 145 150 155 160 Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp 165 170 175 Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe 180 185 190 Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser 195 200 205 Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Glu Pro 210 215 220 Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln 225 230 235 240 Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys His 260 265 270 Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr 275 280 285 Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly 290 295 300 Gln His Leu Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Ser Gln Ala Tyr Ala 305 310 315 320 Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met 325 330 335 Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg 340 345 350 Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly 355 360 365 Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val 370 375 380 Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly 385 390 395 400 Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp 405 410 415 Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly 420 425 <210> 27 <211> 429 <212> PRT <213> Pseudomonas saccharophila <400> 27 Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro 20 25 30 Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp 65 70 75 80 His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp 100 105 110 Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Phe Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn 115 120 125 Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly 130 135 140 Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Glu 145 150 155 160 Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp 165 170 175 Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe 180 185 190 Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser 195 200 205 Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Glu Pro 210 215 220 Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln 225 230 235 240 Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys His 260 265 270 Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr 275 280 285 Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly 290 295 300 Gln His Leu Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Pro Gln Ala Tyr Ala 305 310 315 320 Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met 325 330 335 Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg 340 345 350 Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly 355 360 365 Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val 370 375 380 Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly 385 390 395 400 Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp 405 410 415 Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly 420 425 <210> 28 <211> 429 <212> PRT <213> Pseudomonas saccharophila <400> 28 Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro 20 25 30 Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp 65 70 75 80 His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp 100 105 110 Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Phe Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn 115 120 125 Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly 130 135 140 Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Glu 145 150 155 160 Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp 165 170 175 Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe 180 185 190 Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser 195 200 205 Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Glu Pro 210 215 220 Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln 225 230 235 240 Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys His 260 265 270 Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr 275 280 285 Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly 290 295 300 Gln His Leu Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala 305 310 315 320 Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met 325 330 335 Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg 340 345 350 Thr Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly 355 360 365 Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val 370 375 380 Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly 385 390 395 400 Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp 405 410 415 Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly 420 425 <210> 29 <211> 21 <212> PRT <213> Pseudomonas saccharophila <400> 29 Met Ser His Ile Leu Arg Ala Ala Val Leu Ala Ala Val Leu Leu Pro 1 5 10 15 Phe Pro Ala Leu Ala 20 <210> 30 <211> 101 <212> PRT <213> Pseudomonas saccharophila <400> 30 Glu Gly Gly Leu Val Asn Val Asn Phe Arg Cys Asp Asn Gly Val Thr 1 5 10 15 Gln Met Gly Asp Ser Val Tyr Ala Val Gly Asn Val Ser Gln Leu Gly 20 25 30 Asn Trp Ser Pro Ala Ser Ala Val Arg Leu Thr Asp Thr Ser Ser Tyr 35 40 45 Pro Thr Trp Lys Gly Ser Ile Ala Leu Pro Asp Gly Gln Asn Val Glu 50 55 60 Trp Lys Cys Leu Ile Arg Asn Glu Ala Asp Ala Thr Leu Val Arg Gln 65 70 75 80 Trp Gln Ser Gly Gly Asn Asn Gln Val Gln Ala Ala Ala Gly Ala Ser 85 90 95 Thr Ser Gly Ser Phe 100 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 31 atgacgaggt ccttgttttt c 21 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 32 cgctagtcgt ccatgtcg 18 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucelotide primer <400> 33 gccatggatc aggccggcaa gagcccg 27 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 34 tggatcctca gaacgagccg ctggt 25 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 35 gaattcagcc gccgtcattc ccgcc 25 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 36 agatttacgg catgtttcgc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 37 tagccgctat ggaagctgat 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 38 tgaccttcgt cgacaaccac 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 39 gatagctgct ggtgacggtc 20 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 40 ctgccggccg gccagcgctt ctggcg 26 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 41 cgccagaagc gctggccggc cggcag 26 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 42 gacggtgacc gcttcctggg cggcgagtcg 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 43 cgactcgccg cccaggaagc ggtcaccgtc 30 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 44 ggcgagctgt ggaaagcccc ttctgaatat ccg 33 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 45 cggatattca gaaggggctt tccacagctc gcc 33 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 46 gaacggcggc cagcacctgt gggcgctgca g 31 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 47 ctgcagcgcc cacaggtgct ggccgccgtt c 31 <210> 48 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 48 gtactggccg cacatgtacg actggggcta cggcgaattc atc 43 <210> 49 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 49 gatgaattcg ccgtagcccc agtcgtacat gtgcggccag tac 43 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 50 gcgaagcgcc ctacaactgg tacaac 26 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 51 ccgacggcgg caggtccggc g 21 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 52 caagaacagc cgctacggca gcgac 25 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 53 cacatgaacc gcgactaccc ggacaag 27 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 54 cgcaacgact gcgccgaccc ggg 23 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 55 cgcgacgagt ttaccaacct gcg 23

Claims (64)

  1. 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라(Pseudomonas saccharophilia)의 아미노산 잔기 번호를 기초로하여, 121F, 121Y, 121W, 161A, 223E, 223K, 146G, 146M, 157M, 158T, 158A, 158S, 198W, 198F, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P, 316K, 316Q, 353T, 26E, 70D, 145D, 188S, 188T, 188H, 272Q, 339A 및 339E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 모 폴리펩타이드로부터 유래된 PS4 변이 폴리펩타이드에 있어서,
    상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 동일한 조건 하에서 시험시 모 폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교시 높은 열안정성을 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  4. 제 1항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 하기 각각의 변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드:
    (a) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P;
    (b) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157M, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P;
    (c) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 158T, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L 및 334P;
    (d) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 198W, 223E, 307L 및 334P;
    (e) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307L 및 334P;
    (f) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 198W, 223E, 229P, 307L 및 334P;
    (g) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 303E, 307L 및 334P;
    (h) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 303D, 307L 및 334P;
    (i) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 306T, 307L 및 334P;
    (j) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 306G, 307L 및 334P;
    (k) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 309P, 307L 및 334P;
    (1) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 316S 및 334P;
    (m) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 316P 및 334P;
    (n) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 334P 및 353T.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 하기 각각의 변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드:
    (a) N26E , N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L, S334P;
    (b) N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, G158T, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307L, A309P, S334P;
    (c) N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, N145D, Y146G, I157L, G158T, S161A, Ll78F, A179T, G223E, S229P, H307L, A309P, S334P;
    (d) N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, N145D, Y146G, I157L, G158T, S161A, L178F, A179T, G188H, G223E, S229P, H307L, A309P, S334P, W339E;
    (e) N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, N145D, Y146G, I157L, G158T, S161A, L178F, A179T, G188S, G223E, S229P, H307L, A309P, S334P, W339E;
    (f) N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, G158T, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307L, A309P, S334P, W339A;
    (g) N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, G158T, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307L, A309P, S334P, W339E.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 87 위치에서의 변이를 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  7. 제 1항에 있어서, 상기 모 폴리펩타이드는 슈도모나스속으로부터 유래함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  8. 제 7항에 있어서, 상기 모 폴리펩타이드는 슈도모나스 사카로필라 또는 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri)로부터 유래함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  9. 제 1항에 있어서, 상기 모 폴리펩타이드는 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4에 나타난 서열을 지닌 슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라제 유래의 넌-말토제닉 엑소아밀라제임을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 1항에 있어서, 상기 변이 폴리펩타이드는 PSac-D34(서열번호: 2), PSac-D20(서열번호: 3), PSac-D14(서열번호: 4), PStu-D34(서열번호: 8), PStu-D20(서열번호: 9), PStu-D14(서열번호: 10), pMD55 (서열번호: 13), pMD96(서열번호: 14), SSM 381(서열번호: 15), SSM279 Bl(서열번호: 16), SSM237 P2(서열번호: 17, 서열번호: 18), SSM325 F3(서열번호: 19), pMD129(서열번호: 20), SSM341 A9(서열번호: 21), SSM341 G1l(서열번호: 22), SSM350 B1l(서열번호: 23), SSM350 Cl2(서열번호: 24), SSM332 Q4(서열번호: 25), SSM365 B4(서열번호: 26), SSM365 F4(서열번호: 27) 및 SSM360 C7(서열번호: 28)로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  15. 삭제
  16. 제 1항에 있어서, 상기 변이 폴리펩타이드의 60℃에서의 반감기(t1/2)는 모 폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드 대비 15% 이상 증가됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  17. 제 1항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 동일한 조건 하에서 시험시 모 폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교시 더 높은 엑소-특이성을 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  18. 제 17항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교시 10% 이상의 엑소 특이성을 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  19. 삭제
  20. PS4 변이 폴리펩타이드의 모폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교시 더 높은 열안정성 또는 더 높은 엑소-특이성 또는 둘 모두를 지닌 제 1항에 따른 PS4 변이 폴리펩타이드로부터 유래한 폴리펩타이드
  21. 삭제
  22. 전분을 제 1항에 나타난 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및
    상기 폴리펩타이드가 상기 전분으로부터 하나 이상의 선형 폴리사카라이드 생성물을 생성시키도록 하는 단계;
    를 포함하는 전분의 처리 방법
  23. 삭제
  24. 제 1항에 나타난 폴리펩타이드를 식품 또는 사료 성분과 혼합하는 단계를 포함하는 식품 또는 사료 제품의 제조 방법
  25. 제 24항에 있어서, 상기 식품은 반죽, 반죽 제품, 가공된 반죽 제품을 포함함을 특징으로 하는 제조 방법
  26. 제 25항에 있어서, 상기 식품은 베이커리 제품임을 특징으로 하는 제조 방법
  27. (a) 전분 배지를 제공하는 단계;
    (b) 상기 전분 배지에 제 1항의 폴리펩타이드를 첨가하는 단계; 및
    (c) 단계 (b) 시행 중 또는 그 후 상기 전분 배지에 열을 가하여 베이커리 제품을 제조하는 단계;
    를 포함하는 베이커리 제품의 제조 방법
  28. 제 27항에 따른 방법에 의해 수득된 식품
  29. 제 1항의 폴리펩타이드 및 하나 이상의 또다른 반죽 성분 또는 반죽 첨가제를 포함하는 개량된 반죽용 조성물
  30. 밀가루 및 제 1항의 폴리펩타이드를 포함한 조성물
  31. 반죽 제품의 부패, 퇴화를 지연시키거나 감소시키기 위한 반죽 제품 내에서의 제 1항의 PS4 변이 폴리펩타이드의 사용 방법
  32. 바실러스로부터 유래된 말토제닉 알파-아밀라제와 제 1항의 PS4 변이 폴리펩타이드를 포함하는 조성물
  33. 삭제
  34. 제 32항에 따른 조성물로 처리하여 제조된 식품
  35. 제 1항의 폴리펩타이드를 암호화시킨 핵산
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 제 35항의 핵산을 포함하거나 제 1항의 폴리펩타이드를 발현하는 것이 가능한 발현 벡터
  42. 제 41항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포
  43. 제 1항의 폴리펩타이드를 발현하는 것이 가능한 세포
  44. 삭제
  45. 제 42항의 숙주 세포를 수득하는 단계 및 상기 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 PS4 변이 폴리펩타이드의 발현 방법
  46. 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라제 서열의 아미노산 잔기 번호를 기초로 하여 (a) 121F, 121Y, 121W, 161A, 223E, 223K; (b) 146G, 146M, 157M, 158T, 158A, 158S, 198W, 198F, 229P, 303E, 3O3D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P, 316K, 316Q, 353T; 및 (c) 26E, 70D, 145D, 188S, 188T, 188H, 272Q, 339A, 339E로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 넌-말토제닉 엑소아밀라제 활성을 지닌 모 폴리펩타이드 내로 도입시킴으로서 폴리펩타이드의 서열을 변화시키는 방법
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 제 46항에 나타난 단계를 포함한 폴리펩타이드의 서열을 변화시키는 방법을 통해 폴리펩타이드 열안정성, 엑소-특이성 또는 이들 모두를 증가시키는 방법
  53. 제 45항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 분리, 정제 또는 분리 및 정제시킴을 특징으로 하는 방법
  54. 제 45항의 방법에 의해 수득 가능한 폴리펩타이드
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 제 16항에 있어서, 상기 변이 폴리펩타이드의 60℃에서의 반감기(t1/2)는 모 폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드 대비 50% 이상 증가됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  58. 제 16항에 있어서, 상기 변이 폴리펩타이드의 60℃에서의 반감기(t1/2)는 모 폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드 대비 100% 이상 증가됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  59. 제 17항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교시 20% 이상의 엑소 특이성을 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  60. 제 17항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교시 50% 이상의 엑소 특이성을 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  61. 제 1항에 있어서, 상기 변이 폴리펩타이드는 넌-말토제닉 엑소아밀라제에 존재하는 시그널 서열이 결실되어 있음을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  62. 제 1항에 있어서, 상기 변이 폴리펩타이드는 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라(Pseudomonas saccharophilia)의 아미노산 잔기 번호를 기초로하여 429 위치 이후의 아미노산 잔기에 상응하는 전분 결합 도메인이 결실되어 있음을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩타이드
  63. 제 35항에 있어서, 상기 핵산은 넌-말토제닉 엑소아밀라제에 존재하는 시그널 서열이 결실되어 있는 변이 폴리펩타이드를 암호화함을 특징으로 하는 핵산
  64. 제 35항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호: 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라(Pseudomonas saccharophilia)의 아미노산 잔기 번호를 기초로하여 429 위치 이후의 아미노산 잔기에 상응하는 전분 결합 도메인이 결실된 변이 폴리펩타이드를 암호화함을 특징으로 하는 핵산
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E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20130329

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20120831

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

Patent event date: 20111222

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
PJ0201 Trial against decision of rejection

Patent event date: 20130408

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event code: PJ02012R01D

Patent event date: 20130329

Comment text: Decision to Refuse Application

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Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal

Decision date: 20130930

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Request date: 20130408

PB0901 Examination by re-examination before a trial

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20130408

Patent event code: PB09011R02I

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event date: 20130408

Patent event code: PB09011R01I

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20121029

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Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20120322

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E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20130529

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B701 Decision to grant
PB0701 Decision of registration after re-examination before a trial

Patent event date: 20130930

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Patent event date: 20130509

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