ES2658856T3 - Variantes de exoamilasa no maltogénica - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido variante PS4 que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica con la SEQ ID Nº: 15 que tiene actividad de exoamilasa no maltogénica, donde dicho polipéptido variante PS4 tiene una mutación de aminoácido Y146G con referencia a la numeración de posiciones de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1, y en la que dicho polipéptido tiene una termoestabilidad más alta comparada con el polipéptido de la SEQ ID NO: 1 cuando se ensaya en las mismas condiciones.
Description
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Sin embargo, estará claro para el lector experto que, aunque los polipéptidos variantes PS4 pueden derivarse mutando secuencias ya mutadas, es posible construir dichos polipéptidos variantes empezando a partir de una secuencia de tipo salvaje (o de hecho cualquier secuencia adecuada), identificando las diferencias entre la secuencia de partida y la variante deseada, e introduciendo las mutaciones requeridas en la secuencia de partida con el fin de conseguir la variante deseada.
Las proteínas y ácidos nucleicos relacionados con, preferiblemente que tienen homología de secuencia o funcional, con la secuencia de exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1 o una exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas stutzeri que tiene una secuencia mostrada como SEQ ID NO: 11 se refieren en este documento como miembros de la "familia PS4". Los ejemplos de enzimas exoamilasa no maltogénica de la "familia PS4 " adecuadas para uso en la generación de los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 se describen con más detalle más adelante.
Los polipéptidos variantes PS4 descritos en este documento preferiblemente retienen las características de los polipéptidos parentales, y adicionalmente preferiblemente tienen propiedades beneficiosas adicionales, por ejemplo, actividad o termoestabilidad aumentadas, o resistencia a pH, o cualquier combinación (preferiblemente todas). Esto se describe con más detalle más adelante.
Los mutantes de sustitución PS4 descritos aquí pueden usarse para cualquier propósito adecuado. Pueden usarse preferiblemente para propósitos para los que es adecuada la enzima parental. En particular, pueden usarse en cualquier aplicación para la que se usa la exo-maltotetraohidrolasa. Los mutantes según la invención tienen la ventaja añadida de una mayor termoestabilidad. También pueden tener una mayor actividad exoamilasa o mayor estabilidad en pH, o cualquier combinación. Los ejemplos de usos adecuados para los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 incluyen producción de alimentos, en particular panadería, así como producción de productos alimenticios; los ejemplos adicionales se muestran con detalle más adelante.
Los polipéptidos variantes PS4 pueden comprender una o más mutaciones adicionales además de las posiciones mostradas anteriormente. Pueden ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más mutaciones preferiblemente sustituciones además de las ya mostradas. También pueden incluirse otras mutaciones, tales como deleciones, inserciones, sustituciones, transversiones, transiciones e inversiones, en una o más localizaciones. Además, las variantes PS4 no necesitan tener todas las sustituciones en las posiciones listadas. De hecho, pueden tener una, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones ausentes, es decir, el residuo de aminoácido de tipo salvaje está presente en dichas posiciones.
Polipéptidos variantes PS4 basados en secuencias de tipo salvaje
Cuando el polipéptido parental comprende una secuencia de tipo salvaje, los polipéptidos variantes PS4 pueden comprender una secuencia de tipo salvaje, pero con una mutación en una cualquiera o más de las posiciones 121, 161 y 223, preferiblemente 121F, 121Y, 121W, 161A, 223E ó 223K, más preferiblemente G121F, G121Y, G121W, S161A, G223E o G223K.
Los polipéptidos variantes PS4 pueden comprender una secuencia de tipo salvaje, o una secuencia como se muestra en el párrafo precedente, pero con una mutación en una cualquiera o más de las posiciones 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 ó 353, preferiblemente 146G, 146M, 157M, 158T, 158A, 158S, 198W, 198F, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P, 316K, 316Q ó 353T, más preferiblemente 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P ó 353T.
Los polipéptidos variantes PS4 pueden comprender una secuencia de tipo salvaje, o una secuencia como se muestra en los dos párrafos precedentes, pero con una mutación en una cualquiera o más de las posiciones 26, 70, 145, 188, 272 ó 339, preferiblemente 26E, 26D, 70D, 145D, 188S, 188T, 188H, 272Q, 339A ó 339E, más preferiblemente N26E, N26D, G70D, N145D, G188S, G188T, G188H, H272Q, W339A o W339E.
En general, cualquier combinación de las posiciones, sustituciones y mutaciones específicas puede combinarse de cualquier manera y en cualquier número para producir los polipéptidos variantes PS4 descritos en la presente memoria.
Así, describimos polipéptidos variantes PS4 basados en una secuencia parental PS4 de tipo salvaje, preferiblemente, una exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas saccharophilia que tiene una secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1. Así, el polipéptido variante PS4 puede comprender una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, pero con una cualquiera o más mutaciones en las posiciones mostradas anteriormente. Los polipéptidos variantes PS4 también pueden estar basados en una secuencia de enzima no maltogénica de Pseudomonas stutzeri de tipo salvaje mostrada como SEQ ID NO: 7 más adelante, pero con una cualquiera o más mutaciones en las posiciones mostradas anteriormente.
Aunque los polipéptidos variantes PS4 pueden estar basados en secuencias parentales PS4 de tipo salvaje, los polipéptidos variantes PS4 están basados preferiblemente en versiones preparadas por ingeniería (o mutadas) de secuencias parentales PS4 de tipo salvaje. De acuerdo con esto, las secuencias parentales comprenden secuencias
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PS4 ya mutadas. Dichas secuencias pueden hacerse de novo, o mediante mutación de una secuencia base, una o más veces, como se describe con más detalle más adelante.
Posiciones 121, 161 y/o 223
El polipéptido variante PS4 puede comprender una secuencia de tipo salvaje, o secuencia mutante siendo una variante de una secuencia de tipo salvaje, tal como una secuencia ya mutada, con sustituciones en una o más posiciones tales como 121, 161 y 223.
Así, en general, la mutación o mutaciones objeto en la posición o posiciones relevantes pueden combinarse ventajosamente con una única mutación adicional en una, dos o todas las posiciones 121, 161 ó 223.
La sustitución en la posición 121, cuando está presente, se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en: 121F, 121Y, 121W, 121H, 121A, 121M, 121G, 121S, 121T, 121D, 121E, 121L, 121K y 121V. Preferiblemente, la sustitución en la posición 121 es 121F, 121Y ó 121W. La sustitución en la posición 161, cuando está presente, es preferiblemente 161A, más preferiblemente S161A. Cuando la posición 161 está mutada, también puede estar presente una mutación adicional en la posición 160, preferiblemente 160D, más preferiblemente E160D.
La sustitución en la posición 223, cuando está presente, se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en: 223K, 223E, 223V, 223R, 223A, 223P y 223D. Más preferiblemente, la sustitución 223 es 223E ó 223K. En realizaciones particularmente preferidas, la sustitución o sustituciones adicionales se seleccionan del grupo que consiste en: G121F, G121Y, G121W, 161A, 223E y 223K.
En una realización particularmente preferida, el polipéptido variante PS4 comprende al menos las tres sustituciones siguientes 121F/Y/W, 161A, 223E/K. También pueden incluirse otras mutaciones, como se muestra más adelante.
Posiciones 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 y 353
El polipéptido variante PS4 puede comprender una secuencia de tipo salvaje, o secuencia mutante siendo una variante de una secuencia de tipo salvaje, tal como una secuencia ya mutada -incluyendo un polipéptido variante PS4 que tiene una mutación en una o más de las posiciones 121, 161 y 223 -con sustituciones en una o más posiciones tal como las posiciones 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 y 353.
Posiciones 26, 70, 145, 188, 272 y 339
El polipéptido variante PS4 puede comprender una secuencia de tipo salvaje, o secuencia mutante siendo una variante de una secuencia de tipo salvaje, tal como una secuencia ya mutada -incluyendo un polipéptido variante PS4 que tiene una mutación en una o más de las posiciones 121, 161, 223, 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 y 353.-con sustituciones en una o más posiciones tal como 26, 70, 145, 188, 272 y 339.
Así, en general, la mutación o mutaciones objeto en la posición o posiciones relevantes pueden combinarse ventajosamente con una única mutación adicional en una, dos o todas las posiciones 26, 70, 145, 188, 272 y 339.
El polipéptido variante PS4 puede comprender una sustitución en la posición 26, preferiblemente 26E ó 26E. Más preferiblemente, la sustitución en la posición 26 comprende N26E o N26D. Lo más preferiblemente, la sustitución en la posición 26 comprende N26E.
El polipéptido variante PS4 puede comprender una sustitución en la posición 70, preferiblemente 70D. Más preferiblemente, la sustitución en la posición 26 comprende G70D.
El polipéptido variante PS4 puede comprender una sustitución en la posición 145, preferiblemente 145D. Más preferiblemente, la sustitución en la posición 145 comprende N145D.
El polipéptido variante PS4 puede comprender una sustitución en la posición 188, preferiblemente 188S, 188T ó 188H. Más preferiblemente, la sustitución en la posición 188 comprende G188S, G188T o G188H. Lo más preferiblemente, la sustitución en la posición 188 comprende G188S o G188H.
El polipéptido variante PS4 puede comprender una sustitución en la posición 272, preferiblemente 272Q. Más preferiblemente, la sustitución en la posición 272 comprende H272Q.
El polipéptido variante PS4 puede comprender una sustitución en la posición W339A, preferiblemente 339A ó 339E. Más preferiblemente, la sustitución en la posición 339 comprende W339A o W339E
Polipéptidos variantes PS4 basados en secuencias variantes
Combinaciones con las posiciones 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 y/o 334
En algunas realizaciones, las secuencias parentales comprenden mutaciones en una o más de, preferiblemente todas, las posiciones 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 y 334 (y de acuerdo con esto los polipéptidos variantes PS4 también contendrán las mutaciones relevantes correspondientes).
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En dichas realizaciones, las mutaciones son preferiblemente una o más de, preferiblemente todas de: N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L y S334P.
En dichas realizaciones, el polipéptido variante PS4 puede derivarse convenientemente de una secuencia de enzima no maltogénica de Pseudomonas saccharophila que comprende una secuencia PSac-D34 (SEQ ID NO: 2).
Combinaciones con las posiciones 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 y 334, 121, 161 y/o 223
Los polipéptidos variantes PS4 pueden comprender además mutaciones en cualquiera de las posiciones 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 y 334 en combinación con mutaciones en cualquiera de las posiciones 121, 161 y/o 223. Así, describimos un polipéptido variante PS4 que comprende cualquier combinación de: (a) una cualquiera o más de las mutaciones en los residuos 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 y 334, preferiblemente N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L y S334P; (b) una cualquiera o más de las mutaciones en las posiciones 121, 161 ó 223, preferiblemente 121F, 121Y, 121W, 161A, 223E ó 223K, más preferiblemente 121F, 161A ó 223E, y (c) una cualquiera o más de las mutaciones en las posiciones 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 ó 353, preferiblemente 146G, 146M, 157M, 158T, 158A, 158S, 198W, 198F, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P, 316K, 316Q ó 353T, más preferiblemente 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P ó 353T.
En la presente memoria se describe un polipéptido variante PS4 que comprende todas de las mutaciones siguientes mostradas en (a) anteriormente en combinación con una o más de las mutaciones mostradas en (c) anteriormente. También se describe en la presente memoria un polipéptido variante PS4 que comprende todas de las mutaciones siguientes mostradas en (a) anteriormente en combinación con todas las mutaciones mostradas en (b) anteriormente, en combinación con una o más de las mutaciones mostradas en (c) anteriormente.
Polipéptidos variantes PS4 basados en pMD96
Cuando se incluyen las mutaciones en todos de (a) y (b), el polipéptido variante PS4 puede derivarse convenientemente de una secuencia de enzima no maltogénica de Pseudomonas saccharophila que comprende una secuencia pMD96 (SEQ ID NO: 14).
Así, en la presente memoria se describen polipéptidos variantes PS4 mostrados en los Ejemplos 12 a 20, que tienen secuencias SEQ ID NO: 15 a 28. Como se muestra en los Ejemplos, cada uno de estos polipéptidos tiene una o más propiedades mejoradas comparado con su parental.
Otras combinaciones
Además, también pueden usarse secuencias parentales que comprenden mutaciones en otras posiciones, por ejemplo, una cualquiera o más de 134, 141, 157, 223, 307 y 334. Opcionalmente, éstas pueden incluir mutaciones en una o ambas de las posiciones 33 y 34.
Así, la secuencia parental puede comprender una o más mutaciones en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 134, 141, 157, 223, 307, 334 y opcionalmente 33 y 34, (y de acuerdo con esto por supuesto los polipéptidos variantes PS4 también contendrán las mutaciones relevantes correspondientes).
En algunas realizaciones, los polipéptidos parentales comprenden sustituciones arginina en la posición 134, prolina en la posición 141 y prolina en la posición 334, por ejemplo, G134R, A141P y S334P.
En realizaciones adicionales, el polipéptido parental comprende además una mutación en la posición 121. El polipéptido parental puede comprender además una mutación en la posición 178. Puede comprender además una mutación en la posición 179. Puede comprender aún además una mutación en la posición 87. Las sustituciones respectivas particularmente preferidas son preferiblemente 121D, más preferiblemente G121D, preferiblemente 178F, más preferiblemente L178F, preferiblemente 179T, más preferiblemente A179T y preferiblemente 87S, más preferiblemente G87S.
Los residuos en estas posiciones pueden sustituirse por un número de residuos, por ejemplo, I157V o I157N o G223L o G223I o G223S o G223T o H307I o H307V o D34G o D34A o D34S o D34T o A179V. Sin embargo, los polipéptidos parentales preferiblemente comprenden las sustituciones I157L, G223A, H307L, L178F y A179T (opcionalmente N33Y, D34N).
En una realización altamente preferida, los polipéptidos variantes PS4 comprenden una sustitución en una cualquiera o más de las posiciones 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 y 353, preferiblemente 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P ó 353T, así como una o más de las sustituciones siguientes: G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y y D34N, junto con una o ambas de L178F y A179T.
Polipéptidos variantes PS4 basados en PSac-D20
Una variante PS4 puede estar basada en una secuencia de enzima no maltogénica parental de Pseudomonas saccharophila, PSac-D20 (SEQ ID NO: 3).
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La secuencia de referencia se deriva de la secuencia de Pseudomonas saccharophilia que tiene el número de acceso SWISS-PROT P22963, pero sin la secuencia señal MSHILRAAVLAAVLLPFPALA.
El dominio de unión a almidón C-terminal EGGLVNVNFR CDNGVTQMGD SVYAVGNVSQ LGNWSPASAV RLTDTSSYPT WKGSIALPDG QNVEWKCLIR NEADATLVRQ WQSGGNNQVQ AAAGASTSGS F puede ignorarse opcionalmente. Alternativamente, puede incluirse.
En el contexto de la presente descripción, se emplea una numeración específica de posiciones de residuos de aminoácidos en las enzimas exoamilasa PS4. A este respecto, mediante el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de varias exoamilasas conocidas, es posible asignar sin ambigüedad un número de posición de aminoácido de exoamilasa a cualquier posición de residuo de aminoácido en cualquier enzima exoamilasa, cuya secuencia de aminoácidos es conocida. Usando el sistema de numeración que se origina por ejemplo de la secuencia de aminoácidos de la exoamilasa obtenida de Pseudomonas saccharophilia, alineada con secuencias de aminoácidos de varias otras exoamilasas conocidas, es posible indicar la posición de un residuo de aminoácido en una exoamilasa sin ambigüedad.
Por lo tanto, el sistema de numeración, aunque puede usar una secuencia específica como un punto de referencia básico, también es aplicable a todas las secuencias homólogas relevantes. Por ejemplo, la numeración de posición puede aplicarse a secuencias homólogas de otras especies de Pseudomonas, o secuencias homólogas de otras bacterias. Preferiblemente, dichos homólogos tienen 60% o más de homología, por ejemplo 70% o más, 80% o más, 90% o más ó 95% o más de homología, con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 1 anterior, o las secuencias que tienen números de acceso SWISS-PROT P22963 o P13507, preferiblemente con todas estas secuencias. La homología de secuencia entre proteínas puede averiguarse usando programas de alineamiento muy conocidos y técnicas de hibridación descritas en la presente memoria. Dichas secuencias homólogas, así como los equivalentes funcionales descritos más adelante, se referirán en este documento como la "familia PS4".
Además, y como se ha indicado anteriormente, el sistema de numeración usado en este documento hace referencia a una secuencia de referencia SEQ ID NO: 1, que se deriva de la secuencia de Pseudomonas saccharophilia que tiene el número de acceso SWISS-PROT P22963, pero sin la secuencia señal MSHILRAAVLAAVLLPFPALA. Esta secuencia señal está localizada N terminal respecto a la secuencia de referencia y consiste en 21 residuos de aminoácidos. De acuerdo con esto, será trivial identificar los residuos particulares que se van a mutar o sustituir en secuencias correspondientes que comprenden la secuencia señal, o de hecho secuencias correspondientes que comprenden cualquier otra extensión o deleción N-o C-terminal. En relación con adiciones o deleciones Nterminales, todo lo que se requiere es compensar la numeración de las posiciones por el número de residuos insertados o delecionados. Por ejemplo, la posición 1 en SEQ ID NO: 1 corresponde a la posición 22 en una secuencia con la secuencia señal.
Enzima/polipéptido parental
Los polipéptidos variantes PS4 se derivan de, o son variantes de, otra secuencia, conocida como una "enzima parental", un "polipéptido parental" o una "secuencia parental".
El término "enzima parental" tal y como se usa en est documento significa la enzima que tiene una estructura química cercana, preferiblemente la más cercana, a la variante resultante, es decir, el polipéptido o ácido nucleico variante PS4. La enzima parental puede ser una enzima precursora (es decir, la enzima que está mutada realmente)
o puede prepararse de novo. La enzima parental puede ser una enzima de tipo salvaje, o puede ser una enzima de tipo salvaje que comprende una o más mutaciones.
El término "precursor" tal y como se usa en la presente memoria significa una enzima que precede a la enzima que se modifica para producir la enzima. Así, el precursor puede ser una enzima que se modifica por mutagénesis. Asimismo, el precursor puede ser una enzima de tipo salvaje, una enzima de tipo salvaje variante o una enzima ya mutada.
El término "de tipo salvaje" es un término de la técnica entendido por los expertos en la técnica y significa un fenotipo que es característico de la mayoría de los miembros de una especie naturales y que contrasta con el fenotipo de un mutante. Así, en el presente contexto, la enzima de tipo salvaje es una forma de la enzima encontrada naturalmente en la mayoría de los miembros de la especie relevante. Generalmente, la enzima de tipo salvaje relevante en relación con los polipéptidos variantes descritos aquí es la enzima de tipo salvaje correspondiente relacionada más de cerca en términos de homología de secuencia. Sin embargo, cuando una secuencia de tipo salvaje particular se ha usado como la base para producir un polipéptido variante PS4 como se describe aquí, ésta será la secuencia de tipo salvaje correspondiente independientemente de la existencia de otra secuencia de tipo salvaje que está relacionada más de cerca en términos de homología de secuencia de aminoácidos.
La enzima parental es preferiblemente un polipéptido que preferiblemente presenta actividad exoamilasa no maltogénica. Preferiblemente, la enzima parental es una exoamilasa no maltogénica en sí misma. Por ejemplo, la enzima parental puede ser una exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas saccharophila, tal como un polipéptido que tiene el número de acceso SWISS-PROT P22963, o una exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas stutzeri, tal como un polipéptido que tiene el número de acceso SWISS-PROT P13507.
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Otros miembros de la familia PS4 pueden usarse como enzimas parentales; dichos "miembros de la familia PS4" serán generalmente similares a, homólogos a, o equivalentes funcionalmente a cualquiera de estas dos enzimas, y pueden identificarse por métodos estándar, tal como cribado por hibridación de una biblioteca adecuada usando sondas, o por análisis de la secuencia del genoma.
En particular, los equivalentes funcionales de cualquiera de estas dos enzimas, así como otros miembros de la "familia PS4" también pueden usarse como puntos de partida o polipéptidos parentales para la generación de polipéptidos variantes PS4 como se describe aquí.
Un "equivalente funcional" de una proteína significa algo que comparte una o más, preferiblemente sustancialmente todas, las funciones de esa proteína. Preferiblemente, dichas funciones son funciones biológicas, preferiblemente funciones enzimáticas, tal como actividad amilasa, preferiblemente actividad exoamilasa no maltogénica. En relación con una enzima parental, el término "equivalente funcional" preferiblemente significa una molécula que tiene una función similar o idéntica a una molécula parental. La molécula parental puede ser una exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas saccharophila o una exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas stutzeri o un polipéptido obtenido de otras fuentes.
El término "equivalente funcional" en relación con una enzima parental que es una exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas saccharophila, tal como polipéptido que tiene el número de acceso SWISS-PROT P22963, o una exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas stutzeri, tal como un polipéptido que tiene el número de acceso SWISS-PROT P13507 significa que el equivalente funcional podría obtenerse de otras fuentes. La enzima funcionalmente equivalente puede tener una secuencia de aminoácidos diferente, pero tendrá actividad exoamilasa no maltogénica. Los ejemplos de ensayos para determinar la funcionalidad se describen en la presente memoria y son conocidos para un experto en la técnica.
En realizaciones altamente preferidas, el equivalente funcional tendrá homología de secuencia con cualquiera de las exoamilasas no maltogénicas de Pseudomonas saccharophila y Pseudomonas stutzeri mencionadas anteriormente, preferiblemente ambas. El equivalente funcional también puede tener homología de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID NOs: 1 a 14, preferiblemente SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7 o ambas. La homología de secuencia entre dichas secuencias es preferiblemente al menos 60%, preferiblemente 65% o más, preferiblemente 75% o más, preferiblemente 80% o más, preferiblemente 85% o más, preferiblemente 90% o más, preferiblemente 95% o más. Dichas homologías de secuencia pueden generarse por cualquiera de varios programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, BLAST o FASTA, etc. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, EEUU; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Los ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no están limitados a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 ibid -Capítulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el paquete de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para la búsqueda fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, se prefiere usar el programa GCG Bestfit.
En otras realizaciones, los equivalentes funcionales serán capaces de hibridar específicamente con cualquiera de las secuencias mostradas anteriormente. Los métodos para determinar si una secuencia es capaz de hibridar con otra son conocidos en la técnica, y se describen por ejemplo en Sambrook, et al (supra) y Ausubel, F. M. et al. (supra). En realizaciones altamente preferidas, los equivalentes funcionales serán capaces de hibridar en condiciones astringentes, por ejemplo, 65°C y 0,1xSSC {1xSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3 Citrato pH 7,0}.
Por ejemplo, los equivalentes funcionales que tienen homología de secuencia con exoamilasas no maltogénicas de Pseudomonas saccharophila y Pseudomonas stutzeri son adecuados para uso como enzimas parentales. Dichas secuencias pueden diferenciarse de la secuencia de Pseudomonas saccharophila en una cualquiera o más posiciones. Además, las exoamilasas no maltogénicas de otras cepas de Pseudomonas spp, tal como ATCC17686, también pueden usarse como un polipéptido parental. Los residuos de polipéptido variante PS4 pueden insertare en cualquiera de estas secuencias parentales para generar las secuencias de polipéptido variante PS4.
Se entenderá que cuando se desea que los polipéptidos variantes PS4 comprendan adicionalmente una o más mutaciones, como se ha mostrado anteriormente, pueden hacerse las mutaciones correspondientes en las secuencias de ácido nucleico de los equivalentes funcionales de la exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas spp, así como otros miembros de la "familia PS4", con el fin de que puedan usarse como puntos de partida o polipéptidos parentales para la generación de polipéptidos variantes PS4 como se describe aquí.
Específicamente incluidos en el término "polipéptidos variantes PS4" son los polipéptidos descritos en:
US 60/485.413, 60/485.539 y 60/485.616; PCT/US2004/021723 y PCT/US2004/021739; US 10/886.905 y 10/866.903; US 60/608.919; US 60/612.407; US 60/485.539; PCT/IB2004/002487; US 10/886.023; US 10/886.505, US 10/886.527 y US 10/886,504; US 10/947.612.
Dichos polipéptidos son adecuados para uso en las aplicaciones descritas en la presente memoria, en particular, como aditivos alimenticios, para tratar almidón como se describe, para preparar un producto alimenticio, para
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En realizaciones altamente preferidas, el término "enzima exoamilasa no maltogénica" tal y como se usa en este documento debe tomarse que significa que la enzima no degrada inicialmente almidón en cantidades sustanciales de maltosa como se analiza según el procedimiento de determinación del producto como se describe en este documento.
En realizaciones altamente preferidas, la exoamilasa no maltogénica comprende una exo-maltotetraohidrolasa. La exo-maltotetraohidrolasa (E.C.3.2.1.60) se conoce más formalmente como glucan 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa. Esta enzima hidroliza las uniones 1,4-alfa-D-glucosídicas en polisacáridos amiláceos de manera que se eliminan residuos de maltotetraosa sucesivos desde los extremos de cadena no reductores.
Las exoamilasas no maltogénicas se describen con detalle en la Patente US número 6.667.065.
Ensayos para actividad exoamilasa no maltogénica
El sistema siguiente se usa para caracterizar los polipéptidos que tienen actividad exoamilasa no maltogénica que son adecuados para uso según los métodos y composiciones descritos aquí. Este sistema puede usarse por ejemplo para caracterizar los polipéptidos parentales o variantes PS4 descritos aquí.
Como información de fondo inicial, la amilopectina de maíz ceroso (que se puede obtener como WAXILYS 200 de Roquette, Francia) es un almidón con un contenido muy alto en amilopectina (por encima del 90%). Se hierven 20 mg/ml de almidón de maíz ceroso durante 3 min, en un tampón de 50 mM MES (ácido 2-(Nmorfolino)etanosulfónico), 2 mM cloruro de calcio, pH 6,0 y posteriormente se incuba a 50°C y se usa en media hora.
Una unidad de la exoamilasa no maltogénica se define como la cantidad de enzima que libera productos de hidrólisis equivalentes a 1 µmol de azúcar reductor por min, cuando se incuba a 50 grados C en un tubo de ensayo con 4 ml de 10 mg/ml almidón de maíz ceroso en 50 mM MES, 2 mM cloruro de calcio, pH 6,0 preparado como se ha descrito anteriormente. Los azúcares reductores se miden usando maltosa como estándar y usando el método del ácido dinitrosalicílico de Bernfeld, Methods Enzymol., (1954), 1, 149-158 u otro método conocido en la técnica para cuantificar azúcares reductores.
El patrón de los productos de hidrólisis de la exoamilasa no maltogénica se determina incubando 0,7 unidades de exoamilasa no maltogénica durante 15 ó 300 min, a 50°C en un tubo de ensayo con 4 ml de 10 mg/ml almidón de maíz ceroso en el tampón preparado como se ha descrito anteriormente. La reacción se para sumergiendo el tubo de ensayo durante 3 min en un baño de agua hirviendo.
Los productos de hidrólisis se analizan y cuantifican por HPLC de intercambio aniónico usando una columna Dionex PA 100 con acetato de sodio, hidróxido de sodio y agua como eluyentes, con detección amperométrica pulsada y con maltooligosacáridos lineales conocidos de glucosa a maltoheptaosa como estándares. El factor de respuesta usado para maltooctaosa a maltodecaosa es el factor de respuesta encontrado para maltoheptaosa.
Preferiblemente, los polipéptidos variantes PS4 tienen actividad exoamilasa no maltogénica de manera que si una cantidad de 0,7 unidades de dicha exoamilasa no maltogénica se incubaran durante 15 minutos a una temperatura de 50°C a pH 6,0 en 4 ml de una disolución acuosa de 10 mg de almidón de maíz ceroso pre-hervido por ml de disolución tamponada que contiene 50 mM 2-(ácido N-morfolino)etano sulfónico y 2 mM cloruro de calcio entonces la enzima rendiría producto(s) de hidrólisis que consistirían en uno o más malto-oligosacáridos lineales de dos a diez unidades de D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa; tal como al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80% y lo más preferiblemente al menos 85% en peso de dichos productos de hidrólisis consistiría en maltooligosacáridos lineales de tres a diez unidades de D-glucopiranosilo, preferiblemente de maltooligosacáridos lineales que consisten en cuatro a ocho unidades de D-glucopiranosilo.
Para facilitar la referencia, y para los presentes propósitos, la característica de incubar una cantidad de 0,7 unidades de la exoamilasa no maltogénica durante 15 minutos a una temperatura de 50°C a pH 6,0 en 4 ml de una disolución acuosa de 10 mg de almidón de maíz ceroso pre-hervido por ml de disolución tamponada que contiene 50 mM 2(ácido N-morfolino)etano sulfónico y 2 mM cloruro de calcio, puede referirse como el "Ensayo de Incubación del Almidón de Maíz Ceroso".
Así, expresado de forma alternativa, los polipéptidos variantes PS4 preferidos que son exoamilasas no maltogénicas se caracterizan por tener la capacidad en el ensayo de incubación de almidón de maíz ceroso de rendir producto(s) de hidrólisis que consistirían en uno o más malto-oligosacáridos lineales de dos a diez unidades de Dglucopiranosilo y opcionalmente glucosa; tal como al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80% y lo más preferiblemente al menos 85% en peso de dichos producto(s) de hidrólisis consistiría en maltooligosacáridos lineales de tres a diez unidades de D-glucopiranosilo, preferiblemente de maltooligosacáridos lineales que consisten en cuatro a ocho unidades de D-glucopiranosilo.
Los productos de hidrólisis en el ensayo de incubación del almidón de maíz ceroso pueden incluir uno o más maltooligosacáridos lineales de dos a diez unidades de D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa. Los productos de hidrólisis en el ensayo de incubación del almidón de maíz ceroso también pueden incluir otros productos hidrolíticos. No obstante, las cantidades en % en peso de maltooligosacáridos lineales de tres a diez unidades de D
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En trigo y otros cereales, las cadenas laterales externas en la amilopectina están en el intervalo de DP 12-19. Así, la hidrólisis enzimática de las cadenas laterales de la amilopectina, por ejemplo, por polipéptidos variantes PS4 como se describe que tienen actividad exoamilasa no maltogénica, puede reducir de forma importante sus tendencias a la cristalización.
El almidón en el trigo y otros cereales usados para propósitos de horneado está presente en la forma de gránulos de almidón que generalmente son resistentes al ataque enzimático por amilasas. Así, la modificación del almidón está limitada principalmente a almidón dañado y progresa muy lentamente durante el procesamiento de la masa y horneado inicial hasta que empieza la gelatinización a aproximadamente 60C. Como consecuencia de esto, sólo las amilasas con un alto grado de termoestabilidad son capaces de modificar el almidón eficientemente durante el horneado. y generalmente la eficiencia de las amilasas se incrementa con termoestabilidad incrementada. Esto es porque cuanto más termoestable es la enzima mayor es el tiempo en el que puede estar activa durante el horneado y así mayor será el efecto antiendurecimiento que proporcione.
De acuerdo con esto, el uso de polipéptidos variantes PS4 como se describe aquí cuando se añaden al almidón en cualquier estadio de su procesamiento en un producto alimenticio, por ejemplo, antes, durante o después del horneado en pan puede retardar o impedir o ralentizar la retrogradación. Dicho uso se describe con más detalle más adelante.
Tal y como se usa en la presente memoria el término "termoestable" se refiere a la capacidad de la enzima de retener actividad después de exposición a temperaturas elevadas. Preferiblemente, el polipéptido variante PS4 es capaz de degradar almidón a temperaturas de aproximadamente 55°C a aproximadamente 80°C o más. Adecuadamente, la enzima retiene su actividad después de exposición a temperaturas de hasta aproximadamente 95°C.
La termoestabilidad de una enzima tal como una exoamilasa no maltogénica se mide por su vida media. Así, los polipéptidos variantes PS4 descritos aquí tienen vidas medias prolongadas respecto a la enzima parental preferiblemente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o más, preferiblemente a temperaturas elevadas de 55°C a aproximadamente 95°C o más, preferiblemente a aproximadamente 80°C.
Tal y como se usa aquí, la vida media (t1/2) es el tiempo (en minutos) durante el que la mitad de la actividad de la enzima se inactiva en condiciones de calor definidas. En realizaciones preferidas, la vida media se ensaya a 80 grados C. Preferiblemente, la muestra se calienta durante 1-10 minutos a 80°C o más. El valor de la vida media se calcula entonces midiendo la actividad amilasa residual, por cualquiera de los métodos descritos aquí. Preferiblemente, un ensayo de vida media se lleva a cabo como se describe con más detalle en los Ejemplos.
Preferiblemente, las variantes PS4 descritas aquí son activas durante el horneado e hidrolizan almidón durante y después de la gelatinización de los gránulos de almidón que empieza a temperaturas de aproximadamente 55°C. Cuanto más termoestable es la exoamilasa no maltogénica mayor es el tiempo en el que puede ser activa y así mayor será el efecto antiendurecimiento que proporcionará. Sin embargo, durante el horneado por encima de temperaturas de aproximadamente 85°C, puede tener lugar la inactivación de la enzima. Si esto pasa, la exoamilasa no maltogénica puede inactivarse gradualmente de manera que sustancialmente no hay actividad después del proceso de horneado en el pan final. Por lo tanto, preferentemente las exoamilasas no maltogénicas adecuadas para uso como se describe tienen una temperatura óptima por encima de 50°C y por debajo de 98°C.
La termoestabilidad de las variantes PS4 descritas aquí puede mejorarse usando ingeniería de proteínas para hacerlas más termoestables y así más adecuadas para los usos descritos aquí; por lo tanto, se engloba el uso de variantes PS4 modificadas para hacerlas más termoestables por ingeniería de proteínas.
Preferiblemente, el polipéptido variante PS4 es estable al pH; más preferiblemente, tiene una mayor estabilidad a pH que su polipéptido parental cognado. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "estable a pH" se refiere a la capacidad de la enzima de retener actividad en un intervalo amplio de pH. Preferiblemente, el polipéptido variante PS4 es capaz de degradar almidón a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10,5. En una realización, el grado de estabilidad a pH puede ensayarse midiendo la vida media de la enzima en condiciones específicas de pH. En otra realización, el grado de estabilidad a pH puede ensayarse midiendo la actividad o actividad específica de la enzima en condiciones específicas de pH. Las condiciones específicas de pH pueden ser cualquier pH de pH5 a pH10,5.
Así, el polipéptido variante PS4 puede tener una vida media más larga, o una mayor actividad (dependiendo del ensayo), cuando se compara con el polipéptido parental en condiciones idénticas. Los polipéptidos variantes PS4 pueden tener 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o vida media más larga cuando se compara con sus polipéptidos parentales en condiciones idénticas de pH. Alternativamente, o además, pueden tener dicha mayor actividad cuando se compara con el polipéptido parental en condiciones idénticas de pH.
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Por lo tanto, describimos un método para preparar un producto alimenticio, comprendiendo el método: (a) obtener una exoamilasa no maltogénica; (b) introducir una mutación en una cualquiera o más de las posiciones de la exoamilasa no maltogénica como se muestra en este documento; (c) mezclar el polipéptido resultante con un ingrediente alimenticio.
Los polipéptidos variantes PS4 pueden usarse para aumentar el volumen de los productos de panadería tal como pan. Sin pretender la vinculación a ninguna teoría particular, creemos que esto resulta de la reducción de viscosidad de la masa durante el calentamiento (tal como horneado) como resultado del acortamiento por exoamilasa de las moléculas de amilosa. Esto permite que el dióxido de carbono generado por la fermentación incremente el tamaño del pan con menor impedimento.
Así, los productos alimenticios que comprenden o se tratan con polipéptidos variantes PS4 se expanden en volumen cuando se comparan con productos que no se han tratado de esta manera, o se tratan con polipéptidos parentales. En otras palabras, los productos alimenticios tienen un volumen de aire mayor por volumen de producto alimenticio. Alternativamente, o además, los productos alimenticios tratados con polipéptidos variantes PS4 tienen una menor densidad, o peso (o masa) por relación de volumen. En realizaciones particularmente preferidas, los polipéptidos variantes PS4 se usan para aumentar el volumen del pan. El aumento o expansión del volumen es beneficioso porque reduce la gomosidad o contenido en almidón de los alimentos. Los consumidores prefieren los alimentos ligeros, y se potencia la experiencia del consumidor. En realizaciones preferidas, el uso de polipéptidos variantes PS4 aumenta el volumen un 10%, 20%, 30% 40%, 50% o más.
El uso de polipéptidos variantes PS4 para incrementar el volumen de alimentos se describe con detalle en los Ejemplos.
Usos en alimentos
Los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 descritos aquí pueden usarse como -o en la preparación de -un alimento. En particular, pueden añadirse a un alimento, es decir, como un aditivo alimenticio. El término "alimento" se pretende que incluya tanto alimentos preparados, así como un ingrediente de un alimento, tal como harina. En un aspecto preferido, el alimento es para consumo humano. El alimento puede estar en la forma de una disolución o como un sólido -dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración.
Los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 pueden usarse como un ingrediente alimenticio. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "ingrediente alimenticio" incluye una formulación, que se añade o puede añadirse a alimentos o productos alimenticios funcionales e incluye formulaciones que pueden usarse a niveles bajos en una amplia variedad de productos que requieren, por ejemplo, acidificación o emulsión. El ingrediente alimenticio puede estar en la forma de una disolución o como un sólido -dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración.
Los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 descritos aquí pueden ser -o pueden añadirse a -suplementos alimenticios. Los polipéptidos y ácidos nucleicos variantes PS4 descritos aquí pueden ser -o pueden añadirse a alimentos funcionales. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "alimento funcional" significa alimento que es capaz de proporcionar no solo un efecto nutritivo y/o una satisfacción al gusto, sino también es capaz de proporcionar un efecto beneficioso adicional al consumidor. Aunque no existe una definición legal de un alimento funcional, la mayoría de las partes con un interés en esta área están de acuerdo en que son alimentos comercializados como que tienen efectos específicos en la salud.
Los polipéptidos variantes PS4 también pueden usarse en la fabricación de un producto de alimento o un producto alimenticio. Los productos alimenticios típicos incluyen productos lácteos, productos cárnicos, productos de pollo, productos de peces y productos de masa. El producto de masa puede ser cualquier producto de masa procesado, incluyendo masas fritas, fritas en aceite abundante, asadas, horneadas, al vapor y hervidas, tal como pan y torta de arroz al vapor. En realizaciones altamente preferidas, el producto alimenticio es un producto de panadería.
Preferiblemente, el producto alimenticio es un producto de panadería. Los productos de panadería típicos (horneados) incluyen pan -tal como hogazas, bollos, magdalenas, bases de pizza etc. hojaldre, pretzels, tortillas, pasteles, pasteles, galletas, galletas saladas etc.
Por lo tanto, describimos un método para modificar un aditivo alimenticio que comprende una exoamilasa no maltogénica, comprendiendo el método introducir una mutación en una cualquiera o más de las posiciones de la exoamilasa no maltogénica como se muestra en este documento. El mismo método puede usarse para modificar un ingrediente alimenticio, o un suplemento alimenticio, un producto de alimento, o un producto alimenticio.
Retrogradación/endurecimiento
Describimos el uso de proteínas variantes PS4 que son capaces de retardar el endurecimiento de medios de almidón, tal como geles de almidón. Los polipéptidos variantes PS4 son especialmente capaces de retardar la retrogradación perjudicial del almidón.
19
2. Ciclar las reacciones usando los parámetros siguientes: 35 ciclos de desnaturalización (96°C/1min) hibridación de cebador (62,8°C/1min) elongación (65°C/15min)
5 después mantener a 4°C
Precalentar la tapa de la máquina de PCR hasta 105°C y la placa hasta 95°C antes de poner los tubos de PCR en la máquina (ciclador termal eppendorf). Etapa 2: Digestión con Dpn I
1. Añadir 2 µl de enzima de restricción Dpn I (10 U/µl) a cada reacción de amplificación, mezclar por pipeteo y 10 sedimentar la mezcla.
2. Incubar a 37°C durante ∼3 hr. Etapa 3: Transformación de células ultracompetentes XL10-Gold®
1. Descongelar células XL10-Gold en hielo. Alicuotar 45 µl de células por reacción de mutagénesis en tubos Falcon pre-enfriados.
- 15 2. Encender el baño de agua (42°C) y poner un tubo con caldo NZY+ en el baño para pre-calentarlo.
- 3.
- Añadir 2 µl de mezcla de β-mercaptoetanol a cada tubo. Girar y golpear suavemente e incubar 10 min en hielo, girándolo cada 2 min.
- 4.
- Añadir 1,5 µl de ADN tratado con Dpn I a cada alicuota de células, girar para mezclar e incubar en hielo durante 30 min.
- 20 5. Aplicar pulsos de calor a los tubos en el baño de agua a 42°C durante 30 s y poner en hielo durante 2 min.
- 6.
- Añadir 0,5 ml de caldo NZY+ pre-calentado a cada tubo e incubar a 37°C durante 1hr con agitación a 225-250 rpm.
- 7.
- Plaquear 200 µl de cada reacción de transformación en placas LB (33,6 g/l Agar Lennox L, Sigma) que contiene 1% almidón y 0,05 µg/ml kanamicina
- 25 8. Incubar las placas de transformación a 37°C toda la noche. Tabla 6. Tabla de cebadores para pPD77d14:
- Mutacion
- Secuencia del Oligo Modificación Cadena Propósito
- N33Y, D34N
- GCGAAGCGCCCTACAACTGGTACAAC 5' fosfato + MSDM
- K71R
- CCGACGGCGGCAGGTCCGGCG 5' fosfato + MSDM
- G87S
- CAAGAACAGCCGCTACGGCAGCGAC 5' fosfato + MSDM
- G121D
- CACATGAACCGCGACTACCCGGACAAG 5' fosfato + MSDM
- G134R
- CTGCCGGCCGGCCAGcGCTTCTGGCG 5' fosfato + MSDM
- A141P
- CGCAACGACTGCGCCGACCCGGG 5' fosfato + MSDM
- I157L
- GACGGTGACCGCTTCcTgGGCGGCGAGTCG 5' fosfato + MSDM
- L178F, A179T
- CGCGACGAGTTTACCAACCTGCG 5' fosfato + MSDM
- G223A
- GGCGAGCTGTGGAAAgccCCTTCTGAATATCCG 5' fosfato + MSDM
- H307L
- gaacGGCGGCCAGCACctgTGGGCGCTGCAG 5' fosfato + MSDM
- S334P, D343E
-
imagen28 5' fosfato + MSDM
37
Ejemplo 11. Control del volumen de los bollos daneses
Se preparan bollos daneses a partir de una masa basada en 2.000 g de harina reformada danesa (de Cerealia), 120 g de levadura comprimida, 32 g de sal, y 32 g de sacarosa. Se añade agua a la masa según la optimización de agua previa.
5 La masa se mezcla en un mezclador Diosna (2 min. a baja velocidad y 5 min. a alta velocidad). La temperatura de la masa después del mezclado se mantiene a 26°C. Se escalan 1.350 g de masa y se dejan reposar durante 10 min. en una cabina de calentamiento a 30°C. Los bollos se moldean en un moldeador Fortuna y se fermentan durante 45 min. a 34°C y a 85% de humedad relativa. Posteriormente, los bollos se hornean en un horno Bago 2 durante 18 min. a 250°C con vapor en los primeros 13 segundos. Después del horneado, los bollos se enfrían durante 25 min.
10 antes de pesarlos y medir el volumen.
Los bollos se evalúan respecto a la apariencia de la corteza, homogeneidad de la miga, recubrimiento de la corteza, volumen modelo y específico (medir el volumen con el método de desplazamiento de semilla dee colza).
Sobre la base de estos criterios, se encuentra que las variantes PS4 incrementan el volumen específico y mejoran los parámetros de calidad de los bollos daneses. Así, las variantes PS4 son capaces de controlar el volumen de los
15 productos horneados.
Ejemplo 12. Resultados
Tabla 9. Propiedades bioquímicas de variantes PSac comparado con PSac-cc1 de tipo salvaje
- Variante
- t½-75 t½-80 Betamyl/Phadebas Mutaciones
- PSac-cc1
- <0,5 40
- PSac-D3
- 9,3 3 43 N33Y, D34N, K71 R, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L, D343E,S334P
- PSac-D14 (SEQ ID NO: 4)
- 9,3 2,7 65 N33Y, D34N, K71R, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L, D343E, S334P
- PSac-D20 (SEQ ID NO: 3)
- 7,1 2,7 86 N33Y, D34N, K71R, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L, D343E, S334P
- PSac-D34 (SEQ ID NO: 2)
- 8,4 2,9 67 N33Y,D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L, S334P
- PSac-pPD77d33 (SEQ ID NO: 13)
- 7,1 3 51 N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L, S334P
- pMD55
- 6,0 54 N33Y D34N G121F G134R, A141P I157L G223A H307L S334P L178F A179T
- pMD85
- 5,1 115 N33Y D34N G121F G134R, A141P I157L G223E H307L S334P L178F A179T
- PMD96
- 4,0 231 N33Y D34N G121F G134R, A141P I157L G223E H307L S334P L178F A179T S161A
- pMD86
- 3,6 170 N33Y D34N G121A G134R, A141P I157L G223E H307L S334P L178F A179T
- pMD109
- 3,6 170 N33Y D34N G121A G134R, A141P I157L G223E H307L S334P L178F A179T S161A
Las secuencias pPD77d40, pMD55, pMD85, pMD96, pMD86 y pMD109 tienen los residuos en la columna 5 mutados y el dominio de unión a almidón delecionado en un fondo de P. saccharophila de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1). Sus 20 secuencias pueden construirse de una manera directa con esta información.
Los efectos detallados de mutaciones individuales en varias posiciones se describen en las subsecciones siguientes.
Termoestabilidad aumentada del polipéptido variante PS4 con la mutación 121F
Un polipéptido variante PS4 designado pMD55 que tiene mutaciones de aminoácidos en N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, L178F, A179T se ensaya para termoestabilidad. Este polipéptido 25 presenta termoestabilidad mejorada como se muestra en la tabla siguiente. Véase también el Ejemplo 12 y la Tabla 9 anterior.
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-
imagen1 imagen2
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