KR20050046778A

KR20050046778A - 소정 특성을 가지는 알파-아밀라제 돌연변이체

Info

Publication number: KR20050046778A
Application number: KR1020057004379A
Authority: KR
Inventors: 알렌 스벤드센; 헨릭 비스카르트-프란트첸; 토르벤 베덜 보르체르트
Original assignee: 노보자임스 에이/에스
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1996-02-05
Publication date: 2005-05-18
Also published as: MX9705906A; KR100511499B1; EP0808363B1; CN1172501A; US6022724A; US20050019886A1; CA2211316C; KR19980701901A; BR9607013B1; JP4047379B2; AU4483496A; JP2008017847A; DK2199378T3; BR9607013A; ATE432342T1; DE69637940D1; CN100419076C; ES2390901T3; CA2211316A1; US7163816B2

Abstract

α-아밀라제 활성과 모 α-아밀라제와 비교했을 때 적어도 하나의 변경된 특성을 가지는 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체를 제조하는 방법은

i) 모-테르마밀-유사 α-아밀라제의 특성을 변경시키는데 적당한 것으로 믿어지는(구조적 또는 기능적 고찰을 기초로 하여 평가될 때), 테르마밀-유사 α-아밀라제 구조의 적어도 하나의 아미노산잔기 또는 적어도 하나의 구조적 부분을 동정하기 위해서 모-테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조를 분석하고, ii) 모-테르마밀-유사 α-아밀라제와 비교했을 때, 특성을 변경하기 위해서 i)에서 동정된 아미노산잔기 또는 구조적 부분에서 변형된, 테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체를 제조하고, iii) 해당 특성에 대해 결과적인 테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체를 검사하는 것으로 이루어진다.

Description

소정 특성을 가지는 알파-아밀라제 돌연변이체{ALPHA-AMYLASE MUTANTS WITH PREDETERMINED PROPERTIES}

(기술분야)

본 발명은 예정된 특성을 가지는 α-아밀라제 돌연변이체를 디자인하는 새로운 방법에 관한 것이며, 이 방법은 지금까지 공지되지 않은 박테리아 α-아밀라제의 3차 구조를 바탕으로 한다.

(배경기술)

α-아밀라제(α-1,4 글루칸-4-글루카노히드롤라제, EC 3.2.1.1)는 녹말과 다른 선형 및 분지된 1,4-글루코시딕 올리고당 및 다당류를 가수분해할 수 있는 효소군으로 구성된다. 연구된 거의 모든 α-아밀라제는 대략 동일한 길이 및 공간을 가지는 몇몇 보존된 영역을 가지고 있다. 이런 영역중에 하나는 칼모듈린의 Ca2+ 결합부위와 비슷하고 다른 부위들은 활성중심부 및/또는 기질의 결합을 위하여 필요한 것으로 생각된다.

많은 α-아밀라제의 아미노산서열 및 이에 따른 일차구조가 공지되어 있지만, 모든 α-아밀라제의 3차구조를 결정하는 것이 매우 어렵다는 것이 증명되었다. 3차구조는 α-아밀라제 결정의 X-레이 결정그래프 분석에 의해 결정될 수 있지만, 실제적으로 이 구조를 해명하기에 적당한 α-아밀라제 결정을 얻는 것이 어렵다는 것이 증명되었다.

지금까지 단지 몇몇 α-아밀라제의 3차구조가 높은 해상도로 결정되었다. 이런것들은 Aspergillus oryzae TAKA α-아밀라제(Swift et al., 1991), Aspergillus niger 산성 아밀라제(Brady et al., 1991), 돼지 췌장 α-아밀라제(Qian et al., 1993), 및 보리 알파-아밀라제(Kadziola et al., 1994, Journal of Molecular Biology 239: 104-121, A. Kadziola, Thesis, 화학과 유니버시티 오브 코펜하겐, 덴마크)의 구조를 포함한다. 더욱이, Bacillus circulans 시클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제(CGTase)의 삼차구조가 공지되어 있다(Klein et al., 1992)(Lawson et al., 1994). CGTase는 α-아밀라제와 동일한 형태의 반응을 촉매하며 α-아밀라제와 몇몇 구조적 유사성을 나타낸다.

더욱이, B. subtilis α-아밀라제의 결정화와 예비 X-레이 연구가 기술되었다(Chang et al. (1992)와 Mizuno et al. (1993)). 최종 B. subtilis 구조가 기록되지 않았다. 비슷하게, B. licheniformis α-아밀라제 결정의 제조가 기록되었으나(Suzuki et al. (1990)), X-레이 결정그래프 분석 또는 삼차구조에 대한 그후의 보고는 이용할 수 없다.

여러 연구팀이 상기 공지된 α-아밀라제 구조를 기초로 하여 삼차구조를 형성하기를 시도했다. 예를 들어, Vihinen et al. (J. Biochem. 107, 267-272, 1990)은 TAKA 아밀라제 구조를 기초로 하여 Bacillus stearothermophilus α-아밀라제의 삼차구조의 모델(또는 컴퓨터 시뮬레이션)을 개시한다. 이 모델은 B. stearothermophilus α-아밀라제의 다양한 부위-특이적 돌연변이의 가정구조적 결과를 조사하기 위해서 사용되었다. E.A. MacGregor(1987)는 A. oryzae TAKA α-아밀라제의 공지된 구조와 2차구조 예상 알고리즘을 기초로 하여 보리, 돼지 췌장 및 Bacillus amyloliquefaciens를 포함하는 여러 종류의 α-아밀라제에서 α-헬릭스와 β-베럴의 존재를 예상했다. 더욱이, 예를 들어 B. amyloliquefaciens α-아밀라제에 존재하는 것으로 발견되는 가능한 루프 및 서브사이트가 예상되었다(A. oryzae 서열 및 구조와의 비교를 기초로 함).

A.E. MacGregor(Starch/Starke 45 (1993), No. 7, p. 232-237)는 α-아밀라제 관련 효소의 구조와 활성 사이의 상관관계의 논문을 제시했다.

지금까지, 삼차구조는 B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, 및 B. stearothermophilus α-아밀라제를 포함하여, 산업적으로 중요한 Bacillus α-아밀라제(본 문맥에서 "테르마밀-유사 α-아밀라제"라 칭함)에 대해 이용할 수 없었다.

(발명의 간단한 설명)

테르마밀-유사 박테리아 α-아밀라제의 삼차구조가 현재 밝혀졌다. 상기 구조의 분석을 기초로 하여 구조적 또는 기능적 고찰로부터 테르마밀-유사 α-아밀라제에 다양한 특성을 부여하는데에 중요하게 보이는 구조적 부분 또는 특이 아미노산 잔기를 동정하는 것이 가능하다. 더욱이, 테르마밀-유사 α-아밀라제 구조를 상기 언급된 균류 및 포유류 α-아밀라제의 공지된 구조와 비교했을 때, 구조 사이에 몇몇 유사성이 존재했지만, 또한 몇몇 현저한, 그리고 미리 예상되지 않은 α-아밀라제 사이의 구조적 차이가 존재한다는 것이 발견되었다. 본 발명은 이러한 발견에 기초한다.

따라서, 첫 번째 측면에서 본 발명은 α-아밀라제 활성을 가지며 모 테르마밀 α-아밀라제와 비교했을때 적어도 하나의 변경된 특성을 가지는 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체를 제작하는 방법에 관한 것인데, 이 방법은

i) 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 상기 특성을 변경하기 위해 적절한 것으로 믿어지는(구조적 또는 기능적 고찰을 기초로 하여 평가될때), 테르마밀-유사 α-아밀라제 구조의 적어도 하나의 아미노산 잔기 또는 적어도 하나의 구조적 부분을 동정하기 위해 테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조를 분석하고,

ii) 모 테르마밀-유사 α-아밀라제와 비교했을 때, 상기 특성을 변경시키기 위해 i)에서 동정된 아미노산잔기 또는 구조적 부분에서 변형된 테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체를 제작하고,

iii) 상기 특성에 대해 결과의 테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체를 검사하는 것으로 이루어진다.

두 번째 측면에서 본 발명은 α-아밀라제 활성을 가지며 모 테르마밀-유사 α-아밀라제와 비교했을 때 하나 이상의 변경된 특성을 가지는, 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은

i) 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조와 테르마밀-유사 α-아밀라제의 삼차구조를 비교하고,

ii) 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조와 상이한 테르마밀-유사 α-아밀라제 구조의 부분을 동정하고,

iii) ii)에서 동정된 테르마밀-유사 α-아밀라제의 부분을 변형하여 모 테르마밀-유사 α-아밀라제와는 다른 하나 이상의 특성을 가지는 테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체를 얻는 것으로 이루어진다.

세 번째 측면에서 본 발명은 α-아밀라제 활성을 가지며 모 비-테르마밀-유사 α-아밀라제와 비교했을 때 하나 이상의 변형된 특성을 가지는, 모 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은

i) 테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조와 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 삼차구조를 비교하고,

ii) 테르마밀-유사 α-아밀라제 구조와 상이한 비-테르마밀-유사 α-아밀라제 구조의 부분을 동정하고,

iii) ii)에서 동정된 비-테르마밀-유사 α-아밀라제 부분을 변형하여 모 테르마밀-유사 α-아밀라제와 상이한 하나 이상의 특성을 가지는 비-테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체를 얻는 것으로 이루어진다.

본 발명의 상기 방법에 의해 변경될 수 있는 특성은 예를 들어, 기질 특이성, 기질 결합성, 기질 분해 양상, 온도 안정성, pH 의존 활성, pH 의존 안정성(특히 저(예를 들어 pH＜6 특히 pH＜5) 또는 고(예를 들어 pH＞9 pH 값에서 증가된 안정성), 산화에 대한 안정성, Ca2+-의존성, 특이활성, 및 흥미있는 다른 성질이 있다. 예를 들면, 변경은 모 테르마밀-유사 α-아밀라제와 비교했을 때 주어진 pH 및/또는 변경된 기질 특이성에서 증가된 특이 활성을 가지는 변이체를 일으킨다.

더욱 심화된 측면에서 본 발명은 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체, 이런 변이체를 암호하는 DNA 및 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 다양한 산업적 목적을 위해 변이체의 사용에 관한 것이다.

(발명의 상세한 설명)

테르마밀-유사 α-아밀라제

Bacillus 종에 의해 생성되는 많은 알파-아밀라제는 아미노산 수준에서 매우 상동함이 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 2(시판용 TermamylR)에 제시되어 있는 아미노산서열로 이루어진 B. licheniformis α-아밀라제는 서열 4에 제시된 아미노산서열로 이루어진 B. amyloliquefaciens α-아밀라제와 약 89% 상동성을 서열 6에 제시되어 있는 아미노산서열로 이루어진 B. stearothermophilus α-아밀라제와 약 79% 상동성을 가짐이 발견되었다. 더욱 상동한 α-아밀라제는 모두 WO 95/26397에 자세히 기재되어 있는 Bacillus 종 NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 또는 DSM 9375 균주로부터 유래된 α-아밀라제와 Tsukamoto et al., 1988, Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 151, No. 1에 기재된 α-아밀라제를 포함한다. 더욱 다른 상동한 α-아밀라제는 EP 252 666(ATCC 27811)에 기재된 B. licheniformis에 의해 생성되는 α-아밀라제와 WO 91/18314에서 동정된 α-아밀라제를 포함한다. 다른 상업용 테르마밀-유사 B. licheniformis α-아밀라제는 OptithermR과 TakathermR(Solvay로부터 구입가능), MaxamylR(Gist- brocades/Genencor로부터 구입가능), Spezym AAR(Genencor로부터 구입가능), 및 KeistaseR(Daiwa로부터 구입가능)가 있다.

이런 α-아밀라제 사이에서 발견되는 실제적인 상동성 때문에, 이들은 "테르마밀 유사 α-아밀라제"의 클래스로 명명되는 α-아밀라제의 동일한 클래스에 속하는 것으로 여겨진다.

따라서, 본 문맥에서, "테르마밀 유사 α-아밀라제"라는 용어는 아미노산 수준에서 TermamylR, 즉 B. licheniformis α-아밀라제 서열 2와 실제적 상동성을 나타내는 α-아밀라제를 나타내는 것으로 의도된다. 다른 말로, 테르마밀-유사 α-아밀라제는, 여기에서 서열 2, 4 또는 6에 제시된 아미노산서열, 또는 WO 95/26397의 서열 1 또는 2 또는 Tsukamoto et al., 1988에 제시된 아미노산서열, 또는 상기 아미노산서열의 적어도 하나와 예를 들어 적어도 75%, 적어도 70%같은, 적어도 60% 또는 예를 들어 적어도 95%, 적어도 90% 또는 적어도 85%같은 적어도 80%, 상동성을 나타내는 i) 및/또는 상기 α-아밀라제의 적어도 하나에 대해 발생하는 항체와 면역학적 교차-반응성을 나타내는 ii), 및/또는 본 출원의 서열 1, 3, 및 5와 WO 95/26397의 서열 4와 5로부터 각각 나타나는 상기 특이화된 α-아밀라제를 암호하는 DNA 서열과 혼성화하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 iii)을 가지고 있는 α-아밀라제이다.

특성 i)과 관련하여 "상동성" 은 어떤 종래 알고리즘의 사용, 바람직하게는 GAP 패널티 불이행 값을 사용하는 GCG 팩키지 버젼 7.3(1993년 6월)으로부터 GAP 프로그램의 사용에 의해 결정될 수 있다(Genetic Computer Croup (1991) Programme Manual for the GCG Package, version7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).

α-아밀라제의 특성 ii), 즉 면역학적 교차 반응성은 관련된 테르마밀-유사 α-아밀라제의 적어도 하나의 에피토프에 대해 발생하거나 또는 반응하는 항체를 사용하여 분석될 수 있다. 단일클론 또는 폴리클론인 항체는 예를 들어 Hudson et al., 1989에 의해 기재된 것처럼 본 분야에 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 면역학적 교차반응성은 본 분야에 공지된 분석을 사용하여 결정될 수 있으며, 이것의 예는 예를 들어 Husdon et al., 1989에 기재된 것처럼 웨스턴 블라팅 또는 방사 면역확산 분석법이 있다. 이런 점에서, 아미노산서열 2, 4 및 6 각각을 가지는 α-아밀라제 사이의 면역학적 교차반응성이 발견되었다.

상기 특성 iii)과 일치하여 테르마밀-유사 α-아밀라제의 특징화에 사용되는 올리고누클레오티드 프로브는 해당 α-아밀라제의 전체 또는 부분 누클레오티드 또는 아미노산서열을 기초로 하여 적당히 제조될 수 있다. 혼성화를 검사하기 위한 적당한 조건은 5xSSC에 미리 담그기와 20% 포름아미드, 5x덴하르트 용액, 50mM 인산나트륨 pH 6.8, 및 변성된 소나케이트된 소흉선 DNA 50㎍의 용액에서 1h동안 ∼40℃에서 예비혼성화, 그후 100μM ATP가 공급된 동일용액에서 18h동안 ∼40℃에서 혼성화를 포함하거나 또는 예를 들어 Sambrook et al., 1989에 기재된 다른 방법을 포함한다.

본 문맥에서, "로부터 유래된"은 해당 생물의 균주에 의해서 생성되거나 또는 생성될 수 있는 α-아밀라제를 나타낼 뿐만 아니라 이런 균주로부터 분리되는 DNA 서열에 의해 암호되며 상기 DNA 서열로 형질전환된 숙주생물에서 생성되는 α-아밀라제를 나타내는 것으로 의도된다. 마지막으로, 이 용어는 합성적 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 암호되며 해당 α-아밀라제의 동정된 특성을 가지는 α-아밀라제를 나타내는 것으로 의도된다. 이 용어는 또한 모 α-아밀라제가 자연적으로 발생하는 α-아밀라제의 변이체, 즉 자연적으로 발생하는 α-아밀라제의 하나 이상의 아미노산잔기의 변형(삽입, 치환, 결실)의 결과인 변이체를 나타내는 것으로 의도된다.

모 잡종 α-아밀라제

모 α-아밀라제(테르마밀-유사 또는 비-테르마밀-유사 α-아밀라제)는 잡종 α-아밀라제, 즉 적어도 2개의 α-아밀라제로부터 유래된 부분 아미노산 서열의 조합으로 이루어지는 α-아밀라제일 수 있다.

모 잡종 α-아밀라제는 아미노산 상동성 및/또는 면역학적 교차-반응성 및/또는 DNA 혼성화(상기 정의된 것처럼)를 기초로 하여 테르마밀-유사 α-아밀라제 패밀리에 속하는 것으로 결정될 수 있는 것일 것이다. 이 경우에, 잡종 α-아밀라제는 전형적으로 테르마밀-유사 α-아밀라제의 적어도 한 부분과 미생물(박테리아 또는 균류) 및/또는 포유류 기원의 테르마밀-유사 α-아밀라제 또는 비-테르마밀-유사 α-아밀라제로부터 선택된 하나 이상의 다른 α-아밀라제의 부분으로 구성된다.

따라서, 모 잡종 α-아밀라제는 적어도 두 개의 테르마밀-유사 α-아밀라제,또는 적어도 하나의 테르마밀-유사와 적어도 하나의 비-테르마밀-유사 박테리아 α-아밀라제, 또는 적어도 하나의 테르마밀-유사와 적어도 하나의 균류 α-아밀라제의 조합으로 구성될 수 있다. 예를 들면, 모 α-아밀라제는 B. licheniformis의 균주로부터 유래된 α-아밀라제의 C-말단 부분과 B. amyloliquefaciens 또는 B. stearothermophilus 균주로부터 유래된 α-아밀라제의 N-말단 부분으로 구성된다. 예를 들면 모 α-아밀라제는 B. licheniformis α-아밀라제의 C-말단 부분의 적어도 430 아미노산 잔기로 이루어지며 예를 들면 a) 서열 4에 제시된 아미노산서열을 가지는 B. amyloliquefaciens α-아밀라제의 37 N-말단 아미노산잔기에 해당하는 아미노산절편과 서열 2에 제시된 아미노산서열을 가지는 B. licheniformis α-아밀라제의 445 C-말단 아미노산잔기에 해당하는 아미노산절편으로 이루어질 수 있으며, 또는 b) 서열 6에 제시된 아미노산서열을 가지는 B. stearothermophilus α-아밀라제의 68 N-말단 아미노산 잔기에 해당하는 아미노산절편과 서열 2에 제시된 아미노산서열을 가지는 B. licheniformis α-아밀라제의 415 C-말단 아미노산잔기에 해당하는 아미노산절편으로 이루어질 수 있다.

비슷하게, 모 잡종 α-아밀라제는 예를 들어 펀가밀-유사 α-아밀라제 패밀리같은 비-테르마밀-유사 α-아밀라제 패밀리에 속할 수도 있다. 그런 경우에 잡종은 다른 α-아밀라제로부터 유래된 하나 이상의 부분과 조합하여 비-테르마밀-유사 α-아밀라제 패밀리에 속하는 α-아밀라제의 적어도 한 부분으로 구성될 수 있다.

삼차 테르마밀-유사 α-아밀라제 구조

본 발명에 대한 기초를 형성하는 삼차구조를 밝히기 위해서 사용되었던 테르마밀-유사 α-아밀라제는 B. amyloliquefaciens α-아밀라제(서열 4에 제시된 아미노산서열)의 300 N-말단 아미노산과 아미노산 서열 2를 가지고 있는 B. licheniformis α-아밀라제의 C-말단의 아미노산 301-483으로 구성되어 있다. 박테리아 α-아밀라제는 "테르마밀 유사 α-아밀라제 패밀리"에 속하며 본 구조는 어떤 테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조에 대해 대표적인 것으로 믿어진다.

α-아밀라제의 구조는 "X-레이 구조 결정", Stout, G.K.와 Jensen, L.H., John Wiley & Sons, inc. NY, 1989에 제공된 X-레이 결정그래프 방법의 원리에 따라 해명되었다. 동형 치환 방법을 사용하여 2.2Å 해상도로 α-아밀라제의 해명된 결정구조에 대한 구조적 배위가 부록 1에서 표준 PDB 포맷(브룩하벤 단백질 데이타 베이스)으로 제공되어 있다. 부록 1은 본 출원의 부분을 형성하는 것으로 이해되어야만 한다.

효소의 아미노산잔기가 삼문자 아미노산 코드(대문자)로 동정되어 있다.

α-아밀라제 구조는 서열에 대해 A, B, 및 C 순서의 세 개의 구형 도메인으로 구성되어 있으며, 이것은 B, A, C 순서로 대략 일렬로 놓여 있다. 도메인은 B. licheniformis α-아밀라제에 대해 언급되는 번호인, 도메인 A에 대해 잔기 1-103과 206-395, 도메인 B에 대해 잔기 104-205, 도메인 C에 대해 잔기 396-483인 것으로 정의될 수 있다. 이것은 가장 긴 축이 약 85Å인 신장된 분자를 일으킨다. 이 축에 수직인 가장 넓은 점은 대략 50Å이고 중앙의 A 도메인으로 뻗쳐 있다. B. licheniformis α-아밀라제(서열 2)의 활성부위잔기는 D323, D231 및 E261이다.

도메인 A

도메인 A는 가장 큰 도메인이고 활성부위(효소표면의 깊은 틈의 바닥에 위치하는 세 개의 아미노산잔기 무리로 구성됨)를 포함하고 있다. 모든 공지된 α-아밀라제 구조의 도메인 A는 8개의 중앙의 베타가닥(1-8번)과 8개의 측면의 α-헬릭스를 가지는 (베타/알파)8 베럴이라 하는 동일한 일반적인 접힘을 가지고 있다. β-베럴은 McGregor op. cit.에 의해 정의되었다. 베타 가닥 1의 C-말단은 루프 1로 지정된 루프에 의해 헬릭스 1에 연결되어 있고 동일한 양상이 다른 루프에서도 발견된다. 이들 루프는 크기에서 다소 변이를 나타내며 몇몇은 다소 확장될 수도 있다.

(베타/알파)8 베럴에서 8개의 중앙의 베타-가닥은 다양한 공지된 α-아밀라제 구조 사이에 잘 겹쳐져 있으며, 베타-가닥의 C-말단에 위치한 활성부위를 둘러사는 폐쇄부를 포함하여, 구조의 이런 부분은 여러 아밀라제 사이에서 높은 유사성을 나타낸다.

베타가닥과 알파 헬릭스에 연결된 루프는 알파 아밀라제 사이에서 높은 변이성을 나타낸다. 이런 루프는 활성부위의 구조적 배경을 구성하며 기질과의 접촉의 중요성이 이런 루프에 위치한 잔기 사이에서 발견된다. 기질특이성, 기질결합성, pH/활성 프로필, 녹말분해양상같은 이런 중요한 특징은 아미노산과 이런 루프에서 동일한 위치에 의해 결정된다.

펀가밀-유사 α-아밀라제 구조와 루프 1, 2, 3, 및 8에서 발견되는 여기에 개시된 테르마밀-유사 α-아밀라제 구조 사이의 실제적 차이가 도면으로 보여주고 있다.

도메인 B

테르마밀-유사 α-아밀라제 구조는 또한 도메인 B라고 불리는 A 도메인의 루프 3에서 특별한 도메인 구조로 이루어짐이 발견되었다. 테르마밀-유사 α-아밀라제 B 도메인의 구조는 공지된 α-아밀라제 또는 (β/알파)8-베럴 단백질의 어느 것에서도 전에 볼 수 없었다.

도메인 B 구조는 매우 많은 수의 전하를 띤 잔기를 가지는 매우 밀집된 도메인이다. B 도메인은 도메인 A의 가닥 3과 헬릭스 3 사이의 루프의 확장으로 발생하며(도 7에 제시됨) 적어도 하나의 긴 루프 구조를 포함하고 있으며 -1, +3, -1X, +2 연결도를 가지는 5 가닥의 역방향 β-시트 구조를 포함하고 있다(Richardson, 1981, Adv. Protein Chem. 34, 167-339).

B 도메인의 첫 번째 4개의 가닥은 한쌍의 교차된 손가락같은 서로서로 꼬인 두 개의 헤어핀 루프를 형성한다(오른손방향 꼬임). 주사슬은 두 개의 작은 β-시트 구조에 연결된 B-가닥으로 접힌다. 한 시트에서 1회전을 형성한 후에 이것은 뒤로 접혀서 α-아밀라제 구조에서 도메인 A와 연결되어 두 가닥의 시트와 내부의 구멍을 형성한다. 그후 주사슬은 첫 번째 두 시트에 대해 거의 수직의 작은 시트구조로 접힌다. B-가닥 3의 꼭대기에 헬릭스 3으로 들어가기 전에, 도메인 B의 대략 24 마지막 아미노산은 도메인 A의 접촉부위에서 두 개의 칼슘 결합 부위를 형성한다.

도메인 B는 두 개로 도메인-도메인 접촉 영역으로 나누어지는, 두 개의 펩티드 신장에 의해 도메인 A와 연결되어 있다. 도메인 B는 칼슘결합부위와 물을 함유한 내부적으로 파묻힌 구멍에 의해 도메인 A와 접촉하고 있다. 많은 형태의 분자접촉이 나타난다. 산성과 염기성 아미노산 사이의 이온상호작용이 가능하며, 이런 상호작용은 높은 pH에서 일반적 안정성과 완전한 칼슘결합부위를 유지하는데 매우 중요하다.

도메인 C

도메인 C는 아미노산 394-483으로 구성되는 단백질의 C-말단 부분이다. 도메인 C는 자체적으로 뒤로 접혀 있는 단일 8-가닥의 시트 구조를 형성하는 전체적으로 β-가닥으로 구성되어 있으며, 따라서 β-샌드위치 구조로 설명될 수 있다. 가닥 6과 7은 헐겁게 연결되어 있지만 결합성은 +1, +1, +5, -3, +1, +1, -3이다. β-시트의 한 부분은 도메인 A와 접촉면을 형성한다.

Ca-결합 및 Na-결합 부위

테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조는 4개의 칼슘-결합 부위와 하나의 나트륨-결합 부위를 나타내는 점에서 주목할만하다. 비록 칼슘이온중 하나는 매우 약한 배위결합을 나타내지만, 다른 말로, 4개의 칼슘이온과 하나의 나트륨이온이 이 구조에 존재함이 발견되었다. 칼슘이온중 2개는 세 개 이온, 나트륨에 구속되어 있는 중앙의 이온의 선형 무리의 부분을 형성하며, A와 B 도메인의 결합부에 높여 있다.

A와 B 도메인 사이의 칼슘 이온에 대한 배위결합하는 잔기는 다음과 같다(여기 부록 1에서 발견되는 Pdb 파일에서 아미노산잔기와 원자에 대한 Pdb 파일 명명 사용): 활성부위에 가장 근접한 칼슘이온에 대해(pdb 파일에서 IUM 502), His235와 Asp194로부터 중추 카르보닐, 잔기 Asp194, Asn102 및 Asp200으로부터 부사슬 원자 OD1, 및 하나의 물분자 WAT X3(원자 OW7). 나트륨 이온(IUM 505)에 대해, 결합부위는 Asp194, Asp200, Asp183 및 Asp159로부터 원자 OD2와 Val201로부터 중추 카르보닐을 포함한다. 도메인 A와 B 사이의 다른 칼슘 이온에 대한 배위결합은 (IUM 501): Asp204와 Asp150로부터 원자 OD2, Asp183과 Ala181로부터 중추 카르보닐, Asp202로부터 원자 OD1 및 하나의 물분자 WAT X7(원자 OW7)이 있다.

하나의 칼슘이온은 A와 C 도메인 사이에 위치되어 있으며, 다른 것은 C 도메인에 위치되어 있다. 또한 하나의 가장 잘 배위결합된(IUM 503) 첫 번째 언급된 칼슘이온은 Gly300, Tyr302 및 His406으로부터 카르보닐 중추, Asp430으로부터 원자 OD2/OD1, Asp407로부터 원자 OD1 및 하나의 물분자 WAT X6(원자 OW7)을 포함한다. 다른 매우 약하게 배위결합된 칼슘 부위(IUM 504)는 4개의 물분자 WAT X21(원자 OW8), X6(원자 OW6), X9(원자 OW0) 및 X28(원자 OW8), Glu447로부터 OE1/OE2 및 Asn444로부터 OD1으로 구성되어 있다.

기질-결합 부위

어떤 이론에 제한을 두지 않고 기질분자와 효소 사이의 호의적인 상호작용은 (수소결합 및/또는 강한 정전기적 상호작용같은) 효소에 결합되었을 때, 기질의 4Å의 영역내에서 발견된다. 서열 2에 제시되어 있는 아미노산서열을 가지는 B. licheniformis α-아밀라제의 다음과 같은 잔기가 기질의 4Å의 거리안에 있는 것으로 고찰되며 따라서 기질과 상호작용에 관련되는 것으로 믿어진다:

Trp13, Try14, Asn17, Asp18, Ser50, Gln51, Ala52, Asp53, Val54, Gly55, Tyr56, Lys70, Arg74, Lys76, Val102, His105, Gly107, Gly108, Ala109, Trp138, Thr163, Asp164, Trp165, Asn172, Glu189, Tyr193, Leu196, Met197, Try198, Ala199, Arg229, Asp231, Ala232, Lys234, His235, Glu261, Trp263, His327, Asp328, Gln333, Ser334, 및 Leu335.

기질의 4Å의 거리내에 있는 것으로 고찰되는, 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제의 아미노산잔기는 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제의 아미노산서열과 아미노산서열 2를 배열한 후 상기 동정된 아미노산서열에 대응하는 위치를 동정함으로써 쉽게 동정될 수 있다.

구조의 일반성

다양한 테르마밀-유사 α-아밀라제 사이의 높은 상동성 때문에, 부록 1의 배위에 의해 정의된 해명된 구조는 모든 테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조에 대해 대표적인 것으로 믿어진다. 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제의 모델 구조는 각각 아미노산서열 사이의 배열의 사용에 의해 해당 α-아밀라제에 채택된 부록 1에 제공된 배위를 기초로 하여 쉽게 만들어질 수 있다. 모델 구조의 창출은 실시예 1에 예시화되어 있다.

테르마밀-유사 α-아밀라제 구조의 상기 동정된 구조적으로 특징적인 부분은 (Ca-결합 부위, 기질결합부위, 루프, 등) 각각 구조적 요소의 아미노산장기를 동정하기 위해 관련된 테르마밀-유사 α-아밀라제의 모델(또는 해명된) 구조를 기초로 하거나 또는 간단히 여기에 사용된 B. licheniformis α-아밀라제의 아미노산서열과 해당 테르마밀-유사 α-아밀라제의 아미노산서열 사이의 배열을 기초로 하여 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제에서 쉽게 동정될 수 있다.

더욱이, 특이 테르마밀-유사 α-아밀라제의 특이 아미노산잔기의 변형에 의해 정의되는, 본 발명의 테르마밀-유사 변이체와 관련하여, 대응하는 위치에서 변형된 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체(각각 서열 사이의 가장 가능한 아미노산서열로부터 결정되는 것처럼)가 또한 포함되는 것으로 의도되는 것이 이해될 것이다. 따라서, 아미노산잔기가 제공된 α-아밀라제의 구조적 부분을 정의하는 목적을 위해 여기에서 동정되든지 또는 α-아밀라제의 변이체를 동정하기 위해 사용되든지 상관없이, 이런 아미노산잔기는 어떤 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제의 대응하는 아미노산잔기를 제시함으로써 고려되어져야만 한다.

새로운 α-아밀라제 변이체를 디자인하기 위한 본 발명의 방법

본 발명의 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 측면에 따른 방법에서 "테르마밀 유사 α-아밀라제 구조"와 "테르마밀 유사 α-아밀라제 구조"라는 용어는 부록 1에 제시된 배위에 의해 정의된 해명된 구조를 지시하거나 또는 이 해명된 구조를 기초로 하여 만들어진 제공된 테르마밀-유사 α-아밀라제(B. licheniformis α-아밀라제같은)의 모델 구조를 지시하는 것으로 의도된다.

대부분의 경우에 본 발명과 일치하여 변형되는 모 테르마밀-유사 α-아밀라제는 구조를 해명하기 위해 실제적으로 사용된 α-아밀라제와는 다르다(부록 1). 본 발명의 첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 측면에 따른 방법의 해명된 구조(단계 i)에서 부록 1))에서 동정된 아미노산잔기 또는 구조적 부분(들)이 해당 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 해당 아미노산잔기 또는 구조적 부분으로 번역되어야만 한다. "번역"은 구조를 해명하기 위해 사용된 테르마밀-유사 α-아밀라제의 아미노산서열과 해당 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 아미노산서열 사이의 아미노산 서열 배열을 기초로 하여 편리하게 수행된다.

본 발명의 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 측면 각각에 따른 방법의 단계 i)에서 수행되는 분석 또는 비교는 예를 들어 Biosym Technologies, Inc.로부터 구입할 수 있는 컴퓨터 프로그램 인사이트같은 단백질 구조를 분석 및/또는 비교할 수 있는 어떤 적당한 컴퓨터 프로그램의 사용에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 구조비교의 기본적 원리는 비교되는 삼차구조가 2차구조 요소(예를 들어 베럴에서 중앙의 8개의 β-가닥)의 배열을 기초로 하여 가정되며 구조 사이의 상이한 부분은 가정된 구조로부터 후속적으로 쉽게 동정될 수 있다.

본 발명의 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 측면의 방법의 단계 i)에서 동정된 구조적부분은 하나의 아미노산잔기로 구성될 수 있다. 그러나, 보통 구조적 부분은 A, B, 또는 C 도메인중 하나, 이들 도메인중 어느 것 사이의 접촉면, 칼슘결합부위, 루프구조, 기질결합부위 등같은 테르마밀-유사 α-아밀라제의 상기 부분중 전형적으로 하나를 구성하고 있는, 하나 이상의 아미노산잔기로 이루어져 있다.

본 문맥에서 "구조적 또는 기능적 고찰"이라는 용어는 변형은 관련된 구조 또는 구조적 부분과 효소의 기능상에서 이것의 고찰되는 충격의 분석을 기초로 하여 만들어짐을 지시하는 것으로 의도된다. 따라서 선택적으로 이런 α-아밀라제 사이의 기능적 차이점의 분석과 조합하여, 지금까지 밝혀진 다양한 α-아밀라제의 구조의 분석은 α-아밀라제 구조의 어떤 부분에 대해 α-아밀라제의 어떤 특성을 배정하기 위해 또는 이런 상호관계를 고찰하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 활성부위를 둘러싸는 루프의 양상 또는 구조에서의 차이는 기질의 활성부위에 대한 접근에서의 차이와 이로 인한 기질특이성 및/또는 분해양상에서의 차이를 일으킬 수 있다. 더욱이, 기질 결합(그리고 예를 들어 특이성/분해양상), 칼슘 또는 나트륨 이온결합(예를 들어 효소의 칼슘-의존성에 대한 중요성) 등에 관련되거나 또는 관련되는 것으로 고찰되는 테르마밀-유사 α-아밀라제의 부분이 동정되었다(하기 참조).

아미노산잔기 또는 구조적 부분의 변형은 전형적으로 해당 모 효소를 암호하는 DNA 서열의 적당한 변형에 의해 실행된다. 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 방법에서 단계 ii)에서 사용된 것처럼 "변형된"이라는 용어는 다음과 같은 뜻을 가지는 것으로 의도된다: 아미노산잔기와 관련하여 사용되었을 때 이 용어는 다른 아미노산잔기와 해당 아미노산잔기의 치환을 뜻하는 것으로 의도된다. 구조적 부분과 관련하여 사용되었을 때, 이 용어는 상기 구조적 부분의 하나 이상의 아미노산잔기의 치환, 상기 부분에 대한 하나 이상의 아미노산잔기의 첨가, 또는 상기 구조적 부분의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 뜻하는 것으로 의도된다.

흥미있는 변이체의 제조는 변이체의 생성을 조성하는 조건하에서 변이체를 암호하는 DNA 서열로 이루어진 미생물을 배양하고, 선택적으로 후속인 결과의 배양액으로부터 변이체를 회수함으로써 실행된다. 이것이 아래 더욱 자세히 기재되어 있다.

발명의 첫 번째 측면

본 발명의 첫 번째 측면에 따른 방법의 바람직한 구체예에서 변형되는 모 효소의 특성은 칼슘 의존성, 기질결합성, 분해양상, pH 의존활성 등으로부터 선택된다. 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 이런 특성을 변화시키는 방법의 특이 실시예가 아래에 자세히 제공되어 있다.

다른 바람직한 구체예에서 변형되는 모 테르마밀-유사 α-아밀라제는 B. licheniformis α-아밀라제이다.

발명의 두 번째 및 세 번째 측면

본 발명의 두 번째 및 세 번째 측면에 따른 방법의 한가지 중요한 이점은 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조(또는 구조적부분)에 대해 테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조(또는 구조적부분)을 채택하는 것이 가능하다는 것이다. 예를 들어, 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 특별한 특성에 기여하거나 또는 담당하는 것으로 믿어지는 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 루프구조를 동정할 때, 상기 비-테르마밀-유사 α-아밀라제 구조와 테르마밀-유사 α-아밀라제의 해당 구조를 치환하는 것이 가능하며- 또는 테르마밀-유사 α-아밀라제에 해당 구조가 존재하지 않는다면 -관련된 부분이 관여되는 한, 결과의 변이체 테르마밀-유사 α-아밀라제가 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 해당부분과 비슷하게 되는 그런 방법으로 테르마밀-유사 α-아밀라제로 구조를 삽입하는 것이 가능하다. 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조의 둘 이상의 부분이 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 해당부분과 유사하게 하기 위해서 변형되었을 때 테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체의 비-테르마밀-유사 α-아밀라제에 대한 유사성을 증가시켜 상기 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체의 방향에서 상기 변이체의 특성을 변경시키는 것이 가능하다. 루프 변형이 아래에서 더욱 자세히 논의된다.

전형적으로, 본 발명의 두 번째 측면에 따른 방법의 단계 iii)에서 수행되는 변형은 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 해당 부분에 모 α-아밀라제의 상기 부분의 구조를 채택하기 위해서 변형되는 테르마밀-유사 α-아밀라제의 부분의 하나 이상의 아미노산잔기 결실; 비-테르마밀-유사 α-아밀라제에서 해당 위치를 차지하는 아미노산잔기로 변형되는 테르마밀-유사 α-아밀라제의 부분의 하나 이상의 아미노산잔기 치환; 또는 테르마밀-유사 α-아밀라제에서 해당 위치로 비-테르마밀-유사 α-아밀라제에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입에 의해 실행된다. 세 번째 측면에 따른 방법에 대해 변형은 비슷하게 테르마밀-유사 α-아밀라제보다는 비-테르마밀-유사 모 α-아밀라제에 대해 수행되는 것으로 이해되어야 한다.

발명의 두 번째 또는 세 번째 측면에 따른 방법의 단계 ii)에서 동정되는 구조의 부분은 바람직하게는 접힌 효소에서 기질("기질결합부위"라는 표제의 문단의 상기 명세서 참고)과 접촉하는 것으로 믿어지는 부분 또는 기질특이성 및/또는 분해양상에 관련되는 부분, 및/또는 칼슘 또는 나트륨 이온중 하나와 접촉하는 부분, 및/또는 효소의 pH 또는 온도프로필에 기여하고 있는 부분 또는 다른 경우에, 구조 또는 기능적 고찰로부터, 테르마밀-유사 및 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 하나 이상의 특성에서 차이를 담당하는 것으로 고찰되는 부분이다.

비-테르마밀-유사 α-아밀라제

비교가 본 발명의 두 번째 측면의 방법의 단계 i)에서 만들어지며 발명의 세 번째 측면의 방법에서 모 α-아밀라제인 비-테르마밀-유사 α-아밀라제는 테르마밀-유사 α-아밀라제의 패밀리에 속하지 않으며(상기 정의된 것처럼), 결과적으로 다른 삼차구조를 가지는 어떤 α-아밀라제일 것이다. 더욱이, 비-테르마밀-유사 α-아밀라제는, 방법이 수행될 때, 밝혀진 또는 고찰된 삼차구조를 가지는 것이어야만 한다.

비-테르마밀-유사 α-아밀라제는 예를 들어 균주 α-아밀라제, 포유동물 또는 식물 α-아밀라제 또는 박테리아 α-아밀라제(테르마밀-유사 α-아밀라제와는 다른)일 수 있다. 이런 α-아밀라제의 특이예는 Aspergillus oryzae TAKA α-아밀라제, A. niger 산성 α-아밀라제, Bacillus subtilis α-아밀라제, 돼지 췌장 α-아밀라제 및 보리 α-아밀라제를 포함한다. 이런 α-아밀라제 모두는 여기에 제시된 테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조와는 분명히 다른 밝혀진 구조를 가지고 있다.

A. niger 및 A. oryzae로부터 유래된 상기 언급된 균류 α-아밀라제는 아미노산수준에서 매우 상동하여 일반적으로 α-아밀라제의 동일한 패밀리에 속하는 것으로 여겨진다. 본 명세서에서, 이 패밀리는 "펀가밀 유사 α-아밀라제"라고 명명되고 Fungamyl^R로 시판되고 있는 Aspergillus oryzae와 A. niger α-아밀라제로부터 유래되는 균류 α-아밀라제에 예를 들어 80% 상동성(여기에 정의된 것처럼)같은 70% 이상의 높은 상동성을 나타내는 α-아밀라제를 나타내는 것으로 의도된다.

테르마밀-유사 α-아밀라제의 α-아밀라제 구조의 포함된 예도와 펀가밀-유사 α-아밀라제의 구조와 상기 구조의 비교로부터 중요한 차이가 두 구조 사이에 존재한다는 증거가 있다. 본 발명의 방법에서 펀가밀-유사 α-아밀라제에 큰 차이점을 가지는 부위에 속하는 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 부분을 동정하는 것이 특별히 흥미가 있다. 특히, 하나 이상의 다음과 같은 루프: 모 α-아밀라제의 루프 1, 루프 2, 루프 3 및/또는 루프 8에서 모 테르마밀-유사 α-아밀라제를 변형시키는 것이 흥미가 있다.

본 발명의 세 번째 측면의 방법에서 테르마밀같은 테르마밀-유사 α-아밀라제의 비슷한 루프에 대해 매우 비슷한 모 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 루프 1, 루프 2, 루프 3 및/또는 루프 8을 변형시키는 것이 특별히 흥미가 있다.

다음에서 본 발명의 방법의 사용에 의해 디자인되는 변이체의 특이형태가 기술된다.

루프 변형

변형되는 모 α-아밀라제의 기질특이성을 변화시키기 위해서 루프변형을 고려하는 것이 관련된다. 예를 들어 비-테르마밀-유사 α-아밀라제(펀가밀-유사 α-아밀라제같은)의 해당 루프구조와 매우 유사하게 테르마밀-유사 α-아밀라제의 하나 이상의 루프구조를 변화시킬 때 비-테르마밀-유사 α-아밀라제의 루프구조의 방향에서 기질특이성을 변화시키는 것이 가능하다는 것이 고찰된다. 다음에서 흥미있는 루프변형의 여러 형태가 열거된다. 변이체는 변형된 기질특이성에 추가로 다른 변화된 특성을 가질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 특이 테르마밀-유사 α-아밀라제에 대해 동정된 다음의 변형은 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제의 다른 대응하는 위치에서 해당 변형을 포함하는 것으로 의도된다는 것이 이해될 것이다. 더욱이, 보통 루프 변형은 예를 들어 비-테르마밀-유사 α-아밀라제에서 해당 루프구조(또는 이것의 실제적 부분)와 테르마밀-유사 α-아밀라제에서 전체적인 루프구조 또는 이것의 실제적 부분의 치환으로 구성될 것이라는 것이 이해될 것이다.

루프 2 변형

하나의 구체예에서 본 발명은 서열 4의 아미노산서열의 아미노산절편 44-57에 해당하는 절편, 즉 루프 2에 존재하는, 모 α-아밀라제의 적어도 하나의 아미노산잔기가 결실되거나 또는 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산절편 66-84에 해당하는 절편에 존재하는 하나 이상의 아미노산잔기로 치환되거나, 또는 서열 10의 관련된 부분 또는 다른 펀가밀-유사 α-아밀라제의 해당부분을 주형으로서 사용하여 하나 이상의 추가적 아미노산잔기가 첨가되는 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

서열 10에 제시된 아미노산서열은 A. oryzae α-아밀라제, 즉 펀가밀-유사 α-아밀라제의 아미노산서열이다. 다른 α-아밀라제, 특히 펀가밀-유사 α-아밀라제의 해당위치에서 발견되는 아미노산잔기 또는 절편은 본 발명에 따라 변이체의 제조를 위한 주형으로서 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 다른 상동한 α-아밀라제에서 해당부분은 아미노산서열의 비교 및/또는 각각 α-아밀라제의 삼차구조를 기초로 하여 쉽게 동정될 수 있다.

예를 들어, 변이체는, 변이체의 아미노산서열이 상기 모 α-아밀라제의 아미노산서열과 가장 밀접하게 배열되었을 때, 서열 4의 잔기 X로부터 잔기 Y까지 위치와 동일한 위치, 서열 10의 잔기 Z에서 잔기 V까지 확장되는 서열 10의 부분과 예를 들어 적어도 90%같은 적어도 80% 서열 상동성을 가지는 상기 영역을 차지하고 있는 것일 수 있으며, 이 변이체에서

X는 서열 4의 위치 44, 45, 46, 47 또는 48를 차지하고 있는 아미노산잔기,

Y는 서열 4의 위치 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57을 차지하고 있는 아미노산잔기,

Z는 서열 10의 위치 66, 67, 68, 69 또는 70을 차지하고 있는 아미노산잔기, 및

V는 서열 10의 위치 78, 79, 80, 81, 82, 83 또는 84를 차지하고 있는 아미노산잔기이다.

다른 말로, 변이체는 서열 4의 아미노산절편 44-57에 해당하거나 또는 내부에 있는 모 α-아밀라제의 아미노산절편 X-Y는 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산절편 66-84에 해당하거나 또는 내부에 있는 아미노산절편 Z-V와 치환될 수 있는 것일 수 있으며, X, Y, Z 및 V는 상기 지정된 뜻을 가지고 있다.

본 구체예에 따른 변이체의 특이예는 서열 4의 아미노산잔기 48-51에 해당하는, 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 70-78에 해당하는 아미노산절편과 치환되는, 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체이다.

루프 3 변형 - 제한된 변경

다른 구체예에서 본 발명은 서열 4의 아미노산서열의 아미노산절편 195-202에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 모 α-아밀라제의 아미노산잔기중 적어도 하나가 결실되거나 또는 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산 절편 165-177에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 아미노산잔기중 하나 이상으로 치환되거나, 또는 서열 10의 관련된 부분 또는 다른 펀가밀-유사 α-아밀라제의 해당부분을 주형으로서 사용하여 하나 이상의 추가적인 아미노산잔기가 첨가되는 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

예를 들어, 변이체는 서열 4의 아미노산절편 195-202에 해당하거나 또는 내에 있는 모 α-아밀라제의 아미노산절편 X-Y가 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산절편 165-177에 해당하거나 또는 내에 있는 아미노산절편 Z-V로 치환되는 것일 수 있으며, 이 변이체에서

X는 서열 4의 위치 195 또는 196을 차지하고 있는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Y는 서열 4의 위치 198, 199, 200, 201 또는 202를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Z는 서열 10의 위치 165 또는 166을 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

V는 서열 10의 위치 173, 174, 175, 176 또는 177을 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기이다.

다른 방식으로 표현되었을 때, 이런 측면에 따른 변이체는, 변이체의 아미노산서열이 상기 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 아미노산서열과 가장 밀접하게 배열되었을 때, 서열 4의 잔기 X에서 잔기 Y의 위치와 동일한 위치, 서열 10의 잔기 Z에서 잔기 V까지 확장되는 서열 10의 부분과 예를 들어 90%같은 적어도 80% 서열상동성을 가지는 상기 영역을 차지하는 것일 수 있으며, X, Y, Z 및 V의 의미는 상기 정의된 것과 같다.

본 구체예에 따른 변이체의 특이예는, 서열 4의 아미노산잔기 196-198에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 166-173에 해당하는 아미노산절편과 치환되는, 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체이다.

루프 3 변형 - 완전한 도메인 B

심화된 구체예에서 본 발명은 서열 4의 아미노산서열의 아미노산절편 117-185에 해당하는 절편에 존재하는 모 α-아밀라제의 아미노산잔기중 적어도 하나가 결실되거나 또는 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산절편 98-210에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 아미노산잔기중 하나 이상으로 결실되거나, 또는 서열 10의 관련된 부분 또는 다른 펀가밀-유사 α-아밀라제의 해당부분을 주형으로서 사용하여 하나 이상의 추가적 아미노산잔기가 첨가되는 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

예를 들면, 변이체는 서열 4의 아미노산절편 117-185에 해당하거나 또는 내에 있는 모 α-아밀라제의 아미노산절편 X-Y가 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산절편 98-210에 해당하거나 또는 내에 있는 아미노산절편 Z-V로 치환되는 것일 수 있으며, 이 변이체에서

X는 서열 4의 위치 117, 118, 119, 120 또는 121을 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Y는 서열 4의 위치 181, 182, 183, 184 또는 185를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Z는 서열 10의 위치 98, 99, 100, 101, 102를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기, 및

V는 서열 10의 위치 206, 207, 208, 209 또는 210을 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기이다.

이 구체예에 따른 변이체의 특이예는, 서열 4의 아미노산잔기 121-181에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 102-206에 해당하는 아미노산절편으로 치환되는, 모 α-아밀라제의 변이체이다.

또다른 구체예에서 본 발명은, 서열 4의 아미노산서열의 아미노산절편 117-181에 해당하는 절편에 존재하는 모 α-아밀라제의 아미노산잔기중 적어도 하나가 결실되거나 또는 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산절편 98-206에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 아미노산잔기중 하나 이상으로 치환되거나, 또는 서열 10의 관련된 부분 또는 다른 펀가밀-유사 α-아밀라제의 해당부분을 주형으로서 사용하여 하나 이상의 추가적 아미노산잔기가 첨가되는, 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

예를 들어, 변이체는 서열 4의 아미노산절편 117-177에 해당하거나 또는 내에 있는 모 α-아밀라제의 아미노산절편 X-Y가 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산절편 98-202에 해당하거나 또는 내에 있는 아미노산절편 Z-V로 치환되는 것일 수 있으며, 이 변이체에서

Y는 서열 4의 위치 174, 175, 176 또는 177을 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

V는 서열 10의 위치 199, 200, 201 또는 202를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기이다.

발명의 이런 구체예에 따른 변이체의 특이예는, 서열 4의 아미노산잔기 121-174에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 102-199에 해당하는 아미노산절편으로 치환되는 변이체이다.

루프 1 변형 - 최소 첨가

심화된 구체예에서 본 발명은, 서열 4의 아미노산서열의 아미노산절편 12-19에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 모 α-아밀라제의 아미노산잔기중 적어도 하나가 결실되거나 또는 서열 10의 아미노산절편 28-42에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 아미노산잔기중 하나 이상으로 치환되거나, 또는 서열 10의 관련된 부분 또는 다른 펀가밀-유사 α-아밀라제의 해당부분을 주형으로서 사용하여 하나 이상의 추가적 아미노산잔기가 삽입되는, 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

예를 들면 변이체는 서열 4의 아미노산절편 12-19에 해당하거나 또는 내에 있는 모 α-아밀라제의 아미노산절편 X-Y가 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산절편 28-42에 해당하거나 또는 내에 있는 아미노산절편 Z-V로 치환되는 것일 수 있으며, 이 변이체에서

X는 서열 4의 위치 12, 13 또는 14를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Y는 서열 4의 위치 15, 16, 17, 18 또는 19를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Z는 서열 10의 위치 28, 29, 30, 31 또는 32를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기, 및

V는 서열 10의 위치 38, 39, 40, 41 또는 42를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기이다.

본 발명의 이런 측면에 따른 변이체의 특이예는 서열 4의 아미노산잔기 14-15에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 32-38에 해당하는 아미노산절편으로 치환되는 변이체이다.

루프 1 변형 - 완전한 루프

심화된 구체예에서 본 발명은, 서열 4의 아미노산서열의 아미노산잔기 7-23에 해당하는 절편에 존재하는 모 α-아밀라제의 아미노산잔기중 적어도 하나가 결실되거나 또는 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 13-45에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 하나 이상의 아미노산잔기로 치환되거나, 또는 서열 10의 관련된 부분 또는 다른 펀가밀-유사 α-아밀라제의 해당부분을 주형으로서 사용하여 하나 이상의 추가적 아미노산잔기가 삽입되는, 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

예를 들면, 변이체는, 서열 4의 아미노산절편 7-23에 해당하거나 또는 내에 있는 모 α-아밀라제의 아미노산절편 X-Y가 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산절편 13-45에 해당하거나 또는 내에 있는 아미노산절편 Z-V로 치환되는 것일 수 있으며, 이 변이체에서

X는 서열 4의 위치 7 또는 8을 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Y는 서열 4의 위치 18, 19, 20, 21, 22 또는 23을 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Z는 서열 10의 위치 13 또는 14를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기, 및

V는 서열 10의 위치 40, 41, 42, 43, 44 또는 45를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기이다.

본 구체예에 따른 특이 변이체는 서열 4의 아미노산잔기 8-18에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 14-40에 해당하는 아미노산절편으로 치환되는 것이다.

루프 8 변형

심화된 구체예에서 본 발명은, 서열 2의 아미노산서열의 아미노산잔기 322-346에 해당하는 절편에 존재하는 모 α-아밀라제의 아미노산잔기중 적어도 하나가 결실되거나 또는 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 291-313에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 하나 이상의 아미노산잔기로 치환되거나, 또는 서열 10의 관련된 부분 또는 다른 펀가밀-유사 α-아밀라제의 해당부분을 주형으로서 사용하여 하나 이상의 추가적 아미노산잔기가 삽입되는 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

예를 들면, 변이체는 서열 2의 아미노산절편 322-346에 해당하거나 또는 내에 있는 모 α-아밀라제의 아미노산절편 X-Y가 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산절편 291-313에 해당하거나 또는 내에 있는 아미노산절편 Z-V로 치환되는 것일 수 있으며, 이 변이체에서

X는 서열 2의 위치 322, 323, 324 또는 325를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Y는 서열 2의 위치 343, 344, 345 또는 346을 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Z는 서열 10의 위치 291, 292, 293 또는 294를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기, 및

V는 서열 10의 위치 310, 311, 312 또는 313을 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기이다.

발명의 이런 측면에 따른 특이 변이체는, 서열 2의 아미노산잔기 325-345에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 294-313에 해당하는 아미노산절편으로 치환되는 것이다.

Ca ²⁺ 의존성

테르마밀-유사 α-아밀라제의 Ca²⁺ 의존성을 감소시킬 수 있는 것이 매우 바람직하다. 따라서, 심화된 측면에서 본 발명은 α-아밀라제 활성을 나타내며 모 α-아밀라제와 비교했을 때 감소된 Ca²⁺ 의존성을 가지는 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다. 감소된 Ca²⁺ 의존성은 변이체가 모 효소에 대해 필요한 것보다 외부적 배지에서 칼슘이온의 저농도의 존재하에서 만족한 아밀로스분해활성을 나타내어, 예를 들어 칼슘-착화제(예를 들어 어떤 세제 빌더)를 함유한 배지에서 얻어지는 것처럼 칼슘 이온-고갈 조건에 대해 부모보다 덜 민감한 기능적 결과를 가진다.

발명의 변이체의 감소된 Ca²⁺ 의존성은 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 Ca²⁺ 결합 친화성을 증가시킴으로써 유리하게 달성될 수 있으며, 다른 말로 효소의 Ca²⁺ 결합이 강해질수록, Ca²⁺ 의존성은 낮아진다.

나트륨 또는 칼슘이온으로부터 10Å내에 위치한 아미노산잔기는 효소의 Ca²⁺결합능력에 관련되어 있거나 또는 중요하다는 것이 현재 믿어진다.

따라서 발명의 이런 측면에 따라 변이체는 바람직하게는 칼슘에 대한 α-아밀라제의 친화성이 증가되는 그런 방식으로 삼차 테르마밀-유사 α-아밀라제 구조에서 동정되는 칼슘 및/또는 나트륨이온으로부터 10Å내에 존재하는 하나 이상의 아미노산잔기에서 변형되는 것이다.

아미노산서열 2와 B. licheniformis α-아밀라제의 Ca2+ 결합부위로부터 10Å의 거리내에서 발견되는 아미노산잔기는 실시예 2에 기술된 것처럼 결정되었고 다음과 같다:

V102, I103, N104, H105, K106, R125, W155, W157, Y158, H159, F160, D161, G162, T163, Y175, K176, F177, G178, K180, A181, W182, D183, W184, E185, V186, S187, N192, Y193, D194, Y195, L196, M197, Y198, A199, D200, I201, D202, Y203, D204, H205, P206, V208, A209, D231, A232, V233, K234, H235, I236, K237, F238, F240, L241, A294, A295, S296, T297, Q298, G299, G300, G301, Y302, D303, M304, R305, K306, L307, W342, F343, L346, Q392, Y394, Y396, H405, H406, D407, I408, V409, R413, E414, G415, D416, S417, V419, A420, N421, S422, G423, L424, I428, T429, D430, G431, P432, V440, G441, R442, Q443, N444, A445, G446, E447, T448, W449, I462, G475, Y480, V481, Q482, R483.

본 발명의 이런 측면에 따라 변이체를 제조하기 위해서, 다양한 효소의 Ca²⁺ 결합친화성을 개선하는 어떤 다른 아미노산잔기와, 비-최적 칼슘 결합을 제공하는데에 관련되는 것으로 고찰되는, 상기 언급된 아미노산잔기(또는 서열 2에 정의된 것보다 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제에서 동등한 위치를 차지하는 아미노산잔기)중 적어도 하나를 치환하는 것이 바람직하다. 실제로, 아미노산잔기의 동정 및 후속의 변형은 다음과 같은 방법에 의해 수행된다:

i) 구조적 또는 기능적 고찰로부터 비-최적 칼슘 이온 상호작용을 담당하는 것으로 믿어지는, 테르마밀-유사 α-아밀라제 구조의 Ca²⁺ 결합부위로부터 10Å내의 아미노산잔기를 동정하는 단계,

ii) 상기 아미노산잔기가 구조적 또는 기능적 고찰로부터 높은 Ca²⁺ 결합 친화성을 확립하는데 중요한 것으로 믿어지는 다른 아미노산잔기로 치환되는 변이체를 제조하고 결과적인 테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체의 Ca²⁺ 의존성을 시험하는 단계.

본 문맥에서, "비-최적 칼슘 이온 상호작용"이라는어는 해당 아미노산잔기는 어떤 것으로 상기 아미노산잔기의 치환은 효소의 칼슘 이온 결합 상호작용을 개선시킬 수 있는 가정을 기초로 하여 선택됨을 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들면, 해당 아미노산잔기는 하나 이상의 다음과 같은 고찰을 기초로 하여 선택될 수 있다:

- 효소의 표면 근처에 위치한 아미노산잔기와 칼슘이온 사이의 개선된 상호작용을 얻기 위해서(테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조로부터 동정된 것처럼). 예를 들면, 해당 아미노산잔기가 주변 용매에 노출되면, 상기 아미노산잔기와 칼슘이온 사이의 강한 상호작용을 제공하기 위해서 용매로부터 상기 아미노산잔기의 보호를 증가시키는 것이 유리할 수 있다. 이것은 더욱 큰 부피 또는 다른 경우에 개선된 보호효과를 일으키는 아미노산잔기로 상기 잔기(또는 보호에 기여하는 상기 잔기의 근처에 있는 아미노산잔기)를 치환함으로써 완성될 수 있다.

- 예를 들어 테르마밀-유사 α-아밀라제 구조를 안정화함으로써(예를 들어 A, B 및 C 도메인 사이의 접촉을 안정화하거나 또는 이런 도메인중 하나 이상을 안정화함으로써) 칼슘 결합 부위를 안정화하기 위해서. 이것은 예를 들어 칼슘결합부위의 10Å내의, 및 바람직하게는 3 또는 4Å내의, 예를 들어 N 잔기를 D 잔기로 및/또는 Q 잔기를 E 잔기(예를 들어 N104D)로 치환함으로써 얻어질 수 있는 아미노산부사슬에 더 좋은 배위를 제공함으로써 완성될 수 있다.

- 예를 들어 이온과 결합부위 사이의 강한 상호작용을 제공함으로서 칼슘결합부위를 보호하기 위해서 또는 칼슘이온과 칼슘결합부위 사이의 배위를 개선시키기 위해서.

상기 이론에 따라 테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체를 실제적으로 제조하기 전에 테르마밀-유사 α-아밀라제 구조, 예를 들어 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 모델구조에 적용함으로써 고찰된 아미노산변형을 평가하는 것이 편리할 수 있다.

바람직하게, 변형되는 아미노산잔기는 이런 잔기의 5Å내같은, Ca²⁺ 결합부위잔기의 8Å내에 위치된다. 8Å과 5Å 각각 내의 아미노산잔기는 10Å내의 아미노산잔기를 동정하기 위해 사용되는 유사한 방법에 의해 쉽게 동정될 수 있다(실시예 2 참조).

다음의 돌연변이가 테르마밀-유사 α-아밀라제의 Ca²⁺ 의존성을 감소시키는 것에 관해서 특히 흥미있는 것으로 고찰된다:

N104D(B. licheniformis α-아밀라제 서열 2 또는 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제에서 대응되는 위치의 대응되는 (N에서 D) 돌연변이)

Ca²⁺ 의존성에 대한 관련된 치환과 관련하여, 몇몇 다른 치환은 이들이 예를 들어 모 테르마밀-유사 α-아밀라제내의 칼슘 또는 나트륨 결합부위 각각에 또는 내부에 칼슘이온 또는 나트륨이온의 결합 또는 보유강도를 증가시킬 수 있는 효소형태(예를 들면 효소의 전체적 안전성에 기여하는 도메인 A-B 및/또는 도메인 A-C 상호작용)를 안정화하는데 중요한 것으로 보인다.

효소의 칼슘 안정성 및/또는 열안정성을 증가시키기 위해서 C-도메인을 안정화시키는 것이 바람직하다. 이와 관련하여 안정화는 효소에 의한 칼슘 결합의 안정화와 C-도메인과 A-도메인 사이의 개선된 접촉(열안정성에 중요한)의 결과를 일으킨다. 후자는 시스테인 결합, 염 결합의 도입 또는 수소, 소수성 및/또는 정전기적 상호작용을 증가시킴으로써 완성될 수 있다.

예를 들면, 서열 2에 제시된 아미노산서열을 가지는 B. licheniformis α-아밀라제의 C-도메인은 예를 들어 다음과 같은 돌연변이를 도입함으로써 도메인 A와 도메인 C 사이의 시스테인 결합의 도입에 의해 안정화될 수 있다:

A349C+I479C 및/또는 L346C+I430C.

염결합은 다음과 같은 돌연변이의 도입에 의해 얻어질 수 있다:

N457D, E

N457D, E+K385R

F350D, E+I430R, K

F350D, E+I411R, K

도메인 C의 칼슘부위는 어떤 다른 아미노산잔기와 아미노산잔기 H408 및/또는 G303을 치환함으로써 안정화될 수 있다. 다음과 같은 돌연변이가 특히 흥미있다:

H408Q, E, N, D 및/또는 G303N, D, Q, E

이것은 칼슘 고갈로부터 더 좋은 칼슘 결합 또는 보호를 제공하는 것으로 고찰된다.

비슷한 돌연변이가 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제의 동일한 위치에서 도입될 수 있다.

칼슘 의존성을 감소시키는 것과 관련하여 중요하다고 여겨지는 다른 치환 돌연변이(서열 2, B. licheniformis α-아밀라제에 관련된)는 다음과 같은: R23K, H156Y, A181T, A209V 및 G310D(또는 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제의 동일한 위치에서 동일한 돌연변이)를 포함한다. 다른 아미노산과 R214와 P345의 치환은 이와 관련하여 또한 중요할 수 있다.

고/저 pH에서 변경된 활성을 가지는 변이체

활성부위잔기의 pKa를 변화시킴으로써 주어진 pH에서 테르마밀-유사 α-아밀라제 또는 효소 활성의 최적 pH를 변화시키는 것이 가능하다는 것이 고찰된다. 이것은 예를 들어 변형되는 아미노산잔기의 아미노산사슬의 기능적군과 이것의 근접한 주위 사이의 정전기적 상호작용 또는 소수성 상호작용을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 이것은 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 실행될 수 있다:

i) 해당 테르마밀-유사 α-아밀라제의 구조에서, 아미노산잔기가 활성부위잔기와 정전기적 또는 소수성 상호작용에 관련되는 것으로 고찰되는, 활성부위잔기로부터 15Å내, 특히 활성부위잔기로부터 10Å내의 아미노산잔기를 동정하는 단계,

ii) 구조에서, 상기 아미노산잔기를 활성부위잔기의 정전기적 및/또는 소수성 환경을 변화시키는 아미노산잔기와 치환하고 이 구조에서 아미노산잔기의 조화를 평가하는 단계,

iii) 구조로 조화된 아미노산치환이 동정될 때까지 단계 i) 및/또는 ii)를 선택적으로 반복하는 단계,

iv) 단계 i), ii) 및 선택적으로 iii)으로부터 결과적인 테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체를 제조하고 상기 변이체의 흥미있는 pH 의존 효소활성을 검사하는 단계.

상기 방법에서 글루타메이트의 5Å내로 양전하를 띈 잔기를 첨가하거나(따라서 글루타메이트의 pKa가 약 4.5 내지 4로 낮아짐) 또는 글루타메이트의 5Å내로 음전하를 띈 잔기를 첨가하거나(따라서 pKa가 약 5로 증가됨), 또는 히스티딘의 약 5Å 거리내에서 비슷한 변형을 만드는 것이 특히 적절할 수 있다.

심화된 측면에서 본 발명은 모 α-아밀라제보다 낮은 pH(예를 들어 최적 pH와 비교했을 때)에서 높은 활성을 나타내는 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다. 특히, 변이체는 B. licheniformis α-아밀라제(서열 2)의 다음과 같은 위치중 적어도 하나에 해당하는 아미노산잔기의 돌연변이로 구성된다:

E336, Q333, P331, I236, V102, A232, I103, L196

다음과 같은 돌연변이가 특히 흥미있다:

E336R, K

Q333R, K

P331R, K

V102R, K, A, T, S, G;

I236K, R, N;

I103K, R;

L196K, R;

A232T, S, G;

또는 여기에 개시된 다른 변이체의 어느 것과 이런 변이체의 둘 이상의 어떤 조합 또는 이런 변이체의 하나 이상의 어떤 조합.

더욱 심화된 측면에서 본 발명은 모 α-아밀라제보다 높은 pH에서 높은 활성을 갖는 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다. 특히, 변이체는 B. licheniformis α-아밀라제(서열 2)의 다음과 같은 위치중 적어도 하나에 해당하는 아미노산잔기의 돌연변이로 구성된다:

N236, H281, Y273

특히, 변이체는 B. licheniformis α-아밀라제(서열 2)의 다음과 같은 돌연변이중 적어도 하나에 해당하는 돌연변이로 구성된다:

N326I, Y, F, L, V

H281F, I, L

Y273F, W

또는 여기에 개시된 다른 변이체의 어느 것과 이런 변이체의 두 개 이상의 어떤 조합 또는 이런 변이체의 하나 이상의 어떤 조합.

발명의 변이체의 특이활성과 관련하여 중요하다고 여겨지는 돌연변이는 B. licheniformis α-아밀라제(서열 2)에서 치환 S187D에 해당하는 돌연변이이다.

증가된 열안정성 및/또는 변경된 최적 온도를 갖는 변이체

더욱 원하는 측면에서 본 발명은 변이체의 증가된 열안정성을 얻기 위해서 모 α-아밀라제를 결실, 치환 또는 첨가되는 하나 이상의 아미노산잔기의 결과를 가지는 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

테르마밀-유사 α-아밀라제 구조는 물을 함유할 수도 있는 많은 특별한 내부적 구멍과 많은 틈을 포함하고 있다. α-아밀라제의 열안정성을 증가시키기 위해서 예를 들어 하나 이상의 소수성 접촉을 도입함으로써, 바람직하게는 구멍의 근처 또는 주변에 더욱 부피가 큰 잔기를 도입함으로써 완성되는, 구멍과 틈의 수를 감소시키는 것(또는 구멍 또는 틈의 크기를 감소)이 바람직할 것이다. 예를 들어, 변형되는 아미노산잔기는 구멍의 형성에 관련되는 것들이다.

따라서, 심화된 측면에서 본 발명은 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 열안정성을 증가 및/또는 최적온도를 변경하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은

i) 상기 α-아밀라제의 삼차구조에서 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 내부 구멍 또는 틈을 동정하는 단계,

ii) 구조에서, i)에서 동정된 구멍 또는 틈의 부근에 있는 하나 이상의 아미노산잔기를 구조적 또는 기능적 고찰로부터 소수성 상호작용을 증가시키며 구멍 또는 틈을 채우거나 또는 크기를 감소시키는 것으로 믿어지는 다른 아미노산잔기로 치환시키는 단계,

iii) 단계 ii)로부터 결과적인 테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체를 제조하고 변이체의 열안정성 및/또는 최적 온도를 검사하는 단계로 이루어진다.

또 테르마밀-유사 α-아밀라제의 구멍 또는 틈을 동정하기 위해 사용되는 구조는 부록 1에 동정된 구조 또는 여기에서 만들어진 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 모델구조일 것이다.

구멍 또는 틈은 구멍/틈 주위의 아미노산잔기에 의해 동정되며 상기 아미노산잔기의 변형은 구멍/틈의 크기를 채우거나 또는 감소시키는데에 중요하다는 것이 이해될 것이다. 아래에서 언급되는 특별한 아미노산잔기는 결정구조에서 해당 구멍/틈의 주위에서 발견되는 것들이다.

도메인 A와 B 사이에 위치하는 중요한 구멍을 채우기 위해서(완전하게 또는 부분적으로), B. licheniformis α-아밀라제의 다음과 같은 잔기중 하나 이상에 해당하는 아미노산잔기의 어떤 다른 아미노산잔기에 대한 돌연변이가 고찰된다:

L61, Y62, F67, K106, G145, I212, S151, R214, Y150, F143, R146

모 효소의 아미노산잔기보다 더욱 부피가 큰 아미노산잔기에 대한 돌연변이가 특히 흥미있다.

다음과 같은 돌연변이(B. licheniformis α-아밀라제(서열 2)의 번호를 사용)에 해당하는 돌연변이로 이루어진 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체가 특히 흥미있다.

L61W, V, F;

Y62W;

F67W;

K106R, F, W;

G145F, W;

I212F, L, W, Y, R, K;

어떤 다른 아미노산잔기 및 특히 F, W, I 또는 L로 치환된 S151

R214W;

Y150R, K;

F143W; 및/또는

R146W.

활성부위의 부근의 구멍을 채우기 위해서 B. licheniformis α-아밀라제(서열 2)의 다음과 같은 잔기중 하나 이상에 해당하는 아미노산잔기의 어떤 다른 아미노산잔기에 대한 돌연변이가 고찰된다:

L241, I236.

더욱 부피가 큰 아미노산잔기에 대한 돌연변이가 흥미있다.

B. licheniformis α-아밀라제에서 다음과 같은 돌연변이중 하나 이상에 해당하는 돌연변이로 이루어진 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체가 특히 흥미있다.

L241I, F, Y, W; 및/또는

I236L, F, W, Y

L7, V259, F284

더욱 부피가 큰 아미노산잔기에 대한 돌연변이가 흥미있다.

B. licheniformis α-아밀라제에서 다음과 같은 돌연변이중 하나 이상에 해당하는 돌연변이로 이루어진 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체가 흥미있다:

L7F, I, W

V259F, I, L

F284W

활성부위 부근의 구멍을 채우기 위해서 B. licheniformis α-아밀라제(서열 2)의 다음과 같은 잔기중 하나 이상에 해당하는 아미노산잔기의 어떤 다른 아미노산잔기에 대한 돌연변이가 고찰된다:

F350, F343

더욱 부피가 큰 아미노산잔기에 대한 돌연변이가 흥미있다.

B. licheniformis α-아밀라제에서 다음과 같은 돌연변이중 하나 이상에 해당하는 돌연변이로 이루어진 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체가 특히 흥미있다:

F350W

F343W

L427, V481

더욱 부피가 큰 아미노산잔기에 대한 돌연변이가 흥미있다.

L427F, L, W

V481, F, I, L, W

변경된 분해양상을 가지는 변이체

녹말액화공정에서 짧은 분지된 올리고당(종래 테르마밀-유사 α-아밀라제같은)보다 길게 분지된 올리고당(예를 들어 펀카밀-유사 α-아밀라제같은)으로 녹말분자를 분해할 수 있는 α-아밀라제를 사용하는 것이 바람직하다. 결과적인 매우 작은 분지된 올리고당(패노스 전구체)은 액화공정에서 α-아밀라제후와 아밀로글루코시다제의 전에 사용되는 풀룰라나제에 의해 적절히 가수분해될 수 없다. 따라서, 패노스 전구체의 존재에서 아밀로-글루코아밀라제의 활성은 작은 분지된 제한-덱스트린, 트리사카라이드 패노스의 높은 정도로 끝난다. 패노스의 존재는 당화수율을 상당히 낮추고 따라서 바람직하지 않다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 동시에 테르마밀-유사 α-아밀라제의 열안정성을 감소시킴이 없이 펀가밀-유사 α-아밀라제에 대해 테르마밀-유사 α-아밀라제의 분해특성을 변화시키는 것이다.

따라서, 심화된 측면에서 본 발명은 분지점에 가깝게 기질을 분해하는데에 감소된 능력을 가지는 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

변이체는 다음과 같은 방법에 의해 적당히 제조될 것이다.

i) 상기 α-아밀라제의 삼차구조의 모델에서 모 테르마밀-유사 α-아밀라제의 기질결합영역을 동정하는 단계(예를 들어 "기질결합부위"라는 표제의 상기 문단에서 정의된 것처럼 기질결합부위로부터 4Å의 범위내),

ii) 이 모델에서, 모 α-아밀라제의 분해양상을 담당하는 것으로 믿어지는, i)에서 동정된 틈의 기질결합영역의 하나 이상의 아미노산잔기를 구조적 고찰로부터 변경된 기질분해양상을 일으키는 것으로 믿어지는 다른 아미노산잔기로 치환, 또는 기질에 우호적 상호작용을 도입하기 위해서 고찰되는 기질결합영역의 하나 이상의 아미노산잔기를 결실 또는 기질에 우호적 상호작용을 도입하기 위해서 고찰되는 기질결합영역에 하나 이상의 아미노산잔기를 첨가시키는 단계, 및

iii) 단계 ii)로부터 결과적인 테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체를 제조하고 변이체의 기질분해양상을 검사하는 단계.

야생형 B. licheniformis α-아밀라제의 사용에 의해 얻어지는 것보다 분지점으로부터 하나 이상의 글루코스단위, 바람직하게는 분지점으로부터 둘 또는 삼 이상의 글루코스 단위의 환원말단으로부터, 즉 분지점으로부터 심화된 거리에서, 아밀로펙틴 기질을 분해하는 변이체가 특히 흥미있다.

본 발명의 이런 측면과 관련하여 특히 흥미있는 잔기는 B. licheniformis α-아밀라제(서열 2)의 다음과 같은 잔기: V54, D53, Y56, Q333, G57에 해당하며 이런 측면에 따라 변이체는 바람직하게는 이들 잔기의 하나 이상에서의 돌연변이로 이루어진다.

특히, 변이체는 분지점에 가까운 분해를 방해하는 것으로 예상되는 다음과 같은 돌연변이중 적어도 하나로 이루어진다:

V54L, I, F, Y, W, R, K, H, E, Q

D53L, I, F, Y, W

Y56W

Q333W

G57 모든 가능한 아미노산잔기

A52 예를 들어 A52W, Y, L, F, I 같은 A보다 큰 아미노산잔기

균류 α-아밀라제의 변이체

더욱 심화된 구체예에서 본 발명은, 서열 10의 아미노산서열의 아미노산잔기 291-313에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 모 α-아밀라제의 아미노산잔기중 적어도 하나가 결실되거나 또는 서열 4에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 98-210에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 아미노산잔기중 하나 이상으로 치환되거나, 또는 서열 4의 관련된 부분 또는 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제의 해당부분을 주형으로서 사용하여 하나 이상의 추가적 아미노산잔기가 삽입되는, 모 펀가밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

예를 들어, 변이체는, 서열 10의 아미노산절편 117-185에 해당하거나 또는 내에 있는 모 α-아밀라제의 아미노산절편 X-Y가 서열 4에 제시된 아미노산서열의 아미노산절편 98-210에 해당하거나 또는 내에 있는 아미노산절편 Z-Y로 치환되는 것일 수 있으며, 이 변이체에서

X는 서열 10의 위치 117, 118, 119, 120 또는 121를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Y는 서열 10의 위치 181, 182, 183, 184 또는 185를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기,

Z는 서열 4의 위치 98, 99, 100, 101 또는 102를 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기, 및

V는 서열 4의 위치 206, 207, 208, 209 또는 210을 차지하는 아미노산에 해당하는 아미노산잔기이다.

본 발명의 이런 측면에 따른 변이체의 특이예는 서열 10의 아미노산잔기 121-181에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 서열 4에 제시된 아미노산서열이 아미노산잔기 102-206에 해당하는 아미노산절편으로 치환되는 것이다.

본 발명의 이런 측면에 따른 변이체의 다른 예는 서열 10의 아미노산잔기 121-174에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 서열 4에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 102-199에 해당하는 아미노산절편으로 치환되는 것이다.

심화된 구체예에서 본 발명은 서열 10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 181-184에 해당하는 아미노산절편이 결실되는 모 펀가밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.

발명의 변이체에서 일반적 돌연변이

발명의 변이체 또는 발명의 방법과 일치하여 제조된 발명의 변이체가 상기 개요된 것들에 덧붙여서 하나 이상의 변형으로 이루어지는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 변형되는 α-아밀라제 변이체의 부분에 존재하는 하나 이상의 프롤린 잔기는 가능한, 자연적으로 발생하는 비-프롤린잔기의 어느 것일 것이며, 바람직하게는 알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 발린 또는 루신인 비-프롤린잔기로 치환되는 것이 유리할 것이다.

비슷하게, 모 α-아밀라제가 변형되는 아미노산잔기에 존재하는 하나 이상의 시스테인잔기가 세린, 알라닌, 트레오닌, 글리신, 발린 또는 루신같은 비-시스테인 잔기로 치환되는 것이 바람직할 것이다.

더욱이, 발명의 변이체는 변형만으로 또는 상기 개요된 변형의 어느것과 조합하여 변형되어 서열 8의 아미노산절편 185-209에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 하나 이상의 Asp 및/또는 Glu는 각각 Asn 및/또는 Gln으로 치환된다. 또한 테르마밀-유사 α-아밀라제에 존재하는 하나 이상의 Lys 잔기가 Asn 및/또는 Gln 각각으로 치환된 서열 8의 아미노산절편 185-209에 해당하는 아미노산절편에 존재하는 Arg로 치환되는 변형이 흥미있다.

본 발명과 일치하여 상기 개요된 변형의 둘 이상을 수반하는 변이체가 제조될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들면, 루프 1과 루프 2 영역에서의 변형, 루프 2와 제한된 루프 3에서의 변형, 루프 1, 루프 2, 루프 3 및 루프 8에서의 변형 등으로 이루어진 변이체가 제조될 수 있다.

더욱이, 여기에 기재된 변이체의 어느 것에서 점-돌연변이를 도입하는 것이 유리할 수 있다.

α-아밀라제 변이체 제조방법

유전자로 돌연변이를 도입하기 위한 몇몇 방법이 본 분야에 공지되어 있다. α-아밀라제-암호 DNA 서열 클로닝의 짧은 설명후에, α-아밀라제-암호 서열내의 특이부위에 돌연변이를 발생하기 위한 방법이 논의될 것이다.

α-아밀라제를 암호하는 DNA 서열 클로닝

모 α-아밀라제를 암호하는 DNA 서열은 본 분야에 잘 공지된 다양한 방법을 사용하여, 해당 α-아밀라제를 생성하는 세포 또는 미생물로부터 분리될 것이다. 먼저, 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리가 연구되는 α-아밀라제를 생성하는 생물로부터 염색체 DNA 또는 전력 RNA를 사용하여 제조되어야만 한다. 따라서, α-아밀라제의 아미노산서열이 공지되어 있다면, 상동한 표지된 올리고누클레오티드 프로브가 합성될 것이며 해당 생물로부터 제조된 게놈 라이브러리로부터 α-아밀라제-암호 클론을 동정하기 위해서 사용될 것이다.

선택적으로 공지된 α-아밀라제 유전자에 상동한 서열을 함유하고 있는 표지된 올리고누클레오티드 프로브는 혼성화와 덜 엄격한 세척조건을 사용하여 α-아밀라제-암호 클론을 동정하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 그러나 α-아밀라제-암호 클론을 동정하기 위한 다른 방법은 플라스미드같은 발현벡터로 게놈 DNA의 절편을 삽입, 결과적인 게놈 DNA 라이브러리를 α-아밀라제 음성 박테리아로 형질전환, 그후 α-아밀라제에 대한 기질을 함유하는 아가상에 형질전환된 박테리아를 플레이칭, 따라서 동정된 α-아밀라제를 발현하는 클론을 허용하는 것을 포함한다.

선택적으로, 효소를 암호하는 DNA 서열은 예를 들어 S.L. Beaucage와 M.H. Caruthers (1981)에 의해 기재된 포스포로아미디트 방법 또는 Matthes et al. (1984)에 의해 기재된 방법같은 확립된 표준방법에 의해 합성적으로 제조될 것이다. 포스포로아미디트 방법에서, 올리고누클레오티드는 예를 들어 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제, 어니일링하여 적당한 벡터로 라이게이션되고 클론된다.

마지막으로, DNA 서열은 표준기술에 따라서, 합성, 게놈 또는 cDNA 기원(적당한, 전체 DNA 서열의 다양한 부분에 해당하는 절편)의 절편을 라이게이션함으로써 제조되는 혼합된 게놈 및 합성 기원, 혼합된 합성 및 cDNA 기원 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원일 것이다. DNA 서열은 또한 예를 들면 US 4,682,202 또는 R.K. Saiki et al. (1988)에 기재된 것처럼 특이 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 제조될 수 있다.

부위-특이적 돌연변이 유발

α-아밀라제-암호 DNA 서열이 분리되고, 돌연변이에 대한 바람직한 부위가 동정될 때마다, 돌연변이는 합성 올리고누클레오티드를 사용하여 도입될 거싱다. 이런 올리고누클레오티드는 원하는 돌연변이 부위를 말단화하는 누클레오티드 서열을 함유하고 있다. 즉, 돌연변이 누클레오티드는 올리고누클레오티드 합성동안 삽입된다. 특이 방법에서, α-아밀라제-암호 서열을 연결하는, DNA의 단일가닥 갭이 α-아밀라제 유전제를 수반하는 벡터에서 발생된다. 그후 원하는 돌연변이를 가지는 합성 누클레오티드는 단일가닥 DNA의 상동한 위치로 어니일링된다. 남아 있는 갭은 그후 DNA 중합효소 I(클레노우 절편)으로 채워지고 구조체는 T4 리가아제를 사용하여 라이게이션된다. 본 방법의 특이 실시예가 Morinaga et al. (1984)에 기재되어 있다. US 4,760,025는 카세트의 작은 변경을 수행함으로써 다수 돌연변이를 암호하는 올리고누클레오티드의 도입을 개시한다. 그러나, 다양한 길이의 다수의 올리고누클레오티드가 도입될 수 있기 때문에 더욱 다양한 돌연변이가 Morinaga 방법에 의해 어느 때든지 도입될 수 있다.

α-아밀라제-암호 DNA 서열로 돌연변이를 도입하는 다른 방법이 Nelson과 Long (1989)에 기재되어 있다. 이것은 PCR 반응에서 프라이머의 하나로서 화학적으로 합성된 DNA 기닥을 사용하여 도입되는 원하는 돌연변이를 함유한 PCR 절편의 3-단계 생성을 포함한다. PCR-생성된 절편으로부터, 돌연변이를 수반하는 DNA 절편은 제한 엔도누클레아제 분해로 분리되고 발현 플라스미드로 재삽입될 것이다.

임의 돌연변이유발

임의 돌연변이유발은 해당 또는 전체 유전자내로 제시된 아미노산서열을 해독하는 유전자의 적어도 세부분에서 국부- 또는 영역-특이적 임의 돌연변이유발로 적절히 수행된다.

모-테르마밀-유사 α-아밀라제의 온도 안정성을 개선시키는 목적으로 영역-특이적 임의 돌연변이유발에 대해서, B. licheniformis α-아밀라제(서열 2)의 다음과 같은 아미노산잔기에 해당하는 코돈 위치가 적당히 표적될 것이다:

도메인 A와 C 사이의 칼슘부위의 안정성을 개선시키기 위해서

I428-A435

T297-L308

F403-V409

도메인 A와 B 사이의 안정성을 개선시키기 위해서

D180-D204

H156-T163

A232-F238

테르마밀-유사 α-아밀라제 변이체, 변형된(예를 들어 높은) 기질 특이성 및/또는 기질의 분해(가수분해)에 대하여 변형된(예를 들어 높은) 특이성에 의해 기질의 개선된 결합(즉 아밀로스 또는 아밀로펙틴같은 탄수화물류의 개선된 결합)을 달성하기 위한 목적으로 서열 2에 제시된 아미노산서열에 대한 다음과 같은 코돈위치(또는 본 발명의 문맥에서 다른 모-테르마밀-유사 α-아밀라제에 대한 동일한 코돈 위치)가 특히 적당히 표적될 것이다:

13-18

50-56

70-76

102-109

163-172

189-199

229-235

360-364

327-335

발명의 상기-기재된 방법의 단계 a)와 일치하여 수행되는 모 α-아밀라제를 암호하는 DNA 서열의 임의 돌연변이유발은 본 분야에 공지된 어떤 방법의 사용에 의하여 편리하게 수행될 것이다.

예를 들면, 임의 돌연변이유발은 적당한 물리적 또는 화학적 돌연변이유발제의 사용, 적당한 올리고누클레오티드의 사용, 또는 PCR-생성된 돌연변이유발에 DNA 서열을 적용함으로써 수행될 수 있다. 더욱이, 임의 돌연변이유발은 이런 돌연변이유발제의 어떤 조합의 사용에 의해 수행될 것이다.

돌연변이유발제는 예를 들어 전이, 전좌, 역위, 스크램블링, 결실 및/또는 삽입을 유도하는 어떤 것일 것이다.

본 목적을 위해 적당한 물리적 또는 화학적 돌연변이유발제의 예는 자외선(UV)조사, 히드록실아민, N-에틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), O-메틸히드록실아민, 아질산, 에틸메탄술포네이트(EMS), 이아황산나트륨, 포름산 및 누클레오티드 유사체를 포함한다.

이런 약제가 사용되었을 때, 돌연변이유발은 전형적으로 발생하는 돌연변이유발에 적당한 조건하에서 선택한 돌연변이유발제의 존재하에서 돌연변이되는 모 효소를 암호하는 DNA 서열을 배양하고 원하는 특성을 가지는 돌연변이된 DNA를 선별함으로써 수행된다.

돌연변이유발이 올리고누클레오티드의 사용에 의해 수행되었을 때, 올리고누클레오티드는 변화되어야 하는 위치에서 올리고누클레오티드의 합성동안 세 개의 비-모 누클레오티드로 도우핑되거나 스파이킹될 것이다. 도우핑 또는 스파이깅이 행해져 원하지 않는 아미노산에 대한 코돈이 제거된다. 도핑된 또는 스파이킹된 올리고누클레오티드는 예를 들어 PCR, LCR 또는 어떤 DNA 중합효소 및 리가아제를 사용하여 어떤 발표된 기술에 의해 아밀로스분해효소를 암호하는 DNA로 통합될 수 있다.

PCR-생성된 돌연변이유발이 사용되었을 때, 모 α-아밀라제 효소를 암호하는 화학적으로 처리된 또는 처리되지 않은 유전자는 누클레오티드의 잘못된 통합을 증가시키는 조건하에서 PCR에 적용된다(Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol. 1, 1989, pp 11-15).

E. coli(Folwer et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191), S. cereviseae 또는 어떤 다른 미생물의 돌연변이유발 균주가 예를 들어 모 효소를 함유하고 있는 플라스미드를 돌연변이유발 균주로 형질전환, 플라스미드를 가지고 있는 돌연변이유발 균주를 생장 및 돌연변이유발 균주로부터 돌연변이된 플라스미드를 분리함으로써 아밀로스분해 효소를 암호하는 DNA의 임의 돌연변이유발을 위해 사용될 것이다. 돌연변이된 플라스미드는 후속적으로 발현생물로 형질전환될 것이다.

돌연변이유발되는 DNA 서열은 모 아밀로스분해 효소를 발현하는 생물로부터 제조된 게놈 또는 cDNA 라이브러리로 편리하게 제공될 것이다. 선택적으로, DNA 서열은 플라스미드 또는 박테리오파지같은 적당한 벡터로 제공될 수 있으며, 이것은 돌연변이유발제와 배양되거나 또는 노출될 수 있다. 돌연변이유발되는 DNA는 또한 상기 세포의 게놈에 통합되어 있거나 또는 세포가 가지고 있는 벡터로 제공함으로서 숙주세포로 제공될 수 있다. 마지막으로, 돌연변이유발되는 DNA는 분리된 형태로 나타날 수 있다. 임의 돌연변이유발에 적용되는 DNA 서열을 바람직하게는 cDNA 또는 게놈 DNA 서열인 것이 이해될 것이다.

몇몇 경우에 수행되는 발현단계(b) 또는 검색단계(c) 전에 돌연변이된 DNA 서열을 증폭시키는 것이 편리할 것이다. 이런 증폭은 모 효소의 DNA 또는 아미노산서열을 기초로 하여 제조된 올리고누클레오티드 프라이머를 사용한 PCR-생성 증폭인 현재 바람직한 방법인, 본 분야에 공지된 방법에 따라서 수행될 것이다.

돌연변이유발제와 배양 또는 노출후에, 돌연변이된 DNA는 발생하는 발현을 허락하는 조건하에서 DNA 서열을 수반하는 적당한 숙주세포를 배양함으로써 발현된다. 이런 목적을 위해 사용되는 숙주세포는 선택적으로 벡터로 제공되는 돌연변이된 DNA 서열로 형질전환된 것 또는 돌연변이유발 처리동안 모 효소를 암호하는 DNA 서열을 수반하는 것일 것이다. 적당한 숙주세포의 예는 다음과 같다: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus같은 그람양성 박테리아;와 E. coli같은 그람음성 박테리아.

돌연변이된 DNA 서열은 더욱 돌연변이된 DNA 서열의 발현을 허락하는 기능을 암호하는 DNA 서열로 구성될 수 있다.

국부적 임의 돌연변이유발: 임의 돌연변이유발은 해당 모 α-아밀라제의 부분에 유리하게 위치될 것이다. 이것은 예를 들어 효소의 제공된 특성에 특히 중요한 효소의 어떤 영역이 동정되었을 때, 그리고 개선된 특성을 가지는 변이체를 일으키는 것으로 기대되게 변형되었을 때 유리할 것이다. 이런 영역은 보통 모 효소의 사차구조가 밝혀지고 효소의 기능과 관련되어 있을 때 동정될 수 있다.

국부적 임의 돌연변이유발은 상기 기재된 것처럼 PCR-생성 돌연변이유발 기술 또는 본 분야에 공지된 어떤 다른 적당한 기술의 사용에 의해 편리하게 수행된다.

선택적으로, 변형되는 DNA 서열의 부분을 암호하는 DNA 서열은 예를 들어 적당한 벡터로 삽입됨으로써 분리될 수 있으며, 상기 부분은 후속적으로 상기 논의된 돌연변이유발 방법의 어느 것의 사용에 의해 돌연변이유발에 적용될 수 있다.

발명의 상기-언급된 방법에서 검색단게와 관련하여, 이것은 다음 이론에 기초한 필터 분석의 사용에 의해 편리하게 수행될 것이다:

흥미있는 돌연변이된 아밀로스분해 효소를 발현할 수 있는 미생물은 적당한 배지와 분비되는 효소에 대해 적당한 조건하에서, 첫 번째 단백질-결합 필터와 이것의 꼭대기에서 낮은 단백질 결합성을 나타내는 두 번째 필터로 이루어진 이중필터로 제공되는 배지상에서 배양된다. 미생물은 두 번재 필터에 위치된다. 배양후에, 미생물로부터 분비되는 효소로 이루어진 첫 번째 필터는 미생물로 이루어진 두 번째 필터로부터 분리된다. 첫 번째 필터는 원하는 효소 활성을 검색하는데에 적용되고 두 번째 필터에 존재하는 해당 미생물 콜로니는 동정된다.

효소 활성을 결합하는데에 사용되는 필터는 예를 들어 나일론 또는 니트로셀룰로오스같은 어떤 단백질 결합 필터일 것이다. 발현 생물의 콜로니를 수반하는 꼭대기-필터는 예를 들어 셀룰로오스 아세테이트 또는 DuraporeTM같은 결합 단백질의 친화성이 낮거나 없는 어떤 필터일 것이다. 필터는 검색을 위해 사용되는 조건중 어느 것으로 전처리되거나 또는 효소활성의 검출동안 처리될 것이다.

효소활성은 효소활성의 검출을 위해 염료, 형광, 침전, pH 지시기, IR-흡수도 또는 어떤 다른 공지된 기술에 의해 검출될 것이다.

검출 화합물은 예를 들어 아가로스, 아가, 젤라틴, 폴리아크릴아미드, 녹말, 필터 페이퍼, 옷감같은 고정재; 또는 고정재의 어떤 조합에 의해 고정될 수 있다.

α-아밀라제 활성은 아가로즈상에 고정된 시바크론 레드 표지된 아밀로펙틴으로 검출된다. 증가되는 열 및 고-pH 안정성을 가지는 변이체를 검색하기 위해, 결합된 α-아밀라제 변이체를 가지는 필터는 특별한 시간동안 pH 10.5와 60℃ 또는 65℃에서 완충액과 배양한 후 탈이온화된 물로 간단히 세척한 후 활성검출을 위해 아밀로펙틴-아가로스 기질상에 놓는다. 잔기활성은 아밀로펙틴 분해에 의해 시바크론 레드의 용해로서 보여진다. 조건은 서열 1에 제시된 아미노산서열을 가지는 α-아밀라제가 겨우 검출될 수 있기 때문에 그런 활성이 있는 것으로 선택된다. 안정화된 변이체는 동일한 조건하에서, 시바크론 레드의 증가되는 유리 때문에 증가된 색 강도를 보여준다.

낮은 온도 및/또는 넓은 온도범위상에서 최적 활성을 가지는 변이체를 검색하기 위해, 결합된 변이체를 가지는 필터는 아밀로펙틴-시바크론 레드 기질상에 직접적으로 놓이고 특별한 시간동안 원하는 온도(예를 들어 4℃, 10℃ 또는 30℃)에서 배양된다. 이 시간후에 서열 1에 제시된 아미노산서열을 가지는 α-아밀라제 때문에 활성은 겨우 검출될 수 있지만, 낮은 온도에서 최적 활성을 가지는 변이체는 증가된 아밀로펙틴 용해를 보여준다. 아밀로펙틴 기질로 배양전에, 모든 종류의 원하는 배지-예를 들어 Ca2+, 세제, EDTA 또는 다른 적당한 첨가제를 함유한 용액-에서 배양은 변화된 의존성 또는 이런 첨가제와 해당 변이체의 반응을 검색하기 위해서 수행될 수 있다.

발명의 변이체의 검사

발명의 변이체의 검사는, 예를 들면 녹말-함유 아가로스 플레이트상에서 변이체를 암호하는 DNA 서열로 형질전환된 숙주세포를 생장시키고 녹말-분해 숙주세포를 동정함으로써, 변이체의 녹말-분해 활성을 결정함으로써 적절히 수행될 수 있다. 더욱이, 변경된 특성(특이 활성, 기질 특이성, 분해양상, 열활성화, 최적 pH, pH 의존성, 최적온도, 및 어떤 다른 매개변수를 포함)에 관한 검사는 본 분야에 공지된 방법과 일치하여 수행될 수 있다.

α-아밀라제 변이체의 발현

본 발명에 따라, 상기 기재된 방법 또는 본 분야에 공지된 어떤 또다른 방법에 의해 제조되는 변이체를 암호하는 DNA 서열은 전형적으로 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합부위, 해독 개시 신호 및 선택적으로 억제유전자 또는 다양한 촉진 유전자를 암호하는 조절 서열을 포함하는 발현벡터를 사용하여 효소 형태로 발현될 수 있다.

본 발명의 α-아밀라제 변이체를 암호하는 DNA 서열을 수반하는 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 방법에 편리하게 적용될 수 있는 어떤 벡터일 것이며, 벡터의 선택은 종종 이것이 도입되는 숙주세포에 달려 있을 것이다. 따라서, 벡터는 예를 들어 플라스미드, 박테리오파지 또는 염색체외 요소, 미니염색체 또는 인공염색체같은 염색체 복제에 독립적인 복제인, 염색체의 실체로서 존재하는 벡터, 즉 자가복제벡터일 수 있다. 선택적으로, 벡터는 숙주세포로 도입되었을 때, 숙주세포게놈으로 통합되어 이것이 통합된 염색체와 함께 복제되는 것일 수 있다. 벡터에서, DNA 서열은 적당한 프로모터 서열에 작동적으로 연결되어 있어야만 한다. 프로모터는 선택한 숙주세포에서 전사적 활성을 보여주는 어떤 DNA 서열일 것이며 숙주세포에 동종 또는 이종의 단백질을 암호하는 유전자로부터 유래될 수 있다. 특히 박테리아 숙주에서 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 암호하는 DNA 서열의 전사를 지시하는 적당한 프로모터의 예는 E. coli의 lac 오페론의 프로모터, Streptomyces coelicolor 아가라제 유전자 dagA 프로모터, Bacillus licheniformis α-아밀라제 유전자(amyL)의 프로모터, Bacillus stearothermophilus 말토오스형성 아밀라제 유전자(amyM)의 프로모터, Bacillus amyloliquefaciencs α-아밀라제(amyQ)의 프로모터, Bacillus subtilis xylA와 xylB 유전자의 프로모터 등이 있다. 균류 숙주에서 전사를 위해, 유용한 프로모터의 예는 A. oryzae TAKA 아밀라제, Rhizomucor miehei 아스파르트산 프로테인아제, A. niger 중성 α-아밀라제, A. niger 산 안정한 α-아밀라제, A. niger 글루코아밀라제, Rhizomucor miehei 리파아제, A. oryzae 알칼리성 프로테아제, A. oryzae 트리오스 포스페이트 이소머라제 또는 A. nidulans 아세트아미다제로부터 유래된 것들이 있다.

본 발명의 발현벡터는 또한 적당한 전사 터미네이터 및 진핵세포에서 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 암호하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 폴리아데닐화 서열로 구성될 수 있다. 종결 및 폴리아데닐화 서열은 프로모터처럼 동일한 출처로부터 적절히 유래될 수 있다.

벡터는 추가로 벡터가 해당 숙주세포에서 복제를 할 수 있게 하는 DNA 서열로 구성될 수 있다. 이런 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702의 복제기점이다.

벡터는 또한 예를 들어 B. subtilis 또는 B. licheniformis로부터 dal 유전자같은 숙주세포에서 방어를 보충하는 유전자의 산물, 또는 암피실린, 카나마이신, 글로람페니콜 또는 테트라싸이클린 저항성같은 항생제 저항성을 제공하는 유전자같은 선별 마커로 이루어질 수 있다. 더욱이, 벡터는 amdS, argB, niaD 및 sC같은 Aspergillus 선별마커, 하이그로마이신 저항성을 일으키는 마커로 구성될 수 있으며, 또는 선별은 예를 들어 WO 91/17243에 기재된 것처럼 공-형질전환에 의해 실행될 수 있다.

예를 들어 숙주세포로서 어떤 박테리아를 사용할 때, 세포내 발현이 몇몇 점에서 유리할 수도 있지만, 발현이 세포외인 것이 일반적으로 바람직하다. 일반적으로, 여기에서 언급된 Bacillus α-아밀라제는 배양배지로 발현된 프로테아제의 분비를 허락하는 프리영역으로 구성된다. 만약 바람직하다면, 이런 프리영역은 각각의 프리영역을 암호하는 DNA 서열의 치환에 의해 편리하게 수행되는, 다른 프리영역 또는 신호서열에 의해 치환될 수 있다.

α-아밀라제 변이체를 암호하는 발명의 DNA 구조체, 프로모터, 터미네이터 및 다른 요소를 각각 라이게이션하기 위해서, 그리고 이들을 복제를 위해 필요한 정보를 함유한 적당한 벡터로 삽입하기 위해서 사용되는 방법은 본 분야에 숙련된 사람에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, Sambrook et al. (1989) 참조).

DNA 구조체 또는 상기 정의된 것처럼 발명의 발현벡터로 이루어진, 발명의 세포는 발명의 α-아밀라제 변이체의 재조합 제조에서 숙주세포로서 유리하게 사용된다. 세포는 편리하게 숙주 염색체로 DNA 구조체(하나 이상의 복사체로)를 통합함으로써, 변이체를 암호하는 발명의 DNA 구조체로 형질전환될 수 있다. 일반적으로 DNA 서열로서 유리하다고 여겨지는 이런 통합은 세포에서 더욱 안정하게 유지될 것이다. 숙주염색체로 DNA 구조체의 통합은 예를 들어 동종 또는 이종 재조합같은, 종래의 방법에 따라 수행될 수 있다. 선택적으로, 세포는 여러 다른 형태의 숙주세포와 관련하여 상기 기재된 것처럼 발현벡터로 형질전환될 수 있다.

본 발명의 세포는 포유동물 또는 곤충같은 고등생물의 세포일 수 있지만, 바람직하게는 예를 들어 박테리아 또는 균류(효모 포함) 세포같은 미생물 세포이다.

적당한 박테리아의 예는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, 또는 Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus같은 그람양성 박테리아 또는 E. coli같은 그람음성 박테리아가 있다. 박테리아의 형질전환은 예를 들어 원형질체 형질전환 또는 원래 공지된 방법으로 콤피턴트 세포를 사용하여 달성될 수 있다.

효모 생물은 예를 들어 Saccharomyces cerevisiae같은 Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces의 종으로부터 유리하게 선택될 수 있다. 사상균류는 예를 들어 Aspergillus oryzae 또는 Aspergillus niger같은 Aspergillus종에 유리하게 속할 수 있다. 균류세포는 원래 공지된 방법으로 원형질체 형성과 원형질체의 형질전환후 세포벽의 재생을 포함하는 방법에 의해 형질전환될 수 있다. Aspergillus 숙주세포의 형질전환에 적당한 방법이 EP 238 023에 기재되어 있다.

더욱 심화된 측면에서, 본 발명은 변이체의 생성을 조성하는 조건하에서 상기 기재된 것처럼 숙주세포를 배양하고 세포 및/또는 배양배지로부터 변이체를 회수하는 것으로 이루어지는, 발명의 α-아밀라제 변이체의 제조방법에 관한 것이다.

세포를 배양하기 위해서 사용되는 배지는 해당 숙주세포의 생장과 본 발명의 α-아밀라제 변이체의 발현을 얻기 위해 적당한 어떤 종래 배지일 수 있다. 적당한 배지는 상업용 공급자로부터 구입할 수 있거나 또는 발표된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션의 목록에 기재된 것처럼).

숙주세포로부터 분비되는 α-아밀라제 변이체는 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 세포를 분리, 그리고 황산암모늄같은 염으로 배지의 단백질성 성분을 침전시킨 후, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등같은 크로마토그래피 방법의 사용을 포함하는, 잘-공지된 방법에 의해 배양배지로부터 편리하게 회수될 수 있다.

산업상 이용

본 발명의 α-아밀라제 변이체는 다양한 산업상 이용을 허락하는 가치있는 특성을 소유한다. 특별히 효소변이체는 세탁, 식기세척 및 딱딱한 표면세탁 세제조성물에서 성분으로서 잠재적 이용을 발견할 수 있지만 이것은 또한 녹말로부터 감미료와 에탄올의 제조에서 그리고 직물 풀빼기에 유용할 수 있다. 종래 녹말 전환공정과 액화 및/또는 당화공정에 대한 조건이 예를 들어 US 특허 번호 3,912,590과 EP 특허 공보 번호 252,730과 63,909에 기재되어 있다.

녹말로부터 감미료의 제조: 녹말을 프럭토스 시럽으로 전환하기 위한 "전통적" 공정은 보통 세가지 연속적인 효소공정, 즉 액화공정후 당화공정 및 이성질화 공정으로 구성된다. 액화공정동안, 녹말은 대략 2시간동안 5.5 내지 6.2 사이의 pH 값과 95-160℃의 온도에서 α-아밀라제(예를 들어 Termamyl^TM)에 의해 덱스트린으로 분해된다. 세가지 조건하에서 최적 효소 안정성을 보장하기 위해서, lmM 칼슘이 첨가된다(40ppm 유리칼슘 이온).

액화공정후에 덱스트린은 이소아밀라제 또는 풀룰라나제(예를 들어 프로모자임TM)같은 글루코아밀라제(예를 들어 AMGTM)와 분지효소의 첨가에 의해 덱스트로스로 전환된다. 이 단계전에 고온(95℃ 이상)을 유지하면서, pH는 4.5 이하의 값으로 감소되고 액화하는 α-아밀라제 활성은 변성된다. 온도는 60℃까지 감소되고 글루코아밀라제와 탈분지효소가 첨가된다. 당화공정이 24-72시간동안 계속된다.

당화공정후에 pH는 6-8의 범위, 바람직하게는 pH 7.5의 값으로 증가되고 칼슘은 이온교환으로 제거된다. 덱스트로스 시럽은 그후 예를 들어 고정된 글루코스이소머라제(예를 들어 SweetzymeTM)를 사용하여 고 프럭토스 시럽으로 전환된다.

이 공정의 적어도 3가지 효소적 개선이 얻어질 수 있다. 모든 3가지 개선은 개별적 이점으로 보여질 수 있으나, 어떤 조합(예를 들어 1+2, 1+3, 2+3 또는 1+2+3)이 사용될 수 있다:

개선 1. 액화하는 알파-아밀라제의 칼슘 의존성의 감소.

유리칼슘의 첨가는 α-아밀라제의 적당히 높은 안정성을 보장하기 위해 요구되지만, 유리칼슘은 글루코스이소머라제의 활성은 강하게 억제하며 비싼 단위공정에 의해, 3-5ppm 이하로 유리칼슘의 수치를 감소시키는 정도로 제거되는 것이 필요하다. 이런 조작이 제거될 수 있고 액화 공정이 유리칼슘 이온의 첨가없이 수행될 수 있다면 비용절약이 얻어질 수 있다.

이것을 달성하기 위해서, 유리칼슘의 저농도(＜40ppm)에서 안정하고 매우 활성적인 낮은 칼슘-의존적 테르마밀-유사 α-아밀라제가 요구된다. 이런 테르마밀-유사 α-아밀라제는 4.5-6.5 범위, 바람직하게는 4.5-5.5 범위의 pH에서 최적 pH를 가져야만 한다.

개선 2. 원하지 않은 Maillard 산물의 형성 감소.

액화공정동안 원하지 않은 Maillard 산물의 형성 정도는 pH에 의존된다. 낮은 pH는 Maillard 산물의 형성을 감소시킨다. 따라서 약 pH 6.0에서 약 pH 4.5 값으로 공정 pH를 낮출 수 있는 것이 바람직하다; 불행하게도, 모든 일반적으로 공지된, 열안정성 테르마밀-유사 α-아밀라제는 낮은 pH(즉 pH＜6.0)에서 매우 안정하지 않으며 이들의 특이 활성이 일반적으로 낮다. 상기-언급된 목적의 달성은 높은 특이 활성을 유지하며 4.5-5.5 범위의 낮은 pH와 0-40ppm 범위의 유리칼슘농도에서 안정한 테르마밀-유사 α-아밀라제를 요구한다.

개선 3.

A. niger 글루코아밀라제와 B. acidopullulyticus 풀룰라나제로 당화할 때, 액화공정으로부터 잔여 α-아밀라제 활성의 존재는 α-아밀라제가 당화단계전에 불활성화되지 않는다면 덱스트로스의 낮은 수율을 유도할 수 있다는 것이 이미 보고되었다(미국 특허 5,234,823). 이런 불활성화는 전형적으로 당화동안 60℃까지 온도를 낮추기 전에, 95℃에서 4.3 이하로 pH를 맞춤으로써 수행될 수 있다.

덱스트로스 수율에서 이런 역효과에 대한 이유는 충분이 이해되지 않았지만, 액화 α-아밀라제(예를 들어 B. licheniformis로부터 Termamyl^TM 120L)는 아밀로펙틴에서 분지점의 양쪽면과 분지점에 가까운 1,4-알파-글루코시딕 결합을 가수분해함으로써 "제한적 덱스트린" (B. acidopullulyticus 풀룰라나제에 대한 저급 기질)을 생성하는 것으로 가정된다. 글루코아밀라제에 의한 이런 제한적 덱스트린의 가수분해는 글루코아밀라제에 의해 단지 서서히 가수분해되는 삼탄당 패노스의 생성을 유도한다.

이런 단점으로부터 어려움을 받지 않은 열안정성 α-아밀라제의 발달은 분리된 불활성단계가 요구되지 않음으로써 중요한 공정개선이 된다.

테르마밀-유사, 낮은-pH-안정성 α-아밀라제가 발달된다면, 특이성의 변경은 낮은 pH에서 증가된 안정성과 조합하여 필요한 이점이 될 수 있다.

본 발명의 방법과 이론은 상기 개요된 것처럼 요구되는 특성을 가지는 발명에 따른 변이체를 디자인하고 제조하는 것을 가능하게 만든다.

세제 조성물

발명에 따라서, α-아밀라제는 전형적으로 세제 조성물의 한 성분이 될 수 있다. 마찬가지로, 이것은 비분지성 과립, 안정화된 액체 또는 보호된 효소의 형태로 세제조성물에 포함될 것이다. 비분지성 과립을 예를 들어 US 4,106,991과 4,661,452(양쪽 Novo Industri A/S)에 개시된 것처럼 제조될 수 있으며 선택적으로 본 분야에 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 왁스 코팅 재료의 예는 1000 내지 20000의 평균분자량을 가지는 폴리(에틸렌 산화물) 산물(폴리에틸렌글리콜, PEG), 16 내지 50의 메틸렌 산화물 단위를 가지는 에톡실화 노닐페놀; 알코올이 12-20개의 탄소수를 함유하며 15-80개의 에틸렌 산화물 단위가 있는 에톡실화 지방 알코올; 지방 알코올; 지방산; 및 지방산의 모노-와 디- 및 트리글리세리드가 있다. 유액층 기술에 의한 이용에 적당한 필름-형성 코팅 재료의 예는 특허 GB 1483591에 제공되어 있다. 액체효소 제조는 예를 들어 공지된 방법에 따라 프로필렌 글리콜같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산 또는 붕산을 첨가함으로써 안정화될 수 있다. 다른 효소 안정화제가 본 분야에 잘 공지되어 있다. 보호된 효소는 EP 238,216에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다.

발명의 세제 조성물은 예를 들어 분말, 과립, 페이스트 또는 액체같은 어떤 편리한 형태일 것이다. 액체 세제는 전형적으로 70%의 물과 0-30%의 유기용매를 함유한 수용성 또는 비수용성일 것이다.

세제 조성물은 하나 이상의 계면활성제로 구성되는데, 이것의 각각은 음이온성, 비이온성, 양이온성, 또는 양쪽이온성일 것이다. 세제는 보통 선형 알킬벤젠술포네이트(LAS), 알파-올레핀술포네이트(AOS), 황산알킬(황산지방알코올)(AS), 알코올에톡시설페이트(AEOS 또는 AES), 이차 알칸술포네이트(SAS), 알파-술포 지방산 메틸에스테르, 알킬- 또는 알케닐숙식산 또는 비누같은 음이온성 계면활성제를 0-50% 포함할 수 있다. 이것은 또한 알코올에톡실레이트(AEO 또는 AE), 카르복실화 알코올에톡실레이트, 노닐페놀에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민옥사이드, 에톡실화 지방산 모노에틴올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 또는 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드같은 비온성 게면활성제를 0-40% 함유할 수도 있다(예를 들어 WO 92/06154에 기재된 것처럼).

세제조성물은 추가로 리파아제, 큐티나제, 프로테아제, 셀룰라제, 예를 들어 라카아제같은 퍼옥시다제같은 하나 이상의 다른 효소로 구성될 수도 있다.

세제는 제올라이트, 이인산염, 삼인산염, 포스포네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산(NTA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTMPA), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 수용성 규산염 또는 층진 규산염(예를 들어 Hoechst의 SKS-6)같은 세제빌더 또는 착화제를 1-65% 함유할 것이다. 세제는 빌더되지 않은, 즉 필수적으로 세제빌더가 없을 수도 있다.

세제는 하나 이상의 중합체로 구성될 수 있다. 예는 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 폴리(비닐피롤리돈)(PUP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리(비닐알코올) (PVA), 폴리아크릴레이트같은 폴리카르복실레이트, 말레/아크릴산 공중합체 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체가 있다.

세제는 테트라아세틸에틸렌디아민(TAED) 또는 논아노일옥시벤젠술포네이트(NOBS)같은 과산-형성 표백 활성제와 조합될 수 있는 과붕산염 또는 과탄산염같은 H2O2 원료로 이루어진 표백 시스템을 함유할 수도 있다. 선택적으로, 표백 시스템은 예를 들어 아미드, 이미드 또는 술폰형의 과산으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 세제조성물의 효소는 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세롤같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산, 붕산, 또는 예를 들어 방향족 붕산염 에스테르같은 붕산 유도체같은 종래 안정화제를 사용하여 안정화될 수 있으며, 그 조성물은 예를 들어 WO 92/19709와 WO 92/19708에 기재된 것처럼 제조될 수 있다.

세제는 또한 예를 들어 점토, 거품 촉진제, 거품 억제제, 방부제, 오염물 현탁제, 재오염 방지제, 염료, 살균제, 증백제 또는 항료를 포함하는 섬유 콘디쇼너같은 다른 종래 세제 서분을 함유할 수도 있다.

pH(수용액에서 사용농도로 측정됨)는 보통 예를 들어 7-11의 중성 또는 알칼리성일 것이다.

본 발명의 영역내에서 세제 조성물의 구체적 형태는 다음과 같은 것들을 포함한다.

1) 다음과 같이 이루어진 적어도 600g/ℓ의 부피밀도를 가지는 과립으로서 제조된 세제조성물

선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨)	7 - 12%
알코올 에톡시설페이트 (예를 들어 C12-18 알코올, 1-2 EO) 또는 황산알킬 (예를 들어 C16-18)	1 - 4%
알코올 에톡실레이트 (예를 들어 C14-15 7 EO)	5 - 9%
탄산나트륨 (Na2CO3)	14 - 20%
수용성 규산염 (Na2O, 2SiO2)	2 - 6%
제올라이트 (NaAlSiO4)	15 - 22%
황산나트륨 (Na2SO4)	0 - 6%
시트르산나트륨/시트르산 (C6H5Na3O7/C6H8O7)	0 - 15%
과붕산나트륨 (NaBO3·H2O)	11 - 18%
TAED	2 - 6%
카르복실메틸셀룰소오스	0 - 2%
중합체 (예를 들어 말레산/아크릴산 공중합체,PVP, PEG)	0 - 3%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량 성분 (예를 들어 거품억제제, 향료, 증백제, 광표백제)	0 - 5%

2) 다음과 같이 이루어진 적어도 600g/ℓ의 부피밀도를 가지는 과립으로서 제조된 세제조성물

선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨)	6 - 11%
알코올 에톡시설페이트 (예를 들어 C12-18 알코올,1-2 EO) 또는 황산 알킬 (예를 들어 C16-18)	1 - 3%
알코올 에톡실레이트 (예를 들어 C14-15 알코올, 7 EO)	5 - 9%
탄산 나트륨 (Na2CO3)	15 - 21%
수용성 규산염 (Na2O, 2SiO2)	1 - 4%
제올라이트 (NaAlSiO4)	24 - 34%
황산 나트륨 (Na2SO4)	4 - 10%
시트르산 나트륨/시트르산 (C6H5Na3O7/C6H8O7)	0 - 15%
카르복시메틸셀룰로오스	0 - 2%
중합체 (예를 들어 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG)	1 - 6%
효소 (순수단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량성분 (예를 들어 거품억제제, 향료)	0 - 5%

3) 다음과 같이 이루어진 적어도 600g/ℓ의 부피밀도를 가지는 과립으로서 제조된 세제 조성물

선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨)	5 - 9%
알코올 에톡실레이트 (예를 들어 C12-15 알코올, 7 EO)	7 - 14%
지방산으로서 비누 (예를 들어 C16-22 지방산)	1 - 3%
탄산 나트륨 (Na2CO3)	10 - 17%
수용성 규산염 (Na2O, 2SiO2)	3 - 9%
제올라이트 (NaAlSiO4)	23 - 33%
황산 나트륨 (Na2SO4)	0 - 4%
과붕산 나트륨 (NaBO3.H2O)	8 - 16%
TEAD	2 - 8%
포스포네이트 (예를 들어 EDTMPA)	0 - 1%
카르복시메틸셀룰로오스	0 - 2%
중합체 (예를 들어 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG)	0 - 3%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량성분 (예를 들어 거품억제제, 향료, 증백제)	0 - 5%

4) 다음과 같이 이루어진 적어도 600g/ℓ의 부피밀도를 가지는 과립으로서 제조된 세제 조성물

선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨)	8 - 12%
알코올 에톡실레이트 (예를 들어 C12-15 알코올, 7 EO)	10 - 25%
탄산 나트륨 (Na2CO3)	14 - 22%
수용성 규산염 (Na2O, 2SiO2)	1 - 5%
제올라이트 (NaAlSiO4)	25 - 35%
황산 나트륨 (Na2SO4)	0 - 10%
카르복시메틸셀룰로오스	0 - 2%
중합체 (예를 들어 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG)	1 - 3%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 5%
소량성분 (예를 들어 거품억제제, 향료)	0 - 5%

5) 다음과 같이 이루어진 수성 액체 세제 조성물

선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨)	15 - 21%
알코올 에톡실레이트 (예를 들어 C12-15 알코올, 7 EO 또는 C12-15 알코올, 5 EO)	12 - 18%
지방산으로서 비누 (예를 들어 올레산)	3 - 13%
알케닐숙신산 (C12-14)	0 - 13%
아미노에탄올	8 - 18%
시트르산	2 - 8%
포스페네이트	0 - 3%
중합체 (예를 들어 PVP, PEG)	0 - 3%
붕산염 (B4O7)	0 - 2%
에탄올	0 - 3%
프로필렌 글리콜	8 - 14%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량 성분 (예를 들어 분산제, 거품억제제, 향료, 증백제)	0 - 5%

6) 다음과 같이 이루어진 수성 구조로 된 액체 세제 조성물

선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨)	15 - 21%
알코올 에톡실레이트 (예를 들어 C12-15 알코올, 7 EO, 또는 C12-15 알코올, 5 EO)	3 - 9%
지방산으로서 비누 (예를 들어 올레산)	3 - 10%
제올라이트 (NaAlSiO4)	14 - 22%
시트르산 칼륨	9 - 18%
붕산염 (B4O7)	0 - 2%
카르복시메틸셀룰로오스	0 - 2%
중합체 (예를 들어 PEG, PVP)	0 - 3%
예를 들어, 몰비 25:1; MW 3800인 라우릴 메타크릴레이트/ 아크릴산 공중합체같은 고정 중합체	0 - 3%
글리세롤	0 - 5%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량 성분 (예를 들어 분산제, 거품 억제제, 향료, 증백제)	0 - 5%

7) 다음과 같이 이루어진 적어도 600g/ℓ의 부피밀도를 갖는 과립으로서 제조된 세제 조성물

황산 지방 알코올	5 - 10%
에톡실화 지방산 모노에탄올아미드	3 - 9%
지방산으로서 비누	0 - 3%
탄산 나트륨 (Na2CO3)	5 - 10%
수용성 규산염 (Na2O, 2SiO2)	1 - 4%
제올라이트 (NaAlSiO4)	20 - 40%
황산 나트륨 (Na2SO4)	2 - 8%
과붕산 나트륨 (NaBO3.H2O)	12 - 18%
TEAD	2 - 7%
중합체 (예를 들어 말레산/아크릴산 공중합체, PEG)	1 - 5%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.001 - 0.1%
소량 성분 (예를 들어 증백제, 거품 억제제, 향료)	0 - 5%

8) 다음과 같이 이루어진 과립으로서 제조된 세제 조성물

선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨)	8 - 14%
에톡실화 지방산 모노에탄올아미드	5 - 11%
지방산으로서 비누	0 - 3%
탄산 나트륨 (Na2CO3)	4 - 10%
수용성 규산염 (Na2O, 2SiO2)	1 - 4%
제올라이트 (NaAlSiO4)	30 - 50%
황산 나트륨 (Na2SO4)	3 - 11%
시트르산 나트륨(C6H5Na3O7)	5 - 12%
중합체 (예를 들어 PVP, 말레산/아크릴산 공중합체, PEG)	1 - 5%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량 성분 (예를 들어 거품 억제제, 향료)	0 - 5%

9) 다음과 같이 이루어진 과립으로서 제조된 세제 조성물

선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨)	6 - 12%
비이온성 계면활성제	1 - 4%
지방산으로서 비누	2 - 6%
탄산 나트륨 (Na2CO3)	14 - 22%
제올라이트 (NaAlSiO4)	18 - 32%
황산 나트륨 (Na2SO4)	5 - 20%
시트르산 나트륨(C6H5Na3O7)	3 - 8%
과붕산 나트륨 (NaBO3.H2O)	4 - 9%
표백 활성제 (예를 들어 NOBS 또는 TAED)	1 - 5%
카르복시메틸셀룰로오스	0 - 2%
중합체 (예를 들어 폴리카르복실레이트 또는 PEG)	1 - 5%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량 성분 (예를 들어 증백제, 향료)	0 - 5%

10) 다음과 같이 이루어진 수성 액체 세제 조성물

선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨)	15 - 23%
알코올 에톡시설페이트 (예를 들어 C12-15 알코올, 2-3 EO)	8 - 15%
알코올 에톡실레이트 (예를 들어 C12-15 알코올, 7 EO, 또는 C12-15 알코올, 5 EO)	3 - 9%
지방산으로서 비누 (예를 들어 라우산)	0 - 3%
아미노 에탄올	1 - 5%
시트르산 나트륨	5 - 10%
향수성 물질 (예를 들어 톨루엔술폰산 나트륨)	2 - 6%
붕산염 (B4O7)	0 - 2%
카르복시메틸셀룰로오스	0 - 1%
에탄올	1 - 3%
프로필렌 글리콜	2 - 5%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량 성분 (예를 들어 중합체, 분산제, 향료, 증백제)	0 - 5%

11) 다음과 같이 이루어진 수성 액체 세제 조성물

선형 알키리벤젠술포네이트 (산으로 계산됨)	20 - 32%
알코올 에톡실레이트 (예를 들어 C12-15 알코올, 7 EO, 또는 C12-15 알코올, 5 EO)	6 - 12%
아미노 에탄올	2 - 6%
시트르산	8 - 14%
붕산염 (B4O7)	1 - 3%
중합체 (예를 들어 말레산/아크릴산 공중합체, 예를 들어 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체같은 고정중합체)	0 - 3%
글리세롤	3 - 8%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량 성분 (예를 들어 항수성 물질, 분산제, 향료, 증백제)	0 - 5%

12) 다음과 같이 이루어진 적어도 600g/ℓ의 부피밀도를 갖는 과립으로서 제조된 세제 조성물

음이온성 계면활성제 (선형 알킬벤젠술포네이트, 황산 알킬, 알파올레핀술포네이트, 알파술포 지방산 메틸 에스테르, 알칸술포네이트, 비누)	25 - 40%
비이온성 계면활성제 (예를 들어 알코올 에톡실레이트)	1 - 10%
탄산 나트륨 (Na2CO3)	8 - 25%
수용성 규산염 (Na2O, 2SiO2)	5 - 15%
황산 나트륨 (Na2SO4)	0 - 5%
제올라이트 (NaAlSiO4)	15 - 28%
과붕산 나트륨 (NaBO3.H2O)	0 - 20%
표백 활성제 (TAED 또는 NOBS)	0 - 5%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량 성분 (예를 들어 향료, 증백제)	0 - 3%

13) 선형 알킬벤젠술포네이트 일부 또는 모두가 (C12-18)황산알킬로 치환된 1)-12)에 기재된 것과 같은 세제 조성물

14) 다음과 같이 이루어진 적어도 600g/ℓ의 부피밀도를 갖는 과립으로서 제조된 세제 조성물

(C12-C18) 황산 알킬	9 - 15%
알코올 에톡실레이트	3 - 6%
폴리히드록시 알킬 지방산 아미드	1 - 5%
제올라이트 (NaAlSiO4)	10 - 20%
층을 이룬 이규산염 (예를 들어 Hoechst사의 SK56)	10 - 20%
탄산 나트륨 (Na2CO3)	3 - 12%
수용성 규산염 (Na2O, 2SiO2)	0 - 6%
시트르산 나트륨	4 - 8%
과붕산 나트륨	13 - 22%
TEAD	3 - 8%
중합체 (예를 들어 폴리카르복실레이트와 PVP)	0 - 5%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량 성분 (예를 들어 증백제, 광표백제, 향료, 거품억제제)	0 - 5%

15) 다음과 같이 이루어진 적어도 600g/ℓ의 부피밀도를 갖는 과립으로서 제조된 세제 조성물

(C12-C18) 황산 알킬	4 - 8%
알코올 에톡실레이트	11 - 15%
비누	1 - 4%
제올라이트 MAP 또는 제올라이트 A	35 - 45%
탄산 나트륨 (Na2CO3)	2 - 8%
수용성 규산염 (Na2O, 2SiO2)	0 - 4%
과붕산 나트륨	13 - 22%
TEAD	1 - 8%
카르복시메틸 셀룰로오스	0 - 3%
중합체 (예를 들어 폴리카르복실레이트와 PVP)	0 - 3%
효소 (순수효소단백질로 계산됨)	0.0001 - 0.1%
소량 성분 (예를 들어 증백제, 포스포네이트, 향료)	0 - 3%

16) 부가적 성분 또는 이미 명시된 표백시스템에 대한 치환물로서 안정화된 또는 캡슐화된 과산을 함유하는 1)-15)에 기재된 것과 같은 세제 조성물.

17) 과붕산염이 과탄산염으로 치환된 1), 3), 7), 9) 및 12)에 기재된 것과 같은 세제 조성물.

18) 추가로 망간 촉매를 함유하는 1), 3), 7), 9), 12), 14) 및 15)에 기재된 것과 같은 세제 조성물. 망간 촉매는 예를 들어 "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, pp. 637-639에 기재된 성분중 하나일 수 있다.

19) 예를 들어 선형 알콕실화된 일차 알코올, 빌더시스템(예를 들어 인산염), 효소 및 알칼리같은 액체 비이온성 계면활성제로 이루어진 비수성 세제액으로서 제조된 세제 조성물. 세제는 또한 음이온성 계면활성제 및/또는 표백시스템으로 이루어질 수도 있다.

본 발명의 α-아밀라제 변이체는 세제에 종래 사용되는 농도로 통합될 수도 있다. 본 발명의 세제조성물에서, α-아밀라제는 세척용액 리터당 0.00001-1mg(순수효소단백질로 계산됨)의 α-아밀라제에 해당하는 양으로 첨가될 수 있다는 것이 현재 고찰된다.

식기세척 조성물

식기세척 세제 조성물은 음이온성, 비이온성, 양이온성, 양성적 또는 이들 유형의 혼합인 계면활성제로 구성된다. 세제는 저- 내지 비-거품형성 에톡실화 프로폭실화 직쇄 알코올같은 비이온성 계면활성제를 0-90% 함유할 것이다.

세제 조성물은 무기 및/또는 유기형의 세제 빌더염을 함유할 것이다. 세제빌더는 인-함유와 비-인-함유형으로 나누어질 수 있다. 세제 조성물은 보통 1-90%의 세제빌더를 함유한다.

인-함유 무기 알칼리성 세제빌더의 예는 존재할 때, 수용성 염 특히 알칼리 금속 피로포스페이트, 오르토포스페이트, 및 폴리포스페이트를 포함한다. 인-함유 유기 알칼리성 세제 빌더의 예는 존재할 때, 포스포네이트의 수용성 염을 포함한다. 비-인-함유 무기빌더의 예는 존재할 때 제올라이트가 가장 잘 공지된 대표물질과 여러 형태의 불용성 결정형 또는 비정형 알루미노 규산염 뿐만 아니라 수용성 알칼리 금속 탄산염, 붕산염 및 규산염을 포함한다.

적당한 유기 빌더의 예는 알칼리금속, 암모늄 및 치환된 암모늄, 시트레이트, 숙신산염, 말로네이트, 지방산 술포네이트, 카르복시메톡시 숙신산염, 암모늄 폴리아세테이트, 카르복실레이트, 폴리카르복실레이트, 아미노폴리카르복실레이트, 폴리아세틸카르복실레이트 및 폴리히드록스술포네이트를 포함한다.

다른 적당한 유기 빌더는 예를 들면 적당한 폴리아크릴산, 폴리말레산 및 폴리아크릴산/폴리말레산 공중합체와 이들의 염같은 빌더 특성을 가지는 것으로 공지된 고분자량 중합체와 공중합체를 포함한다.

식기세척 세제 조성물은 염소/브롬-형 또는 산소-형의 표백제를 함유할 수도 있다. 무기 염소/브롬형 표백제의 예는 염소화된 인산 삼나트륨 뿐만 아니라 치아염소산 및 치아브롬산 리튬, 나트륨 또는 칼슘이 있다. 유기 염소/브롬형 표백제의 예는 트리클로로이소시아누르산, 트리브로모이소시아누르산, 디브로모이소시아누르산 및 디클로로이소시아누르산같은 이종고리 N-브로모 및 N-클로로 이미드와 칼륨 및 나트륨같은 수용성 양이온을 가지는 이들의 염이 있다.

산소 표백제는 예를 들어 바람직하게는 표백 전구체를 가지거나 또는 과산화산 화합물로써 무기과염의 형태가 바람직하다. 적당한 과산화표백 화합물의 예는 알칼리 금속 과붕산염, 사수화물과 일수화물, 알칼리금속 과탄산염, 과규산염 및 과인산염이 있다. 바람직한 촉진제 재료는 TAED와 글리세롤 트리아세테이트가 있다.

본 발명의 식기세척 세제조성물은 예를 들어 프로필렌글리콜같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산, 붕산 또는 방향족 붕산 에스테르같은 붕산 유도체같은 효소에 대한 종래 안정화제를 사용하여 안정화될 수 있다.

본 발명의 식기세척 세제조성물은 또한 예를 들어 해교제, 충전제, 거품억제제, 방부제, 오염물 현탁제, 금속이온붕쇄제, 재오염방지제, 탈수제, 염료, 살균제, 형광제, 증점제 및 향료같은 다른 종래 세제 성분을 포함할 수도 있다.

마지막으로, 본 발명의 α-아밀라제 변이체는 예를 들어 다음과 같은 특허 공보중 어느 것에 기술된 세제의 어느 것에서처럼 종래 식기세척 세제로 사용될 수 있다.

EP 518719, EP 518720, EP 518721, EP 516553, EP 516554, EP 516555, GB 2200132, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 3833047, WO 93/17089, DE 4205071, WO 52/09680, WO 93/18129, WO 93/04153, WO 92/06157, WO 92/08777, EP 429124, WO 93/21299, US 5141664, EP 561452, EP 561446, GB 2234980, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP 554943, EP 346137, US 5112518, EP 318204, EP 318279, EP 271155, EP 271156, EP 346136, GB 2228945, CA 2006687, WO 93/25651, EP 530635, EP 414197, US 5240632.

(실시예)

실시예 1

TERM의 상동한 제조상의 실시예

다른 테르마밀-유사 α-아밀라제에 대한 B. licheniformis α-아밀라제(이하 TERM으로 언급함)의 전체적 상동성은 높으며 퍼센트 유사도는 매우 높다. 위스콘신 대학교의 제네틱 컴퓨터 그룹의 프로그램 GCG를 사용하여 BSG(서열 6을 가지는 B. stearothermophilus α-아밀라제)와 BAN(서열 4를 가지는 B. amyloliquefaciens α-아밀라제)에 대한 TERM의 계산된 유사도는 각각 89%와 78% 얻었다. TERM은 BAN과 BSG와 비교하여 잔기 G180과 K181 사이에 2개 잔기의 결실을 가지고 있었다. BSG는 BAN과 TERM과 비교하여 G371과 I372 사이에 3개 잔기의 결실을 가지고 있었다. 더욱 BSG는 BAN과 TERM과 비교하여 20잔기 이상의 C-말단 확장을 가지고 있었다. BSG와 비교하여 N-말단에서 BAN은 2개의 잔기를 TERM은 하나의 잔기를 덜 가지고 있었다.

B. licheniformis(TERM)와 B. amyloliquefaciens α-아밀라제(BAN) 각각의 구조는 여기 부록 1에서 개시된 구조상으로 만들어진 모델이었다. 다른 테르마밀-유사 α-아밀라제(예를 들어 여기에 개시된 것들)의 구조가 비슷하게 만들어질 수 있다.

본 구조를 증명하기 위해 사용되는 α-아밀라제와 비교하여, TERM은 약 178-182에서 두 개의 잔기가 부족한 점에서 다르다. 모델 구조에서 이것을 보충하기 위해서, BIOSYM으로부터의 호몰로지 프로그램이 결실점을 제외한 구조(구조적으로 보존된 영역뿐만 아니라)에서 해당하는 위치에서 잔기를 치환하기 위해서 사용하였다. 펩티드 결합이 TERM(BAN)에서 G179(G177)와 K180(K180) 사이에서 확립되었다. 해명된 구조와 모델구조(그리고 따라서 후자의 타당성) 사이의 가까운 구조적 상관관계를 모델에서 서로 매우 가까운 것으로 발견되는 단지 소수의 원자의 존재에 의해서 나타내어진다.

TERM의 이런 매우 개략적 구조에 그후 INSIGHT 프로그램을 사용하여 상기 해명된 구조에 대해서 처럼 동일한 배위에서 해명된 구조(부록 1)로부터 모든 물(605)과 이온(4 칼슘과 1 나트륨)을 첨가하였다. 이것은 단지 극소수의 중복-다른 말로 매우 좋은 적합성-을 가지고 수행할 수 있다. 이 모델구조는 그후 급강하 200단계와 콘쥬게이트된 구배 600단계를 사용하여 최소화하였다(Brooks et al., 1983, J. Computational Chemistry 4, p. 187-217 참조). 최소화된 구조는 그후 5ps로 가열후 200ps 평형까지 그러나 35ps 이상의 분자 역학에 적용하였다. Verlet 알고리즘과 평형온도 300K를 가지고 작동하므로써 역학은 워터베스에 Behrendsen 결합을 사용하여 유지하였다(Berendsen et al., 1984, J. Chemical Physics 81, p. 3684-3690). 회전과 번역을 각 피코초마다 제거하였다. 잠재적 에너지는 대략 35ps 평형후에 안정하게 되었다. 평균역학구조를 추출하였고 자세한 분석을 위해 사용할 수 있었다.

실시예 2

해명된 구조에 존재하는 이온으로부터 10Å내 잔기의 결정

부록 1의 배위는 BIOSYM 기술에 의해 제공되는 INSIGHT 프로그램으로부터 읽었다. 공간배위는 원자 사이의 결합을 나타냄으로써 제시하였다. 물원자뿐만 아니라 이온을 제시하였다. 서브세트를 창출하는 프로그램 팩키지 부분을 명령 ZONE을 사용하여 구조에서 칼슘과 나트륨이온 주위의 10Å 서브세트를 창출하기 위해서 사용하였다. 10Å내의 원자를 가지는 모든 잔기는 LIST MOLECULE 명령에 의해 수집하고 썼다. 배위화일에서 이움이라는 이온을 제공함으로써 이움이라고 불리는 모든 원자 주위의 10Å 영역을 수집하였다. 이 방법으로 동정된 특이 잔기는 상기 "Ca²⁺ 의존성"이라는 표제의 문단에서 자세히 제공되어 있다.

실시예 3

해명된 구조에서 공동의 결정 (부록 1)

해명된 구조는 많은 내부적 구멍과 공동을 나타낸다. 이런 공동을 분석할 때 코놀리 프로그램이 보통 사용된다(Lee, B.와 Richards, F.M. (1971) J. Mol. Biol. 55, p. 379-400). 프로그램은 단백질의 외부적 및 내부적 표면을 연구하기 위해서 반경을 가지는 프로브를 사용한다. 이 방법으로 관찰할 수 있는 가장 작은 구멍은 프로브 반경을 가지고 있다.

해명된 구조를 분석하기 위해서 INSIGHT의 프로그램에 포함된 코놀리 프로그램의 변형된 버젼을 사용하였다. 먼저 물분자와 이온은 해명된 구조로부터 이런 원자를 탈합병함으로써 제거하였다. 명령 MOLECULE SURFACE SOLVENT를 사용함으로써 용매 접근용이 표면영역은 1.4Å의 프로브 반경을 사용하여 모든 원자와 잔기에 대해 계산하였고 해명된 구조의 모델과 함께 그래프 스크린상으로 나타내었다. 그후 내부적 공동은 외부적 표면과 연결되지 않은 점 표면으로써 나타내었다.

구멍을 채우기 위한 돌연변이 제안이 명세서에 제공되어 있다 ("증가된 열안정성 및/또는 변경된 최적 온도를 가지는 변이체"라는 표제의 문단에서). 상동성을 사용하여 TERM과 BSG와 BAN의 상동한 구조에 대한 제작 구조 및/또는 서열 배열 돌연변이가 만들어질 수 있다.

실시예 4

본 발명에 따른 Termamyl^TM 변이체의 제작

테르마밀(서열 2)은 pDN1528로 표시되는 플라스미드로부터 B. subtilis에서 발현되었다. 이 플라스미드는 테르마밀, amyL을 암호하는 완전한 유전자를 포함하며, 이것의 발현은 이 자신의 프로모터에 의해 지시된다. 더욱이, 이 플라스미드는 플라스미드 pUB110으로부터의 복제기점, ori와 클로람페니콜에 대한 저항성을 제공하는 플라스미드 pC194로부터의 cat 유전자를 포함한다. pDN1528이 도 9에 제시되어 있다.

서열 1의 암호부위의 주요부분을 포함하는 특이 돌연변이유발 벡터를 제조하였다. pJeEN1으로 표시되는, 이 벡터의 중요한 특징은 pUC 플라스미드로부터 유래되는 복제기점, 클로람페니콜에 대한 저항성을 제공하는 cat 유전자, 및 bla 유전자의 틀이동-함유 버젼을 포함하며, 이것의 야생형은 정상적으로 암피실린(ampR 표현형)에 대한 저항성을 제공한다. 이런 돌연변이된 버젼은 ampS 표현형을 일으킨다. 플라스미드 pJeEN1이 도 10에 제시되어 있고, E. coli 복제기점, ori, bla, cat, 테르마밀 아밀라제 유전자의 5' 절단된 버젼 및 선별된 제한부위가 플라스미드에 나타나 있다.

"선별 프라이머(프라이머 #6616: 하기 참조)"를 가지는 플라스미드가 통합된 것을 제외하고 Deng과 Nickoloff (1992, Anal. Biochem. 200, pp. 81-88)에 기재된 방법에 의해 amyL로 도입된 돌연변이는 Deng과 nickoloff에 의해 개요된 제한효소절단에 의한 선별을 사용하는 대신, 수선된 bla 유전자를 가지는 플라스미드를 가지는 형질전환된 E. coli 세포의 amp^R 표현형을 기초로 하여 선별하였다. 돌연변이유발을 위해 사용되는 화학물질과 효소는 Stratagene으로부터 Chameleon^TM 돌연변이유발 키트로부터 얻었다(목록번호 200509).

변이 플라스미드에서 DNA 서열의 확인후에, 원하는 변경을 포함하고 있는 절단된 유전자는 PstI-EcoRI 절편으로서 pDN1528로 서브클로닝하였고 변이 효소를 발현시키기 위해서 프로테아제- 및 아밀라제- 고갈된 Bacillus subtilis 균주로 형질전환하였다.

테르마밀 변이체 V54W는 다음과 같은 돌연변이유발 프라이머의 사용으로 제조하였다(5'에서 3'으로, 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여짐):

PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG

테르마밀 변이체 A52W+V54W는 다음과 같은 돌연변이유발 프라이머의 사용으로 제조하였다(5'에서 3'으로, 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여짐):

PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG

프라이머 #6616(5'에서 3'으로, 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여짐: P는 5 인산을 나타냄)

P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C

실시예 5

"잔여" α-아밀라제 활성의 존재에서 당화

변경된 특이성을 가지는 두 개의 적당한 테르마밀 변이체는 변이 아밀라제가 활성적인 조건하에서 A. niger 글루코아밀라제와 B. acidopullulyticus 플룰라나제로 DE 10(DE=덱스트로스 당량) 말토덱스트린 기질을 당화함으로써 평가하였다.

당화:

당화를 위한 기질은 약 30% w/w로 건조기질(DS) 함량을 조절하면서 460㎖ 가열 탈이온화된 물에, 일반적인 옥수수 녹말로부터 제조된 230g DE 10 스프레이-건조된 말토덱스트린을 용해하고 약 30% w/w로 건조기질(DS) 함량을 맞춤으로써 제조하였다. pH는 4.7(60℃에서 측정)로 적정하였고 15g 건조중량에 해당하는 기질의 분액은 50㎖ 푸른색 뚜껑 유리 플라스크로 옮겼다.

플라스크는 그후 60℃로 맞추어진 쉐이킹 워터 베스에 방치하였고 효소를 첨가하였다. pH는 필요할 때 4.7로 재적정하였다.

다음과 같은 효소를 사용하였다.

글루코아밀라제: AMG^TM(노보 노르디스크 A/S); 사용량 0.18 AG/g DS

풀룰라나제: 프로모자임^TM(노보 노르디스크 A/S); 사용량 0.06 PUN/g DS

α-아밀라제: 테르마밀^TM(노보 노르디스크 A/S); 사용량 60 NU/g DS

테르마밀 변이체 V54W; 사용량 60 NU/g DS

테르마밀 변이체 V54W+A52W; 사용량 60 NU/g DS

2㎖ 샘플을 주기적으로 취하였다. 각각 샘플의 pH는 약 3.0으로 적정하였고, 그후 샘플은 효소를 불활성화하기 위해서 15분간 끓는 워터베스에서 가열하였다. 냉각후에, 샘플은 회전 믹서상에서 30분동안 대략 0.1g 혼합된-배드 이온교환 수지(BIO-Rad 501-X (D))로 처리한 후 여과하였다. 각 샘플의 탄수화물 조성물은 HPLC로 결정하였다. 다음과 같은 결과를 72시간후에 얻었다 [DPn은 n 글루코스 단위를 가지는 덱스트로스(D-글루코스) 올리고머를 나타낸다]:

α-아밀라제	%DP1	%DP2	%DP3	%DP4
없음 (대조구)	95.9	2.8	0.4	1.0
V54W	96.0	2.9	0.4	0.8
V54W + A52W	95.9	2.8	0.4	0.8
테르마밀^TM	95.6	2.8	0.8	0.8

대조구(α-아밀라제 활성이 액화동안 존재하지 않음)와 비교했을 때, 변이체 V54W와 V54W+A52W로부터 α-아밀라제 활성의 존재는 증가된 패노스(DP3) 수치를 유도하지 않음을 상기 결과로부터 볼 수 있다. 반대로, 테르마밀 α-아밀라제 활성은 패노스의 높은 수치와 후속의 D-글루코스(DP1) 수율의 손실을 일으켰다.

따라서, 만약 α-아밀라제 변이체 V54W 또는 V54W+A52W가 녹말당화를 위해 사용된다면, 당화의 개시전에 잔여 α-아밀라제 활성을 불활성화시키는 것이 필요하지 않을 것이다.

실시예 6

본 발명의 α-아밀라제 변이체의 칼슘-결합 친화성

열 또는 구아니딘 히드로클로라이드같은 변성제에 노출에 의해 아밀라제의 풀림은 형광에서의 감소를 수반한다. 칼슘이온의 손실은 풀림을 유도하며, 칼슘에 대한 α-아밀라제의 친화성은 충분히 긴 기간의 시간(55℃에서 22시간같은)동안 칼슘(예를 들어 1μM-100mM의 범위로) 또는 EGTA(예를 들어 1-1000μM의 범위로) [EGTA= 1,2-di(2-아미노에톡시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산]의 여러 농도를 가지는 완충액(예를 들어 50mM HEPES, pH 7)에서 각각 α-아밀라제(예를 들어 10㎍/㎖의 농도로)의 배양 전과 후의 형광측정에 의해 측정할 수 있다.

측정된 형광도 F는 효소의 접힌 그리고 접히지 않은 형태의 기여형태로 구성된다. 다음과 같은 방정식이 칼슘농도([Ca])상에서 F의 의존성을 기술하기 위해서 유도할 수 있다:

F = [Ca]/(Kdiss + [Ca]) (αN -βNlog([Ca]))+

Kdiss/(Kdiss + [Ca]) (αU -βUlog([Ca]))

여기에서 αN은 효소 원형(접힌)의 형광도이고, βN은 칼슘농도의 알고리즘상에서(실험적으로 관찰된 것처럼) αN의 직선적 의존성이며, αU는 접히지 않은 형태의 형광도이고 βU는 칼슘농도의 알고리즘상에서 αU의 직선적 의존성이다. Kdiss는 다음과 같은 평형공정에 대한 분명한 칼슘-결합 상수이다:

Kdiss

N - Ca ↔ U + Ca (N = 원효소; U = 접히지 않은 효소)

사실상, 풀림 과정은 매우 느리며 가역적이다. 풀림의 속도는 칼슘농도에 의존적이며 주어진 α-아밀라제에 대한 의존성은 효소의 Ca-결합 친화성의 측정을 제공한다. 반응조건(예를 들어 55℃에서 22시간)의 표준세트를 규정함으로써, 여러 α-아밀라제에 대한 Kdiss의 의미있는 비교가 만들어질 수 있다. 일반적으로 α-아밀라제에 대한 칼슘해리곡선은 Kdiss의 해당값의 결정을 허락하는, 상기 식에 맞쳐질 수 있다.

Kdiss의 다음과 같은 값은 WO 95/26397의 서열 1에 제시된 아미노산서열을 가지는 모-테르마밀-유사 α-아밀라제와 본 발명에 따른 이것의 지정된 변이체에 대해 얻었다:

α-아밀라제	K_diss (mol/ℓ)
L352C+M430C+T183+G184	1.7 (±0.5) × 10-3
부모	1.7 (±1.1) × 10-1

해당 변이체의 칼슘-결합 친화성은 부모보다 더욱 강하게 상당히 칼슘에 결합하기 때문에 부모보다 상응하게 더 낮은 칼슘의존성을 가짐을 상기로부터 명백하다.

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서열 목록

다음 서열 1, 3, 5에서, 적당한 α-아밀라제 유전자의 5′암호서열 및 3′서열이 제시되어 있다. 5′서열은 소문자로 쓰여진 서열의 첫 번째 분리된 부분이고, 암호서열은 서열의 중간부분이며, 여기에서 신호서열은 소문자로 쓰여 있으며 성숙 α-아밀라제를 암호화하는 서열은 대문자로 쓰여 있고, 3′서열은 소문자로 쓰여진 서열의 세번째 분리된 부분이다.

본 발명의 방법에 의해 변경된 특성, 예를 들어, 기질 특이성, 기질 결합성, 기질 분해 양상, 온도 안정성, pH 의존 활성, pH 의존 안정성(특히 저(예를 들어 pH＜6 특히 pH＜5) 또는 고(예를 들어 pH＞9 pH 값에서 증가된 안정성), 산화에 대한 안정성, Ca2+-의존성, 특이활성, 및 흥미있는 다른 성질을 갖는 변이체가 제공된다. 예를 들면, 변경은 모 테르마밀-유사 α-아밀라제와 비교했을 때 주어진 pH 및/또는 변경된 기질 특이성에서 증가된 특이 활성을 가지는 변이체를 일으킨다.

더욱 심화된 측면에서 본 발명은 테르마밀-유사 α-아밀라제의 변이체, 이런 변이체를 암호하는 DNA 및 변이체를 제조하는 방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 다양한 산업적 목적을 위해 변이체가 사용될 수 있다.

도 1은 루프 2의 구조,

도 2는 루프 3(a)의 구조,

도 3은 루프 3(b)의 구조,

도 4는 루프 1(a)의 구조,

도 5는 루프 1(b)의 구조,

도 6은 루프 8의 구조,

도 7은 도메인 B의 구조,

도 8은 B. liqueliformis α-아밀라제의 누클레오티드서열,

도 9는 플라스미드 pDN1528의 구조,

도 10은 플라스미드 pJeEN1의 구조.

Claims

SEQ ID NO:4의 아미노산잔기 196-198에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 166-173에 해당하는 아미노산절편으로 치환된 SEQ ID NO:4의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체.
SEQ ID NO:4의 아미노산잔기 121-181에 해당하는, 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 102-206에 해당하는 아미노산절편으로 치환된 SEQ ID NO:4의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체.
SEQ ID NO:4의 아미노산잔기 121-174에 해당하는, 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 102-199에 해당하는 아미노산절편으로 치환된 SEQ ID NO:4의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체.
SEQ ID NO:4의 아미노산잔기 14-15에 해당하는, 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 32-38에 해당하는 아미노산절편으로 치환된 SEQ ID NO:4의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체.
SEQ ID NO:4의 아미노산잔기 8-18에 해당하는, 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 14-40에 해당하는 아미노산절편으로 치환된 SEQ ID NO:4의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체.
SEQ ID NO:2의 아미노산잔기 325-345에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 294-313에 해당하는 아미노산절편으로 치환된 SEQ ID NO:2의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체.
SEQ ID NO:10의 아미노산잔기 121-181에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 102-206에 해당하는 아미노산절편으로 치환된 SEQ ID NO:10의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체.
SEQ ID NO:10의 아미노산잔기 121-174에 해당하는 모 α-아밀라제의 아미노산절편이 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 102-199에 해당하는 아미노산절편으로 치환된 SEQ ID NO:10의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체.
SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산서열의 아미노산잔기 181-184에 해당하는 아미노산절편이 결실되는 것을 특징으로 하는 SEQ ID NO: 10의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체.
α-아밀라제 활성을 나타내고 SEQ ID NO:2의 서열을 갖는 모 α-아밀라제와 비교했을 때 감소된 Ca2+ 의존성을 가지며, SEQ ID NO:2에서 다음과 같은 위치: N104, A349, I479, L346, I430, N457, K385, F350, I411, H408 또는 G303중 적어도 하나에 해당하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 모 α-아밀라제의 변이체.
제 10항에 있어서, 돌연변이는

N104D;

A349C+I479C;

L346C+I430C;

N457D, E;

N457D, E+K385R;

F350D, E+I430R, K;

F350D, E+I411R, K;

H408Q, E, N, D; 또는

G303N, D, Q, E인 것을 특징으로 하는 변이체.
SEQ ID NO: 2, 4 또는 6의 서열을 갖는 모 α-아밀라제보다 최적 pH 이하에서 높은 활성을 나타내는 모 α-아밀라제의 변이체에 있어서, B. licheniformis α-아밀라제(SEQ ID NO:2)의 다음과 같은 위치: E336, Q333, P331, I236, V102, A232, I103, L196중 적어도 하나에 해당하는 아미노산잔기의 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
모 α-아밀라제보다 최적 pH 이상에서 높은 활성을 나타내는 SEQ ID NO: 2, 4 또는 6의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체에 있어서, B. licheniformis α-아밀라제(SEQ ID NO:2)의 다음과 같은 위치: N236, H281 및 Y273중 하나 이상에 해당하는 아미노산잔기의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
모 α-아밀라제와 비교했을 때 α-아밀라제 활성을 나타내며 증가된 열안정성, 변경된 최적 온도 또는 증가된 열안정성과 변경된 최적온도 모두를 가지는 SEQ ID NO: 2, 4 또는 6의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체에 있어서, B. licheniformis α-아밀라제(SEQ ID NO:2)의 다음과 같은 위치: L61, Y62, F67, K106, G145, I212, S151, R214, Y150, F143, R146, L241, I236, L7, V259, F284, F350, F343, L427 및 V481 중 하나 이상에 해당하는 아미노산잔기의 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
모 α-아밀라제와 비교했을 때 α-아밀라제 활성을 나타내며 분지점에 가깝게 올리고당 기질을 분해하는데 감소된 능력을 가지는, SEQ ID NO: 2, 4 또는 6의 서열을 갖는 모 α-아밀라제의 변이체에 있어서, B. licheniformis α-아밀라제(SEQ ID NO:2)의 다음과 같은 위치: V54, D53, Y56, Q333 및 G57 중 하나 이상에 해당하는 아미노산잔기의 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 갖는 DNA.
제 16 항에 따른 DNA를 수반하는 재조합 발현 벡터.
제 16 항에 따른 DNA로 형질전환된 미생물 세포.
제 17 항에 따른 벡터로 형질전환된 미생물 세포.
제 19 항에 있어서, 박테리아 또는 균류인 것을 특징으로 하는 세포.
제 20 항에 있어서, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, 또는 Bacillus thuringiensis같은 그람양성 박테리아인 것을 특징으로 하는 세포.
제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 사용하는 것을 포함하는, 세제 또는 식기세척기 세제 조성물의 제조방법.
제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 포함하는 풀빼기 조성물 첨가제.
제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 포함하는 녹말당화 조성물 첨가제.
선택적으로 비-분지 과립, 안정화된 액체 또는 보호된 효소의 형태로 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 포함하는 세제첨가제.
제 25 항에 있어서, 첨가제 g당 0.02-200mg의 α-아밀라제 변이체를 함유하는 것을 특징으로 하는 세제첨가제.
제 25 항에 있어서, 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다제, 다른 아밀로스분해 효소, 셀룰라아제 또는 그들의 혼합물 같은 다른 효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세제첨가제.
제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 포함하는 세제조성물.
제 28 항에 있어서, 추가로 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다제, 다른 아밀로스분해 효소, 셀룰라아제 또는 그들의 혼합물 같은 다른 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 세제조성물.
제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 포함하는 수동 또는 자동 식기세척 세제조성물.
제 30 항에 있어서, 추가로 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다제, 다른 아밀로스분해 효소, 셀룰라아제 또는 그들의 혼합물 같은 다른 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 식기세척 세제조성물.
제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 포함하는 수동 또는 자동 세탁물 세척조성물.
제 32 항에 있어서, 추가로 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다제, 아밀로스분해 효소, 셀룰라아제 또는 그들의 혼합물 같은 다른 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 세탁물 세탁조성물.
제 12 항에 있어서, 돌연변이는

E336R, K;

Q333R, K; P331R, K;

V102R, K, A, T, S, G;

I236K, R, N;

I103K, R;

L196K, R; 또는

A232T, S, G인 것을 특징으로 하는 변이체.
제 13 항에 있어서, 돌연변이는

N326I, Y, F, L, V;

H281F, I, L; 또는

Y273F, W인 것을 특징으로 하는 변이체.
제 14 항에 있어서, 돌연변이는

L61W, V, F;

Y62W;

F67W;

K106R, F,W;

G145F, W;

I212F, L, W, Y, R, K;

어떤 다른 아미노산잔기로 치환된 S151;

R214W;

Y150R, K;

F143W;

R146W;

L241I, F, Y, W;

I236L, F, W, Y;

L7F, I, W;

V259F, I, L;

F284W;

F350W;

F343W;

L427F, L, W; 또는

V481, F, I, L, W인 것을 특징으로 하는 변이체.
제 36 항에 있어서, S151은 F, W, I 또는 L로 치환된 것을 특징으로 하는 변이체.
제 15 항에 있어서, 돌연변이는

V54L, I, F, Y, W, R, K, H, E, Q;

D53L, I, F, Y, W;

Y56W;

Q333W; 또는

모든 가능한 아미노산잔기 중 어느 하나로 치환된 G57인 것을 특징으로 하는 변이체.
제 26 항에 있어서, 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다제, 다른 아밀로스분해 효소, 셀룰라아제 또는 그들의 혼합물 같은 다른 효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세제첨가제.