CN102796717A

CN102796717A - 外切特异性的淀粉酶多肽、编码那些多肽的核酸及其应用

Info

Publication number: CN102796717A
Application number: CN2012102445180A
Authority: CN
Inventors: C·T·贝尔格; K·博伊森; P·M·F·德克斯; C·费奥雷西; G·赫里兹; K·M·克拉; W·刘; A·肖; C·R·索达尔
Original assignee: Genencor International Inc; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 2003-07-07
Filing date: 2004-07-07
Publication date: 2012-11-28
Also published as: BRPI0412328A; JP2011041575A; ES2313034T3; KR101286991B1; WO2005007867A3; AU2004257209C1; US7833770B2; CA2531647C; WO2005007867A2; BRPI0412401A; EP1641925B1; EP2292744A1; AU2011202098B2; EP1649006A2; JP4790605B2; KR20070085027A; AU2004257209B2; US20110212241A1; EP1649006A4; US8129511B2

Abstract

本发明涉及淀粉酶多肽和编码所述多肽的核酸及其用途。本发明的淀粉酶被设计为具有更多的有益性质。具体来说，本发明的淀粉酶显示了改变的外切特异性。

Description

外切特异性的淀粉酶多肽、编码那些多肽的核酸及其应用

本申请是于2004年7月7日提交的发明名称为“外切特异性的淀粉酶多肽、编码那些多肽的核酸及其应用”，申请号为200480023286.X发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉参考

本申请要求USSN 60/485,616和USSN 60/485,413的权益和优先权，USSN 60/485,616由Berg等在2003年7月7日提交，题目是“Exo-specificAmylase Polypeptides，Nucleic acid Encoding Those Polypeptides and UsesThereof”(案卷编号GC807P)，USSN 60/485,413是2003年7月7日提交的，题目是“Thermostable Amylase Polypeptides，Nucleic acid Encoding ThosePolypeptides and Uses Thereof”(案卷编号GC806P)。这些申请涉及2003年7月7日提交的USSN 60/485,539，题目是“Polypeptides”(案卷编号P016939USO)。

技术领域

本发明涉及淀粉酶多肽和编码所述多肽的核酸及其应用。本发明的淀粉酶被设计为，具有更多的有益性质。具体来说，本发明的淀粉酶显示了改变的外切特异性(exospecifity)。

背景技术

改进的淀粉酶可以改善在某些过程如烘焙中的内在问题。在烘焙后数天，在淀粉颗粒中发生支链淀粉的结晶，这导致面包的坚硬性增加，并引起面包变得不新鲜(staling)。当面包不新鲜时，面包丧失了面包屑(crumb)的软度和面包屑的湿度。结果是，面包屑变得弹性降低，面包变为坚韧的干面包片。

支链淀粉侧链的酶促水解(例如，通过淀粉酶)可以减少结晶并增强保鲜能力。结晶取决于支链淀粉侧链的长度：侧链越长，结晶越多。大多数淀粉颗粒是由两种聚合物的混合物组成的：支链淀粉和直链淀粉，其中大约75％是支链淀粉。支链淀粉是非常大的分支的分子，由通过(1-4)键连接的α-D-吡喃葡萄糖基单位构成的链组成，其中链通过α-(1-6)键进行连接，从而形成分支。直链淀粉是(1-4)键接的α-D-吡喃葡萄糖基单位构成的线性链，几乎不带有α-(1-6)分支。

烘焙含淀粉面包产品如白面包、由筛选的黑麦粉和小麦粉制成的面包以及面包卷，是通过烘焙面团完成的，炉温为180至250℃，持续大约15至60分钟。在烘焙过程中，急骤的温度梯度(200→120℃)遍及面团外层，此时，烘焙产品的硬皮生成。然而，由于蒸气，在烘焙过程的末期，面包屑的温度仅为大约100℃。在高于大约85℃的温度，可能发生酶的失活，酶将不具有保鲜特性。因此，只有热稳定的淀粉酶能够在烘焙期间有效地修饰淀粉。

由于支链糊精的积累会导致产生粘性的或胶粘的面包屑，内切淀粉酶活性会对最终面包产品的质量产生负面影响。外切淀粉酶活性是优选的，因为其完成了期望的淀粉修饰，所述修饰导致老化(不新鲜化)的延迟，而与内切淀粉酶活性相关的负面效应则较少。内切淀粉酶活性的降低可以导致更高的外切特异性，这可以减少支链糊精并产更高质量的面包。

本发明涉及具有改变的外切特异性的多肽。

发明内容

在第一方面，本发明提供了包括PS4变异体的多肽，PS4变异体衍生自亲代多肽(parent polypeptide)。亲代酶可以优选地是嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的非产麦芽外切淀粉酶(non-maltogenicexoamylase)，如具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中列出的氨基酸序列的外切淀粉酶。亲代酶可以优选地是施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的非产麦芽外切淀粉酶，如具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO11中列出的氨基酸序列的多肽。PS4家族的其它成员可以被用作亲代酶。

在优选的实施方案中，亲代多肽是来自嗜糖假单胞菌的非产麦芽外切淀粉酶，其具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中列出的氨基酸序列。在其它优选的实施方案中，亲代多肽是来自施氏假单胞菌的非产麦芽外切淀粉酶，其具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11中列出的氨基酸序列。在一种优选的实施方案中，PS4变异体通过包含氨基酸取代而不同于亲代多肽，取代所处的位置包括选自下列的至少一个位置：4、9、13、33、34、42、70、71、87、99、100、108、113、121、131、134、135、141、153、157、158、160、161、166、170、171、178、179、184、188、198、199、221、223、238、270、277、290、307、315、334、335、342、343、372、392、398、399、405、415、425，其中对位置所进行的编号是参照SEQ ID NO：1列出的嗜糖假单胞菌序列。在一种优选的实施方案中，PS4变异体通过包含氨基酸取代而不同于亲代多肽，所述取代所处的位置包括选自下列的至少一个位置：4、33、34、70、71、87、99、108、113、121、131、134、141、157、158、171、178、179、188、198、199、223、290、307、315、334、343、399和405，其中位置编号是参照SEQID NO：1列出的嗜糖假单胞菌序列。优选地，所述位置是选自下列的至少一个位置：33、34、71、87、121、134、141、157、178、179、223、307、334和343。优选地，PS4变异体包括至少一个取代，其选自：N33Y、D34N、K71R、G87S、G121D、G134R、A141P、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P和D343E。

在另一种实施方案中，所述外切淀粉酶还包括至少一个另外的取代，位置选自108、158、171和188。优选地，PS4变异体包括选自下列的至少一个取代：K108R、G158D、Y171S和G188A。

优选地，PS4变异体包括选自下列的至少一个取代：G4D、N33Y、D34N、G70D、K71R、G87S、A99V、K108R、V113I、G121D、G134R、A141P、I157L、G158D、Y171S、L178F、A179T、G188A、Y198F、Y198L、A199V、G223A、V290I、H307L、I315V、S334P、D343E、S399P、A405F和A405E。优选地，PS4变异体包括下列取代：N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L和S334P，带有至少一个另外的取代：L178F或A179T。优选地，PS4变异体包括下列取代中的至少一个：N33Y、D34N、I157L、L178F、A179T、G223A或H307L。优选地，PS4变异体包括下列取代中的至少一个：G87S、G134R、A141P或S334P。

在其它优选的实施方案中，PS4变异多肽包括选自下列的组合：

G134R，A141P I157L G223AH307L S334P D343E G121D；

G134R A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33Y G121D；

G134R A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33Y；

G134R，A141P I157L G23A H307L S334P D343E N33Y D34N K71RL178F A179T G87S G121D S214N T375A；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33Y D34N K71RL178F A179T G121D Y171S G188A N138D；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33Y D34N K71RL178F A179T G121D；

G87S G121D G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33YD34N K71R L178F A179T；

G87S G121D G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33YD34N K71R L178F A179T G188A；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P K71R L178F A179T；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P L178F A179T；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P N33Y D34N L178F A179T；G134R，A141P I157L G223A H307L S334P L178F A179T G87S G121D；G134R，A141P I157L G223A H307L S334P L178F A179T G121D；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33Y D34N K71RL178F A179T G121D E343D；

G87S G121D G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33YD34N K71R L178F A179T Y33N N34D E343D；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33Y D34N K71RL178F A179T G121D；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P K71R L178F A179T G121D；G87S，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

113F，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；A99V，V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

A199V， D343E，V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，S334P，D343E；

V113I，G121D，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，A141P，Y198F，G223A，V290I，H307L；

V113I，A141P，Y198F，G223A，V290I，S334P，D343E；

V113I，A141P，Y198F，G223A，A268P，V290I，S399P

V113I，A141P，Y198F，G223A，V290I，S399P；

V113I，A141P，Y198W，G223A，V290I；

V113I，A141P，Y198F，G223A，V290I；

Y198F，G223A，V290I；

Y198W，G223A，V290I；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I；

V113M；

V113A；

V113I，G134R，A141P， I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，I315V， S334P，D343E；

D34N，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，G188S，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

K71R，V113I，G134R，A141P，I157L，L178L，Y198F，G223A，V290I，H307L，G313G， S334P，D343E；

D34N，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，G313G， S334P，D343E；V113I，G134R，A141P，I157L，A179V， Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，I170I，Y198F，G223A，V290I，H307L，G313G，S334P，D343E

V113I，G134R，A141P，I157L，A179V， Y198F，G223A，V290I，H307L，G313G， S334P，D343E；

G87S，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E，A405E；

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E， A405V；

A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198L，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

K71R，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

K108R，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P， D343E；

D34G， V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

G4D，V113I， A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；和

A141P， G134R，G223A，H307L，I157L，V113I，V290I，Y198F，G188A；

在其它优选的实施方案中，PS4变异体多肽包括选自下列的组合：

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L和S334P；

G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L和S334；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L和S334P；

G134R，A141P，I157L，L178F，A179T， G223A，H307L和S334P；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；

G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；N33Y，D34N，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；N33Y，D34N，G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；和

N33Y，D34N，G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P。

N33Y，D34N，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；

N33Y，D34N，G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；和

N33Y，D34N，G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T， G223A，H307L和S334P

在优选的实施方案中，PS4变异体是包含在SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中列出的序列的氨基酸。

PS4变异体可以是源自假单胞菌(Pseudomonas sp)。在一种实施方案中，假单胞菌某种是选自嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌。

PS4变异多肽可以包括除上面列出的那些突变之外的一种或多种突变。也可以包括其它突变，例如在一个或多个其它位点的删除、插入、取代、颠换、转换和倒位(inversions)。同样地，多肽可以缺失上面列出的取代的至少一个。

在一种优选的实施方案中，多肽被截短。截短(truncation)可以在N末端或C末端。亲代酶或PS4变异体可以缺少一个或多个部分，例如子序列(sub-sequences)、信号序列、结构域或部分(moieties)，不论其是有活性或是没有活性的。例如，如本文所描述，亲代酶或PS4变异体多肽可以缺乏信号序列。作为选择地，或者附加地，亲代酶或PS4变异体可以缺乏一个或多个催化结构域或结合结构域。在优选的实施方案中，亲代酶或PS4变异体可以缺乏存在于非产麦芽外切淀粉酶中的一个或多个结构域，如淀粉结合结构域。例如，PS4多肽可以仅具有直至位置429的序列，这是相对于SEQ ID NO：1中列出的嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶的编号而言的。在一种优选的实施方案中，提供了PS4变异体pSac-d34(SEQ ID NO：15，图8c)、pSac-D20(SEQ ID NO：13，图8a)和pSac-D14(SEQ ID NO：14，图8b)，所述变异体具有如图中列出的氨基酸序列。

PS4变异体也可以包括同源序列。同源序列包括核苷酸序列，其与编码PS4变异体多肽酶的核苷酸序列有至少75％、80％、85％或90％是相同的(indentical)，优选地有至少95％、96％、97％、98％或99％是相同的。

优选的实施方案也包括功能上的等价物(functional equivalents)。本文中描述的PS4变异多肽来源于优选地显示出非产麦芽外切淀粉酶活性的多肽或者是优选地显示出非产麦芽外切淀粉酶活性的多肽的变异体。优选地，亲代酶本身是非产麦芽外切淀粉酶。优选实施方案中的PS4变异多肽也显示出非产麦芽外切淀粉酶活性。

本文描述的PS4变异体将优选地具有外切特异性，例如，由本文所描述的外切特异性指数(exospecificity indices)所量度的，这和它们是外切淀粉酶相一致。而且，与亲代酶或它们的起源多肽相比较，它们优选地具有更高的或增加的外切特异性。因此，例如，PS4变异多肽可以具有20或更大的外切特异性指数，即，其总淀粉酶活性(包括外切淀粉酶活性)比其内切淀粉酶活性多20倍或更多。在优选的实施方案中，外切淀粉酶的外切特异性指数是30或更多、40或更多、50或更多、60或更多、70或更多、80或更多、90或更多、或100或更多。在优选的实施方案中，外切特异性指数是150或更多、200或更多、300或更多、或400或更多。

优选地，PS4变异体将比亲代更加热稳定。优选地，PS4变异多肽能够在从大约55℃至大约80℃或更高的温度下降解淀粉。优选地，PS4变异体在暴露于高达大约95℃的温度后保持其活性。本文描述的PS4变异多肽相对于亲代酶，具有延长的半衰期，优选地延长10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多，这优选地在从55℃至大约95℃或更高的高温下，优选地在大约80℃发生。优选地，将样品在80℃或更高温度下加热1-10分钟。

优选地，PS4变异多肽是更加pH稳定的。优选地，它比其同源亲代多肽的pH稳定性高。优选地，PS4变异多肽能够在pH从大约5至大约10.5时降解淀粉。在相同的pH条件下，和它们的亲代多肽相比较时，PS4变异多肽可以具有多出10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更长的半衰期。在另一种实施方案中，可以通过测定酶在特定pH条件下的活性或比活性来分析pH稳定性的程度。特定的pH条件可以是从pH5至pH10.5的任何pH。

在优选的实施方案中，功能上的等价物将和PS4家族成员中的至少一个具有序列同源性。功能上的等价物将和上面提及的嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶中的任一个具有序列同源性，优选地，和两者都具有序列同源性。功能上的等价物也可以和SEQ ID NOs：1至12中所示序列的任一个，优选地和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7或两者具有序列同源性。序列同源性优选地至少是60％、优选地是65％或更多、优选地是75％或更多、优选地是80％或更多、优选地是85％或更多、优选地是90％或更多、优选地是95％或更多。序列同源性可以通过本文列出的任何程序或所有程序生成。在其它的实施方案中，功能性等价物将能够特异地和上面列出的任何序列杂交。

在第二方面，本发明提供了核酸，该核酸编码包括PS4变异体的多肽，多肽可以从亲代多肽得到，如上所述。亲代酶可以优选地是SEQ ID NO：1中列出的或SEQ ID NO：5中列出的嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶。亲代酶可以优选地是SEQ ID NO：7列出的或SEQ ID NO：11中列出的施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶。PS4家族的其它成员可以被用作亲代酶。

在优选的实施方案中，亲代多肽是来自嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶的非产麦芽外切淀粉酶，其具有如SEQ ID NO：1列出的或SEQ ID NO：5列出的序列。在其它优选的实施方案中，亲代多肽包括来自施氏假单胞菌的非产麦芽外切淀粉酶，其具有如SEQ ID NO：7列出的或SEQ ID NO：11列出的序列。在一种优选的实施方案中，编码PS4变异体的核酸通过编码氨基酸取代而不同于亲代核酸，所述取代所处的位置包括至少一个位置，其选自：4、9、13、33、34、42、70、71、87、99、100、108、113、121、131、134、135、141、153、157、158、160、161、166、170、171、178、179、184、188、198、199、221、223、238、270、277、290、307、315、334、335、342、343、372、392、398、399、405、415、425，其中对位置所作的编号是参照SEQ ID NO：1列出的嗜糖假单胞菌序列。优选地，所述位置选自下列的至少一个位置：33、34、87、121、134、141、157、178、179、223、307和334。

优选地，编码PS4变异体的核酸包括编码多肽中至少一个取代的核酸，所述取代选自：N33Y、D34N、G87S、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307L和S334P。优选地，编码PS4变异体的核酸包括下列取代：N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L和S334P，并带有至少一个另加的L178F或A179T取代。优选地，编码PS4变异体的核酸包括下列取代中的一个：N33Y、D34N、I157L、L178F、A179T、G223A或H307L。优选地，编码PS4变异体的核酸包括下列取代中的一个：G87S、G134R、A141P或S334P。在另一种实施方案中，编码PS4变异体的核酸包括编码下列取代中的至少一个的核酸：K71R、K108R、G158D、Y171S、G188A和D343E。

在另一种实施方案中，编码PS4变异体的核酸包括这样的核酸，其编码下列的至少一个组合：

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E G121D；

G134RA141P I157L G223AH307L S334P D343E N33Y G121D；

G134RA141P I157L G223AH307L S334P D343E N33Y；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33Y D34N K71RL178F A179T G87S G121D S214N T375A；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33Y D34N K71RL178F A179T G121D Y171S G188AN138D；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33Y D34N K71RL178F A179T G121D；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P K71R L178F A179T；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P L178F A179T；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33Y D34N K71RL178F A179T G121D；

V113I，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E

A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

A199V，D343E，V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，S334P，D343E；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，A141P，Y198F，G223A，V290I，H307L；

V113I，A141P，Y198F，G223A，V290I，S334P，D343E；

V113I，A141P，Y198F，G223A，A268P，V290I，S399P

V113I，A141P，Y198F，G223A，V290I，S399P；

V113I，A141P，Y198W，G223A，V290I；

V113I，A141P，Y198F，G223A，V290I；

Y198F，G223A，V290I；

Y198W，G223A，V290I；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I；

V113M；

V113A；

K71R，V113I，G134R，A141P，I157L，L178L，Y198F，G223A，V290I，H307L，G313G，S334P，D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，A179V，Y198F，G223A，V290I，H307L，G313G，S334P，D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E，A405V；

A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

K108R，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

D34G，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

G4D，V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；和

A141P， G134R，G223A，H307L，I157L，V113I，V290I，Y198F，G188A；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L和S334P；

G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L和S334；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L和S334P；

G134R，A141P，I157L，L178F，A179T， G223A，H307L和S334P；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；

N33Y，D34N，G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；

N33Y，D34N，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；

在优选的实施方案中，编码PS4变异体的核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：10。

在一种优选的实施方案中，核酸编码截短的多肽。截短可以在N末端或C末端。亲代酶或PS4变异体可以缺少一个或多个部分，如子序列、信号序列、结构域或部分(moieties)，不论是有活性的或是没有活性的。例如，亲代酶或PS4变异多肽可以缺乏信号序列。替代地，或附加地，亲代酶或PS4变异体可以缺乏一个或多个催化结构域或结合结构域。在一种优选的实施方案中，亲代酶或PS4变异体可以缺乏存在于非产麦芽外切淀粉酶中的一个或多个结构域，如淀粉结合结构域。例如，PS4多肽可以具有仅至位置429的序列，这是相对于SEQ ID NO：1中显示的嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶的编号而言的。在一种优选的实施方案中，核酸编码如图中列出的PS4变异体pSac-d34、pSac-D20和pSac-D14。

编码PS4变异多肽的核酸可以包括除上面列出的那些突变之外的一个或多个突变。也可以包括其它突变，例如在一个或多个其它位置的删除、插入、取代、颠换、转换和倒位。同样地，核酸编码的多肽可以缺少至少一个在上面列出的取代。

编码PS4变异体的核酸也可以包括同源序列。同源序列包括核苷酸序列，其与编码PS4变异多肽酶的序列是至少75％、80％、85％或90％相同的，优选的是至少95％、96％、97％、98％或99％相同的。

优选的实施方案也包括编码多肽的核酸，所述多肽是PS4变异体的功能上的等价物。编码本文中描述的PS4变异多肽的核酸衍生自这样的核酸或是这样的核酸的变异体，所述核酸优选地编码具有非产麦芽外切淀粉酶活性的酶。优选地，由核酸编码的亲代酶本身是非产麦芽外切淀粉酶。优选实施方案中由核酸编码的PS4变异多肽也显示出非产麦芽外切淀粉酶活性。

如本文描述，由核酸编码的PS4变异体将优选地具有外切特异性，例如，由外切特异性指数所量度的。而且，优选地，在相同条件下，与亲代酶或它们的起源多肽相比较，它们优选地具有更高的或增加的外切特异性。因此，例如，PS4变异多肽可以具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高的外切特异性指数。优选地在相同条件下，当和它们的亲代多肽相比较时，它们具有1.5x或更高、2x或更高、5x或更高、10x或更高、50x或更高、100x或更高的外切特异性。

优选地，由核酸编码的PS4变异体将比亲代更加热稳定。优选地，PS4变异多肽能够在从大约55℃至大约80℃或更高的温度下降解淀粉。优选地，PS4变异体在暴露于高达大约95℃的温度后保持其活性。本文描述的PS4变异多肽相对于亲代酶，具有延长的半衰期，优选地延长10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多，这优选地在从55℃至大约95℃或更高的高温下，优选地在大约80℃发生。优选地，将样品在80℃或更高的温度下加热1-10分钟。

优选地，由核酸编码的PS4变异多肽是pH稳定的。优选地，它比其亲代多肽的pH稳定性高。优选地，PS4变异多肽能够在pH从大约5至大约10.5时降解淀粉。具体的pH条件可以是从pH5至pH10.5的任何pH。在相同的条件下，和亲代多肽相比较时，该核酸编码的PS4变异多肽可以具有更长的半衰期或更高的活性(取决于分析方法)。在相同的pH条件下，和亲代多肽相比较时，PS4变异多肽可以有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更长的半衰期。替代地，或附加地，在相同的pH条件下，和亲代多肽相比较时，它们可以具有更高的活性。

在一种优选的实施方案中，该核酸编码的功能上的等价物将和PS4家族成员中的至少一个具有序列同源性。功能上的等价物将和上面提及的嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶中的任一个具有序列同源性，在一种优选的实施方案中，优选地和两者都具有序列同源性。功能上的等价物也可以和SEQ ID NOs：1至12中的任何一个，优选地和SEQ ID NO：1或SEQID NO：7或两者具有序列同源性。序列同源性优选地至少是60％、优选地是65％或更多、优选地是75％或更多、优选地是80％或更多、优选地是85％或更多、优选地是90％或更多、优选地是95％或更多。

在其它实施方案中，提供了核酸，所述核酸和编码本文列出的任意PS4变异体的核酸互补。此外，提供了能够和该互补序列杂交的核酸。在一种优选的实施方案中，编码功能上等价物的核酸将能够特异地和上面列出的任意序列杂交，它和它的互补物提供于此。

在一种优选的实施方案中，用于本文描述的方法和组合物的序列是合成序列。其包括但不限于，利用宿主生物体的最佳密码子使用所形成的序列，宿主生物体如甲基营养酵母毕赤酵母(Pichia)和汉逊酵母(Hansenula)。

本发明的第三方面提供了组合物，其包括至少一种PS4变异多肽和另一组分。另一组分可以是酶，其选自氧化还原酶、水解酶、脂肪酶、酯酶、糖苷酶、淀粉酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉降解酶、蛋白酶和脂加氧酶。在一种优选的实施方案中，组合物包括至少一种PS4变异体和来自杆菌的产麦芽淀粉酶，如WO91/04669中所公开的。优选的实施方案包括PS4变异体和面粉。

另外的酶可以和任何面团成分共同加入，面团成分包括面粉、水或任选的其它组分或添加剂或面团改良组合物(dough improving composition)。可以在面粉、水或任选的其它组分或添加剂或面团改良组合物之前或之后加入另外的酶。另外的酶可以是液体制备物，或干燥组合物的形式。

第四方面提供了包括PS4变异多肽的载体、包括PS4变异多肽的细胞和表达PS4变异多肽的方法。在一种优选的实施方案中，本发明涉及重组的可复制载体，其带有编码PS4变异多肽的核酸。载体可以附加地包括本文列出的任何元素。另一种优选的实施方案提供了宿主细胞，其包含编码PS4变异体的核酸。宿主细胞可以是本文列出的任何细菌、真菌或酵母细胞。在一种优选的实施方案中，如本文所提供，本发明涉及表达PS4多肽的方法。

本发明的其它方面可以在相关申请中找到，其律师案卷编号为674510-2007和GC806P，它们在此并入作为参考，包括任何图表、参考文献和附图。

附图说明

图1显示了PS4变异体的热稳定性改善。PS4cc1是表达的对照酶，其来自嗜糖假单胞菌，不带有信号序列并缺乏淀粉结合结构域。对PS4cc1、pSac-D3、pSac-D20和pSac-D14，以半衰期对温度作图，半衰期以分钟表示，温度以摄氏度表示。

图2显示了在模型面团体系试验(model dough system trial)中，PSac-D34的剂量效应。面包屑的固体含量是通过NMR测定的。对于对照、D340.5、1、2ppm，以通过固体含量来量度的坚硬度对烘焙后的天数作图。

图3显示了烘焙试验(baking trial)的结果，结果显示了以每kg面粉1mg的剂量加入PSac-D3和Psac-D14时，降低的坚硬性和坚硬速度。对对照组，以通过hPa量度的坚硬性对烘焙后的天数作图。

图4显示了烘焙试验，显示了相比于不带有N33Y、D34N、K71R、L178F、A179T的PSac-D3，PSac-D3(G134R、A141P、I157L、G223A、A307L、S334P、K71R、D343E、N33Y、D34N、L178F、A179T)的增加软化的效应，在75C时，和PSac-D3的9，3分钟相比，其t_1/2-75是3，6。

图5显示了PS4(SEQ ID NO：1)参照序列，来自嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列。

图6显示了PS4变异体的序列(SEQ ID NO：2)；嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F和A179T取代。

图7显示了PS4变异体的序列(SEQ ID NO：3)；嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179T和G121D取代。

图8A显示了PS4变异体的序列(SEQ ID NO：4)；嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179T、G121D和G87S取代。

图8B显示了PSac-D20序列(SEQ ID NO：13)；嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有13个取代和淀粉结合结构域的删除。

图8C显示了PSac-D14序列(SEQ ID NO：14)；嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有14个取代和淀粉结合结构域的删除。

图8D显示了PSac-D34序列的序列(SEQ ID NO：15)；嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有11个取代和淀粉结合结构域的删除。

图9显示了嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。嗜糖假单胞菌葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶前体(EC 3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(麦芽四糖形成淀粉酶)(外切麦芽四糖水解酶)(麦芽四糖形成外切淀粉酶)。SWIS S-PROT登记号(accession number)是P22963。

图10A和10B显示了嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶的核酸序列(SEQ IDNO：6)。编码麦芽四糖水解酶的嗜糖假单胞菌mta基因(EC登记号＝3.2.1.60)。GenBank登记号是X16732。

图11显示了施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。

图12显示了PStu-D34的序列(SEQ ID NO：8)；施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶的氨基酸序列，其带有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N取代。

图13显示了PStu-D20的序列(SEQ ID NO：9)；施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶的氨基酸序列，其带有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N和G121D。

图14显示了PStu-D14的序列(SEQ ID NO：10)；施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶的氨基酸序列，其带有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、G121D和G87S。

图15显示了施氏假单胞菌(Pseudomonas perfectomarina)的序列(SEQ IDNO：11)。葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶前体(EC 3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(麦芽四糖形成淀粉酶)(外切麦芽四糖水解酶)(麦芽四糖形成外切淀粉酶)。

SWISS-PROT登记号P13507。

图16显示了施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶核酸序列的序列。施氏假单胞菌麦芽四糖形成淀粉酶(amyP)基因的全长编码序列(complete cds.)GenBank登记号M24516(SEQ ID NO：12)。

具体实施方式

如无其它指明，本发明的实践将采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术，这些都包含在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术在文献中得到阐述。参见，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等(1995和定期增刊；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，和16，John Wiley &Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，DNA Isolation andSequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；J.M.Polak和James O′D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford UniversityPress；M.J.Gait(编者)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNAStructure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods inEnzymology，Academic Press；Using Antibodies：A Laboratory Manual：PortableProtocol NO.I，作者是Edward Harlow，David Lane，Ed Harlow (1999，ColdSpring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies ：ALaboratory Manual，作者是Ed Harlow(Editor)，David Lane(Editor)(1988，ColdSpring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-314-2)，1855，Lars-Inge Larsson″Immunocytochernistry：Theory and Practice″，CRC Press inc.，Baca Raton，Florida，1988，ISBN 0-8493-6078-1，John D.Pound(ed)；″ImmunochemicalProtocols，vol 80″，来自系列：″Methods in Molecular Biology″，Humana Press，Totowa，New Jersey，1998，ISBN 0-89603-493-3，Handbook of Drug Screening，由Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes编辑(2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN 0-8247-0562-9)；和Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use at the Bench，Jane Roskams和Linda Rodgers，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3。这些普通文献中的每一个在此并入，作为参考。

如本文所应用，“PS4”是指有关嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶或施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶的家族成员，或与嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶或施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶具有序列同源性或功能上同源性的家族成员，嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶如具有SEQ ID NO：1或SEQID NO：5列出的氨基酸序列的外切淀粉酶，施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶如具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11列出的氨基酸序列的多肽。其它的家族成员在表1中列出。

对来源于嗜糖假单胞菌外切淀粉酶的PS4变异体的位置编号是参照SEQID NO：1：

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APNDWYNILR QQASTIAADG FSAIWMPVPW

61 RDFSSWTDGG KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR

121 GYPDKEINLP AGQGFWRNDC ADPGNYPNDC DDGDRFIGGE SDLNTGHPQI YGMFRDELAN

181 LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKGPSEYPSW DWRNTASWQQ

241 IIKDWSDRAK CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHHWAL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWSHMYDWG YGDFIRQLIQ VRRTAGVRAD

361 SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LANPGQVASG SFSEAVNASN GQYRVWRSGS

421 GDGGGNDGGE GGLVNVNFRC DNGVTQMGDS VYAVGNVSQL GNWSPASAVR LTDTSSYPTW

481 KGSIALPDGQ NVEWKCLIRN EADATLVRQW QSGGNNQVQA AAGASTSGSF

参照序列来自嗜糖假单胞菌序列，其SWISS-PROT登记号是P22963，但是没有信号序列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA。

尽管是用特定的序列作为基本参照点，但该编号系统也可以适用于所有相关的同源序列。例如，该位置编号可以被用于来自其它假单胞菌种的同源序列，或来自其它细菌的同源序列。优选地，这种同源序列有60％或更多的同源性，例如70％或更多、80％或更多、90％或更多或95％或更多的同源性，这是相对于参照序列SEQ ID NO：1而言的。可以用本文描述的公知的联配程序和杂交技术确认蛋白之间的序列同源性。

对来源于施氏假单胞菌的PS4变异体的位置进行的编号是参照SEQ IDNO：7：

1 DQAGKSPNAV RYHGGDEIIL QGFHWNVVRE APNDWYNILR QQAATIAADG FSAIWMPVPW

61 RDFSSWSDGS KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAS ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR

121 GYPDKEINLP AGQGFWRNDC ADPGNYPNDC DDGDRFIGGD ADLNTGHPQV YGMFRDEFTN

181 LRSQYGAGGF RFDFVRGYAP ERVNSWMTDS ADNSFCVGEL WKGPSEYPNW DWRNTASWQQ

241 IIKDWSDRAK CPVFDFALKE RMQNGSIADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHHWAL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWSHMYDWG YGDFIRQLIQ VRRAAGVRAD

361 SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLVVALNSD LGNPGQVASG SFSEAVNASN GQVRVWRSGT

421 GSGGGEPGAL VSVSFRCDNG ATQMGDSVYA VGNVSQLGNW SPAAALRLTD TSGYPTWKGS

481 IALPAGONEE WKCLIRNEAN ATQVRQWQGG ANNSLTPSEG ATTVGRL

如本文所应用，“PS4变异核酸”(PS4variant nucleic acids)是指编码PS4多肽的核酸，所述多肽是PS4家族成员的变异体。

如本文所应用，“PS4变异多肽”(PS4variant polypeptides)或“PS4变异体”(PS4variant)是指多肽，所述多肽是PS4家族成员的变异体。

如本文所应用，“亲代酶”(parent enzymes)、“亲代序列”(parent sequence)、“亲代多肽”(parent polypeptide)、“亲代多肽”(parent polypeptides)是指酶和多肽，PS4变异多肽是基于所述的酶和多肽。亲代酶可以是前体酶(即，实际上被突变的酶)或其可以被从头制备。亲代酶可以是野生型的酶。

如此处所应用，“变异体”(variant)意味着衍生自亲代分子的分子。变异体将包括多肽以及核酸。其中，变异体将包括在一个或多个位点处的取代、插入、颠换和倒位。变异体也将包括截短。变异体将包括亲代分子的同源衍生物和功能衍生物。变异体还包括这样的序列，其与能够杂交于本文列出的核苷酸序列的序列互补。例如，变异体序列互补于这样的序列，所述序列能够在严紧条件下(例如50℃和0.2x SSC{1x SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})和本文出现的核苷酸序列杂交。更优选地，术语变异体包括互补于下述序列的序列，其能够在高度严紧的条件下(例如，65℃和0.1x SSC{1x SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})和本文出现的核苷酸序列杂交。

如本文所应用，“前体”(precursor)是指用于产生修饰的酶的酶。前体可以是通过突变被修饰的酶。同样地，前体可以是野生型的酶、变异的野生型酶或已经突变的酶。

如本文所应用，亲代酶的“功能上的等价物”(functional equivalent)是指，和亲代分子有相似或相同功能的分子。亲代分子可以是嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶或施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶或从其它来源得到的多肽。功能上等价的酶可以有不同的氨基酸序列但具有非产麦芽外切淀粉酶活性。本文描述了确定功能的分析的实例，这对本领域的技术人员是已知的。

如本文所应用，“分离的”(isolated)是指，序列至少基本上游离于至少一种其它组分，所述组分是与所述序列天然联系的并在天然中发现的。

如本文所应用，“纯化的”(purified)是指，序列处于相对纯的状态——例如，至少大约90％纯度，或至少大约95％纯度或至少大约98％纯度。

如本文所应用，“淀粉酶”(amylase)是指这样的酶，其尤其能够催化淀粉的降解。淀粉酶是水解酶，其切割淀粉中的α-D-(1→4)O-糖苷键。通常地，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1，α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为，以随机方式切割淀粉分子中的α-D-(1→4)O-糖苷键的内作用酶(endo-acting enzymes)。与之对照，外作用淀粉分解酶(exo-acting amylolytic enzymes)如β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2，α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如产麦芽α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)，从底物的非还原末端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.20，α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3，α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)，和产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的麦芽寡糖。

如本文所应用，“非产麦芽外切淀粉酶”(non-maltogenic exoamylaseenzyme)是指这样的酶，其起初并不降解淀粉为实质量的麦芽糖。用于实施这种确认的分析方法提供于本文。

如本文所应用，“线性的麦芽寡糖”(linear malto-oligosaccharide)是指，由α-(1→4)键连接的2-20个单位的α-D-吡喃型葡萄糖。

如本文所应用，“热稳定的”(thermostable)涉及酶暴露于升高的温度之后保持活性的能力。酶如非产麦芽外切淀粉酶的热稳定性是通过其半衰期来测定的。半衰期(t_1/2)是以分钟表示的时间，在此时间期间内，在限定的条件下，酶活性的一半丧失。半衰期值是通过测定残留的淀粉酶活性而计算的。半衰期分析如实施例中更详细的描述而进行。

如本文所应用，“pH稳定的”(pH stable)是指酶在宽范围的pHs下保持活性的能力。pH分析如实施例所描述而进行。

如本文所应用，“外切特异性的”(exo-specific)涉及改进的，例如，增加的“外切特异性指数”(exo-specificity index)，如与未取代的外切淀粉酶的外切特异性比率相比较时。

如本文所应用，“外切特异性指数”(exo-specificity index)是指总淀粉酶活性与总内切淀粉酶活性的比率。测定淀粉酶和内切淀粉酶活性的分析方法提供于本文。

如本文所应用，“食物”将包括制备好的食物以及食物的成分，如面粉。

如本文所应用，“食物成分”(food ingredient)将包括配方(制剂)，其可以是功能食品(functional foods)或食品原料(foodstuffs)或可以被加入功能食品或食品原料，并包括以低水平应用于宽范围产品中的配方，所述产品需要例如酸化或乳化。食物成分可以是溶液的形式或固体形式——这取决于用途和/或应用的方式和/或给予的方式。

如本文所应用，“功能食品”是指这样的食品，其不仅能够提供营养效果和/或味觉上的满足，也可以向消费者传递进一步的有益效果。

如本文所应用，“氨基酸序列”和术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”和术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”和术语“酶”同义。

如本文所应用，“类肽形式”(peptoid form)是指变异的氨基酸残基，其中α-碳取代基是在残基的氮原子上而不是在α-碳上。制备类肽衍生物形式的肽的方法在本领域中是已知的，例如，Simon RJ et al.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。

如本文所应用，“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其变异体，同源物，片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因组来源或合成来源或重组来源，其可以是双链或单链，不论代表正义链或反义链。如此处所应用，术语核苷酸序列包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地，它是指DNA，更优选地，是编码PS4变异多肽的cDNA序列。

如本文所应用，“淀粉”是指淀粉本身或其组分，特别是支链淀粉。术语“淀粉介质”(starch medium)是指包括淀粉的任何合适的介质。术语“淀粉产物”(starch product)是指包含淀粉或基于淀粉或来自淀粉的任何产物。优选地，淀粉产物包含或基于或来自从小麦粉得到的淀粉。

如本文所应用，“面粉”是指小麦或其它谷物的细磨粉末(finely-groundmeal)。例如，面粉可以从小麦本身而不是从其它谷物得到。小麦粉一般指小麦粉本身以及存在于介质如面团中的小麦粉。

如本文所应用，“烘焙的含淀粉的面包产品”(baked farinaceous breadproduct)是指基于面团的任何烘焙产品，所述面团可以在形成面团的条件下，通过混合面粉、水和发酵剂得到。可以向面团混合物中加入其它的成分。

如本文所应用，“同源物”(homologue)和“同源”(homology)是指这样的实体，它和目标氨基酸序列(subject amino acid sequence)和目标核苷酸序列有一定程度的同一性(identity)。同源序列被认为包括与目标序列有至少75％、80％、85％或90％同一性的氨基酸序列，优选地有至少95％、96％、97％、98％或99％是同一的。典型地，同源物将包括和目标氨基酸序列相同的活性位点。

如本文所应用，“杂交”将包括核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程以及如在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。PS4核酸可以作为单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链或RNA/DNA共聚物而存在。

如本文所应用，“共聚物”(copolymer)是指这样的单条核酸链，其包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。PS4核酸甚至可以是被密码子最优化以进一步增加表达。

如本文所应用，“合成的”是指通过体外化学合成或酶合成产生的物质。它包括但不限于由宿主生物体如甲基营养酵母毕赤酵母和汉逊酵母的最佳密码子使用而生成的PS4核酸。

如本文所应用，“转化的细胞”包括应用重组DNA技术被转化了的细胞。转化通常通过向细胞内插入一个或多个核苷酸序列而发生。插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列(即，该序列对于欲被转化的细胞不是天然的)。此外，或替代地，插入的核苷酸序列可以是同源核苷酸序列(即，该序列对于欲被转化的细胞是天然的)。由此细胞接受一个或多个额外的核苷酸序列拷贝，所述序列已存在于细胞内。

如本文所应用，“可操作地连接的”(operably linked)是指，所描述的组分处于一种关联中，所述关联允许它们以其所期望的方式起作用。可操作地连接于编码序列的调节序列以这样的方式被连接：在和该调控序列相容的条件下，编码序列的表达被实现。

如本文所应用，“生物学上有活性”(biologically active)是指这样的序列，它和天然发生的序列具有相似的结构功能(但是不一定是相同的程度)，和/或相似的调节功能(但是不一定是相同的程度)，和/或相似的生物化学功能(但是不一定是相同的程度)。

1.对本发明多肽的详述

在第一方面，本发明通提供了包括PS4变异体的多肽，PS4变异体来自亲代多肽。亲代酶可以优选地是非产麦芽外切淀粉酶，优选地是细菌非产麦芽外切淀粉酶。亲代酶可以优选地是显示出非产麦芽外切淀粉酶活性的多肽。

亲代酶可以是嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶，如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5列出的外切淀粉酶。亲代酶可以是施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶，如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11列出的多肽。PS4家族的其它成员可以被用作亲代酶，如下面的表1所列出。优选地，PS4家族成员将通常地和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11列出的外切淀粉酶相似、同源或功能上等价，并可以用标准方法鉴定，如用探针对合适的文库进行杂交筛选，或用基因组测序分析。鉴定方法如下列出。

表1.亲代序列(PS4家族成员)。所描述的序列在表中第一行显示的位置处，通过包含由列出的氨基酸残基构成的取代，而不同于嗜糖假单胞菌序列。例如，pS4cc-1-S161A是野生型假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶的变异体，并因此可以被用作亲代酶。而且，来自假单胞菌属(Pseudomonas spp)其它菌株如ATCC17686的非产麦芽外切淀粉酶，也可以被用作亲代多肽。PS4变异体多肽残基可以被插入这些亲代序列中的任意一个，以产生变异的PS4多肽序列。

PS4变异多肽通过包含许多突变而不同于亲代序列，所述突变包括氨基酸取代。在优选的实施方案中，亲代多肽是来自嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶的非产麦芽外切淀粉酶，其具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5列出的序列。在其它优选的实施方案中，亲代多肽包括来自施氏假单胞菌的非产麦芽外切淀粉酶，其具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11列出的序列。在一种优选的实施方案中，PS4变异体通过包含氨基酸取代而不同于亲代多肽，所述取代所处的位点包括选自下列的至少一个位置：4、9、13、33、34、42、70、71、87、99、100、108、113、121、131、134、135、141、153、157、158、160、161、166、170、171、178、179、184、188、198、199、221、223、238、270、277、290、307、315、334、335、342、343、372、392、398、399、405、415、425，其中对位置所作的编号是参照SEQ ID NO：1列出的嗜糖假单胞菌外切淀粉酶序列。优选地，所述位置选自下列的至少一个位置：33、34、87、121、134、141、157、178、179、223、307和334。在另一种实施方案中，变异体进一步包括选自下列位置的取代：71、108、158、171、188和343。在另一种实施方案中，变异体进一步包括选自位置113、198和290的取代。

优选地，PS4变异体包括至少一个取代，其选自：N33Y、D34N、G87S、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307L和S334P。优选地，PS4变异体包括下列取代：N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L和S334P，并带有至少一个另外的取代：L178F或A179T。优选地，PS4变异体包括下列取代之一：N33Y、D34N、I157L、L178F、A179T、G223A或H307L。优选地，PS4变异体包括下列取代之一：G87S、G134R、A141P或S334P。在另一种实施方案中，PS4变异体包括下列取代之一：K71R、K108R、G158D、Y171S、G188A和D343E。在另一种实施方案中，PS4变异体包括下列取代之一：V113I、Y198F、Y198W和V290I。

尽管不希望受限于理论，但发明人提出，与提出的底物模型结合位点相关的假单胞菌淀粉酶三维晶体结构(由从Chemical Computing Group，Inc.，Montreal Canada获得的Molecular Operating Environment[MOE]软件程序得出)提示，残基位点121、157、223和307将密切接近(close proximity)底物结合位点。由于如实施例所显示的数据证明，G121D既改善酶的稳定性又改善外切特异性，G223A改善酶的热稳定性，假定已经观察到改善，并且预期的位点接近底物结合位点，进一步的改善可以通过在每一这样的位点制造所有可能的氨基酸替代而获得。在一种实施方案中，密切接近是指，特定位点在底物结合位点的10.0埃之内。在另一种实施方案中，密切接近是指，特定位点在底物结合位点的7.5埃之内。在一种实施方案中，密切接近是指，特定位点在底物结合位点的6.0埃之内，例如，G121C-α至底物大约5.9埃；G223C-α至底物大约5.82埃。

在一种实施方案中，PS4变异体包括选自下列的组合：

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E和G121D；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y和G121D；G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E和N33Y；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F，A179T，G87S，G121D，S214N和T375A；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F，A179T，G121D，Y171S，G188A和N138D；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F，A179T和G121D；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F和A179T；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F，A179T和G188A；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，K71R，L178F和A179T；G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，L178F和A179T；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，N33Y， D34N，L178F和A179T；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，L178F，A179T，G87S和G121D；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，L178F，A179T和G121D；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，N33Y， D34N，K71R，L178F，A179T和G121D；

G87S G121D G134R，A141P I157L G223A H307L S334P K71R L178FA179T；

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P D343E N33Y D34N K71RL178F A179T G121D；和

G134R，A141P I157L G223A H307L S334P K71R L178F A179T G121D。

在另一种实施方案中，至少一种取代包括选自下列的组合：

A141P，I157L，G223A，H307L和S334P；

G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L和S334；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L和S334P；

G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T， G223A，H307L和S334P；

G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T， G223A，H307L和S334P；N33Y， D34N，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；

N33Y，D34N，G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；和

在另一种实施方案中，含有至少一个取代的外切淀粉酶包括选自下列的组合：

N33Y，D34N，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P；

G87S，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

113F，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

A99V， V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

V113I，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

A199V，D343E，V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L和S334P；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，S334P和D343E；

V113I，G121D，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；V113I，A141P，Y198F，G223A，V290I和H307L；

V113I，A141P，Y198F，G223A，V290I，S334P和D343E；

V113I，A141P，Y198F，G223A，A268P，V290I和S399P

V113I，A141P，Y198F，G223A，V290I和S399P；

V113I，A141P，Y198W，G223A和V290I；

V113I，A141P，Y198F，G223A和V290I；

Y198F，G223A和V290I；

Y198W，G223A和V290I；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A和V290I；

V113M；

V113A；

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，I315V，S334P和D343E；

D34N，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，G188S，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

K71R，V113I，G134R，A141P，I157L，L178L，Y198F，G223A，V290I，H307L， G313G，S334P和D343E；

D34N，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，G313G，S334P和D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，A179V，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，I170I，Y198F，G223A，V290I，H307L，G313G，S334P和D343E

V113I，G134R，A141P，I157L，A179V，Y198F，G223A，V290I，H307L，G313G，S334P和D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E和A405E；

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E和A405V；

A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198L，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

K71R，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

K108R，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

D34G，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

G4D，V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P和D343E；

A141P，G134R，G223A，H307L，I157L，V113I，V290I，Y198F和G188A；

在优选的实施方案中，PS4变异体是包括SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

PS4变异体多肽可以包括除上面列出的那些突变之外的一个或多个突变。也可以包括在一个或多个其它位置的其它突变如删除、插入、取代、颠换、转换和倒转(inversions)。同样地，多肽可以缺少至少一个上面列出的取代。

PS4变异体也可以包括保守性置换，其可以是类似物-对-类似物的取代(例如，碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等)。非保守性置换也可以发生，即，从一类残基变为另一类，或者替代地，涉及含有非天然的氨基酸如鸟氨酸(此后称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(此后称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(norleucine ornithine)(此后称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。

序列也可以有氨基酸的删除、插入或取代，其导致沉默改变(silentchange)并导致功能上的等价物质。有意的氨基酸取代可以基于氨基酸性质的相似性而制造(如残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或兼性性质)，因而以功能基团将氨基酸分组是有用的。可以仅根据氨基酸侧链的性质将氨基酸分组。然而，当同时纳入突变数据时，是更加有用的。这样产生的氨基酸集合由于结构原因可能是保守的。这些集合可以用温氏图(Venndiagram)的形式来描述(Livingstone C.D.和Barton G. J.(1993)″Proteinsequence alignments：a strategy for the hierarchical analysis of residueconservation″Comput.Appl Biosci.9：745-756)(Taylor W.R.(1986)″Theclassification of amino acid conservation″J. Theo：Biol.119；205-218)。保守性置换可以例如，根据下面的表来制造，下面的表描述了普遍被接受的氨基酸分类温氏图。

除氨基酸间隔物(spacers)如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，变异的氨基酸序列也可以包括在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，包括烷基如甲基、乙基或丙基。变异的其它形式涉及类肽衍生物形式的一个或多个氨基酸残基的存在。

PS4变异体也可以包括同源序列。同源序列包括这样的核苷酸序列，它和编码PS4变异体的核苷酸序列至少75％、80％、85％或90％是相同的，优选地至少95％、96％、97％、98％或99％是相同的。通常，同源物将包含编码与目标序列的活性位点相同的序列。

同源性比较可以通过目测来进行，或更通常地，在容易得到的序列比对程序的协助下进行。这些商业上可以利用的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同源性百分数(％同源)。同源性百分数可以在连续序列的范围内计算，即，一个序列和另一序列联配，在一个序列中的每一氨基酸和另一序列中的相应氨基酸按每一次一个残基来直接进行比较。这被称为“无空位的”(ungapped)联配。典型地，这样的无空位的联配仅在相对短的残基数的范围中进行。

尽管这是非常简单和可靠的方法，但它没有考虑到，例如，在原本相同的序列对中，一个插入或一个删除将导致其后的氨基酸残基伸出联配之外，因此很可能导致进行全面联配时，同源性百分数大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计为，可以形成最佳的联配，所述联配考虑了可能的插入或删除而不过度罚掉总同源性分数。这是通过在序列联配中插入“空位”以试图最大化局部同源性而获得的。

然而，这些更为复杂的方法为联配中出现的每一空位设定了“空位罚分”，因而，对于相同数目的相同氨基酸，带有尽可能少的空位的序列联配——反映了两个比较序列之间的更高的相关性——将得到比带有许多空位的序列联配更高的分数。“仿射空位成本(Affine gap costs)”通常被应用，其对空位的延伸记入相对高的成本(cost)，对空位中的每一后续残基记入较小的罚分。这是最普遍应用的空位记分系统。高的空位罚分将必然地产生带有较少空位的最优化联配。大多数联配程序允许修改空位罚分。然而，当应用这样的软件进行序列比对时，优选地应用缺省值。例如，当应用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的缺省空位罚分是每一空位-12，每一延伸-14。

因此，计算最大同源性百分数首先需要考虑空位罚分，生成最佳的联配。进行这种联配的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux et al 1984 Nuc.Acids Research 12p387)。可以进行序列比对的其它软件的例子包括但不限于，BLAST软件包(参见Ausubel et al.，1999 ShortProtocols in Molecular Biology，4th Ed-Chapter 18)，FASTA(Altschul et al.，1990J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比对工具组。BLAST和FASTA可以用于离线和在线检索(参见Ausubel et al.，1999，Short Protocols in MolecularBiology，第7-58至7-60页)。然而，对于一些用途，优选使用GCG Bestfit程序。BLAST 2 Sequences也可以用于比对蛋白序列和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatianancbi.nlm.nih.gov)。

尽管最终的同源性百分数可以以同一性来量度，联配过程本身通常地不以全有或全无的(all-or-nothing)配对比较为基础。替代地，通常应用尺度式相似性记分矩阵(scaled similarity score matrix)，其根据化学相似性或进化距离对每一两两比较设定分数。通常应用的这种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵——BLAST程序组的的缺省矩阵。如果被提供，GCG Wisconsin程序通常应用公共缺省值或自定义符号比较表(custom symbol comparison table)(关于进一步的细节，参见使用指南)。对于一些用途，GCG软件包优选应用公共缺省值，或在其它软件情况下，优选应用缺省矩阵，如BLOSUM62。

替代地，可以用DNASIS^TM(Hitachi Software)中的多重联配特征(multiplealignment feature)计算同源性百分数，这基于运算法则，其类似于CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)。

一旦软件生成了最佳联配，可能计算同源性百分数，优选地是序列同一性的百分数。软件通常将此作为序列比对的一部分来进行，并生成数字结果。

优选的实施方案也包括功能上的等价物。本文中描述的PS4变异多肽来源于这样的多肽，或是这样的多肽的变异体，所述多肽优选地显示出非产麦芽外切淀粉酶活性。优选地，这些亲代酶本身是非产麦芽外切淀粉酶。优选实施方案中的PS4变异多肽也显示出非产麦芽外切淀粉酶活性。

本文描述的PS4变异体将优选地具有外切特异性，例如，如上所述，由外切特异性指数所量度的，这和它们是外切淀粉酶相一致。而且，与亲代酶或它们的起源多肽相比较，它们优选地具有更高的或增加的外切特异性。因此，例如，优选地在相同条件下，当与其亲代多肽相比较时，PS4变异多肽可以具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高的外切特异性指数。优选地在相同的条件下，当与其亲代多肽相比较时，它们可以有1.5x或更高、2x或更高、5x或更高、10x或更高、50x或更高、100x或更高的外切特异性。

在优选的实施方案中，功能上的等价物将和PS4家族的至少一个成员有序列同源性。功能上的等价物将和上面提及的嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶中的任一个具有序列同源性，优选地，和两者都具有序列同源性。功能上的等价物也可以和SEQ ID NOs：1至12中列出的任意序列，优选地和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7或两者具有序列同源性。这些序列之间的序列同源性优选地至少是60％、优选地是65％或更多、优选地是75％或更多、优选地是80％或更多、优选地是85％或更多、优选地是90％或更多、优选地是95％或更多。

在其它实施方案中，功能上的等价物将能够特异地和上面列出的任意序列杂交。确定一个序列是否能够和另一序列杂交的方法是本领域中已知的，例如，描述于Sambrook et al(上述)和Ausubel，F.M.et al.(上述)中。在高度优选的实施方案中，功能上的等价物将能够在严紧的条件下杂交，例如，在65℃和0.1x SSC时{1x SSC＝0.15MNaCl，0.015M柠檬酸三钠pH 7.0}。

可以从合适的来源制备/分离氨基酸序列，或可以通过合成方法来制备或可以通过应用重组DNA技术制备氨基酸序列。几种方法描述于下。

2.对本发明核酸的详述

在第二方面，本发明提供了核酸，该核酸编码包括PS4变异体的多肽，所述多肽可来源于亲代多肽，如上所述。

本领域的技术人员将意识到核酸序列和多肽序列之间的关系，具体来说，是遗传密码和此密码简并性之间的关系，并且能够容易地构建出这样的PS4核酸。例如，本领域的技术人员将意识到，对于PS4变异多肽序列中的每一氨基酸取代，可以有一个或多个密码子，所述密码子编码该取代的氨基酸。因此，显而易见的是，根据有关具体氨基酸残基的密码子简并性，对应于PS4变异多肽序列可以生成一个或多个PS4核酸序列。因此，例如，PS4变异核酸序列可以来源于编码多肽的亲代序列，其中PS4变异核酸编码下列位点的氨基酸取代：G134、A141、I157、G223、H307、S334、N33和D34，同时带有L178和A179的取代中的一个或两个。

氨基酸序列和核酸序列的突变可以用许多技术形成，如本领域所知的那些。在特别优选的实施方案中，应用合适的引物，通过PCR方法(聚合酶链式反应)将突变导入亲代序列，如实施例所说明。

可以在氨基酸水平或核酸水平修饰亲代酶，生成本文描述的PS4变异体序列。因此，本发明的本方面的优选实施方案提供了产生PS4变异多肽，这是通过在编码非产麦芽外切淀粉酶多肽的核苷酸序列处导入一个或多个相应的密码子变化来实施的。

将被理解的是，上面的密码子变化可以在任意PS4家族核酸序列中进行。例如，可以对嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶核酸序列进行序列变化(例如，X16732，SEQ ID NO：6或M24516，SEQ ID NO：12)。

亲代酶可以包括“完全的”酶，即，以其全长存在，如在天然中发生的(或有突变的)，或可以包括其截短形式。因而，来源于此的PS4变异体可以是被截短的或是“全长的”。截短可以在N末端或C末端。亲代酶或PS4变异体可以缺乏一个或多个部分(portions)，如子序列、信号序列、结构域或部分(moieties)，不论它们有无活性。例如，如上所述，亲代酶或PS4变异多肽可以缺乏信号序列。替代地，或附加地，亲代酶或PS4变异体可以缺乏一个或多个催化结构域或结合结构域。

在高度优选的实施方案中，亲代酶或PS4变异体可以缺乏存在于非产麦芽外切淀粉酶中的一个或多个结构域，如淀粉结合结构域。例如，PS4多肽可以仅具有达位点429的序列，这是相对于SEQ ID NO：1中列出的嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶的编号而言的。例如，PS4变异体pSac-d34、pSac-D20、pSac-D14或实施例中描述的其它变异体是其中的例子。

典型地，PS4变异核苷酸序列是应用重组DNA技术制备的。然而，在一种替代的实施方案中，可以用本领域中已知的化学方法，以整体或部分，合成核苷酸序列(参见Caruthers MH et al.，(1980)NucAcids Res Symp Ser215-23和Horn T et al.，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。

可以从产生所述酶的任何细胞或生物体中鉴定和/或分离和/或纯化出编码酶的核苷酸序列，所述酶或是具有本文所定义的特殊性质的酶，或是适于修饰的酶如亲代酶。在本领域中，用于鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的各种方法是已知的。作为举例，一旦鉴定和/或分离和/或纯化出合适的序列，可以应用制备更多这样的序列的PCR扩增技术。

作为进一步的举例，应用来自产生该酶的生物体的染色体DNA或信使RNA，构建基因组DNA文库和/或cDNA文库。如果酶的氨基酸序列或酶氨基酸序列的一部分是已知的，可以合成标记的寡核苷酸探针并用其从生物体制备的基因组文库鉴定出编码酶的克隆。替代地，可以用标记的寡核苷酸探针鉴定编码酶的克隆，所述探针包含与另一已知酶基因同源的序列。在后一情况下，应用较低严紧性的杂交和洗涤条件。

替代地，通过下列步骤鉴定编码酶的克隆：将基因组DNA片段插入表达载体如质粒，用得到的基因组DNA文库转化酶阴性的细菌，然后将转化了的细菌铺板在琼脂平板上，所述平板含有酶的底物(例如，麦芽糖)，从而使表达酶的克隆被鉴定出来。

在更进一步的选择方案中，可以通过已确立的标准方法合成制备编码酶的核苷酸序列，例如，Beucage S.L. et al.(1981)Tetrahedron Letters 22，p1859-1869描述的phosphoroamidite方法，或Matthes et al.，(1984)EMBO J. 3，p 801-805描述的方法。在phosphoroamidite方法中，寡核苷酸被合成、纯化、退火、连接并克隆入合适的载体中，合成是例如，在自动DNA合成仪上进行的。

核苷酸序列可以是混合的基因组来源和合成来源，混合的合成来源和cDNA来源或混合的基因组来源和cDNA来源，根据标准技术，通过连接合成的、基因组或cDNA来源的片段而制备。每一被连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。也可以用特定的引物，用聚合酶链式反应(PCR)制备DNA序列，例如US 4,683,202或Saiki R K et al.，(Science(1988)239，pp487-491)所描述。

本文描述的核苷酸序列，和适用于本文描述的方法和组合物的核苷酸序列可以包含合成或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域中已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3′和/或5′末端加入吖啶或聚赖氨酸链。对于本文的目的，应该理解，可以用本领域中的任何可利用的方法修饰此处描述的核苷酸序列。为了增强核苷酸的体内活性或寿命，可以进行这种修饰。

本发明的一种优选实施方案提供了核苷酸序列和核苷酸序列的用途，所述核苷酸序列互补于此处提出的序列，或是其任何衍生物、片段或衍生物。如果序列互补于其片段，则该序列可以被用作探针以鉴定其它生物体中的相似的编码序列。

可以用许多方法得到与PS4变异体序列不是100％同源的多核苷酸。可以得到此处描述的序列的其它变异体，例如，通过用探针杂交从一系列个体——例如从不同群体的个体——制备的DNA文库而得到。此外，可以得到其它同源物，这样的同源物及其片段通常将能够选择性地和本文的序列表中显示的序列杂交。可以通过用探针杂交cDNA文库或基因组DNA文库得到这样的序列，所述文库是从其它物种制备的，在中度至高度严紧的条件下，用包含所附序列表中的任一序列的全部或部分序列的探针杂交这样的文库。相似的考虑可以用来获得本文描述的多肽或核苷酸序列的种同源物(specieshomologues)和等位基因变异体(allelic variants)。

也可以用简并PCR得到变异体和株/种同源物，简并PCR应用的引物被设计成靶向变异体和同源物内的序列，所述序列编码保守的氨基酸序列。用于简并PCR的引物将包含一个或多个简并位点，并且，将用于严紧条件下，所述条件的严紧性低于用针于已知序列的单一序列引物来克隆序列时的条件的严紧性。保守序列可以被预期，例如，通过比对来自几个变异体/同源物的氨基酸序列。用本文描述的本领域中的已知计算机软件，可以进行序列联配。

替代地，可以通过对特征性序列进行定点诱变得到这样的多核苷酸。这可以用于例如，需要沉默密码子序列变化(silent codon sequence changes)来最优化特定宿主细胞的密码子偏好的情况，在所述宿主细胞中多核苷酸序列被表达。为了导入限制性内切酶识别位点或改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能，其它的序列变化可以被期望。

多核苷酸可以被用来生成引物和探针，或多核苷酸可以被克隆入载体，所述引物例如，PCR引物、用于选择性扩增反应的引物，所述探针例如，用放射性或非放射性标记通过传统方法进行标记的探针。这些引物、探针和其它片段的长度将是至少15，优选地至少20，例如至少25、30或40个核苷酸，它们也包括在术语多核苷酸内。

多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可以重组产生、合成产生或用本领域技术人员可得到的任何方法产生。通常地，引物将通过合成方法得到，包括每次一个核苷酸逐步地制备所需的核酸序列。用自动技术完成此合成的技术是本领域容易得到的。

更长的多核苷酸通常用重组方法产生，例如，用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。可以将引物设计为，含有合适的限制性酶识别位点，以便扩增的DNA可以被克隆入合适的克隆载体。优选地，变异序列至少和本文提供的序列同样具有生物学活性。

本发明的一个优选实施方案包括，互补于PS4变异体核酸序列的序列，或能够杂交于PS4变异体核苷酸序列(包括本文提供的序列的互补序列)的序列，以及互补于能够和PS4变异体核苷酸序列(包括本文提供的序列的互补序列)杂交的序列的核苷酸序列。优选的实施方案提供了这样的多核苷酸序列，其能够在中度至最大严紧的条件下，和本文提供的核苷酸序列杂交。

一种优选的实施方案包括这样的核苷酸序列，其能够在严紧条件下(例如，50℃和0.2x SSC)，和PS4变异体核酸的核苷酸序列或其互补物杂交。更优选地，在高度严紧的条件下(例如，65℃和0.1x SSC)，核苷酸序列可以和PS4变异体的核苷酸序列或其互补物杂交。

一旦编码酶的核苷酸序列被分离出来，或推定的编码酶的核苷酸序列被鉴定出来，则可以使该序列突变，从而制备出酶。因此，可以从亲代序列制备出PS4变异体序列。突变可以用合成的寡核苷酸导入。这些寡核苷酸含有在期望的突变位点侧翼的核苷酸序列。Morinaga et al.，(Biotechnology(1984)2，p646-649)中公开了一种合适的方法。Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)中描述了将突变导入编码酶的核苷酸序列的另一种方法。Sarkar和Sommer(Biotechniques(1990)，8，p404-407″The megaprimermethod of site directed mutagenesis″)中描述了其它的方法。

在一种优选的实施方案中，用于本文描述的方法和组合物的序列是重组序列，即，用重组DNA技术制备的序列。这种技术例如在文献中被说明，例如J.Sambrook，E.F.Frisch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。

3.对本发明组合物的详述

本发明的第三方面提供了包括多肽的组合物，所述多肽是具有非产麦芽外切淀粉酶活性的多肽的变异体，本发明也提供了这种变异多肽和组合物的用途，所述组合物包括多肽变异体和另一组分。

本发明的一种优选实施方案包括PS4变异多肽，任选地加之另外的成分或另外的酶或两者均加入。除了PS4变异多肽之外，可以加入一种或多种酶，例如，向食品、面团制备物、食品原料或淀粉组合物加入。可以加入面团的另外的酶包括氧化还原酶、水解酶，例如脂肪酶(诸如能够水解羧酸酯键以释放羧酸盐的脂肪酶(EC 3.1.1)或诸如三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)、半乳糖脂肪酶(EC 3.1.1.26)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)和脂蛋白脂肪酶A2(EC 3.1.1.34))和酯酶以及糖苷酶如α-淀粉酶、支链淀粉酶和木聚糖酶。可以应用氧化还原酶如麦芽糖氧化酶、葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)、糖氧化酶、甘油氧化酶、吡喃糖氧化酶、半乳糖氧化酶(EC 1.1.3.10)和己糖氧化酶(EC 1.1.3.5)来加强面团和控制烘焙产品的体积，并可以加入木聚糖酶和其它半纤维素酶改善面团操作性、面包屑软度和面包体积。脂肪酶用作面团强化剂和面包屑软化剂，α-淀粉酶和其它淀粉分解酶可以被加入面团以控制面包体积并进一步减低面包屑的坚硬性。可以应用的另外的酶可以选自纤维素酶、半纤维素酶、淀粉降解酶、蛋白酶、脂加氧酶。在一种优选的实施方案中，PS4变异多肽可以和淀粉酶组合，具体地，和产麦芽淀粉酶组合。产麦芽α-淀粉酶(葡聚糖1，4-a-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够水解直链淀粉和支链淀粉为α-构型的麦芽糖。

来自杆菌(EP 120693)的产麦芽α-淀粉酶是商业上可得到的(NovoNordiskA/S，Denmark)，由于其降低淀粉退化(retrogradation)的能力，它作为保鲜剂被广泛用于烘焙工业(参见，例如，WO 9I/04669)。产麦芽α-淀粉酶和环糊精淀粉葡聚糖转移酶(CGTases)共同拥有几种特性，包括序列同源性(Henrissat B，Bairoch A；Biochem.J.，316，695-696(1996))和形成转糖基作用产物(Christophersen，C.，et al.，1997，Starch，vol.50，No.1，39-45)。一种优选的实施方案包括含有PS4变异体多肽和α-淀粉酶或其任意变异体的组合。这种组合被用于食品生产如烘焙。美国专利6,162,628中公开的变异体、同源物和变异体的突变体，可以和本文描述的PS4变异体多肽组合应用，该专利的全部公开内容在此并入，作为参考。具体地，可以应用该文献所描述的任意多肽，特别是美国专利6,162,628的SEQ ID NO：1的变异体，变异位置是在对应于Q13、I16、D17、N26、N28、P29、A30、S32、Y33、G34、L35、K40、M45、P73、V74、D76N77、D79、N86、R95、N99、I100、H103、Q119、N120、N131、S141、T142、A148、N152、A163、H169、N171、G172、I174、N176、N187、F188、A192、Q201、N203、H220、N234、G236、Q247、K249、D261、N266、L268、R272、N275、N276、V279、N280、V281、D285、N287、F297、Q299、N305、K316、N320、L321、N327、A341、N342、A348、Q365、N371、N375、M378、G397、A381、F389、N401、A403、K425、N436、S442、N454、N468、N474、S479、A483、A486、V487、S493、T494、S495、A496、S497、A498、Q500、N507、I510、N513、K520、Q526、A555、A564、S573、N575、Q581、S583、F586、K589、N595、G618、N621、Q624、A629、F636、K645、N664和/或T681的任何一个或多个位点。

另外的酶可以和任何面团组分共同加入，所述面团组分包括面粉、水或任选的其它组分或添加剂或面团改良组合物。可以在面粉、水或任选的其它组分或添加剂或面团改良组合物之前或之后加入另外的酶。另外的酶可以是液体制备物，或干燥组合物的形式。

在面团状态下，面团改良组合物的一些酶能够彼此相互作用，达到一种程度，其中对面粉面团的流变学和/或机械力(machineability)性质和/或通过酶由面团制备的产品的质量的改善效应不仅仅是附加的，而且该效应是协同的。由面团制成的产品(成品)被改善，与之相关的是，发现上述联合对面包屑结构也产生了实质上的协同效应。同时，就烘焙产品的比体积而言，也可以发现协同效应。

4.载体、细胞和表达PS4多肽的方法

第四方面提供了包括PS4变异多肽的载体、包含PS4变异多肽的细胞和表达PS4变异多肽的方法。

用于本文描述的方法和组合物的核苷酸序列可以被整合入重组的可复制载体。载体可以被用来在相容的宿主细胞中和/或从相容的宿主细胞，复制和以酶的形式表达核苷酸序列。可以用调控序列如调节序列来调控表达。根据序列和/或应用的载体，通过表达核苷酸序列而由宿主重组细胞产生的酶可以被分泌或包含在细胞内。编码序列可以被设计为带有信号序列，信号序列指导序列编码物分泌穿过特定的原核或真核细胞膜。

多核苷酸可以被整合入重组的可复制载体。载体可以被用于在相容的宿主细胞中复制核酸。包含多核苷酸序列的载体可以被转化入合适的宿主细胞。合适的宿主细胞可以包括细菌、酵母、昆虫和真菌细胞。

可以通过将多核苷酸导入可复制载体，将载体导入相容性宿主细胞，并使宿主细胞在载体可复制的条件下生长，表达PS4变异多肽和多核苷酸。载体可以从宿主细胞回收。

PS4核酸可以被可操作地连接于在感兴趣的宿主细胞中有活性的转录调节元件和翻译调节元件。PS4核酸也可以编码融合蛋白，融合蛋白包括信号序列如，例如，来自Schwanniornyces occidentalis的葡糖淀粉酶基因，来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子接合型基因(α-factor matingtype gene)和来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的TAKA-淀粉酶的信号序列。替代地，PS4核酸可以编码融合蛋白，融合蛋白包含膜结合结构域。

用表达载体，可以按期望的水平在宿主生物体内表达PS4变异体。包含PS4核酸的表达载体可以是，能够在选出的宿主生物体内表达编码PS4核酸的基因的任何载体，载体的选择取决于欲被导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制的载体，即，以附加型实体(episomal entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，如，例如，质粒、噬菌体或附加体元件、微型染色体或人工染色体。替代地，载体可以是这样的载体，当其被导入细胞时，其整合入宿主基因组并和染色体一同复制。

表达载体通常包括克隆载体的组件如，例如，允许载体在选出的宿主生物体中自主复制的元件，和一种或多种用于筛选目的的表型上可检测的标记。表达载体通常包括调控核苷酸序列，所述序列编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地，阻遏基因或一个或多个激活基因(activatorgenes)。另外，表达载体可以包括编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列能够将PS4变异体靶向至宿主细胞的细胞器如过氧化物酶体，或靶向至特定的宿主细胞区室。这样的靶向序列包括但不限于序列SKL。为了在调控序列的指导下进行表达，PS4变异体的核酸序列以适于表达的合适方式被可操作地连接于调控序列。

优选地，载体中的多核苷酸被可操作地连接于调控序列，调控序列能够使宿主细胞表达编码序列，即，载体是表达载体。调控序列可以被修饰，例如通过加入另外的转录调节元件来修饰，使调控序列所指导的转录水平对转录调节物更加具有反应性。调控序列可以特别地包括启动子。

在载体中，编码变异的PS4多肽的核酸序列可操作地和合适的启动子序列联合。启动子可以是任何DNA序列，其在选出的宿主生物体内具有转录活性，并且可以从和宿主生物体同源或异源的基因中得到。用于指导修饰的核苷酸序列转录——例如指导PS4核酸在细菌宿主中转录——的合适的启动子的例子包括，大肠杆菌(E.coli)lac操纵子的启动子、蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)的aprE启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽淀粉酶基因(amyM)启动子、液化淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因的启动子和来自乳球菌属某种(Lactococcus sp.)衍生启动子的启动子，包括P170启动子。当编码PS4变异体多肽的基因在细菌如大肠杆菌中表达时，可以从例如噬菌体启动子选择合适的启动子，噬菌体启动子包括T7启动子和噬菌体λ启动子。对于在真菌中的转录，有用启动子的例子是那些来自编码下列的基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶。用于在酵母中的表达的合适的启动子的例子包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal1和Gal10启动子，和PichiapastorsAOX1或AOX2启动子。

合适的细菌宿主生物体的例子是，革兰氏阳性菌如芽孢杆菌(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，链霉菌属(Streptomyces)的菌种如Streptomyces murinus，乳酸菌种包括乳球菌(Lactococcus spp.)如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)包括罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，明串珠菌属(Leuconostoc spp.)，片球菌属(Pediococcusspp.)和链球菌属(Streptococcus spp.)。替代地，属于包括大肠杆菌在内的肠杆菌属(Enterobacteriaceae)或属于假单胞菌属(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性菌种的菌株可以被选作宿主生物体。合适的酵母宿主生物体可以选自生物技术上相关的酵母菌种，例如但不限于酵母菌种如毕赤酵母(Pichia sp.)、汉逊酵母(Hansenula sp)或克鲁维酵母(Kluyveromyces)、Yarrowinia菌种或酵母菌(Saccharomyces)种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或属于Schizosaccharomyce的种例如，裂殖酵母(S.Pompe)菌种。优选地，甲基营养酵母种巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)的菌株被用作宿主生物体。优选地，宿主生物体是汉森酵母(Hansenula)菌种。在丝状真菌中合适的宿主生物体包括曲霉菌(Aspergillus)种，例如，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、Aspergillus tubigensis、Aspergillus awamori或Aspergillus nidulans。替代地，镰刀霉(Fusarium)种的菌株例如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)或根毛霉(Rhizomuco)种的菌株例如米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)可以被用作宿主生物体。其它合适的菌株包括高温菌(Thermomyces)和毛霉菌(Mucor)菌种。

包含多核苷酸的宿主细胞可以被用于表达多肽，例如变异的PS4多肽、其片段、同源物、变异体或衍生物。可以在允许蛋白表达的合适条件下培养宿主细胞。多肽的表达可以是组成型的，这样它们被持续产生，或是诱导型的，这需要刺激以起始表达。在诱导型表达的情况下，可以在需要时起始蛋白表达，这是通过例如，向培养基中加入诱导物质，例如地塞米松或IPTG实施的。用本领域已知的各种技术将多肽从宿主细胞中提取出来，包括酶学的、化学的和/或渗透压裂解和物理破解。多肽也可以在体外无细胞系统中重组产生，如TnN^TM(Promega)兔网织红细胞系统。

5.用途

如果上下文没有其它指明，在下面的描述和实施例中，PS4变异体多肽的剂量是以在面粉中的百万比率(每克中的微克数)给出的。例如，如表2中使用的“1D34”是指，1百万分之一的pSac-D34。

本文描述的PS4取代突变体可以被用于亲代酶适用的各种用途。具体地，它们可以被用于应用外切麦芽四糖水解酶的任何用途。在高度优选的实施方案中，它们具有额外的优势：更高热稳定性、或更高外切淀粉酶活性或更高pH稳定性或任何组合。PS4变异多肽和核酸的合适用途的例子包括食品生产，特别是烘焙，以及食品原料生产；进一步的实施例详细描述于下。

下述系统被用于表征具有非产麦芽外切淀粉酶活性的多肽，所述多肽适于按照本文描述的方法和组合物被应用。此系统可以，例如被用于表征本文描述的PS4亲代或变异多肽。

作为初步的背景信息，蜡质玉米支链淀粉(waxy maize amylopectin)(WAXILYS 200，从Roquette，France得到)是具有高支链淀粉含量(高于90％)的淀粉。将20mg/ml的蜡质玉米淀粉在pH 6.0的50mM MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，2mM氯化钙缓冲液中煮沸3分钟，随后在50℃温育并在半小时内应用。

一个单位的非产麦芽外切淀粉酶被定义为：在50℃，在试管中与4ml10mg/ml蜡质玉米淀粉温育时，释放相当于每分钟1μmol还原糖的水解产物的酶量，蜡质玉米淀粉如上所制备溶于pH 6.0的50mM MES、2mM氯化钙中。还原糖是用麦芽糖作为标准并用Bernfeld，Methods Enzymol.，(1954)，1，149-158的二硝基水杨酸法或本领域已知的用于定量还原糖的其它方法测定的。

非产麦芽外切淀粉酶的水解产物情况是如下测定的：在50℃，在试管中，温育0.7单位的非产麦芽外切淀粉酶和4ml 10mg/ml蜡质玉米淀粉15或300分钟，蜡质玉米淀粉如上述制备溶于缓冲液中。将试管在沸腾的水浴中浸没3分钟，以终止反应。

用阴离子交换HPLC分析和定量水解产物，用Dionex PA 100柱，用乙酸钠、氢氧化钠和水作为洗脱液，脉冲电流检测，以从葡萄糖到麦芽七糖的已知线性麦芽寡糖作为标准。用于麦芽八糖至麦芽十糖的响应因子(responsefactor)是麦芽七糖的响应因子。

优选地，PS4亲代多肽(和PS4变异多肽)具有非产麦芽外切淀粉酶活性，以致于如果0.7单位的所述非产麦芽外切淀粉酶在pH6.050℃下在4ml水溶液中温育15分钟时，则酶将产生水解产物，所述水溶液为每毫升缓冲液中有10mg预煮沸蜡质玉米淀粉，缓冲液含有50mM 2-(N-吗啉)乙磺酸和2mM氯化钙，所述水解产物由一个或多个线性麦芽寡糖组成，线性麦芽寡糖是从两个至十个D-吡喃葡萄糖基单位(D-glucopyranosyl units)，可任选地有葡萄糖；以致于由从两个至十个D-吡喃葡萄糖基单位以及可任选的葡萄糖组成的所述水解产物中的至少60％％、至少70％、至少80％和/或至少85％重量是由从三至十个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽寡糖组成，优选地由从四至八个D-吡喃葡萄糖基单位构成的线性麦芽寡糖组成。

为了便于参照，和针对本应用，在pH 6.050℃下在4ml水溶液中温育0.7单位的非产麦芽外切淀粉酶15分钟，可以被称为“蜡质玉米淀粉温育实验”(Waxy Maize Starch Incubation Test)，所述水溶液是每毫升缓冲液中含有10mg预煮沸蜡质玉米淀粉，缓冲液含有50mM 2-(N-吗啉)乙磺酸和2mM氯化钙。

因此，换一种表达，优选的非产麦芽外切淀粉酶被表征为，在蜡质玉米淀粉温育实验中有能力产生水解产物，所述产物由一个或多个线性麦芽寡糖组成，线性麦芽寡糖从两个至十个D-吡喃葡萄糖基单位，任选地是葡萄糖；以致于由从两个至十个D-吡喃葡萄糖基单位，任选地是葡萄糖组成的所述水解产物中的至少60％％、至少70％、至少80％和/或至少85％重量份是由从三至十个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽寡糖组成的，优选地由从四至八个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽寡糖组成。

蜡质玉米淀粉温育实验中的水解产物包括从两个至十个D-吡喃葡萄糖基单位的一种或多种线性麦芽寡糖，以及任选的葡萄糖。蜡质玉米淀粉温育实验中的水解产物也可以包括其它水解产物。而且，三个至十个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽寡糖的重量百分数是以这样的水解产物的量为基础的，所述水解产物由两个至十个D-吡喃葡萄糖基单位的一种或多种线性麦芽寡糖以及任选的葡萄糖组成。换言之，三个至十个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽寡糖的重量百分数不是以除了两个至十个D-吡喃葡萄糖基单位的一种或多种线性麦芽寡糖和葡萄糖之外的水解产物的量为基础的。可以用任何合适的方法分析水解产物。例如，可以用Dionex PA 100柱经阴离子交换HPLC分析水解产物，用脉冲电流检测并用例如已知的葡萄糖到麦芽七糖的线性麦芽寡糖作为标准。

优选地，本文描述的PS4变异体在烘焙期间是有活性的，在淀粉颗粒的糊化期间及之后水解淀粉，所述糊化在大约55℃的温度时开始。非产麦芽外切淀粉酶越耐热，其具有活性的时间越长，因此其将提供更强的保鲜效应。然而，在高于大约85℃的温度下烘焙时，可能发生酶的失活。如果发生了酶的失活，非产麦芽外切淀粉酶可以被逐渐失活，以致于在烘焙过程之后在最终的面包中基本上没有活性。因此，优选地，适于如描述地应用的非产麦芽外切淀粉酶的最适温度是高于50℃和低于98℃。

通过确定总淀粉酶活性比总内切淀粉酶活性的比值，可以有效地测定外切特异性。该比值在本文中被称为“外切特异性指数”。在优选的实施方案中，如果酶的外切特异性指数是20或更多，即，其总淀粉酶活性(包括外切淀粉酶活性)是其内切淀粉酶活性的20倍或更多，则认为该酶是外切淀粉酶。在高度优选的实施方案中，外切淀粉酶的外切特异性指数是30或更多、40或更多、50或更多、60或更多、70或更多、80或更多、90或更多、或100或更多。在高度优选的实施方案中，外切特异性指数是150或更多、200或更多、300或更多、或400或更多。

可以通过本领域中已知的任何方法测定总淀粉酶活性和内切淀粉酶活性。例如，可以通过分析从淀粉底物释放的还原末端的总数，测定总淀粉酶活性。替代地，在实施例中进一步详述了Betamyl分析的应用，为了方便，在表格和图中，以术语“Betamyl单位”描述如实施例中分析的淀粉酶活性。

可以用Phadebas试剂盒(Pharmacia and Upjohn)分析内切淀粉酶活性。这利用的是蓝色标记的交联淀粉(用偶氮染料标记)；仅淀粉分子中的内部切割释放标记，而外部切割不释放这样的标记。染料的释放可以用分光光度法测定。因此，Phadebas试剂盒测定内切淀粉酶活性，为了方便，这样的分析的结果(描述于实施例中)在本文中称为“Phadebas单位”。

因此，在一种优选的实施方案中，外切特异性指数被表示为术语Betamyl单位/Phadebas单位(Betamyl Units/Phadebas Units)。

也可以根据现有技术中描述的方法分析外切淀粉酶活性，例如，在公布号WO99/50399中描述的方法。这是通过内切淀粉酶活性比外切淀粉酶活性之比的方式测定外切特异性。因此，在一个优选的方面，本文描述的PS4变异体将是，每单位外切淀粉酶活性对应有少于0.5个内切淀粉酶单位(EAU)。优选地，适于本发明的应用的非产麦芽外切淀粉酶，每单位外切淀粉酶活性对应有少于0.05EAU，更优选地，每单位外切淀粉酶活性对应有少于0.01EAU。

PS4变异多肽、核酸、宿主细胞、表达载体等，可以被用于应用淀粉酶的任何用途。具体地，它们可以被用于替代任何非产麦芽外切淀粉酶。它们可以被用于补充淀粉酶或非产麦芽外切淀粉酶活性，不论是单独应用或是和其它已知淀粉酶或非产麦芽外切淀粉酶联合应用。

本文描述的PS4变异序列可以被用于食品工业中的各种用途-如在烘焙产品和饮料产品中，它们也可以被用于其它用途如药物组合物，或甚至在化学工业中。具体地，PS4变异多肽和核酸用于各种工业用途，包括烘焙(如WO 99/50399中所公开)和面粉标准化(体积增加或改进)。它们可以被用于从淀粉和其它底物产生麦芽四糖。

PS4变异多肽可以被用于增加烘焙产品如面包的体积。因此，包括PS4变异多肽或用PS4变异多肽处理的食品产品和未经如此处理的产品或用亲代多肽处理的产品相比，体积膨胀。换言之，对于食品产品，每单位食品产品体积中含有更大的空气体积。替代地，或附加地，用PS4变异多肽处理的食品产品具有更低的密度，或更低的单位体积重量(或质量)。在特别优选的实施方案中，PS4变异多肽被用于增加面包的体积。体积增加或膨胀是有益的，原因是它降低了食品的黏性或浆糊状(starchiness)。轻的食品是消费者优选的，消费者的感受会更好。在优选的实施方案中，应用PS4变异多肽增加了体积10％、20％、30％、40％、50％或更多。

本文描述的PS4变异多肽和核酸可以被用作食品-或用在食品的制备中。具体地，它们可以被加入食品，即，作为食品添加剂。在一个优选的方面，食品用于人类消费。食品可以是溶液或固体的形式-这取决于用途和/或应用的方式和/或给予的方式。

PS4变异多肽和核酸可以被用作食物成分。本文公开的PS4变异多肽和核酸可以是食品增补剂-或被加入到食品增补剂。本文公开的PS4变异多肽和核酸可以是功能食品-或被加入到功能食品。

PS4变异多肽也可以被用于生产食品或食品原料。典型的食品包括乳制品、肉类产品、家禽产品、鱼类产品和面团产品。面团产品可以是任何处理过的面团产品，包括煎的、油炸的、烤的、烘焙的、蒸的和煮的面团，如蒸的面包和年糕。在高度优选的实施方案中，食物产品是烘焙产品。

优选地，食品是面包产品。典型的面包(烘焙的)产品包括面包-如长方面包、小圆面包、泡夫奶油面包、比萨饼(pizza bases)等，酥皮糕点、椒盐卷饼、玉米粉圆饼、糕饼、曲奇饼、饼干、脆饼干等等。

PS4变异多肽能够延迟淀粉介质如淀粉凝胶的不新鲜化。PS4变异多肽特别能够延迟淀粉的有害退化。

因此，应用本文描述的PS4变异多肽，可以延迟或阻止或减慢退化，所述应用是在其加工成食品产品的任何时期加入到淀粉时发生的，例如，在烘焙为面包之前、之间或之后。这样的应用在下面被更详细地描述。

为了评价本文描述的具有非产麦芽外切淀粉酶活性的PS4变异多肽的保鲜效应，在烘焙后1、3和7天可以测定面包屑坚硬性，这是用Instron 4301Universal Food Texture Analyzer或本领域中的相似设备进行的。

在本领域中传统应用的用于评价具有非产麦芽外切淀粉酶活性的PS4变异多肽在淀粉退化中的效应的另一方法是以DSC(差示扫描量热法)为基础的。在此，在用酶或不带有酶(对照)进行烘焙的情况下，测定面包屑中或来自模型体系面团(model system dough)的面包屑的退化支链淀粉的熔化焓。用于所描述的实施例中的DSC设备是Mettler-Toledo DSC 820，运行的温度梯度是从20至95℃，每分钟10℃。为制备样品，称量10-20mg的面包屑，并将其转移至Mettler-Toledo铝盘(aluminium pans)，随后与外界隔绝地密封Mettler-Toledo铝盘。

用于描述的实施例中的模型体系面团含有标准小麦粉和最佳量的水或缓冲液，带有或不带有非产麦芽的PS4变异外切淀粉酶。分别将它们在10或50g布拉班德淀粉测定记录仪(Brabender Farinograph)中混合6或7分钟。将面团样品放置在带盖的玻璃检测管(15*0.8cm)中。使这些检测管在水浴中遭受烘焙过程，开始时在33℃温育30分钟，接着从33至95℃，梯度是每分钟1.1℃，最后在95℃温育5分钟。随后，在DSC分析之前，在恒温器中保存所述管于20℃。

在优选的实施方案中，本文描述的PS4变异体相对于对照组具有降低的熔化焓。在高度优选的实施方案中，PS4变异体具有10％或更低的熔化焓。优选地，与对照组相比，它们具有20％或更大程度、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更降低的熔化焓。

	DSC(J/g)
		对照	2.29
0.5D34	1.91
		1D34	1.54
2D34	1.14

表2

上面的表2显示了，用不同剂量PSac-D34制备的模型面团体系在存储7天之后的DSC值。检测了面粉的每百万份中的0.5、1和2份(或微克/克)。

PS4变异多肽可以被用来制备食物产品，特别是淀粉产品。方法包括：通过向淀粉介质中加入非产麦芽外切淀粉酶如PS4变异多肽，形成淀粉产品。如果淀粉介质是面团，则面团是通过将面粉、水、非产麦芽外切淀粉酶和任选的其它可能的成分和添加剂混合在一起而制备的，非产麦芽外切淀粉酶是PS4变异多肽。

优选的面粉是小麦粉或黑麦粉或小麦粉和黑麦粉的混合物。然而，也可以预期包含来自其它类型谷物的面粉的面团，所述谷物如，例如来自稻、玉米、大麦和高粱。优选地，淀粉产品是烘焙产品。更优选地，淀粉产品是面包产品。甚至更优选地，淀粉产品是烘焙的含淀粉面包产品。

因此，如果淀粉产品是烘焙的含淀粉面包产品，则方法包括，在面团形成条件下，以任何合适的顺序混合面粉、水和发酵剂，并进一步加入PS4变异多肽，优选地以预混合料的形式。发酵剂可以是化学发酵剂如碳酸氢钠或酿酒酵母(面包酵母)的任何菌株。

可以将PS4变异非产麦芽外切淀粉酶和包括水在内的任何面团组分或面团组分混合物或者任何添加剂或添加剂混合物一起加入。可以通过在烘焙工业中或在制造基于面粉面团的产品的任何其它工业中普遍应用的任何常规的面团制备方法来制备面团。

优选的实施方案是这样的制备面包产品的过程，包括：(a)提供淀粉介质；(b)向淀粉介质加入本文中描述的PS4变异多肽；和(c)在步骤(b)期间或之后向淀粉介质施加热，以产生面包产品。另一优选的实施方案是这样的制造面包产品的过程，包括向淀粉介质加入本文中描述的PS4变异多肽。

非产麦芽外切淀粉酶PS4变异多肽可以以液体制剂或干燥的粉状组合物的形式加入，其中包含的酶或是作为唯一的活性成分，或是与一种或多种额外的面团组分或面团添加剂相混合。

另一优选的实施方案是这种面包和面团改良组合物在烘焙中的应用。进一步的实施方案提供了由所述面包改良组合物或面团改良组合物得到的烘焙产品或面团。另一实施方案提供了由应用面包改良组合物或面团改良组合物得到的烘焙产品或面团。

可以通过混合面粉、水、面团改良组合物和任选的其它成分和添加剂来制备面团，所述面团改良组合物包含PS4变异多肽(如上述)。

可以将面团改良组合物和包括面粉、水和任选的其它成分或添加剂的任何面团组分一同加入。可以在面粉或水或任选的其它成分和添加剂之前加入面团改良组合物。可以在面粉或水或任选的其它成分和添加剂之后加入面团改良组合物。可以通过在烘焙工业中或在制造基于面粉面团的产品的任何其它工业中普遍应用的任何常规的面团制备方法来制备面团。

面团改良组合物可以以液体制备物或干粉组合物的形式加入，其或是包括作为单一活性成分的组合物，或和一种或多种其它面团组分或添加剂混合。

加入的PS4变异多肽非产麦芽外切淀粉酶的量通常是，导致在最终面团中存在的量是每kg面粉50至100,000单位的量，优选地，每kg面粉100至50,000单位。优选地，量是在每kg面粉200至20,000单位的范围内。

在本文中，1单位的非产麦芽外切淀粉酶被定义为：在50℃，在试管中和4ml 10mg/ml蜡质玉米淀粉温育时，释放相当于每分钟1μmol还原糖的水解产物的酶量，所述蜡质玉米淀粉溶于如下所述的pH 6.0的50mM MES，2mM氯化钙中。

本文所描述的面团通常包括小麦粗粉或小麦面粉和/或其它类型的粗粉、面粉或淀粉如玉蜀黍粉(corn flour)、玉米淀粉、玉米粉(maize flour)、稻粉、黑麦粗粉、黑麦粉、燕麦粗粉、燕麦粉、高粱粗粉、高粱粉、马铃薯粗粉、马铃薯粉或马铃薯淀粉。面团可以是新制的、冷冻的或部分烘焙的。

面团可以是发酵了的面团或欲被发酵的面团。可以用各种方法发酵面团，如通过加入化学发酵剂，例如，碳酸氢钠或加入酵母(发酵面团)，但是优选地通过加入合适的酵母培养物发酵面团，如酿酒酵母(baker′s yeast)的培养物，酿酒酵母例如，酿酒酵母的商业上可获得的菌株。

面团可以包含脂肪如颗粒状脂肪或起酥油脂(shortening)。面团可以进一步包括另外的乳化剂如甘油一酯或甘油二酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的多甘油酯、甘油一酯乳酸酯、甘油一酯乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、或溶血卵磷脂。

另一实施方案是预混合料，其包含面粉，同时带有本文描述的组合。预混合料可以含有其它面团改良和/或面包改良添加剂，例如，任何的包括本文提及的酶的添加剂。

为了进一步改进烘焙产品的性质和赋予烘焙产品不同的品质，可以在面团中加入其它的面团成分和/或面团添加剂。典型地，这类其它的添加的成分可以包括面团成分如盐、谷物、脂肪和油、糖或增甜剂、膳食纤维，蛋白源如奶粉、面筋豆(gluten soy)或蛋，和面团添加剂如乳化剂、其它酶、水状胶体、增味剂、氧化剂、矿物质和维生素。

乳化剂可用作面团增强剂(dough strengtheners)和面包屑软化剂。作为面团增强剂，乳化剂可以提供对休眠期(resting time)的耐受(tolerance)和对发泡(proofing)期间振动的耐受。而且，面团增强剂将改善给定的面团对发酵时间变化的耐受。大多数面团增强剂也改善烘焙弹性，这意味着从发酵产品至烘焙产品的体积增加。最后，面团增强剂将乳化存在于配方混合物中的任何脂肪。

合适的乳化剂包括卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、可食用脂肪酸的甘油一酯和甘油二酯、可食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的醋酸酯、可食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乳酸酯、可食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的柠檬酸酯、可食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、可食用脂肪酸的蔗糖酯、硬脂酰-2-乳酸钙、和硬脂酰-2-乳酸钠。

可以将另外的面团添加剂或组分和任何其它的面团组分一起加入，所述面团组分包括面粉、水或任选的其它组分或添加剂，或面团改良组合物。另外的面团添加剂或组分可以在面粉、水、任选的其它组分和添加剂或面团改良组合物之前加入。另外的面团添加剂或组分可以在面粉、水、任选的其它组分和添加剂或面团改良组合物之后加入。

另外的面团添加剂或组分可以方便地是液体制备物。然而，另外的面团添加剂或成分也可以方便地是干燥组合物的形式。

优选地，另外的面团添加剂或组分是面团面粉成分重量的至少1％。更优选地，另外的面团添加剂或组分占至少2％、优选地至少3％、优选地至少4％、优选地至少5％、优选地至少6％。如果添加剂是脂肪，则典型地，脂肪存在的量可以是从1至5％，典型地是从1至3％，更典型地是大约2％。

其它用途可以在律师案卷编号674510-2007和GC806P找到，其在此并入，作为参考，包括任何图表、参考文献或附图。

实施例

实施例1：PS4的克隆

让嗜糖假单胞菌在LB培养基中生长过夜，用标准方法(Sambrook J，1989)分离染色体DNA。用引物P1和P2(参见表3)，经PCR从嗜糖假单胞菌染色体DNA扩增出2109bp的片段，所述片段含有PS4开放阅读框架(Zhou et al.，1989)。将得到的片段用作巢式PCR的模板，引物是P3和P4，扩增不带有信号序列的PS4开放阅读框并在基因的5’末端导入NcoI位点，在基因的3’末端导入BamHI位点。N-末端甲硫氨酸的密码子和NcoI位点共同导入，使得PS4可以在细胞内表达。将1605bp的片段克隆入pCRBLUNT TOPO(Invitrogen)，通过测序分析构建物的完整性。修饰大肠杆菌穿梭载体pDP66K(Penninga et al.，1996)，以使得PS4可以在P32启动子和ctgase信号序列的调控下表达。将得到的质粒pCSmta转化入枯草芽孢杆菌。

构造第二个表达构建体，其中去除了PS4的淀粉结合结构域。在用引物P3和P6对pCSmta进行的PCR中，产生了截短形式的mta基因。pCSmta中的全长mta基因被截短形式所替换，从而形成质粒pCSmta-SBD。

实施例2：PS4的定点诱变

突变是通过2种方法导入mta基因的。或是通过基于2步PCR的方法，或是通过Quick Exchange方法(QE)。为了方便，将mta基因分为3部分；PvuI-FspI片段、FspI-PstI片段和PstI-AspI片段，分别进一步称为片段1、2和3。

在基于2步PCR的方法中，突变是用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)导入的。第一轮PCR是针对编码链的诱变引物(表4)加上另一链(lower strand)下游的引物(或是2R或是3R，表3)来进行的。反应产物和编码链上游的引物共同被用作第二轮PCR的引物。将终末反应的产物克隆入pCRBLUNT topo(Invitrogen)，测序之后，片段与pCSmta中的相应片段替换。

用Quick Exchange方法(Stratagene)，用两个互补引物，在含有mta基因或部分mta基因的质粒中经PCR导入突变。

对于此用途，构建出方便的一组质粒，包括3个SDM质粒和3个pCSΔ质粒。每一SDM质粒带有如上提及的mta基因的一个片段，其中所需突变是经QE导入的。经测序确认后，将片段克隆入相应的受体pCSΔ质粒。pCSΔ质粒是pCSmta的失活衍生物。活性是通过克隆来自SDM质粒的相应片段而恢复的，这使得能够容易地筛选。

表3：用于克隆mta基因的引物，以及用于在2步PCR方法中构建定点突变体的标准引物。

引物	引物序列	导入的位点
			P1	5′-ATG ACG AGG TCC TTG TTT TTC
P2	5′-CGC TAG TCG TCC ATG TCG
			P3	5′-GCC ATG GAT CAG GCC GGC AAG AGC CCG	NcoI
P4	5′-TGG ATC CTC AGA ACG AGC CGC TGG T	BamHI
			P6	5′-GAA TTC AGC CGC CGT CAT TCC CGC C	EcoRI
2L	5′-AGA TTT ACG GCA TGT TTC GC
			2R	5′-TAG CCG CTA TGG AAG CTG AT
3L	5′-TGA CCT TCG TCG ACAACC AC
			3R	5′-GAT AGC TGC TGG TGA CGG TC

表4：用于在mta中导入定点诱变的引物

表5：SDM和pCSΔ质粒的特征

质粒	特征/结构
		SDM1	pBlueSK+480bp SalI-StuI片段mta
SDM2	pBlueSK+572bp SacII-PstI片段mta
		SDM3	pBlueSK+471bp SalI-StuI片段mta
pCSΔ1	FseI位点，用Klenow填充----＞mta中发生框移(frameshift in mta)
		pCSΔ2	mta的FspI-PstI片段，用′废物DNA(junk DNA)′替代
pCSΔ3	mta的FstI-AspI片段，用′废物DNA(junk DNA)′替代

实施例3：Multi SDM

PS4变异体是根据使用说明书，用

Multi Site DirectedMutagenesis Kit(Stratagene)生成的，带有如所述的一些改变。

步骤1：突变链合成反应(PCR)

-在10ml的Falcon管中接种3ml LB(22g/l Lennox L Broth Base，Sigma)+抗生素(0.05μg/ml卡那霉素，Sigma)

-37℃温育过夜(o/n)，约200rpm

-离心沉降细胞(5000rpm/5分钟)

-倒去培养基

-用QIAGEN Plasmid Mini Purification Protocol制备双链DNA模板

1.用于热循环的突变链合成反应物按如下所述来制备：

PCR混合物：

2.5μl 10X Quick

Multi反应缓冲液

0.75μl QuickSolution

Xμl 引物

1μl dNTP混合物

Xμl 双链DNA模板(200ng)

1μl Quick

Multi酶混合物(2.5U/μl)(

DNA聚合酶)

X μl dH₂O(加至终体积25μl)

抽吸并短暂沉降反应混合物，以混合所有成分。

2.用下列参数来循环反应：

35个循环变性(96℃/1分钟)

引物退火(62.8℃/1分钟)

延伸(65℃/15分钟)

然后维持在4℃

在将PCR管放入PCR仪之前(eppendorf热循环仪)之前，预加热PCR仪的盖至105℃并预加热板至95℃。

步骤2：Dpn I消化

1.向每一扩增反应体系中加入2μl DpnI限制性内切酶(10U/μl)，抽吸并短暂沉降混合物而混合。

2.37℃温育～3小时。

步骤3：转化XL10-

超感受态细胞(Ultracompetent Cells)

1.在冰上解冻XL10-Gold细胞。将每个突变反应所需的45μl细胞分装至预冷的Falcon管中。

2.打开水浴(42℃)并将带有NZY⁺肉汤的试管放在水浴中预热。

3.向每一管加入2μlβ-巯基乙醇混合物。旋转并轻弹并在冰上温育10分钟，每2分钟旋转一次。

4.向每等份细胞加入1.5μl DpnI处理的DNA，旋转混合并在冰上温育30分钟。

5.在42℃水浴中热激(heat-pulse)试管30秒，在冰上放置2分钟。

6.向每一管加入0.5ml预热的NZY⁺肉汤，在37℃温育1小时，同时以225-250rpm振荡。

7.将200μl的每一转化反应物铺板在LB平板上(33.6g/l Lennox L Agar，Sigma)，LB平板含有1％淀粉和0.05μg/ml卡那霉素。

8.37℃温育转化平板过夜。

表6：用于pPD77d14的引物表：

表7：用于pPD77d20的引物表：

表8：用于pPD77d34的引物表：

基于pPD77的载体系统

用于pPD77的载体系统是基于pCRbluntTOPOII(invitrogen)。Zeocin抗性序列盒通过使用pmlI去除，去除了393bp的片段。然后，将来自pCC载体的表达序列盒(P32-ssCGTase-PS4-tt)插入载体。

将PS4变异体连接入pCCMini

用限制性内切酶Nco I和Hind III(Biolabs)切割含有相关突变(经MSDM建立)的质粒：

3μg质粒DNA，Xμl 10x缓冲液2，10单位Nco 1，20单位HindIII，37℃温育2小时

在1％琼脂糖凝胶上分析消化产物。从凝胶中切取出长度为1293bp的片段(PS4基因)，并用Qiagen gel purification kit纯化。

然后，用限制性内切酶Nco 1和Hind III切割载体pCCMini，然后，在1％琼脂糖凝胶上分离消化产物。从凝胶中切取出长度为3569bp的片段并用Qiagen gel purification kit纯化。

连接：用Rapid DNA ligation kit(Roche)

用双倍量于载体的插入片段

例如，2μl插入片段(PS4基因)

1μl载体

5μl T4连接缓冲液2x conc

1μl dH₂O

1μl T4DNA连接酶

连接5分钟/室温

根据产品说明书(Invitrogen)，将连接物转化入One Shot TOPO感受态细胞。每次转化用5μl连接物。

将50μl转化混合物铺板在LB平板上(33.6g/l Lennox L Agar，Sigma)，LB平板包括1％淀粉和0.05μg/ml卡那霉素。可以通过淀粉平板上的晕圈形成来识别含有插入片段(PS4变异体)的载体。

实施例4：转化入枯草芽孢杆菌(原生质体转化)

根据下列方案，用突变的pCS-质粒转化枯草芽孢杆菌(菌株DB104A；Smith et al.1988；Gene 70，351-361)。

A.用于原生质化(protoplasting)和转化的培养基

2x SMM 每升：342g蔗糖(1M)；4.72g马来酸钠(0.04M)；8.12gMgCl₂·6H₂O(0.04M)；用浓NaOH调节pH为6.5。分为50ml份并高压灭菌10分钟。

4x YT(1/2NaCl)每100ml 2g酵母提取物+3.2g胰蛋白胨+0.5g NaCl

SMMP 混合等体积的2x SMM和4x YT。

PEG 10g聚乙二醇6000(BDH)或8000(Sigma)，在25ml 1xSMM中(高压灭菌10分钟)。

B.用于铺板/再生的培养基

琼脂 4％Difco最简化琼脂。高压灭菌15分钟。

琥珀酸钠 270g/l(1M)，用HCl调节pH 7.3。高压灭菌15分钟。

磷酸缓冲液每100ml 3.5g K₂HPO₄+1.5g KH₂PO₄。高压灭菌15分钟。

MgCl₂ 每100ml 20.3g MgCl₂·6H₂O(1M)。

酪蛋白氨基酸 5％(w/v)溶液。高压灭菌15分钟。

酵母提取物每100ml 10g，高压灭菌15分钟。

葡萄糖 20％(w/v)溶液。高压灭菌10分钟。

DM3再生培养基：60℃下混合(水浴；500-ml容器)：

250ml琥珀酸钠

50ml酪蛋白氨基酸

25ml酵母提取物

50ml磷酸缓冲液

15ml葡萄糖

10ml MgCl₂

100ml熔化的琼脂

加入合适的抗生素：氯霉素和四环素，5ug/ml；红霉素，1ug/ml。在DM3培养基上基于卡那霉素进行选择是有问题的：需要250ug/ml的浓度。

C.制备原生质体

1.始终应用无清洁剂的塑料或玻璃器具。

2.将单个克隆接种到含有10ml 2x YT培养基的100ml烧瓶中。使培养物在振荡器中(200rev/min)25-30C生长过夜。

3.稀释过夜的培养物20倍，放入100ml新鲜的2x YT培养基(250-ml烧瓶)，在振荡器中(200-250rev/min)37C生长，直至OD₆₀₀＝0.4-0.5(大约2小时)。

4.离心收集细胞(9000g，20min，4C)。

5.用移液管移去上清液，在5ml SMMP+5mg溶菌酶中重悬浮细胞，无菌过滤。

6.在水浴振荡器中37C温育(100rev/min)。

30分钟后以及其后每隔15分钟，用显微镜检测25ul样品。继续温育，直至细胞的99％被原生质化(球形外观)。离心收集原生质体(9000g，20分钟，室温)并移去上清。在1-2ml SMMP中轻柔地重悬浮沉淀。

现在，原生质体已准备好，可以被应用。可以在-80C冷冻几份(例如，0.15ml)，用于将来应用(不需要加入甘油)。尽管这可能导致转化能力的一定程度降低，但用冷冻的原生质体可以得到每ug DNA 106个转化子。

D.转化

1.向微量管中转移450ul PEG。

2.混合1-10ul DNA(0.2ug)和150ul原生质体，并将混合物加入带有PEG的微量管。立即但轻柔地混合。

3.室温放置2分钟，然后加入1.5ml SMMP并混合。

4.离心收集原生质体(10分钟，13.000rev/min(10-12.000g))，并倒去上清液。用棉纸移除残余小滴。

加入300ul SMMP(不漩涡)并在水浴振荡器中37C温育60-90分钟(100rev/min)，以使得抗生素抗性标记被表达。(通过水浴的振荡行为，原生质体有效地重悬浮)。制备溶于1x SSM中的合适稀释液，在DM3平板上铺0.1ml。

实施例5：PS4变异体在摇瓶中发酵

摇瓶底物被制备如下：

成分	％(w/v)
		水	-
酵母提取物	2
		大豆粉	2
NaCl	0.5
		磷酸氢钾	0.5
抗泡沫剂	0.05

在高压灭菌之前，用4N硫酸或氢氧化钠将底物调节为pH6.8。将100ml的底物放在带有遮护物的500ml的瓶中，高压灭菌30分钟。随后，加入6ml无菌右旋糖浆。右旋糖浆是通过混合1个体积的50％w/v的右旋糖和1个体积的水，随后高压灭菌20分钟而制备的。

用变异体接种摇瓶，在温育箱内35℃/180rpm温育24小时。温育后，经离心从肉汤分离出细胞(10.000x g，10分钟)，最终，经0.2μm微过滤，上清液被制备为不含细胞。将无细胞上清液用于分析和用途测试。

实施例6：淀粉酶分析

Betamyl分析

一个Betamyl单位被定义为这样的活性，每分钟降解0.0351mmole PNP-偶联麦芽戊糖，以致于在分析混合物中由过量的a-葡糖苷酶可以释放出每分钟0.0351mmole PNP。分析混合物含有50ul 50mM的柠檬酸钠，5mM CaCl2，pH 6.5，带有25ul酶样品和25ul Betamyl底物(Glc5-PNP和a-葡糖苷酶)，来自Megazyme，Ireland(1小瓶，溶解于10ml水)。40C温育分析混合物30分钟，然后通过加入150ul 4％Tris终止反应。用ELISA-读数器测定420nm处的吸光度，并根据活性＝A420*d计算Betamyl活性，单位是Betamyl单位/ml被分析的酶样品。

内切淀粉酶分析

内切淀粉酶分析和根据制造商(Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB)实施的Phadebas分析相同。

外切特异性

外切淀粉酶活性相对Phadebas活性的比率被用于评价外切特异性。

比活性

对于PSac-D14、PSac-D20和PSac-D34变异体，根据Bradford(1976；Anal.Biochem.72，248)测定结果，我们发现平均比活性是每微克纯化的蛋白为10个Betamyl单位。将此比活性用于用途试验中所采用的剂量的基于活性的计算。

实施例7：半衰期测定

t1/2被定义为这样的时间(以分钟表示)，在所述时间内，在限定的加热条件下，酶活性失去一半。为了确定酶的半衰期，将样品在60℃至90℃的固定温度下加热1-10分钟。根据残余的Betamyl分析计算半衰期。

方法：在Eppendorf管中，预热1000ul缓冲液至少10分钟，温度是60℃或更高。在热温育器(Eppendorf的Termomixer comfort)中持续混合(800rpm)Eppendorf管的条件下，向预热的缓冲液中加入100ul样品，开始热处理样品。温育0、2、4、6、8和9分钟之后，通过将45ul样品转移至已在20℃平衡的1000ul缓冲液，并在1500rpm及20℃下温育1分钟，终止该处理。用Betamyl分析测定残余活性。

计算：根据残余Betamyl活性的log10(底数10的运算方法)比温育时间所得的斜率计算t1/2。t1/2被计算为斜率/0.301＝t1/2。

实施例8：结果

表9：PSac-变异体相对于野生型PSac-cc1的生物化学性质

表10

表11

表12

表13

表14

表15

实施例9：模拟体系烘焙试验(Model System Baking Tests)

在30.0℃，在淀粉测定记录仪(Farinograph)中制备面团。称出10.00g改良面粉(reformed flour)并加入到淀粉测定记录仪；混合1分钟之后，用无菌移液器通过搓揉桶(kneading vat)的孔加入参照物/样品(参照物＝缓冲液或水，样品＝酶+缓冲液或水)。30秒之后，从边缘刮去面粉——也是通过搓揉桶的孔。将样品搓揉7分钟。

在最终的参照物被运行之前，在淀粉测定记录仪上用缓冲液或水进行测试。参照物的FU应该是400，如果不是，应该用例如液体的量来校正。用刮铲移出参照物/样品并放置在手中(戴有一次性手套)，再将参照物/样品装入小玻璃管(长度大约是4.5cm)，小玻璃管被放入NMR管并塞住。每个面团制备7管。

当制备了所有样品后，将管放在(可程序控制的)水浴中25分钟，温度是33℃(不带有塞子)，此后，使水浴在33℃维持5分钟，然后在56分钟内加热至98℃(每分钟1.1℃)并最终在96℃维持5分钟。

于20.0℃将管存储在热橱(thermo cupboard)中。在1、3和7天时，用BrukerNMS 120Minispec NMR分析仪通过质子NMR测定面包屑的固体含量，如图2中所示，对用0、0.5、1和2ppm PSacD34制备的面包屑样品进行测定。固体含量随时间推移的增加变慢，代表支链淀粉退化(amylopectinretrogradation)的减少。于20.0℃在热橱中存储7天之后，称出10-20mg面包屑样品并放置在40ul铝标准DSC舱(capsule)中，在20℃保存。

在Mettler Toledo DSC 820设备上，对所述舱进行差示扫描量热分析。应用下列参数：热循环20-95℃，每分钟加热10℃，气体/流量：N₂/每分钟80ml。分析结果，以J/g计算退化支链淀粉的熔化焓。

实施例10：保鲜效应

根据实施例8制备和测定模型面包屑。如表2中所示，差示扫描量热法测定结果显示，相对于对照，PS4变异体在烘焙后，支链淀粉退化显著降低。

PS4变异体显示了明显的剂量效应。

实施例11：烘焙试验中的坚硬性影响

烘焙试验是用标准白面包发面团和用于美国吐司面包的面团配方进行的。发面团是由1600g来自Sisco Mills，USA的“All Purpose Classic”面粉、950g水、40g大豆油和32g干酵母制备的。在Hobart螺旋式混合器上，以低速度混合发面团1分钟，随后以速度2混合3分钟。随后在35℃，85％RH发酵发面团2.5小时，随后在5℃发酵0.5小时。

此后，向发面团加入400g面粉、4g干酵母、40g盐、2.4g丙酸钙、240g高果糖玉米糖浆(Isosweet)、5g乳化剂PANODAN 205、5g酶活性的大豆粉、30g非活性的大豆粉、220g水和30g抗坏血酸溶液(由溶于500g水的4g抗坏血酸制备)。在Hobart螺旋式混合器上，将得到的面团以低速度混合1分钟，随后以速度2混合6分钟。此后，室温搁置面团5分钟，然后称量500g面团块，搁置5分钟，随后在Glimek轧面机上铺开，设置为各侧为1∶4、2∶4、3∶15、4∶12和10，并将其转变为烘焙形式。在43℃，90％RH下，发酵面团60分钟之后，在218℃烘焙面团29分钟。

用TA-XT 2质地分析仪(texture analyser)测定坚硬性和弹性。用来自Stable Micro Systems，UK的质地分析仪(Texture Analyser)，通过质地状况分析仪(Texture Profile Analysis)分析面包片，测定柔软度、粘性和弹性。应用下列设置：

预测试速度(Pre Test Speed)：2mm/s

测试速度(Test Speed)：2mm/s

测试后速度(Post Test Speed)：10mm/s

破裂测试距离(Rupture Test Distance)：1％

距离(Distance)：40％

力(Force)：0.098N

时间(Time)：5.00sec

计数(Count)：5

测压元件(Load Cell)：5kg

触发类型(Trigger Type)：Auto-0.01N

结果显示于图3和图4。

实施例12：控制丹麦面包卷(Danish Rolls)的体积

丹麦面包卷是基于2000g丹麦改良面粉(来自Cerealia)、120g压缩的酵母、32g盐和32g蔗糖，由面团制备的。根据前面的水最优化(water optimisation)，向面团加入水。

在Diosna搅拌器上混合面团(低速2分钟，高速5分钟)。将混合后的面团温度保持在26℃。称量1350g面团，在30℃在加热箱中搁置10分钟。在Fortuna成型机(molder)上模塑面包卷，并在34℃和85％的相对湿度下发酵45分钟。随后，在Bago 2烤箱中烘焙面包卷18分钟，温度是250℃，在开始的13秒中施加蒸气。烘焙后，在称量和测定体积之前，冷却面包25分钟。

就面包皮的外观、面包屑的均一性、面包皮的表层、ausbund和比体积(用油菜籽置换方法(rape seed displacement method)测定体积)，对面包卷作出评价。

根据这些标准，发现PS4变异体增加了比体积(specific volume)并改进了丹麦面包的质量参数。因此，PS4变异体能够控制烘焙产品的体积。

本文中提及的每一申请和专利，以及上述申请和专利中引用和提及的每一文献，包括在每一申请和专利(“申请引用的文献”)进行期间和在每一申请和专利以及任何申请引用文献中引用或提及的任何产品的使用说明书或目录，均在此并入，作为参考。而且，本文中引用的所有文献，和本文中引用的文献中引用或提及的所有文献，以及本文中引用或提及的任何产品的使用说明书或目录，均在此并入，作为参考。

本发明所描述的方法和体系的各种修改和变化，对本领域的技术人员将是显而易见的，不背离本发明的精神和范围。尽管参考具体的优选实施方案描述了本发明，但应该理解，所要求保护的发明不应当过度地被限制在这些具体实施方案中。实际上，对所描述的实施本发明的方式的各种修改，都意图于包含在权利要求范围内，这对分子生物学或相关领域的技术人员是显而易见的。

Claims

1.具有淀粉酶活性的非产麦芽外切淀粉酶，其选自以下组成的组：

(a)包含序列表SEQ ID NO：15列出的氨基酸序列的具有淀粉酶活性的非产麦芽外切淀粉酶；和

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的由(a)的非产麦芽外切淀粉酶衍生的具有淀粉酶活性的非产麦芽外切淀粉酶；

其中与亲本多肽或野生型多肽相比，所述非产麦芽外切淀粉酶具有更高的热稳定性。

2.具有淀粉酶活性的非产麦芽外切淀粉酶，其选自以下组成的组：

(b)由以下核苷酸序列编码的具有淀粉酶活性的非产麦芽外切淀粉酶，其中所述核苷酸序列与能够在严格条件(例如50℃和0.2x SSC{1x SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与编码序列表SEQ ID NO：15所示非产麦芽外切淀粉酶的核苷酸序列杂交的核苷酸序列互补；

3.非产麦芽外切淀粉酶，

(a)其中，所述非产麦芽外切淀粉酶包含与SEQ ID Nos：2～4或13～15之一至少90％是相同的氨基酸序列，并且包含157位点的取代，其中对位置所进行的编号是参照SEQ ID NO：1列出的嗜糖假单胞菌序列，且所述氨基酸序列具有157位点的I157L取代，并且其中与由SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列组成的亲本多肽相比，所述非产麦芽外切淀粉酶具有更高的热稳定性；或

(b)其中，所述非产麦芽外切淀粉酶包含与SEQ ID Nos：8～10之一至少90％是相同的氨基酸序列，并且包含157位点的取代，其中对位置所进行的编号是参照SEQ ID NO：1列出的嗜糖假单胞菌序列，且所述氨基酸序列具有157位点的I157L取代，并且其中与由SEQ ID NO：7列出的氨基酸序列组成的亲本多肽相比，所述非产麦芽外切淀粉酶具有更高的热稳定性。

4.如权利要求1或2所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中所述非产麦芽外切淀粉酶(b)具有157位点的氨基酸取代，其中对位置所进行的编号是参照SEQ ID NO：1列出的嗜糖假单胞菌序列。

5.如权利要求1或2所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中所述非产麦芽外切淀粉酶(b)的157位氨基酸被L取代，其中对位置所进行的编号是参照SEQID NO：1列出的嗜糖假单胞菌序列。

6.如前述任一项权利要求所述的外切淀粉酶，其还包含选自以下的至少一个取代：G4D、N33Y、D34N、G70D、K71R、G87S、A99V、K108R、V113I、G121D、G134R、A141P、G158D、Y171S、L178F、A179T、G188A、Y198F、A199V、G223A、V290I、H307L、I315V、S334P、D343E、S399P、A405F和A405E。

7.如前述任一项权利要求所述的外切淀粉酶，其还包括至少一个另外的取代，位置选自：33、34、71、87、121、134、141、178、179、223、307、334和343。

8.权利要求7所述的外切淀粉酶，其中所述至少一个另外的取代选自：N33Y、D34N、K71R、G87S、G121D、G134R、A141P、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P和D343E。

9.权利要求7所述的外切淀粉酶，其进一步包括至少一个另外的取代，位置选自108、158、171和188。

10.权利要求9所述的外切淀粉酶，其中所述至少一个另外的取代选自K108R、G158D、Y171S和G188A。

11.如前述任一项权利要求所述的外切淀粉酶，其包含选自以下取代的组合：

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，G121D；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，G121D；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y， D34N，K71R，L178F，A179T， G87S，G121D，S214N，T375A；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F，A179T，G121D，Y171S，G188A，N138D；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F，A179T，G121D；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F，A179T；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F，A179T，G188A；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，K71R，L178F，A179T；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，L178F，A179T；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，N33Y，D34N，L178F，A179T；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，L178F，A179T，G87S，G121D；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，L178F，A179T，G121D；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F，A179T， G121D，E343D；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F，A179T，Y33N，N34D，E343D；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L，S334P，K71R，L178F，A179T，G121D；

113F，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

A99V，V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，S334P，D343E；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I；

V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，I315V，S334P，D343E；

D34N，V113I，G134R，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，G313G，S334P，D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，A179V，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

V113I，G134R，A141P，I157L，I170I，Y198F，G223A，V290I，H307L，G313G，S334P，D343E；

A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

G4D，V113I，A141P，I157L，Y198F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E；

A141P，G134R，G223A，H307L，I157L，V113I，V290I，Y198F和G188A；

G134R，A141P，I157L，G223A，H307L和S334P；

G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L和S334P；

G87S，G121D，G134R，A141P，I157L，G223A，H307L和S334P；

N33Y， D34N，G121D，G134R，A141P，I157L，L178F，A179T， G223A，H307L和S334P；和

12.如权利要求1～5中任一项所述的外切淀粉酶，其中所述淀粉酶包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

13.如前述任一项权利要求所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中所述外切淀粉酶具有选自下列的一个或多个位置：4、33、34、70、71、87、99、108、113、121、134、141、157、158、171、178、179、188、198、199、223、290、307、315、334、343、399和405的氨基酸取代，其中位置编号是参照SEQ IDNO：1列出的嗜糖假单胞菌序列。

14.如权利要求1-13中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其缺乏存在于非产麦芽外切淀粉酶中的一个或多个结构域。

15.如权利要求1-14中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其缺乏淀粉结合结构域，其中所述淀粉结合结构域对应于429位之后的氨基酸，其中的位置编号是参照SEQ ID NO：1列出的嗜糖假单胞菌序列。

16.一种制备食物产品的方法，其包括：(a)提供淀粉介质；(b)向所述淀粉介质中加入权利要求1～15中任一项所述的外切淀粉酶。

17.一种食物产品，其由权利要求16所述的方法制备。

18.一种非产麦芽外切淀粉酶，其用于权利要求16所述的方法。

19.一种制备面包产品的方法，包括：(a)提供淀粉介质；(b)向所述淀粉介质加入权利要求1～15中任一项所述的外切淀粉酶；和(c)在步骤(b)期间或之后向所述淀粉介质施加热，以产生面包产品。

20.一种面包产品，其由权利要求19所述的方法制备。

21.一种非产麦芽外切淀粉酶，其用于权利要求19所述的方法。

22.一种延迟或阻止或减慢食物产品中淀粉的有害退化的方法，其中向面团中添加权利要求1～15中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶、

23.一种食物产品，其由权利要求22所述的方法制备。

24.一种非产麦芽外切淀粉酶，其用于权利要求22所述的方法。

25.权利要求1～15、18、21或24所述的非产麦芽外切淀粉酶用于增加烘焙产品的体积的应用。

26.权利要求1～15、18、21或24所述的非产麦芽外切淀粉酶用于食物产品以延迟或阻止或减慢淀粉的有害退化的应用。

27.如权利要求1～15、18、21或24所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中在从55℃至95℃或更高的高温下，所述非产麦芽外切淀粉酶的半衰期相对于亲代酶延长10％或更多，延长50％或更多，或延长100％或更多。

28.如权利要求27所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中高温为80℃。

29.如权利要求1～15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其与亲本多肽相比具有更高的pH稳定性。

30.如权利要求1～15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中在相同的pH条件下，与其亲代多肽相比较时，所述非产麦芽外切淀粉酶具有多出10％或更长，多出50％或更长，或多出100％或更长的半衰期。

31.如权利要求1～15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中与其亲代酶相比较，所述非产麦芽外切淀粉酶具有更高的外切特异性。

32.如权利要求1～15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中在相同条件下，与其亲代多肽相比较，所述非产麦芽外切淀粉酶具有高出10％或更高，高出50％或更高，或高出100％或更高的外切特异性指数。

33.核酸，其编码权利要求1～15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶。

34.载体，其包含权利要求33所述的核酸。

35.宿主细胞，其包含权利要求34所述的载体。

36.用于制备食品产物的组合物，其包含权利要求1～15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶。

37.如权利要求36所述的组合物，其包含另外的成分或另外的酶或两者。

38.如权利要求37所述的组合物，其中所述另外的酶选自以下组成的组：氧化还原酶、水解酶、脂肪酶、酯酶、糖苷酶、淀粉酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉降解酶、蛋白酶和脂加氧酶。

39.如权利要求37所述的组合物，其中所述酶是来自杆菌的产麦芽淀粉酶。

40.如权利要求37～39中任一项所述的组合物，其中所述非产麦芽外切淀粉酶是EP 120693中公开的来自杆菌的产麦芽α-淀粉酶，或其具有α-淀粉酶活性的变异体、同源物或突变体，或具有所述产麦芽α-淀粉酶或其具有α-淀粉酶活性的变异体、同源物或突变体的组合物。

41.权利要求1～15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶在制备食物产品或作为食品成分中的应用。

42.如权利要求41所述的应用，其中所述食物产品包括面团产品。

43.如权利要求41或42所述的应用，其中所述食物产品包括煎的、油炸的、烤的、烘焙的、蒸的和煮的面团产品。

44.如权利要求41所述的应用，其中所述食物产品包括烘焙产品。

45.面团改良组合物，其包含权利要求1～15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶和至少一种其他面团成分或面团添加剂。

46.一种表达权利要求1～15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶的方法，所述方法包括将权利要求34所述的载体导入相容性宿主细胞，并使所述宿主细胞在载体可复制的条件下生长。