CN105007744A - α-淀粉酶和G4-形成淀粉酶的组合 - Google Patents

α-淀粉酶和G4-形成淀粉酶的组合 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶的酶组合物、包含这些酶的预混合物、制备面团的方法和制备烘焙产品的方法。本发明还涉及在工业方法(例如，在食品工业，例如烘焙工业)中使用所述酶组合物和所述预混合物的方法。本发明还涉及所述酶组合物或所述预混合物用于减小烘焙的贮存后的硬度和/或减小烘焙产品贮存期间的回弹性损失的用途。

Description

α-淀粉酶和G4-形成淀粉酶的组合
发明领域
本发明涉及包含α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶(G4-forming amylase)的酶组合物、包含这些酶的预混合物、制备面团的方法和制备烘焙产品的方法。
本发明还涉及在工业方法(例如，在食品工业，例如烘焙工业)中使用所述酶组合物和所述预混合物的方法。本发明还涉及所述酶组合物或所述预混合物用于减小烘焙产品贮存后的硬度和/或减小烘焙产品贮存期间的回弹性损失的用途。
发明背景
关于面包老化的研究已表明：面包中的淀粉部分在贮存期间再结晶，从而导致内芯紧实度的增加，其可以以面包片硬度的增加来测量。减少烘焙产品(例如，面包和蛋糕)的老化一直是食品工业的关注点。
US 4,598,048描述了麦芽糖淀粉酶的制备。US 4,604,355描述了麦芽糖淀粉酶、其制备和用途。US RE38,507描述了抗老化方法和抗老化剂。
WO2008/148845描述了制备基于面团的产品的方法。
WO2006/032281描述了制备基于面团的产品的方法。
WO9950399描述了非麦芽糖外淀粉酶及其在延缓淀粉回生中的用途。
WO2005007818描述了外特异性淀粉酶多肽、编码这些多肽的核酸及其用途。
WO2004111217描述了具有非麦芽糖外淀粉酶活性的变体假单胞菌多肽及其在制备食品中的用途。
WO2005003339描述了包含假单胞菌非麦芽糖外淀粉酶变体的食品添加剂。
WO2005007818描述了外特异性淀粉酶多肽、编码这些多肽的核酸及其用途。
WO2005007867描述了热稳定性淀粉酶多肽、编码这些多肽的核酸及其用途。
WO2006003461描述了多肽。
WO2007007053描述了来自嗜糖假单胞菌的改性淀粉酶。
WO2007148224描述了多肽。
WO2009083592描述了嗜糖假单胞菌G4-淀粉酶变体及其用途。
WO2009088465描述了使用嗜糖假单胞菌G4-淀粉酶及其变体且不使用葡糖淀粉酶获得乙醇的方法。
WO2010133644描述了淀粉酶多肽。
WO2010118269描述了使用嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶变体生产麦芽四糖糖浆。
WO2010132157描述了使用嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶变体和脱支酶生产麦芽四糖糖浆。
工业中需要进一步改进面团和/或由所述面团制成的烘焙产品的性质。
发明内容
本发明涉及制备面团的方法，所述方法包括：加入α-淀粉酶多肽和G-4形成淀粉酶。
根据本发明制备面团的方法包括组合下述物质：
i)α-淀粉酶多肽，其包含
(a)SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少99.5％的氨基酸序列；或
(c)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的第100-2157位核苷酸所示多核苷酸编码的氨基酸序列；或
(d)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义；或
(e)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义；且所述氨基酸序列的特征在于：当用于制备基于面粉具有至少5重量％糖的烘焙产品时，所述烘焙产品相较于不使用所述氨基酸序列制备的烘焙产品具有减小的贮存后硬度；或
(f)氨基酸序列，其具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换37、39、46、47、48、49、53、78、80、84、87、94、101、102、103、104、105、106、107、108、110、111、113、115、120、121、127、128、130、133、136、137、150、157、158、159、161、162、163、166、167、169、176、177、179、201、207、210、211、216、219、221、222、223、227、228、232、233、234、237、240、243、247、250、252、255、258、260、266、267、268、269、273、284、285、287、291、292、293、295、296、297、299、300、302、304、306、312、314、315、316、317、319、321、332、355、356、358、360、361、364、367、383、389、391、400、403、404、407、410、411、421、424、447、454、455、478、483、500、521、538、569、581、616、621、636、670、681、684、685、693、709、710，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
和
ii)G4-形成淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列；和
iii)至少一种面团成分。
本发明还涉及可被用于延缓烘焙产品(例如，面包和蛋糕)老化的酶组合物。因此，本发明涉及涉及包含α-淀粉酶多肽和G-4形成淀粉酶的酶组合物。因此，本发明提供：
包含α-淀粉酶多肽的酶组合物，所述α-淀粉酶多肽包含
(a)SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少99.5％的氨基酸序列；或
(c)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的第100-2157位核苷酸所示多核苷酸编码的氨基酸序列；或
(d)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义；或
(e)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义且所述氨基酸序列的特征在于：当用于制备基于面粉具有至少5重量％糖的烘焙产品时，所述烘焙产品相较于不使用所述氨基酸序列制备的烘焙产品具有减小的贮存后硬度；或
(f)氨基酸序列，其具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换37、39、46、47、48、49、53、78、80、84、87、94、101、102、103、104、105、106、107、108、110、111、113、115、120、121、127、128、130、133、136、137、150、157、158、159、161、162、163、166、167、169、176、177、179、201、207、210、211、216、219、221、222、223、227、228、232、233、234、237、240、243、247、250、252、255、258、260、266、267、268、269、273、284、285、287、291、292、293、295、296、297、299、300、302、304、306、312、314、315、316、317、319、321、332、355、356、358、360、361、364、367、383、389、391、400、403、404、407、410、411、421、424、447、454、455、478、483、500、521、538、569、581、616、621、636、670、681、684、685、693、709、710，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，所述组合物还包含G4-形成淀粉酶，所述G4-形成淀粉酶具有与SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列。
本发明还描述了新的α-淀粉酶多肽。
此外，本发明涉及包含所述α-淀粉酶多肽和所述G4-形成淀粉酶的预混合物。本发明还涉及包含所述α-淀粉酶多肽和所述G4-形成淀粉酶的面团。
本发明还涉及制备烘焙产品的方法，所述方法包括烘焙根据本发明面团的步骤。
本发明还涉及烘焙产品。
附图说明
图1：说明不使用成熟DSM-AM(α-淀粉酶多肽)且不使用PowerFRESH Special(由DuPont Industrial Biosciences,丹麦生产的G4-形成淀粉酶)制造的面包片的可折叠性的照片。
图2：说明使用50ppm成熟DSM-AM制造的面包片的可折叠性的照片。
图3：说明使用75ppm PowerFRESH Special制造的面包片的可折叠性的照片。
图4：说明使用50ppm成熟DSM-AM和75ppm PowerFRESH Special制造的面包片的可折叠性的照片。
序列表说明
SEQ ID NO:1展示了来源于Alicyclobacillus pohliae NCIMB14276的多核苷酸序列，其编码野生型信号序列(展示于第1-99位核苷酸中)、α-淀粉酶多肽(展示于第100-2157位核苷酸中)和在3’末端的终止密码子(展示于第2157-2160位核苷酸中)。
SEQ ID NO:2展示了Alicyclobacillus pohliae NCIMB14276野生型信号序列(展示于第1-33位氨基酸中)和α-淀粉酶多肽(展示于第34-719位氨基酸中)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3展示了密码子经优化的来源于Alicyclobacillus pohliaeNCIMB14276的多核苷酸序列，其编码野生型信号序列(展示于第1-99位核苷酸中)、α-淀粉酶多肽(展示于第100-2157位核苷酸中)和在3’末端的终止密码子(展示于第2157-2160位核苷酸中)。
SEQ ID NO:4展示了来自Pseudomonas saccharophila的G4-形成淀粉酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5展示了另一种G4-形成淀粉酶的氨基酸序列。
发明详述
贯穿本说明书和所附权利要求，词语“包含”、“包括”和“具有”以及它们的变体应被包含地解释。换言之，当语境允许时，这些词语旨在表达可能包含未明确列举的其它元素或整体。
贯穿本说明书和所附权利要求，词语“第100-2157位核苷酸”表示第100位直至并包括第2157位核苷酸。
贯穿本说明书和所附权利要求，词语“第34-719位核苷酸”表示第34位直至并包括第719位核苷酸。
术语“具有SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的多肽”、“SEQ ID NO:2中所示成熟多肽”和“成熟DSM-AM”和“成熟α-淀粉酶多肽”在本文中可互换使用。
术语“根据本发明”和“本发明的”在本文中可互换使用。
在本发明的语境中，“成熟多肽”在本文中被定义为具有α-淀粉酶活性的多肽，其是在翻译和包括N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等任何翻译后修饰之后的其最终形式。成熟过程可取决于所使用的特定的表达载体、表达宿主和生产工艺。
术语参照α-淀粉酶多肽和具有α-淀粉酶活性的参照多肽在本文中可互换使用。
参照α-淀粉酶多肽(此处及之后也被称为具有α-淀粉酶活性的参照多肽)优选地是SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的α-淀粉酶。
此处及之后的术语α-淀粉酶多肽包括α-淀粉酶多肽变体。α-淀粉酶多肽变体包含至少一个位置(在变体中)的替换，所述位置对应于以上所示的SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸中的一个位置。
本发明涉及包含α-淀粉酶多肽的酶组合物，所述α-淀粉酶多肽包含
(a)SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少99.5％的氨基酸序列；或
(c)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的第100-2157位核苷酸所示多核苷酸编码的氨基酸序列；或
(d)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义；或
(e)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义且所述氨基酸序列的特征在于：当用于制备基于面粉具有至少5重量％糖的烘焙产品时，所述烘焙产品相较于不使用所述氨基酸序列制备的烘焙产品具有减小的贮存后硬度；或
(f)氨基酸序列，其具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换37、39、46、47、48、49、53、78、80、84、87、94、101、102、103、104、105、106、107、108、110、111、113、115、120、121、127、128、130、133、136、137、150、157、158、159、161、162、163、166、167、169、176、177、179、201、207、210、211、216、219、221、222、223、227、228、232、233、234、237、240、243、247、250、252、255、258、260、266、267、268、269、273、284、285、287、291、292、293、295、296、297、299、300、302、304、306、312、314、315、316、317、319、321、332、355、356、358、360、361、364、367、383、389、391、400、403、404、407、410、411、421、424、447、454、455、478、483、500、521、538、569、581、616、621、636、670、681、684、685、693、709、710，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，所述组合物还包含G4-形成淀粉酶，所述G4-形成淀粉酶具有与SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列。
根据本发明的酶组合物对改进的性质有协同效应，优选地对减小烘焙产品贮存后的硬度和/或减小烘焙产品贮存期间的回弹性损失有协同效应。
在本发明的一个实施方式中，α-淀粉酶多肽与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换
46、48、49、53、78、94、101、103、105、108、110、111、121、127、157、159、161、162、162、166、167、169、201、207、210、211、219、221、227、228、232、233、243、252、255、258、267、287、294、297、300、302、304、314、315、316、317、321、356、358、360、364、367、391、403、404、410、421、454、483、685，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与具有SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列的参照多肽相比，所述α-淀粉酶多肽优选地展示出下述性质中的任一种
-增强的热稳定性，或
-增强的蔗糖耐受性，或
-增加的在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换
46、94、101、103、108、121、161、166、201、221、233、255、287、294、297、314、315、360、404、421，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与具有SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列的参照多肽相比，所述α-淀粉酶多肽具有增强的热稳定性。
蔗糖耐受性
蔗糖耐受性可通过测量在浓度渐增的蔗糖存在时的活性来测定(例如，在0-40(按重量计算)蔗糖存在时，与Phadebas片剂一起在60℃下孵育15分钟。其被表示为在0％蔗糖时的活性的百分比)。活性可利用合适的试验来测定，例如如本文所述的NBAU试验或麦芽三糖试验。
α-淀粉酶多肽变体的蔗糖耐受性可被表示成
[α-淀粉酶多肽在蔗糖存在时的活性]与[α-淀粉酶多肽在不存在蔗糖时的活性]的比率；
其被表示为[具有α-淀粉酶活性的参照多肽在蔗糖存在时的活性]与[具有α-淀粉酶活性的参照多肽在不存在蔗糖时的活性]的比率的百分比。
α-淀粉酶多肽变体的蔗糖耐受性可被表示成
[α-淀粉酶多肽在蔗糖存在时对麦芽三糖的活性]与[α-淀粉酶多肽在不存在蔗糖时对麦芽三糖的活性]的比率；
其被表示为[具有α-淀粉酶活性的参照多肽在蔗糖存在时对麦芽三糖的活性]与[具有α-淀粉酶活性的参照多肽在不存在蔗糖时对麦芽三糖的活性]的比率的百分比。
如此获得的百分比可被用作对α-淀粉酶多肽变体的蔗糖耐受性的测量。蔗糖耐受性高于100％显示：与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的蔗糖耐受性。
在本发明的一方面，与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的蔗糖耐受性，其中所述具有α-淀粉酶活性的参照多肽具有SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列。
在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率
可如下测定在pH4时的活性和在pH5时的活性：利用合适的试验，例如如本文所述的NBAU试验或麦芽三糖试验；并相应地调节pH。
α-淀粉酶多肽变体在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率可被表示成
[在pH4时测定的α-淀粉酶多肽的活性]与[在pH5时测定的α-淀粉酶多肽的活性]的比率；
其被表示为[在pH4时具有α-淀粉酶活性的参照多肽的活性]与[在pH5时参照多肽的活性]的比率的百分比。
根据本发明的α-淀粉酶多肽变体在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率可被表示成
[在pH4时测定的α-淀粉酶多肽对麦芽三糖的活性]与[在pH5时测定的α-淀粉酶多肽对麦芽三糖的活性]的比率；
其被表示为[在pH4时具有α-淀粉酶活性的参照多肽对麦芽三糖的活性]与[在pH5时参照多肽对麦芽三糖的活性]的比率的百分比。
如此获得的百分比可被用作对α-淀粉酶多肽变体在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率的测量。在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率大于100％显示：与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增加的在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率。与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽具有增加的在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率。
在本发明的一方面，与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增加的在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率，其中所述具有α-淀粉酶活性的参照多肽具有SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列。
热稳定性
可如下测定热稳定性：利用合适的试验(例如如本文所述的NBAU试验或麦芽三糖试验)测量在较高温度下孵育(例如在50-100℃下持续1-30分钟)之后的残留活性。
可在合适的pH(例如pH4或pH5)下测定热稳定性。可在蔗糖存在时测定热稳定性。
在本发明的一方面，与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的热稳定性，其中所述具有α-淀粉酶活性的参照多肽具有SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列。
在pH5时的热稳定性
α-淀粉酶多肽变体在pH5时的热稳定性可被表示成
[在pH5、高于37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽的残留活性]与[在pH5、37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽的活性]的比率；
其被表示为[在pH5、高于37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽的残留活性]与[在pH5、37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽的活性]的比率的百分比。
α-淀粉酶多肽变体在pH5时的热稳定性可被表示成
[在pH5、高于37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽对麦芽三糖的残留活性]与[在pH5、37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽对麦芽三糖的活性]的比率；
其被表示为[在pH5、高于37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽对麦芽三糖的残留活性]与[在pH5、37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽对麦芽三糖的活性]的比率的百分比。
如此获得的百分比可被用作对α-淀粉酶多肽变体在pH5时的热稳定性的测量。在pH5时的热稳定性高于100％显示：与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的在pH5时的热稳定性。
在本发明的一方面，与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的在pH5时的热稳定性，其中所述具有α-淀粉酶活性的参照多肽具有SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列。
在pH4时的热稳定性
α-淀粉酶多肽变体在pH4时的热稳定性可被表示成
[在pH4、高于37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽的残留活性]与[在pH4、37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽的活性]的比率；
其被表示为[在pH4、高于37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽的残留活性]与[在pH4、37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽的活性]的比率的百分比。
α-淀粉酶多肽变体在pH4时的热稳定性可被表示成
[在pH4、高于37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽对麦芽三糖的残留活性]与[在pH4、37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽对麦芽三糖的活性]的比率；
其被表示为[在pH4、高于37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽对麦芽三糖的残留活性]与[在pH4、37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽对麦芽三糖的活性]的比率的百分比。
如此获得的百分比可被用作对α-淀粉酶多肽变体在pH4时的热稳定性的测量。在pH4时的热稳定性高于100％显示：与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的在pH4时的热稳定性。
在本发明的一方面，与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的在pH4时的热稳定性，其中所述具有α-淀粉酶活性的参照多肽具有SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列。
在蔗糖存在时的热稳定性
α-淀粉酶多肽变体在蔗糖存在时的热稳定性可被表示成
[在蔗糖存在时，在高于37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽变体的残留活性]与[在不存在蔗糖时，在37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽变体的活性]的比率；
其被表示为[在蔗糖存在时，在高于37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽的残留活性]与[在不存在蔗糖时，在37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽的活性]的比率的百分比。
α-淀粉酶多肽变体在蔗糖存在时的热稳定性可被表示成
[在蔗糖存在时，在高于37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽变体对麦芽三糖的残留活性]与[在不存在蔗糖时，在37℃的温度下孵育后测定的α-淀粉酶多肽变体对麦芽三糖的活性]的比率；
其被表示为[在蔗糖存在时，在高于37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽对麦芽三糖的残留活性]与[在不存在蔗糖时，在37℃的温度下孵育后测定的具有α-淀粉酶活性的参照多肽对麦芽三糖的活性]的比率的百分比。
如此获得的百分比可被用作对α-淀粉酶多肽变体在蔗糖存在时的热稳定性的测量。在蔗糖存在时的热稳定性高于100％显示：与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的在蔗糖存在时的热稳定性。
在本发明的一方面，与具有α-淀粉酶活性的参照多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的在蔗糖存在时的热稳定性，其中所述具有α-淀粉酶活性的参照多肽具有SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列。
多肽
本发明提供酶组合物，其包含至少两种(分离的)具有淀粉降解活性的多肽，即α-淀粉酶和G4-形成淀粉酶。
术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如通常认为的那样)并且每个术语可以按照上下文需要互换使用来指代通过肽键联接的至少两个氨基酸的链。词语“多肽”(或蛋白质)在本文中用于含有多于7个氨基酸残基的链。本文所有的寡肽和多肽的式或序列为从左至右并且以从氨基末端向羧基末端的方向书写。本文所使用的氨基酸的三字母代码是本领域常规已知的，并且可以在Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001)中找到。
本文所使用的氨基酸的单字母代码也是本领域常规已知的，并且可以在Stryer(Biochemistry,第三版,W.H.Freeman and company new York,1975)中找到。
本发明提供包含α-淀粉酶多肽的酶组合物，所述α-淀粉酶多肽包含
(a)SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少99.5％的氨基酸序列；或
(c)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的第100-2157位核苷酸所示多核苷酸编码的氨基酸序列；或
(d)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义；或
(e)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义且所述氨基酸序列的特征在于：当用于制备基于面粉具有至少5重量％糖的烘焙产品时，所述烘焙产品相较于不使用所述氨基酸序列制备的烘焙产品具有减小的贮存后硬度；或
(f)氨基酸序列，其具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换37、39、46、47、48、49、53、78、80、84、87、94、101、102、103、104、105、106、107、108、110、111、113、115、120、121、127、128、130、133、136、137、150、157、158、159、161、162、163、166、167、169、176、177、179、201、207、210、211、216、219、221、222、223、227、228、232、233、234、237、240、243、247、250、252、255、258、260、266、267、268、269、273、284、285、287、291、292、293、295、296、297、299、300、302、304、306、312、314、315、316、317、319、321、332、355、356、358、360、361、364、367、383、389、391、400、403、404、407、410、411、421、424、447、454、455、478、483、500、521、538、569、581、616、621、636、670、681、684、685、693、709、710，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，所述组合物还包含G4-形成淀粉酶，所述G4-形成淀粉酶具有与SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列。
本文所述多肽的一个或多个氨基酸可被替换以改进在宿主细胞中的表达。本文所述多肽的一个或多个氨基酸可被替换以改变酶的比活性，包括蔗糖耐受性或热稳定性。
保守的氨基酸替换是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。
优选的保守氨基酸替换组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的替换变体是其中所公开序列中的至少一个残基被去除并且该位置插入了不同的残基的那些。优选地，氨基酸改变是保守的。对于每个天然存在的氨基酸，优选的保守替换包括：Ala至ser；Arg至Iys；Asn至gln或his；Asp至glu；Cys至ser或ala；GIn至asn；GIu至asp；GIy至pro；His至asn或gln；He至Ieu或val；Leu至ile或val；Lys至arg；gln或glu；Met至leu或ile；Phe至met、leu或tyr；Ser至thr；Thr至ser；Trp至tyr；Tyr至trp或phe；以及Val至ile或leu。
本文所述多肽可以是基本上分离的形式。可以理解，所述多肽可以与不会干扰该多肽的预期目的的载体或稀释剂混合，但仍然被认为是基本上分离的。本发明的多肽还可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，其通常包括制剂中的多肽，其中按重量计所述制剂中超过50％，例如超过80％、超过90％、超过95％或超过99％的多肽是本发明的多肽。
例如，如同已通过任何合适的技术(例如，Smith和Johnson,Gene67:31-40(1988)中披露的单步纯化法)基本上纯化的天然的或重组的多肽，在宿主细胞中重组生产的多肽和蛋白质对于本发明目的被认为是分离的。
本文所述多肽可以是化学修饰的，例如翻译后修饰的。例如，它们可以被糖基化或包含经修饰的氨基酸残基。它们也可以通过添加组氨酸残基或T7标签而被修饰以协助其纯化或通过添加信号序列来促进其从细胞分泌。这类经修饰的多肽和蛋白质落入本发明的术语“多肽”的范围之内。
为了翻译的蛋白质能够分泌到内质网腔、壁膜间隙或胞外环境，可将恰当的分泌信号序列与本发明的多核苷酸融合。此信号对于多肽而言可以是内源的或者它们也可以是异源信号。
本文所述多肽可以以经修饰的形式(例如，融合蛋白)被生产，并且可不仅包含分泌信号还包含额外的异源功能区域。因此，例如，额外的氨基酸(特别是带电荷的氨基酸)区域可被添加到多肽的N-末端以改进纯化期间或随后的操作和贮存期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。此外，多肽部分可被添加至多肽以有利于纯化。
本文所述多肽包括天然纯化的产物、化学合成方法的产物，和通过重组技术由原核或真核宿主(包括，例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。依赖于在重组生产方法中所使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。另外，本发明多肽还可包括最初修饰的甲硫氨酸残基，在一些情况下是宿主介导过程的结果。
α-淀粉酶多肽
本文中的α-淀粉酶多肽是淀粉降解酶。α-淀粉酶多肽变体通常保留α-淀粉酶活性。换言之，α-淀粉酶多肽变体通常具有α-淀粉酶活性。
合适地，可使用由美国谷物化学家协会(AACC)推荐的程序来测定α-淀粉酶的活性。
例如，可使用Megazyme CERALPHAα-淀粉酶试验试剂盒(Megazyme International Ireland Ltd.、Co.Wicklow、爱尔兰)并根据制造商的说明来测定α-淀粉酶的活性。
本文中的α-淀粉酶多肽具有与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列。
在一方面，本文中的α-淀粉酶多肽具有与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少75％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％、在一方面至少99％的氨基酸序列。
在一方面，本文中的α-淀粉酶多肽具有与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少99.5％的氨基酸序列。
本文中的α-淀粉酶多肽包含
(a)SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少99.5％的氨基酸序列；或
(c)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的第100-2157位核苷酸所示多核苷酸编码的氨基酸序列；或
(d)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义；或
(e)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义且所述氨基酸序列的特征在于：当用于制备基于面粉具有至少5重量％糖的烘焙产品时，所述烘焙产品相较于不使用所述氨基酸序列制备的烘焙产品具有减小的贮存后硬度；或
(f)氨基酸序列，其具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换37、39、46、47、48、49、53、78、80、84、87、94、101、102、103、104、105、106、107、108、110、111、113、115、120、121、127、128、130、133、136、137、150、157、158、159、161、162、163、166、167、169、176、177、179、201、207、210、211、216、219、221、222、223、227、228、232、233、234、237、240、243、247、250、252、255、258、260、266、267、268、269、273、284、285、287、291、292、293、295、296、297、299、300、302、304、306、312、314、315、316、317、319、321、332、355、356、358、360、361、364、367、383、389、391、400、403、404、407、410、411、421、424、447、454、455、478、483、500、521、538、569、581、616、621、636、670、681、684、685、693、709、710，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，所述组合物还包含G4-形成淀粉酶，所述G4-形成淀粉酶具有与SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列。
在一个实施方式中，α-淀粉酶多肽包含与具有SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的多肽(其具有α-淀粉酶活性)的同一性为至少99.5％、优选地至少99.6％、优选地至少99.7％、优选地至少99.8％、优选地至少99.9％的氨基酸序列。通常，SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示的天然存在的氨基酸序列是优选的。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
如本领域技术人员已知的，有可能SEQ ID NO:2或根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列中成熟α-淀粉酶多肽(如第34-719位氨基酸所示)的N-和/或C-末端由于成熟期间加工中的变化而可以是异源的。特别地，所述加工变化可在多肽过表达时发生。此外，外切蛋白酶活性可引起异源性。异源性发生的程度也取决于所使用的宿主和发酵方案。这样的C-末端加工的人工制品可导致SEQ ID NO:2或根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列中成熟多肽所示的更短的多肽或更长的多肽。由于这样的加工变化，N-末端也可以是异源的。N-末端的加工变体可以是由于信号肽酶对信号序列的可替换性切割。
在一个方面，α-淀粉酶多肽与SEQ ID NO:2中所示序列的序列同一性为至少99.5％。
SEQ ID NO:2的多肽的序列可被如此修饰以提供本发明的多肽。可进行氨基酸替换，例如1、2、3或4个替换。经修饰的多肽保留如α-淀粉酶的活性。
在一个方面，α-淀粉酶多肽与具有SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列或具有SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的多肽的同一性为至少70％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％、在一方面至少99.5％。
优选地，所述多肽具有这样的氨基酸序列，当与SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列比对时，所述氨基酸序列包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。优选地，所述α-淀粉酶至少包含第297位的Ala，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽可包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少两个，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。优选地，所述多肽至少包含：第184位的Asp和第297位的Ala；第297位的Ala和第368位的Thr；或第297位的Ala和第489位的Asn，所有所述位置均参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽可包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少三个，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。优选地，所述多肽至少包含：第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn；第184位的Asp、第297位的Ala和第368位的Thr；或第184位的Asp、第297位的Ala和第489位的Asn，所有所述位置均参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽可包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所有所述位置均参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少80％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少85％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少90％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少95％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少80％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少85％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少90％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少95％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少99.5％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义；且所述氨基酸序列的特征在于：当用于制备基于面粉具有至少5重量％糖的烘焙产品时，所述烘焙产品相较于不使用所述氨基酸序列制备的烘焙产品具有减小的贮存后硬度。
α-淀粉酶多肽的实施方式包括但不限于这样的多肽，所述多肽具有α-淀粉酶活性，且与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、251、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、351、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、451、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、551、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、651、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包括但不限于这样的多肽，所述多肽具有α-淀粉酶活性，且与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换34、35、40、45、73、74、76、77、79、86、95、99、100、103、119、120、131、141、142、148、152、163、169、171、172、174、176、187、188、192、201、203、220、234、236、247、249、261、266、268、272、275、276、280、281、285、287、297、299、305、316、320、321、327、341、342、348、365、371、375、378、397、381、389、401、403、425、436、442、454、468、474、479、483、486、487、493、494、495、496、497、498、500、507、510、513、520、526、555、564、573、575、581、583、586、589、595、618、621、624、629、636、645、664和/或681，所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包括但不限于这样的多肽，所述多肽具有α-淀粉酶活性，且与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换37、39、46、47、48、49、53、78、80、84、87、94、101、102、103、104、105、106、107、108、110、111、113、115、120、121、127、128、130、133、136、137、150、157、158、159、161、162、163、166、167、169、176、177、179、201、207、210、211、216、219、221、222、223、227、228、232、233、234、237、240、243、247、250、252、255、258、260、266、267、268、269、273、284、285、287、291、292、293、295、296、297、299、300、302、304、306、312、314、315、316、317、319、321、332、355、356、358、360、361、364、367、383、389、391、400、403、404、407、410、411、421、424、447、454、455、478、483、500、521、538、569、581、616、621、636、670、681、684、685、693、709、710，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义。
在一个方面，α-淀粉酶多肽包括但不限于这样的多肽，所述多肽具有α-淀粉酶活性，且与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％并具有对应于F221L、D321G、T294P的任何一个或多个替换，所述位置参照SEQ ID NO:2来定义。
换言之，当将α-淀粉酶多肽序列与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸序列比对时，变体将包含至少一个在如下位置(在变体中)的替换，所述位置对应于以上所示的SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸中的一个位置。在该语境中，“替换”表示：对应于以上所示的SEQ ID NO:2中的一个位置的变体中的位置包含不出现在SEQ ID NO:2中该位置上的氨基酸残基。
α-淀粉酶多肽变体可包含在一个或多个所述位置的替换，例如在2个、3个、4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个或在所有所述位置的替换。
α-淀粉酶多肽变体可包含一个或多个如上文所限定的替换。在该语境中，“替换”表示：对应于SEQ ID NO:2中以上所示位置中的一个的变体中的位置包含不出现在亲本α-淀粉酶多肽(亲本α-淀粉酶多肽优选地是SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的多肽)的该位置的氨基酸残基。
α-淀粉酶多肽变体可使用本文所述替换的任意组合来产生。
在本发明的一方面，α-淀粉酶多肽变体具有这样的氨基酸序列，当与包含SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示序列的α-淀粉酶比对时，其包含第116位氨基酸残基的替换，所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示多肽来定义。
在本发明的一方面，α-淀粉酶多肽变体具有这样的氨基酸序列，当与包含SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示序列的α-淀粉酶比对时，其包含第116位氨基酸残基的替换，所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示多肽来定义，其中所述替换是S166L。
在本发明的一方面，α-淀粉酶多肽变体具有这样的氨基酸序列，当与包含SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示序列的α-淀粉酶比对时，其包含第587位氨基酸残基的替换，所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示多肽来定义。
在本发明的一方面，α-淀粉酶多肽变体具有这样的氨基酸序列，当与包含SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示序列的α-淀粉酶比对时，其包含第587位氨基酸残基的替换，所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示多肽来定义，其中所述替换是A587G。
与参照α-淀粉酶多肽相比，α-淀粉酶多肽变体还可包含在不同于上文所指明那些位置的额外修饰，例如，一个或多个额外的替换、添加或缺失。α-淀粉酶多肽变体可包含不同类型的这种修饰的组合。α-淀粉酶多肽变体可包含1个、2个、3个、4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或更多个这样的修饰(其可全部为相同的修饰类型或可为不同的修饰类型)。额外的修饰通常可以是替换。
本文的α-淀粉酶多肽变体具有与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列。
在一方面，本文的α-淀粉酶多肽变体具有与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的同一性为至少75％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％、在一方面至少99％的氨基酸序列。
在一方面，本文的α-淀粉酶多肽变体具有与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的同一性为至少99.5％的氨基酸序列。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换
46、94、101、103、108、121、161、166、201、221、233、255、287、294、297、314、315、360、404、421，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增强的热稳定性。
在本发明的一个方面，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的热稳定性；且与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的氨基酸序列的同一性为至少75％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％、在一方面至少96％、在一方面至少97％、在一方面至少98％、在一方面至少99％、在一方面至少99.5％。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并具有至少一个对应于如下的氨基酸残基替换
Q46E、L94F、T101A、W103Y、L108F、G121A、F161I、S166T、F201Y、F221I、S233N、A255V、V287F、D294G、A297S、V314L、L315F、L315M、L315I、L315T、N360S、N404G、A421L，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增强的热稳定性。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换
94、108、121、166、201、221、233、255、287、297、314、360、46、103、161、315、421、294，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增强的在pH5时的热稳定性。
在本发明的一个方面，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的在pH5时的热稳定性；且与SEQ IDNO:2的第34-317位氨基酸所示的氨基酸序列的同一性为至少75％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％、在一方面至少96％、在一方面至少97％、在一方面至少98％、在一方面至少99％、在一方面至少99.5％。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并具有至少一个对应于如下的氨基酸残基替换
L94F、L108F、G121A、S166T、F201Y、F221I、S233N、A255V、V287F、A297S、V314L、N360S、Q46E、W103Y、F161I、L315F、L315M、L315M、A421L、D294G，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增强的在pH5时的热稳定性。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换
121、221、233、255、103、315、315、315、315、315，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增强的在pH4时的热稳定性。
在本发明的一个方面，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的在pH4时的热稳定性；且与SEQ IDNO:2的第34-317位氨基酸所示的氨基酸序列的同一性为至少75％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％、在一方面至少96％、在一方面至少97％、在一方面至少98％、在一方面至少99％、在一方面至少99.5％。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并具有至少一个对应于如下的氨基酸残基替换
G121A、F221I、S233N、A255V、W103Y、L315F、L315I、L315M、L315T、L315M，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增强的在pH4时的热稳定性。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换
94、108、166、201、221、233、287、297、314、360、404、101、103、315、421、294，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增强的在蔗糖存在时的热稳定性。
在本发明的一个方面，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的在蔗糖存在时的热稳定性；且与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的氨基酸序列的同一性为至少75％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％、在一方面至少96％、在一方面至少97％、在一方面至少98％、在一方面至少99％、在一方面至少99.5％。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并具有至少一个对应于如下的氨基酸残基替换
L94F、L108F、S166T、F201Y、F221I、S233N、V287F、A297S、V314L、N360S、N404G、T101A、W103Y、L315F、L315I、L315M、L315T、L315M、A421L、D294G，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增强的在蔗糖存在时的热稳定性。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换
48、49、78、108、127、127、162、167、207、210、211、219、227、243、267、287、314、356、358、391、404、685、46、103、105、315、315、315、316、316、317、294、110、121、111、167、166，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增强的蔗糖耐受性。
在本发明的一个方面，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增强的蔗糖耐受性；且与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的氨基酸序列的同一性为至少75％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％、在一方面至少96％、在一方面至少97％、在一方面至少98％、在一方面至少99％、在一方面至少99.5％。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并具有至少一个对应于如下的氨基酸残基替换
I48V、I49T、M78L、L108V、T127A、T127P、V162A、T167S、I207L、W210F、D211N、K219Q、F227Y、L243F、N267P、V287F、V341L、T356N、I358F、S391A、N404G、F685I、Q46E、W103Y、S105T、L315F、L315M、L315T、D316N、D316S、F317W、D294G、N110C、N121C、L111C、T167C、S166L，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增强的蔗糖耐受性。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并在第110位和第121位两个位置具有半胱氨酸或在第111位和第167位两个位置具有半胱氨酸，所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增强的蔗糖耐受性。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换
157、159、162、169、201、219、228、232、252、255、300、302、304、321、358、364、403、410、454、483、685、53、101、105、258、315、367，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增加的在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率。
在本发明的一个方面，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的多肽相比，α-淀粉酶多肽变体具有增加的在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率；且与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的氨基酸序列的同一性为至少75％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％、在一方面至少96％、在一方面至少97％、在一方面至少98％、在一方面至少99％、在一方面至少99.5％。
在本发明的一个方面，α-淀粉酶多肽变体与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸中所示氨基酸序列的同一性为至少70％，
并具有至少一个对应于如下的氨基酸残基替换
V157I、V159I、V1262A、F169A、F201Y、K219Q、S228A、L232F、A252D、A255V、A255I、H300N、E302D、V304T、T321S、T321N、I358F、S364D、G403N、G410A、I454V、T483S、F685I、Y53L、Y53V、T101A、T101G、S105T、L258F、L315I、L315M、L367H，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示的参照多肽相比，所述变体具有增加的在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率。
用于生产具有1个或多个替换的α-淀粉酶多肽(即，变体)的核酸分子可利用本领域技术人员众所周知的标准分子生物学技术并结合本文所提供的序列信息来产生。
例如，可使用标准的合成技术，从头合成所需的核酸分子。这种合成方法通常是自动化方法。
或者，可通过利用现有核酸分子(例如，野生型核酸分子)的定点突变来产生用于生产本文所述α-淀粉酶多肽的核酸分子。可利用一些本领域技术人员众所周知的技术来进行所述定点突变。
在一个这样的方法中(此处仅作为例子提及)，在质粒模板上使用编码期望替换的寡核苷酸“引物”来进行PCR。由于引物是新合成链的末端，因此在结合模板DNA链的第一循环期间应该存在错配，在该第一轮之后，基于引物的链(含有突变)将与原始模板的浓度相等。在连续循环之后，它将以指数方式增长，25个循环之后，它将在数量上超过原始、未突变链8百万：1左右，从而产生几乎均一的突变的扩增片段的溶液。然后，可通过利用例如使用仅切割甲基化DNA的限制酶(例如Dpn1)酶促消化来除去模板DNA。在这个步骤中，来源于碱裂解质粒制备并因此被甲基化的模板被破坏，但突变的质粒被保留，因为它在体外产生且结果未被甲基化。
在这种方法中，可在单个PCR反应中向核酸分子中引入多于一个突变(编码如本文所述的替换)，例如通过使用一个或多个各自包含一个或多个错配的寡核苷酸。或者，可通过进行多于一个PCR反应来向核酸分子中引入多于一个突变，其中每个反应引入一个或多个突变，因此以连续、重复的方式将改变的核酸引入核酸中。
用于生产本文所述α-淀粉酶多肽的核酸分子可以通过使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和恰当的错配寡核苷酸引物，根据如上所述的定点突变技术来产生。以这种方式产生的核酸分子可被克隆到恰当的载体中并通过DNA序列分析进行表征。
G4-形成淀粉酶
优选地，本文的G4-形成淀粉酶具有与SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列。
Pseudomonas saccharophila表达麦芽四糖-形成麦芽四糖水解酶(EC3.2.1.60)，它在此处和之后还可被称为G4-形成淀粉酶。编码G4-形成淀粉酶的P.saccharophila基因的核苷酸序列已被测定。Zhou等人,"Nucleotidesequence of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas saccharophila,"FEBS Lett.255:37-41(1989)；GenBank Ace.No.X16732。
合适的G4-形成淀粉酶或其变体可包括G4-形成淀粉酶(也被称为麦芽四糖水解酶)，如WO9950399、WO2005007818、WO2004111217、WO2005003339、WO2005007818、WO2005007867、WO2006003461、WO2007007053、WO2007148224、WO2009083592、WO2009088465、WO2010133644、WO2010118269或WO2010132157中的任一个所述。
合适的G4-形成淀粉酶可包括这样的G4-形成淀粉酶，其具有与SEQ IDNO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列并具有在任意一个如下位置的替换
7、8、32、38、49、62、63、64、67、72、73、74、75、76、104、106、107、110、112、116、119、122、123、124、125、126、128、130、137、138、140、142、143、144、148、149、150、151、154、156、163、164、168、169、182、183、192、195、196、200、202、208、213、220、222、225、226、227、232、233、234、236、237、239、253、255、257、260、264、267、269、271、276、282、285、295、297、300、302、305、308、312、323、324、325、341、358、367、379、390，所述位置参照SEQ ID NO:4来定义。
合适的G4-形成淀粉酶可包括这样的G4-形成淀粉酶，其具有与SEQ IDNO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列并具有在任意一个如下位置的替换
121、161、223、146、157、158、198、229、303、306、309、316、353、26、70、145、188、272、339，所述位置参照SEQ ID NO:4来定义。
合适的G4-形成淀粉酶可包括这样的G4-形成淀粉酶，其具有与SEQ IDNO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列并具有在任意一个如下位置的替换
3、33、34、70、121、134、141、146、157、161、178、179、229、307、309、334，所述位置参照SEQ ID NO:4来定义。
合适的G4-形成淀粉酶可包括这样的G4-形成淀粉酶，其具有与SEQ IDNO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列并具有在任意一个如下位置的替换
134、141、157、223、307、334，所述位置参照SEQ ID NO:4来定义。
合适的G4-形成淀粉酶可包括这样的G4-形成淀粉酶，其具有与SEQ IDNO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列并在第121位和第223位中任一个位置具有替换(优选地是G121D和/或G223A)，所述位置参照SEQ ID NO:4来定义。第223位的替换还可包含G223L。在一个方面，G4-形成淀粉酶可包括这样的G4-形成淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列并在第33位(优选地是N33，更优选地是N33Y)、第34位(优选地是D34，更优选地是D34N)、第178位和第179位具有替换。
合适的G4-形成淀粉酶可包括WO2009061380的SEQ ID NO:18。
合适的G4-形成淀粉酶可包括具有SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的多肽。G4-形成淀粉酶的一个实施方式可包括具有如本文所公开的SEQ IDNO:5中所示氨基酸序列的多肽。G4-形成淀粉酶的一个实施方式可包括具有如WO2009061380所公开的SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列的多肽。
G4-形成淀粉酶是尤其能够催化淀粉降解的酶。具体地，它能够切割淀粉中的α-D-(l—>4)O-糖苷键。它可被称为葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)。它还可被称为麦芽四糖水解酶。
Pseudomonas saccharophila(GenBank Acc.No.X16732)表达G4-形成淀粉酶。
G4-形成淀粉酶可以是由Pseudomonas saccharophila表达的G4-形成淀粉酶，如SEQ ID NO:4中所示的多肽或其变体。G4-形成淀粉酶能够在高温(例如，约60℃-约75℃)下从液化的淀粉或其它麦芽糊精来源生产麦芽四糖。
当在本文中使用时，术语淀粉指的是包含复杂的植物(例如玉米)多糖碳水化合物(包含直链淀粉和支链淀粉)的任何材料。
具有G4-形成活性的淀粉酶以一定水平定量加入以实现恰当的烘焙效果。合适的用于测定G4-形成淀粉酶活性的试验包括本领域已知的试验，例如Betamyl试验(Megazyme)；Phadebas试验(Pharmacia&UpjohnDiagnostics AB)。还可以应用如本文所述的NBAU试验(如本文所述的Ceralpha,Megazyme)。
在一个方面，G4-形成淀粉酶具有与SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少75％、在一方面至少80％、在一方面至少85％、在一方面至少90％、在一方面至少95％、在一方面至少99％的氨基酸序列。
序列同一性
术语“同源性”、“同一性百分比”和“同源性百分比”在本文可互换使用。为了本发明的目的，本文中定义：为了确定两氨基酸序列或两多核苷酸序列(本文也被称为核酸序列)的同源性百分比，序列以最佳比较为目的而被比对。为了优化两序列之间的比对，可以向所比较的两序列中的任一个中引入缺口。所述比对可以在被比较序列的全长上进行。或者，比对可以在更短的长度上进行，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。同源性百分比或同一性百分比是在报道的对比区域上两序列之间相同匹配的百分比。
序列的比较以及两序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。本领域技术人员知道若干不同的计算机程序能够用于比对两序列并确定两序列之间的同源性这一事实(Kruskal,J.B.(1983)An overview ofsequence comparison In D.Sankoff and J.B.Kruskal,(ed.),Time warps,stringedits and macromolecules:the theory and practice of sequence comparison,第1-44页Addison Wesley)。两氨基酸序列之间或两核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用用于比对两序列的Needleman和Wunsch算法来确定。(Needleman,S.B.and Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和多核苷酸序列两者都可以用算法比对。Needleman-Wunsch算法已经在计算机程序NEEDLE中实施。为了本发明的目的，使用来自EMBOSS软件包的NEEDLE程序(2.8.0或更高版本,EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.and Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)第276—277页,http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62作为替换矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。使用的可选参数是缺口开放罚分为10和缺口延伸罚分为0.5。本领域技术人员应该理解：所有这些不同的参数会产生稍微不同的结果，但是，使用不同算法时两序列的整体百分比同一性不会显著改变。
通过如上所述的NEEDLE程序比对之后，如下计算查询序列和本发明的序列之间的百分比：在比对中两序列显示为相同氨基酸或相同核苷酸的相应位点的数目除以减去比对中缺口总数之后的比对总长度。本文中所定义的同一性百分比可以通过使用NOBRIEF选项由NEEDLE获得并且在程序的输出中被标记为“最长同一性”。
本发明的多核苷酸和蛋白质序列还可被用作“查询序列”来进行对公众数据库的搜索，例如，来鉴定其它家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行此类搜索。可以用NBLAST程序，以分数＝100，字长＝12来进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的多核苷酸同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，以分数＝50，字长＝3来进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的缺口比对，可以利用Altschul等人.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。见国家生物技术信息中心的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
脂解酶
脂解酶(在本文中也被称为脂肪酶)是水解甘油三酯和/或半乳糖脂和或磷脂的酶。
脂肪酶的活性可以用分光光度法通过使用显色底物棕榈酸对硝基苯基酯(pNPP，Sigma N-2752)来测定。在该试验中，pNPP溶解于2-丙醇(每10ml 2-丙醇(Merk 1.09634)40mg pNPP)，并悬浮于pH＝5.0含1.0％的Triton X-100(Merkl.12298)的100mM乙酸盐缓冲液中(45ml缓冲液中5ml底物)。最终的底物浓度为1.1mM。脂肪酶用该底物溶液在37℃下孵育10分钟。通过相对于所述反应混合物以1:1的比例加入终止缓冲液2％Tris(Merk 1.08387)+1％的Triton X-100使反应终止，然后在405nm下测量形成的对硝基苯酚(pNP)。该试验也可以在不同的pH值下进行，以确定脂肪酶的pH依赖性。应当理解，不同的pH值可需要不同的缓冲液，或为了乳化底物不同的清洁剂去污可能是必要的。一个脂肪酶单位被定义为在所述反应条件下每分钟释放1微摩尔的对硝基苯酚的酶的量。应当理解，下述内容不是常规分析中不常见的实践：使用标准校准酶溶液(其具有在不同的试验中测定的已知活性)校正给定的试验的活性(其具有在校准试验中将被测定的单位)。
或者，脂肪酶活性可以通过使用2,3-巯基-1-丙醇-丁酸(TBDMP)作为底物来测定。脂肪酶水解TBDMP的硫酯键从而释放丁酸以及2,3-巯基-1-丙醇-二丁酸酯、2,3-巯基-1-丙醇-单丁酸酯或2,3-巯基-1-丙醇。释放的硫醇基在随后的反应中用4,4,-二硫代二吡啶(DTDP)滴定形成4-硫代吡啶酮。后者与在334nm吸收的4-巯基吡啶处于互变异构平衡。反应在含有0.2％的Triton-X100、0.65mM TBDMP和0.2mM DTDP的pH5.0的0.1M醋酸盐缓冲液中在37℃下进行。一个脂肪酶单位被定义为在所述反应条件下每分钟释放1微摩尔的4-硫代吡啶酮的酶的量。
除了分光光度测量，脂肪酶活性还可以使用滴定测量来测定。例如脂解酶的酯酶活性可以根据Food Chemical Codex,第四版,National AcademyPress,1996,第803页在三丁酸甘油酯作为底物时测量。
磷脂酶是催化脂肪酰基从磷脂中释放的酶。其可以是磷脂酶A2(PLA2，EC 3.1.1.4)或磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)。其可以或可以不具有其它的活性，如三酰甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)和/或半乳糖脂酶(EC3.1.1.26)的活性。
磷脂酶可以是来自哺乳动物或微生物来源的天然酶。
哺乳动物磷脂酶的一个例子是胰腺PLA2，例如牛或猪PLA2，例如商业产品Lecitase 10L(猪PLA2，Novozymes A/S的产品)。
微生物的磷脂酶可以来自Fusarium，如F.oxysporum磷脂酶A1(WO1998/026057)、F.venenatum磷脂酶A1(作为磷脂酶A2被描述在WO2004/097012中，称为FvPLA2)，来自块菌属(Tuber)，例如T.borchii磷脂酶A2(称为TbPLA2，WO 2004/097012)。
磷脂酶还可以是具有磷脂酶活性的脂解酶变体，例如如WO2000/032758或WO 2003/060112所描述的。
磷脂酶也可催化脂肪酰基从存在于面团的其它脂质特别是小麦脂质中释放。因此，磷脂酶可以具有三酰甘油脂肪酶活性(EC 3.1.1.3)和/或半乳糖脂酶活性(EC 3.1.1.26)。
磷脂酶可以是如WO2009/106575中所述的脂解酶，如商业产品DSM的产品。
三酰基甘油脂肪酶可以是真菌脂肪酶，优选地来自Rhizopus、Aspergillus、Candida、Penicillum、Thermomyces或Rhizomucor。在一个实施方式中，三酰基甘油脂肪酶来自Rhyzopus，在另一个实施方式中，使用来自Rhyzopus oryzae的三酰基甘油脂肪酶。任选地，可以使用两种或更多种三酰基甘油脂肪酶的组合。
纤维素酶
纤维素酶可来自A.niger或来自Trichoderma reesei。
淀粉葡糖苷酶
淀粉葡糖苷酶可以是来自Aspergillus的淀粉葡糖苷酶，例如来自A.oryzae或A.niger、优选地来自A.niger的淀粉葡糖苷酶。
额外的酶
额外的酶可包括但不限于如WO2006/032281、WO2008/148845、WO2006/012902、WO2006/012899、WO2004/081171、WO99/43793或WO2005/066338中所公开的酶。
预混合物
术语“预混合物”在本文中被定义为以其常规含义来理解，即，作为烘焙剂的混合物(通常包含面粉)，其不仅可被用于工业面包烘焙工厂/设备中，还可被用于零售面包店中。可如下制备预混合物：将α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶或根据本发明的酶组合物与合适的载体(例如面粉、淀粉或盐)混合。预混合物可包含如本文中所提及的添加剂。
烘焙产品
术语“烘焙产品”指的是由面团制备的烘焙食品。
可有利地通过本发明生产的烘焙产品(白、棕或全麦类型)的实例包括，通常为条状或卷状形式的面包(特别是白面包、全麦面包或黑麦面包)、法棍型(French baguette-type)面包、油酥糕点(pastries)、牛角面包、黄油鸡蛋面包(brioche)、意大利节日蛋糕(panettone)、通心粉、面条(煮或(翻)炒)、皮塔饼和其它扁面包、玉米饼、玉米卷、蛋糕、薄烤饼、饼干尤其是酥饼干(biscuits)、甜甜圈、包括酵母发酵的甜甜圈、百吉饼、馅饼皮、馒头、脆面包、布朗尼、单层蛋糕(sheet cakes)、休闲食品(如椒盐卷饼(pretzel)、玉米片、合成点心、合成薯片)。术语烘焙产品包括，含有2-30重量％糖的面包、含有水果的面包、早餐谷物、谷物棒、不含蛋的蛋糕、软面包卷和无麸质面包。此处及之后的无麸质面包是含有至多20ppm麸质的面包。几种谷类和淀粉来源被认为是对于无麸质饮食可以接受的。常用的来源是土豆、大米和木薯淀粉(tapioca)(来自木薯(cassava))。烘焙产品包括但不限于模制面包、面包块、绞花面包、小圆面包如汉堡小圆面包或小圆慢头、印度薄饼(chapati)、面包干、干馒头片、面包屑、无酵饼(matzos)、佛卡夏面包(focaccia)、梅尔巴吐司(melba toast)、特制加蛋烤面包片(zwieback)、烤面包丁(croutons)、软脆饼干、软和硬面包、面包条、酵母发酵和化学发酵的面包、叠层面团产品如丹麦糕点、牛角面包或泡芙糕点产品、松饼(muffin)、丹麦包、百吉饼、糖果包衣、薄饼干(crackers)、威化饼、比萨饼皮、玉米饼、通心粉产品、油煎薄饼、华夫饼、半烘焙(parbaked)产品及冷藏的和冷冻的面团产品。
半烘焙产品的例子包括但不限于在销售或消费时通过短暂的第二烘焙过程完成的部分烘焙的面包。
面包可以是白的盘式面包(pan bread)或棕的盘式面包；这种面包可以例如使用所谓的美式中种发酵法(Sponge和Dough Method)或美式直接方法(Direct method)来制造。
本文中的术语玉米饼包括玉米玉米饼和小麦玉米饼。玉米玉米饼是薄的、扁的面包类型，通常由细磨的玉米(maize)(在美国通常称为“玉米(corn)”)未经发酵制成。面粉玉米饼是薄的、扁的面包类型，通常由细磨小麦面粉未经发酵制成。术语玉米饼还包括来自南美的被称作阿瑞巴(arepa)的类似面包，尽管阿瑞巴通常比玉米饼厚得多。术语玉米饼还包括烙饼(Iaobing)，一种来自中国的比萨形状的厚"薄烤饼"，以及基本上由小麦面粉制成的印度烤饼(Indian Roti)。玉米饼通常具有圆形或椭圆形的形状，其直径可由约6cm至超过30cm变化。
面团
术语“面团”在本文定义为面粉和其它成分的混合物。一方面，面团足够紧实以揉捏或滚动。面团可以是新鲜的、冷冻的、制备好的或半烘焙的。冷冻面团的制备由Kulp和Lorenz在Forzena and Refrigerated Doughs andBatters中描述。
面团用面团成分制作，所述面团成分包括但不限于(谷物)面粉，卵磷脂来源包括蛋，水，盐，糖，调味剂，脂肪来源包括黄油、人造黄油、油和起酥油，发面酵母、化学发酵系统如酸(产生化合物)和碳酸氢盐的组合，蛋白质来源包括奶、大豆粉，氧化剂(包括抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺(ADA))，还原剂(包括L-半胱氨酸)，乳化剂(包括单/二甘油酯，单甘油酯例如单硬脂酸甘油酯(GMS))、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、脂肪酸聚甘油酯(PGE)和二乙酰酒石酸单和双甘油酯(DATEM)，胶(包括瓜尔豆胶和黄原胶)，调味剂，酸(包括柠檬酸、丙酸)，淀粉，改性淀粉，麸质，湿润剂(包括甘油)和防腐剂。
谷物包括玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦、藜麦、斯佩尔特小麦、单粒小麦、二粒小麦、硬粒小麦和卡姆小麦。
面团通常是由基本面团成分制作，所述基本面团成分包括(谷物)面粉如小麦花或米粉、水和任选地盐。对于被发酵的产品，主要使用发面酵母，接着是例如酸(产生化合物)和碳酸氢盐的组合的化学发酵系统。
本文的术语面团包括面糊。面糊是一种或更多种面粉与例如水、乳或蛋的液体相组合的半液体混合物，其足够稀薄，能够从勺中落下或倒出，其用于制备多种食品包括蛋糕。
面团可以使用混合物制作，所述混合物包括蛋糕混合物、酥饼干混合物、布朗尼混合物、面包混合物、薄烤饼混合物和油煎薄饼混合物。
术语面团包括冷冻的面团，也被称为冷藏的面团。有不同类型的冷冻的面团；在发面前冷冻的面团和在部分或完全发面阶段之后冷冻的面团。冷冻的面团通常用于制造烘焙产品，包括但不限于酥饼干、面包、面包条和牛角面包。
协同效应
α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶的组合使用对减小烘焙产品贮存后的硬度和/或减小烘焙产品贮存期间的回弹性损失有协同效应。
α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶的组合对本文所述改进的性质可有协同效应。所述改进的性质可包括但不限于：增加的面团强度、增加的面团弹性(elasticity)、增加的面团稳定性、减小的面团粘性、改进的面团延展性、改进的面团可加工性、增加的烘焙产品体积、改进的烘焙产品风味、改进的烘焙产品内芯结构、改进的烘焙产品的内芯柔软性，减少的烘焙产品起泡、改进的脆性、改进的初始回弹性以及特别地贮存后回弹性两者、减小的贮存后硬度和/或改进的烘焙产品的抗老化性。
改进的性质可包括更快的面团的面团形成时间和/或减小的面团的面团粘性。
改进的性质可包括改进的烘焙产品可折叠性，如玉米饼、薄烤饼、扁面包、比萨饼皮、烤饼(roti)和/或面包片的改进的可折叠性。
改进的性质可包括改进的烘焙产品柔韧性，包括玉米饼、薄烤饼、扁面包、比萨饼皮、烤饼和/或面包片的改进的柔韧性。
改进的性质可包括改进的扁烘焙产品的可堆叠性，所述扁烘焙产品包括玉米饼、薄烤饼、扁面包、比萨饼皮、烤饼。
改进的性质可包括减小的面条粘性和/或增强的面条柔韧性。
改进的性质可包括减小的经烹饪面条的结块性和/或改进的面条风味甚至贮存一段时间后的面条风味。
改进的性质可包括减少的薄饼干(cracker)产品中的发丝裂缝的形成，以及产生发酵效果和改进的风味形成。
改进的性质可包括改进的口感和/或改进的挤压时的柔软性。
改进的性质可包括减少的运输过程中的损坏，包括减少的运输过程中的破裂。
改进的性质可包括减小的无麸质面包贮存后的硬度。
改进的性质可包括改进的无麸质面包的回弹性。改进的性质可以包括改进的无麸质面包的初始回弹性以及特别地贮存后回弹性两者。
改进的性质可包括减小的黑麦面包贮存后硬度。
改进的性质可包括减小的黑麦面包贮存期间的回弹性损失。
改进的性质可包括改进的可切片性。这可通过观察切片后面包屑的量来证明。较少的面包屑指示较好的可切片性。
改进的性质可包括改进的内芯结构和/或回弹性，而不创造胶粘性。
改进的性质可包括减小的烘焙产品贮存期间的回弹性损失，所述烘焙产品基于面粉包含至少5重量％的糖、在一方面包含至少8重量％的糖、在一方面包含至少12重量％的糖、在一方面包含至少15重量％的糖。基于面粉在一方面包含至少18重量％的糖、在一方面包含至少20重量％的糖、在一方面包含至少25重量％的糖、在一方面包含至少30重量％的糖。因此，例如，5％表示：配方中使用的每1000g面粉有50g糖。
改进的性质可包括减小的烘焙产品的贮存后硬度，所述烘焙产品基于面粉包含至少5重量％的糖、在一方面包含至少8重量％的糖、在一方面包含至少12重量％的糖、在一方面包含至少15重量％的糖。基于面粉在一方面包含至少18重量％的糖、在一方面包含至少20重量％的糖、在一方面包含至少25重量％的糖、在一方面包含至少30重量％的糖。因此，例如，5％表示：配方中使用的每1000g面粉有50g糖。
可如下测定协同效应(也可被称为协同作用)：单独以及组合添加α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶来制作面团或烘焙产品，然后比较效果；当组合产生比单独使用的每种酶更好的效果时，即指示协同作用。比较可以在组合与双倍剂量的每种单独的酶之间进行，基于所加入的具有限定的酶活性/酶的ppm或者基于以面粉的重量或最终产品的重量加入的酶的活性。如果Y ppm酶A+Z ppm酶B的效果强于2Y ppm酶A的效果且强于2Z ppm酶B的效果，则可认为出现了所述协同作用。
因此，例如，如果50ppm酶A+5ppm酶B的效果强于100ppm酶A的效果且强于10ppm酶B的效果，则可认为出现了所述协同作用。
或者，可利用相同的总酶剂量(每kg面粉或单位重量最终产物中纯净的酶蛋白)来进行比较。如果利用组合比利用任一种单独酶的效果强，这可被视为指示协同作用。例如，如果0.5mg酶A+1.0mg酶B的效果强于1.0mg酶A的效果且强于2.0mg酶B的效果，则可认为出现了协同作用。
酶的合适剂量通常可被发现在0.01-20mg酶蛋白/kg面粉、特别地0.1-10mg/kg的范围内。可通过如下发现组合中两种酶中的每一种的合适剂量：首先确定每种单独酶的合适剂量(例如，最佳剂量，即产生最强效果的剂量)，然后对于组合中的每种酶，使用30-67％(例如33-50％，特别地50％)的该剂量。同样，如果使用组合的效果强于单独使用的任一种酶的效果，则这可被视为指示协同作用。
在根据本发明的酶组合物的一个实施方式中，所述组合物包含额外的酶。
在根据本发明的酶组合物的一个实施方式中，所述组合物包含至少一种额外的酶、在一方面2种额外的酶、在一方面3种额外的酶。
例如，α-淀粉酶可在与G4-形成淀粉酶组合之前，与额外的酶组合。组合可包括但不限于混合或共同添加到面团成分中。
额外的酶可以是如US 4,598,048中所述的酶，US 4,598,048描述了麦芽糖淀粉酶的制备。
在根据本发明的酶组合物的一个实施方式中，额外的酶选自由淀粉酶、其它α-淀粉酶、β-淀粉酶、环糊精葡萄糖基转移酶、蛋白酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、三酰基甘油脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、漆酶、或氧化酶、己糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧合酶或L-氨基酸氧化酶和淀粉葡糖苷酶组成的组。
在根据本发明的酶组合物的一个实施方式中，额外的酶是脂解酶，优选地是磷脂酶、半乳糖脂酶或具有磷脂酶和半乳糖脂酶两种活性的酶。
在根据本发明的组合物的一个实施方式中，额外的酶是磷脂酶。
在根据本发明的组合物的一个实施方式中，额外的酶是半乳糖脂酶。
在根据本发明的酶组合物的一个实施方式中，额外的酶是具有磷脂酶和半乳糖脂酶两种活性的酶。
在根据本发明的酶组合物的一个实施方式中，额外的酶是如WO2009/106575中所述的
在根据本发明的酶组合物的一个实施方式中，额外的酶是如WO9826057中所述的酶。
在根据本发明的酶组合物的一个方面，额外的酶是如US RE38,507中所述的酶。
在根据本发明的酶组合物的一个方面，额外的酶是如WO 9943794中所述的酶，尤其是如EP1058724B1的权利要求1中所限定的酶。
在根据本发明的酶组合物的一个方面，额外的酶是如WO2008/148845中所述的酶。
在根据本发明的酶组合物的一个方面，额外的酶是如WO2006/032281中所述的酶。
合适的额外的酶可以是如WO2008/148845中所述的淀粉酶，它们是如WO2008/148845中所限定的根据SEQ ID NO:1的多肽或者包含一个或多个氨基酸替换的如WO2008/148845中所限定的SEQ ID NO:1的变体，所述替换包括但不限于如下位置中的任何一个：261和288，所述位置参照如WO2008/148845中所限定的SEQ ID NO:1来定义。
合适的额外的酶可以是真菌淀粉酶，包括P 500BG(DSM,荷兰)。
合适的额外的酶可以是半纤维素酶，包括HSP(DSM,荷兰)、6000BG(DSM,荷兰)和/或BXP5001(DSM,荷兰)。
如果根据本发明的方法添加一种或多种额外的酶活性物，则这些活性物可以单独添加或与根据本发明的酶组合物或与根据本发明的预混合物一同加入。其它酶活性物可以根据确定的烘焙实践来确定剂量。
优选地，根据本发明的酶组合物以干燥形式被提供，以允许易于处理产品。不论酶的制剂为何，根据本发明的酶组合物可包含一种或多种选自如下组的组分，所述组由奶粉、麸质、粒状脂肪、额外的酶、氨基酸、盐、氧化剂(例如抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺)、还原剂(例如L-半胱氨酸)、乳化剂(例如单甘油酯(例如单硬脂酸甘油酯)、二甘油酯(或其组合))、硬脂酰乳酸钠、硬脂酰乳酸钙、脂肪酸聚甘油酯和二乙酰酒石酸单和双甘油酯、胶(例如瓜尔豆胶和黄原胶)、调味剂、酸(例如柠檬酸、丙酸)、淀粉、改性淀粉、麸质、湿润剂(例如甘油)和防腐剂组成。
为了包含在面粉的预混合物中，根据本发明的酶组合物是干燥产物例如无粉尘颗粒的形式是有利的，而为了与液体一起加入，液体形式是有利的。
本发明还涉及预混合物，所述预混合物包含面粉、α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶。
在根据本发明的预混合物的一个实施方式中，所述预混合物还包含一种或多种选自如下组的组分，所述组由奶粉、麸质、粒状脂肪、额外的酶、氨基酸、盐、氧化剂(例如抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺)、还原剂(例如L-半胱氨酸)、乳化剂(例如甘油酯(单硬脂酸甘油酯)、二甘油酯(或其组合))、硬脂酰乳酸钠、硬脂酰乳酸钙、脂肪酸聚甘油酯和二乙酰酒石酸单和双甘油酯、胶(例如瓜尔豆胶和黄原胶)、调味剂、酸(例如柠檬酸、丙酸)、淀粉、改性淀粉、麸质、湿润剂(例如甘油)和防腐剂组成。
在根据本发明的预混合物的一个实施方式中，额外的酶选自由淀粉酶、其它α-淀粉酶、β-淀粉酶、环糊精葡萄糖基转移酶、蛋白酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、三酰基甘油脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、漆酶、或氧化酶、己糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧合酶或L-氨基酸氧化酶和淀粉葡糖苷酶组成的组。
在根据本发明的预混合物的一个实施方式中，额外的酶是脂解酶，优选地是磷脂酶、半乳糖脂酶或具有磷脂酶和半乳糖脂酶两种活性的酶。
在根据本发明的预混合物的一个实施方式中，额外的酶是磷脂酶。
在根据本发明的预混合物的一个实施方式中，额外的酶是半乳糖脂酶。
在根据本发明的预混合物的一个实施方式中，额外的酶是具有磷脂酶和半乳糖脂酶两种活性的酶。
本发明还涉及制备面团的方法，所述方法包括：将α-淀粉酶多肽、G-4形成淀粉酶和至少一种面团成分组合。
面团成分包括选自以下的组分：面粉，蛋，水，盐，糖，调味剂，脂肪(包括黄油、人造黄油、油和起酥油(shortening))，发面酵母(baker’s yeast)，化学发酵系统(chemical leavening systems)，奶，氧化剂(包括抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺(ADA))，还原剂(包括L-半胱氨酸)，乳化剂(包括单/二甘油酯，单甘油酯例如单硬脂酸甘油酯(GMS))、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、脂肪酸聚甘油酯(PGE)和二乙酰酒石酸单和双甘油酯(DATEM)，胶(包括瓜尔豆胶和黄原胶)，酸(包括柠檬酸、丙酸)，淀粉，改性淀粉，麸质，湿润剂(包括甘油)和防腐剂。
“组合”包括但不限于，将α-淀粉酶和G4-形成淀粉酶添加至至少一种面团成分中，将至少一种面团成分添加至α-淀粉酶和G4-形成淀粉酶中，将α-淀粉酶、G4-形成淀粉酶和至少一种面团成分混合。
还可将一种或多种额外的酶掺入面团中。在一个实施方式中，额外的酶可以是淀粉酶，包括其它α-淀粉酶，例如真菌α-淀粉酶(其可有益于提供通过酵母可发酵的糖并延缓老化)、β-淀粉酶、环糊精葡萄糖基转移酶、蛋白酶、肽酶特别是外肽酶(其可有益于风味增强)、转谷氨酰胺酶、三酰基甘油脂肪酶(其可有益于修饰面团或面团成分中存在的脂质从而软化面团)、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶尤其是戊聚糖酶如木聚糖酶(其可有益于戊聚糖更特别地阿拉伯木聚糖的部分水解，这增加了面团的延展性)、蛋白酶(其可有益于麸质弱化，当使用硬小麦面粉时尤其如此)、蛋白质二硫键异构酶例如WO 95/00636公开的蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶(其可有益于改进面团稠度)、漆酶、或氧化酶、己糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧合酶或L-氨基酸氧化酶(其可有益于改进面团稠度)或蛋白酶。
根据本发明制备面团的方法包括：将α-淀粉酶多肽、G-4形成淀粉酶和至少一种面团成分组合。
“组合”包括但不限于，将α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶添加至至少一种面团成分中、将至少一种面团成分添加至α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶中，并包括将α-淀粉酶、G4-形成淀粉酶和至少一种面团成分混合。
在根据本发明制备面团的方法的一个实施方式中，所述方法包括如下步骤：将根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物和至少一种面团成分组合。
“组合”包括但不限于，根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物添加至至少一种面团成分中、将至少一种面团成分添加至根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物中，并包括将根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物和至少一种面团成分混合。
本发明还涉及面团，所述面团包含α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶、如权利要求1-3中任一项所限定的酶组合物或者如权利要求4-6中任一项所限定的预混合物。
由面团成分制备面团在本领域众所周知，其包括混合所述成分以及任选的一个或更多个模制和发酵步骤。
根据本发明制备烘焙产品的方法包括如下步骤：烘焙根据本发明的面团。
由所述面团制备烘焙产品的方法在本领域亦众所周知，其可包括：模制面团、使面团成形和进一步发酵面团，随后在所需的温度和烘焙时间下烘焙。在一个实施方式中，本发明提供制备烘焙产品的方法，所述方法包括如下步骤：烘焙根据本发明的面团。烘焙面团以产生烘焙产品可使用本领域众所周知的方法来进行。本发明还提供根据该方法能够获得的烘焙产品。在一个实施方式中，根据本发明的烘焙产品是面包或蛋糕。在本发明的一个方面，根据本发明的酶组合物可用来制备用于具有改进脆性的烘焙产品的分层面团。
在制备烘焙产品的方法的一个实施方式中，所述方法包括：烘焙包含根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物的面团。
在制备烘焙产品的方法的一个实施方式中，所述方法包括：烘焙包含根据本发明的预混合物的面团。
在制备烘焙产品的方法的一个实施方式中，烘焙产品是面包或蛋糕。
本发明还涉及制备面团或烘焙产品的方法，所述方法包括：将有效量的α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶掺入面团，相比其中没有掺入α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶的面团或烘焙产品，其改进了面团或由所述面团获得的烘焙产品的一个或多个性质。
短语“掺入面团”在本文被定义为将α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶添加到面团、将由其制得面团的任何成分和/或将由其制得面团的面团成分的任何混合物中。换言之，α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶可以在面团制备的任何步骤中加入，并且可以在一个、两个或更多个步骤中加入。将α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶加入到面团的成分中，用本领域公知的方法揉捏和烘焙所述面团。见，例如美国专利No.4567046、EP-A-426,211、JP-A-60-78529、JP-A-62-111629和JP-A-63-258528。
术语“有效量”在本文被定义为足够对面团和/或烘焙产品的至少一个目的性质提供可测量效果的α-淀粉酶多肽或G4-形成淀粉酶的量。α-淀粉酶的合适的量是0.5-1500NBAU/kg面粉的范围、在一个实施方式中是5-200NBAU/kg面粉、在另一个实施方式中是20-100NBAU/kg面粉。合适的量包括活性范围约700-1100NBAU/g的1ppm-2000ppm的酶。在一个实施方式中，有效量的范围是活性范围约700-1100NBAU/g的10-200ppm的酶，在另一个实施方式中是活性范围约700-1100NBAU/g的30-100ppm的酶。在一个实施方式中，有效量的范围是活性范围约700-1100NBAU/g的10-200ppm的酶。此处以及之后的NBAU表示本文所述的如实施例中标题“NBAU试验”下定义的新的烘焙淀粉酶单位(New BakingAmylase Unit)。
术语“改进的性质”在本文被定义为面团和/或由面团获得的产品特别是烘焙产品的任何性质，相对于没有掺入α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶的面团或产品，所述性质在α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶、根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物的作用下被改进。改进的性质可以包括但不限于增加的面团强度、增加的面团弹性、增加的面团稳定性、减小的面团粘性、改进的面团延展性、改进的面团可加工性、增加的烘焙产品体积、改进的烘焙产品风味、改进的烘焙产品内芯结构、改进的烘焙产品的内芯柔软性，减少的烘焙产品起泡、改进的脆性、改进的初始回弹性以及特别地贮存后回弹性两者、减小的贮存后硬度和/或改进的烘焙产品的抗老化性。
改进的性质可包括更快的面团的面团形成时间和/或减小的面团的面团粘性。
改进的性质可包括改进的烘焙产品可折叠性，如玉米饼、薄烤饼、扁面包、比萨饼皮、烤饼和/或面包片的改进的可折叠性。
改进的性质可包括改进的烘焙产品柔韧性，包括玉米饼、薄烤饼、扁面包、比萨饼皮、烤饼和/或面包片的改进的柔韧性。
改进的性质可包括改进的扁烘焙产品的可堆叠性，所述扁烘焙产品包括玉米饼、薄烤饼、扁面包、比萨饼皮、烤饼。
改进的性质可包括减小的面条粘性和/或增强的面条柔韧性。
改进的性质可包括减小的经烹饪面条的结块性和/或改进的面条风味甚至贮存一段时间后的面条风味。
改进的性质可包括减少的薄饼干(cracker)产品中的发丝裂缝的形成，以及产生发酵效果和改进的风味形成。
改进的性质可包括改进的口感和/或改进的挤压时的柔软性。
改进的性质可包括减少的运输过程中的损坏，包括减少的运输过程中的破裂。
改进的性质可包括减小的无麸质面包贮存后的硬度。
改进的性质可包括改进的无麸质面包的回弹性。改进的性质可以包括改进的无麸质面包的初始回弹性以及特别地贮存后回弹性两者。
改进的性质可包括减小的黑麦面包贮存后硬度。
改进的性质可包括减小的黑麦面包贮存期间的回弹性损失。
改进的性质可包括减小的烘焙产品贮存期间的回弹性损失，所述烘焙产品基于面粉包含至少5重量％的糖、在一方面包含至少8重量％的糖、在一方面包含至少12重量％的糖、在一方面包含至少15重量％的糖。基于面粉在一方面包含至少18重量％的糖、在一方面包含至少20重量％的糖、在一方面包含至少25重量％的糖、在一方面包含至少30重量％的糖。因此，例如，5％表示：配方中使用的每1000g面粉有50g糖。
改进的性质可包括减小的烘焙产品的贮存后硬度，所述烘焙产品基于面粉包含至少5重量％的糖、在一方面包含至少8重量％的糖、在一方面包含至少12重量％的糖、在一方面包含至少15重量％的糖。基于面粉在一方面包含至少18重量％的糖、在一方面包含至少20重量％的糖、在一方面包含至少25重量％的糖、在一方面包含至少30重量％的糖。因此，例如，5％表示：配方中使用的每1000g面粉有50g糖。
改进的口感包括初咬时或咀嚼之后柔软的感觉，优选地没有口中的发粘的感觉和/或没有烘焙产品粘在牙上。改进的口感包括烘焙产品在初咬时或咀嚼之后在口中感觉的干涩更少。改进的口感包括烘焙产品在其被放置于包装或容器外之后在初咬时或咀嚼之后在口中感觉的干涩更少。改进的性质可以包括在面包片从其包装或容器中取出并暴露于环境条件下5分钟、在一个方面10分钟、在一个方面20分钟后，其具有改进的口感。
改进的性质可以包括在饼干从其包装或容器中取出并暴露于环境条件下10分钟、在一个方面20分钟、在一个方面30分钟、在一个方面1小时之后，其具有改进的口感。
在一个方面，此处以及之后的环境条件包括20℃的温度和40％湿度的潮湿水平。
减少的运输过程中的破裂包括烘焙产品(包括但不限于饼干、面包如无麸质面包)不因为运输而破裂成额外的部分。
改进的挤压时的柔软性包括这样的触觉体验，即如果小圆面包被拿在手的手指和拇指之间时，拇指和手指向对方移动时需要较少的力量。
改进的烘焙产品的可折叠性可以进行如下测定。
将烘焙产品放置在平表面上。通过提起产品的一边并把它放在产品的相对边来折叠烘焙产品。通过这种方式得到的折叠的烘焙产品，其在位于或靠近中心的区域具有弯曲的曲线。肉眼检查折叠的烘焙产品的弯曲的外侧表面。如果在弯曲处或其附近观察到较少的裂缝，则可折叠性得到改进。如果与对照面包相比，折叠的烘焙产品不太倾向于沿着弯曲断裂，则可折叠性得到改进。如果与对照面包相比，折叠的烘焙产品沿着弯曲损伤较少，则可折叠性得到改进。如果烘焙产品是玉米饼、薄烤饼和/或面包片，这可以是特别有用的性质。
改进的可堆叠性可以如下测定。
将10个烘焙产品堆叠在彼此的顶部并密封在聚合物包装如聚乙烯箔中。这样得到一包烘焙产品。将10包烘焙产品堆叠在彼此的顶部并且在环境条件下保持3天、在一个方面为5天、在一个方面为1周、在一个方面为2周。环境条件是如本文所定义的条件。在此期限之后烘焙产品的底部包被打开，将烘焙产品彼此分离并且肉眼检查产品的表面。如果观察到更少的表面损伤，则可堆叠性得到改进。表面损伤可例如由被堆叠在彼此的顶部上的两个烘焙产品在分离过程中的表面破裂引起。如果烘焙产品是玉米饼，则这可以是特别有用的性质。
更快的面团形成时间可以如下测定。
面团形成时间是在麸质链开始分解之前，面团达到最大稠度、最大粘度需要的时间。其可以用来自德国的通过测量峰值时间来确定。如果用faronigraph确定面团形成时间，则面团形成时间是加入水的时刻与曲线达到其最高点的时刻之间的时间。峰时间优选地以分钟表示。
减小的面团粘性可以如下测定。
面团粘性优选地以至少8个面团块的两个单独批次，用配备压缩模式下测量力的5kg测力盒并带有圆柱形探头(25mm直径)的质构仪TAXT2i(Stable Micro Systems Ltd.、Surrey、英国)测定。使用2.0mm/s的测定前及测定后速度，而测定速度为1.0mm/s。集中面团块并将其压缩50％，探头在最大压缩下保持10秒。负峰值表示面团粘性。更小的负峰值表示减少的面团粘性。
增强的柔韧性可如下测定。
将烘焙产品放置在平表面上。烘焙产品被卷制成类似于管的形状，通过这种方式获得卷制的烘焙产品。如果卷制的烘焙产品仍然保持卷起的形状并且不松开则柔韧性得到改进。如果烘焙产品是玉米饼或薄烤饼，这可以是特别有用的性质。
改进的性质可以通过比较根据以下实施例中所描述的本发明方法添加了和不添加本发明(分离的)多肽所制备的面团和/或烘焙产品来测定。感官品质可以使用烘焙工业中已良好确立的程序进行评估，并且可以包括例如使用受训的味道测试者的小组。
术语“增加的面团强度”在本文被定义为这样的面团性质，即具有一般地更弹性的性质和/或需要更多的输入功(work input)来模制和成型。
术语“增加的面团弹性”在本文被定义为面团在经受一定的物理应变之后具有更高的倾向来恢复其原始形状的性质。
术语“增加的面团稳定性”在本文被定义为面团比较不易因机械损害而形成断层(faults)，从而更好地保持其形状和体积的性质，并且其以正常和/或延长的发面之后面包块横截面的高度：宽度的比例来评估。
术语“减小的面团粘性”在本文中被定义为面团在例如面团生产机械中粘附到表面的倾向更小的性质，并且其或者由具备本领域技能的测试烘焙者根据经验评估或者使用本领域已知的质构仪(例如TAXT Plus)来测量。
术语“改进的面团延展性”在本文中被定义为面团可以经受增加的应变或拉伸而不破裂的面团的性质。
术语“改进的面团可加工性”在本文被定义为面团一般地粘性更小和/或更紧实和/或更有弹性的性质。因此，厂房设备污垢较少并且清洁需求减少。
术语“增加的烘焙产品体积”优选地通过自动面包体积分析仪(例如BVM-3，TexVol Instruments AB，Viken，瑞典)使用本领域已知的超声或激光检测法测量为面包的给定的面包块的体积。在体积增加的情况下，性质得到改进。或者，在同一尺寸的罐(tin)中烘焙后的烘焙产品的高度指征烘焙产品的体积。在烘焙产品的高度增加的情况下，烘焙产品的体积增加。
术语“减少的烘焙产品起泡”在本文被定义为烘焙面包外皮上的气泡在视觉上测定的减少。
术语“改进的烘焙产品内芯结构”在本文被定义为烘焙产品的内芯中具有更细小的气囊(cell)和/或更薄的气囊壁和/或在内芯中具有更均一/均匀的气囊分布的性质，并且其通常由烘焙者来视觉评价或通过本领域中已知的数字成像分析(例如C-cell，Calibre Control International Ltd，Appleton，Warrington，英国)来评价。
术语“改进的烘焙产品柔软性”与“硬度”相对，在本文被定义为烘焙产品更容易被压缩的性质，并且其或者由具备本领域技能的测试烘焙者凭借经验评估或者通过使用本领域已知的质构仪(例如TAXT Plus)来测量。
术语“改进的烘焙产品风味”由受训的测试小组评估。
术语“改进的烘焙产品的抗老化性”在本文被定义为烘焙产品的质量参数(例如减小的贮存后硬度和/或减小的贮存后回弹性损失)衰退速率减小的性质。
抗老化性质可以通过烘焙产品减小的贮存后硬度来证明。根据本发明的α-淀粉酶或根据本发明的预混合物可以导致减小的硬度，例如在更容易被压缩的烘焙产品中。烘焙产品的硬度可以或者由具备本领域技能的测试烘焙者凭借经验评估或者通过使用本领域已知的质构仪(例如TAXT Plus)来测量。烘焙后24小时内测量的硬度被称为初始硬度。烘焙后24小时或更长时间测量的硬度被称为贮存后硬度，并且也是确定保质期的度量。在初始硬度减小的情况下，抗老化性质得到了改进。在贮存后硬度减小的情况下，抗老化性质得到了改进。优选地如本文实施例9所述测量硬度。
烘焙产品的回弹性优选地通过使用本领域中已知的质构仪(例如TAXTPlus)测量。
烘焙后24小时内测量的回弹性被称为初始回弹性。烘焙后24小时或更长时间测量的回弹性被称为贮存后回弹性，并且也是确定保质期的度量。新鲜烘焙的产品的内芯一般有高的初始回弹性但回弹性会在保质期期间损失。改进的抗老化性质可以通过贮存期间回弹性损失的减少来证明。优选地如本文实施例1所述测量回弹性。
术语“改进的脆性”在本文被定义为烘焙产品相比本领域已知的参考商品有更脆的感觉以及比参考商品保持更长时间的脆感的性质。该性质可以使用例如质构仪TA-XT Plus(Stable Micro Systems Ltd,Surrey,英国)在压缩实验中测量固定速度下的力对距离的曲线并从该压缩曲线中获得物理参数来量化，即(i)第一个峰的力，(ii)第一个峰的距离，(iii)初始斜率，(iv)最高峰的力，(v)曲线下面积和(vi)断裂事件(力降大于某一预定值)的数量。改进的脆性的指征是更高的第一个峰的力、更短的第一个峰的距离、更高的初始斜率、更高的最高峰的力、更大的曲线下面积和更多数目的断裂事件。较之参考商品，更脆的产品应在这些参数的至少两个中有统计学上显著更好的得分。在本领域中，“脆性”还指脆、松脆(crunchiness)或硬皮性(crustiness)，表示具有脆的、松脆的或硬皮性的断裂行为的物质。
本发明可以提供具有至少一种改进的性质的面团，所述改进的性质选自由增加的强度、增加的弹性、增加的稳定性、减小的粘性和/或改进的延展性组成的组。
本发明还可以提供具有增加的面包块体积的烘焙产品。本发明还可以提供具有至少一种改进的性质的烘焙产品，所述性质选自由增加的体积、改进的风味、改进的内芯结构、改进的内芯柔软性、改进的脆性、减少的起泡和/或改进的抗老化性组成的组。
根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物可用于延缓烘焙产品如面包和蛋糕的老化。老化的延缓可以通过：与不利用α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶生产的烘焙产品(包括面包和蛋糕)相比，通过减小的硬度、特别是减小的贮存后硬度来表示。
根据本发明的烘焙产品能够通过根据本发明制备烘焙产品的方法来获得。
用途
本发明还涉及根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物在一些工业方法中的用途。尽管对于这些方法获得了长期的经验，但是根据本发明的酶组合物或预混合物可具有优于目前使用的组合物或预混合物的优势。取决于特定的应用，这些优势可包括以下方面，如更低的生产成本、对底物的更高的特异性、更少的抗原性(antigenic)、更少的不期望的副活性、在合适的微生物中的更高的产率、更合适的pH和温度范围、最终产品的更好的口味以及食品级和按犹太教可食(kosher)。
根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物可以用于食品工业，包括用于食品制造。工业应用的一个实例是其在烘焙应用中的用途。例如以改进面团和/或烘焙产品的质量。
在食品制造中的用途的一个实施方式中，用途是制造烘焙产品，所述烘焙产品包括但不限于面包或蛋糕。
在一方面，根据本发明的用途涉及α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶的组合用于减小烘焙产品的贮存后硬度并/或减小烘焙产品贮存期间的回弹性损失的用途。
在一方面，根据本发明的用途涉及根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物用于减小烘焙产品的贮存后硬度并/或减小烘焙产品贮存期间的回弹性损失的用途。
在一方面，根据本发明的用途涉及根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物用于改进烘焙产品的可折叠性的用途。在一方面，根据本发明的用途涉及根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物用于改进玉米饼、薄烤饼、扁面包、比萨饼皮、烤饼和/或面包片(特别是玉米饼、薄烤饼和/或面包片)的可折叠性的用途。
在一方面，根据本发明的用途涉及本文所述的α-淀粉酶多肽和本文所述的G4-形成淀粉酶的组合用于改进烘焙产品的可折叠性的用途。在一方面，根据本发明的用途涉及根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物用于改进玉米饼、薄烤饼、扁面包、比萨饼皮、烤饼和/或面包片(特别是玉米饼、薄烤饼和/或面包片)的可折叠性的用途。
使用α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶的组合以减小烘焙产品的贮存后硬度并/或减小烘焙产品贮存期间的回弹性损失。
使用根据权利要求1、3或4中任一项的酶组合物或关于权利要求1、3或4中任一项的根据权利要求5-7中任一项的预混合物以减小烘焙产品的贮存后硬度并/或减小烘焙产品贮存期间的回弹性损失。
在一方面，根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物可用于生产蛋糕和生产可由其制成蛋糕的面糊。
α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶的组合、根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物可被用于制备许多蛋糕，包括油脂蛋糕(shortenedcakes)，例如磅蛋糕(pound cake)和黄油蛋糕(butter cake)，以及包括乳沫蛋糕(foam cake)，诸如例如蛋白糖霜蛋糕(meringues)、海绵蛋糕、酥饼干蛋糕(biscuit cake)、蛋糕卷(roulade)、杰诺瓦士蛋糕(genoise)和戚风蛋糕(chiffon cake)。海绵蛋糕是一种基于小麦面粉、糖、焙粉(baking powder)和蛋(以及任选地焙粉)的软蛋糕。存在的仅有的脂肪来自蛋黄，其有时独立于蛋清添加。其经常被用作其它类型的蛋糕和甜点的基料(base)。磅蛋糕一般用各一磅的面粉、黄油、蛋和糖来制备，以及任选地补充有焙粉。戚风蛋糕中黄油/人造黄油已被油替换。相比磅蛋糕或海绵蛋糕，糖和蛋黄的含量已减少，蛋清含量已增加。
制备面糊的方法优选地包括以下步骤：
a.通过至少加入下述物质来制备蛋糕的面糊：
i.糖；
ii.面粉；
iii.α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶；
iv.至少一个蛋；以及
v.任选的磷脂酶。
根据本发明制备蛋糕的方法还包括以下步骤
b.烘焙面糊以产生蛋糕。
本领域技术人员知道如何由面团成分制备面糊或蛋糕。任选地，一种或更多种其它的成分可以存在于组合物中例如以使得蛋糕中的蛋和/或脂肪减少，例如水胶体、酵母提取物、钙。
根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物的上述工业应用仅包括了几个例子，该列表并不意味着是限制性的。
根据本发明的酶组合物或根据本发明的预混合物的其它用途可以包括：
-生产葡萄糖、果糖和麦芽糖糖浆；
-生产淀粉水解物如麦芽糖糊精；
-生产改性淀粉；
-动物饲料中淀粉组分的改性；
-替换酿造中的麦芽；
-在胶水包括墙纸涂浆(wall paper paste)中的用途；
-在使用淀粉制作的塑料物品(包括由聚合淀粉膜制成的塑料袋)中的用途；和/或
-在废弃面包(waste bread)再加工中的用途。
实施例
麦芽三糖试验
该试验可用来测定对麦芽三糖底物的活性
一个麦芽三糖单位(MU)被定义为在下列试验条件下使用麦芽三糖底物每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶的量。在使用麦芽三糖作为底物且于37℃、pH5.0下的30分钟孵育中测定酶活性。酶法水解麦芽三糖导致定量释放葡萄糖，这是对酶活性的测量。
将约0.4-4mg/ml蛋白的样品在含1g/L BSA的100mM柠檬酸缓冲液中稀释至0.0125-0.125MU/ml之间的范围，并使用4N NaOH将pH调节至5.0。在MQ水中的2.5mM NaCl中制备10mg/ml麦芽三糖底物。在设定为37℃的PCR热循环仪中的96孔PCR板中预热160微升底物约30分钟。将40微升经稀释的样品加入到热循环仪中预热的底物中并通过用移液器上下吸打数次来充分混合。加入样品30分钟之后，加入20微升0.33N NaOH并充分混合以终止反应，然后从热循环仪中取出PCR板。通过将55微升终止的反应混合物与195微升己糖激酶单试剂(Ecoline GlucoseHexokinase FS,DiaSys诊断系统GmbH,Holzheim,德国)在平底96孔板中在室温下孵育15分钟来测量释放的葡萄糖。通过离心将气泡从表面除去，然后使用微量滴定板读取仪来读取在340nm处的吸光度。相对于葡萄糖校准线来测定释放的葡萄糖的量。
测定G4-形成淀粉酶活性的试验
如下可例如被用于表征G4-形成淀粉酶的亲本或其变体。
通过最初的背景信息，糯玉米支链淀粉(可以以来自Roquette,法国的WAXILYS 200获得)是具有极高的支链淀粉含量(高于90％)的淀粉。将20mg/ml的糯玉米淀粉在50mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、2mM氯化钙、pH6.0的缓冲液中煮3分钟，随后在50℃下孵育并在半小时内使用。
一个单位的G4-形成淀粉酶被定义为：当在含有4ml如上所述制备的50mM MES、2mM氯化钙、pH6.0的缓冲液中的10mg/ml糯玉米淀粉的测试管中在50℃下孵育时，每分钟释放等价于1微摩尔还原糖的水解产物的酶的量。使用麦芽糖作为标准并利用Bernfeld,Methods Enzymol.,(1954),1,149-158的二硝基水杨酸方法或本领域已知的用于定量还原糖的另一方法来测量还原糖。
如下测定G4-形成淀粉酶的水解产物谱：将0.7个单位的G4-形成淀粉酶在含有4ml如上所述制备的缓冲液中的10mg/ml糯玉米淀粉的测试管中在50℃下孵育15分钟或30分钟。通过将测试管浸在沸水浴中3分钟来终止反应。分析水解产物并通过阴离子交换HPLC来定量，其中使用Dionex PA100柱，使用乙酸钠、氢氧化钠和水作为洗脱液，利用脉冲安培检测并利用已知的从葡萄糖至麦芽七糖的线性麦芽低聚糖作为标准品。关于麦芽八糖至麦芽十糖所使用的响应因子是关于麦芽七糖所发现的响应因子。
换言之，G4-形成淀粉酶在糯玉米淀粉孵育试验中具有产生如下水解产物的能力，所述水解产物由一种或多种2-10个D-吡喃葡萄糖基单元的线性麦芽低聚糖和任选地葡萄糖组成，所述水解产物能够通过阴离子交换进行分析；从而至少60重量％、优选地至少70重量％、更优选地至少80重量％且最优选地至少85重量％的所述水解产物由3-10个D-吡喃葡萄糖基单元的线性麦芽低聚糖、优选地4-8个D-吡喃葡萄糖基单元的线性麦芽低聚糖组成。
当在本文中使用时，术语“线性麦芽低聚糖”以其通常含义被使用，其表示2-10个由α-(l->4)键连接的α-D-吡喃葡萄糖单元。
水解产物可通过任何合适的方法来分析。例如，水解产物可通过阴离子交换HPLC来分析，其中使用Dionex PA 100 1000柱，利用脉冲安培检测并利用例如已知的从葡萄糖至麦芽七糖的线性麦芽低聚糖作为标准品。
NBAU试验
成熟DSM-AM的酶活性以NBAU表示。1个NBAU被定义为：在pH5.2、T＝37℃下，使用末端封闭的pNP-G7Ceralpha底物，导致每分钟释放1微摩尔的pNP(对硝基苯酚)的酶的量。
NBAU活性测试的原理起源于(手册)Megazymeα-淀粉酶试剂盒测试(Ceralpha)。已使该试验适合分析仪应用。考虑到α-葡糖苷酶和淀粉葡糖苷酶的最适pH(pH范围为5-6)，在pH5.20下进行试验。利用KonelabArena 30分析仪(Thermo Scientific,Vantaa,芬兰)进行试验。
在37℃、pH5.20下，使用非还原末端封闭的对硝基苯麦芽庚糖苷底物(＝BPNPG7,Ceralpha)联合过量水平的热稳定性α-葡糖苷酶和淀粉葡糖苷酶(二者均来自Ceralpha:α-淀粉酶试剂R-CAAR4,Megazyme,爱尔兰)来测定酶活性。通过α-淀粉酶水解BPNPG7底物产生对硝基苯麦芽糖(p-nitrophenyl maltosaccharide)片段。通过加入碱性溶液来终止反应(且产生颜色)。测定在405nm波长处的吸光度，其是对酶活性的测量。由摩尔消光系数测定来计算活性，并通过利用浓度已知的对硝基苯酚溶液来校正。
实施例1烘焙实验
在美式中种发酵白面包(American style Sponge and Dough white bread)中测试成熟DSM-AM、PowerFresh Bread 8100(DuPont IndustrialBiosciences,丹麦)和这些酶的组合的烘焙性能。成分列于表1中。结果列于表2和3中。这些表中的对照指的是根据相同配方但不含成熟DSM-AM、PowerFresh Bread 8100(来自DuPont,美国的G4-形成淀粉酶的一个例子)或其组合制备的面包的面包块。
成熟DSM-AM可如尚未公开的美国专利申请No.13/532072中所述来生产。成熟DSM-AM可如美国专利US 8,426,182B1中所述来生产。
使表1中所列出的酵头(sponge)成分在具有钩式搅拌器的Hobart A-120混合器中以速度1混合2分钟，其后以速度2混合3分钟，至最终的酵头温度为24℃。然后，使酵头在发面箱(proof box)中在38℃下发酵3小时。之后，使表1中所列出的面团成分在相同的具有钩式搅拌器的Hobart A-120混合器中以速度1混合30秒。之后，将酵头加入到面团中并以速度1混合另外2分钟，接着以速度2混合另外8分钟至最佳的麸质形成，至最终的面团温度为27℃。使充分混合的面团在塑料覆盖下在室温静息(rest)2分钟。
将面团分成565g的块，制成圆形并在室温下静息5分钟。随后使用Unic制模机(顶部6.5/底部6)对面团片进行模制，然后将模制块放置在面包盘中并放置在38℃、相对湿度为85％的发面橱(proofing cabinet)中85分钟。将充分发酵的面团块放置在BeCOM烤箱中并在215℃下烘焙20分钟。然后，将面包从烤箱中取出、出盘(depanned)并放在架子上，在通常是20℃-25℃之间的环境温度下冷却至少1小时。在1-2小时的冷却后，将面包包裹在聚乙烯塑料袋中。
此后，对面包进行评估。
面团的稠度、本身、形成、延展性、弹性和粘性由有经验的烘焙师进行评估并判定为良好。
面包的体积、内芯结构和内芯颜色由有经验的烘焙师判定为良好。
获得了令人满意的结果，这指示良好的面团和良好的面包。
冷却至室温以后，面包块的体积由自动化面包体积分析仪(BVM-3,TexVol仪器)来测定。对照面包的面包块体积被限定为100％。
在硬度和回弹性测量之间，保持面包在塑料袋中。
表1
除了抗坏血酸和酶之外的所有成分均由Inter-County Bakers,Inc.Lindenhurst,纽约供应。
*调节剂包含50ppm抗坏血酸(来自DSM Nutritional Products，瑞士)、5ppmP500(来自DSM，荷兰的真菌α-淀粉酶)、20ppmHSP6000(来自DSM，荷兰的真菌半纤维素酶)、20ppmBXP5000(来自DSM，荷兰的细菌半纤维素酶)、30重量％的EMPLEX(来自Caravan Ingredients，美国的SSL)、30重量％的STARPLEX90(来自Caravan Ingredients，美国的单甘油酯)、5重量％的用于防尘的菜籽油(Bunge Oils，美国)和King Arthur面粉作为混合材料。
硬度和回弹性的测量
将面包切成厚度为1英寸或2.5cm的片，并使用来自Stable MicroSystems仪器的质构仪TA-XTPlus并且应用以下设置来测量硬度。
设置
·测试模式＝压缩
·测试前速度＝3mm/s
·测试速度＝1mm/s
·测试后速度5mm/s
·距离＝5mm
·保持时间＝10秒
·触发力＝5克
列出的硬度是测量的力；最大峰值以克记录。误差幅度在烘焙试次中可不同且通常小于约10％(小于约40个硬度单位)。
回弹性是10秒保持时间之后的力(F)除以最大峰力乘以100。回弹性＝(F2/F1)×100。误差幅度在烘焙试次中可不同且通常小于10％(小于约0.03个回弹性单位)。
表2.利用酵头和面团的配方的平均值(测量来自2个面包、每个面包9片(1英寸＝2.54cm厚)的平均)。
第1天是烘焙面包那一天之后的第一天。第7天是烘焙面包之后的第7天。第14天是烘焙面包之后的第14天。
所使用的成熟DSM-AM的活性为：950NBAU/g酶，ppm表示mg/kg，例如，50ppm表示每kg面粉有50mg所示的产物。
表3.利用酵头和面团的配方的平均值(测量来自2个面包、每个面包9片(1英寸＝2.54cm厚)的平均)。
第1天是烘焙面包那一天之后的第一天。第7天是烘焙面包之后的第7天。第14天是烘焙面包之后的第14天。所使用的成熟DSM-AM的活性为：950NBAU/g酶，ppm表示mg/kg，例如，50ppm表示每kg面粉有50mg所示的产物。
实施例2：烘焙实验，剂量响应曲线
在美式中种发酵白面包中测试成熟DSM-AM的剂量响应曲线。所使用的成分和配方与本发明的实施例1中所述相似，配方使用3种量的成熟DSM-AM：分别为50ppm、75ppm和100ppm(活性为750NBAU/g酶的酶)。
观察下述。在第1天(即，烘焙面包的那一天)，3种量的硬度在各自的误差幅度之内。在烘焙面包之后的第8天(第8天)和烘焙面包之后的第15天(第15天)观察到了相同的结果。
这说明：加入超过一定量的酶产物时，与对照相比的硬度减小达到了平台值，超过该量观察不到另外的紧实度益处。对于这种类型的酶，关于加入更多酶的这种平台效应并非是罕见的。
对于回弹性，观察到了相似的效果。在第1天(即，烘焙面包的那一天)，3种量的回弹性在各自的误差幅度之内。在第8天和第15天观察到了相同的结果。这说明：加入超过一定量的酶产物时，与对照相比的回弹性增加达到了平台值。进一步增加酶剂量无额外效果时达到平台，这对于酶在面包中的应用并非罕见的。
实施例3：烘焙实验
类似于实施例1，使用成熟DSM-AM(α-淀粉酶多肽)和PowerFRESH Special(来自DuPont Industrial Biosciences,丹麦的G4-形成淀粉酶产品)来制备面包。
在美式中种白面包中测试成熟DSM-AM、PowerFRESH Special(来自DuPont的G4-形成淀粉酶的一个例子)和这些酶的组合的烘焙性能。所使用的成分列于表4中。成熟DSM-AM(α-淀粉酶多肽)和PowerFRESHSpecial的量列于表5中。对照指的是根据相同配方但不含成熟DSM-AM、PowerFRESH Special或其组合而制备的面包的面包块。
成熟DSM-AM可如尚未公开的美国专利申请No.13/532072中所述来生产。成熟DSM-AM可如美国专利US 8,426,182B1中所述来生产。
使表4中所列出的酵头成分在具有钩式搅拌器的Hobart A-120混合器中以速度1混合2分钟，其后以速度2混合3分钟，至最终的酵头温度为24℃。然后，使酵头在发面箱中在38℃下发酵3小时。之后，使表1中所列出的面团成分在相同的具有钩式搅拌器的Hobart A-120混合器中以速度1混合30秒。之后，将酵头加入到面团中并以速度1混合另外2分钟，接着以速度2混合另外8分钟至最佳的麸质形成，至最终的面团温度为27℃。使充分混合的面团在塑料覆盖下在室温静息(rest)2分钟。
将面团分成565g的块，制成圆形并在室温下静息5分钟。随后使用Unic制模机(顶部6.5/底部6)对面团片进行模制，然后将模制块放置在面包盘中并放置在38℃、相对湿度为85％的发面橱(proofing cabinet)中85分钟。将充分发酵的面团块放置在BeCOM烤箱中被在215℃下烘焙20分钟。然后，将面包从烤箱中取出、出盘(depanned)并放在架子上，在通常是20℃-25℃之间的环境温度下冷却至少1小时。在1-2小时的冷却后，将面包包裹在聚乙烯塑料袋中。
面团的稠度、本身、形成、延展性、弹性和粘性由有经验的烘焙师进行评估并判定为良好。
面包的体积、内芯结构和内芯颜色由有经验的烘焙师判定为良好。
将面包贮存14天(第1天是烘焙面包的那一天之后的第一天)。在第14天，将面包切片，然后折叠面包片以分析它们的可折叠性。
如下分析可折叠性。
将面包片持在双手中，通过将面包片的一边移动至相对边来折叠面包片。通过这种方式得到的折叠的面包片产品，其在位于或靠近面包片中心的区域具有弯曲的曲线。肉眼检查折叠的烘焙产品的弯曲的外侧表面。如果在弯曲处或其附近观察到较少的裂缝，则可折叠性得到改进。如果折叠的烘焙产品较不倾向于沿着弯曲断裂，则可折叠性得到改进。
表4
除了抗坏血酸和酶之外的所有成分均由Inter-County Bakers,Inc.Lindenhurst,纽约供应。
*调节剂包含50ppm抗坏血酸(来自DSM Nutritional Products，瑞士)、5ppmP500(来自DSM，荷兰的真菌α-淀粉酶)、20ppmHSP6000(来自DSM，荷兰的真菌半纤维素酶)、20ppmBXP5000(来自DSM，荷兰的细菌半纤维素酶)、30重量％的EMPLEX(来自Caravan Ingredients，美国的SSL)、30重量％的STARPLEX90(来自Caravan Ingredients，美国的单甘油酯)、5重量％的用于防尘的菜籽油(Bunge Oils，美国)和King Arthur面粉作为混合材料。
表5
第1天是烘焙面包那一天之后的第一天。第7天是烘焙面包之后的第7天。第14天是烘焙面包之后的第14天。所使用的成熟DSM-AM的活性为：950NBAU/g酶，ppm表示mg/kg，例如，50ppm表示每kg面粉有50mg所示的产物。
可折叠性结果显示于图1-4中：
图1：说明不使用成熟DSM-AM且不使用PowerFRESH Special制造的面包片的可折叠性的照片。
图2：说明使用50ppm成熟DSM-AM制造的面包片的可折叠性的照片。
图3：说明使用75ppm PowerFRESH Special制造的面包片的可折叠性的照片。
图4：说明使用50ppm成熟DSM-AM和75ppm PowerFRESH Special制造的面包片的可折叠性的照片。
照片1和照片2中的面包片经折叠后断裂。照片3中的面包片有大量裂缝且几乎断裂。照片4中的面包片有裂缝但未断裂。与图1-3相比，图4显示了折叠的面包片的弯曲外表面上最少的裂缝。显然，照片4中的面包片经折叠后受损最小。
因此，图4说明：联合使用α-淀粉酶多肽和G4-形成淀粉酶改进了烘焙产品的可折叠性。

Claims (16)

1.酶组合物，其包含α-淀粉酶多肽，所述α-淀粉酶多肽包含
(a)SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少99.5％的氨基酸序列；或
(c)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的第100-2157位核苷酸所示多核苷酸编码的氨基酸序列；或
(d)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义；或
(e)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ IDNO:2来定义，且所述氨基酸序列的特征在于：当用于制备基于面粉具有至少5重量％糖的烘焙产品时，所述烘焙产品相较于不使用所述氨基酸序列制备的烘焙产品具有减小的贮存后硬度；或
(f)氨基酸序列，其具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％，并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换
37、39、46、47、48、49、53、78、80、84、87、94、101、102、103、104、105、106、107、108、110、111、113、115、120、121、127、128、130、133、136、137、150、157、158、159、161、162、163、166、167、169、176、177、179、201、207、210、211、216、219、221、222、223、227、228、232、233、234、237、240、243、247、250、252、255、258、260、266、267、268、269、273、284、285、287、291、292、293、295、296、297、299、300、302、304、306、312、314、315、316、317、319、321、332、355、356、358、360、361、364、367、383、389、391、400、403、404、407、410、411、421、424、447、454、455、478、483、500、521、538、569、581、616、621、636、670、681、684、685、693、709、710，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，所述组合物还包含G4-形成淀粉酶，所述G4-形成淀粉酶具有与SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的同一性为至少70％的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的酶组合物，其中，所述α-淀粉酶多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列的同一性为至少70％，并在对应于如下的任何一个或多个位置具有替换
46、48、49、53、78、94、101、103、105、108、110、111、121、127、157、159、161、162、162、166、167、169、201、207、210、211、219、221、227、228、232、233、243、252、255、258、267、287、294、297、300、302、304、314、315、316、317、321、356、358、360、364、367、391、403、404、410、421、454、483、685，
所述位置参照SEQ ID NO:2的第34-719位氨基酸所示氨基酸序列来定义；
且其中，与具有SEQ ID NO:2的第34-317位氨基酸所示氨基酸序列的参照多肽相比，所述α-淀粉酶多肽优选地展示出以下的任一种
-增强的热稳定性，或
-增强的蔗糖耐受性，或
-增加的在pH4时的活性：在pH5时的活性的比率。
3.根据权利要求1或2的酶组合物，其包含额外的酶。
4.根据权利要求3的酶组合物，其中所述额外的酶选自：淀粉酶、其它α-淀粉酶、β-淀粉酶、环糊精葡萄糖基转移酶、蛋白酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、三酰基甘油脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、漆酶、氧化酶、己糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧合酶、L-氨基酸氧化酶和淀粉葡糖苷酶。
5.预混合物，其包含面粉、权利要求1或2所限定的α-淀粉酶多肽和权利要求1所限定的G4-形成淀粉酶。
6.根据权利要求5所述的预混合物，其中所述预混合物还包含一种或多种选自如下的组分：奶粉、麸质、粒状脂肪、额外的酶、氨基酸、盐、氧化剂例如抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺、还原剂例如L-半胱氨酸、乳化剂例如单甘油酯、二甘油酯、硬脂酰乳酸钠、硬脂酰乳酸钙、脂肪酸聚甘油酯和二乙酰酒石酸单和双甘油酯、胶例如瓜尔豆胶和黄原胶、调味剂、酸例如柠檬酸和丙酸、淀粉、改性淀粉、麸质、湿润剂例如甘油，以及防腐剂。
7.根据权利要求6所述的预混合物，其中所述额外的酶选自：淀粉酶、其它α-淀粉酶、β-淀粉酶、环糊精葡萄糖基转移酶、蛋白酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、三酰基甘油脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、漆酶、氧化酶、己糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧合酶、L-氨基酸氧化酶和淀粉葡糖苷酶。
8.制备面团的方法，所述方法包括：将权利要求1或2所限定的α-淀粉酶多肽和权利要求1所限定的G4-形成淀粉酶以及至少一种面团成分组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中将根据权利要求1-4中任一项所述的酶组合物或根据权利要求5-7中任一项所述的预混合物与至少一种面团成分组合。
10.面团，其包含：权利要求1或2所限定的α-淀粉酶多肽和权利要求1所限定的G4-形成淀粉酶；或根据权利要求1-4中任一项所述的酶组合物；或根据权利要求5-7中任一项所述的预混合物。
11.制备烘焙产品的方法，所述方法包括烘焙根据权利要求10所述的面团的步骤。
12.烘焙产品，其能够通过根据权利要求11所述的方法获得。
13.权利要求1或2所限定的α-淀粉酶多肽与权利要求1所限定的G4-形成淀粉酶组合用于减小烘焙产品贮存后的硬度和/或减小烘焙产品贮存期间的回弹性损失的用途。
14.根据权利要求1-4中任一项所述的酶组合物或根据权利要求5-7中任一项所述的预混合物用于减小烘焙产品贮存后的硬度和/或减小烘焙产品贮存期间的回弹性损失的用途。
15.权利要求1或2所限定的α-淀粉酶多肽与权利要求1所限定的G4-形成淀粉酶组合用于改进烘焙产品的可折叠性的用途。
16.根据权利要求1-4中任一项所述的酶组合物或根据权利要求5-7中任一项所述的预混合物用于改进烘焙产品的可折叠性的用途。
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