KR20070085027A - 엑소-특이성 아밀라아제 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를코딩하는 핵산 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아밀라아제 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 아밀라아제는 더욱 유익한 품질을 갖도록 조작된다. 구체적으로, 본 발명의 아밀라아제는 변경된 엑소특이성을 나타낸다.

Description

엑소-특이성 아밀라아제 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 그의 용도{EXO-SPECIFIC AMYLASE POLYPEPTIDES, NUCLEIC ACIDS ENCODING THOSE POLYPEPTIDES AND USES THEREOF}
본 출원과 관련된 상호 참고
본 발명은 2003년 7월에 제출한 Berg 등의 "Exo-specific, Nucleic Acids Encoding Those Polypeptides and Uses Thereof" (문서 제 GC807P호)의 USSN 60/485,616 및 2003년 7월에 제출한 "Thermostable Amylase Polypeptides, Nucleic Acids Encoding Those Polypeptides and Uses Thereof" (문서 제 GC806P호)의 USSN 60/485,413에 대한 우선권 및 이익을 주장한다. 상기 출원은 2003년 7 월에 제출한 "Polypeptides"(문서 제 PO16939USO 호)의 USSN 60/485,539에 관한 것이다.
본 발명은 아밀라아제 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 아밀라아제는 더 유익한 품질을 갖도록 설계되어 있다. 상세하게, 본 발명의 아밀라아제는 변경된 엑소특이성을 보인다.
본 발명의 배경
개선된 아밀라아제는 베이킹과 같은 특정 공정에서 본질적인 문제점을 개선할 수 있다. 빵의 경화가 증가되고 빵이 딱딱해지는 아밀로펙틴의 결정화가, 베이킹 후 수 일에 전분 과립에서 일어난다. 빵이 딱딱해질 때, 빵은 빵의 속의 연화성과 수분성을 잃게 된다. 그 결과, 빵의 속은 탄력을 잃고, 빵은 질겨진다.
아밀로펙틴 측쇄의 효소에 의한 가수분해(예컨대, 아밀로라아제에 의함)는 결정화를 감소시키고 딱딱해짐의 방지를 증가시킬 수 있다. 결정화는 아밀로펙틴의 측쇄 길이에 좌우된다: 측쇄가 길수록, 결정은 더 커진다. 대부분의 전분 과립은 두 가지의 중합체(아밀로펙틴과 아밀로오스)의 혼합물로 이루어지고, 약 75%가 아밀로펙틴이다. 아밀로펙틴은 (1-4) 연결에 의해 합해지는 α-D-글루코피라노실 단위의 사슬로 이루어진 매우 큰 분지형 분자이며, 여기서 사슬은 α-D-(1-6)연결에 의해 결합되어 분지를 형성한다. 아밀로오스는 α-D-(1-6) 분지를 거의 갖지 않는 α-D-글루코피라노실 단위에 (1-4)연결된 선형 사슬이다.
전분질의 빵 산물, 예컨대 흰 빵, 체질한 호밀곡분 및 밀곡분으로 만든 빵 및 롤 빵의 베이킹은 180 내지 250℃ 의 오븐 온도에서, 약 15 내지 60 분간 빵 반죽을 베이킹함으로써 수행된다. 베이킹 공정 동안, 가파른 온도 구배(200→120℃)가 베이킹된 산물의 빵 껍질이 발생되는 반죽의 외곽층에 걸쳐 우세하다. 그러나, 증기 때문에 빵 속의 온도는 베이킹 공정 마지막에 약 100℃일 뿐이다. 약 85℃ 온도 이상에서, 효소는 불활성화가 발생할 수 있어, 상기 효소는 노화 방지 특징(anti-staling property)을 갖지 않을 것이다. 따라서, 오직 열안정성 아밀라아제만이 베이킹 동안 효과적으로 전분을 개질시킬 수 있다.
엔도아밀라아제 활성은 분지쇄 덱스트린의 축적으로 인한 끈끈하거나 또는 검과 같은 빵 속을 제공하여 최종 빵 생산품의 품질에 부정적으로 영향을 줄 수 있다. 엑소아밀라아제 활성이 바람직한데, 이는 엔도아밀라아제 활성과 연관된 부정적인 효과를 더 적게 하면서 노화의 지연을 유도하는, 전분의 요망되는 개질을 달성하기 때문이다. 엔도아밀라아제 활성의 감소는 더 큰 엑소특이성을 유도할 수 있어, 분지화된 덱스트린을 감소시킬 수 있고 더 높은 품질의 빵을 제공할 수 있다.
본 발명은 변경된 엑소특이성을 가진 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 요약
첫 번째 국면에서, 본 발명은 모 폴리펩티드에서 유래된 PS4 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 모 효소는 바람직하게 슈도모나스 사카로필라 비(非)-말토제닉 엑소아밀라아제(Pseudomonas saccharophila non-maltogenic exoamylase), 예컨대 서열 번호 1 또는 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열을 가진 엑소아밀라아제일 수 있다. 모 효소는 바람직하게 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri) 비 말토제닉 엑소아밀라제, 예컨대 서열 번호 7 또는 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드일 수 있다. PS4 패밀리(family)의 다른 구성원이 모 효소로서 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 모 폴리펩티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열을 가진 슈도모나스 사카로필라의 비-말토제닉 엑소아밀라아제이다. 기타 바람직한 구현예에서, 모 폴리펩티드는 서열 번호 7 또는 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열을 가진 슈도모나스 스투트제리의 비-말토제닉 엑소아밀라아제이다. 바람직한 구현예에서 PS4 변이체는 아미노산 치환을 포함함으로써 모 폴리펩티드와 상이하며, 이 때 상기 치환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치로 이루어진 위치에 위치한다:
Figure 112006001199932-PCT00001
(이 때, 위치 넘버링(numbering) 언급은 서열 번호 1에 나타난 슈도모나스 사카로필라 서열에 대한 것이다). 바람직한 구현예에서, PS4 변이체는 아미노산 치환을 포함함으로써 모 폴리펩티드와 다르며, 이 때 상기 치환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치로 이루어진 위치에 위치한다: 4, 33, 34, 70, 71, 87, 99, 108, 113, 121, 134, 141, 157, 158, 171, 178, 179, 188, 198, 199, 223, 290, 307, 315, 334, 343, 399 및 405 (이 때, 위치 넘버링 언급은 서열 번호 1 에 나타난 슈도모나스 사카로필라 서열에 대한 것이다). 바람직하게는, 상기 위치는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치이다: 33, 34, 71, 87, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307, 334, 및 343. 바람직하게, 상기 PS4 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다: N33Y, D34N, K71R, G87S, G121D, G134R, A141P, L178F, A179T, G223A, H307L, S334P 및 D343E.
또다른 구현예에서, 엑소아밀라아제는 108, 158, 171 및 188 로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 추가적인 치환을 또한 포함한다. 바람직하게는, PS4 변이체는 K108R, G158D, Y171S 및 G188A 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다.
바람직하게, PS4 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다: G4D, N33Y, D34N, G70D, K71R, G87S, A99V, K108R, V113I, G121D, G134R, A141P, I157L, G158D, Y171S, L178F, A179T, G188A, Y198F, Y198L, A199V, G223A, V290I, H307L, I315V, S334P, D343E, S399P, A405F 및 A405E. 바람직하게, PS4 변이체는 L178F 또는 A179T의 하나 이상의 추가적인 치환과 함께 하기의 치환을 포함한다: N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, G223A, H307L 및 S334P. 바람직하게, PS4 변이체는 하나 이상의 하기 치환을 포함한다: N33Y, D34N, I157L, L178F, A179T, G223A 또는 H307L. 바람직하게, PS4 변이체는 하나 이상의 하기 치환을 포함한다: G87S, G134R, A141P, 또는 S334P.
또다른 바람직한 구현예에서, PS4 변이체 폴리펩티드는 하기에서 선택된 조합을 포함한다:
Figure 112006001199932-PCT00002
Figure 112006001199932-PCT00003
기타 바람직한 구현예에서, PS4 변이체 폴리펩티드는 하기에서 선택된 조합을 포함한다:
Figure 112006001199932-PCT00004
기타 바람직한 구현예에서, PS4 변이체 폴리펩티드는 하기에서 선택된 조합을 포함한다:
Figure 112006001199932-PCT00005
바람직한 구현예에서, PS4 변이체는 서열 번호 2; 서열 번호 3; 서열 번호 4; 서열 번호 4a, 서열 번호 4b, 서열 번호 4c, 서열 번호 8, 서열 번호 9 또는 서열 번호 10 에 기재된 서열을 포함하는 아미노산이다.
PS4 변이체는 슈도모나스 종에서 유래될 수 있다. 구현예에서, 슈나모나스 종은 슈나모나스 사카로필라 및 슈나모나스 스투트제리로부터 선택된다.
PS4 변이체 폴리펩티드는 상기에 설명된 것 이외에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 다른 위치에서, 결실, 삽입, 치환, 염기전환, 염기전이 및 역위와 같은 다른 돌연변이가 또한 포함될 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩티드는 상기에서 설명된 치환 중 하나 이상이 누락될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 절단(truncation)된다. 절단(truncation)은 N-말단 또는 C-말단에 있을 수 있다. 모 효소 또는 PS4 변이체는, 활성 여부에 관계 없이 아-서열(sub-sequence), 시그널 서열, 도메인(domain) 또는 부분 구조(moiety)와 같은 하나 이상의 부분이 결핍될 수 있다. 예를 들면, 모 효소 또는 PS4 변이 폴리펩티드는 본원에 설명된 바와 같이 시그널 서열이 결핍될 수 있다. 대안적으로, 또는 이에 더하여 모 효소 또는 PS4 변이체가 하나 이상의 촉매활성 도메인(catalytic domain) 또는 결합 도메인이 결핍될 수 있다. 바람직한 구현예에서는 모 효소 또는 PS4 변이체는 전분 결합 도메인과 같은 비-말토제닉 엑소아밀라아제에 존재하는 하나 이상의 도메인이 결핍될 수 있다. 예를 들면, PS4 폴리펩티드는 서열 번호 1 에 나타낸 슈도모나스 사카로필라 비-말토제닉 엑소아밀라아제의 넘버링에 대해서 위치 429 이하 서열만을 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, PS4 변이체 pSac-d34 (서열 번호 4c, 도 8c), pSac-D20 (서열 번호 4a, 도 8a) 및 pSac-D14 (서열 번호 4b, 도 8b) 가 제공되며, 이 때 상기 변이체는 도면에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
PS4 변이체는 또한 상동 서열을 포함할 수 있다. 상동 서열은 PS4 변이체 폴리펩티드 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75, 80, 85 또는 90% 이상 상동인 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 상동인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직한 구현예는 또한 관능성 등가물을 포함할 수 있다. 상기 문헌에 기재된 PS4 변이체 폴리펩티드는 하기로부터 유래되거나 하기의 변이체일 수 있다: 폴리펩티드, 바람직하게는 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 보이는 폴리펩티드. 바람직하게는, 모 효소는 비-말토제닉 엑소아밀라아제 자체이다. 바람직한 구현예에서의 PS4 변이체 폴리펩티드는 또한 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 보인다.
본원에 기재된 PS4 변이체는 바람직하게 엑소특이성(exospecificity), 예컨대 본원에 기재된 바와 같이, 그것이 엑소아밀라아제인 것과 일치하는 엑소특이성 지수에 의해 측정된 엑소특이성을 가질 것이다. 더욱이, 그것은 그것이 유래된 폴리펩티드 또는 모 효소와 비교하면, 바람직하게 더 높거나 또는 증가된 엑소특이성을 갖는다. 따라서, 예를 들면, PS4 변이체 폴리펩티드는 20 이상의 엑소-특이성 지수를 가질 수 있으며, 즉, 그것의 총 아밀라아제 활성(엑소-아밀라아제 활성 포함)이 그것의 엔도아밀라아제 활성의 20 배 이상이다. 바람직한 구현예에서, 엑소아밀라아제의 엑소-특이성 지수는 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 또는 100 이상이다. 바람직한 구현예에서, 엑소-특이성 지수는 150 이상, 200 이상, 300 이상 또는 400 이상이다.
바람직하게, PS4 변이체는 모체(parent)보다 더 열안정성이 있다. 바람직하게, PS4 변이체 폴리펩티드는 약 55℃ 내지 약 80℃ 또는 그 이상의 온도에서 전분을 분해할 수 있다. 바람직하게 PS4 변이체는 약 95℃ 이상의 온도에 노출된 후 그것의 활성을 유지한다. 바람직하게, 본원에 기재된 PS4 변이체 폴리펩티드는 바람직하게, 55℃ 내지 약 95℃ 이상의 상승된 온도에서, 바람직하게 약 80℃에서 바람직하게 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상으로 모 효소보다 연장된 반감기를 갖는다. 바람직하게는 시료는 80℃ 또는 그 이상에서 1 내지 10 분 동안 가열된다.
바람직하게, PS4 변이체 폴리펩티드는 pH 에 대해 훨씬 더 안정적이다. 바람직하게, 그것은 그것의 같은 기원의 모 폴리펩티드보다 pH 안정성이 더 높다. 바람직하게, PS4 변이체 폴리펩티드는 약 5 내지 약 10.5 의 pH 에서 전분을 분해할 수 있다. PS4 변이체 폴리펩티드는 동일한 pH 조건하에서 그의 모 폴리펩티드와 비교할 때, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상의 더 긴 반감기를 가질 수 있다. 또다른 구현예에서, pH 안정도는 특정 pH 조건에서 효소의 활성 또는 특이적 활성을 측정함으로써 검정될 수 있다. 특이적 pH 조건은 pH 5 내지 pH 10.5의 임의 pH 일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 관능성 등가물은 PS4 패밀리 구성원 중 하나 이상과 서열 상동성을 가질 것이다. 관능성 등가물은 상기에서 언급된 슈도모나스 사카로필라 및 슈도모나스 스투트제리 비-말토제닉 엑소아밀라아제 중 하나, 바람직하게는 둘 다와 서열 상동성을 가질 것이다. 또한 관능성 등가물은 서열 번호 1 내지 12, 바람직하게는 서열 번호 1 또는 서열 번호 7 또는 둘 다에 기재된 서열 중 임의 서열과 서열 상동성을 가질 것이다. 서열 상동성은 바람직하게 60% 이상, 바람직하게 65% 이상, 바람직하게 75% 이상, 바람직하게 80% 이상, 바람직하게 85% 이상, 바람직하게 90% 이상, 바람직하게 95% 이상이다. 서열 상동성은 본원에 기재된 모든 프로그램 또는 임의 프로그램에 의해 산출될 것이다. 기타 구현예에서, 관능성 등가물은 상기에 기재된 임의 서열에 특이적으로 하이브리디제이션(hybridization)할 수 있을 것이다.
두 번째 국면에서, 상기에 기재된 바와 같이, 본 발명은 핵산을 제공하며, 이 때 핵산은 모 폴리펩티드에서 유래된 PS4 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이다. 모 효소는 바람직하게 서열 번호 1 또는 서열 번호 5 에 기재된 바와 같이 슈도모나스 사카로필라 비-말토제닉 엑소아밀라아제일 것이다. 모 효소는 바람직하게 서열 번호 7 또는 서열 번호 11에 기재된 바와 같이, 슈도모나스 스투트제리 비-말토제닉 엑소아밀라아제일 것이다. PS4 패밀리의 다른 구성원은 모 효소로 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 모 폴리펩티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 5에 기재된 서열을 가진 슈도모나스 사카로필라 비-말토제닉 엑소아밀라아제의 비-말토제닉 엑소아밀라아제이다. 다른 바람직한 구현예에서, 모 폴리펩티드는 서열 번호 7 또는 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 슈도모나스 스투트제리의 비-말토제닉 엑소아밀라아제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, PS4 변이체를 코딩하는 핵산은 아미노산 치환을 코딩함으로써 모 핵산과 상이하며, 이 때 치환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치를 포함하는 위치에 위치한다: 4, 9, 13, 33, 34, 42, 70, 71, 87, 99, 100, 108, 113, 121, 131, 134, 135, 141, 153, 157, 158, 160, 161, 166, 170, 171, 178, 179, 184, 188, 198, 199, 221, 223, 238, 270, 277, 290, 307, 315, 334, 335, 342, 343, 372, 392, 398, 399, 405, 415, 425 (여기서, 위치 넘버링에 대한 언급은 서열 번호 1에 기재된 슈도모나스 사카로필라 서열에 관한 것이다). 바람직하게 위치는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치이다: 33, 34, 87, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 및 334.
바람직하게, PS4 변이체를 코딩하는 핵산은 폴리펩티드의 하나 이상의 치환을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 치환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: N33Y, D34N, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L 및 S334P. 바람직하게, PS4 변이체를 코딩하는 핵산은, L178F 또는 A179T 의 하나 이상의 추가 치환과 함께 하기 치환을 포함한다: N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, G223A, H307L 및 S334P. 바람직하게, PS4 변이체를 코딩하는 핵산은 하기 치환 중 하나를 포함한다: N33Y, D34N, I157L, L178F, A179T, G223A 또는 H307L. 바람직하게, PS4 변이체를 코딩하는 핵산은 하기 치환 중 하나를 포함한다: G87S, G134R, A141P 또는 S334P. 또다른 구현예에서, PS4 변이체를 코딩하는 핵산은 하기 치환 중 하나를 포함한다: K71R, K108R, G158D, Y171S, G188A 및 D343E.
한 구현예에서, PS4 변이체를 코딩하는 핵산은 하기의 군으로부터 선택된 조합을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다:
Figure 112006001199932-PCT00006
Figure 112006001199932-PCT00007
Figure 112006001199932-PCT00008
Figure 112006001199932-PCT00009
바람직한 구현예에서, PS4 변이체를 코딩하는 핵산은 서열 번호 2; 서열 번호 3; 서열 번호 4; 서열 번호 4a; 서열 번호 4b; 서열 번호 4c; 서열 번호 8, 서열 번호 9 또는 서열 번호 10 을 포함하는 아미노산 서열을 코딩한다.
바람직한 구현예에서, 상기 핵산은 절단된 폴리펩티드를 코딩한다. 절단은 N-말단 또는 C-말단에 있을 수 있다. 모 효소 또는 PS4 변이체는 활성 여부에 관계 없이 아 서열, 시그널 서열, 도메인 또는 부분 구조와 같은 하나 이상의 부분이 결핍될 수 있다. 예를 들면, 모 효소 또는 PS4 변이체 폴리펩티드는 시그널 서열이 결핍될 수 있다. 대안적으로, 또는 이에 더하여, 모 효소 또는 PS4 변이체는 하나 이상의 촉매활성 도메인 또는 결합 도메인이 결핍될 수 있다. 바람직한 구현예에서는 모 효소 또는 PS4 변이체는 전분 결합 도메인과 같은 비-말토제닉 엑소아밀라아제에 존재하는 하나 이상의 도메인이 결핍될 수 있다. 예를 들면, PS4 폴리펩티드는 서열 번호 1 에 나타낸 슈도모나스 사카로필라 비-말토제닉 엑소아밀라아제의 넘버링에 대해서 위치 429 이하 서열만을 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 도면에 나타낸 PS4 변이체 pSac-d34, pSac-D20 및 pSac-D14를 코딩한다.
PS4 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 상기에 설명된 것 이외에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 다른 위치에서, 결실, 삽입, 치환, 염기전환, 염기전이 및 역위와 같은 다른 돌연변이가 또한 포함될 수 있다. 마찬가지로, 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드는 상기에서 설명된 치환 중 하나 이상이 누락될 수 있다.
PS4 변이체를 코딩하는 핵산은 또한 상동 서열을 포함할 수 있다. 상동 서열은 PS4 변이체 폴리펩티드 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75, 80, 85 또는 90% 이상 상동인 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 상동인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직한 구현예는 또한 PS4 변이체의 관능성 등가물인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 문헌에 기재된 PS4 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 하기로부터 유래되거나 하기의 변이체일 수 있다: 바람직하게, 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 핵산. 바람직하게는, 핵산에 의해 코딩된 모 효소는 비-말토제닉 엑소아밀라아제 자체이다. 바람직한 구현예에서의 핵산에 의해 코딩된 PS4 변이체 폴리펩티드는 또한 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 보인다.
핵산에 의해 코딩된 PS4 변이체는 바람직하게 엑소특이성, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이, 엑소특이성 지수에 의해 측정된 엑소특이성을 가질 것이다. 더욱이, 바람직하게는, 그것은 바람직하게 동일한 조건하에서 그것이 유래된 폴리펩티드 또는 모 효소와 비교시, 더 높거나 또는 증가된 엑소특이성을 갖는다. 따라서, 예를 들면, PS4 변이체 폴리펩티드는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 그 이상의 엑소특이성 지수를 가질 것이다. 이들은 바람직하게는 동일한 조건에서 그것의 모 폴리펩티드와 비교시, 1.5x 이상, 2x 이상, 5x 이상, 10x 이상, 50x 이상, 100x 이상을 가질 것이다.
바람직하게, 핵산에 의해 코딩된 PS4 변이체는 모체 상대쪽보다 더 큰 열안정성을 가질 것이다. 바람직하게, PS4 변이체 폴리펩티드는 약 55℃ 내지 약 80℃ 이상의 온도에서 전분을 분해할 수 있다. 바람직하게, PS4 변이체는 약 95℃ 이하의 온도에 노출된 후에 그것의 활성을 보유한다. 본원에 기재된 PS4 변이체 폴리펩티드는 바람직하게 55℃ 내지 약 95℃ 이상의 상승된 온도에서, 바람직하게 약 80℃에서, 바람직하게 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 그 이상으로 모 효소보다 반감기를 연장시킨다. 바람직하게는 시료는 80℃ 또는 그 이상에서 1 내지 10 분 동안 가열된다.
바람직하게, 핵산에 의해 코딩된 PS4 변이체 폴리펩티드는 pH 에 대해 안정적이다. 바람직하게, 그것은 그것의 모 폴리펩티드보다 pH 안정성이 더 높다. 바람직하게, PS4 변이체 폴리펩티드는 약 5 내지 약 10.5 의 pH 에서 전분을 분해할 수 있다. 구체적인 pH 조건은 pH 5 내지 pH 10.5의 임의 pH 일 수 있다. 핵산에 의해 코딩된 PS4 변이체 폴리펩티드는 동일한 조건하에서 모 폴리펩티드와 비교할 때, 더 긴 반감기, 또는 더 높은 활성(검정에 따라 좌우됨)을 가질 수 있다. PS4 변이체 폴리펩티드는 동일한 pH 조건 하에서, 그것의 모 폴리펩티드와 비교할 때 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상의 반감기를 가질 수 있다. 대안적으로, 또는 이에 더하여, 그것은 동일한 pH 조건하에서 모 폴리펩티드와 비교할 때, 더 높은 활성을 가질 수 있다.
바람직한 구현예에서, 핵산에 의해 코딩된 관능성 등가물은 PS4 패밀리 구성원 중 하나 이상과 서열 상동성을 가질 것이다. 관능성 등가물은 상기에서 언급된 슈도모나스 사카로필라 및 슈도모나스 스투트제리 비-말토제닉 엑소아밀라아제 중 하나, 바람직하게는 둘 다와 서열 상동성을 가질 것이다. 또한 관능성 등가물은 서열 번호 1 내지 12, 바람직하게는 서열 번호 1 또는 서열 번호 7 또는 둘 다에 기재된 서열 중 임의 서열과 서열 상동성을 가질 것이다. 서열 상동성은 바람직하게 60% 이상, 바람직하게 65% 이상, 바람직하게 75% 이상, 바람직하게 80% 이상, 바람직하게 85% 이상, 바람직하게 90% 이상, 바람직하게 95% 이상이다.
또다른 구현예에서, 본원에 기재된 임의 PS4 변이체를 코딩하는 핵산과 상보적인 핵산이 제공된다. 추가적으로, 상기 상보물에 하이브리디제이션할 수 있는 핵산이 제공된다. 바람직한 구현예에서, 관능성 등가물을 코딩하는 핵산은 특히 상기에 기재된 임의 서열에 하이브리디제이션할 수 있는데, 그것은 그것의 상보물과 함께 본원에 제공된다.
바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 서열은 합성 서열이다. 그것은 이에 제한되는 것은 아니지만, 메탄올 자화 효모 피키아(Pichia) 및 한세눌라(Hansenula)와 같은 숙주 유기체에 대한 최적 코돈을 이용하는 서열을 포함한다.
본 발명의 세번째 국면은 하나 이상의 PS4 변이체 폴리펩티드 및 기타 성분을 포함하는 조성물을 제공한다. 기타 성분은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 효소일 수 있다: 옥시도리덕타아제, 하이드롤라아제, 리파아제, 에스테라아제, 글리코시다아제, 아밀라아제, 풀루라나아제, 자일라나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 전분 분해 효소, 프로테아제 및 리폭시게나아제. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 WO 91/04669에 개시된 바와 같이, 하나 이상의 PS4 변이체 및 바실러스(bacillus)의 말토제닉 아밀라아제를 포함한다. 바람직한 구현예는 PS4 변이체 및 곡분을 포함한다.
추가 효소는 곡분, 물 또는 임의의 기타 성분 또는 첨가제 또는 반죽 개선 조성물을 포함하는 임의 반죽 성분과 함께 첨가될 수 있다. 추가 효소는 곡분, 물 및 임의 기타 성분 및 첨가제 또는 반죽 개선 조성물 전 또는 후에 첨가될 수 있다. 추가 효소는 액체 제제 또는 건조 조성물의 형태일 수 있다.
네 번째 국면은 PS4 변이체 폴리펩티드를 포함하는 벡터, PS4 변이체 폴리펩티드를 포함하는 세포 및 PS4 변이체 폴리펩티드 발현 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 PS4 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 가진 복제가능한 재조합 벡터에 관한 것이다. 벡터는 추가적으로 본원에 기재된 임의 구성원을 포함할 수 있다. 또다른 바람직한 구현예는 PS4 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 본원에 기재된 임의의 효모 세포, 박테리아 또는 진균일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 바와 같이 PS4 폴리펩티드의 발현 방법을 제공한다.
본 발명의 기타 국면은 관련 적용 (임의 그림, 참고서 및 도면을 포함하며, 본원에 참고 문헌으로 포함되는 대리인 문서 제 674510-2007 호 및 제 GC807 호)에서 알아낼 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1 은 PS4 변이체의 열안정성 향상을 보여주는 그래프이다. PS4cc1 은 시그널 서열이 없고 전분 결합 도메인이 결핍된 슈도모나스 사카로필라로부터 유래된 발현된 대조군 효소이다. 온도(℃)에 대해 PS4ccl, pSac-D3, pSac-D20 및 pSac-D14의 분당 반감기를 도면에 나타냈다.
도 2 는 반죽 시스템 시험 모델에서 PSac-D34 의 투여량 효과 (dosage effect) 를 보이는 그래프이다. 빵의 속의 고체 함량은 NMR로 측정했다. 고체 함량에 의해 측정된 대조군, D34의 0.5, 1, 2 ppm 의 경도는 베이킹 후 경과 일수에 따라 도면에 나타냈다.
도 3 은 곡분 kg 당 1mg 의 투여량으로 PSac-D3 및 Psac-D14를 첨가시 감소된 경도 및 경화 속도를 보이는 베이킹 시도의 결과를 나타내는 그래프이다. hPa로 측정된 경도를 대조군용으로 베이킹 후 경과 일수에 따라 도면에 나타냈다.
도 4 는 N33Y, D34N, K71R, L178F, A179T 없는 Psac-D3 과 비교하여, PSac-D3 (G134R, A141P, I157L, G223A, A307L, S334P, K71R, D343E, N33Y, D34N, L178F, A179T)의 증가된 연화 유효성을 보이는 베이킹 시도를 보여주며, 이것은 75℃에서의 반감기가 3,6인 반면, PSac-D3의 반감기는 75℃에서 9,3 분이다.
도 5 는 슈도모나스 사카로필라 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열로부터 유래된 PS4(서열 번호 1) 참고 서열을 나타낸다.
도 6 은 PS4 변이체 (서열 번호 2)의 서열; 치환 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, L178F 및 A179T 을 가진 슈도모나스 사카로필라 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열을 나타낸다.
도 7 은 PS4 변이체 (서열 번호 3)의 서열;치환 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, L178F, A179T 및 G121D 을 가진 슈도모나스 사카로필라 말토테르라히드롤라아제 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8a 는 PS4 변이체 (서열 번호 4)의 서열; 치환 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, L178F, A179T, G121D 및 G87S을 가진 슈도모나스 사카로필라 말토테르라히드롤라아제 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8b 는 PSac-D20 서열 (서열 번호 4a); 13개의 치환 및 전분 결합 도메인의 결실을 가진 슈도모나스 사카로필라 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8c 는 PSac-D14 서열 (서열 번호 4b); 14 개의 치환 및 전분 결합 도메인의 결실을 가진 슈도모나스 사카로필라 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8d 는 Psac-D34 서열; 11개의 치환 및 전분 결합 도메인의 결실을 가진 슈도모나스 사카로필라 아미노산 서열을 나타낸다.
도 9 는 슈도모나스 사카로필라 말토테트라히드롤라아제 (서열 번호 5)의 아미노산 서열; 슈도모나스 사카로필라 글루칸 1,4-알파-말토테트라히드롤라아제 전구체 (EC 3.2.1.60) (G4-아밀라아제) (말토테트라오스-형성 아밀라아제) (엑소-말토테트라오히드롤라아제) (말토테트라오스-형성 엑소-아밀라아제)을 나타낸다. SWISS-PROT 접근 번호 P22963.
도 10A 및 10B 는 슈도모나스 사카로필라 말토테트라히드롤라아제 (서열 번호 6)의 핵산 서열; 말토테트라오히드롤라아제를 코딩하는 슈도모나스 사카로필라 mta 유전자(EC 번호 = 3.2.1.60)을 나타낸다. GenBank 접근 번호 X16732.
도 11 은 슈도모나스 스투트제리 말토테트라히드롤라아제 (서열 번호 7)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 12 는 PStu-D34 (서열 번호 8)의 서열; 치환 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N 을 가진 슈도모나스 스투트제리 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열을 나타낸다.
도 13 은 PStu-D20 (서열 번호 9)의 서열; 치환 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N 및 G121D을 가진 슈도모나스 스투트제리 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열을 나타낸다.
도 14 는 PStu-D14 (서열 번호 10); 치환 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, G121D 및 G87S을 가진 슈도모나스 스투트제리 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열을 나타낸다.
도 15 는 슈도모나스 스투트제리 (슈도모나스 페르펙토마리나(perfectomarina)) (서열 번호 11)의 서열; 글루칸 1,4-알파-말토테트라히드롤라아제 전구체 (EC 3.2. 1.60) (G4-아밀라아제) (말토테트라오스-형성 아밀라아제) (엑소-말토테트라오히드롤라아제) (말토테트라오스-형성 엑소-아밀라아제)을 나타낸다. SWISS-PROT 접근 번호 P13507.
도 16 은 슈도모나스 스투트제리 말토테트라히드롤라아제 핵산 서열; 슈도모나스 스투트제리 말토테트라오스-형성 아밀라아제 (amyP) 유전자, 완전 cds를 나타낸다. GenBank 접근 번호 M24516 (서열 번호 12).
바람직한 구현예의 상세한 설명
본 발명의 실행은 달리 언급되지 않는다면, 당업자의 능력 범위 내에 있는 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 상기 기술은 예컨대 하기 문헌에 설명된다: J. Sambrook, E. F. Fritsch, 및 T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. 등. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch.9, 13 및 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree 및 A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice;Oxford University Press; M.J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley 및 J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson "Immunocytochernistry : Theory and Practice", CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed); "Immunochemical Protocols, vol 80", in the series:"Methods in Molecular Biology", Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); and Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3. 상기 일반 본문 각각은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "PS4" 는 서열 번호 1 또는 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 엑소아밀라아제와 같은 슈도모나스 사카로필라 비-말토제닉 엑소아밀라아제, 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 같은 슈도모나스 스투트제리 비-말토제닉 엑소아밀라아제와 관능성 상동성을 갖거나 또는 상기 서열을 갖거나 이와 유연 관계가 있는 패밀리 구성원에 관한 것이다. 다른 패밀리 구성원은 표 1에 나타냈다.
슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라아제로부터 유래된 PS4 변이체에 대한 위치 넘버링은 서열 번호 1에 대한 것이다:
Figure 112006001199932-PCT00010
.
참고 서열은 SWISS-PROT 접근 번호 P22963을 가지나, 시그널 서열 MSHILRAAVLAAVLLPFPALA이 없는 슈도모나스 사카로필라 서열로부터 유래된다.
또한, 넘버링 시스템은, 그것이 염기 참고 포인트로서 특정 서열을 이용함에도 불구하고, 모든 관련 상동 서열에 적용할 수 있다. 예를 들면, 위치 넘버링은 다른 슈도모나스 종의 상동 서열, 다른 박테리아의 상동 서열에 적용될 수 있다. 바람직하게 상기 상동 서열은, 서열 번호 1의 참고 서열과 60% 이상의 상동성, 예컨대 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 상동성을 가진다. 단백질간의 서열 상동성은 본원에 기재된 하이브리디제이션 기술 및 공지된 정렬 프로그램을 이용해 확인될 수 있다.
슈도모나스 스투트제리에서 유래된 PS4 변이체에 대한 위치 넘버링은 서열 번호 7에 관한 것이다:
Figure 112006001199932-PCT00011
본원에 사용된 "PS4 변이체 핵산"은 PS4 패밀리 구성원의 변이체인 PS4 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 지칭한다.
본원에 사용된 "PS4 변이체 폴리펩티드" 또는 "PS4 변이체" 는 PS4 패밀리 구성원의 변이체인 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 "모 효소", "모 서열", "모 폴리펩티드" 및 "모 폴리펩티드"는 PS4 변이체 폴리펩티드가 기초한 폴리펩티드 및 효소를 의미한다. 모 효소는 전구체 효소(즉, 실제로 돌연변이된 효소) 일 수 있거나, 새로이(de novo) 제조될 수 있다. 모 효소는 야생형 효소일 수 있다.
본원에 사용된 "변이체"는 모 분자에서 유래된 분자를 의미한다. 변이체는 핵산 뿐 아니라 폴리펩티드를 포함할 것이다. 변이체는 다른 것들 중에, 하나 또는 그 이상의 위치에서 치환, 삽입, 염기전환 및 역위를 포함한다. 변이체는 또한 절단을 포함한다. 변이체는 모 분자의 상동성 및 관능성 유도체를 포함한다. 변이체는 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리디제이션할 수 있는 서열과 상보적인 서열을 포함한다. 예를 들면, 변이체 서열은 엄격한 조건(50℃ 및 0.2xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3시트레이트 pH 7.0})하에서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리디제이션할 수 있는 서열과 상보적이다. 더 바람직하게, 용어 변이체는 엄격한 조건(예를 들어, 65℃ 및 0.1xSSC{1xSSC=0.15 M NaCl, 0.015 M Na3시트레이트 pH 7.0}) 하에서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리디제이션할 수 있는 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "전구체" 는 개질된 효소를 제조하는데 사용된 효소를 의미한다. 전구체는 돌연변이유발에 의해 개질된 효소일 수 있다. 마찬가지로, 전구체는 야생형 효소, 변이체 야생형 효소 또는 이미 돌연변이된 효소일 수 있다.
본원에 사용된 모 효소와 관련된 "관능성 등가물"은 모 분자와 유사한 또는 동일한 관능성을 가진 분자를 의미한다. 모 분자는 슈도모나스 사카로필라 비-말토제닉 엑소아밀라아제 또는 슈도모나스 스투트제리 비-말토제닉 엑소아밀라아제 또는 기타 근원으로부터 수득된 폴리펩티드일 수 있다. 관능성 등가 효소는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 가질 것이다. 관능성을 측정하기 위한 검정의 예시는 본원에 개시되었으며, 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 "단리된" 이란, 서열이 자연히 연계되고 자연에서 발견되는 하나 이상의 기타 성분으로부터 그 서열이 적어도 실질적으로 유리된 것을 의미한다.
본원에 사용된 "정제된" 이란, 서열이 상대적으로 순수한 상태 - 예를 들면, 약 90% 이상 순수, 또는 약 95% 이상 순수 또는 약 98% 이상의 순수한 상태를 의미한다.
본원에 사용된 "아밀라아제" 는 다른 것들 중에, 전분 분해를 촉진시킬 수 있는 효소를 의미한다. 아밀라아제는 전분의 α-D(1→4)O-글리코시드 연결을 절단하는 가수분해 효소이다. 일반적으로 α-아밀라아제(E.C.3.2.1.1, α-D-(1→4)-글루칸 글루카노히드롤라아제)는 무작위로 전분 분자 내에서 α-D(1→4)O-글리코시드 연결을 절단하는 엔도-작용 효소로서 정의된다. 반대로, 엑소-작용 전분 분해 효소(amylolytic enzyme), 예컨대 β-아밀라아제(E.C.3.2.1.2, α-D-(1→4)-글루칸 말토히드롤라아제) 및 말토제닉 알파-아밀라아제(E.C. 3.2.1.133)과 같은 일부 생성물-특이적 아밀라아제는 전분 분자를 기질의 비-환원 말단으로부터 절단시킨다. β-아밀라아제, α-글루코시다아제(E.C.3.2.1.20, α-D-글루코시드 글루코히드롤라아제), 글루코아밀라아제(E.C.3.2.1.3, α-D(1→4)-글루칸 글루코히드롤라아제), 및 생성물-특이적 아밀라아제는 전분으로부터 특이적 길이의 말토-올리고당을 생성할 수 있다.
본원에 사용된 "비-말토제닉 엑소아밀라아제 효소" 는 전분을 실질적인 양의 말토오스로 처음부터 분해하지 않는 효소를 의미한다. 상기 측정용 검정이 본원에 제공된다.
본원에 사용된 "선형 말토-올리고당"은 α-(1→4)결합에 의해 연결된 α-D-글루코피라노오스의 2-20 단위를 의미한다.
본원에 사용된 "열안정성"은 상승된 온도에 노출된 후, 활성을 보유하는 효소의 능력을 지칭한다. 비-말토제닉 엑소아밀라아제와 같은 효소의 열안정성은 반감기에 의해 측정된다. 반감기 (t1/2)는 정의된 조건하에서 효소 활성의 절반이 불활성되는 동안의 분이다. 반감기 값은 잔류 아밀라아제 활성을 측정함으로써 계산된다. 반감기 검정은 실시예에서 더 자세히 기재된 대로 실시된다.
본원에 사용된 "pH 안정성" 은 pH 광범위에 걸친 활성을 보유하는 효소의 능력을 지칭한다. pH 검정은 실시예에 기재된 대로 실시된다.
본원에 사용된 "엑소-특이성"은 비치환된 엑소아밀라제의 엑소-특이성 비율을 비교시의, 향상된, 예컨대 증가된 "엑소 특이성 지수"에 관한 것이다.
본원에 사용된 "엑소-특이성 지수" 는 전체 엔도아밀라아제 활성에 대한 전체 아밀라아제 활성 비를 의미한다. 아밀라아제 및 엔도아밀라아제 활성 측정용 검정이 본원에 제공된다.
본원에 사용된 "식품"은 곡분과 같은 식품의 성분뿐 아니라 차려진 식품 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 "식품 성분"은 기능성 식품 또는 식료품에 첨가되거나 첨가될 수 있는 제형물을 포함하며, 예를 들면, 산성화 또는 유화를 요구하는 다양한 제품에서 저 수준으로 사용된 제형물도 포함한다. 식품 성분은 용도 및/또는 적용 양태 및/또는 투약 양태에 따라 고체로서 존재하거나 또는 용액의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 "기능성 식품"은 영양 효과 및/또는 기호 만족 뿐 아니라, 소비자에게 추가의 유익한 효과를 제공할 수 있는 식품을 의미한다.
본원에 사용된 "아미노산 서열"은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질"과 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "펩티드"와 동의어이다. 일부 예에서 용어 "아미노산 서열"은 용어 "효소"와 동의어이다.
본원에 사용된 "펩토이드 형태"는 α-탄소 치환기가 α-탄소라기 보다는 잔기의 질소 원자 상에 있는 변이체 아미노산 잔기를 지칭한다. 펩토이드 형태의 펩티드 제조 방법은 당분야, 예컨대 문헌[Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol (1995) 13 (4), 132-134]에 공지되어 있다.
본원에 사용된 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 올리고뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 변이체, 상동체, 절편 및 그의 유도체(예컨대, 그의 부분)를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열은 센스 또는 안티-센스 가닥을 나타내는지 여부에 상관없이 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있는, 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원일 수 있다. 본원에 사용된 용어 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 RNA를 포함한다. 바람직하게, 그것은 DNA, 더욱 바람직하게는 PS4 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 서열을 의미한다.
본원에 사용된 "전분"은 그 자체 전분 또는 그의 성분, 특히 아밀로펙틴을 의미한다. 용어 "전분 매질"은 전분을 포함하는 임의의 적합한 매질을 의미한다. 용어 "전분 생성물"은 전분에서 유래되거나 전분에 기초하거나 전분을 포함하는 임의의 생성물을 의미한다. 바람직하게, 전분 생성물은 밀 곡분으로부터 수득된 전분으로부터 유래되거나 기초하거나 함유한다.
본원에 사용된 "곡분"은 밀 또는 기타 곡식을 정교하게 가루로 만든 가루를 의미한다. 예를 들면, 곡분은 기타 곡식으로부터가 아닌 밀 자체로부터 수득될 수 있다. 밀 곡분은 밀 곡분 자체를 지칭할 수 있을 뿐만 아니라 반죽과 같은 매질에 존재할 때의 밀 곡분을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 "베이킹된 전분질의 빵 생성물"은 반죽 형성 조건하에서 곡분, 물 및 발효소제를 혼합함으로써 수득될 수 있는 반죽 상에 기초한 임의의 베이킹된 생성물을 의미한다. 추가 성분이 반죽 혼합물에 첨가될 수 있다.
본원에 사용된 "상동체" 및 "상동성"은 대상체 아미노산 서열 및 대상체 뉴클레오티드 서열과의 동일성 정도를 가진 존재를 의미한다. 상동 서열은 대상체 서열과 75, 80, 85 또는 90% 이상, 바람직하게는 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이 상동인 아미노산 서열을 포함하는 것으로 여겨진다. 전형적으로 상동체는 대상체 아미노산 서열과 동일한 활성 부위를 포함할 것이다.
본원에 사용된 "하이브리디제이션"는, 핵산 가닥이 염기쌍 및 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 기술에 실시된 증폭 공정을 통해 상보성 가닥과 연결되는 공정을 포함한다. PS4 핵산은 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA, RNA/DNA 이질두가닥 (heteroduplex) 또는 RNA/DNA 공중합체로서 존재할 수 있다.
본원에 사용된 "공중합체"는 리보뉴클레오티드 및 디옥시리보뉴클레오티드 모두를 포함하는 단일 핵산 가닥을 지칭한다. PS4 핵산은 심지어 추가로 발현을 증가시키기 위해 최대한으로 활용된 코돈일 수 있다.
본원에 사용된 "합성"은 시험관내 화학 또는 효소 합성에 의해 생성된 것을 지칭한다. 그것은 이에 제한되는 것은 아니지만, 메탄올 자화 효모 피키아 및 한세눌라와 같은 숙주 유기체에 대한 최적 코돈을 이용하는 PS4 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 "형질전환 세포" 는 재조합 DNA 기술을 이용해 형질전환된 세포를 포함하는 것을 의미한다. 형질전환은 전형적으로 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 세포로 삽입함으로써 일어난다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 이종기원의 뉴클레오티드 서열일 수 있다(즉, 형질전환될 세포에 대해 자연성(natural)이지 않은 서열이다). 게다가, 또는 대안적으로, 삽입된 뉴클레오티드 서열은 상동 뉴클레오티드 서열이므로(즉, 형질전환될 세포에 대해 자연성인 서열이다), 그 안에 이미 존재하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 여분의 카피(copy)를 상기 세포는 수용한다.
본원에 사용된 "작동적으로 연결된"이란 설명된 성분이 그것의 의도하는 방식으로 작용할 수 있도록 상관되어 있음을 의미한다. 코딩 서열과 작동적으로 연결된 조절 서열은 코딩 서열이 대조군 서열과 양립할 수 있는 조건하에서 발현되는 방식으로 라이게이션(ligation) 된다.
본원에 사용된 "생물학적으로 활성인"이란 자연히 발생하는 서열의 유사한 구조적 관능(그러나 반드시 동일한 정도까지는 아님), 및/또는 유사한 조절 관능(그러나, 반드시 동일한 정도까지는 아님) 및/또는 유사한 생물화학적 관능(그러나, 반드시 동일한 정도까지는 아님)을 갖는 서열을 지칭한다.
I. 본 발명의 폴리펩티드의 상세한 설명
첫 번째 국면에서, 본 발명은 PS4 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, 이 때 상기 PS4 변이체는 모 폴리펩티드로에서 유래된 것이다. 모 효소는 바람직하게, 비-말토제닉 엑소아밀라아제, 바람직하게 박테리아성 비-말토제닉 엑소아밀라아제 효소일 수 있다. 모 효소는 바람직하게 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 보이는 폴리펩티드일 수 있다.
모 효소는 슈도모나스 사카로필라 비-말토제닉 엑소아밀라아제, 예컨대 서열 번호 1 또는 서열 번호 5에 나타낸 엑소아밀라아제일 수 있다. 모 효소는 슈도모나스 스투트제리 비-말토제닉 엑소아밀라아제, 예컨대 서열 번호 7 또는 서열 번호 11에 기재된 폴리펩티드일 수 있다. PS4 패밀리의 기타 구성원은 하기 표 1 에 기재된 모 효소로서 사용될 수 있다. 바람직하게, PS4 패밀리 구성원은 일반적으로 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 7 또는 서열 번호 11에 기재된 엑소아밀라아제와 유사, 상동 또는 기능적으로 등가적일 것이며, 프로브를 이용한 적합한 라이브러리의 하이브리디제이션 스크리닝과 같은 표준 방법 또는 게놈 서열 분석으로 식별될 수 있다. 식별 방법은 하기에 나타냈다:
Figure 112006001199932-PCT00012
표 1. 모 서열(PS4 패밀리 구성원). 도시한 서열은 표의 맨 처음 줄에 나타낸 위치에서의 슈도모나스 사카로필라 서열과 제시한 아미노산 잔기로 이루어진 치환을 포함함으로써 상이하다. 예를 들면, pS4ccl-S161A 는 야생형 슈도모나스 비-말토제닉 엑소-아밀라아제의 변이체이고 따라서 모 효소로서 사용될 수 있다. 게다가 ATCC17686과 같은 슈도모나스 종의 기타 균주로부터의 비-말토제닉 엑소아밀라아제는 또한 모 폴리펩티드로서 사용될 수 있다. PS4 변이체 폴리펩티드 잔기는 임의의 상기 모 서열로 삽입되어 변이체 PS4 폴리펩티드 서열을 생산할 수 있다.
PS4 변이체 폴리펩티드는 아미노산 치환을 포함하는 많은 돌연변이를 포함함으로써 모 서열과 상이하다. 바람직한 구현예에서, 모 폴리펩티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 5에 기재된 서열을 가진 슈도모나스 사카로필라 비-말토제닉 엑소아밀라아제의 비-말토제닉 엑소아밀라아제이다. 다른 바람직한 구현예에서, 모 폴리펩티드는 서열 번호 7 또는 서열 번호 11 에 나타낸 서열을 가진 슈도모나스 스투트제리의 비-말토제닉 엑소아밀라아제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, PS4 변이체는 아미노산 치환을 포함함으로써 모 폴리펩티드와 상이하며, 상기 치환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치를 포함하는 위치에 위치된다:
Figure 112006001199932-PCT00013
(여기서, 위치 넘버링에 대한 언급은 서열 번호 1 에 나타난 슈도모나스 사카로필라 엑소아밀라아제 서열에 관한 것이다). 바람직하게, 위치는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있다: 33, 34, 87, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 및 334. 다른 구현예에서, 변이체는 71, 108, 158, 171, 188 및 343의 군으로부터 선택된 치환을 추가로 포함한다. 또다른 구현예에서, 변이체는 추가로 113, 198 및 290의 군으로부터 선택된 치환을 포함한다.
바람직하게, PS4 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다: N33Y, D34N, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L 및 S334P. 바람직하게, PS4 변이체는 추가적인 하나 이상의 L178F 또는 A179T의 치환과 함께 하기 치환을 포함한다: N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, G223A, H307L 및 S334P. 바람직하게 PS4 변이체는 하기 치환 중 하나를 포함한다: N33Y, D34N, I157L, L178F, A179T, G223A 또는 H307L. 바람직하게, PS4 변이체는 하기 치환 중 하나를 포함한다: G87S, G134R, A141P 또는 S334P. 또다른 구현예에서, PS4 변이체는 하기 치환 중 하나를 포함한다: K71R, K108R, G158D, Y171S, G188A 및 D343E. 또 다른 구현예에서, PS4 변이체는 하기 치환 중 하나를 포함한다: V113I, Y198F, Y198W 및 V290I.
이론에 구애되지 않고, 본 발명자들은 제안된 기질 모델 결합 부위(Chemical Computing Group, Inc., Montreal Canada에서 입수가능한 Molecular Operating Environment [MOE] 소프트웨어 프로그램에 의해 표시됨)와 함께 슈도모나스 아밀라아제의 3차원 결정 구조가 잔기 위치 121, 157, 223 및 307 이 기질 결합 부위에 매우 근접함을 지시함을 제안했다. 실시예에서 나타낸 데이터는 G121D가 효소의 안정성 및 엑소-특이성을 모두 개선시키며, G223A 가 효소 열안정성을 개선시킨다는 것을 증명하므로, 상기 개선이 이미 관측되고, 기질 결합 부위에 근접한 것으로 예상되는 위치라면, 상기 각 위치에서의 모든 가능한 아미노산을 치환시켜 추가 개선을 수득할 수 있다. 한 구현예에서, 근접성은 기질 결합 부위의 10.0 옹스트롬 내에 있는 특정 위치를 지칭한다. 또다른 구현예에서, 근접성은 기질 결합 부위의 7.5 옹스트롬 내에 있는 특정 위치를 지칭한다. 한 구현예에서, 근접성은 기질 결합 부위의 6.0 옹스트롬 내에 있는 특정 위치를 지칭한다. 예를 들면, G121 C-알파는 기질까지 5.9 옹스트롬; G223 C-알파는 기질까지 5.82 옹스트롬이다.
한 구현예에서, PS4 변이체는 하기의 군으로부터 선택된 조합을 포함한다:
Figure 112006001199932-PCT00014
한 구현예에서, PS4 변이체는 하기로부터 선택되는 조합을 포함한다:
Figure 112006001199932-PCT00015
한 구현예에서, PS4 변이체는 하기로부터 선택되는 조합을 포함한다:
Figure 112006001199932-PCT00016
한 구현예에서, PS4 변이체는 하기로부터 선택되는 조합을 포함한다:
Figure 112006001199932-PCT00017
PS4 변이체 폴리펩티드는 상기에 기재된 것 이외에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 기타 위치에서 결실, 삽입, 치환, 염기전환, 염기전이 및 역위와 같은 다른 돌연변이가 또한 포함될 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩티드는 상기에 기재된 치환 중 하나 이상이 누락될 수 있다.
PS4 변이체는 또한 치환은 동등한 것끼리의 치환으로서(예컨대, 염기는 염기로, 산은 산으로, 극성은 극성으로 등) 일어날 수 있는 보존성 치환을 포함할 수 있다. 또한, 비-보존성 치환, 즉 대안적으로 오르니틴(이하 Z 로 지칭함), 디아미노부티르산 오르니틴(이하 B로 지칭함), 노르류신 오르니틴(이하 O로 지칭함), 피리일알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 인위 아미노산의 삽입을 포함하여 잔기의 한 클래스에서 다른 클래스로 일어날 수 있다.
서열은 또한 침묵적 변화(silent change)를 일으켜 그 결과 기능적으로 등가인 물질을 제공하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 계획적인 아미노산 치환은 아미노산 특성(예컨대, 잔기의 극성, 충전, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성)의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있고, 따라서 관능기에서 아미노산을 함께 구분하기에 유용하다. 아미노산은 오직 그것의 측쇄의 특성에 기초해 함께 구분할 수 있다. 그러나, 돌연변이 데이타도 포함하는 것이 더 유용하다. 이에 따라 유도된 아미노산의 세트는 구조적인 이유에서 보존되기 쉽다. 상기 세트는 벤 도표(Venn diagram)의 형태로 설명될 수 있다(Livingstone C. D. 및 Barton G. J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation"Comput. Appl Biosci. 9: 745-756) (Taylor W. R. (1986) "The classification of amino acid conservation"J. Theo : Biol. 119; 205-218). 예를 들면, 보존성 치환은 일반적으로 수용되는 아미노산의 벤 도표 집단을 설명하는 하기의 표에 따라 형성될 수 있다:
Figure 112006001199932-PCT00018
.
변이체 아미노산 서열은 또한 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서(spacer)에 더하여 메틸, 에틸 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함하는 서열의 임의 2 개의 아미노산 잔기 사이에 삽입된 적합한 스페이서기를 포함할 수 있다. 변이체의 추가 형태는 펩토이드 형태의 하나 이상의 아미노산 잔기 존재를 포함한다.
PS4 변이체는 또한 상동 서열을 포함할 수 있다. 상동 서열은 PS4 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75, 80, 85 또는 90% 이상, 바람직하게는 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 상동인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 전형적으로 상동체는 대상체 서열로서 활성 부위를 코딩하는 동일한 서열을 포함할 것이다.
육안으로, 또는 더 통상적으로는 용이하게 입수가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 상동성 비교를 수행할 수 있다. 상기 시판되고 있는 컴퓨터 프로그램은 두 개 이상의 서열간의 % 상동성을 계산할 수 있다. % 상동성은 연속적인 서열상에서 계산될 수 있다, 즉 하나의 서열을 나머지 서열과 정렬시켜 한 서열의 각 아미노산을 나머지 서열의 대응되는 아미노산과 한번에 한 잔기씩 직접 비교한다. 이것은 "갭없는" 정렬이라 불린다. 전형적으로, 상기 갭없는 정렬은 상대적으로 짧은 수많은 잔기 상에서만이 수행된다.
상기는 매우 간단하고 모순 없는 방법이지만, 예를 들면, 다른 점에서 동일한 서열 쌍에서, 한 개의 삽입 또는 결실이 후속하는 아미노산 잔기가 정렬에서 벗어나게하여, 전체 정렬 수행시 잠재적으로 % 상동성에서 커다란 감소 결과를 보이게할 수 있다는 점을 고려하지는 못한다. 따라서, 대부분의 서열 비교 방법은 과도하게 전체 상동성 점수를 불리하게 매기지 않으면서, 있을 수 있는 삽입 및 결실을 고려하는 최적의 정렬을 제조하는 것으로 설계된다. 이는 국지적 상동성을 최대화하기 위해 "갭"을 삽입하여 달성된다.
그러나, 상기 더 복잡한 방법은 정렬 내 발생하는 각각의 갭에 "갭 페널티"를 부여하기 때문에, 동일한 수의 동일한 아미노산에 있어서, 갭이 가능한 거의 없는 서열 정렬(두 개의 비교 서열 간의 높은 관련성을 반영함)은 많은 갭을 가진 것보다 더 높은 점수를 획득할 것이다. 갭 존재시 비교적 높은 벌점을 부여하며 갭에서 각각의 후속 잔기에 대해 더 적은 페널티를 부여하는 "일가(一家)의 갭 벌점(affine gap cost)"이 전형적으로 사용된다. 이것이 가장 통장적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 보다 더 작은 갭을 가진 최적화된 정렬을 제공할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티의 수정을 허용한다. 그러나, 서열 비교를 위한 상기 소프트웨어를 사용할 때, 디폴트 값(default value)을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 사용할 때, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 페널티는 갭 당 -12이고, 각각의 확장 당 -4 이다.
따라서 최대 % 상동성의 계산을 위해서는 우선 갭 페널티를 고려한 최적 정렬의 제작이 요구된다. 상기 정렬을 수행하는 데 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지 (Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 기타 소프트웨어의 예는 이에 제한되지 않지만, BLAST 패키지(Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed-Chapter 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) 및 비교 수단의 GENEWORKS 일원이 포함된다. BLAST 및 FASTA 둘 다는 오프라인 및 온라인 검색에 이용가능하다 (Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 to 7-60 참조). 그러나, 일부 적용에 있어서, GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequences는 또한 단백질 및 뉴클레오티드 서열 비교에 이용가능하다(FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2):247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8 and tatiana@ncbi. nlm. nih. gov 참조).
최종 % 상동성은 동일성에 의해 측정될 수 있음에도 불구하고, 정렬 과정 자체는 전형적으로 전부-또는-전무 쌍 비교에 바탕을 두지 않는다. 그 대신에, 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기초한 각각의 쌍 비교에 대해 점수를 부여하는 기준화 유사성 스코어 행렬(scaled similarity score matrix)이 일반적으로 사용된다. 일반적으로 사용되는 상기 행렬의 예는 BLOSUM62 행렬 (프로그램 BLAST 조의 디폴트 행렬)이다. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 제공된다면 맞춤 시스템 비교표 또는 범용 디폴트값을 사용한다(더 자세한 사항은 사용자 매뉴얼 참조). 일부 적용에 있어서, GCG 패키지의 범용 디폴트 값을 사용하거나, 기타 소프트웨어의 경우에는 BLOSUM62와 같은 디폴트 행렬을 사용하는 것이 바람직하다.
대안적으로, 백분율 상동성은, CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244)과 유사한, 알고리즘을 기초로 한 DNASISTM (Hitachi Software)의 다중 정렬 특징을 이용해 계산될 수 있다.
일단 소프트웨어가 최적 정렬을 제작하면, % 상동성, 바람직하게는 % 서열 동일성을 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 전형적으로 서열 비교의 일부로서 이것을 행하며, 수치적인 결과를 산출한다.
바람직한 구현예는 또한 관능성 등가물을 포함한다. 상기 문헌에 기재된 PS4 변이체 폴리펩티드는, 바람직하게 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 보이는 폴리펩티로부터 유래되거나 그것의 변이체이다. 바람직하게, 상기 모 효소는 비-말토제닉 엑소아밀라아제 자체이다. 바람직한 구현예의 PS4 변이체 폴리펩티드 자체는 또한 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 보인다.
본원에 기재된 PS4 변이체는, 바람직하게는 예를 들면 상기에 기재된 바와 같이, 엑소아밀라아제인 것과 일치하는 엑소-특이성 지수로 측정된 엑소특이성을 가진다. 더욱이, 그것은 그것이 유래된 폴리펩티드 또는 모 효소와 비교했을 때, 바람직하게는 더 높고 증가된 엑소특이성을 가진다. 따라서, 예를 들면, PS4 변이체 폴리펩티드는, 바람직하게 동일한 조건하에서 그것의 모 폴리펩티드와 비교했을 때, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상의 엑소 특이성 지수를 가질 수 있다. 그것은 바람직하게 동일한 조건 하에서, 그것의 모 폴리펩티드와 비교했을 때, 1.5x 이상, 2x 이상, 5x 이상, 10x 이상, 50x 이상, 100x 이상 더 높을 수 있다.
바람직한 구현예에서, 관능성 등가물은 PS4 패밀리 원 중 하나 이상과 서열 상동성을 가질 것이다. 관능성 등가물은 슈도모나스 사카로필라 및 슈도모나스 스투트제리 비-말토제닉 엑소아밀라아제 중 하나, 바람직하게는 둘 다와 서열 상동성을 가질 것이다. 관능성 등가물은 또한 서열 번호 1 내지 12, 바람직하게는 서열 번호 1 또는 서열 번호 7 또는 둘 다에 기재된 임의 서열과 서열 상동성을 가질 수 있을 것이다. 상기 서열간의 서열 상동성은 바람직하게 60% 이상, 바람직하게 65% 이상, 바람직하게 75% 이상, 바람직하게 80% 이상, 바람직하게 85% 이상, 바람직하게 90% 이상, 바람직하게 95% 이상이다.
다른 구현예에서, 관능성 등가물은 특히 상기에 기재된 임의 서열에 하이브리디제이션할 수 있다. 하나의 서열이 다른 서열에 하이브리디제이션 가능성 여부를 결정하는 방법이 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, Sambrook et al (상기 문헌) 및 Ausubel, F. M. et al. (상기 문헌)에 기재되어 있다. 매우 바람직한 구현예에서, 관능성 등가물은 엄격한 조건하에서, 예를 들면, 65℃ 및 0.1xSSC {lxSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3시트레이트 pH 7.0}에서 하이브리디제이션할 수 있을 것이다.
아미노산 서열은 적합한 근원으로부터 제조/단리될 수 있거나, 재조합 DNA 기술의 사용함으로써 제조될 수 있거나, 합성으로 제조될 수 있다. 여러 방법이 하기에 기재된다.
2. 본 발명의 핵산의 상세한 설명
두 번째 국면에서, 본 발명은 상기에 기재된 대로, 모 폴리펩티드모 폴리펩티드S4 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다.
당업자는 핵산 서열 및 폴리펩티드 서열, 특히 유전자 코드 및 상기 코드의 축퇴간의 관계를 인식할 것이며, 상기 PS4 핵산을 어려움 없이 구축할 수 있을 것이다. 예를 들면, 당업자는 PS4 변이체 폴리펩티드 서열 내의 각 아미노산 치환에 있어서, 치환된 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 코돈이 있을 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 특정 아미노산 잔기에 대한 유전자 코드의 축퇴에 따라, 하나 이상의 PS4 핵산 서열은 상기 PS4 변이체 폴리펩티드 서열에 상응하여 제조될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 따라서, 예컨대, PS4 변이체 핵산 서열은, PS4 변이체 핵산이 코딩하는, L178 및 A179 중 하나 또는 모두와 함께 함께 하기 위치에 아미노산치환이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 모 서열로부터 유도될 수 있다: G134, A141, I157, G223, H307, S334, N33 및 D34.
아미노산 서열 및 핵산 서열의 돌연변이는 당 업계에 공지된 대로, 임의의 많은 기술로 제조될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서는, 실시예에서 설명된 바와 같이 적절한 프라이머를 이용한 PCR(폴리머라아제 연쇄 반응)을 이용하여 돌연변이가 모 서열로 도입된다.
모 효소는 본원에 기재된 PS4 변이체 서열을 제조하기 위해 아미노산 수준 또는 핵산 수준에서 개질될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 상기 국면의 구현예는 비-말토제닉 엑소아밀라아제 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 상응하는 코돈 변화를 도입함으로써, PS4 변이체 폴리펩티드의 제조를 제공한다.
임의 PS4 패밀리 핵산 서열에서 상기 코돈 변화가 인정될 것이다. 예를 들면, 슈도모나스 스투트제리 비-말토제닉 엑소아밀라아제 핵산 서열 (예컨대, X16732, 서열 번호 6 또는 M24516, 서열 번호 12) 에 대해, 서열 변화가 일어날 수 있다.
모 효소는 즉, 사실상 그것이 발생하는 전체 길이로 (또는 돌연변이 된 대로의) "완전한" 효소를 포함할 수 있거나, 그것의 절단 형태를 포함할 수 있다. 상기로부터 유래된 PS4 변이체는 그에 따라 절단될 수 있거나, 또는 "전장"일 수 있다. 절단은 N-말단 또는 C-말단에서 일어날 수 있다. 모 효소 또는 PS4 변이체는 아 서열, 시그널 서열, 도메인 또는 부분 구조와 같은 하나 이상의 부분이 활성 여부와 관계없이 결핍될 수 있다. 예를 들면, 모 효소 또는 PS4 변이체 폴리펩티드는 상기에 기재된 바와 같이 시그널 서열이 결핍될 수 있다. 대안적으로, 또는 이에 더하여, 모 효소 또는 PS4 변이체는 하나 이상의 촉매활성 도메인 또는 결합 도메인이 결핍될 수 있다.
매우 바람직한 구현예에서, 모 효소 또는 PS4 변이체는 전분 결합 도메인과 같은 비-말토제닉 엑소아밀라아제에 존재하는 하나 이상의 도메인이 결핍될 수 있다. 예를 들면, PS4 폴리펩티드는 서열 번호 1 로서 나타낸 슈도모나스 사카로필라 비-말토제닉 엑소아밀라아제의 넘버링에 대해 위치 429 이하의 서열만 가질 수 있다. 예를 들면, PS4 변이체 pSac-d34, pSac-D20 및 pSac-D14 의 경우가 그것이다.
전형적으로 PS4 변이체 뉴클레오티드 서열은 재조합 DNA 기술을 이용해 제조된다. 그러나, 대안적인 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 당 분야에 잘 공지된 화학 방법(Caruthers MH et al., (1980) NucAcids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232 참조)를 이용해, 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다.
본원에 정의된 특정 성질을 가진 효소 또는 개질에 적합한 효소, 예컨대 모 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 상기 효소를 생산하는 임의 세포 또는 유기체로부터 동정 및/또는 단리 및/또는 정제될 수 있다. 각종 방법이 뉴클레오티드 서열의 식별 및/또는 단리 및/또는 정제용으로 당 분야 내에 잘 공지되어 있다. 예시로서, 일단 적합한 서열이 동정 및/또는 단리 및/또는 정제될 때 사용되면 더 많은 서열을 제조하기 위한 PCR 증폭 기술이 이용될 수 있다.
추가 예시로서, 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리는 효소를 생산하는 유기체로부터 염색체성 DNA 또는 메신저 RNA를 이용해 구축될 수 있다. 효소의 아미노산 서열 또는 효소의 아미노산 서열 일부가 공지된 경우, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 합성될 수 있고, 유기체로부터 제조된 게놈 라이브러리로부터 효소-코딩 클론을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 또다른 공지된 효소 유전자와 상동인 서열을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 효소-코딩 클론 동정에 사용될 수 있다. 후자의 경우, 덜 엄격한 세척 및 하이브리디제이션 조건이 사용된다.
대안적으로, 게놈 DNA의 절편을 플라스미드와 같은 발현 벡터에 삽입하고, 생성된 게놈 DNA 라이브러리를 가진 효소-네거티브 박테리아의 형질 전환한 후, 이어서 효소(예컨대 말토오스)를 위한 기질을 포함하는 아가 플레이트 상에 형질 전환된 박테리아를 플레이팅하여, 효소를 발현시키는 클론을 동정 가능하게 함으로써 효소-코딩 클론이 동정될 수 있다.
추가적인 대안에서, 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 입증된 표준 방법, 예컨대 [Beucage S. L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869]에 기재된 포스포로아미다이트 방법 또는 [Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805]에 기재된 방법으로 합성 제조될 수 있다. 포스포로아미다이트 방법에서, 올리고뉴클레오티드는, 예컨대 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 적절한 벡터에 정제, 어닐링, 라이게이션 및 클로닝된다.
뉴클레오티드 서열은 표준 기술에 따른 합성, 게놈 또는 cDNA 기원의 절편을 라이게이션하여 제조된, 혼합된 게놈 및 합성 기원, 혼합된 합성 및 cDNA 기원 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원일 수 있다. 각 라이게이션된 절편은 전체 뉴클레오티드 서열의 각종 부분에 해당된다. 또한 DNA 서열은 특정 프라이머를 이용한 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해, 예컨대 US 4,683, 202 또는 [Saiki R K et al. , (Science (1988) 239, pp 487-491)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 본원에 기재된 조성물 및 방법에 적합한 것은 그의 내부에 합성 또는 개질 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 많은 다른 종류의 개질이 당 분야에 공지된다. 상기는 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 골격 및/또는 분자의 3' 및/또는 5' 말단에 아크리딘 또는 폴리리신의 첨가가 포함된다. 상기 문헌의 목적을 위해, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열이 당 분야에 유용한 임의 방법에 의해 개질될 수 있다. 상기 개질은 생체 내 활성 또는 뉴클레오티드 서열의 수명을 강화하기 위해 실시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예는 뉴클레오티드 서열 및 본원에 제시된 서열 또는 임의 유도체, 절편 또는 그의 유도체에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 용도를 제공한다. 이 때 서열이 그의 절편에 상보적이면, 서열은 기타 유기체 등에 유사한 코딩 서열을 식별하는 프로브로서 사용될 수 있다.
PS4 변이체 서열에 100% 상동이지 않은 폴리뉴클레오티드는 많은 방법으로 수득될 수 있다. 본원에 기재된 서열의 기타 변이체는 예컨대 개체 범위(예를 들면, 다른 개체군의 개체)에서 만들어진 DNA 라이브러리를 프로빙함으로써 수득될 수 있다. 추가로, 다른 상동체는 수득될 수 있고, 상기 상동체 및 그의 절편은 일반적으로 본원의 서열 목록에서 나타낸 서열에 선택적으로 하이브리디제이션 할 수 있다. 상기 서열은 다른 종으로부터 만들어진 cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA 라이브러리를 매우 엄격한 매질의 조건하에서, 첨부한 서열 목록의 임의 서열 중 모두 또는 일부를 포함하는 프로브로 프로빙함으로써 수득될 수 있다. 수득한 종 상동체 및 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드의 대립 변이체(allelic variant)에 대해 유사한 고찰을 적용한다.
변이체 및 균주/종 상동체는 또한, 보존성 아미노산 서열을 코딩하는 상동체 및 변이체 내의 표적 서열용으로 고안된 프라이머를 사용하는 축퇴 PCR(degenerate PCR)를 이용해 수득될 수 있다. 축퇴 PCR에 사용된 프라이머는 하나 이상의 축퇴 위치를 포함할 것이며, 공지된 서열에 대해 단일 서열 프라이머를 가진 클로닝 서열용으로 사용된 것보다 덜한 엄격한 조건에서 사용될 것이다. 보존성 서열은 예컨대, 몇 가지의 변이체/상동체로부터의 아미노산 서열을 정렬시킴으로써 예측될 수 있다. 서열 정렬은 본원에 기재된 당분야에 공지된 컴퓨터 소프트웨어를 이용해 실시될 수 있다.
대안적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 특징적인 서열의 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 수득될 수 있다. 상기는, 예컨대 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되는 특정 숙주세포에 대한 코돈 선호를 최적화하기 위해 침묵성 코돈 서열 변화가 요구되는 데에서 유용할 것이다. 기타 서열 변화는 제한 효소 인지 부위를 도입하기 위해 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 관능 또는 특성을 변형하기 위해 요구될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 프라이머, 예를 들어 PCR 프라이머, 대안적인 증폭 반응용 프라이머 제조에 이용될 수 있으며, 예를 들어 방사성 또는 비방사성 표지를 이용하는 통상적인 수단에 의한 눈에 띄는 표지로 표지된 프로브 또는 폴리뉴클레오티드가 벡터로 클로닝될 수 있다. 상기 프라이머, 프로브 및 기타 분절은 길이가 15 개 이상, 바람직하게는 20 개 이상, 예를 들어 25, 30, 40 개 이상의 뉴클레오티드이며, 또한 용어 폴리뉴클레오티드에 의해서도 포함된다.
폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 폴리뉴클레오티드 및 프로브는 재조합적으로, 합성으로, 또는 당업자가 이용가능한 임의의 수단으로 제조될 수 있다. 이들은 또한 표준 기술에 의해 클로닝될 수 있다. 일반적으로, 프라이머는 동시에 원하는 핵산 서열 한 뉴클레오티드의 단계적인 제조를 수반하는 합성 수단에 의해 제조된다.
더 긴 폴리뉴클레오티드가 일반적으로 재조합적 수단, 예를 들어 PCR (폴리머라아제 연쇄 반응) 클로닝 기술을 이용하여 제조된다. 프라이머는 적합한 제한효소 인식 부위를 포함하도록 고안되어 증폭된 DNA 가 적합한 클로닝 벡터에 클로닝될 수 있도록 할 수 있다. 바람직하게는, 변이체 서열은 본원에 제시된 서열 이상으로 생물학적으로 활성이다.
본 발명의 바람직한 구현예에는, PS4 변이체 (본원에 제시된 것의 상보적인 서열 포함) 의 핵산 서열에 상보적인 서열 또는 PS4 변이체의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 하이브리다이즈할 수 있는 서열 뿐만 아니라, PS4 변이체 (본원에 제시된 것의 상보적인 서열 포함) 의 뉴클레오티드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 바람직한 구현예는, 중간 내지 최대 엄격함의 조건 하에 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
바람직한 구현예에는 엄격한 조건 (예를 들어, 50℃ 및 0.2 × SSC) 하에 PS4 변이체 핵산의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보물에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 더욱 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 서열은 매우 엄격한 조건 (예를 들어, 65℃ 및 O.1 × SSC) 하에 PS4 변이체의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보물에 하이브리다이즈할 수 있다.
일단 효소-코딩 뉴클레오티드 서열이 단리되거나 또는 추정되는 효소-코딩 뉴클레오티드 서열이 동정되면, 효소 제조를 위해 서열을 돌연변이화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, PS4 변이체 서열은 모 서열 (parent sequence) 로부터 제조될 수 있다. 돌연변이화는 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 도입될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 돌연변이화 부위에 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적합한 방법은, 문헌 [Morinaga et al., (Biotechnology (1984) 2, p646-649)] 에 개시되어 있다. 효소 코딩 뉴클레오티드 서열로의 돌연변이 도입의 또다른 방법은 문헌 [Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147- 151)] 에 기재되어 있다. 추가적인 방법은 Sarkar 및 Sommer 의 문헌 (Biotechniques (1990), 8, p. 404-407 - "The megaprimer method of site directed mutagenesis") 에 기재되어 있다.
바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 이용되는 서열은 재조합 서열, 예를 들어 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조되는 서열이다. 상기 기술은, 예를 들어, 문헌에, 예를 들어, [J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 에서 설명되어 있다.
3. 본 발명의 조성물의 상세한 설명
본 발명의 제 3 의 국면은 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 가진 폴리펩티드의 변이체인 폴리펩티드를 함유하는 조성물 뿐만 아니라 상기 변이체 폴리펩티드 및 상기 조성물의 용도를 제공한다. 상기 조성물에는 또다른 성분과 함께 상기 폴리펩티드 변이체가 포함된다.
본 발명의 바람직한 구현예에는 추가적인 성분 또는 추가적인 효소, 또는 이들 두가지 모두와 임의로는 함께 PS4 변이체 폴리펩티드를 포함한다. PS4 변이체 폴리펩티드에 더하여, 하나 이상의 효소가, 식품, 반죽 제제, 식량 또는 전분 조성물에 첨가될 수 있다. 반죽에 첨가될 수 있는 추가적인 효소에는, 옥시도리덕타아제, 하이드롤라아제, 예컨대 카르복실 에스테르 결합을 가수분해하여 카르복실레이트를 방출할 수 있는 리파아제 (예를 들어, 리파아제 (EC 3.1.1) 또는 예컨대 트리아실글리세롤 리파아제 (EC 3.1.1.3), 갈락토리파아제 (EC 3.1.1.26), 포스포리파아제 A1 (EC 3.1.1.32), 포스포리파아제 A2 (EC 3.1.1.4) 및 지질단백질 리파아제 A2 (EC 3.1.1.34)) 및 에스테라아제 뿐만 아니라 글리코시다아제 유사 α-아밀라아제, 풀루라나아제 및 자일라나아제가 포함된다. 옥시도리덕타아제, 예컨대 말토오스 산화 효소, 글루코오스 옥시다아제 (EC 1.1.3.4), 탄수화물 옥시다아제, 글리세롤 옥시다아제, 피라노오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 (EC 1.1.3.10) 및 헥소오스 옥시다아제 (EC 1.1.3.5) 는 반죽 강화 및 베이킹된 생성물의 부피 조절에 이용될 수 있으며, 자일라나아제 및 기타 헤미셀룰라아제는 반죽 취급 특성, 빵속 연화 및 빵 부피를 개선하기 위해 첨가될 수 있다. 리파아제는 반죽 강화제 및 빵유연제 (crumb softener) 로서 유용하며, α-아밀라아제 및 기타 전분분해 효소가 반죽에 혼입되어 빵 부피를 조절할 수 있으며, 추가로 빵 경도를 감소시킬 수 있다. 사용될 수 있는 추가적인 효소는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 전분 분해 효소, 프로테아제, 리폭시게나아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, PS4 변이체 폴리펩티드는 아밀라아제, 특히, 말토제닉 아밀라아제와 조합될 수 있다. 말토제닉 알파-아밀라아제 (글루칸 1,4-α-말토히드롤라아제, E.C.3.2.1.133) 는 아밀로오스 및 아밀로펙틴을 가수분해하여 알파-배치의 말토오스를 제공할 수 있다.
바실러스 (Bacillus) 유래의 말토제닉 알파-아밀라아제 (EP 120 693) 는 시판되어 입수가능하며 (Novo Nordisk A/S, Denmark), 전분의 노화를 감소시키는 능력으로 인해 선도유지제로서 베이킹 산업에서 널리 이용된다 (참고 문헌은, 예를 들어, WO 91/04669). 말토제닉 알파-아밀라아제는, 서열 상동성 (Henrissat B, Bairoch A; Biochem. J., 316,695-696 (1996)) 및 트란스글리코실화 생성물의 형성 (Christophersen, C., et al., 1997, Starch, vol. 50, No. 1,39-45) 을 포함하여, 시클로덱스트린 글루카노트란스퍼라아제 (CGTase) 와 각종 특징들을 공유한다. 바람직한 구현예에는, 알파-아밀라아제 또는 임의의 그의 변이체와 함께 PS4 변이체 폴리펩티드를 포함하는 조합이 포함된다. 상기 조합들은 베이킹과 같은 식품 생산에 유용하다. 변이체, 상동체, 및 변이체의 돌연변이체는 전체가 본원에 참고문헌으로 포함되는 US 특허 제 6,162,628 호에 기재되어 있고, 본원에 기재된 PS4 변이체 폴리펩티드와의 조합에 이용될 수 있다. 특히, 상기 문헌에 기재된 임의의 폴리펩티드, 구체적으로는 하기:
Figure 112006001199932-PCT00019
Figure 112006001199932-PCT00020
Figure 112006001199932-PCT00021
및/또는
Figure 112006001199932-PCT00022
에 상응하는 임의의 하나 이상의 위치에서의 US 6,162,628 의 서열 번호 1 의 변이체가 이용될 수 있다.
추가적인 효소는, 곡분, 물 또는 임의적인 기타 성분 또는 첨가제 또는 반죽 개선 조성물을 포함하는 임의의 반죽 성분과 함께 첨가될 수 있다. 추가적인 효소가 곡분, 물 및 임의로는 기타 성분 및 첨가제 또는 반죽 개선 조성물 이전 또는 이후에 첨가될 수 있다. 추가적인 효소는 통상적으로 액체 제제 또는 건조 조성물 (dry composition) 의 형태로 존재할 수 있다.
반죽 개선 조성물의 일부 효소들은 반죽 조건 하에 서로 상호작용하여 상기 효소에 의한 곡분 반죽의 유변학적 및/또는 기계적 특성의 개선 및/또는 반죽으로 제조된 생성물의 품질 개선에 대한 효과가 추가적인 것일 뿐만 아니라 상기 효과들이 상승적인 정도에까지 이를 수 있다. 반죽으로 제조된 생성물 (마감된 생성물) 의 개선과 관련하여, 상기 조합이 빵속 구조에 대하여 실질적으로 상승적인 유효성을 제공한다는 것을 발견할 수 있다. 또한, 베이킹된 생성물의 비부피에 관하여, 상승적 효과가 발견될 수 있다.
4. 벡터, 세포 및 PS4 폴리펩티드 발현 방법
제 4 국면은 PS4 변이체 폴리펩티드, PS4 변이체 폴리펩티드를 포함하는 세포 및 PS4 변이체 폴리펩티드 발현 방법을 제공한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 이용되는 뉴클레오티드 서열은 재조합성의 복제가능한 벡터로 혼입될 수 있다. 벡터는 효소 형태 및/또는 혼화가능한 숙주 세포 내부 및/또는 유래의 뉴클레오티드 서열을 복제 및 발현하기 위해 이용될 수 있다. 발현은 제어 서열 (control sequence), 예를 들어 조절 서열 (regulatory sequence) 을 이용하여 제어될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 발현으로 숙주 재조합 세포에 의해 생산되는 효소는 사용되는 서열 및/또는 벡터에 따라 분비되거나 또는 세포내에 포함될 수 있다. 코딩 서열은 특별한 원핵성 또는 진핵성 세포막을 통해 실체 코딩 서열의 분비를 지령하는 시그널 서열로 고안될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 재조합성의 복제가능한 벡터로 혼입될 수 있다. 벡터는 혼화가능한 숙주 세포의 핵산을 복제하기 위해 이용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 안정한 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 적합한 숙주에는 박테리아, 효모, 곤충 및 진균 세포가 포함된다.
PS4 변이체 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드를 복제가능한 벡터로 도입하고, 상기 벡터를 혼화가능한 숙주 세포에 도입하고, 상기 숙주 세포를 벡터의 복제를 야기하는 조건 하에서 배양함으로써 발현될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포로부터 회수될 수 있다.
PS4 핵산은 관심 대상의 숙주 세포 내의 전사 조절 및 트랜슬레이션 조절 구성원에 작동적으로 연결될 수 있다. PS4 핵산은 또한 예를 들어, 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) 유래의 글루코아밀라아제 유전자, 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 α-인자 교미형 유전자 및 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 유래의 TAKA-아밀라아제로부터 유래되는 것과 같은 시그널 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 대안적으로, PS4 핵산은 멤브레인 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
PS4 변이체는 발현 벡터를 이용하여 숙주 유기체 내에서 원하는 수준으로 발현될 수 있다. PS4 핵산을 포함하는 발현 벡터는 선택된 숙주 유기체 내에서 PS4 핵산을 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 도입될 숙주 세포에 좌우된다. 이에 따라, 벡터는 자부피으로 복제하는 벡터, 예를 들어 에피좀 실체 (episomal entity) 로서 존재하는 벡터로서, 그의 복제가 염색체 복제와 독립적인 것, 예컨대, 플라스미드, 박테리오파지 또는 에피좀 구성원, 미니크로모좀 또는 인공 크로모좀일 수 있다. 대안적으로는, 벡터는 숙주 세포에 도입되는 경우 숙주 세포 게놈에 통합되어 염색체와 함께 복제되는 것일 수 있다.
발현 벡터는 전형적으로는 클로닝 벡터의 구성원, 예컨대 선택된 숙주 유기체에서 벡터의 자가 복제를 허용하는 구성원 및 선별 목적으로 하나 이상의 표현형으로 탐지가능한 마커를 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 프로모터, 작동자, 리보좀 결합 부위, 트랜슬레이션 개시 시그널 및 임의로는 억제자 유전자 또는 하나 이상의 활성화 인자 유전자를 코딩하는 제어 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가적으로, 발현 벡터는 숙주 세포 소기관, 예컨대 퍼옥시좀 또는 특별한 숙주 세포 구획으로 PS4 변이체를 표적화할 수 있는 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 상기 표적화 서열에는 이에 제한되지 않으나, 서열 SKL 이 포함된다. 제어 서열의 지령 하에서의 발현을 위해서는, 핵산 서열 PS4 변이체가 발현에 적절한 방식으로 제어 서열에 작동적으로 연결된다.
바람직하게는, 벡터 내의 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 의한 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 제어 서열에 작동적으로 연결되며, 예를 들어 벡터가 발현 벡터이다. 제어 서열은 예를 들어 제어 서열에 의해 지령되는 전사 수준을 전사 조절자에 대해 더욱더 응답성이 되도록 만들기 위한 추가적인 전사 조절 구성원의 추가로 개질될 수 있다. 제어 서열은 특히 프로모터를 포함할 수 있다.
벡터에서, 변이체 PS4 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 적합한 프로모터 서열과 작동적으로 조합된다. 프로모터는 선택된 숙주 유기체에서 전사 활성을 가진 임의의 DNA 서열일 수 있으며, 숙주 유기체와 동종성이거나 또는 이종성인 유전자로부터 유도될 수 있다. 개질된 뉴클레오티드 서열, 예컨대 PS4 핵산의 박테리아 숙주 내에서의 전사 지령을 위한 적합한 프로모터의 예시에는, 에셰리키아 콜라이 (E. coli) 의 lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리콜라 (Streptomyces coelicolor) 아가로스 유전자 dagA 프로모터, 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) α-아밀라아제 유전자 (amyL) 의 프로모터, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 의 aprE 프로모터, 바실러스 스테아로테르모필러스 (Bacillus stearothermophilus) 말토제닉 아밀라아제 유전자 (amyM) 의 프로모터, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) α-아밀라아제 유전자 (amyQ) 의 프로모터, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) xylA 및 xylB 유전자의 프로모터, 및 P170 프로모터를 포함하여 락토코코스 종 (Lactococcus sp.) 유래의 프로모터로부터 유도된 프로모터가 포함된다. PS4 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 에셰리키아 콜라이와 같은 박테리아 종에서 발현되는 경우, 적합한 프로모터가, 예를 들어 T7 프로모터 및 파지 람다 프로모터를 포함하는 박테리오파지 프로모터로부터 선택될 수 있다. 진균류에서의 전사에 대해서, 유용한 프로모터의 예시는 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 리조뮤코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 아스파르트 프로테이나아제, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 중성 α-아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 (A. niger) 산 안정성 α - 아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 (A. niger) 글루코아밀라아제, 리조뮤코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 리파아제, 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 알칼리성 프로테아제, 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 트리오스 포스페이트 이소머라제 또는 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 아세타미다제를 코딩하는 유전자로부터 유도되는 것이다. 효모 종에서의 발현을 위한 적합한 프로모터의 예시에는, 이에 한정되지 않지만 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 의 Gal 1 및 Gal 10 프로모터 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) AOXI 또는 AOX2 프로모터가 포함된다.
적합한 박테리아 숙주 유기체의 예시는, 그람 양성 박테리아 종, 예컨대 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실러스 스테아로테르모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실러스 알칼로필러스 (Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 라우투스 (Bacillus lautus), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 및 바실러스 투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis) 를 포함하는 바실라세아에 (Bacillaceae), 스트렙토마이세스 무리누스 (Streptomyces murinus) 와 같은 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces species), 락토코코스 속 (Lactococcus spp.) 을 포함하는 락트산 박테리아 종, 예컨대 락토코코스 락티스 (Lactococcus lactis), 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) 를 포함하는 락토바실러스 속 (Lactobacillus spp.), 레우코노스톡 속(Leuconostoc spp.), 페디오코코스 속 (Pediococcus spp.) 및 스트렙토코코스 속 (Streptococcus spp.) 을 포함한다. 대안적으로, 에셰리키아 콜라이 (E. coli) 를 포함하는 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae) 또는 슈도모나다세아에 (Pseudomonadaceae) 에 속하는 그람 음성 박테리아의 균주는 숙주 유기체와 같이 선택될 수 있다. 적합한 효모 숙주 유기체는, 이에 한정되지 않으나, 피키아 속 (Pichia sp.), 한세눌라 속 (Hansenula sp.) 또는 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 야로위니아 (Yarrowinia) 종 또는 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) 를 포함하는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 의 종 또는 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyce) 에 속하는 종, 예를 들어, 쉬조사카로마이세스 폼베 (S. Pombe) 종과 같은 효모 종들과 같이 생명공학적으로 유연관계가 있는 효모로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 메탄올 자화 효모 종 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 의 균주가 숙주 유기체로서 사용된다. 바람직하게는, 숙주 유기체는 한세눌라 (Hansenula) 종이다. 사상균 중에서 특히 적합한 숙주 유기체에는 아스페르길루스 (Aspergillus) 의 종들, 예를 들어 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 투비겐시스 (Aspergillus tubigensis), 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori) 또는 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 가 포함된다. 대안적으로, 푸사리움 (Fusarium) 종의 균주, 예를 들어 푸사리움 옥시포룸 (Fusarium oxysporum) 또는 리조뮤코르 (Rhizomucor) 종의 균주, 예컨대 리조뮤코르 메이헤이 (Rhizomucor miehei) 가 숙주 유기체로서 사용될 수 있다. 기타 적합한 균주에는 테르모마이세스 (Thermomyces) 및 뮤코르 (Mucor) 종이 포함된다.
폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포는 변이체 PS4 폴리펩티드, 분절, 상동체, 변이체 또는 그의 유도체와 같은 폴리펩티드 발현을 위해 이용될 수 있다. 숙주 세포는 단백질의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에 배양될 수 있다. 폴리펩티드의 발현은 이들이 지속적으로 생산되거나 또는 유도가능하도록 본질적일 수 있어, 발현의 개시를 자극하는 것이 필요하다. 유도가능한 발현의 경우, 단백질 생산은 필요한 경우, 예를 들어, 배양 배지에 유도성 물질, 예를 들어 덱사메타손 또는 IPTG 의 첨가로 개시될 수 있다. 폴리펩티드는 효소적, 화학적 및/또는 삼투적 분해 및 물리적 파쇄를 포함하는 당업계에 공지된 각종 기술로 숙주 세포로부터 추출될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 TnTTM (Promega) 토끼 망상 적혈구 시스템과 같은 시험관내 무세포 계에서 재조합적으로 제조될 수 있다.
5. 용도(들)
하기 명세서 및 실시예에서, 달리 표시되지 않는 한, PS4 변이체 폴리펩티드의 투여량은 곡분 백만부 당 부 (그람 당 마이크로그람) 으로 제시된다. 예를 들어, 표 2 에 사용된 "1 D34" 는 pSac-D34 백만부 당 1 부를 나타낸다.
본원에 기재된 PS4 치환 돌연변이체는 모 효소 (parent enzyme) 가 적합한 임의의 목적에 이용될 수 있다. 특히, 이들은 엑소-말토테트라오하이드롤라아제가 이용되는 임의의 적용에 이용될 수 있다. 매우 바람직한 구현예에서, 이들은 더 높은 열안정성, 또는 더 높은 엑소아밀라아제 활성 또는 더 높은 pH 안정성 또는 이들의 조합의 추가적인 장점을 갖는다. PS4 변이체 폴리펩티드 및 핵산의 적합한 용도의 예시에는, 식품 생산, 특히 베이킹 뿐만 아니라 식량 생산이 포함되며; 추가적인 예시는 하기에 상세히 기재될 것이다.
하기의 계는 본원에 기재된 방법 및 조성에 따라 이용되기에 적합한 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 가진 폴리펩티드를 특징짓기 위해 이용된다. 상기 계는, 예를 들어 본원에 기재된 PS4 모(母) 또는 변이체 폴리펩티드를 특징짓기 위해 이용될 수 있다.
출발 배경 정보로서, 유연한 (waxy) 옥수수 아밀로펙틴 (Roquette (France) 로부터 WAXILYS 200 로서 입수가능) 은 아밀로펙틴 함량이 매우 높은 (90% 초과) 전분이다. 20 mg/ml 의 유연한 옥수수 전분을 3 분 동안 50 mM MES (2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산), 2 mM 염화칼슘, pH 6.0 의 완충액 중에서 끓인 후, 후속적으로 50℃ 에서 인큐베이션하여 30 분 이내에 사용했다.
비-말토제닉 엑소아밀라아제의 단위는, 상기 기재된 바와 같이 제조된 50 mM MES, 2 mM 염화칼슘, pH 6.0 내에서 10 mg/ml 유연한 옥수수 전분 4 ml 을 시험관에서 50℃ 로 인큐베이션할 때 매 분 1 μmol 의 환원당에 해당하는 가수분해 산물을 방출하는 효소의 양으로 정의된다. 환원당은 말토오스를 기준으로 문헌 [Bernfeld, Methods Enzymol., (1954), 1, 149-158] 의 디니트로살리실산법 또는 환원당 정량을 위해 당업계에 공지된 또다른 방법을 이용하여 측정된다.
비-말토제닉 엑소아밀라아제의 가수분해 산물 패턴은 상기 기재된 바와 같이 제조된 완충액에서 10 mg/ml 인 유연한 옥수수 전분 4 ml 를 이용하여 시험관 내에서 50℃ 로 15 또는 300 분 동안 비-말토제닉 엑소아밀라아제 0.7 단위를 인큐베이션함으로써 결정된다. 반응은 끓는 수조에 3 분 동안 시험관을 침잠시켜 중단한다.
가수분해 산물은 나트륨 아세테이트, 나트륨 히드록시드 및 물을 용출액으로 사용하는 Dionex PA 100 칼럼을 이용하는 음이온 교환 HPLC 로, 펄스되는 전류측정방식 탐지를 이용하고, 글루코오스에서 말토헵타오스로의 공지된 선형 말토올리고당을 표준으로 이용하여 분석 및 정량한다. 말토옥타오스 내이 말토데카오스에 대한 응답 요인은 말토헵토오스에 대해 발견되는 응답 요인이다.
바람직하게는, PS4 모 폴리펩티드 (및 PS4 변이체 폴리펩티드) 는 상기 비-말토제닉 엑소아밀라아제 0.7 단위의 양을 15 분 동안 50℃ 의 온도에서 50 mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 및 2 mM 염화칼슘을 함유하는 완충화 용액의 ml 당 10 mg 의 미리 끓인 유연한 옥수수 전분 10 ml 의 pH 6.0 인 수용액 4 ml 중에서 인큐베이션한 후, 효소는 2 내지 10 의 D-글루코피라노실 단위의 하나 이상의 선형 말토-올리고당 및 임의로는 글루코오스로 이루어진 가수분해 산물(들)을 제공하여; 2 내지 10 단위의 D-글루코피라노실 및 임의로는 글루코오스로 이루어진 상기 가수분해 산물 60 중량% 이상, 70 중량% 이상 80 중량% 이상 및/또는 85 중량% 이상이 3 내지 10 단위의 D-글루코피라노실, 바람직하게는 4 내지 8 단위의 D-글루코피라노실로 이루어진 선형 말토올리고당으로 이루어지도록 하는 비-말토제닉 엑소아밀라아제의 활성을 갖는다.
참고의 용이성을 위해, 또한 본 발명의 목적을 위해, 50 mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 및 2 mM 염화칼슘을 함유하는 완충화된 용액 ml 당 10 mg 의 미리 끓인 유연한 옥수수 전분의 수용액 4 ml 내에서 pH 6.0 로 50℃ 의 온도에서 15 분 동안 비-말토제닉 엑소아밀라아제 0.7 단위의 양을 인큐베이션하는 특징은 "유연한 옥수수 전분 인큐베이션 시험" 으로 언급할 수 있다.
이에 따라, 대안적으로 표현되는, 바람직한 비-말토제닉 엑소아밀라아제는 유연한 옥수수 전분 인큐베이션 시험에서 2 내지 10 단위의 D-글루코피라노실 및 임의로는 글루코오스로 이루어진 하나 이상의 선형 말토올리고당으로 이루어진 가수분해 산물(들)을 제공하는 능력을 가진 것을 특징으로 하며; 상기 가수분해 산물(들) 의 60 중량% 이상, 바람직하게는 70 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 80 중량% 이상, 가장 바람직하게는 85 중량% 이 3 내지 10 단위의 D-글루코피라노실로 이루어진 선형 말토올리고당, 바람직하게는 4 내지 8 단위의 D-글루코피라노실로 이루어진 선형 말토올리고당으로 이루어진다.
유연한 옥수수 전분 인큐베이션 시험에서의 가수분해 산물에는, 2 내지 10 단위의 D-글루코피라노실 및 임의로는 글루코오스로 이루어진 하나 이상의 말토올리고당이 포함된다. 유연한 옥수수 전분 인큐베이션 시험에서의 가수분해 산물에는 또한 기타 가수분해 산물이 포함될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 3 내지 10 단위의 D-글루코피라노실로 이루어진 선형 말토올리고당의 중량% 는 2 내지 10 단위의 D-글루코피라노실 및 임의로는 글루코오스로 이루어진 하나 이상의 선형 말토올리고당으로 이루어진 가수분해 산물의 양을 기준으로 한다. 다시 말하면, 3 내지 10 단위의 D-글루코피라노실로 이루어진 선형 말토올리고당의 중량% 은 2 내지 10 단위의 D-글루코피라노실 및 글루코오스로 이루어진 하나 이상의 선형 말토올리고당 이외의 가수분해 산물의 양을 기준으로 하지 않는다. 가수분해 산물은 임의의 적합한 수단으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 가수분해 산물은 Dionex PA 100 칼럼을 이용하는 음이온 교환 HPLC 로, 예를 들어 글루코오스에서 말토헵타오스로의 공지된 선형 말토올리고당을 표준으로 이용하는 펄스되는 전류측정방식 탐지를 이용해 분석될 수 있다.
바람직하게는, 본원에 기재된 PS4 변이체는 약 55℃ 의 온도에서 출발하는 전분 과립의 겔화 도중 및 이후 전분의 베이킹 및 가수분해 동안 활성이다. 더욱 열안정성인 비-말토제닉 엑소아밀라아제는 활성일 수 있는 시간이 더 길고, 이에 따라 더욱 큰 빵의 노화 방지 효과를 제공할 것이다. 그러나, 약 85℃ 를 초과하는 온도에서의 베이킹 동안, 효소 불활성화가 발생할 수 있다. 이것이 발생하는 경우, 비-말토제닉 엑소아밀라아제는 점차적으로 불활성화되어, 최종 빵에서 베이킹 과정 후 실질적으로 활성이 없어진다. 따라서, 바람직하게는 본원에 기재된 용도에 적합한 비-말토제닉 엑소아밀라아제는 50℃ 초과 및 98℃ 미만의 최적 온도를 갖는다.
엑소-특이성은 전체 엔도아밀라아제 활성에 대한 전체 아밀라아제 활성의 비율을 결정함으로써 유용하게 측정될 수 있다. 상기 비율은 "엑소-특이성 지수" 로서 본 문헌에 표시된다. 바람직한 구현예에서, 효소는 엑소-특이성 지수가 20 이상, 예를 들어 그의 전체 아밀라아제 활성 (엑소-아밀라아제 활성 포함) 이 그의 엔도아밀라아제 활성보다 20 배 이상 더 큰 경우, 엑소아밀라아제로 고려된다. 매우 바람직한 구현예에서, 엑소아밀라아제의 엑소-특이성 지수는 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 또는 100 이상이다. 매우 바람직한 구현예에서, 엑소-특이성 지수는 150 이상, 200 이상, 300 이상, 또는 400 이상이다.
전체 아밀라아제 활성 및 엔도아밀라아제 활성은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 전체 아밀라아제 활성은 전분 기질로부터 방출되는 환원 말단의 전체 갯수를 검정하여 측정될 수 있다. 대안적으로, Betamyl 검정의 이용은 실시예에서 더욱 상세하게 기재될 것이며, 편의를 위해, 실시예에서 검정된 아밀라아제 활성을 표 및 도면에서 "Betamyl 단위체" 라는 용어로 기재한다.
엔도아밀라아제 활성은 Phadebas Kit (Pharmacia and Upjohn) 의 이용으로 검정될 수 있다. 이는 청색으로 표지된 가교 전분 (아조 염료로 표지함) 을 이용하며; 전분 분자의 내부의 컷만이 표지를 방출하고, 외부의 컷은 그렇지 않다. 염료의 방출은 분광법으로 측정될 수 있다. 따라서, Phadebas Kit 는 엔도아밀라아제 활성을 측정하고, 편의를 위해, 상기 검정 결과 (실시예에 기재됨) 를 본 문헌에서 "Phadebas 단위체" 라는 용어로 기재한다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 엑소-특이성 지수는 Betamyl 단위체/Phadebas 단위체라는 용어로 표현한다.
엑소-특이성은 또한 선행기술, 예를 들어, 공보 번호 W0 99/50399 에 기재된 방법에 따라 검정될 수 있다. 상기는 엔도아밀라아제 활성과 엑소아밀라아제 활성 사이의 비율로 엑소-특이성을 측정한다. 이에 따라, 바람직한 국면에서, 본원에 기재된 PS4 변이체는 엑소아밀라아제 활성의 단위 당 0.5 미만의 엔도아밀라아제 단위 (EAU) 를 가질 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 용도에 적합한 비-말토제닉 엑소아밀라아제는 엑소아밀라아제 활성 단위 당 0.05 EAU 미만, 더욱 바람직하게는 엑소아밀라아제 활성 단위 당 0.01 EAU 미만을 가질 것이다.
PS4 변이체 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 발현 벡터 등은 아밀라아제가 이용될 수 있는 임의의 적용에 이용될 수 있다. 특히, 이들은 임의의 비-말토제닉 엑소아밀라아제를 대체하기 위해 이용될 수 있다. 이들은 단독으로 또는 기타 공지된 아밀라아제 또는 비-말토제닉 엑소아밀라아제와 조합하여, 아밀라아제 또는 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 보충하기 위해 이용될 수 있다.
본원에 기재된 PS4 변이체 서열은 베이커리 및 음료 생산품에서와 같은 식품 산업에서 다양한 적용에 이용될 수 있으며, 이들은 또한 약제학적 조성물과 같은 기타 적용에 이용될 수 있거나, 또는 심지어 화학 산업에 이용될 수 있다. 특히, PS4 변이체 폴리펩티드 및 핵산은 베이킹 (WO 99/50399 에 기재된 바와 같음) 및 곡분 표준화 (부피 증강 또는 개선) 를 포함하는 각종 공업적 적용에 유용하다. 이들은 전분 및 기타 기질로부터 말토테트라오스 생산을 위해 이용될 수 있다.
PS4 변이체 폴리펩티드는 빵과 같이 베이커리 생산품의 부피 증강을 위해 이용될 수 있다. 이에 따라, PS4 변이체 폴리펩티드를 포함하거나 또는 이로 처리된 식품 생산품은 그렇지 않은 생산품과 비교시, 부피가 팽창된다. 다시 말하면, 식품 생산품은 식품 생산품의 부피 당 더 큰 부피의 공기를 갖는다. 대안적으로, 또는 부가적으로, PS4 변이체 폴리펩티드로 처리된 식품 생산품은 더 낮은 밀도, 또는 부피 비율 당 더 낮은 중량 (또는 질량) 을 갖는다. 특히 바람직한 구현예에서, PS4 변이체 폴리펩티드는 빵의 부피 증강에 이용된다. 부피 증강 또는 팽창은, 이것이 식품의 끈적끈적함 또는 뻣뻣함을 감소시키므로 유리하다. 가벼운 식품은 소비자에게 더욱 선호되며, 소비 경험이 강화된다. 바람직한 구현예에서, PS4 변이체 폴리펩티드의 이용으로 부피가 10%, 20%, 30% 40%, 50% 또는 그 이상 증강된다.
본원에 기재된 PS4 변이체 폴리펩티드 및 핵산은 식품 자체로 또는 식품 제조시 이용될 수 있다. 특히, 이들은 식품에, 예를 들어 식품 첨가제로서 첨가될 수 있다. 바람직한 국면에서, 식품은 인간 소비를 위한 것이다. 상기 식품은 용도 및/또는 적용의 양태 및/또는 투여의 양태에 따라 용액 또는 고체의 형태로서 이용될 수 있다.
PS4 변이체 폴리펩티드 및 핵산은 식품 성분으로서 이용될 수 있다. 본원에 개시된 PS4 변이체 폴리펩티드 및 핵산은 식품 보조제이거나 또는 식품 보조제에 첨가될 수 있다. 본원에 개시된 PS4 변이체 폴리펩티드 및 핵산은 기능성 식품이거나 또는 기능성 식품에 첨가될 수 있다.
PS4 변이체 폴리펩티드는 또한 식품 생산품 또는 식량의 제조에 이용될 수 있다. 전형적인 식량에는, 유제품, 육류 제품, 조류 제품, 어류 제품 및 반죽 제품이 포함된다. 반죽 제품은 튀겨내거나, 완전히 튀겨내거나 (deep fried), 굽거나, 베이킹되거나, 찌거나 끓인 반죽, 예컨대 찐빵 및 떡을 포함하는 임의의 가공된 반죽 제품일 수 있다. 매우 바람직한 구현예에서, 식품 생산품은 베이커리 생산품이다.
바람직하게는, 식량은 베이커리 생산품이다. 전형적인 베이커리 (베이킹된) 생산품에는, 빵 - 예컨대 로프 (loaf), 롤, 번, 피자 베이스 등, 페스트리, 프레젤, 토틸라, 케이크, 쿠키, 비스킷, 크래커 등이 포함된다.
PS4 변이체 단백질은 전분 매질, 예컨대 전분 겔의 노화를 지연시킬 수 있다. PS4 변이체 폴리펩티드는 특히 전분의 불리한 노화를 지연시킬 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같은 PS4 변이체 폴리펩티드의 이용은, 식품 생산품에 대한 그의 가공의 임의의 단계, 예를 들어 빵으로의 베이킹 이전, 도중 또는 이후 전분에 첨가될 때, 노화를 지연시키거나 또는 방해하거나 또는 늦출 수 있다.
본원에 기재된 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 가진 PS4 변이체 폴리펩티드의 노화 방지 효과 평가를 위해, 빵 속의 경도는 Instron 4301 Universal Food Texture Analyzer 또는 당업계에 공지된 유사한 장치를 수단으로 베이킹 후 1, 3 및 7 일째에 측정할 수 있다.
당업계에서 전통적으로 이용된, 비-말토제닉 엑소아밀라아제 활성을 가진 PS4 변이체 폴리펩티드의 전분 노화에 대한 효과를 평가하기 위해 이용되는 또다른 방법은 DSC (시차 주사 열량계) 를 기초로 한다. 본원에서, 효소를 사용하거나 또는 사용하지 않은 (대조군) 베이킹된 모델 시스템 반죽 유래의 빵속 (bread crumb) 또는 속 (crumb) 에서 노화되는 아밀로펙틴의 용융 엔탈피를 측정한다. 기재된 예시에 적용되는 장치는 20 에서 95℃ 까지 매 분 10℃ 씩 온도를 상승시키며 가동되는 Mettler-Toledo DSC 820 이다. 시료 제조를 위해서는 10-20 mg 의 속 (crumb) 을 칭량하여 Mettler-Toledo 알루미늄 팬으로 이동시킨 후, 밀폐시켜 밀봉한다.
기재된 실시예에서 이용된 모델 시스템 반죽은 표준 밀 곡분 및 비-말토제닉 PS4 변이체 엑소아밀라아제가 있거나 또는 없는 최적량의 물 또는 완충액을 포함한다. 이들은 각각 10 또는 50 g 의 Brabender Farinograph 내에서 6 또는 7 분 동안 혼합된다. 반죽의 시료는 뚜껑이 있는 시험관 (15*0.8 cm) 에 위치시킨다. 상기 시험관들은 33℃ 에서 30 분 동안 수조에서 인큐베이션을 시작해 33 에서 95℃ 까지 매 분 1.1 ℃ 씩 상승시켜 95℃ 에서 가열하는 베이킹 공정에 적용된다. 후속적으로, 관을 20℃ 의 열량계에 보관한 후 DSC 분석을 했다.
바람직한 구현예에서, 기재된 PS4 변이체는 대조군에 비해 감소된 용융 엔탈피를 갖는다. 매우 바람직한 구현예에서, PS4 변이체는 10% 이상 감소된 용융 엔탈피를 갖는다. 바람직하게는, 이들은 대조군과 비교시 20% 이상, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 감소된 용융 엔탈피를 갖는다.
[표 2]
DSC (J/g)
대조군 2.29
0.5 D34 1.91
1 D34 1.54
2 D34 1.14
상기 표 2 는 보관 7 일 후 PSac-D34 를 상이한 투여량으로 사용하여 제조된 모델 반죽 시스템의 DSC 값을 나타낸다. 백만부 당 0.5, 1 및 2 부 (또는 그람 당 마이크로그람) 의 곡분을 시험한다.
PS4 변이체 폴리펩티드는 식품 생산품, 특히 전분 생산품의 제조에 이용될 수 있다. 상기 방법은 비-말토제닉 엑소아밀라아제 효소, 예컨대 PS4 변이체 폴리펩티드를 전분 매질에 첨가함에 의한 전분 생산품의 생산을 포함한다. 전분 매질이 반죽인 경우, 상기 반죽은 곡분, 물, PS4 변이체 폴리펩티드인 비-말토제닉 엑소아밀라아제 및 임의로는 기타 가능한 성분 및 첨가제를 함께 혼합하여 제조된다.
바람직한 곡분은 밀 곡분 또는 호밀 곡분 또는 밀 및 호밀 곡분의 혼합물이다. 그러나, 예를 들어 쌀, 옥수수, 보리 및 팥수수와 같은 기타 유형의 곡물로부터 유도된 곡분을 함유하는 반죽이 또한 고려된다. 바람직하게는, 전분 생산품은 베이커리 생산품이다. 더욱 바람직하게는, 전분 생산품은 빵 생산품이다. 더욱더 바람직하게는, 전분 생산품은 베이킹된 전분질의 빵 생산품이다.
이에 따라, 전분 생산품이 베이킹된 전분질의 빵 생산품인 경우, 공정은 - 임의의 적합한 순서로-곡분, 물 및 팽창제를 반죽 형성 조건 하에 혼합한 후, 임의로는 프리믹스의 형태인 PS4 변이체 폴리펩티드를 첨가하는 것을 포함한다. 팽창제는 중탄산나트륨과 같은 화학적 팽창제이거나 또는 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae; Baker's Yeast) 와 같은 임의의 균주일 수 있다.
PS4 변이체 비-말토제닉 엑소아밀라아제는 물 또는 반죽 성분 혼합물을 포함하는 임의의 반죽 성분 또는 임의의 첨가제 또는 첨가제 혼합물과 함께 첨가될 수 있다. 반죽은 제빵 산업 또는 곡분 반죽 기재의 생산품을 제공하는 임의의 기타 산업에서 일반적인 임의의 통상적인 반죽 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.
바람직한 구현예는, 하기의 단계를 포함하는 빵 생산품 제조 공정이다: (a) 전분 매질의 제공 단계; (b) 전분 매질에 본 문헌에 기재된 바와 같은 PS4 변이체 폴리펩티드를 첨가하는 단계; 및 (c) 단계 (b) 동안 또는 그 이후에 전분 매질에 열을 가하여 빵 생산품을 제공하는 단계. 또다른 바람직한 구현예는, 전분 매질에 상기 기재된 바와 같은 PS4 변이체 폴리펩티드를 첨가하는 단계를 포함하는 빵 생산품 제조 공정이다.
비-말토제닉 엑소아밀라아제 PS4 변이체 폴리펩티드는 단독적인 활성 성분으로서 효소를 함유하거나 또는 하나 이상의 추가적인 반죽 성분 또는 반죽 첨가제와의 혼합물로서 효소를 함유하는 액체 제제로서 또는 건조 미분 조성물로서 첨가될 수 있다.
또다른 바람직한 구현예는 베이킹에서 상기와 같은 빵 및 반죽 개선 조성물의 용도이다. 추가적인 구현예는 빵 개선 조성물 또는 반죽 개선 조성물로부터 수득되는 베이킹된 생산품 또는 반죽을 제공한다. 또다른 구현예는 빵 개선 조성물 또는 반죽 개선 조성물의 이용으로 수득되는 베이킹된 생산품 또는 반죽을 제공한다.
반죽은 곡분, 물, PS4 변이체 폴리펩티드 (상기 기재된 바와 같은 것) 를 함유하는 반죽 개선 조성물 및 임의로는 기타 성분 및 첨가제를 혼합하여 제조될 수 있다.
반죽 개선 조성물은 곡분, 물 또는 임의로는 기타 성분 및 첨가제를 포함하는 임의의 반죽 성분과 함께 첨가될 수 있다. 반죽 개선 조성물은 곡분 또는 물 또는 임의적인 기타 성분 및 첨가제 전에 첨가될 수 있다. 반죽 개선 조성물은 곡분 또는 물, 또는 임의적인 기타 성분 및 첨가제 후에 첨가될 수 있다. 반죽은 제빵 산업 또는 곡분 반죽 기재 생산품을 제조하는 임의의 기타 산업에서 일반적인 임의의 통상적인 반죽 제조법으로 제조될 수 있다.
반죽 개선 조성물은 상기 조성물을 단독적인 활성 성분으로 또는 하나 이상의 기타 반죽 성분 또는 첨가제와의 혼합물로 함유하는 건조 분말 조성물의 형태로 또는 액체 제제로서 첨가될 수 있다.
첨가되는 PS4 변이체 폴리펩티드 비-말토제닉 엑소아밀라아제의 양은 일반적으로 곡분 kg 당 50 내지 100,000 단위의 최종 반죽, 바람직하게는 곡분 kg 당 100 내지 50,000 단위의 최종 반죽이 존재하도록 하는 양이다. 바람직하게는, 상기 양은 곡분 kg 당 200 내지 20,000 단위의 범위이다.
본 발명의 문맥에서, 1 단위의 비-말토제닉 엑소아밀라아제는, 이후 기재되는 바와 같이 50 mM MES, 2 mM 염화칼슘, pH 6.0 에서 10 mg/ml 인 유연한 옥수수 전분 4 ml 를 이용하여 시험관에서 50℃ 로 인큐베이션할 때, 매 분 1 μmol 의 환원당에 상당하는 가수분해 산물을 방출하는 효소의 양으로서 정의된다.
상기 기재된 바와 같은 반죽은 일반적으로 밀분 또는 밀 곡분 및/또는 기타 유형의 분(粉), 곡분 또는 전분, 예컨대 콘옥수수 전분, 옥수수 (maize) 전분, 옥수수 곡분, 쌀 곡분, 호밀 분, 호밀 곡분, 귀리 곡분, 귀리 분, 대두 곡분, 수수 분, 수수 곡분, 감자 분, 감자 곡분 또는 감자 전분을 포함한다. 반죽은 갓 만들거나, 동결되거나 또는 일부 베이킹될 수 있다.
반죽은 팽창된 반죽 또는 팽창에 적용될 반죽일 수 있다. 반죽은 화학적 팽창제, 예를 들어, 중탄산나트륨을 첨가하거나, 또는 누룩 (반죽 발효) 을 첨가하는 것과 같이 각종 방식으로 팽창될 수 있으나, 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae; baker's yeast) 의 배양물, 예를 들어 시판되어 입수가능한 사카로마이세스 세레비시애 (S. cerevisiae) 의 균주의 배양물과 같은 적합한 효모 배양물을 첨가함으로써 반죽을 팽창시키는 것이 바람직하다.
반죽은 과립화 지방 또는 쇼트닝과 같은 지방을 함유할 수 있다. 반죽은 추가로 모노- 또는 디글리세리드, 지방산의 당 에스테르, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 모노글리세리드의 락트산 에스테르, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 모노글리세리드의 락트산 에스테르, 모노글리세리드의 아세트산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트 또는 리솔레시틴와 같은 추가적인 유화제를 함유할 수 있다.
또다른 구현예는, 상기 기재된 바와 같이 함께 조합된 곡분을 함유하는 프리믹스이다. 상기 프리믹스는 기타 반죽 개선 및/또는 빵 개선 첨가제, 예를 들어 본원에 언급된 효소를 포함하는 임의의 첨가제를 함유할 수 있다.
베이킹된 생산품의 추가적인 특징 개선 및 탁월한 특징 부여를 위해 추가적인 반죽 성분 및/또는 반죽 첨가제를 반죽에 혼입시킬 수 있다. 전형적으로는, 상기 추가적인 성분에는 반죽 성분, 예컨대 염, 곡물, 지방 및 오일, 당 또는 당화제, 식이섬유, 단백질 공급원, 예컨대 분유, 글루텐 대두 또는 난(卵) 및 반죽 첨가제, 예컨대 유화제, 기타 효소, 히드로콜로이드, 풍미제, 산화제, 미네랄 및 비타민이 포함될 수 있다.
유화제는 반죽 강화제 및 빵속 연화제로서 유용하다. 반죽 강화제로서, 유화제는 휴지 기간 (resting time) 에 대한 용인성 및 보강 동안 충격에 대한 용인성을 부여할 수 있다. 추가로, 반죽 강화제는 주어진 발효 기간 내에서 주어진 반죽의 내성을 개선시킨다. 대부분의 반죽 강화제는 또한 베이킹된 상품에 대한 보강으로 인한 부피 증가를 의미하는 가마 늘림 (oven spring) 에 대해 개선된다. 최근, 반죽 강화제는 조리법의 혼합물에 존재하는 임의의 지방을 유화시킬 것이다.
적합한 유화제에는 레시틴, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 식용 지방산의 모노- 및 디글리세리드, 식용 지방산의 모노- 및 디글리세리드의 아세트산 에스테르, 식용 지방산의 모노- 및 디글리세리드의 락트산 에스테르, 식용 지방산의 모노- 및 디글리세리드의 시트르산 에스테르, 식용 지방산의 모노- 및 디글리세리드의 아세틸 타르타르산 에스테르, 식용 지방산의 수크로오스 에스테르, 나트륨 스테아로일-2-락틸레이트 및 칼슘 스테아로일-2-락틸레이트가 포함된다.
추가적인 반죽 첨가제 또는 성분은 곡분, 물 또는 임의의 기타 성분 또는 첨가제, 또는 반죽 개선 조성물을 포함하는 임의의 반죽 성분과 함께 첨가될 수 있다. 추가적인 반죽 첨가제 또는 성분은 곡분, 물, 임의적인 기타 성분 및 첨가제 또는 반죽 개선 조성물 이전에 첨가될 수 있다. 추가적인 반죽 첨가제 또는 성분은 곡분, 물, 임의적인 기타 성분 및 첨가제 또는 반죽 개선 조성물 이후에 첨가될 수 있다.
추가적인 반죽 첨가제 또는 성분은 통상적으로 액체 제제일 수 있다. 그러나, 추가적인 반죽 첨가제 또는 성분은 통상적으로 건조 조성물의 형태일 수 있다.
바람직하게는, 추가적인 반죽 첨가제 또는 성분은 반죽의 곡분 성분의 1 중량% 이상이다. 더욱 바람직하게는, 추가적인 반죽 첨가제 또는 성분은 2% 이상, 바람직하게는 3% 이상, 바람직하게는 4% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 바람직하게는 6% 이상이다. 첨가제가 지방인 경우, 전형적으로는 지방은 1 내지 5%, 전형적으로 1 내지 3%, 더욱 전형적으로는 약 2% 의 양으로 존재할 수 있다.
기타 용도는 대리인 문서 제 674510-2007 호 및 제 GC806P 호에서 찾을 수 있을 것이며, 임의의 표, 참고문헌 또는 도면을 포함하여 이들은 모두 본원에 참고문헌으로 포함된다.
실시예 1. PS4 의 클로닝
슈도모나스 사카로필라 (Pseudomonas saccharophila) 를 LB 배지 상에서 밤새 배양하고, 염색체 DNA 를 표준 방법 (Sambrook J, 1989) 으로 단리했다. PS4 오픈 리딩 프레임 (Zhou et al., 1989) 을 포함하는 2190 bp 분절을, 프라이머 P1 및 P2 (표 3 참조) 를 이용하는 PCR 로써 슈도모나스 사카로필라 (Pseudomonas saccharophila) 염색체 DNA 로부터 증폭했다. 프라이머 P3 및 P4 을 이용하는 유전자 검사 (nested PCR) 에서, 상기 수득한 분절을 템플레이트로 이용하여, 시그널 서열이 없는 PS4 의 오픈 리딩 프레임을 증폭하고, NcoI 부위를 유전자의 5' 말단에, BamHI 부위를 3' 말단에 도입했다. NcoI 부위와 함께 N-말단 메티오닌 에 대한 코돈을 도입하여, PS4 의 세포내 발현을 가능하게 했다. 1605 bp 분절은 pCRBLUNT TOPO (Invitrogen) 에 클로닝하고, 구축물의 통합성은 서열분석으로 분석했다. 에셰리키아 콜라이 (E. coli) 바실러스 (Bacillus) 셔틀 벡터 pDP66K (Penninga et al., 1996) 를 개질하여 P32 프로모터 및 ctgase 시그널 서열의 제어 하에서의 PS4 의 발현을 가능케 했다. 수득한 플라스미드 pCSmta 를 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis) 로 형질전환시켰다.
전분 결합 도메인인 PS4 가 제거된 제 2 의 발현 구축물을 제조했다. pCSmta 상에서 프라이머 P3 및 P6 (표 3) 를 이용한 PCR 에서, mta 유전자의 절단 (truncated) 버젼이 생성되었다. pCSmta 중의 전장 mta 유전자를 상기 절단 버젼으로 교환하여, 플라스미드 pCSmta-SBD 를 제공했다.
실시예 2. PS4 의 부위 지정 돌연변이유발
돌연변이는 두 가지 방법으로 mta 유전자에 도입했다. 2 단계 PCR 에 근거하는 방법, 또는 Quick Exchange 방법 (QE). 편의상, mta 유전자를 3 부분으로 나누었다; PvuI-FspI 분절, FspI-PstI 분절 및 PstI-AspI 분절, 이후 각각 분절 1, 2 및 3 으로 명명한다.
상기 2 단계 PCR 에 근거하는 방법에서, 돌연변이는 Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene) 를 이용하여 도입된다. 첫번째 PCR 은 코딩 가닥에 대한 돌연변이화 (표 4) 및 하부 가닥 하류 프라이머 (표 3 에서의 2R 또는 3R) 를 이용하여 수행했다. 반응 생성물은 두번째 PCR 에서 코딩 가닥의 상류 프라이머와 함께 프라이머로서 이용된다. 최종 반응의 산물은 pCRBLUNT topo (Invitrogen) 으로 클로닝하여, 서열 분석 후 분절을 pCSmta 내의 상응하는 분절로 교환했다.
Quick Exchange 방법 (Stratagene) 을 이용하여, 돌연변이는 mta 유전자 또는 mta 유전자의 일부를 포함하는 플라스미드 상에서의 PCR 에서 2 개의 상보적인 프라이머를 이용하여 도입된다.
상기 목적을 위해, 3 SDM 플라스미드 및 3 pCSΔ 플라스미드를 포함하여 이루어지는 플라스미드의 편의적 세트가 구축되었다. 상기 SDM 플라스미드는 각각 상기 언급된 바와 같은, QE 에 의해 원하는 돌연변이가 도입된 mta 유전자의 1 개의 분절을 포함한다. 서열 분석으로 확인한 후, 상기 분절을 상응하는 수용자 pCSΔ 플라스미드에 클로닝했다. 상기 pCSΔ 플라스미드는 pCSmta 유래의 불활성 유도체이다. 활성은 SDM 플라스미드로부터 상응하는 분절을 클로닝함으로써 보존되어, 용이한 스크리닝을 가능하게 한다.
[표 3]
Figure 112006001199932-PCT00023
[표 4]
Figure 112006001199932-PCT00024
[표 5]
Figure 112006001199932-PCT00025
실시예 3. 다중 SDM
PS4 변이체들을 QuickChange
Figure 112006001199932-PCT00026
Multi Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) 을 이용하여, 기재된 일부 개질과 함께 제조사의 프로토콜에 따라 제조했다.
단계 1: 돌연변이체 가닥 합성 반응 ( PCR )
- 10 ml 팔콘 튜브 (Falcon tube) 에 3 ml. LB (22g/1 Lennox L Broth Base, Sigma) + 항생제 (0,05 ㎍/ml 카나마이신, Sigma) 를 접종함
- o/n 37℃, 약 200 rpm 에서 인큐베이션함.
- 원심분리 (5000 rpm/5 분) 로 세포를 스핀 다운시킴
- 매질을 따라 버림
- ds-DNA 템플레이트를 QIAGEN Plasmid Mini Purification Protocol 을 이용하여 제조함
1. 열순환을 위한 돌연변이체 가닥 합성 반응을 하기와 같이 준비했다:
PCR 믹스 (Mix):
2,5 ㎕ 10 × QuickChange
Figure 112006001199932-PCT00027
Multi 반응 완충액
0.75 ㎕ QuickSolution
X ㎕ 프라이머
프라이머 길이 28-35 bp → 10 pmol
프라이머 길이 24-27 bp → 7 pmol
프라이머 길이 20-23 bp → 5 pmol
1 ㎕ dNTP mix
X ㎕ ds-DNA 템플레이트 (200 ng)
1 ㎕ QuickChange
Figure 112006001199932-PCT00028
Multi 효소 블렌드 (2.5 U/㎕) (PfuTurbo
Figure 112006001199932-PCT00029
DNA 폴리머라아제)
X ㎕ dH2O (최종 부피 25 ㎕ 가 되도록 함)
모든 성분을 피펫팅으로 혼합하고, 반응 혼합물을 간단히 스핀 다운시킨다.
2. 하기 파라미터를 이용하여 반응을 순환시킴:
35 싸이클의 변성 (96℃/1 분)
프라이머 어닐링 (62.8℃/1 분)
신장 (65℃/15 분)
이후, 4℃ 에서 대기함.
PCR 튜브를 기계 (에펜도르프 열 순환기) 에 위치시키기 전에 PCR 기계의 뚜껑을 105℃ 까지 미리 가열하고, 플레이트를 95℃ 까지 미리 가열한다.
단계 2: Dpn I 절단
1. 2 ㎕ 의 Dpn I 제한 효소 (10 U/㎕) 를 각각의 증폭 반응에 첨가하여, 피펫으로 혼합하고 혼합물을 스핀다운시킨다.
2. 37℃ 에서 약 3 시간 동안 인큐베이션한다.
단계 3: XL10 -Gold
Figure 112006001199932-PCT00030
울트라컴피턴트 세포의 형질전환
1. XL10-Gold 세포를 얼음에서 해동한다. 매 돌연변이유발 반응마다 분취물 45 ㎕ 세포를 팔콘 튜브에서 미리 냉각시킨다.
2. 수조 (42℃) 를 켜고, NZY+ 브로쓰가 있는 튜브를 수조에 위치시켜 예열한다.
3. 2 ㎕ β-메르캅토에탄올 믹스를 각각의 튜브에 첨가한다. 흔들고 가볍게 두드리고, 10 분간 얼음에서 인큐베이션하고, 매 2 분마다 흔들어준다.
4. 1.5 ㎕ Dpn I-처리 DNA 를 각각의 세포 분취물에 첨가하고, 혼합되도록 흔들고 얼음 위에서 30 분 동안 인큐베이션한다.
5. 42℃ 수조에서 튜브를 30 초 동안 가열-펄스하고 얼음 위에 2 분간 정치시킨다.
6. 예열된 NZY+ 브로쓰 0.5 ml 를 각각의 튜브에 첨가하고, 225 내지 250 rpm 으로 진탕하며 1 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션한다.
7. 200 ㎕ 의 각 형질전환 반응물을 1% 전분 및 0.05 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 (33.6 g/1 Lennox L Agar, Sigma) 에 플레이팅했다.
8. 형질전환 플레이트를 37℃ 에서 밤새 인큐베이션했다.
[표 6]
Figure 112006001199932-PCT00031
[표 7]
Figure 112006001199932-PCT00032
[표 8]
Figure 112006001199932-PCT00033
pPD77 기재의 벡터 시스템
pPD77 용으로 이용된 벡터 시스템은 pCRbluntTOPOII (invitrogen) 기재이다. 제오신 내성 카세트는 pmlI 에 의해 제거되어, 393 bp 분절이 제거되었다. 이어서, pCC 벡터 유래의 발현 카세트 (P32-ssCGTase-PS4-tt) 를 벡터에 삽입했다.
pCCMini 에 대한 PS4 변이체의 라이게이션
상관 돌연변이 (relevant mutation) (MSDM 에 의해 창출됨) 를 포함하는 플라스미드는 제한 효소 NcoI 및 Hind III (Biolabs) 로 절단했다:
3 ㎍ 플라스미드 DNA, X ㎕ 10 × 완충액 2, 10 단위 NcoI, 20 단위 HindIII,
2 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다.
1% 아가로스 겔 상에서 효소에 의한 절단 (digestion) 을 수행했다. 크기가 1293 bp (PS4 유전자) 인 분절을 겔에서 잘라내어, Qiagen 겔 정제 키트를 이용하여 정제했다.
이어서, 벡터 pCCMini 를 제한효소 NcoI 및 HindIII 로 절단하고, 이어서, 상기 절단물을 1% 아가로스 겔에 걸었다. 크기가 3569 bp 인 분절을 겔에서 잘라내어, Qiagen 겔 정제 키트를 이용하여 정제했다.
라이게이션: Rapid DNA ligation kit (Roche) 이용
벡터에 대해 2 배량의 삽입체를 이용한다:
예를 들어, 2 ㎕ 삽입체 (PS4 유전자)
1 ㎕ 벡터
5 ㎕ T4 DNA 라이게이션 완충액 2 배 농축물
1 ㎕ dH20
1 ㎕ T4 DNA 리가아제
라이게이션을 5 분/RT 함.
상기 라이게이션된 것을 One Shot TOPO 컴피턴트 세포에 제조사의 프로토콜 (Invitrogen) 에 따라 형질전환했다. 바람직하게는 5 ㎕ 라이게이션물을 형질전환에 이용했다.
1% 전분 및 0.05 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 (33.6 g/L Lennox L Agar, Sigma) 상에 50 ㎕ 의 형질전환체 믹스를 플레이팅했다. 삽입체 (PS4 변이체) 를 포함하는 벡터는 전분 플레이트 상에서 할로 형성으로 식별될 수 있다.
실시예 4. 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis ) 로의 형질전환 (원형질체 형질전환)
바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) (균주 DB104A ; Smith et al. 1988; Gene 70,351-361) 는 하기 프로토콜에 따라 돌연변이화된 pCS-플라스미드를 이용하여 형질전환했다.
A. 원형질체화 및 형질전환용 배지
2 x SMM: 리터 당, 342 g 수크로오스 (1 M); 4.72 g 나트륨 말레에이트 (0.04 M); 8: 12 g MgCl2, 6H20 (0.04 M); 진한 NaOH 을 이용하여 pH 6.5 으로 함. 50-ml 부씩 나누어 10 분 동안 오토클레이브.
4 x YT (1/2 NaCl): 100 ml 당 2 g 효모 추출물 + 3.2 g 트립톤 + 0.5 g NaCl
SMMP: 2 x SMM 및 4 x YT 의 부피에 해당하는 믹스 (mix).
PEG: 25 ml 1 × SMM (10 분 동안 오토클레이브) 중 10 g 폴리에틸렌글리콜 6000 (BDH) 또는 8000 (Sigma).
B. 플레이팅/재생용 배지
아가: 4% Difco 최소 아가. 15 분 동안 오토클레이브.
나트륨 숙시네이트: 270 g/l (1 M), HCl 을 이용하여 pH 7.3 로 함. 15 분 동안 오토클레이브.
포스페이트 버퍼: 100 ml 당 3.5 g K2HP04 + 1.5 g KH2PO4. 15 분 동안 오토클레이브.
MgCl2: 100 ml 당 20.3 g MgCl2, 6H20 (1 M)
카사미노산: 5% (w/v) 용액. 15 분 동안 오토클레이브.
효모 추출물: 100 ml 당 10 g, 15 분 동안 오토클레이브.
글루코오스 20% (w/v) 용액. 10 분 동안 오토클레이브.
DM3 재생 배지: 60℃ 에서 혼합 (수조; 500-ml 병):
250 ml 나트륨 숙시네이트
50 ml 카사미노산
25 ml 효모 추출물
50 ml 포스페이트 버퍼
15 ml 글루코오스
10 ml MgCl2
100 ml 용융 아가
적당한 항생제 첨가: 클로람페니콜 및 테트라싸이클린, 5 ㎍/ml; 에리트로마이신, 1 ㎍/ml. 카나마이신 상에서의 선별은 DM3 배지에서는 문제가 된다: 농도 250 ㎍/ml 가 필요할 것이다.
C. 원형질체의 제조
1. 전체적으로 계면활성제가 없는 플라스틱 또는 유리제를 이용한다.
2. 단일 콜로니 유래의 100 ml 플라스크 중의 10 ml 의 2 × YT 배지를 접종한다. 밤새 진탕기 (200 rev/분) 중에서 25-30℃ 로 배양물을 배양시킨다.
3. 밤새 배양한 것을 20 배 희석하여 100 ml 의 새로 만든 2 x YT 배지 (250-ml flask) 로 옮기고, 진탕기 (200 내지 250 rev/분) 내에서 37℃에서 OD600 = 0.4 내지 0.5 (약 2 시간) 이 될 때까지 배양한다.
4. 원심분리 (9000 g, 20 분, 4℃) 로 세포를 수합한다.
5. 피펫으로 상청액을 제거하고, 세포를 5 ml 의 SMMP + 5 mg 라이소자임 중에 재현탁하고, 멸균 여과시킨다.
6. 수조 진탕기 (100 rev/분) 에서 37℃ 로 인큐베이션한다.
30 분 후, 15 분 간격으로 현미경으로 시료 25 ㎕ 를 검사했다. 99% 의 세포가 원형질체화 (구형의 외양) 될 때까지 인큐베이션을 지속한다. 원심분리 (4000 g, 20 분, RT) 로 원형질체를 수합하고, 상청액을 피펫으로 제거했다. 펠렛을 1-2 ml 의 SMMP 로 가볍게 재현탁했다.
이로서, 원형질체가 즉시 사용된다. (일부 (예를 들어 0.15 ml) 는 장래의 사용을 위해 -80℃ 에서 동결될 수 있다 (글리세롤 첨가는 필요하지 않다). 냉동 원형질체를 이용하면 형질전환 능력이 약간 감소하게 되지만, DNA ㎍ 당 106 개의 형질전환체가 수득될 수 있다).
D. 형질전환
1. 450 ㎕ 의 PEG 를 마이크로튜브에 이동시킨다.
2. 1 내지 10 ㎕ 의 DNA (0.2 ㎍) 와 150 ㎕ 의 원형질체를 혼합하고, 상기 혼합물을 PEG 가 있는 마이크로튜브에 첨가한다. 즉시, 그러나 가볍게 혼합한다.
3. 2 분 동안 RT 에서 정치시킨 후, 1.5 ml 의 SMMP 를 첨가하여 혼합한다.
4. 마이크로원심분리 (10 분, 13.000 rev/분 (10 내지 12.000 g)) 로 원형질체를 수합하고, 상청액을 제거한다. 잔류 액적을 티슈로 제거한다.
300 ㎕ 의 SMMP (와동하지 않음) 를 첨가하고, 60 내지 90 분 동안 37℃ 로 수조 진탕기 (100 rev/분) 에서 인큐베이션하여, 항생제 내성 마커의 발현을 가능하게 했다. (원형질체는 수조의 진탕 작용을 통해 충분히 재현탁된다). 1 ×SSM 로 적절히 희석시키고, 0.1 ml 를 DM3 플레이트에 플레이팅했다.
실시예 5. 진탕 플라스크에서의 PS4 변이체의 발효
진탕 플라스크 기질은 하기와 같이 준비했다:
성분 % (w/w)
물 -
효모 추출물 2
대두분 2
NaCl 0.5
디포타슘 포스페이트 0.5
발포억제제 0.05
기질은 오토클레이브 전에 4N 황산 또는 수산화나트륨을 이용하여 pH 6.8 으로 조정했다. 100 ml 의 기질을 1 개의 노가 있는 500 ml 플라스크에 위치시키고, 30 분 동안 오토클레이브했다. 후속적으로, 6 ml 의 멸균 덱스트로오스 시럽을 첨가했다. 덱스트로오스 시럽은 한 부피의 50% w/v 덱스트로오스 및 한 부피의 물을 혼합한 후 20 분 동안 오토클레이브하여 제조했다.
진탕 플라스크는 변이체로 접종하여 인큐베이터에서 24 시간 동안 35℃/180 rpm 으로 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리 (10,000 x g, 10 분 동안) 하여 분리하고, 최종적으로 상청액을 0.2 ㎛ 에서 미세여과하여 세포가 없게 만들었다. 세포가 없는 상청액을 검정 및 적용 시험에 이용했다.
실시예 6. 아밀라아제 검정
베타밀 검정
베타밀 1 단위는 PNP-커플링된 말토펜타오스를 1 분 마다 0.0351 mmole 을 분해하는 활성으로 정의되며, 이로서 1 분 마다 0.0351 mmole 이 검정 믹스에서 과량의 α-글루코시다아제에 의해 방출될 수 있다. 검정 믹스는 pH 6.5 인 50 mM Na-시트레이트, 5 mM CaCl2 50 ㎕ 를 효소 시료 25 ㎕ 및 이스라엘의 Megazyme 제조의 베타밀 기질 (Glc5-PNP 및 α-글루코시다아제) (10 ml 물에 용해된 1 바이알) 25 ㎕ 와 함께 함유한다. 상기 검정 믹스는 30 분 동안 40℃ 에서 인큐베이션 한 후, 150 ㎕ 의 4% 트리스를 첨가하여 중단했다. 420 nm 에서의 흡광도를 ELISA 검독기를 이용해 측정하고, 베타밀 활성은 검정된 효소 시료의 ml 당 베타밀 단위체에서의 활성 = A420 * d 를 근거로 계산했다.
엔도- 아밀라아제 검정
엔도-아밀라아제 검정은 제조사 (Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB) 의 프로토콜에 따라 진행되는 Phadebas 검정과 동일하다.
엑소 -특이성
엑소-아밀라아제 활성 대 Phadebas 활성의 비율은 엑소-특이성의 평가에 사용되었다.
특이적 활성
PSac-D14, PSac-D20 및 PSac-D34 변이체에 있어서, Bradford (1976; Anal. Biochem. 72,248) 에 따라 측정된 정제된 단백질의 마이크로그람 당 10 개의 베타밀 단위체의 평균 특이적 활성을 발견했다. 상기 특이적 활성은, 활성을 근거로 하는 적용 시도에서 이용되는 투여량 계산에 이용된다.
실시예 7. 반감기 결정
t1/2 은 정해진 가열 조건 하에 효소 활성의 절반이 불활성화되는 동안 걸리는 시간 (분) 으로 정의된다. 효소의 반감기를 결정하기 위해서는, 시료는 60℃ 내지 90℃ 의 일정한 온도에서 1 내지 10 분 동안 가열한다. 상기 반감기는 잔류 베타밀 검정을 근거로 계산된다.
과정: 에펜도르프 바이알에서, 1,000 ㎕ 완충액을 60℃ 이상에서 10 분 이상 예열한다. 시료의 열처리는 가열 인큐베이터 (Eppendorf 사 제조의 Termomixer comfort) 에서 에펜도르프 바이알의 연속적인 혼합 (800 rpm) 하에 예열된 완충액에 100 ㎕ 의 시료를 첨가하여 시작한다. 인큐베이션 0, 2, 4, 6, 8 및 9 분 후, 처리는 45 ㎕ 의 시료를 20℃ 에서 평형화된 1000 ㎕ 의 완충액에 이동시켜 처리를 중지하고, 1 분 동안 1500 rpm 및 20℃ 에서 인큐베이션했다. 잔류 활성은 베타밀 검정으로 측정했다.
계산: t1/2 의 계산은 잔류 베타민 활성 대 인큐베이션 시간의 log10 (밑이 10 인 로그) 의 기울기를 기준으로 한다. t1/2 은, 기울기/0.301 = t1/2 로 계산한다.
실시예 8. 결과
[표 9] 야생형 PSac-cc1 와 비교한 PSac-변이체의 생화학적 특성
Figure 112006001199932-PCT00034
[표 10]
Figure 112006001199932-PCT00035
[표 11]
Figure 112006001199932-PCT00036
[표 12]
Figure 112006001199932-PCT00037
[표 12]
Figure 112006001199932-PCT00038
Figure 112006001199932-PCT00039
[표 13]
Figure 112006001199932-PCT00040
[표 14]
Figure 112006001199932-PCT00041
[표 15]
Figure 112006001199932-PCT00042
Figure 112006001199932-PCT00043
Figure 112006001199932-PCT00044
실시예 9. 모델 베이킹 시험
반죽을 30.0℃ 의 파리노그라프 (Farinograph) 에서 제조했다. 10.00 g 의 재형성된 곡분을 칭량하고, 파리노그라프에 추가했으며; 1 분 후 표준/시료 (표준 = 완충액 또는 물, 시료 = 효소 + 완충액 또는 물) 를 멸균 피펫을 이용하여 혼련통의 구멍을 통해 첨가했다. 30 초 후, 곡분을 테두리에서 긁어 모으고 - 혼련통의 구멍을 통해서도 긁어 모았다. 시료를 7 분 동안 혼련했다.
완충액 또는 물을 이용한 시험은 최종적인 표준을 가동시키기 전 파리노그라 프 상에서 수행했다. FU 는 표준 상에서는 400 이어야 하는데, 그렇지 않을 경우, 이는 예를 들어 액체의 양으로 조정되어야 한다. 표준/시료는 시약수저로 제거하고, 손에 위치시키고 (손에는 1 회용 장갑 착용), 이후 NMR 관에 들어가 잠겨질 작은 유리관 (길이가 약 4.5 cm) 에 채웠다. 반죽마다 7 개의 관을 제조했다.
모든 시료가 준비되었으면, 관을 33℃ 의 (프로그램 가능한) 수조 (코크 없음) 에 25 분 동안 위치시킨 후, 수조를 5 분 동안 33℃ 에서 정치시킨 후, 56 분에 걸쳐 98℃ 까지 가열하고 (매 분 1.1℃), 최종적으로 5 분 동안 96℃ 에서 정치시켰다.
관을 20.0℃ 에서 열량계 선반에서 보관했다. 빵 속의 고체 함량은 제조된 빵 속 시료에 대해, 도 2 에서 0, 05, 1 및 2 ppm PSacD34 으로 나타낸 바와 같이, 제 1, 3 및 7 일에 Bruker NMS 120 Minispec NMR analyser 를 이용하는 양성자 NMR 로 측정했다. 경시적으로 고체 함량에 있어서 더 적은 증가는 아밀로펙틴 노화의 감소를 나타낸다. 열량계 선반 내에서 20.0℃ 로 7 일 저장 후, 빵 속 시료 10 내지 20 mg 를 칭량하여, 40 ㎕ 알루미늄 표준 DSC 캡슐에 위치시키고, 20℃ 로 유지했다.
상기 캡슐은 Mettler Toledo DSC 820 장치 상의 시차 주사 열량계용으로 이용했다. 파라미터로서, 매 분 10℃ 씩 20 내지 95℃ 의 가열 싸이클 및 기체/유동: 매 분 N2/80 ml 를 이용했다. 결과를 분석하고, 노화 아밀로펙틴의 용융 엔탈피를 J/g 로 계산했다.
실시예 10. 노화 방지 효과
모델 빵 속 (bread crumb) 을 제조하고, 실시예 8 에 따라 측정했다. 표 2 에 나타낸 바와 같이, PS4 변이체는 대조군과 비교시 시차 주사 열량계로 측정되는 바와 같이 베이킹 후 아밀로펙틴 노화의 강력한 감소를 나타낸다. PS4 변이체는 명확한 투여량 효과를 나타낸다.
실시예 11. 베이킹 시도에서 경도 효과
베이킹 시도는 표준 백색 빵 스폰지 및 US 토스트용 반죽 조리법을 이용하여 수행했다. 스폰지 반죽은 곡분 (Sisco Mills, USA 사 제조의 "All Purpose Classic" 인 곡분 1600 g, 950 g 의 물, 40 g 의 대두유 및 32 g 의 건조 효모로부터 제조했다. 상기 스폰지를 Hobart 나선 혼합기 상에서 1 분 동안 저속으로 혼합한 후, 후속적으로 3 분 동안 속도 2 로 혼합했다. 상기 스폰지는 후속적으로 2.5 시간 동안 35℃, 습도 85% RH 에서 발효시킨 후, 0.5 시간 동안 5℃ 에서 발효시켰다.
이후, 400 g 의 곡분, 4 g 의 건조 효모, 40 g 의 염, 2,4 g 의 칼슘 프로피오네이트, 240 g 의 고급 프룩토오스 옥수수 시럽 (Isosweet), 5 g 의 유화제 PANODAN 205,5 g 의 효소 활성 대두분, 30 g 의 비활성 대두 곡분, 220 g 의 물 및 30 g 의 아스코르브산 용액 (물 500 g 에 아스코르브산 4 g 을 용해시켜 제조) 을 스폰지에 첨가했다. 수득한 반죽을 Diosna 혼합기 상에서 1 분 동안 저속에서 혼합하고 6 분 동안 속도 2 로 혼합했다. 이후, 반죽을 5 분 동안 상온에서 정 치시킨 후, 550 g 의 반죽 조각을 잘라내어 5 분 동안 정치시킨 후, 1: 4, 2:4, 3:15, 4:12 및 각 측면 10 으로 고정된 Glimek 시터 상에서 시팅하고 베이킹 형태로 이동시켰다. 43℃ 에서 90% RH 로 60 분 보강 후, 반죽을 29 분 동안 218℃ 에서 베이킹했다.
경도 (firmness) 및 탄성을 TA-XT 2 텍스쳐 분석기로 측정했다. 연화도, 접착성 및 탄력성은 Stable Micro Systems, UK 사의 Texture Analyser 를 이용한 텍스쳐 프로파일 분석 (Texture Profile Analysis) 으로 빵 슬라이스를 분석하여 결정한다. 하기의 설정을 이용했다:
시험 전 속도: 2 mm/s
시험 속도: 2 mm/s
시험 후 속도: 10 mm/s
균열 시험 거리: 1%
거리: 40%
강도: 0.098 N
시간: 5.00 sec
계수: 5
하중 셀: 5 kg
촉진자 유형: Auto-0.01 N
결과는 도 3 및 4 에 나타냈다.
실시예 12. 대니쉬 롤의 부피 제어
대니쉬 롤은 2000 g 의 대니쉬 (Danish) 재형성 곡분 (Cerealia 사), 120 g 의 압착 효모, 32 g 의 염 및 32 g 의 수크로오스 기재의 반죽으로부터 제조된다. 선행 기술의 물 최적화에 따라 반죽에 물을 첨가한다.
반죽을 Diosna 혼합기 (저속에서 2 분, 고속에서 5 분) 상에서 혼합했다. 혼합 후 반죽 온도는 26℃ 로 유지했다. 1350 g 의 반죽을 오려내고 10 분 동안 가열 캐비넷 내에서 30℃ 로 정치시켰다. 롤을 Fortuna 몰더에서 몰딩하고 45 분 동안 34℃ 및 85% 상대 습도에서 강화했다. 후속적으로, 롤을 18 분 동안 250℃ 에서, 처음 13 초 동안 수증기를 동반하여 Bago 2 오븐에서 베이킹했다. 베이킹 후, 롤을 25 분 동안 냉각시키고, 칭량 및 부피 측정을 했다.
롤을 크러스트 외관, 빵 속 균질성, 크러스트의 캡핑, 오스번드 (ausbund) 및 비부피 (평지유 치환법으로 부피 측정) 에 관해 평가했다.
상기 기준을 바탕으로, PS4 변이체는 비부피를 증가시키며 대니쉬 롤의 품질 파라미터를 개선한다는 것을 발견했다. 이에 따라, PS4 변이체는 베이킹된 생산품의 부피를 제어할 수 있다.
본 문건에서 언급한 각각의 출원 및 특허, 및 상기 출원 및 특허 각각에서 인용 또는 참조된 문건은, 기소 중인 출원 및 특허 ("출원 인용 문헌"), 상기 각각의 출원 및 특허 및 출원 인용 문헌에서 인용 또는 언급된 임의의 생산품 제조사의 지시사항 또는 카탈로그를 포함하여, 본원에 참고문헌으로 포함된다. 더욱이, 본 명세서에 인용된 모든 문건들, 본 명세서에 인용된 문건에서 인용 또는 참조한 모든 문건들, 및 본 명세서에서 인용 또는 언급한 임의의 생산품에 대한 임의의 제 조사의 지시사항 또는 카탈로그는 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 범위 및 진의를 벗어나지 않는 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 각종 개질 및 변형은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 특별한 바람직한 구현예와 연관하여 기재되었지만, 청구된 본 발명은 상기 특별한 구현예로 한정되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다. 물론, 분자생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 자명한, 본 발명을 수행하기 위해 기재된 양태의 각종 개질은 청구범위의 범위에 속하는 것으로 의도된다.
서열목록
서열 번호 1: PS4 참고 서열, 슈도모나스 사카로필라 (Pseudomonas saccharophila) 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열 유래
Figure 112006001199932-PCT00045
서열 번호 2: PS4 변이체; 10 개의 치환이 있는 슈도모나스 사카로필라 (Pseudomonas saccharophila) 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열
Figure 112006001199932-PCT00046
서열 번호 3: PS4 변이체 서열; 11 개의 치환이 있는 슈도모나스 사카로필라 (Pseudomonas saccharophila) 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열
Figure 112006001199932-PCT00047
서열 번호 4: PS4 변이체 서열; 12 개의 치환이 있는 슈도모나스 사카로필라 (Pseudomonas saccharophila) 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열
Figure 112006001199932-PCT00048
Figure 112006001199932-PCT00049
서열 번호 4a: PSac-D20 서열; 13 개의 치환 및 전분 결합 도메인의 결실이 있는 슈도모나스 사카로필라 (Pseudomonas saccharophila) 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열
Figure 112006001199932-PCT00050
서열 번호 4b: PSac-D14 서열; 14 개의 치환 및 전분 결합 도메인의 결실이 있는 슈도모나스 사카로필라 (Pseudomonas saccharophila) 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열
Figure 112006001199932-PCT00051
서열 번호 4c: Psac-D34 서열; 11 개의 치환 및 전분 결합 도메인의 결실이 있는 슈도모나스 사카로필라 (Pseudomonas saccharophila) 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열
Figure 112006001199932-PCT00052
서열 번호 5: 슈도모나스 사카로필라 (Pseudomonas saccharophila) 글루칸 1,4-알파-말토테트라히드롤라아제 전구체 (EC 3.2.1.60) (G4-아밀라아제) (말토테트라오스-형성 아밀라아제) (엑소-말토테트라히드롤라아제) (말토테트라오스-형성 엑소-아밀라아제). SWISS-PROT 접근 번호 P22963.
Figure 112006001199932-PCT00053
서열 번호 6: 말토테트라오히드롤라아제 (EC 번호 = 3.2.1.60) 를 코딩하는 슈도모나스 사카로필라 (P. saccharophila) mta 유전자. GenBank 접근 번호 X16732.
Figure 112006001199932-PCT00054
Figure 112006001199932-PCT00055
서열 번호 7: PS4 참고 서열, 슈도모나스 스투트제리 (Pseudomonas stutzeri) 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열 유래
Figure 112006001199932-PCT00056
서열 번호 8: PStu-D34 서열; 8 개의 치환이 있는 슈도모나스 스투트제리 (Pseudomonas stutzeri) 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열
Figure 112006001199932-PCT00057
서열 번호 9: PStu-D20 서열; 9 개의 치환이 있는 슈도모나스 스투트제리 (Pseudomonas stutzeri) 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열
Figure 112006001199932-PCT00058
서열 번호 10: PStu-D14 서열; 10 개의 치환이 있는 슈도모나스 스투트제리 (Pseudomonas stutzeri) 말토테트라히드롤라아제 아미노산 서열
Figure 112006001199932-PCT00059
서열 번호 11: 슈도모나스 스투트제리 (Pseudomonas stutzeri) (슈도모나스 페르펙토마리나 (Pseudomonas perfectomarina)). 글루칸 1,4-알파- 말토테트라히드롤라아제 전구체 (EC 3.2.1.60) (G4-아밀라아제) (말토테트라오스-형성 아밀라아 제) (엑소-말토테트라히드롤라아제) (말토테트라오스-형성 엑소-아밀라아제). SWISS-PROT 접근 번호 P13507.
Figure 112006001199932-PCT00060
서열 번호 12: 슈도모나스 스투트제리 (P. stutzeri) 말토테트라오스-형성 아밀라아제 (amyP) 유전자, 완전 cds. GenBank 접근 번호 M24516.
Figure 112006001199932-PCT00061
<110> Genencor International, Inc. Danisco A/S Berg, Casper Tune Bojsen, Kirsten Derkx, Patrick M.F. Fioresi, Carol Gerritse, Gijsbert Kragh, Karsten M. Liu, Wei Shaw, Andrew Thoudahl, Charlotte R. <120> Exo-Specific Amylase Polypeptides, Nucleic Acids Encoding Those Polypeptides and Uses Thereof <130> GC807 <140> 10/886,903 <141> 2004-07-07 <150> US 60/485,616 <151> 2003-07-07 <150> US 60/485,539 <151> 2003-07-07 <150> US 60/485,413 <151> 2003-07-07 <160> 42 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 530 <212> PRT <213> Pseudomonas saccharophilia <400> 1 Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro 20 25 30 Asn Asp Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp 65 70 75 80 His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp 100 105 110 Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Gly Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn 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Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro 20 25 30 Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Trp Thr Asp Pro Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp 65 70 75 80 His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp 100 105 110 Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Asp Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn 115 120 125 Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly 130 135 140 Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Glu 145 150 155 160 Ser Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp 165 170 175 Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe 180 185 190 Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser 195 200 205 Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Ala Pro 210 215 220 Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln 225 230 235 240 Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys His 260 265 270 Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr 275 280 285 Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly 290 295 300 Gln His Leu Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala 305 310 315 320 Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met 325 330 335 Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg 340 345 350 Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly 355 360 365 Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val 370 375 380 Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly 385 390 395 400 Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp 405 410 415 Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly 420 425 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Pseudomonas saccharophilia <400> 16 Met Ser His Ile Leu Arg Ala Ala Val Leu Ala Ala Val Leu Leu Pro 1 5 10 15 Phe Pro Ala Leu Ala 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 atgacgaggt ccttgttttt c 21 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cgctagtcgt ccatgtcg 18 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gccatggatc aggccggcaa gagcccg 27 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tggatcctca gaacgagccg ctggt 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gaattcagcc gccgtcattc ccgcc 25 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 agatttacgg catgtttcgc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tagccgctat ggaagctgat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tgaccttcgt cgacaaccac 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gatagctgct ggtgacggtc 20 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 26 ctgccggccg gccagcgctt ctggcg 26 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 27 cgccagaagc gctggccggc cggcag 26 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 28 gacggtgacc gcttcctggg cggcgagtcg 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 29 cgactcgccg cccaggaagc ggtcaccgtc 30 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 30 ggcgagctgt ggaaagcccc ttctgaatat ccg 33 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 31 cggatattca gaaggggctt tccacagctc gcc 33 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 32 gaacggcggc cagcacctgt gggcgctgca g 31 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 33 ctgcagcgcc cacaggtgct ggccgccgtt c 31 <210> 34 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 34 gtactggccg cacatgtacg actggggcta cggcgaattc atc 43 <210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 35 gatgaattcg ccgtagcccc agtcgtacat gtgcggccag tac 43 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 36 gcgaagcgcc ctacaactgg tacaac 26 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 37 ccgacggcgg caggtccggc g 21 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 38 caagaacagc cgctacggca gcgac 25 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 39 cacatgaacc gcgactaccc ggacaag 27 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 40 cgcaacgact gcgccgaccc ggg 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 41 cgcgacgagt ttaccaacct gcg 23 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 42 gtactggccg cacatgtacg actggggcta cggc 34

Claims (19)

  1. 서열 번호 1, 5, 7 또는 11 과 75% 이상 상동인 아미노산 서열, 및 4, 33, 34, 70, 71, 87, 99, 108, 113, 121, 134, 141, 157, 158, 171, 178, 179, 188, 198, 199, 223, 290, 307, 315, 334, 343, 399 및 405 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 외형 특이성 비-말토제닉 엑소아밀라아제.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 1 과 75% 이상 상동인 엑소아밀라아제.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 5 와 75% 이상 상동인 엑소아밀라아제.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 7 과 75% 이상 상동인 엑소아밀라아제.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 11 과 75% 이상 상동인 엑소아밀라아제.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산이 서열 번호 2 내지 4b 또는 8 내지 10 과 75% 이상 상동인 아미노산 서열을 포함하는 엑소아밀라아제.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 치환이 G4D, N33Y, D34N, G70D, K71R, G87S, A99V, K108R, V113I, G121D, G134R, A141P, I157L, G158D, Y171S, L178F, A179T, G188A, Y198F, Y198F, Y198L, A199v, G223A, V290I, H307L, 1315V, S334P, D343E, S399P, A405F 및 A405E 로부터 선택되는 엑소아밀라아제.
  8. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 위치가 33, 34, 71, 87, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 207, 334 및 343 로부터 선택되는 엑소아밀라아제.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 하나 이상의 치환이 N33Y, D34N, K71R, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L, S334P 및 D343E 로부터 선택되는 엑소아밀라아제.
  10. 제 8 항에 있어서, 108, 158, 171 및 188 로부터 선택되는 위치에서의 하나 이상의 추가적인 치환을 포함하는 엑소아밀라아제.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 치환이 K108R, G158D, Y171S 및 G188A 로부터 선택되는 엑소아밀라아제.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 치환이 하기로부터 선택되는 조합을 포함하는 엑소아밀라아제:
    Figure 112006001199932-PCT00062
    Figure 112006001199932-PCT00063
    12. 제 3 항에 있어서, 상기 하나 이상의 치환이 하기로부터 선택되는 조합을 포함하는 엑소아밀라아제:
    Figure 112006001199932-PCT00064
  13. 제 3 항에 있어서, 상기 하나 이상의 치환이 하기로부터 선택되는 조합을 포함하는 엑소아밀라아제:
    Figure 112006001199932-PCT00065
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 아밀라아제가 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 4a, 서열 번호 4b, 서열 번호 8, 서열 번호 9 및 서열 번호 10 으로 부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 엑소아밀라아제.
  15. 제 1 항에 있어서, 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.) 으로부터 유래되는 엑소아밀라아제.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 슈도모나스 속이 슈도모나스 사카로필리아 (Pseudomonas saccharophilia) 및 슈도모나스 스투트제리 (Pseudomonas stutzeri) 로부터 선택되는 엑소아밀라아제.
  17. 제 1 항의 엑소아밀라아제를 코딩하는 핵산 서열과 75% 이상 상동인 핵산 서열.
  18. 제 17 항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  19. 제 18 항의 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포.
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