JP2745152B2 - 組換え体プラスミドならびに該プラスミドを含む微生物 - Google Patents
組換え体プラスミドならびに該プラスミドを含む微生物Info
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- JP2745152B2 JP2745152B2 JP22228889A JP22228889A JP2745152B2 JP 2745152 B2 JP2745152 B2 JP 2745152B2 JP 22228889 A JP22228889 A JP 22228889A JP 22228889 A JP22228889 A JP 22228889A JP 2745152 B2 JP2745152 B2 JP 2745152B2
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は組換え体プラスミドならびに該プラスミドを
含む、異種遺伝子産物をペリプラズムあるいは菌体外に
蓄積可能な微生物に関するものである。
含む、異種遺伝子産物をペリプラズムあるいは菌体外に
蓄積可能な微生物に関するものである。
従来技術 クローニングされた酵素などの生理活性蛋白質の遺伝
子を用いて微生物によりその遺伝子産物を大量生産する
方法に注目があつめられている。
子を用いて微生物によりその遺伝子産物を大量生産する
方法に注目があつめられている。
かかる技術のひとつとして異種蛋白質の遺伝子を大腸
菌用ベクタープラスミドに接続し、これを大腸菌に導入
して異種蛋白質を生産することが試みられたが、菌体内
に蓄積された蛋白質のインクルージョンボディー（凝集
塊）の形成による蛋白質の失活や微生物自体の成育阻害
による生産阻害が認められ、遺伝子産物の大量生産には
いまだ問題点が残っている。
菌用ベクタープラスミドに接続し、これを大腸菌に導入
して異種蛋白質を生産することが試みられたが、菌体内
に蓄積された蛋白質のインクルージョンボディー（凝集
塊）の形成による蛋白質の失活や微生物自体の成育阻害
による生産阻害が認められ、遺伝子産物の大量生産には
いまだ問題点が残っている。
菌体外酵素遺伝子は数多くクローン化され、その塩基
配列の決定がなされている。その結果、ほとんどの菌体
外酵素遺伝子はシグナル配列とよばれる部分を有し、そ
の産物はアミノ末端にシグナルペプチドのついた前駆体
として翻訳合成されることが明らかとなった。シグナル
ペプチドはアミノ末端のメチオニンに続きリジンやアル
ギニンの塩基性アミノ酸の多い部分、そして疎水性アミ
ノ酸の領域よりなり、全体で17〜36アミノ酸程度の長さ
を示すが、この領域がタンパク質の菌体外分泌の際に重
要な役割を果たす。そこでシグナル配列の下流に有用蛋
白質をコードするための異種生物由来の構造遺伝子を組
込み、主として枯草菌を宿主として有用蛋白質の菌体外
生産が試みられた（山根國男著，蛋白質核酸酵素,30巻
925（1983）；中山等,J.Biotechnol.5,71（198
7））。この場合に用いられたシグナル配列は枯草菌の
α−アミラーゼやプロテアーゼ遺伝子由来のものであっ
た。しかしながら枯草菌の場合、蛋白質と共にプロテア
ーゼをも菌体外に分泌するため、生産分泌された異種蛋
白質がこのプロテアーゼにより分解され生産性の向上が
阻害される。
配列の決定がなされている。その結果、ほとんどの菌体
外酵素遺伝子はシグナル配列とよばれる部分を有し、そ
の産物はアミノ末端にシグナルペプチドのついた前駆体
として翻訳合成されることが明らかとなった。シグナル
ペプチドはアミノ末端のメチオニンに続きリジンやアル
ギニンの塩基性アミノ酸の多い部分、そして疎水性アミ
ノ酸の領域よりなり、全体で17〜36アミノ酸程度の長さ
を示すが、この領域がタンパク質の菌体外分泌の際に重
要な役割を果たす。そこでシグナル配列の下流に有用蛋
白質をコードするための異種生物由来の構造遺伝子を組
込み、主として枯草菌を宿主として有用蛋白質の菌体外
生産が試みられた（山根國男著，蛋白質核酸酵素,30巻
925（1983）；中山等,J.Biotechnol.5,71（198
7））。この場合に用いられたシグナル配列は枯草菌の
α−アミラーゼやプロテアーゼ遺伝子由来のものであっ
た。しかしながら枯草菌の場合、蛋白質と共にプロテア
ーゼをも菌体外に分泌するため、生産分泌された異種蛋
白質がこのプロテアーゼにより分解され生産性の向上が
阻害される。
発明が解決しようとする問題点 そこで新規な組換え体プラスミドを用い大腸菌による
蛋白質の如き有用物質の、失活がなく効率的な大量生産
可能な製造法が要望されている。さらにまた、枯草菌を
使用する技術にあっては有用蛋白質の発現効率を大にす
ることと、せっかく分泌生産された有用蛋白質をプロテ
アーゼにより分解されることを防止する有効な手段を提
供することが要望されている。さらにまた、新規な組換
え体プラスミドで大腸菌に対しても枯草菌に対してもく
みこむことが可能なものの提供が望まれている。かかる
要望に応えることが本発明目的である。
蛋白質の如き有用物質の、失活がなく効率的な大量生産
可能な製造法が要望されている。さらにまた、枯草菌を
使用する技術にあっては有用蛋白質の発現効率を大にす
ることと、せっかく分泌生産された有用蛋白質をプロテ
アーゼにより分解されることを防止する有効な手段を提
供することが要望されている。さらにまた、新規な組換
え体プラスミドで大腸菌に対しても枯草菌に対してもく
みこむことが可能なものの提供が望まれている。かかる
要望に応えることが本発明目的である。
問題点を解決するための手段 本発明に従えば、上記発明目的が （１）大腸菌用ベクタープラスミドのクローニングサイ
トに、枯草菌IFO 3034株の菌体外セルラーゼ遺伝子の
プロモーター及びシグナル配列と、その下流に特定有用
物をコードするための異種生物由来の構造遺伝子とを組
み入れてなる組換え体プラスミドおよび （２）Bacillus subtilisおよびその近縁種から選ばれ
るBacillus菌のベクタープラスミドのクローニングサイ
トに、前記第１項記載の組換え体プラスミドのプロモー
ター、シグナル配列および構造遺伝子部分から該プラス
ミドに含まれるレプリコン部までを酵素的に切り取り連
結してなる組換え体プラスミドにより達成せられる。
トに、枯草菌IFO 3034株の菌体外セルラーゼ遺伝子の
プロモーター及びシグナル配列と、その下流に特定有用
物をコードするための異種生物由来の構造遺伝子とを組
み入れてなる組換え体プラスミドおよび （２）Bacillus subtilisおよびその近縁種から選ばれ
るBacillus菌のベクタープラスミドのクローニングサイ
トに、前記第１項記載の組換え体プラスミドのプロモー
ター、シグナル配列および構造遺伝子部分から該プラス
ミドに含まれるレプリコン部までを酵素的に切り取り連
結してなる組換え体プラスミドにより達成せられる。
本発明では枯草菌の菌体外酵素の１つであるセルラー
ゼの遺伝子のもつ分泌生産能力を利用して、異種蛋白質
に分泌機能を与え、大腸菌菌体内での生産異種蛋白質の
蓄積を解消し、ペリプラズム空間あるいは培地中にそれ
を放出させることを骨子とする。即ち、枯草菌IFO 303
4株の菌体外セルラーゼ遺伝子のプロモーター及びシグ
ナル配列とその下流に有用蛋白質をコードするための異
種生物由来の構造遺伝子とを接続したキメラ遺伝子を作
成し、これを大腸菌用ベクタープラスミドのクローニン
グサイトに組み入れ分泌ベクターとし、このように構築
された組換え体プラスミドを大腸菌に導入して形質転換
体を得るものである。さらに枯草菌用ベクタープラスミ
ドに上記の分泌ベクターのプロモーター、シグナル配列
および構造遺伝子部分から該プラスミドに含まれるレプ
リコン部までを連結して、新規な組換え体プラスミドを
作成し、これを枯草菌に組み入れ形質転換体をうること
により、枯草菌での異種蛋白質の効率的な生産が可能と
なり、特に枯草菌のプロテアーゼ欠損株B.subtilisN−2
4（Akira Nakamura:Eur.J.Biochem.169,137（1987））
に上記組換え体プラスミドを導入した形質転換体とする
ことにより、菌体外での異種蛋白質の分解を有効に防止
し、又こういった組換え体プラスミドを枯草菌のみなら
ず大腸菌に組み入れ利用することを意図するものであ
る。
ゼの遺伝子のもつ分泌生産能力を利用して、異種蛋白質
に分泌機能を与え、大腸菌菌体内での生産異種蛋白質の
蓄積を解消し、ペリプラズム空間あるいは培地中にそれ
を放出させることを骨子とする。即ち、枯草菌IFO 303
4株の菌体外セルラーゼ遺伝子のプロモーター及びシグ
ナル配列とその下流に有用蛋白質をコードするための異
種生物由来の構造遺伝子とを接続したキメラ遺伝子を作
成し、これを大腸菌用ベクタープラスミドのクローニン
グサイトに組み入れ分泌ベクターとし、このように構築
された組換え体プラスミドを大腸菌に導入して形質転換
体を得るものである。さらに枯草菌用ベクタープラスミ
ドに上記の分泌ベクターのプロモーター、シグナル配列
および構造遺伝子部分から該プラスミドに含まれるレプ
リコン部までを連結して、新規な組換え体プラスミドを
作成し、これを枯草菌に組み入れ形質転換体をうること
により、枯草菌での異種蛋白質の効率的な生産が可能と
なり、特に枯草菌のプロテアーゼ欠損株B.subtilisN−2
4（Akira Nakamura:Eur.J.Biochem.169,137（1987））
に上記組換え体プラスミドを導入した形質転換体とする
ことにより、菌体外での異種蛋白質の分解を有効に防止
し、又こういった組換え体プラスミドを枯草菌のみなら
ず大腸菌に組み入れ利用することを意図するものであ
る。
以下本発明を有用蛋白質をコードするための異種生物
由来の構造遺伝子として大腸菌のペニシリン分解酵素β
−ラクタマーゼを例にとり説明する。本発明で利用する
枯草菌セルラーゼは菌の成育期に構成的に生産される。
また36個のアミノ酸がシグナルペプチドとして機能し、
菌体膜透過時に切断され成熟蛋白質として菌体外に分泌
せられる。本発明では枯草菌IFO 3034株の菌体外セル
ラーゼ遺伝子のプロモーターとシグナル配列をラクタマ
ーゼ遺伝子の成熟体アミノ末端側に接続し、このキメラ
遺伝子を大腸菌用ベクタープラスミドに組み入れ、組換
え体プラスミド（pBTD1）となし、大腸菌に導入してラ
クタマーゼを生産せしめ、また上記の組換え体プラスミ
ドの前記キメラ遺伝子部分からレプリコン部分までを枯
草菌用ベクタープラスミドに組み入れ、組換え体プラス
ミド（pCesec2）となし、これを枯草菌あるいは大腸菌
に導入してラクタマーゼを生産せしめた。
由来の構造遺伝子として大腸菌のペニシリン分解酵素β
−ラクタマーゼを例にとり説明する。本発明で利用する
枯草菌セルラーゼは菌の成育期に構成的に生産される。
また36個のアミノ酸がシグナルペプチドとして機能し、
菌体膜透過時に切断され成熟蛋白質として菌体外に分泌
せられる。本発明では枯草菌IFO 3034株の菌体外セル
ラーゼ遺伝子のプロモーターとシグナル配列をラクタマ
ーゼ遺伝子の成熟体アミノ末端側に接続し、このキメラ
遺伝子を大腸菌用ベクタープラスミドに組み入れ、組換
え体プラスミド（pBTD1）となし、大腸菌に導入してラ
クタマーゼを生産せしめ、また上記の組換え体プラスミ
ドの前記キメラ遺伝子部分からレプリコン部分までを枯
草菌用ベクタープラスミドに組み入れ、組換え体プラス
ミド（pCesec2）となし、これを枯草菌あるいは大腸菌
に導入してラクタマーゼを生産せしめた。
以下実施例により本発明をより詳細かつ具体的に説明
する。
する。
実施例1:プラスミドpBTD1の構築 大腸菌用ベクタープラスミドpBR322を改変したプラス
ミドpTG2（Kadonaga J.T.;J.Biol.Chem.259,2149〜2154
（1984）１μｇと、制限酵素BstE II（ニューイングラ
ンドバイオラブス162）10単位を30μのBstE II緩衝液
（10mM Tris HCl（pH8.0）10mM MgCl2 150mM NaCl）に
いれ37℃で１時間反応させた。そこに2.5mM NTP（トリ
フォスエート混合物、シグマ社（製））を３μ加えポ
リメラーゼＩラージフラグメント（宝酒造2140A）4.5単
位で37℃にて30分間反応させ５′突出末端を修復して平
滑末端とした。アガロース電気泳動法により4366bpのDN
A断片（断片ａ）を回収した。この断片ａと制限酵素Bam
H I（東洋紡BAH−105）15単位と20μのBamH I緩衝液
（10mM Tris HCl（pH7.5）7mM MgCl2 150mM KCl）とを
混合し37℃にて１時間消化反応を行った。アガロース電
気泳動法により約3.7KbのDNA断片（断片Ａ）を回収し
た。
ミドpTG2（Kadonaga J.T.;J.Biol.Chem.259,2149〜2154
（1984）１μｇと、制限酵素BstE II（ニューイングラ
ンドバイオラブス162）10単位を30μのBstE II緩衝液
（10mM Tris HCl（pH8.0）10mM MgCl2 150mM NaCl）に
いれ37℃で１時間反応させた。そこに2.5mM NTP（トリ
フォスエート混合物、シグマ社（製））を３μ加えポ
リメラーゼＩラージフラグメント（宝酒造2140A）4.5単
位で37℃にて30分間反応させ５′突出末端を修復して平
滑末端とした。アガロース電気泳動法により4366bpのDN
A断片（断片ａ）を回収した。この断片ａと制限酵素Bam
H I（東洋紡BAH−105）15単位と20μのBamH I緩衝液
（10mM Tris HCl（pH7.5）7mM MgCl2 150mM KCl）とを
混合し37℃にて１時間消化反応を行った。アガロース電
気泳動法により約3.7KbのDNA断片（断片Ａ）を回収し
た。
枯草菌IFO 3034株の菌体外セルラーゼ遺伝子を含む
プラスミドpBC501（Eur.J.Biochem.164,317−320（198
7））２μｇを20μｌのEcoR I緩衝液に溶解し、制限酵
素HinP1 I（ニューイングランドバイオラブス＃124）10
単位とEcoR I（東洋紡ECO−103）10単位によって37℃に
て１時間消化反応を行った。その産物をアガロースゲル
電気泳動にかけ、該セルラーゼ遺伝子のプロモーターと
シグナル配列領域を含む713bpのDNA断片を回収した。こ
の断片をプラスミドpBR322のEcoR I,Cla I制限部位の中
にサブクローニングしてプラスミドpBRSig01を構築し
た。pBRSig01 １μｇを制限酵素Dde I（ニューイング
ランドバイオラブス175）６単位でDde I緩衝液20μｌ中
で消化した後、最終濃度0.25mMになるようNTPを加えポ
リメラーゼＩラージフラグメント（宝酒造2140A）4.5単
位で37℃にて30分間反応させ５′突出末端を修復して平
滑末端とした。アガロース電気泳動法で約600bpの断片
（断片ｂ）を回収した。この断片ｂと制限酵素EcoR I
（東洋紡Eco−103）10単位と20μのEcoR I緩衝液（10
0mM Tris HCl（pH7.5）7mM MgCl2 60mM NaCl）とを混合
し37℃にて１時間消化反応を行った。アガロース電気泳
動法により563bpのDNA断片（断片Ｂ）を回収した。
プラスミドpBC501（Eur.J.Biochem.164,317−320（198
7））２μｇを20μｌのEcoR I緩衝液に溶解し、制限酵
素HinP1 I（ニューイングランドバイオラブス＃124）10
単位とEcoR I（東洋紡ECO−103）10単位によって37℃に
て１時間消化反応を行った。その産物をアガロースゲル
電気泳動にかけ、該セルラーゼ遺伝子のプロモーターと
シグナル配列領域を含む713bpのDNA断片を回収した。こ
の断片をプラスミドpBR322のEcoR I,Cla I制限部位の中
にサブクローニングしてプラスミドpBRSig01を構築し
た。pBRSig01 １μｇを制限酵素Dde I（ニューイング
ランドバイオラブス175）６単位でDde I緩衝液20μｌ中
で消化した後、最終濃度0.25mMになるようNTPを加えポ
リメラーゼＩラージフラグメント（宝酒造2140A）4.5単
位で37℃にて30分間反応させ５′突出末端を修復して平
滑末端とした。アガロース電気泳動法で約600bpの断片
（断片ｂ）を回収した。この断片ｂと制限酵素EcoR I
（東洋紡Eco−103）10単位と20μのEcoR I緩衝液（10
0mM Tris HCl（pH7.5）7mM MgCl2 60mM NaCl）とを混合
し37℃にて１時間消化反応を行った。アガロース電気泳
動法により563bpのDNA断片（断片Ｂ）を回収した。
プラスミドpBR322を制限酵素EcoR I 10単位、BamH I
15単位でEcoR I緩衝液（100mM Tris HCl（pH7.5）7mM
MgCl2 60mM NaCl）20μ中で37℃にて１時間消化反応
を行った。アガロース電気泳動法により377bpのDNA断片
（断片Ｃ）を回収した。
15単位でEcoR I緩衝液（100mM Tris HCl（pH7.5）7mM
MgCl2 60mM NaCl）20μ中で37℃にて１時間消化反応
を行った。アガロース電気泳動法により377bpのDNA断片
（断片Ｃ）を回収した。
３つの断片A,B,CをT4リガーゼ（宝酒造 2011B）350
単位でリガーゼ緩衝液（66mM Tris−HCl（pH7.6）6.6mM
MgCl210mM DTT 66mM ATP）30μ中で10時間４℃で反
応させた。結合したDNAを用いて大腸菌RR Iをカルシウ
ム法（Norgard,M.V.Gene ３,279（1978））で形質転換
しテトラサイクリン含有寒天培地（７μg/ml）で選抜し
成育したコロニーをアンピシリン含有寒天培地（50μg/
ml）で二段階選抜を行い両耐性株より約4.5Kbのプラス
ミドpBTD1を得た。
単位でリガーゼ緩衝液（66mM Tris−HCl（pH7.6）6.6mM
MgCl210mM DTT 66mM ATP）30μ中で10時間４℃で反
応させた。結合したDNAを用いて大腸菌RR Iをカルシウ
ム法（Norgard,M.V.Gene ３,279（1978））で形質転換
しテトラサイクリン含有寒天培地（７μg/ml）で選抜し
成育したコロニーをアンピシリン含有寒天培地（50μg/
ml）で二段階選抜を行い両耐性株より約4.5Kbのプラス
ミドpBTD1を得た。
実施例2:プラスミドpCesec2の構築 プラスミドpBTD1 １μｇを制限酵素EcoR I（東洋紡E
co−103）10単位、Pvu II（ベーリンガーマンハイム64
3,703）９単位でEcoR I緩衝液（100mM Tris−HCl（pH7.
5）7mM MgCl2 60mM NaCl）20μ中で37℃１時間消化
し、アガロース電気泳動法により約2.0KbのDNA断片（断
片α）を回収する。
co−103）10単位、Pvu II（ベーリンガーマンハイム64
3,703）９単位でEcoR I緩衝液（100mM Tris−HCl（pH7.
5）7mM MgCl2 60mM NaCl）20μ中で37℃１時間消化
し、アガロース電気泳動法により約2.0KbのDNA断片（断
片α）を回収する。
次にプラスミドPUB110（Gryczan T.J.Proc.Natl.Aca
d.Sci.74 5463（1979））１μｇを制限酵素EcoR I（東
洋紡Eco−103）10単位、Pvu II（ベーリンガーマンハイ
ム643,703）９単位でEcoR I緩衝液（100mM Tris−HCl
（pH7.5）7mM MgCl2 60mM NaCl）20μ中で37℃１時間
消化し、アガロース電気泳動法により約3.5KbのDNA断片
（断片β）を回収する。DNA断片αと断片βをT4リガー
ゼ（宝酒造2011B）350単位でリガーゼ緩衝液（66mM Tri
s−HCl（pH7.6）6.6mM MgCl210mM DTT 66mMATP）30μ
中で10時間４℃で反応させた。結合したDNAを用いて大
腸菌RR Iをカルシウム法（Norgard,M.V.Gene 3,279（19
78））で形質転換しアンピシリン含有寒天培地（50μg/
ml）で選択してアンピシリン性株を得た。この形質転換
体から約6.6KbのプラスミドpCesec2を得た。
d.Sci.74 5463（1979））１μｇを制限酵素EcoR I（東
洋紡Eco−103）10単位、Pvu II（ベーリンガーマンハイ
ム643,703）９単位でEcoR I緩衝液（100mM Tris−HCl
（pH7.5）7mM MgCl2 60mM NaCl）20μ中で37℃１時間
消化し、アガロース電気泳動法により約3.5KbのDNA断片
（断片β）を回収する。DNA断片αと断片βをT4リガー
ゼ（宝酒造2011B）350単位でリガーゼ緩衝液（66mM Tri
s−HCl（pH7.6）6.6mM MgCl210mM DTT 66mMATP）30μ
中で10時間４℃で反応させた。結合したDNAを用いて大
腸菌RR Iをカルシウム法（Norgard,M.V.Gene 3,279（19
78））で形質転換しアンピシリン含有寒天培地（50μg/
ml）で選択してアンピシリン性株を得た。この形質転換
体から約6.6KbのプラスミドpCesec2を得た。
実施例3:プラスミドpCesec2を用いた枯草菌B.subtilit
RM141およびB.subtilis Ｎ−24の形質転換および組
換え株の取得 枯草菌B.subtilis RA141株をＬ−ブロス（バクトト
リプトン10g、バクトリーストエクストラクト5g、NaCl5
g、グルコース1g、水１）3mlで、試験管内で一夜37℃
で振盪培養し、次にこの培養液を5mlのアンチバイオチ
ックメディウム３（バクトビーフエキストラクト 1.
5、バクトイーストエキストラクト，バクトトリプトン5
g、バクトデキストロース1g、NaCl3.5g、NaHPO4 3.68
g、KHPO4 1.32g、水１）に対して100μ接種し37℃
で４時間振盪培養した。その後氷水中で５分間静置し遠
心分離（7000rpm、5min.）で集菌し培養上清除去後500
μのSMMP（シュークロス0.5M、マレイン酸0.02M、MgC
l2 0.02M、pH6.5を２倍濃度のアンチバイオチイクメデ
ィウムに溶解したもの）に加え、37℃で90分間反応さ
せ、遠心分離（7000rpm、5min.）でプロトプラスト化し
た菌を集め、SMMPに懸濁、洗浄後、再度遠心分離し、得
られた菌体に500μのSMMPを加えプロトプラスト懸濁
液を作った。プラスミドpCesc2 0.5μｇをSMM30μに
溶解したDNA溶液はプロトプラスト懸濁液に加えた後、
すぐに40％ポリエチレングリコール6000SMM液（0.5Mシ
ュークロス 0.02Mマレイン酸、0.02M MgCl2、pH6.5）1.
5mlを添加し室温で２分間静置した。5mlのSMMPをさらに
加え、遠心分離し、集菌物をSMMP1mlに懸濁後ゆっくり
と90分間振到培養した。最後にDM3寒天倍地（0.8％寒
天、0.5％カザミノ酸、0.5％バクトイーストエキストラ
クト、0.35％K2HPO4、0.15％KH2PO4、0.5％グルコー
ス、0.02M MgCl2、0.01％ボバインセーラムアルブミ
ン、0.5Mコハク酸ナトリウム、300μg/mlカナマイシ
ン）に200μのプロトプラスト懸濁液を塗り付け広げ
２日間37℃で成育させコロニー形成を見る。このコロニ
ーをアンピシリン含有寒天培地に移したところアンピシ
リン耐性株が得られた。
RM141およびB.subtilis Ｎ−24の形質転換および組
換え株の取得 枯草菌B.subtilis RA141株をＬ−ブロス（バクトト
リプトン10g、バクトリーストエクストラクト5g、NaCl5
g、グルコース1g、水１）3mlで、試験管内で一夜37℃
で振盪培養し、次にこの培養液を5mlのアンチバイオチ
ックメディウム３（バクトビーフエキストラクト 1.
5、バクトイーストエキストラクト，バクトトリプトン5
g、バクトデキストロース1g、NaCl3.5g、NaHPO4 3.68
g、KHPO4 1.32g、水１）に対して100μ接種し37℃
で４時間振盪培養した。その後氷水中で５分間静置し遠
心分離（7000rpm、5min.）で集菌し培養上清除去後500
μのSMMP（シュークロス0.5M、マレイン酸0.02M、MgC
l2 0.02M、pH6.5を２倍濃度のアンチバイオチイクメデ
ィウムに溶解したもの）に加え、37℃で90分間反応さ
せ、遠心分離（7000rpm、5min.）でプロトプラスト化し
た菌を集め、SMMPに懸濁、洗浄後、再度遠心分離し、得
られた菌体に500μのSMMPを加えプロトプラスト懸濁
液を作った。プラスミドpCesc2 0.5μｇをSMM30μに
溶解したDNA溶液はプロトプラスト懸濁液に加えた後、
すぐに40％ポリエチレングリコール6000SMM液（0.5Mシ
ュークロス 0.02Mマレイン酸、0.02M MgCl2、pH6.5）1.
5mlを添加し室温で２分間静置した。5mlのSMMPをさらに
加え、遠心分離し、集菌物をSMMP1mlに懸濁後ゆっくり
と90分間振到培養した。最後にDM3寒天倍地（0.8％寒
天、0.5％カザミノ酸、0.5％バクトイーストエキストラ
クト、0.35％K2HPO4、0.15％KH2PO4、0.5％グルコー
ス、0.02M MgCl2、0.01％ボバインセーラムアルブミ
ン、0.5Mコハク酸ナトリウム、300μg/mlカナマイシ
ン）に200μのプロトプラスト懸濁液を塗り付け広げ
２日間37℃で成育させコロニー形成を見る。このコロニ
ーをアンピシリン含有寒天培地に移したところアンピシ
リン耐性株が得られた。
実施例4:細胞分画とβ−ラクタマーゼ活性の測定 大腸菌RR I（pBTD1）、枯草菌RM141（pCesec2）、枯
草菌Ｎ−24（pCesec2）の分泌を確認するために培養の
時間経過によるβ−ラクタマーゼ活性の所在について調
べた。また比較のために大腸菌RR1（pTG2）についても
同様の実験を行った。
草菌Ｎ−24（pCesec2）の分泌を確認するために培養の
時間経過によるβ−ラクタマーゼ活性の所在について調
べた。また比較のために大腸菌RR1（pTG2）についても
同様の実験を行った。
Ｌ−ブロス（アンピシリン50μg/ml）3mlでRR1（pTG
2）、RR1（pBTD1）、RM141（pCesec2）、Ｎ−24（pCese
c2）をそれぞれ７℃で10時間成育させ、夫々2XYT（バク
トトリプトン16g,バクトイーストエキストラクト10g、N
aCl5g、水１）50mlに37℃で１％接種した後、１時間
毎に吸光゜（650nm）を測定しながら３時間、６時間後
に10mlずつ分取し、大腸菌の場合は細胞内、ペリプラズ
マ画分、培養上清の３画分、枯草菌の場合は培養上清と
細胞内の２画分についてラクタマーゼ活性を測定した。
2）、RR1（pBTD1）、RM141（pCesec2）、Ｎ−24（pCese
c2）をそれぞれ７℃で10時間成育させ、夫々2XYT（バク
トトリプトン16g,バクトイーストエキストラクト10g、N
aCl5g、水１）50mlに37℃で１％接種した後、１時間
毎に吸光゜（650nm）を測定しながら３時間、６時間後
に10mlずつ分取し、大腸菌の場合は細胞内、ペリプラズ
マ画分、培養上清の３画分、枯草菌の場合は培養上清と
細胞内の２画分についてラクタマーゼ活性を測定した。
細胞分画は10mlの培養液を遠心分離（15000rpm、５分
間）で集菌して上清は保存し、菌体を洗浄後（0.85％Na
Cl、10ml Tris−HCl、pH8.0）で２度洗浄し、高張緩衝
液（20％シュークロース、30mM Tris−HCl、pH8.0）に
懸濁する。0.25M EDTAを400μ添加し10分間室温で静
置した後、遠心分離で集菌し、氷水中で冷却した蒸留水
を振とうしながら急激に加え外膜を破壊する。遠心分離
（15000rpm、５分間）で不溶画分を分離し上清をペリプ
ラズムとする。
間）で集菌して上清は保存し、菌体を洗浄後（0.85％Na
Cl、10ml Tris−HCl、pH8.0）で２度洗浄し、高張緩衝
液（20％シュークロース、30mM Tris−HCl、pH8.0）に
懸濁する。0.25M EDTAを400μ添加し10分間室温で静
置した後、遠心分離で集菌し、氷水中で冷却した蒸留水
を振とうしながら急激に加え外膜を破壊する。遠心分離
（15000rpm、５分間）で不溶画分を分離し上清をペリプ
ラズムとする。
不溶画分に10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）を加えて
懸濁後、超音波処理し内膜も破壊して遠心分離（15000r
pm、５分間）で不溶物を沈殿させ上清を保存し細胞質画
分とした。枯草菌RM141（pCesec2）、Ｎ−24（pCesec
2）では遠心分離（15000rpm、５分間）で培養液から上
清を分離し10mM Tris−HCl緩衝液中で懸濁後、超音波処
理を行い、細胞質画分とした。
懸濁後、超音波処理し内膜も破壊して遠心分離（15000r
pm、５分間）で不溶物を沈殿させ上清を保存し細胞質画
分とした。枯草菌RM141（pCesec2）、Ｎ−24（pCesec
2）では遠心分離（15000rpm、５分間）で培養液から上
清を分離し10mM Tris−HCl緩衝液中で懸濁後、超音波処
理を行い、細胞質画分とした。
活性測定は基質溶液（アンピシリン14mg/ml、0.1M
リン酸緩衝液、pH7.0）5mlを30℃５分間加温後、1mlの
酵素液（培養上清10倍希釈液、ペリプラズム画分50倍希
釈液、細胞質画分50倍希釈液）を加え、30分間反応させ
た。ヨウ素溶液（100g KI、20.3g I2/）2M酢酸緩衝
液PH4.加えて反応を停止後、澱粉溶液（２％コーンスタ
ーチ）500μを加えて青色に発色させた。ハイポ液
（3.97gチオ硫酸ナトリウム、100mg炭酸ナトリウム、水
１）で青色が消失するまで滴定しハイポ液量より分解
したアンピシリン量を算出した。ただしヨウ素を加えた
後に酵素を添加したものを対照として用いた。
リン酸緩衝液、pH7.0）5mlを30℃５分間加温後、1mlの
酵素液（培養上清10倍希釈液、ペリプラズム画分50倍希
釈液、細胞質画分50倍希釈液）を加え、30分間反応させ
た。ヨウ素溶液（100g KI、20.3g I2/）2M酢酸緩衝
液PH4.加えて反応を停止後、澱粉溶液（２％コーンスタ
ーチ）500μを加えて青色に発色させた。ハイポ液
（3.97gチオ硫酸ナトリウム、100mg炭酸ナトリウム、水
１）で青色が消失するまで滴定しハイポ液量より分解
したアンピシリン量を算出した。ただしヨウ素を加えた
後に酵素を添加したものを対照として用いた。
画酵素の原液中の酵素活性は次の式で示される。
［（対照滴定量ml）−（反応滴定量ml）］×8/F×1/T×Ｄ 式中Ｆはヨウ素消費当量（アンピシリンの場合 Ｆ＝
４）;Tは反応時間;Dは反応液に加えた酵素液の希釈率 第１表に画分中の酵素活性を培養液1mlに換算した値
を示す。
４）;Tは反応時間;Dは反応液に加えた酵素液の希釈率 第１表に画分中の酵素活性を培養液1mlに換算した値
を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (6)
- 【請求項１】大腸菌用ベクタープラスミドのクローニン
グサイトに、枯草菌IFO 3034株の菌体外セルラーゼ遺
伝子のプロモーター及びシグナル配列と、その下流に有
用蛋白質をコードするための異種生物由来の構造遺伝子
とを組み入れてなる組換え体プラスミド。 - 【請求項２】Escherichia coli種に属し請求項第１項記
載の組換え体プラスミドを含む、遺伝子産物をペリプラ
ズムに蓄積可能な微生物。 - 【請求項３】Bacillus subtilisおよびその近縁種から
選ばれるBacillus菌のベクタープラスミドのクローニン
グサイトに、請求項第１項記載の組換え体プラスミドの
プロモーター、シグナル配列および構造遺伝子部分から
該プラスミドに含まれるレプリコン部までを酵素的に切
り取り連結してなる組換え体プラスミド。 - 【請求項４】Escherichia coli種に属し請求項第３項記
載の組換え体プラスミドを含む、遺伝子産物をペリプラ
ズムに蓄積又は菌体外への分泌可能な微生物。 - 【請求項５】Bacillus種に属し請求項第３項記載の組換
え体プラスミドを含む、遺伝子産物を菌体外に分泌する
ことが可能な微生物。 - 【請求項６】Bacillus種に属する微生物が枯草菌Ｎ−24
である請求項第５項記載の微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22228889A JP2745152B2 (ja) | 1989-08-29 | 1989-08-29 | 組換え体プラスミドならびに該プラスミドを含む微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22228889A JP2745152B2 (ja) | 1989-08-29 | 1989-08-29 | 組換え体プラスミドならびに該プラスミドを含む微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0383590A JPH0383590A (ja) | 1991-04-09 |
| JP2745152B2 true JP2745152B2 (ja) | 1998-04-28 |
Family
ID=16780020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22228889A Expired - Lifetime JP2745152B2 (ja) | 1989-08-29 | 1989-08-29 | 組換え体プラスミドならびに該プラスミドを含む微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2745152B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0771495B2 (ja) * | 1991-04-16 | 1995-08-02 | 工業技術院長 | 大腸菌による蛋白分泌生産の方法 |
-
1989
- 1989-08-29 JP JP22228889A patent/JP2745152B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0383590A (ja) | 1991-04-09 |
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