JPH03500845A - 脂質分解性酵素をコードする遺伝子の分子クローニング及び発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （５）前記原核細胞がバチルス、大腸菌又はシュードモナス細胞である請求の範 囲（４）記載の形質転換宿主細胞。 （６）前記ＤＮＡ配列がｐＴＭＰｖ１ｇＡ中のリパーゼコード化遺伝子と少なく とも６７％のヌクレオチド配列相同性を有する少なくとも３ｏｏｂｐの配列を含 む請求の範囲（１）記載の形質転換宿主細胞。 （７）前記ＤＮＡ配列がｐＥＴ３中のリパーゼコード化遺伝子と少なくとも６７ ％のヌクレオチド配列相同性を有する少なくとも３００ｂｐの断片を含む請求の 範囲（１）記載の形質転換宿主細胞。 （８）前記ＤＮＡ配列が微生物細胞に由来する請求の範囲（６）又は（７）記載 の形質転換宿主細胞。 （９）前記ＤＮＡ配列がシュードモナス又はアシネトバクタ一種に由来する請求 の範囲（８）記載の形質転換宿主細胞。 （１０）前記ＤＮＡ配列がＰ、スツゼリ、Ｐ、アルカリゲンス、Ｐ。 シュードモナスアルカリゲンス、Ｐ、アルギノサ又はＡ、カルコアセチカスに由 来する請求の範囲（９）に由来する形質転換宿主細胞。 （１１）前記ＤＮＡ配列がＰ、スツゼリＴｈａｉｒＶ１７　１株（ＣＢＳ４６１ ．８５）、ＰＧ−１−３株（ＣＢＳ　１３７．８９）　、　ＰＧ−１−４株（Ｃ ＢＳ１３８．８９）、ＰＣ−Ｉｔ−１１，１株（ＣＢＳｌ、　３９．８９　）又 はＰＧ−Ｉｔ−１１，２株（ＣＢＳ　１４０．８９）　。 Ｐ、７７Ｌ／ギノサＰＡＯ（ＡＴＣＣ１５６９２）、Ｐ、アルカリゲンスＤＳＭ ５０３４２．Ｐ、　シュードアル力リゲンスｌＮ１１−５　（ＣＢＳ４６８．８ ５）、Ｐ、シュードアル力リゲンスＭ−１’（ＣＢＳ４６８．８５）又はＡ、カ ルコアセチカスＧｒＶ−３９（ＣＢＳ　４６０．８５）に由来する請求の範囲（ ｌＯ）記載の形質転換宿主細胞。 （１２）　Ｔ　Ｌ　Ｕ測定条件下、ｐＨ一定で測定して、８〜１０．５の至適ｐ Ｈを有し、かつ温度約６０℃以下及びｐ）１７〜１１という洗浄条件下、１０ｇ ／ｌまでの濃度で洗剤を含む水溶液中でリパーゼ活性を示すことを特徴とする実 質的に純粋な脂質分解性酵素で、転写の５’−３’方向に、宿主細胞中で機能す る転写調節領域及び翻訳開始領域、前記脂質分解性酵素をコードするＤＮＡ配列 、及び宿主細胞中で機能する翻訳及び転写終止領域を含み、該ＤＮＡ配列の発現 が該転写及び翻訳調節領域の制御下にある発現カセソ゛トを含む形質転換微生物 宿主から得られる酵素。 （１３）前記酵素が１０４〜１０’　ＴＬＵ／ｇの比活性を存する請求の範囲（ １２）記載の脂質分解性酵素。 （１４）請求の範囲（１）乃至（１４）記載の形質転換微生物宿主により生産さ れる請求の範囲（１２）記載の脂質分解性酵素。 （１５）　Ｔ　Ｌ　Ｕ測定条件下ｐｎ一定での測定で８〜１０．５の至適ｐｌ＋ 範囲を有し、かつ温度約６０℃以下でかつｐＨ７〜１１の洗浄条件下、１０ｇ／ ｊｌまでの濃度で洗剤を含む水溶液中でリパーゼ活性を示す脂質分解性酵素を調 製する方法で、（イ）栄養培地中、転写の５　’−３’の方向に宿主細胞中で機 能する転写調節領域及び翻訳開始領域、前記脂質分解性酵素をコードするＤＮＡ 配列及び宿主細胞中で機能する翻訳及び転写終止領域を含み、該ＤＮＡ配列が該 転写及び翻訳調節領域制御下にある発現力セントを含む宿主細胞を増殖する、（ ［１）前記脂質分解性酵素を単離する以上のステップを含む方法。 （１６）脂質分解性酵素を生産する方法で、（イ）栄養培地中、請求の範囲（１ ）乃至（］１）記載の形質転換微生物宿主細胞を培養し、リンチブイヨンを作る 、（Ｕ）該培地から該脂質分解性酵素を単離する、以上のステップを含む方法。 （１７）転写の方向に、微生物宿主細胞中で機能する転写調節領域、ＴＬＵ測定 条件下ｐＨ一定で８〜１０．５の至適ｐ）Ｉ範囲を有し、かつ温度約６０℃以下 でかつｐＨ１〜１１の洗浄条件下で１０ｇ／ｌまでの濃度の洗剤を含む水溶液中 でリパーゼ活性を示す脂質分解性酵素をコードするＤＮＡ配列、及び宿主細胞中 で機能する転写終止ＵｆＪ節領域を含むＤＮＡ構築物。 （Ｉ８）請求の範囲（１７）記載のＤＮＡ構築物で、さらに選択マーカー遺伝子 及び分泌リーダー配列のうちの１つを含むＤＮＡ構築物。 （１９）ｐＴＭＰｖ　１８Ａ又はｐＥＴ３上のリパーゼ遺伝子の１つと少なくと も６７％のヌクレオチド配列相同性を有する少なくとも３００ｂρの断片を含む 請求の範囲（１７）又は（１Ｂ）記載のＤＮＡ構築物。 （２０）プラスミドｐＡＴ１、ｐＡＴ３、ｐＥＴｌ、ｐＥＴ３、ＰＡＭＩ、９Ｍ ６−５、ｐＰ５−４、ｐＴＭＰｖ１８Ａ又はｐｓＷ１０３゜（２１）Ｐ、スツゼ リＴｈａｉＩＶ１７−１株（ＣＢＳ　４６１．．８５）　。 ＰＧ−１−３株（ＣＢＳ４３７．８９）、ＰＧ−１−４株（ＣＢＳ１３８．８９ ）、ＰＧ−ｎ−１１，１株（ＣＢＳ　１３９．８９）又はＰＧ−ＩＩ−１１，２ 株（ＣＢＳ　１４０．８９）　、Ｐ、アルギノサＰＡＯ（ＡＴＣＣ１５６９２） 、Ｐ、アルカリゲンスＤＳＭ５０３４２、Ｐ、シュードアル力リゲンスｌＮｎ− ５（ＣＢＳ４６８．８５）、Ｐ、シュードアル力リゲンスＭ−１（ＣＢＳ４７３ ．８５）又はＡ、力Ｊｌ／］アセチカスＧｒ　Ｖ−３９（ＣＢＳ４６０．８５） 由来の脂質分解性酵素のアミノ酸配列をコードする配列とハイブリダイズし得る ヌクレオチドから選ばれた連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含むオリ ゴヌクレオチド単離物。 （２２）前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求の範囲（２１）記載のオリ ゴヌクレオチド。 （２３）前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである請求の範囲（２１）記載のオリ ゴヌクレオチド。 （２４）前記オリゴヌクレオチドが放射性ラベルを含む請求の範囲（２１）記載 のオリゴヌクレオチド。 （２５）前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを 含む請求の範囲（２１）記載のオリゴヌクレオチド。 脂質分解性酵素をコードする遺伝子の 分子クローニング及び発現 明細書 序文 （技術分野ン 本発明は組換えＤＮＡ技術による脂肪の酵素的分解に用いる酵素、特に洗剤添加 物として使用するのに適する特性を有する脂質分解性酵素の調製に関する。 （背　景） クリーニングに関する１つの問題は脂肪性のシミの除去にある。 現在、脂肪を含む汚れは高温と高アルカリの組合せによりエマルジヨン化され除 去されている。しかし、最近は特に脂肪性シミの除去には適さない比較的低温、 すなわち約４０を以下での洗浄が主流となっている。それゆえより低い洗浄温度 で効果的であり、高アルカリ洗剤溶液中で安定であり、かつ固体及び液体洗剤組 成物中の保存条件下で安定な洗剤添加物に対する需要がある。トリグリセ、リド を加水分解する一群の酵素はリパーゼ（ε、Ｃ，３，１，１，３，）である、リ パーゼは真核細胞の他多種の原核生物中にあって広く分布している。その酵素の 起源に応じて基質特異性の他に種々の条件下での安定性を含む特性も様々である 。リパーゼはこれまでに洗剤組成物中で使用されてきたが、ここで用いられてい るものは洗濯条件下で低い洗浄効果しか示さず、さらに洗剤に適した安定性を満 していない、　゛ 現代の洗濯条件下でリパーゼ活性を示し得る脂質分解性酵素、すなわち高洗剤濃 度、高ｐＨ及び低洗浄温度の条件で有効なものはシュードモナス・シェードアル カリゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏ−ａｌｃａＬｉｇｅｎｅｓ ）＋　シュードモナス”スタゼリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒυ 及びアシネトバクタ−・カフＬｚ：１７−！’チヵス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ ｅｒ　ｃａｌｃｏ−ａｔｉｃｕｓ）種に属する特定の株（ヨーロンバ特許出願Ｅ Ｐ−Ａ−０２１８２７２参照）から生産される。しかしこれらの微生物種は潜在 的に植物及び動物に対して病因性を有し、かつこれらの微生物を用いたリパーゼ 生産プロセスに有効な発酵条件に関してはほとんどデータがない。 それゆえ洗剤添加物に対して望ましい特性を有する脂質分解酵素を生産する上で 有効でかつ安全な方法の開発が望まれる。さらに、その酵素を発酵混合物の細胞 外液から直接回収し得るようその宿主生物から分泌されることが望ましい。 （関連文献） シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｐａｏｎａｓ）種によって生産されるリパーゼに 関してはその培養条件がそれらの酵素の最終的存在位置に強く影響することが知 られている（スギウラ（Ｓｕｇｉｕｒａ）　＊“リパーゼ”Ｂ、ポーゲストロム （Ｂｏｒｇｓ　ｔｒｏｍ）及びＨ，Ｌ、ブロックマン（Ｂｒｏｃｋｗａｎ）！（ １９８４）５０５〜５２３、エルスバイア版、アムステルダム）、シばしば形成 するタンパク質の折りたたみ方の誤りや、タンパク質の分解、タンパク質の不適 正な存在位置を含む、微生物において異質遺伝子を効果的に発現する上での問題 につき当る。 ハリス０１ａｒｒｉｓ）“遺伝子工学”、第４巻（１９８３）アカデミツクブレ ス版、ニューヨーク参照、大腸菌における分泌クローニングベクターの使用は一 般に細胞周辺校への異質遺伝子産物の輸送を可能にし、またその生産物は時たま 培養培地中に見られる。ラン（Ｌｕｎｎ）等、“微生物学及び免疫学における最 新のトピックス”１２５　（１９８６）５９−７４参照、宿主細胞として大腸菌 を用いた場合のボッＣＧｏｔｚ＞等（ヌクレイフクアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌ ｅｉｃＡｃｒｄｓ　Ｒｅｓ＋）上３　（１９８５）５８９５−５９０６、クギミ ャ（Ｘｕｇｉｇｉｙａ）等（バイオケム・バイオフィズ・リサーチ・コミュニケ ーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、）　１ ４１　（１９８６）１．８５−　］、　９０　）及びオデラ（Ｏｄｅｒａ）等（ ジャーナル・オブ・）゛１アーメンタル・テクノロジー（Ｊ、　Ｆｅｒ＋＋＋ｅ ｎｔａ１．　Ｔｅｃｈｎｏｌ、）　６４（１９８６）３６３−３７１）により報 告されているクローン化した微生物リパーゼは培養培地中にほとんど分泌されな い。 ウォルファース（Ｗｏｈｌｆａｒｔｈ）及びウィンクラ−（Ｗｉｎｋｌｅｒ）　 （ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ。 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）上主土（１９８８）４３３−４４０）はシュードモナス アルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　Ｐ　Ａ　Ｏ２ ３０２株由来の新しく単離されたリパーゼ欠損変異株の生理学的特性及び相当す る遺伝子の染色体地図及びクローニングに関して報告している。 バチルス種、特にバチルス・サチルス株は外来及び内在遺伝子の発現及びコード されているクンバク質産物の分泌に関して宿主株として用いられ種々の成功をお さめている。レヴユーについては例えばサーバス（Ｓａｒｖａｓ）、′微生物学 及び免疫学における最近のトピックス”工又工（１９８６）１０３−１２５、Ｈ ，Ｃ，つ（−）及びｐ、ｃ、タイ（Ｔａｉ）　ｋＪＡ、スプリンガー・パーラグ 版及びヒメノ（旧ｍｅｎｏ）等、Ｆ、Ｅ、ｌ’１．Ｓ、マイクロバイオロジカル ・レターズ（Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ）３５　（１９８６）　 １７−２１参照。 米国特許第３，９５０，２７７号及び英国特許明細書番号第１，４４２，４１８ 号は各々活性化因子及びカルシウムイオン及び、又はマグネシウムイオンと合せ てリパーゼ酵素を公開しており、それらを汚れた生地を浸し各々ポリエステル又 はポリエステル／綿混紡の生地からトリグリセリドのシミ及び汚れを除去するの に使用している。公開された存用な微生物リパーゼにはシェードモナス（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ）　＋アスベルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューモ コフカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）　＋スタフィロコフカス（Ｓｔａｐｈｙ ｌｏｃｏｃｃｕｓ）　＋　マイコバクテリウム・スべｌレクロシス（Ｍｙｃｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）＋　マイコトルラリポリティカ （Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ）及びスフレロチニア（Ｓｃｌ ｅｒＯ−ｔｉｎｉａ）由来のものが含まれる。 英国特許明細書番号第１，３７２．０３４号はシュードモナススッゼリ（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒｉ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１９１５４株により生産 される細菌性リパーゼを含む洗剤組成物を公開している。さらにこの特許はこの 好ましい脂質分解性酵素がｐＨ６〜１０の至適ｐＨ値を存し、かつこのｐＨ範囲 、好ましくはｐＨ７〜９で活性を示すことを公開している。（ここでシュードモ ナス・スッゼリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｔ−ｚｅｒｉ）株と推定され ている株はシュードモナスアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇ ｉｎｏｓａ）として再分類されている。）英国特許出願（ＥＰ−Ａ）０１３００ ６４は従来のリパーゼよりも高い脂質分解洗浄効率を有するフザリウム・オキシ スポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍから単離されたリパーゼを含 む酵素性洗剤添加物を公開している。また例えば英国特許明細書番号第１　、２ ９３．、６１３号及びカナダ特許第８３５，３４３号も脂質分解性洗剤添加物を 公開している。 ヨーロッパ特許出＠ＥＰ−Ａ−０２０５２０８及びＥＰ−Ａ−０２０６３９６は 洗剤へのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びクロモベクター（Ｃｈ ｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）由来のリパーゼの使用を公開している。洗剤添加物とし てのリパーゼに関する包括的レヴユーに関してはアンドリー（Ａｎｄｒｅｅ）等 のジャーナル・オブ・アプライド・バイオケミストリー（Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、）　２　（１９８０）　２１　Ｂ−２２９参照せよ。 本発明の概要 洗剤組成物への使用に適した脂質分解性酵素を生産する形質転換微生物細胞を含 む新しい組成物及びそれらの調製法が提供されている。アルカリ性ｐＨで活性を 有し、洗濯条件下で安定な脂質分解性酵素をコードするＤＮＡ配列を含む発現力 セントで宿主微生物細胞をトランスホームする。脂質分解性酵素の調製法には微 生物システムにおけるクローニング及び発現及びＤＮ’Ａホモロジーに基づくス クリーニングが含まれる。 ２つのＤＮＡ配列も提供されてお°す、これらの配列は各々シュードモナスシュ ードアルカリゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｐｅｕｄｏａｌｃａｌｒ−ｇｅ ｎｅｓ）株及びシュードモナスアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ ｇｉｎｏｓａ）株に由来する脂質分解性酵素をコードする遺伝子を含んでいる。 特定のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種由来のリパーゼ遺伝子はリ パーゼ生産に関して特に興味深い。 図の簡単な説明 第１図；脂質分解性酵素遺伝子クローニングの戦略。記号については第２図の脚 注参照。 第２図ζｐＡＴ１の制限地図。プラスミドｐＡＴ１における多くの制限酵素認識 部位がｆＩｉ認されている。 口二二コ　、ｐＵＮ１２１ベクターＤＮＡ［；Ｔｈａｉ　■１７−ｌＤＮＡ挿入 物使用されている記号ニ ーＯｒｆ　Ｅ、　ｃｏｌｊ　；大腸菌の複製オリジンＡ　ｐ　ｒ　；アンピシリ ン耐性をコードするｐＵＮ１２１の遺伝子 −Ｔｃ’；テトラサイタリン耐性をコードするｐＵＮ１２１の遺伝子 −ｃＩ；ｃｌリプレッサーをコードするバクテリオファージラムダの遺伝子 シュードモナススツゼリ（Ｐｓｅｕｄｏ＋ｏｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒｉ）Ｔｈ ａｉ　ＩＶ　１７−１　（ＣＢＳ４６１．８５）の染色体ＤＮＡの５ａｎ３Ａ部 分分解物をｐＵＮ１２１にライゲーションした位置はＢｃｌ　Ｉ　／　Ｓａｎ　 ３　Ａで示されている。脂質分解活性をコードする遺伝子の位置は点線で示しで ある。 第３図ＨｐＡＴ３の制限地回、記号は第２図で使用したものと同様。 第４図；ｐＥＴｌの制限地図、記号は第２図で使用したものと同様。 第５図；ｐＥ７３の制限地図。記号は第２図で使用したものと同様。 第６図ＨｐＡＭ１の制限地図。記号は第２図で使用したものと同様。 第７図；ｐＭＳ−５の制限地図。記号は第２図で使用したものと同様。 第８図；　ｐｐｓ−４の制限地図。記号は第２図で使用したものと同様。アシネ トバクタ−・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅ ｔｉｃｕｓ）ＧＲＶ　−３９（ＣＢ　Ｓ　４６０．８５）の染色体ＤＮＡのＥｃ ｏＲＩ”部分消化物をｐＵＮＩ２１にライゲーションした位置はＥｃｏＲＩ　／ 　ＥｃｏＲＩ　”で示しである。 第９図、５ＤＳ１０−１５％グラジェントファストゲル（ファルマシア社） 第９Ａ図；コマージブリリアントブルー染色後第９Ｂ図：β−ナフチルアセテー ト／フプストブルＢＢ染色後レしン１；９５℃、１０分間ＳＤＳとともに加熱し た、ｐｔＪＮ１２１を宿す大腸菌ＪＭＩＯＩＩｄＳ　ｒｅｃＡ株由来の分解物。 レーン２：９５℃、１０分間ＳＤＳとともに加熱した、ＰＢｒ３を宿す大腸菌Ｊ Ｍ１０１ｈｓｄΣ　ｒｅｃ　Ａ株由来の分解物。 レーン３；９５℃、１０分間ＳＤＳとともに加熱した、Ｐ、スッゼリ（ｓｔｕｔ ｚｅｒｉ）Ｔｈａｉ　ｒＶ　１７　１株由来の培養物上清。 レーン４・：９５℃、５分間ＳＤＳとともに加熱したこと以外はレーン２と同様 のサンプル。 レーン５；９５℃、５分間ＳＤＳとともに加熱したこと以外はレーン３と同様の サンプル。 レーン６；室温１０分間ＳＤＳとともにインキュベー・トしたこと以外はレーン ２と同様のサンプル。 レーン７；室温１０分間ＳＤＳとともにインキュベートしたこと以外はレーン３ と同様のサンプル。 レーン８；ファルマシア社の低分子量タンパク質マーカー。 第１０図；コマ−ジブグリアントプル−染色後の５Ｄ３１３％ポリアクリルアミ ドゲル。 レーン１；精製Ｍ−１リパーゼ。 レーン２；低分子量タンパク質マーカー（ファルマシア社）。 第１１図ｉ　ｐ、ＴＭＰｖｌ　８Ａの制限地図。 口＝＝コ　；ｐＴＺ１８ＲベクターＤＮＡ竪乙７Ｚ久　；Ｍ−Ｉ　ＤＮＡ挿入物 使用した記号ニ ーＯｒｉ　Ｅ、ｃｏｌｉ；ｐＢＲ３２２ベクター由来の大腸菌の複製オリジン ｆｌｏｒｉＨ繊維状バタテリオファージｆ１由来の複製オリジＰＴ’ｒ：インビ トロ転写物を調製するためのバクテリオファージＴ７のプロモーター ＡＰ’　；アンピシリン耐性をコードする遺伝子−Ｌｉｐ；Ｍ−１リパーゼをコ ードする遺伝子第１２図；第１２図はＭ−１リパーゼ遺伝子のヌクレオチド配列 （すなわち最初の９４２ヌクレオチド）及びそれに由来するＭ−１リパーゼのア ミノ配列を示している。終止コドンＴＧＡはアステリスクで示されている。Ａボ ックスはリパーゼタンパク質の活性中心を表わしている。矢印は推定されるシグ ナルペプチダーゼ切断部位を示している。成熟リパーゼタンパク質のアミノ末端 配列は下線が引かれている。 第１３図、ｐＳＷ１０３の制限地図。 ロ二二］；ｐＵｃ１９ベクターＤＮＡ 竪乙クグ圀　、ＰＡｏｌ　ＤＮＡ挿入物使用されている記号； 一０ｒｉ　Ｅ、ｃｏｌｉ；ｐＢＲ３２２ベクター由来の大腸菌の複製オリジン Ｐ　Ｉａｃ　ｉ大腸菌波オペロンのプロモーター−Ａｐｒ　、アンピシリン耐性 をコードする遺伝子−Ｌｉｐ；ＰＡＯＩリパーゼをコードする遺伝子第１４図、 ＰＡＯリパーゼ遺伝子の部分ヌクレオチド配列（すなわち内部の５ａｉ１部位か ら）及びそれに由来するＰＡＯリパーゼのアミノ酸配列、終止コドンＴＡＧはア ステリスクで示しである。Ａボックスはリパーゼタンパク質の活性中心を表わし ている。 第１５図；プラスミドｐＢＨＡＭ１及びｐＢＨｃＭｌの構築。 使用している記号ニ ーＢａｃｉｌｌｕｓ　ｏｒｉ　；バチルスの複製オリジン−に＋ｗ’；カナマイ シン耐性をコードするｐＵＢｌｌｏの遺伝子 −Ｃ＋＋；クロラムフェニコール耐性をコードするＴａ２）ランスボゾン遺伝子 Ｐ　、Ｉｐａ　Ｕ　；プラスミドＰ　ＵＢ　１１００）Ｈｐａｍルミｍプロモー ター号は第１１図と同様である。 第１６図；第１６図はプラスミドｐＢＲＡＭＩＮ１の構築を示している。記号は 第１５図で使用しているものと同様である。 第１７図り第１７図はプラスミドｐＴＺＮＩＭ１の構築を説明している。使用し ている記号はり −Ｉａｃ　Ｚα；β−ガラクトシダーゼのα−ドメインをコードする■匹Ｚ遺伝 子のＮ末端部分 Ｐｔｍｃ；大腸菌１ａｃオペロンのプロモーター他の記号は第１１図と同様であ る。 第１８図；第１８図はプラスミドｐＭｃＴＭ１の構築を示している。使用してい る記号はニ ーＣｍ’；クロラムフェニコール耐性をコードする遺伝子Ｐｔｍｃｉ大腸菌のハ イブリッド触−セにプロモーター他の記号は第１１図及び第１５図と同様である 。 第１９図；トランスホームした大腸菌細胞から生産されるＭ−１リパーゼタンパ ク質のイムノプロット検出。 レーンＡ−Ｄは次の構築物を宿す大腸菌細胞の細胞周辺校両分を含む： レーンＡ；ｐＴＺ１８ＲＮ レーンＢ　；　ｐＴＺＮＩＭル −ンＣ；ｐＭｃＭル −ンＤ：シュードモナス・シェードアルカリゲンス（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ 　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｓ）　Ｍ　−１株由来の精製Ｍ−１リパーゼ 。 マーカータンパク質（アマーシ十ム社レインボー）の分子量は右側にｋＤａで示 しである。 第２０図；プラスミドｐＢＨＭＩＮ１の構築。記号は第１５図のものと同様であ る。 第２１図；インビトロで合成した３５３ラベル化タンパク質のオートラジオグラ フ。 レーンＡ−Ｄ　；　Ｍ−１リパーゼに対するモノクローナル抗体によるインビボ で翻訳されたタンパク質の免疫沈殿化。 レーンＥ−Ｈｉ次のプラスミドのインビトロにおける転写／翻訳産物： レーンＡ及びＥ；ｐＴＺ１８ＲＮ レーンＢ及びＦ　；　ｐＴＭＰｖ　１８ＡレーンＣ及びＧ；ｐＭｃＴＭル −ンＤ及びＨ；　ｐＭＣＴｂ　１　ｉＭ１第２２Ａ図及び第２２Ｂ図；バクテリ アＤＮＡ中のリパーゼをコードする配列の検出。プラスミドＤＮＡ５ナノグラム 及び染色体ＤＮＡ５マイクログラムを示されている制限酵素で消化し、０．８％ アガロースゲルで分画後ニトロセルロースフィルターにブロッティングし各々ｐ ＥＴ３及びｐＴＭＰｖ１８Ａのニックトランスレーションした挿入物とハイブリ ダイズさせた。 第２２Ａ図；第２２Ａ図はｐ　ＥＴ　３　ＥｃｏＲＩ挿入物によるハイブリダイ ゼーション後のオートラジオグラフ。 第２２Ｂ図；第２２Ｂ図はｐＴＭＰｖ　１８Ａ　ＸｈｏＩ　−ＥｃｏＲＶ挿入物 によるハイブリダイゼーション後のオートラジオグラフを示している。 レーンＡ；プラスミドｐＴＭＰＶ１８ＡのＨｉｎｄＩ［［／５Ｓｔｌ消化物 レーンＢ；プラスミドｐＥＴ３のＥｃｏＲＩ消化物ＢＲＬ　ＤＮＡゲルマ−カー ＭＷ、０．５．１．０．１．６．２．０．３．０．４．０．５．０．６．０．７ ．８．９．１０．１１．１２ｋｂ。 レーンｃ　；　ｐ、シュードアル力リゲンス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｊｇｅｎ ｅｓ）Ｍ−１（ＣＢＳ４７３．８５）の５ａｌｌ消化物レーンＤ、Ｐ、　シュー ドアル力リゲンス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ＩＮｎ−５（ＣＢＳ ４６８．８５）の５ａｌｌ消化物レーンＥ　；　Ｐ、アルカリゲンス（ａｌｃａ ｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｄ　Ｓ　Ｍ５０３４２の５ａｉｌ消化物 レーンＦｉｐ、アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　Ｐ　Ａ　ＣＩ　Ｒ（ＣＢ 　５１３６．８９）の５ａｉｌ消化物 レーンｃｉｐ、アルギノサ（ａｅｒｕｇｊｎｏｓａ）　Ｐ　Ａ　Ｏ２３０２（６ −１）の５ａｌｌ消化物 レーンＨ、Ｐ、スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）Ｔｈａｔ　ＩＶ　１７−１　（Ｃ Ｂ　Ｓｌ ４６１．８５）の５ａｌｌ消化物 レーンＴ、Ｐ、スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）　Ｐ　Ｇ　−１−３（ＣＢ　Ｓｌ 、３７．８９）の５ａｌｌ消化物 レーンＪ　、　Ｐ、スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）　Ｐ　Ｇ　−Ｔ　−４（ＣＢ 　５１３８．８９）の５ａｌｌ消化物 レーンＫｉＰ、スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）　Ｐ　Ｃ−ＩＩノ１１．１（ＣＢ Ｓ４６８．８９）の５ａｌｌ消化物 レーンＬｉＰ、スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＰＧ−Ｕ　−１１，２（ＣＢＳ４ ６８８９）の５ａｌｌ消化物 レーンＭＡＰ、フラジ（ｆｒａｇｉ）　Ｓｅｒｍ、ＤＢ　１０５１　（＝ファー ムＢＰ１０５１）の５ａｉｌ消化物 レーンＮ、Ｐ、グラジオリ（ｇｌａｄｉｏｌｉ）　（ＣＢ　Ｓ　１７６．８６　 ）の５ａｌＩ消化物 レーン０；Ａ、カルコアセチカス（ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）　Ｇｒ　−Ｖ 　−３９（ＣＢＳ　４６０．８５）の５ａｌｌ消化物レーンＰ　、　Ｓ、オーレ ウス（ａｕｒｅｕｓ）　（ＡＴＣＣ２７６６１）の５ａｉｌ消化物 特定の態様の説明 本発明に従がい新しいＤＮＡ構築物及び脂質分解性酵素を生産する微生物株を含 む新しい組成物が提供されている０本発明で興味が持たれるリパーゼは約８から １０．５の至適ｐＨ値を有し、６〇　−℃以下の温度、好ましくは３０〜４０℃ でかつ約７〜１１のｐＨ値、好ましくは約９〜１０．５のｐＨ値の洗浄条件下約 １０ｇ／ｊ！までの濃度で洗浄組成物を含む水溶液中で効果的なリパーゼ活性を 示す。 望ましい特性を有するリパーゼをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド構築物 が真核細胞又は原核細胞のいずれかの宿主細胞をトランスホームするのに用いら れる。その後このトランスホームした宿主細胞を増殖させこの遺伝子が発現され る。 リパーゼ遺伝子を単離するのに用いる技術は当分野ではよく知られており、これ らには合成、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃ　ＤＮＡからの調製又はその組換えな どが含まれる。この遺伝子を取扱う種々の技術はよく知られており、これらには 制限切断、消化、切断、ライゲーション、インビトロ突然変異誘発、プライマー 修復、リンカ−及びアダプターの使用等が含まれる。マニアチス（Ｍａｎｉ＝ａ ｔｉｓ）　等、”モレキュラークローニングコールドスプリングノ１−バーラボ ラトリー、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク、１９８２年参照。 −Ｍに、この方法は、望ましい特性を有するリパーゼを発現する生物からのゲノ ムライブラリーの作成を含んでいる。これらのリパーゼの例にはシュードモナス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びアシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ ｒ）から得られるもの、特にシュードモナスアルカリゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ　ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　＋　シュードモナス・シュードアルカリゲ ンス（Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シ ュードモナスアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）＋ 　シュードモナス・スツゼリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒｉ）及 びアシネトバクタ−・アルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌ ｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）種に属する株から得られるものがある。これらのリパー ゼ及び株については、ここで参考として引用するＥＰ−Ａ−０２１８２７２に十 分記述されている。供与；、ス生物のゲノムを単離し、ついで５ａｕ３Ａのよう な適当な制限酵素でこれを切断する。得られた断片を予め適合する制限酵素で切 断したベクター分子に結合する。適当なベクターの例には制限エンドヌクレアー ゼＢｃ１１で切断し得るプラスミドｐＵＮ１２１がある。さらにそのアミノ酸配 列はリパーゼ遺伝子に関してｍＲＮＡから調製されるｃ　ＤＮＡ又はゲノムライ ブラリー又は供与細胞由来のＤＮＡをスクリーニングするのに用いるプローブを 投函するのに使用し得る。 さらに、ハイブリダイゼーションプローブとしてそのリパーゼＤＮＡ又はその断 片を用いることにより、他の微生物中に存在する構造的に関連する遺伝子のクロ ーニングも容易に行ない得る。 本発明は特にＥＰ−Ａ−０２１８２７２に述べられている生物に由来するリパー ゼ遺伝子のヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用いた、脂 質分解活性を示す生物からの遺伝子の単離に関する。別に、これらのオリゴヌク レオチドは目的とするリパーゼのアミノ酸配列からも誘導し得る。これらのプロ ーブはその全配列よりもかなり短かくすることができるが少なくとも１０個、好 ましくは少なくとも１４個のヌクレオチド長であるべきである。またその遺伝子 の全長までで、好ましくは多くとも５００個、より好ましくは多くとも３００個 のヌクレオチド長のより長いオリゴヌクレオチドも有用である。ＲＮＡ及びＤＮ Ａプローブの両方とも使用し得る。 使用に際し、一般的にこのプローブは検出様式に応じてラベル化され（例えばｓ ｚ　ｐ　、　ｓｓ　３　、　ｓ　Ｈ、ビオチン又はアビジンによる）、ついで遺 伝子を探索する生物に由来する一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡと共にインキュベートす る。−末鎖及び二本鎖（ハイブリダイズしたもの）ＤＮＡ　（ＤＮＡ／ＲＮＡ） を分離後（一般的にはニトロセルロースペーパーを使用する）ラベルによりハイ ブリダイゼーションを検出する。オリゴヌクレオチドの使用に適したハイブリダ イゼーション技術は当分野ではよく知られている。 通常プローブは簡単に同定し得る検出可能ラベルと共に使用されるが、非ラベル 化オリゴヌクレオチドもラベル化プローブの前駆体として、並びに二本鎖ＤＮＡ 　（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）の直接的検出を提供する方法で使用するのに有用であ る。従って、“オリゴヌクレオチドプローブという語句はラベル化型及び非ラベ ル化型の両方を意味する。 本発明の好ましい態様の１つの場合シュードモナス・シュードアルカリゲンス（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）のリパーゼ由 来の配列をＣＢ５４７３．８５　（Ｍ−１）株からクローン化する。 驚くべきことに、かつて配列決定されたシェードモナスアルギノサ（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ（ＡＴ　ＣＣ１５６９２）のクロ ーン化したリパーゼはＭ−１のリパーゼ遺伝子配列と高い配列ホモロジーを示し た。さらに驚くべきことにこの高い配列ホモロジーはＭ−１株のリパーゼ遺伝子 配列及び多くのシュードモナススツゼリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｔｚ ｅｒｉ）単離物（ＰＧＩ−３（ＣＢ５１３７．８９）　、ＰＧ−１−４（ＣＢＳ Ｉ　３８．８９）、ＰＧ−１１−１ｔ１（ＣＢＳ　ｌ　３９．８９）　、ＰＧ− １１−ｔ　１．２　（ＣＢ３１４０．８９））及びシュードモナスアルカリゲン ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ’　ａｌｃａｌＬｇｅｎｅｓ）ＤＳＭ５０３４２の 染色体ＤＮＡの間にも見受けられた。この明細書中で用いられている“高度のハ イブリダイゼーション′とは少なくとも６７％のホモロジーを有する少なくとも ３００ｂｐの連続するＤＮＡと定義される。 Ｐ、アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びＰ、スッゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ ）のリパーゼ酵素を生産し、ＳＬＭテストで洗浄性能のテストを行った。 驚くべきことにＭ−１！Ｊパーゼ遺伝子と高度のホモロジーを示す全ての酵素は 、現代の洗浄プロセスを真似た条件下で優れた安定性、有効性及び性能を示すこ とが分った。オウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等の方法に従かい（カレントブロト コールス・イン・モレキュラー１バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃ ｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）。 １９８７−１９８８）、サウザンハイブリダイゼーション技術でこのレベルのホ モロジーを検出し得る。この発見されたホモロジーはＥＰ−Ａ−０２０５２０８ 及びＥＰ−Ａ−０２０６３９０に述だられているＰ、グラジオリ（ｇｌａｄｉｏ ｌｉ）又はＢＰ−Ａ−０３０５２１６に述べられているフミコラ・ランギノサ（ Ｈｕｍｉｃｏｌａ　Ｉａｎｇｕｉｎｏｓａ）のリパーゼには観察されなかった。 このＤＮＡ挿入断片を含むクローンは大腸菌（クン（にｕｈｎ）等、ジーン（Ｇ ｅｎｅ）４４　（１９８６）　２５３−２６３）及びＢ、サチラス（ｓｕｂｔｉ ｌｉｓ）　（グリクデン（Ｇｒｙｃｚａｎ）及びドゥブナウ（［１ｕｂｎａｕ） 。 ジーン（Ｇｅｎｅ）２０　（１９８２）４５９−４６９）に対して開発された直 接又はポジティブ選択操作を用い同定し得る。大腸菌に対するポジティブ選択ベ クターの例としてはｐＵＮ１２１にルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）等ヌクレイックア シッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）１１　（１９８３）８ ０１９−８０３０）がある。 さらに、脂質分解性酵素を発現するクローンは例えばローダミンＢとともにトリ ブチリン又はオリーブ油を含む寒天培地などの（クーカー（Ｋｏｕｋｅｒ）及び ジャガー（Ｊａｅｇａｒ）、アプライドエンバイロメンタルマイクロバイオロジ ー（Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　５３（１９８７）２１１ ）適当なインジケータプレート検定法を用いて同定し得る。さらに複製コロニー はエステラーゼ活性を検出するために述べられた操作（ヒルガード（Ｈｉｌｇｅ ｒｄ）及びスピジゼン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）　＋ジャーナル・オブ・バクテリオ ロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１１４　（１９７８）１１８４）に基づく 軟寒天技術改良法を用いてスクリーニングし得る。別に、脂質分解性酵素を発現 するクローンはウォルファース（Ｗｏｈｌｆａｒｔｈ）及びウィンクラ−（Ｗｉ ｎｋｌｅｒ）（ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ、　Ｇ ｅｎ。 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）上主土（１９８８）４３３−４４０）により述べられて いるような適当なリパーゼ欠損受容株における遺伝子的相補により同定し得る。 一度完全な遺伝子がｃＤＮＡにしろ染色体ＤＮＡにしろ同定されればそれを発現 させるための種々の方法で取り扱うことができる。微生物宿主には例えば大腸菌 、タルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ−ｍｙｃｅｓ）　＋　アスベルギラス（ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉ　１ｌｕｓ）及びシュードモナ ス（Ｐｓｅｕｄｏ＋５ｏｎａｓ）種のような細菌、イースト及び菌類を用いるこ とができる。それゆえ、その遺伝子はそのリパーゼの野生型転写及び翻訳調節領 域を認識する宿主中で発現されることから、野生型５′及び３′調節領域を有す る全遺伝子が適当な発現ベクター中に導入されなければならない。原核性細胞由 来の複製システムを有する種々の発現ベクターが存在する０例えばボーウェルス （Ｐｏｕｗｅｌｓ）等、′クローニングベクター、ラボラトリ−マニュアル１、 エルスピア版１９８５参照、これらの複製システムはトランスホーマントの選択 を可能にするマーカーを提供し、かつ遺伝子を挿入し得る簡便な制限部位を提供 するよう開発されてきている。 天然の野生型転写及び翻訳調節領域を認識しない宿主中でその遺伝子を発現する 場合、別の操作が必要となる。簡便には、種々の３′転写調節領域が知られてい ることから、これを終止コドンの下流に挿入することができる。構造遺伝子の上 流の５′側非コード領域はエンドヌクレアーゼ制限処理、Ｂａ１３１切除等で除 去し得る。別に構造遺伝子の５′末端近傍に便利な制限部位がある場合には、そ の構造遺伝子を制限処理し、かつ構造遺伝子の欠失したヌクレオチドを補うアダ プターがその構造遺伝子をプロモーター領域に結合するのに用いられる。 ５’−３’の転写方向に調節の誘導を可能にする調節配列も含む転写調節領域及 び翻訳開始領域、好ましくは指定された宿主細胞により認識される分泌用リーダ ー配列を含む脂質分解性酵素をコードする読み枠及び翻訳及び転写終止領域を有 する発現カセットを提供する種々の戦略が用いられる。さらにこの発現カセット は少なくとも１個のマーカー遺伝子を含む。この開始及び終止領域は宿主細胞中 で機能するもので、これらは同種（その宿主に由来するもの）又は異種でその宿 主に由来するもの、もしくは異種で別の起源又は合成りＮＡ配列に由来するもの のいずれかである。 このようにこの発現カセットは全体的に又は部分的に天然のものに由来すること もあるし、全体的に又は部分的に宿主細胞と同種の起源に由来することもあり、 もしくはその宿主細胞と異種の起源に由来することもある。本発明の種々のＤＮ Ａ構築物（ＤＮＡ配列、ベクター、プラスミド、発現カセット）は単離され、及 び、又は精製又は合成されるもので、従って“天然に存在するもの”ではない。 適当な調節配列の選択には発現に影響する次の因子が考慮される。転写調節につ いてはメツセンジャーＲＮＡの量及び安定性が遺伝子産物の発現を左右する重要 な因子である。ｍＲＮＡの量は特定の遺伝子のコピー数、プロモーターの相対的 効率及びエンハンサ−又はリプレッサー等のプロモーターを調節する因子により 決定する。ｍＲＮＡの安定性はりボヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの怒受性に支 配される。一般にエクソヌクレアーゼ切断は−ＲＮＡの末端の構造様式パリンド ローム構造、修飾ヌクレオチドあるいは特異的ヌクレオチド配列の存在により阻 害される。エンドヌクレアーゼ切断はｍＲＮＡ内の特異的認識部位で起こると考 えられており、安定なｍＲＮＡはこれらの部位を欠いているのであろう。 また高いレベルで翻訳を行うｍＲＮＡはｍＲＮＡ上のりボゾームの存在によって も分解から保護されているといういくつかの証拠もある。 翻訳については、ｍＲＮＡが存在するならばその発現は開始速度（ｍＲＮＡへの りボゾームの結合）、伸長速度（ｍＲＮＡ上のりポゾームの移動）、翻訳後の修 正速度及び遺伝子産物の安定性により調節され得る。伸長速度はおそら（使用す るコドンに影響される。すなわち少ないｔＲＮＡに対するコドンの使用は翻訳速 度を減少させる。開始はコード配列の始めの直前の領域で起こると考えられてい る。原核生物においてほとんどの場合、この領域にはＡＧＧＡのコンセンサスヌ クレオチド配列が含まれており、これはシャイン・ダルガルノ配列と呼ばれてい る。この配列はりボゾーム結合部位となる特徴を有する一方、この配列の上流及 び下流の配列は翻訳開始に影響しうろことは明白である。 また、別の証拠は、おそらく開始部位をリボゾームが認識する構造様式の形成に よってリボゾーム結合に影響を与えうるコード領域内のヌクレオチド配列の存在 も指摘している。開始コドンＡＴＧに対するＡＧＧＡ配列の位置は発現に影響を 与え得る。従って特定の発現速度を決定するのはこれら全ての因子の相互作用に よる。しかし、発現される遺伝子はこれら全ての因子の組合せを展開して特定の 発現速度を生み出してきた。商いレベルの遺伝子産物を生ずる発現システムの設 計は、発現に影響すると決定された特定の領域だけでなく、それらの領域（配列 ）が互いにどのように影響し合うかを考慮しなければならない。 代表的な転写調節領域又はプロモーターには例えば工業的生産に用いられる株中 で過剰発現される遺伝子由来の配列が含まれる。 さらに転写調節領域には、例えば生育培地中の栄養物又は発現産物の有無又は温 度等により調節される構造遺伝子の発現を可能にする調節配列も含まれる。例え ば原核細胞において構造遺伝子の発現はバタテリオファージラムダＯＬオペレー ター及び温度感受性リプレッサーとともにバクテリオファージラムダＰＬプロモ ータ・−を含む調節配列を用いると温度によって調節できる。このプロモーター の調節はリプレッサーとオペレーター間の相互作用を通して行なわれる。バチル ス（Ｂａｃｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）のアミラーゼとプロテアーゼの遺伝子の調節配列を 用いた脂質分解性酵素を発現し得る発現力セントは特に興味深い。目的の構造遺 伝子はりボゾーム結合部位の下流に結合され、そうすることにより転写調節領域 及び翻訳開始領域の調節制御下に置かれることになる。 また分泌リーダーシグナル及びプロセシングシグナルをコードする配列を構造遺 伝子の５′側に付けることにより融合遺伝子が調製される。もし選択した宿主細 胞中で機能的であるなら、リパーゼ遺伝子それ自体のシグナル配列も用いられる 。代表的異種分泌リーダー配列にはベニシリナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ 及びイーストのα因子の分泌リーダー配列が含まれる。目的とする構造遺伝子と 分泌リーダー配列を適正な読み枠で融合することにより成熟した脂質分解性酵素 が培養培地中に分泌される。 発現力セントは適当な宿主微生物中エビソーム的維持を可能にする複製システム 内に含まれていてもよいし、また複製システムなしに提供され、宿主ゲノムに組 込まれる場合もある。宿主微生物への種々のＤＮＡ構築物のトランスホーメーシ ヲンの方法は本発明にとってあまり重要ではない。ＤＮＡは、リン酸カルシウム 沈殿化ＤＮＡ、接合、エレクトロポレーション、細胞のウィルスとの接触による トランスフェクション、細胞へのＤＮＡのマイクロインジェクション等を用いた トランスホーメーション等の従来技術に従かい宿主細胞中に導入される。この宿 主細胞は細胞自体でもちよいしプロトプラストでもよい。 宿主生物としては脂質分解性酵素の生産と抽出に適したものであればどの微生物 でもよい。また、この宿主生物は生産した酵素を分泌でき、それにより無細胞発 酵液からその酵素を回収し得ることが望ましい。また宿主微生物は非病原性生物 であることが望ましい。上記の条件を満足する宿主生物の例には大腸菌、シュー ドモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｉｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）及びバチルス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ）株、特にＢ、サチラス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ、リチェニホ ルミス（ｌｉｃｈｅｎｉ−。 ｆｏｒ＋ａｉｓ）＋ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株及び各々 アスベルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びタルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖ ｅｒｏｍｙｃｅｓ）等の菌類及びイースト株が含まれる。 宿主株は研究用の株でもよいし、又工業用の微生物株も含みうる。工業用の菌株 はファージ感染又はトランスホーメーションなど遺伝的変化に耐性を持つ特徴が ある。この株は安定であり、また胞子を形成し得るものと形成し得ないものがあ る。それらは独立栄養性であり、またα−アミラーゼや種々のプロテアーゼのよ うな内在性タンパク質産物を高収率で提供しろるよう変えられる。 工業生産プロセスにおいて得られる内在性タンパク質産物の収量は少なくとも５ ｇ／ｆ（０，５％ｗ　／　ｖ　）にまで高め得る。また工業用株はＤＮａｓｅを 分泌し、これが培地中のＤＮＡを分解することにより遺伝的変化に対する耐性を 与えている。 一度構造遺伝子を適当な宿主の中に導入すれば、その宿主細胞を増殖しその構造 遺伝子を発現させ得る。脂質分解活性の生産レベルはその遺伝子が由来する本来 の株と同様かもしくはそれより高い。その宿主細胞を適当な培地中で高密度に増 殖させて富栄養培地を作る。プロモーターが誘導可能な場合、例えば温度変化、 貧栄養又は過剰の代謝産物又は栄養物などの誘導条件が用いられる。 分泌が行なわれる場合、発現産物は従来法により生育培地がら単離される。生産 された脂質分解性酵素の放出は希薄な界面活性剤溶液で促進し得る０分泌が行な われない場合、宿主細胞を収穫し、従来の条件の従って分解する。それから望ま しい産物を単離しクロマトグラフィー、電気泳動法、溶剤抽出、相分離等の既知 技術に従って精製する。 本組成物は巾広い方法で使用し得る。トランスホームした宿主微生物は洗剤組成 物で有用となる特性を有するリパーゼ生産を増加するのに使用し得る。また、ク ローン化したリパーゼ遺伝子は、エステラーゼではなくリパーゼとしての脂質分 解性遺伝子の同定を含むリパーゼ遺伝子のスクリーニングに使用し得る。 またそれらは、必要とされる修正した特性を有するリパーゼを生ずるランダム又 は部位指定突然変異誘発に関する従来技術を用いて酵素工学で使用される。 脂質分解性酵素組成物は一般に洗浄組成物で用いられる洗剤及び別に添加される 成分を含む洗濯組成物に使用し得る。これらの成分には、少なくとも１種の界面 活性剤、複合リン酸、アルカリ金属ケイ酸塩及び重炭酸塩などの柔軟剤、アルカ リ金属硫酸塩などのファイラー、プロテアーゼ及びアミラーゼなどの酵素、漂白 剤、及び香料、ケイ光漂白剤などのその他の化合物が含まれ得る。 本発明に従かう酵素的洗浄組成物において、そのリパーゼ活性は１〜２０，００ ０ＴＬＵ／ｇ　（Ｍｉ成物）の範囲であることが好ましく、一方タンパク質分解 酵素活性は５０〜１０．０００デルフトユニツト（Ｄｅｌｆｔ　Ｕｎｉｔｓ）　 ／　ｇ　（洗浄組成物）の範囲であることが好ましい。ＩＴＬＵ　（真リパーゼ 単位）はｐｕａ、ｏ、２５℃でオリーブ油／アラビアゴムエマルジョンから放出 される、１μａ＋ｏｌｅＮａＯＨ／ｌｌｌ１ｎと等価の滴定値をもつ脂肪酸と定 義される。テルフトユニットはジャーナル・オブ・アメリカン・オイル・ケミカ ル・ソサイアテＩ　（Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｏ４ｌ　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、）　６ ０　（１９８３）　１６７２に定義されている。 本発明の洗剤は通常の方法、例えば各成分を一緒に混合すること、又は予備混合 物を調製し、つづいて他の成分と混合することにより調合される。ある調合経路 では、１つ以上のリパーゼ調製物を１つ以上の他の化合物と混合して所定の酵素 活性濃縮物を作り、それからこの濃縮物を他の望ましい成分と混合する。 本発明の脂質分解性酵素は酵素性洗剤添加物の形で使われることが望ましい。ま たこの添加物には例えば現在の洗剤で使用し得るプロテアーゼ及び／又はアミラ ーゼなど他の１つ以上の酵素及び例えば非イオン性、塩、安定化剤及び／又はコ ーティング剤など一般にこの分野で用いられている他の１つ以上の成分が含まれ る。酵素性洗剤添加物はリパーゼに加えてプロテアーゼ及び場合によってはα− アミラーゼを含み得る。このタンパク質分解性酵素はこの調合物中の脂質分解性 酵素とうまく適合する。一般に酵素性洗剤添加物を当分野で知られている１個以 上の洗剤及び他の成分と混合し洗剤を調合する。一般に酵素性洗剤添加物は１０ ”〜１０’　ＴＬＵ／ｇ　（添加物）の範囲で用いられる一方、場合により存在 するタンパク質分解活性は５Ｘ１０’〜１０”デルフトユニット／ｇの範囲であ る。 本発明の酵素性洗剤添加物は例えば一般に当分野で知られている方法によって調 製される顆粒又は粒（ｐｒｉｌｌ）の形をしている。 例えば英国特許第１，３２４，１１６号及び第１，３６２，３６５号及び米国特 許第３．５１９，５７０号、第４，１０６．９９１号及び第４，２４２，２１９ 号参照。 酵素性洗剤添加物は例えばプロピレングリコールなどの酵素安定化剤と共に液体 状とすることもできる。またそれらは可溶性又は不溶性サポートに固定するか、 又は１種以上の安定化剤の存在下水性又は無水溶液中の有機性又は無機性スラリ ー、エマルジョン又はカプセルの形状とすることができる。このような添加剤は 液体洗剤中で用いることが望ましい。 以下に述べる例は説明のためのものであり発明を制限するものではない。 実験 一般的なりローニング技術はマニアチス（？Ｉａｎｉａｔｉｓ）等（１モレキユ ラークローニング、ラボラトリ−マニュアル”コールドスプリングハーバ−ラボ ラトリ−１１９８２、Ｃ３Ｈ，ニューヨーク）により報告されているものを用い た。全てのＤＮＡ修正酵素は市販されているものを用いた。それらは業者の説明 書に従って用いた。ＤＮＡ精製及び分離用の物質及び装置は業者の説明書に従っ て使用した。 例１ トリアシルクリセロール・アシルヒドロラーゼの分子クローニング Ａ、ＤＮＡ及び選択ベクターの起源 ＢＰ−Ａ−０２１８２７２は洗剤への使用に通したリパーゼを生産する一数種の バクテリア株を公開している。その中のアシネトバクタ−カルコアセチカス（Ａ ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）　Ｇ　ｒＶ−３９（ ＣＢＳ４６０．８５）　、シュードモナススツゼリ（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ 　５ｔｕｔｚｅｒｉ）　Ｔｈａｉ　ｒＶｌ　７　１　（ＣＢＳ４６１．８５）　 、シュードモナス・シュードアル力リゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｏｎａｓ　Ｐｓ ｕｄｏａｌｃａｌｉ−ｇｅｎｅｓ）Ｍ−１（ＣＢＳ４７３．８５）が脂質分解性 遺伝子の起源として選択した。 アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びバクテリオファージ ラムダのｃｌレセプター遺伝子を存するプラスミドベクターｐＵＮ１２１にルソ ン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）等、ヌクレイツク・アシソズ・リサーチ（Ｎａｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）土工（１９８３）８０１９）はＭ、ウールン博士（王 立技術研究所、生化学科、スウェーデン・ストックホルムＳ−１００４４、テク ニクリンゲン（Ｔｅｋｒ＋ｉｋｒｉｎｇｅｎ）　１０　）から入手した。テトラ サイクリン遺伝子の転写はＣＩリプレッサーにより妨かれる。外来ＤＮＡの単一 の制限部位（Ｂｃｌ　Ｉ　、　Ｓｅａ　Ｉ、Ｈ４ｎｄｎ［及びＥＣＯＲ■）への 挿入はテトラサイクリン遺伝子を活性化する。このことは８μｇ　／　ｍ　１テ トラサイクリン及び５０μｇ　／　ｍ　１！アンピシリンを含むルリア（Ｌｕｒ ｉａ）培地寒天プレート上で組換えトランスホーマントの直接的（ポジティブ） 選択を可能にする。 Ｂ、遺伝子ライブラリーの調製（第１図参照）プラスミド及び染色体ＤＮＡはア ンドレオリ（Ａｎｄｒｅｏｌｉ）　（モレキュラーアンドゼネラルジエネテイク ス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）１９９（１９８５）３７２−３８０） により報告されている方法で単離した。　Ｔｈａｔ　ＴＶＩ　７　１及びＭ−１ から単離した各染色体ＤＮＡを５ａｎ３Ａで部分消化した。それからそのＤＮＡ を７４ＤＮＡリガーゼを用いマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（上述）により 報告されている方法に従がいＢｃｌＩで消化したｐＵＮ１２１ＤＮＡにライゲー トし大腸菌ＪＭ１０１ｈｓｄＳ　ｒｅｃＡ株（ダガート（口ａｇｅｒｔ）及びア ーリッヒ（εｈｒｌ　１ｃｈ）　＋ジーン（Ｇｅｎｅ）６　（１９７９）２３− ２８）のコンピテント細胞にトランスホームした。大腸菌ＪＭＩＯＩｈｓｄＳ　 ｒｅｃＡはファバゲン・コレクション（受Ｅｌ１号ＰＣ２４９５）（オランダウ レン）　（Ｕ　ｔｒｅｃｈ　ｔ）から入手した。シリア培地寒天プレート中８μ ｇ　／　ａ＋　ｌ！のテトラサイクリンに耐性のトランスホーマントを選択した 。 Ｃ，）ランスホーマントのスクリーニング上記のようにして得られた遺伝子ライ ブラリーのレプリカプレートを作り、以下の２つの操作を用い脂質分解活性でス クリーニングした。第１の操作では複製コロリーをトリブチリン含有のペプトン 寒天培地上の脂質分解活性でスクリーニングした。脂質分解活性は濁った脂質エ マルジョンの分解によるコロニー周辺の透明領域（ハロー）として検出した。第 ２の操作においては複製コロニーを軟寒天重層技術を用いてニーステラーゼ活性 でスクリーニングした。この方法はヒルガード（ｔｌｉｌｇｅｒｄ）及びスピジ ゼン（Ｓｐｉｚｔｚｅｎ）（７）方法（ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（ Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１１４　（１９８７）　１１８４）に基づいている。 基本的には０．４％低融点アガロース、０．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，５） 、アセトンに溶解した０、　５　ｗａｇ／　ｉｔβ−ナフチルアセテート及び０ ．５−ｇ／１２ファーストブルーＢＢ（例２参照）の混合物をトランスホーマン トに注ぐと、数分以内にエステラーゼ又はリパーゼ活性を有するコロニーは紫色 に変色する。 Ｔｈａｉ　ＩＶＩ　７　１／ｐＵＮ１２１遺伝子バンクから得た１２００個のテ トラサイクリン耐性トランスホーマントのうち３個がトリブチリン寒天プレート 上にハローを作った。Ｍ−１／ｐ　ＵＮ１２１遺伝子バンク由来の、テストした １２０００個の組換えトランスホーマントのうちわずか１個のクローンが弱い脂 質分解活性を示した。 このトリブチリンポジティブクローンを２ＴＹ培地（１６ｇ／Ｅバクトドリプト ン、Ｌｏｇ／ｊ！バクトイ−ストエクストラクト、５　ｇ／／　ＮａＣｌ２．　 ｐＨ７，０＞中−晩増殖させ、ついでプラスミド含量（下のＩＤ参照）及び脂質 分解活性の指標となる種々のβ−ナフチル基質の転換能（例２Ａ参照）の両方に ついて検定を行った。 Ｄ、プラスミドの単離 り、Ｉ　ＴｈａｔｌＶ１７　１リパーゼ遺伝子の包含化Ｔｈａｉ　ＩＶＩ　７　 １／１）ＵＮＩ　２１　）ランスホーマントから単離したプラスミドはｐＡＴｌ 及びｐＡＴ３と命名した。それらの構造を各々第２図及び第３図に示す、ｐＡＴ ２と命名した第３のクローンはｐＡＴ１構築物と同じプラスミドを宿していた。 脂質分解活性をコードする遺伝子はｐＡＴｌの２．７　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片内 （第２図、点線）及びｐＡＴ３の３．２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片内（第３図、点ｖ Ａ）に位置する。これら２つのＥｃｏＲＩ断片をＤＮＡ配列決定用及び高収率脂 質分解活性獲得用に適当なベクターにサブクローンした。 ｐＵＮ１２１ベクターへのｐＡＴ１由来の２．７ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片のクロー ニングにより組換えプラスミドｐＥＩを作った（第４図）、プラスミドｐＥＴ１ を宿す大腸菌ＪＭＩ　Ｏ１ｈｓｄＳ　ｒｔにＡ株はＣＢ５１５７．８７として、 １９８７．２月５日ＣＢＳに登録された。 ’ｐＵＮ１２Ｊベクターへのｒ＋ＡＴ３由来の−３，２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片の クローニングにより組換えプラスミドｐＥＴ３を作った（第５図）。プラスミド ｐ、ＥＴ３を宿す大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　ｈｓｄＳ　ｒｅｃＡ株はＣＢＳＬ５５ ．８７として、１９８７．２月５日ＣＢＳに登録した。 Ｄ、２Ｍ−１リパーゼ遺伝子の包含化 ｐＡＭ１と命名されたＭ−１／ｐＵＮ　１２１　）ランスホーマントから単離し た組換えプラスミドを単離し、特性を明らかにした（第６図）。しかし、ｐＡＭ ｌの脂質分解活性の生化学的特性はこのプラスミドが目的とするリパーゼをコー ドしていないことを示した（例２及び例３参照）。それゆえ以後説明する他の戦 略を開発しなければならなかった。 大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　ｈｓｄＳ　ｒｅｃＡ中のプラスミドｐＡＭ１は第１５４ ．８７号として１９８７年、２月５日ＣＢＳに登録した。 Ｄ、３　１ＮＩＩ−５リパーゼ遺伝子の包含化プラスミドベクターｐＵＮ１２１ を使用し５ａｕ３Ａで部分消化したシュードモナス・シュードアル力リゲンス（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏ口ａＳｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｉ　Ｎ　ＩＩ 　−５Ｄ　Ｎ　Ａ断片を大腸菌に１２ＤＨ１株（ＡＴＣＣ３３８４９）にクロー ン化した。ライゲーション及びハナハン（ｔ（ａ　ｎ　ａ　ｈ　ａ　ｎ　）　（ ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉａｓ、）１ ６６　（１９８３）５５７−５８０）により報告されている方法で調製したＤＨ Ｉコンピテント細胞へのトランスホーメーション後、５０μｇ／ｍｌｌアンピシ リン及び８μｇ　／ｒｒ１１テトラサイクリンに耐性の約１５００個のトランス ホーマントが得られた。トリブチリン及びβ−ナフチルアセテートを加水分解し 得るトランスホーマントはＩＣで述べた方法で選択した。１個のポジティブコロ ニーからプラスミドＤＮＡを単離し、数種の制限酵素認識部位の決定たよる特性 化を行った。９Ｍ６−５と命名されたこのプラスミドの物理マツプを第７図に示 す。 β−ナフチルエステルに対する大腸菌ＤＨＩ　（９Ｍ６−５）の活性を測定した （第１表）、プラスミドｐＭＳ−５を宿す大腸菌ＤＨＩ株を、第１５３．８７号 として１９８７年２月５日ＣＢＳに登録した。 Ｄ、４ＧｒＶ−３９リパーゼ遺伝子の包含化ＥｃｏＲＩ”で部分消化した（ガー ドナー（Ｇａｒｄｎｅｒ）等、ＤＮＡ１　（１９８２）１０９−１１４に従う条 件下）アシネトバクタ−カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａ ｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）　Ｇｒ　Ｖ　−３９ＤＮＡｔ−ＥｃｏＲＩ　Ｔ：線状 化したｐＵＮ１２１ＤＮＡと混合し、Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼを用いて再 環状化した後、このＤＮＡ混合物をこの例で先に述べたトランスホーメーシジン 操作を用い大腸菌ＤＨＩ　（ＡＴＣＣ３３８４９）に導入した。得られた全１８ ００個のテトラサイクリン耐性トランスホーマントをＩＣで述べた脂質分解活性 でスクリーニングした。 このＧｒ　Ｖ−３９／ｐＵＮ１２１遺伝子ライブラリーのうちの３個のコロニー は脂質分解性酵素を生産した。ｐｐｓ−ｔと命名した３個のクローンのうちの１ 個に由来するプラスミドＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼで特徴づけた 。このプラスミドｐＰ５−４の物理マツプを第８図に示した。それから大腸菌Ｄ ＨＩ（ｐＰ５−４）由来の酵素粗調製物によるβ−ナフチルエステルの加水分解 を測定した（第１表）。大腸菌ＤＨＩ中のプラスミドｐｐｓ−４は第１５１．８ ７号として１９８７年２月５日ＣＢＳに登録した。 例２ クローン化した脂質分解性酵素調製物の特性Ａ、脂質分解活性の測定 トリブチリンポジティブ大腸菌コロニーを５００ｍｊ！コニカルフラスコ中のア ンピシリン及びテトラサイクリンを含む１００ｍｊ！の２ＴＹ培地に接種した。 この大腸菌培養物を２５Ｏｒｐｍのシェーカー中３０℃で４０時間振盪した。４ ０時間後、５７５ｎｍの光学密度を測定し、ついでその培地をＧＳＡローターを 用いたソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）’　ＲＣ５Ｂ遠心機により６０００ｒｐｍ、 １０分の遠心を行った。酵素検定までその上清を４℃で保存した。 ｔｒＥＪ２を４ｍｐの溶菌バッファ　（２５％スクロース、５０ｍＭ）リス−Ｈ Ｃβｐ８７．５　）中に懸濁した。リゾチームを添加し、２１℃、３０分のイン キュベーション後ＤＮａｓｅ　（２０１Ｊ　ｇ／ｍｊりを加え、さらに３７℃、 ３０分間インキュベーションを続けた。トリトンＸ−１００（０，１％ｖ　／　 ｖ　）を添加し、その細胞サスペンションをラブソニック（Ｌａｂｓｏｎｉｃ） 　１５１０超音波装置を用い氷上で超音波処理した（１分間隔を置いて１ワット ３０秒間の処理５回）。 それから細胞破片をヘチクミクロラピンド／　Ｋ　（Ｈｅｔｔｉｃｈ　１１ｉｋ ｒ。 Ｒａｐｉｄ／Ｋ）遠心機を用い１．２００Ｏｒｐｍ、１５分間の遠心で除去した 。得られた上清脂質分解活性を検定した。この検定は脂質分解性酵素によるβ− ナフチルエステルの加水分解に基づいている。放出されたβ−ナフチルはジアゾ ニム塩ファーストブルーＢＢと反応し５４０ｎ＋ｍに吸収をもつアゾ色素を生ず る。この方法は基本的にマクケラ−（？Ｉｃ）ｔｅｌ　ｊａｒ）の方法（ジャー ナル・オプ・ディリーリサーチ（Ｊ、　ＤａｉｒｙＲｅｓ、）　５３　（１９８ ６）　１１７　１２７）であり、以下のように行った。 反応管中の最終容積は２．０＋＊ｆであった：１．８閉１−５５ａｌｌ　ＹＥＳ （Ｎ−トリス（ヒドロキシ−メチル）メチル−２−アミノエクンスルホン酸、シ グマ社）；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，メルク社）又はメチル・セルソル ブアセテート（メルク社）に溶解した０、　０２’＋ａｎ　１００ｍＭβ−ナフ チルエチテル、０．１ｍＪ１２０ｍＭ　ＮａＴＣ（Ｎａ　）−ロクロレート、シ グマ）、及び０．１ｍｊ！の酵素調製物。 酵素を欠くコントロール及び酵素及び基質をかくβ−ナフチル（シグマ社）標準 物質も使用した。 反応混合物を入れたコーニングの遠心管（１５ｍｊりを３７℃又は指定されに温 度で３０分間インキュベートした。０．０２＋ｅＡ１００ｍＭＦＢ溶液（ＤＭＳ Ｏに溶かしたファストブルーＢＢ塩（シグマ））を加え、さらに１０分間インキ ュベーションする。 ０．２ｍＡの０．７２ＮＴＣＡ（）リクロロ酢酸、リーデルデハン（Ｒｉｅｄｅ ｌ　Ｄｅ　Ｈａｅｎ））を加えて反応を停止し、発色複合体を２．５ｍｌ！１− ブタノール（メルク）と激しく混ぜることにより抽出した。 その層はへりウスクリストミンフユージ（Ｈｅｒａｅｕｓ　Ｃｈｒｉｓｔ　Ｍｉ ｎｉ−ｆｕｇｅ）　ＲＦを用い５０００ｒｐＩｍ、５分間の遠心で分離した。上 層の吸光度をＬＫＢウルトラスペク■分光光度計を用い５４０ｎｍで測定した。 コントロールを差引いた後、その測定値を標準物質としてカンディダ・シリンド ラセア（Ｃａｎｄｊｄａ　ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）のリパーゼ（Ｌ１７５４、 シグマ）を用いたＴＬＵ値（真リパーゼ単位）に変換した。ＩＴ２Ｕは１　μｍ ｏｌｅ　ＮａＯＨ／ｓｉｎと等価の脂肪酸滴定値と定義される（ＥＰ−Ａ−０２ １８２７２参照）、その結果を以下の第１表に示す。 アシル鎖長をＣ４〜Ｃ１８と種々に変化させたβ−ナフチルエステルの加水分解 のデータを比較すると以下のことが示される。 １″、ｐＡＴ３及びｐＥＴ３プラスミドを宿すクローンは真のリパーゼを生産す る。及び２°、ｐＡＴｌ、Ｉ）ＥＴＩ、ｐＡＭｌ、ｐＰ５−４及び９Ｍ６−５プ ラスミドを宿すクローンは実質的にエステラーゼ活性を有する酵素を生産する。 組換えプラスミドを有する大腸菌によって合成される全んどの脂質分解酵素は細 胞分解物中に存在した。 Ｂ、クローン化した脂質分解性調製物のより詳細な特性クローン化した脂質分解 性酵素調製物は業者の指示に従かいファストゲル勾配置０〜１５％を使用したフ ァストゲルシステム（ファルマシア）によるＳＤＳゲル電気泳動を行ない、その 特性を調べた。 大腸菌のクローンｐＥＴ３及びｐＵＮ１２１ベクターを含むＤＨＩ株由来の無細 胞抽出物を供与株Ｔｈａｉ■１７−１由来の部分精製酵素（スチュア（Ｓｔｕｏ ｒ）等、ジャーナル・オブ・バタテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） 　１６８　（１９８６）　１０７０−１０７９）と比較した。 （サンプル調製）酵素調製物の適当な希釈液４部に１０％ＳＯ３゜１０％β−メ ルカプトエタノールの０．５　Ｍ　）リス・ＩＩＣｊ２（ＰＨ６，８）溶液１部 を混合する。この溶液を３等分した。その１つはゲル電気泳動するまでなにも処 理を行なわず室温で保存した。第２及び第３のものは各々５分及び１０分間９５ ℃に加熱し、氷水中で冷却した後ゲル電気泳動するまで室温で保存した。 （電気泳動）処理したサンプルは２度６５ボルト／時間のファストゲルシステム による電気泳動を行った。１つのゲルはファルマシア開発技術ファイル番号２０ ０に従かいコマージブリリアントブルーによるタンパク質染色を行った。第２の ゲルは５０ｍＭ）　’）ス−，ｌＩＣ’Ａ　（ｐＨ７，５）　、０．１％）　！ Ｊ　）：／Ｘ−１００テ洗浄しＳＤＳを除き酵素活性を再活性化した。洗浄ゲル 中の脂質分解活性の存在は例ＩＣで述べたβ−ナフチルアセテート／ファストブ ルーＢＢ塩法に基づく軟寒天重層技術で可視化した。３０℃で３０分間インキュ ベーションした後、透明な背景に紫色のバンドが出現してきた。第９Ｂ図に示し たように、大腸菌ｐＥＴ３クローン由来のリパーゼ及び天然のＰ、スツゼリ　（ Ｓｔｕｔｚｅｒｉ）　ＴｈａｉｒＶ１７−１のリパーゼ（ＭＷ４０ｋＤａ　）は ＳＤＳゲル電気泳動で同じ移動度を示した。同様の熱変化性が大腸菌に１２の別 の外膜タンパク質（御上Ａ遺伝子産物）についても報告されている（フリュード ル（ＦｒｅｕｄＩ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・広域宿主ベクター におけるシュードモナスシュードアル力リゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐ ｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）遺伝子ライブラリーの構築 Ｐ、シュードアル力リゲンス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｍ　− １株のリパーゼ遺伝子クローニングに対する別の戦略として、二要素性広域宿主 クローニングシステムを使用した。これは種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ）の変異株に対する相補性により遺伝子バンクの直接スクリーニング を可能にする。２つの広域宿主ベクターｐＬＡＦＲ１（フリートマン（Ｆｒｉｅ ｄｍａｎ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）１主（１９８２）２８９−２９６）及びｐＫ Ｔ２４８（バグダサリアン（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ） 　１６　（１９８１）２３７−２４７）を用いた。プラスミドｐ　ＬＡＦＲ１は テトラサイクリン耐性を供与するＲＫ２由来の広域宿主コスミドであり、これは 転移可能であるが自立転移することはできない、プラスミドｐＫＴ２４８はスト レプトマイシン耐性及びクロラムフェニコール耐性を供与する転移可能なＲ３０ ０Ｂ由来の広域宿主プラスミドである。大腸菌からシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ）へのこれらのベクターの転移はＲＫ２転移機能を有する（ジンク （Ｄｉｔｔａ）等、プロシイ−ディング・イン・ナショナルアカデミ−・オブ・ ７３４７−７３５１）ｐＲＫ２０１３の助けを借り、フリートマン（Ｆｒｉｅｄ ａ＋ａｎ）等（ジーン（Ｇｅｎｅ）　１８　（１９８２）　２８９　２９６）の 三親交配操作に従って行った。Ｐ、アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ ２３０２株のリバーゼマイナム変異株（ウォルファース（Ｗｏｈｌｆａｒｔｈ） 及びＵ、に、ウィンクラ−（Ｗｉｎｋｌｅｒ）、（ルア大学、ポカム、ＦＲＧ） から入手した）を受容シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ−１ｌｏｎａｓ）として使 用した（ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロインビトロからのラムダファー ジバッキング抽出物の調製及びｐＬＡＦＲＩ　ＤＮＡのパフキングは基本的にイ シュホロヴイソツ（Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ）及びパーク　（Ｂｕｒｋｅ）　 （ヌクレイソファシラズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｔｄｓ　Ｒｅｓ、）　 ９　（１９８１）　２９８９−２９９８）の方法で行った。ｒ３単に言うと、全 Ｐ、シュードアルカリゲンス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）Ｍ　−Ｉ 　Ｄ　Ｎ　ＡをＥｃｏＲｒ又は５ａ１１で部分切断し、ＥｃｏＲＩ制限切断ｐＬ ＡＦＲＩ　ＤＮＡ又は５ａｉｌ制限切断ｐＫＴ２４８ＤＮＡにライゲーションし た。ベクターに対する挿入物の比を１；５にしてベクターとベクターのライゲー ションの可能性を減らした。インビトロでライゲーションしたＭ−１／ｐＬＡＦ ＲＩ　ＤＮＡをラムダファージの頭部にパフキングし、大腸菌ＤＨＩへ注入した （マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、上述１９８２）。 Ｐ、シュードアル力リゲンス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｍ　− １１部ｇ当たり約２．５００個のテトラサイクリン耐性のトランスホーマントが 得られた。Ｐ、シュードアルカリゲンス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉ−ｇｅｎｅ ｓ）が５０００ｋｂのゲノムサイズを有し、かつ少くともテトラサイタリン耐性 トランスダクタントの５０％が２０ｋｂの挿入物を有すると仮定すると、特定の Ｉ）ＮＡ配列を９９％の確立で発見することを保証するには２３００個の異なる クローンが必要である（クラーク（Ｃ１ａｒｋ）及びカーボン（Ｃａｒｂｏｎ） 、セル（Ｃｅｌｌ）　９（１９７６）９１）、この遺伝子ライブラリーは８５０ ０個以上の異なる組換えコロニーを含んでいるのでおそらくそれは全Ｐ。 シュードアルカリゲンス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）のゲノムを含 んでいるであろう。 ライゲーションしたＭ−１／ｐＫＴ２４８ＤＮＡを例１で述べたようにコンピテ ント大腸菌にトランスホームした。大腸菌ＪＭ１０１、　ｈｓｄＳ　ｒｅｃＡの トランスホーマントをストレプトマイシン耐性（Ｓｓ”）で選択し、かつクロラ ムフェニコール感受性（Ｃ＋ｍｓ）で逆選択した。５０００個の５ＩＩＲＣＩｎ Ｓクローンが得られた。大腸菌宿主中に得られた２つのＭ−１遺伝子ライブラリ ーのレプリカをプレートにとり、例１で述べたように脂質分解活性についてスク リーニングした。１３０００個の組換えトランスホーマントのいずれもリパーゼ 活性を示さなかった。 それゆえ大腸菌からＰ、アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　Ｐ　Ａ　Ｏ２３ ０２（６−１）へのそのクローンの転移を以下のように行った。組換えプラスミ ドは、供与株を受容株（ＰＡ００２３０２／６−１）及びヘルパー株（ｐＲＫ２ ０１３プラスミドを宿す大腸菌？ＩＣ１０６１又はＤＨ１）の下地にレプリカを とることによりシュードモナス受容株に転移させた。供与株、受容株及びヘルパ ー株を、ノ＼−トインフユージョン寒天プレート上で一晩増殖させた後、０．２ ％クエン酸塩、メチオニン（１０μｇ　／　ｖａ　Ｉｔ　）及びストレプトマイ シン又はテトラサイクリンを含む最小寒天培地にレプリカをとることによるエク スコンシュカントを選択した。 クエン酸塩は大腸菌によって代謝されない。組換えプラスミドを有するリパーゼ 欠損変異体のリエ発現型の保は、クーカー（Ｋｏｕｋｅｒ）及びジャガー（Ｊａ ｅｇｅｒ）が報告しているように（アプライド・アンド・エンバイロメンタル・ マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　５３ 　（１９８７）　２１１−２１３）そのＰ、アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ）のエクスコンシュカントのレプリカをトリオレオイルグリセロール及び蛍光色 素ローダミンＢを含む栄養寒天培地にとることによりテストした。 １３０００個のスクリーニングを行ったエクスコンシュガントのうちの４個は、 ３７℃、４０時間のインキュベーション後、細菌コマニーの周辺に３６０ｎｏ＋ の光で可視光を発するオレンジの蛍光性ハローを発現することで確認されるリパ ーゼ活性を示した。 これらのポジティブクローンのうちの１つ、ｐＡＬＭ５を選んでさらに特性を調 べた。 、最後に、ｐＡＬＭ５を宿ずｐＡ０２３０２／６−１エクスコンシユガントによ り生産されるリパーゼがＰ、シュードアル力リゲンス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ）　Ｍ　−１株由来のリパーゼが示す望ましい特性を有することを 確認するため、酵素サンプルを調製し生化る）を行った。これらのテストで得ら れた結果は、ｐＡＬＭ５クローンにより生産された酵素の脂質分解活性は、親株 のＭ−１に由来する酵素と同じ特性を存していた。 例４ シュードモナスシュードアル力リゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄ ｏ−ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｍ　−１リパーゼ遺伝子の分子クローニングＡ 、タンパク質の精製及び配列決定 シュードモナスシュードアル力リゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄ ｏ−ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｍ　−１株の凍結乾燥上清の醗酵及び調製は、 ＢＰ−Ａ−０２１８２７２に述べられている。脂質分解性酵素は基本的にウィン ゲルダ−（Ｗｉｎｇｅｒｄｅｒ）等（アプライドマイクロバイオロジーアンドバ イオテクノロジー（Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ 、）叢７　（１９８７）１３９−１４５）の方法に従がい、この上清から精製し た。精製後のこのタンパク質調製物はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動と つづくコマージブリリアントブルー染色による検定で８０％以上の純度を有して いた（第１０図参照）。 Ｎ−末端配列分析は、マツダイラ（Ｍａｔｕｄａｉｒａ）　（ジャーナル・オブ ・バイオロジカル・ケミトリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）１工１（１９ ８７）１００３５−１００３８）の方法に従がいＳＤＳゲル電気泳動及びイムモ ビロントランスファーメンブレン（ミリボア社）へのエレクトロブロッティング 後に行った。この分析は以下の配列を示した（簡便な１文字アミノ酸コードを使 用している）。 ＧＬＦＧＳＴＧＹＴＫＴＫＹＰ　Ｉ　ＶＬＴＨＧＭＬＧＦｌ　１０　２０ Ｂ、Ｍ−１リパーゼ遺伝子のクローニング２つの３２７−の合成オリゴヌクレオ チド５　’　ＡＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＧ　ＡＣＣＡＡＧ　ＴＡＣＣＣＣＡ ＴＣＧＴ−３’及び５　’　ＡＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＧ　ＡＣＣＡＡＧ　 ＴＡＣＣＣＧ　ＡＴＣＧＴ−３’は、Ｐ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ）のコドン選択性及び遺伝子コードの縮重を考慮し、先に述べた成熟リパー ゼタンパク質のＮ末端配列のアミノ酸６番−１５番（ＴＧＹＴＫＴＫＹＰ　Ｉ） から誘導した。ハイブリダイゼーションプローブとして使用するため、このオリ ゴヌクレオチドはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端ラベルした。 染色体ＤＮＡをアンドレオリ　（Ａｎｄｒｅｏｌ　ｉ）の方法（モレキュラー・ アンド・ゼネラル・ジエネテイクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）１９ ９　（１９８５）３７２−３８０）に従かいシュードモナスシュードアル力リゲ ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）Ｍ　− １株（ＣＢＳ４７３．８５＞から単離し、いくつかの制限エンドヌクレアーゼで 消化した後、０．８％アガロースゲルで分離した。プローブとして放射性ラベル した３２マーのオリゴヌクレオチドを用いたこれらのゲルのサウザンプロット分 析は、以下に示す独特のハイブリダイズするＤＮＡバンドを示した：　１．８ｋ ｂ　ＢｃｌＩ。 ２．０ｋｂＰｖｕＩＩ及び１．７ｋｂＳａ１１．それゆえＭ−１染色体ＤＮＡを これら三種の制限エンドヌクレアーゼで別々に消化し、０．８％アカ１−スゲル ミ気泳動で分画したのち、上述の）１イブリダイズした両分を、シレイチ−？　 −（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）及びシュル（Ｓｃｈｕｌｌ）社から市販されている バイオトラップＢＴ１００Ｏ装置での電気溶出により回収した。 １、８　ｋｂのＢｃｌＩ消化画分をＢａｍＨＩ切断後脱リン酸化したベクターｐ ＴＺ１８Ｒ／１９Ｒ（ファルマシアから市販されている、ウォーデン、オランダ ）にライゲーションした。２．０ｋｂのＰｖｕｌＩ消化画分はＳｍａＩ切断後脱 リン酸化したベクターｐＴＺ１８Ｒ／１９Ｒにライゲーションした。１．７　ｋ ｂの５ａｌＩ切断画分は、５ａｌＩ切断後脱リン酸化したベクターｐＺＴ１８Ｒ ／１９Ｒにライゲーションした。これら三つのライゲーション物質を大腸菌Ｊ　 Ｍ　１０１　ｈｓｄＳ　ｒｅｃＡのコンピテント細胞（アンドレオリ（Ａｎｄｒ ｅｏｌｉ）により報告されている、上述）にトランスホームレ、アンピシリン、 Ｘ−ｇｅｌ（５−ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ ド）及びＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含むル リア培地寒天プレートにブレーティングした。 新鮮な寒天プレート上に約４０００個の白色コロニーをピックアップし、放射性 ラベルした３２７−のオリゴヌクレオチドへのコロニーハイブリダイゼーション によりスクリーニングした。この方法により１２個のポジティブコロニーが得ら れた。これらのポジティブコロニーのそれぞれからアルカリ分解法によりプラス ミドミニプレフプを調製し、業者の説明書に従って適当な制限エンドヌクレアー ゼで消化した。６個のプラスミドは期待されるハイブリダイズ挿入物を含んでい た。ｐＴＭＰｖ１８Ａと命名された２、０ｋｂ　ＰｖｕＩ＋断片のみを含むプラ スミドの１つをさらに詳細に分析するために選んだ。プラスミドｐＴＭＰν１８ Ａを宿す大腸菌ＪＭ１０１罫Ｓ工Ａのサンプルを、ＣＢＳＬ４２．８９として、 １９８９．３月８日ＣＢＳに登録した。 上記のようにして得た大腸菌のｐＴＺｌ　８Ｒ／１９Ｒ組換えトランスホーマン トのレプリカをとり、例２で述べたように脂質分解活性でスクリーニングにた。 試験した５Ｘ１０’個の大腸菌トランスホーマントのうちのいずれも脂質分解活 性を示さなかった。 この失敗のいくつかの理由としては以下のものが考えられる。ａ）Ｍ−１リパー ゼ遺伝子の遺伝子発現開始シグナルが大腸菌の転写／翻訳システムに認識されな い（例えばジーンズ（Ｊｅｅｎｅｓ）等、モレキュラー・アンド・ゼネラル・ジ ェネティクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。 Ｇｅｎｅｔ、）２０３　（１９８６）４２１　４２９参照）、ｂ）このＭ−１リ パーゼ遺伝子に関しては調節配列又は調節タンパク質を変える必要性がある。　 ｃ）大腸菌中ではＭ−１リパーゼの適正な折りたたみ又は分泌がうまく行なわれ ない。 Ｃ，Ｍ−１リパーゼ遺伝子の特性及び配列決定プラスミドｐＴＭＰｖ１８Ａを６ ｂｐの認識配列をもつい（つかｐＴＭＰｖ１８Ａの２．Ｏｋｂ　ＰｖｕＩ［挿入 物の予備的制限エンドヌクレアーゼ切断地図を作ることができた。この地図を第 １１図に示す。 使用したｐＴ２１８／１９ＲベクターはＤＮＡクローニング、ジデオキシＤＮＡ シーケンシング、インビトロ突然変異誘発及びインビトロ転写を可能にする多目 的性′オールワンシステム”を提供した（ミード（Ｍｅａｄ）等、プロティンエ ンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）土（１９８６）６ ７−７４）、二本鎖プラスミドはファルマシアから入手できるヘルパーファージ ）１１３ＫＯ７を用いた重感染により一本鎖ＤＮＡに転換した。ｐＴＭＰｖ１８ ＡのＸｈｏｌ及びＥｃｏＲＶ部位間の０．９４ｋｂＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を第 １２図に示す。全ての可能な読み枠で翻訳されたとき、このＤＮＡ配列は直接的 アミノ酸配列決定で決定されたように、リパーゼタンパク質のＮＨ，末端アミノ 酸残基（残基１−２４）を含・む大きな読み枠を持つことを明らかにした（本例 のＡ参照）。 位置−２４のメチオニンは、バクテリアのシグナルペプチドに典型的な一連のア ミノ酸に先行することからタンパク質前駆体の開始コドンである（フォンヘイン （Ｖｏｎ　Ｈｅｙｎｅ）、ジャーナル・オプ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ 、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）上９２（１９８６）２８７−２９０）、２４個のア ミノ酸からなるこのシグナルペプチドは、分泌プロセルの際にＡＥＡ（−３〜− １）シグナルペプチダーゼ認識シグナルの後ろで切り離される。このシグナル配 列のシスティン残基の回りの領域は脂質タンパク質コンセンサスシグナルペプチ ド（フォノへイン（Ｖａｎ　Ｉ（ｅｙｎｅ）、同上）に非常に似ていることが注 目される。 このＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列は、成熟Ｍ−１リパーゼはＴＧＡ終 止コドンで終わる２８９個のアミノ酸から成ることを示している（第１２図参照 ）、この成熟タンパク質の予想分子量は３０，３２３であり、これはＳＤＳポリ アクリルアミドゲル電気泳動によりＭ−１リパーゼについて測定された分子量（ ＭＷ３１５００）と非常によく一致している（第１０図参照）。 例５ シュードモナスアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） 　Ｐ　Ａ　Ｏリパーゼ遺伝子の分子クローニング シュードモナスアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） のリパーゼは分子量約２９０００の脂質加水分解酵素（ＥＣ３，］、１．３）で あり、これは後期対数増殖期に培地中に分泌される（スチュア（Ｓｔｕｅｒ）等 、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ）土工主（ １９８６）１０７０−１０７４）。 Ａ、クローニング及び特性 シュードモナスアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） 　Ｐ　Ａ　０１株（ＡＴＣＣ１５６９２）のリパーゼ遺伝子をクローニングする ため、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ＋ｎｏｎａｃｅａｅ）の種々の突然変異株 に対する相補性により直接遺伝子バンクをスクリーニングし得る広域宿主クロー ニングシステムを使用した。広域宿主ベクターとしてｐＫ７２４８（バグダサリ アン（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）上６　（１９８１）２ ３７−２４７）を用いた。これはストレプトマイシン及びクロラムフェニコール 耐性を有する転移性Ｒ３００Ｂ由来の広域宿主プラスミドである。 シュードモナスアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） 　Ｐ　Ａ　０１　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ａ１１で部分分解し、ｐＫ ７２４８ベクターの単一の５ａｉ１部位にライゲーションした。挿入物二ベクタ ーの比を５：１としベクター−ベクターライゲーシッンの可能性を減少させた。 ライゲーションしたＰＡＯ／ｐＫＴ２４８ＤＮＡは、例ＩＢで述べたように大腸 菌５Ｋ１１０Ｂコンピテント細胞にトランスホームした（トノパン（Ｄｏｎｏｖ ａｎ）及びクシュナ−（Ｋｕｓｈｎｅｒ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）２ｊ　（１９８ ３）３９−４８）。 大腸菌Ｓ　Ｋ　１．１０８のトランスホーマントをストレプトマイシン耐性（Ｓ ｍ”）で選択し、かつクロラムフェニコール惑受性（Ｃｍｓ）で逆選択した。 ６０００個の５ＩｌｌＣＩｌｓクローンが得られ、それらを例２で述べたように 脂質分解活性でスクリーニングした。おそらく大腸菌中ではシュードモナス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のプロモーターがよく認識されないため、これらのクロ ーンのいずれもその活性を示さなかった（ジーンズ（Ｊｅｅｎｅｓ）等、上述） 。 それゆえ、そのクローンの、大腸菌からシェードモナスアルギノサ（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　Ｐ　Ａ　Ｏ２３０２リパ一ゼ欠損変異 株６−１　（ウォルファース（Ｗｏｈ　１　ｆ　ａｒ　ｔｈ）及びウィンクラ− （Ｗｉｎｋｌｅｒ）　、ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー　 （Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌ、）　１３４　（１９８８）　４３３− ４４０）への転移を以下のように行った。６０００個のクローンを各々５０個づ つから成る１２０のグループに分けた。各グループからフラスミＹｔＡ製物を作 り、ＰＡＯ２３０２（６−１）　１ｉｐ−変異体のコンピテント細胞へのトラン スホームに用いた。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ＋５ｏｎａｓ）のコンピテン ト細胞の調製はオルセン（Ｏｌｓｅｎ）等（ジャーナル・オブ・バクテリオロジ −（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１５０（１９８２）６０−６９）に従った。 選択はストレプトマイシン（５０μｓ／ａｆ）を補ったカルシウムトリオレイン （ＣＴ）寒天プレート（つｔシフ１−ス（ｊｌｏｈｌｆａｒｔｈ）及びウィンク ラ−（Ｗｔｎｋｌｅｒ）　、上述）で行った。スクリーニングした５０００個の ＰＡ○トランスホーマントのうちの１０個がコロニー先端の白色結晶によって確 認されるリパーゼ活性を示した。さらに特性を明らかにするため、これらのポジ ティブＰＡＯ）ランスホーマントのうちの個、ｐ　Ｓ　Ｗ　１を選んだ。 これに含まれるプラスミドを、制限分析及びアガロースゲル電気泳動により特性 を調べてみると、１．３　ｋｂ、０．９７ｋｂ及び０．７６ｋｂの５ａｌｌサブ フラグメントからなる３、Ｉｋｂの３ａｌｌ挿入物を含むことが分った。ＤＮＡ 配列決定及びリパーゼ遺伝子の発現を行うため、これらの挿入物を適当なベクタ ーにサブクローン化した。 ｐｓＷ１０３と命名したｐＵｃ１９由来のサブクローンのプラスミドＤＮＡ　（ １，３ｋｂ及び０．９７ｋｂ挿入物を含む）を単離し、制限エンドヌクレアーゼ で分析した。このプラスミドｐｓＷ１０３の物理地図を第４３図に示す。プラス ミドｐｓＷ１０３を宿す大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　ｈｓｄＳ　ｒｅｃＡのサンプル を、第１４１．８９号として、１９８９年、３月８日ＯＢＳに登録した。 Ｂ、シュードモナスアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓ ａ）　ＰＡＯＩリパーゼ遺伝子の配列決定と特性 ＰＡＯＩリパーゼ遺伝子を含むｐｓＷ１０３の２．３　ｋｂＳ　ａｌ　ｌ挿入物 を２つの操作で配列決定した：バクテリオファージＭ１３誘導体ｍｐ１８及びｍ ｐ１９（ヤニシューペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、ジーン（Ｇｅ ｎｅ）３３　（１９８５）１０３−１１９）を用いたデニンガ−（Ｄｅｉｎｉｎ ｇｅｒ）の“強制”クローニング配列決定法あるいは“ショットガン“クローニ ング配列決定法（アナリティカル・バイオケミストリー　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、）　１２９　（１９８３）　２１６−２２３）及びミズサワ　（Ｍｉ ｚｕｓａｗａ）等のジデオキシチェーンターミネーション技術（ヌクレイックア シッズリサーチ　（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ、）１４　（１９８６）１３ １９−１３２４）。 “強制“クローニング配列決定操作では、ｐｓＷ１０３の２．３ｋｂ挿入物の５ ａｌＩ／ＰｓｔＩ及びＳ　ａｌ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩ断片を精製し、適当なＭ１ ３ｍｐ１８ベクターにライゲーションした。得られたＤＮＡ配列の断片を継ぎ合 せることにより全ＤＮＡ配列を確定した。全んどのＤＮＡ配列は両鎮について測 定した。全ての可能な読み枠で翻訳されたとき、このＤＮＡ配列は、ｐｓＷ１０ ３の０、９７　ｋｂｓａｌ　Ｉ断片のみが（第１４図参照）成熟ＰＡＯ１リパー ゼをコードしていることを明らかにした。 ｐＳＷ１０３サブクローンの１．３　ｋｂｓ　ａｌ　Ｉ断片は、全ての可能な読 み枠で翻訳してみた時も、直接的アミノ酸配列決定で測定されたようなＰＡＯ１ リパーゼタンパク質の２４個のＮ末端アミノ酸残基をコードしていなかった。 ０、９７　ｋｂの３ａｌＩ断片のＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列は、１ 個の興味あるドメインを示している（第１４画人で示しである）。 、ドメインＡは真核性リパーゼ（ライオン（Ｗｉｏｎ）等、サイエンス　（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ）２３５　（１９８７）１６３８−１６４１）　、ボドマ−（Ｂｏｄ ｍｅｒ）等、バイオケム・バイオロジー・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）９０９　（１９８７）　２３７−２４４）及び原 核性リパーゼ（クギミャ（１（ｕｇｉｍ　１ｙａ）等、バイオケム・バイオロジ ー・すでに決定されているアミノ酸配列Ｇ−Ｈ−Ｓ−Ｈ−Ｇをコードしている。 例６ Ａ、バクテリアにおけるクローン化したＭ−１リパーゼの発現異種宿主における Ｍ−１リパーゼの発現レベルを向上させるため、Ｍ−１リパーゼ遺伝子を含むｐ ＴＭＰｖ１８Ａの２．０　ｋｂＫ　ｐｎ　ｌ−ＨｌｎｄＩＩ［断片をＫｐｎｌ及 びＨｉｎｄＩＩ［で消化したｐＢＨＡ／Ｃｌベクターにライゲーションした。ｐ ＢＨＡ１ベクターのヌクレオチド配列はＥＰ−Ａ−０２７５５９８に述べられて いる。以下の抗生物質耐性遺伝子の発現が異なること以外はｐＢＨｃ１ベクター とｐＢＨＡ１ベクターは同じである：クロラムフエニコールアセチルトランスフ エラーゼ遺伝子はｐＢＨｃ１ベクターを宿す大腸菌ＷＫ６株中で発現し、またβ −ラクタマーゼ遺伝子はｐＢＨＡ１ベクターを宿す大腸菌ＷＫ６株中で発現する 。大腸菌ＷＫ６株についてはＲ，ゲル（Ｚｅｌｌ）及びＨ，Ｊ、フリフッ（Ｆｒ ｉ　ｔｚ）によッテ報告されテイル（ＥＭＢＯＪ、６　（１９８７）　１８０９ ）。 ＷＫ６株のトランスホーメーション及び得られたアンピシリン（ｐＢＨＡｌの場 合）及びクロラムフェニコール（ｐＢＨｃｌの場合）耐性コロニーの分析の結果 各々プラスミドｐＢＨＡＭ−１及びｐＢＨＣＨ−１が検出された（第１５図参照 ）。 次のステップはＭ−１前駆体タンパク質のＡＴＧ開始コドンへのＨｄｅｌ制限エ ンドヌクレアーゼ部位の導入である。スタンセンス（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ）等じ タンパク質工学及び部位指定突然変異誘発”、２４回ハーダー（Ｈａｒｄｅｒ） 会議、１９８５、Ａ、Ｒ，ファースト（Ｆｅｅｒｓｈｔ）及びＧ、ウィンター（ Ｗｉｎｔｅｒ）　Ｗ）の方法に従がいｐＢＨＡ／ＣＭ−１プラスミドの部位指定 突然変異誘発を行った。 突然変異誘発後、制限酵素分析及びミヅザワ（Ｍｉｚｕｓａｗａ）等のジデオキ シ法を用いた配列分析により（例５参照）関連する突然変異を有する潜在的変異 体のチェックを行った。これらの分析後、ｐＢＨＡＭＩＮｌと命名した適正なプ ラスミドを発見した（第１６図参照）、大腸菌中でのＭ−１リパーゼの発現を調 節するため、Ｍ−１リパーゼ構造遺伝子を含むｐＢＨＡＭＩＮＩの１．７　ｋｂ Ｈｄｅｌ　Ｈｉｎｄ　ｍ断片を単離し、２つの発現ベクターにライゲーションし た。 −ｐＴＺ１８ＲＮ：β−ガラクトシダーゼのＡＴＧ開始コドンに単一のＮｄｅＩ 部位を含むｐＴＺ１８Ｒ誘導体（ミード（Ｍｅａｄ）等、タンパク質工学（Ｐｒ ｏｔｅｉｎ　［Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）土（１９８６）６？−７４）。 −ｐＭＣＴＮ：　ｔａｃプロモーター及びリボゾーム結合部位の後に単一のＮｄ ｅＩ部位を含むｐＭＣ誘導体（スタンセンス（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ）等、上述） 。 ２つのライゲーション調製物を大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　ｈｓｄＳ　ｒｅｃＡのコ ンピテント細胞にトランスホーメーションした後、このトランスホーマントを０ ．５ｍＭ　Ｉ　ＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を含むト リブチリン寒天プレートを用Ｇ）脂質分解活性でスクリーニングした。これらの トリブチリンプレートの３０℃４８時間のインキュベーションとそれにつづく数 日間の冷蔵庫保存の後、いくつかのコロニーが脂質分解活性を示す淡０７１０− を形成した。これらのトリブチリンポジティブクローンのプラスミドの特性を制 限酵素分析で調べた請求めていた２つのプラスミドが発見された： ｐＴＺＮＩＭｌ　＋　Ｉａｃコントロール配列の後にＭ−１リノ（−ゼ遺伝子を 有する（第１７図参照）、 −ｐＭｃＴＭｌ　：　ｔａｃコントロール配列の後にＭ−１リノず一ゼ遺伝子を 有する（第１８図参照）。 プラスミドｐＴＺＮＩＭ−１及びｐＭＣＴＭ−１をそれぞれ宿す大腸菌トランス ホーマントによって生産される脂質分解活性を同定するため、これらのクローン を３０℃で一晩、１００ｍｊ！の２ＴＹ培地（１６ｇ／ｌバクトドリプトン、１ ０ｇ７１）くクトイーストエキストラクト、５ｇ／１ｌＮａｃ１、ｐＨ７，０＞ 中で増殖させ、ついで０．５ｍＭ　ＩＰＴＧを用い、３０℃３時間の誘導を行つ た。ネガ１イブコントロ・−ルとしてはｐＴＺ１８ＲＮを宿す大腸菌Ｊ　Ｍ　１ ０１ｈｓｄＳμにへ株を用いた。細胞を遠心により培養上清を分離した後、テラ アキ（Ｔｅｔｕａｋｉ）等（アプライド・エンバイロメンタル・マイクロバイオ ロジー（Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖ、　Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌ、）　５０（１９８５）２ ９８−３０３）の方法に従がいペリプラズマ及び膜／細胞質成分に分画した。各 両分は、レムリ　（Ｌａｅｍ＊１ｉ）の方法に従かい（ネイチ＋　（Ｎａｔｕｒ ｅ）　２２７　（１９７０）　６８０−６８５）１３％の分離ゲル及び５％のス タンキングゲルから成るＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析した。電気泳動は ブロモフェノールプル（ＢＰＢ）マーカー色素がゲルの底に到達するまで６０ｍ Ａで運転した。サンプル調製及びタンパク質プロッティング操作はＥＰ−Ａ−０ ２５３４５５に述べられているように行った。ウェスタンプロット分析には、Ｐ 、シェードアルカリゲンス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｍ　−１ 株由来の精製リパーゼに対する多価ウサギ抗血清を用いた。第１９図に示した結 果から、各々ｐＴＺＮＩＭ１及びｐＭＣＴＭｌを宿す大腸菌はＭ−１リパーゼ特 異的３１．５ｋＤａポリペプチドを合成し、かつ細胞周辺腔に分泌し得ると結論 される（第１９図、レーンＢ及びＣ参照）、この３１．５ｋＤａポリペプチドの 脂質分解活性は例ＩＣで述べたβ−ナフチルアセテート／ファーストブルーＢＢ 塩法に基づく軟寒天重層技術により確認した。 ＥＰ−Ａ−０２７５５９８及びＥＰ−Ａ−０２５３４５５は目的遺伝子を含むベ ビクルをバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に効率的に転移し、望ましいポリペプチ ド産物を効率的に分泌するバチルス（Ｂａｃｉｌ　Ｉｕｓ）株を得るための方法 を公開している。この方法はＴｈａｉＴＶ　１７−１及びＭ−１リパーゼ遺伝子 の両方に用いた。 Ｍ−１リパーゼ遺伝子の場合、ｐＢＨＡＭＩＮ１ブラスミド（上述）をＮｄｅｌ で消化し、再結合した。このライゲーション混合物をバチルスリチェニホルミス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌ１ｃｈｅｎｉｆｏｒ＋＋１ｓ）Ｔ９のプロトプラストに トランスホームした。多くのネオマイシン耐性トリブチリンポジティブコロニー を分析し、適正なプラスミドを得た。このプラスミドはｐＵＢｌｌｏのＨｐａＩ Ｉプロモーター（ジブリアン（Ｚｙｐｒｉａｎ）及びマツバラ（Ｍａ　Ｌｕｂａ ｒａ）、ＤＮＡ　５（１９８６）２１９−２２５参照）の後ろにＭ−１の前駆体 タンパク質を含んでおりｐＢＨＭＩＮｌと命名された（第２０図参照）。 プラスミドｐＢＨＭＩＮ１を宿すＴ９）ランスホーマントを例２で述べた方法に 従かい工業用培地中での醗酵の後β−ナフチルエステルの加水分解能についてテ ストした。その結果は、このＴ９クローンによって生産される酵素の脂質分解活 性が親株のシュードモナスシュードアル力リゲンスＣＰｓｅｕｄｏｔａｏｎａｓ 　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅ−ｎｅｓ）Ｍ　１株のリパーゼと同様の特性で あることを示した。 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）宿主における発現については、シュ ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）特異的バクテリオファージＰｔ３のｐ７ ８遺伝子の構成プロモーターを用いた（Ｒ，Ｇ、Ｍ、ルイテン（Ｌｕｉｔｅｎ） 　“繊維状バクテリオファージ”Ｐｆ３：分子遺伝学的研究”、ＰｈＤセシス（ Ｔｈｅｓｉｓ）　、１９８７、ニメゲンカソリック大学、オランダ）、このＰｆ ３プロモーターをコードする合成りＮＡ断片： ＴＣＴＡＧＧＴＧＣＡＴＣＴＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣ３’ＡＧＡＴＣ ＣＡＣにＴＡＧＡＣＴＴＡＣＣＴＣＧＡＧＣ５’を合成した。 この断片をＥｃｏＲＩ及びＫｐｎｌで切断したベクターｐＴＺ１８Ｈにライゲー ションし、プラスミドｐＴＺＰｆ３１Ａを作った。 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）中でクローン化したＭ−１リパーゼ 遺伝子を発現させるため、ｐＴＭＰｖｌ　８Ａ、ｐＭｃＴＭｌ、及びｐＴＺＰｆ ３ＭＩ中に存在するＭ−１発現カセントを広域宿主ベクターｐＫＴ２３１　（バ グダサリオン（Ｂａｇｄａｓａｒｉｏｎ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）１６　（１９ ８１）２３７　２４７）　、ｐＬＡＦＲ３（スタスカウィス（Ｓｔａｓｋａｗｉ ｓｚ）等、ジャーナル・オブ・バクテ（１９８７）２７５−２８０）に挿入した 。Ｍ−１発現カセントを宿す広域宿主プラスミドをフリートマン（Ｆｒｉｅｄｍ ａｎ）等、（ジーン（Ｇｅｎｅ）１８　（１９８２）２８９　２９６）の二組交 配操作に従がい、次のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株に転移させ た。 −Ｐ、アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　Ｐ　Ａ　Ｏ２３０２株のリパーゼ 欠損変異株６−１　（ウォルファース（Ｗｏｈｌｆａｒｔｈ）及びウィンクラ− ０１ｉｎｋｌｅｒ））。 一すパーゼ欠損Ｐ、プチダ（ｐｕｔｉｄａ）　Ｋ　Ｔ　２４４２株（ゼヤー（Ｚ ｅｙｅｒ）等、アプライド・エンバイロメンタルマイクロバイオローＰ、　シュ ードアルカリゲンス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｍ　−１株（Ｃ ＢＳ４７３．８５）。 −Ｐ、シュードアル力リゲンス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｉ　 Ｎ　ｌｌ−５株（ＣＢＳ４６８．８５）。 ミドの転移の別の操作法としてシーンパルサー（バイオラドラボラトリ−社）の 使用マニュアルに従かう電場によるトランスホーマントョ７（’エレクトロポレ ーション”）を使用した。 得られたシュードモナス（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａＳ）のトランスホーマントのリ パーゼ生産テストをオデラ（Ｏｄｅｒａ）等（ジャーナル・オブ・ファーメンタ ）Ｌｔ−テクノロジー（Ｊ、　Ｆｅｒ＋ｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、）　６４ （１９８６）３６３−３７１＞により報告されているオリーブ油培地中の発酵後 行った。 以下の第２表では種々の株の脂質分解活性生産性を示した。 第２表 特定のトランスホームを受けたＭ−１リパーゼ遺伝子を含むシュードモナス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株のリパーゼ生産性”　脂質分解活性は例２で述べた方 法を用い、培養上清につ０て測定した。 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のトランスホーマントによって生産 されるリパーゼをＳＤＳ・ゲル電気泳動で分析してみると、本来のＰ、シュード アルカリゲンス（ｐｓｅｕｄｏａｌｅｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｍ　１株によって 生産されるリパーゼと同じ移動度を示した。 Ｐ、シュードアル力リゲンス（ｐｓｅｕｄｏａｌｅｃａｌｉｇｅｎｅｓ）中にＭ −１発現カセントを多数導入することにより供与株によって生産されるリパーゼ レベルと比較すると２〜４倍の向上が見られる。さらにＭ−１リパーゼ遺伝子の 本来の遺伝子発現開始シグナル又はプロモーターは、ＰＡＯＩ株及びＫＴ２４４ ２株とは対照的にシュードモナスシュードアル力リゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉ−ｇｅｎｅｓ）において活性をもつと結論する ことができる。 Ｂ、クローン化したＭ−１リパーゼ遺伝子のインビトロでの発現Ｍ−１リパーゼ を含むクローンのインビトロでの発現は真核性ＤＮＡ依存翻訳キット（アマージ ャムインターナショナル社）を用いて行った。このシステムはもし関連するコン トロールシグナルが存在するなら、そのバクテリアプラスミド上の遺伝子のイン ビトロの発現を可能にする。以下の４つのバクテリアプラスミドについて分析し た。 Ｂ、１．　Ｍ−１リパーゼ及びβ−ラクタマーゼ遺伝子産物をコードし、かつア ンピシリン（Ａｐ）耐性を付与するプラスミドｐＴＭＰｖ１８Ａ（第１１図参照 ）、さらにｐＴＭＰｖ１８Ａは自分自身の調節シグナル、プロモーター、シャイ ン・ダルガルノ配列及びリーダー配列を存している。 Ｂ、２．Ｍ−１リパーゼ遺伝子及びクロラムフェニルコール耐性遺伝子（Ｃｍ） を存するプラスミドＩ）ＭＣＴＭＩ　＜第１８図参照）。 この構築物の場合リパーゼプロモーターは強力なｔａｃプロモーターに交換して いる。 Ｂ、３．　プラスミドＩＩ）ＭＣＴｂ　１　ｉＭｌもＭ−１リパーゼ遺伝子及び クロラムフェニコール耐性遺伝子を有している。この構築物の場合、リバーゼシ クナル配列はα−アミラーゼシグナル配列に交換されている（ＢＰ−Ａ−０２２ ４２９４参照）。プロモーターは構築物ｐＭｃＴＭ１と同じである。 Ｂ、４．　プラスミドｐＴＺ１８ＲＮはネガティブコントロールとして使用した （第１７図参照）。 上述したプラスミドのＤＮＡ（０，５！ｇ）をインビトロで転写した。この反応 は０．５　ｐ　ｊ！の１０　ｘＴＢ／１０　ｘＮＴＰミックス（２０ｘＴＢ及び ２０ＸＮＴＰの等景況合物；　２０　ｘＴＢは８００ｍＭ）リス−ＨＣ１，ｐＨ １，５，１２０＋ｗＭ　ＭｇＣ７！　、及び４０ｗ１Ｍスペルミジン；２０ＸＮ ＴＰミツクスには１０＋ａＭ　ＡＴＰ、　１０ｍＭ　ＣＴＰ、１０謡Ｍ　ＧＴＰ 及び１０閣Ｍ　ＵＴＰ）、０．５μｌの０．ＩＭＤＴＴ、０．５．１７１のＲＮ ａｓｉｎ　（４０ｕ／μ＃、プロメガ社）及び０．５　ｐ　ＩｌのＴ７ＲＮＡポ リメラーゼ（１５ｕ／、ｃ＋ｌ。 プロメガ社）又は１μＥの大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ（１ｕ／μＥ゛、ベーリン ガー社）を加えることにより行った。この反応混合物を３９．５℃で１時間イン キュベーションした。 ＲＮＡ転写物のインビトロでの翻訳は業者の説明書に従って行った。Ｍ−１リパ ーゼはヴアンモリク（Ｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋ）　（ジャーナル・オブ・バイオロ ジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　２６０（１９８５） １１３００−１１３０６）の方法に従かいＭ−１１７バーゼに対するモノクロー ナル抗体を用いて免疫沈殿化した。 ネガティブコントロールとしてはｐＴＺ１８ＲＮを使用した（第２１図、レーン Ａ及びＥ）−ｐＴＭＰｖ１８Ａの免疫沈殿化（レーンＢ）はプロセシングを受け ていない３４ｋＤａＭ−１！Ｊバーゼを示した。ｐＭｃＴＭ−１の免疫沈殿化（ レーンＣ）ではプロセシングを受けていない３４ｋＤａのＭ−１１Ｊバーゼ及び ３１、５　ｋ　Ｄ　ａの成熟Ｍ−１リパーゼが示された。一方ｐＭｃＴｂｌｉＭ １の免疫沈殿化（レーンＤ）は３１．５　ｋ　Ｄの成熟Ｍ−１１Ｊバーゼを示し た。このインビトロでの翻訳実験からＭ−１リパーゼ遺伝子は大腸菌の５−３０ 抽出物中で発現し得ると結論できる。ｐＴＭＰｖ１８Ａのインビトロ転写／翻訳 実験から得られたデータはＭ−１！Ｊバーゼがプロセシングを受けてない理由か らトリブチリンプレート上で脂質分解活性を示さない事を裏付けた（例４Ｂ参照 ）。 例７ プローブとして特性の明らかなリパーゼ遺伝子を用いた酵素分子のスクリーニン グ さらに本発明の一般的応用性を説明するために、別の微生物に由来する同等の特 性を有するリパーゼ遺伝子の探索に本出願で公開されているプローブを使用した 。ここでは同様又は同等の洗浄応用性を有するリパーゼをコードするリパーゼ遺 伝子を選択し得ることを示した。 例８において我々は本ハイブリダイゼーション技術によって他ゲンス（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｍ　−１（ＣＢ　５ ４７３．８５）＋Ｐ、シュードモナスシュードアル力リゲすスｌＮｌｌ−５（Ｃ ＢＳ４６８．８５）　、Ｐ、　アルカリゲンス（ＤＳＭ５０３４２）、Ｐ。 アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　（ＰＡＣＩ　Ｒ（ＣＢＳ　１３６．８５ ）　Ｐ。 アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ（ＡＴＣＣ１５６９２）　（ウォル ファース（Ｗｏｈｌｆａｒｔｈ）及びウィンクラ−（Ｗｉｎｋｌｅｒ）　、１９ ８８、ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ。 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　１３４．　４３３−４４０）　、Ｐ、スツゼリ（ｓｔ ｕｔｚｅｒｉ）Ｔｈａｉ　ｒＶｌ　？　−１（ＣＢＳ　４６１．８５）　；　Ｐ 、スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＰＧ−Ｉ−３（ＣＢＳ　１３７．８９）、Ｐ、 　スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＰＧ−１−４（ＣＢＳ　１３＆８９）、Ｐ、　 スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＰＧ−ｎ−１１，１（ＣＢＳ　１３９．８９＞、 Ｐ、　スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＰＧ−ｎ−１１，２（ＣＢＳ１４０．８９ ）、Ｐ、フラジ（ｆｒａｇｉ）ＤＢ１０５１．Ｐ、グラジオリ（ｇｌａｄｉｏｒ ｉ）　（ＣＢ　５１７６．８６　）。 アシネトバクタ−カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏ ａｃｅｔｉｃｕｓ）Ｇｒ−Ｖ−３９（ＣＢＳ　４６０．８５）及びスタフイ（１ １−１７カスオーレウス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕａ　ａｕｒｅｕｓ）　（ ＡＴＣＣ２７６６１）の染色体Ｄ　Ｎ　Ａを単離し、その５μｇを消化してから サウザンブロツティング技術で分析した（マニアラス（＆１ａｎｉａｔｉｓ）等 、上述）。そ（７）ＤＮＡをニトロセルロースフィルター（シュレイチャー・ア ンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）社、ＢＡ８５　 ：　０．４５ｒＩＩＭ）に移した。このフィルターを６ｘＳＳＣ１５ｘデンノ１ −ト液、０．５％ＳＤＳ及びｌ　ＯＯｔｔ　ｇ／ｍｌ変性ウシ胸つＤＮＡ中でプ リハイブリダイズした。 ２時間のブレインキュベーション後、各々３２Ｐラベル化したｐＴＭＰｖ１８Ａ 又はｐＥＴ３の挿入物を加え、ハイブリダイゼーションを５５℃、１６時間で行 った。 挿入ＤＮＡｆ！−ＸｈｏＴ及びＥＣ０ＲＶによるｐＴＭＰｖ　１８Ａ及びＥＣ０ ＲＩによるｐＥＴ３の消化によりそれぞれ単離し、その断片を０．８％アガロー スゲル電気泳動で分画した後ガラスミルク操作（シーンクリーン）によりそれら を回収した。ｐＴＭＰｖ１８Ａの挿入物であるｌｋｂ　ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ断 片及びｐＥＴＴ３（Ｄ挿入物である３、　２　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片をα３２Ｐ ＡＴＰを用いたニックトランスレーションによりインビトロで高い放射性をもつ ように（２〜５　Ｘ　１０　’　ｃｐｍ／μｇ）ラベル化した（フエインバーグ （Ｐｅｉｎｂｅｒｇ）及びボゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）、アナリテ イカルバイオケミストリ−（Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）↓３２　（１９８３ ）６−１３）。 プローブ断片は平均３００〜８００塩基長を有することが示された。 それからフィルターを６ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中５５℃で３０分の条件で２ 回洗浄した。フィルターを室温で乾燥後−７０℃で増感スクリーン（クロネック ス、ライティングプラスＧＨ２２００２０）を用いコダックＸ−ｏｍａｔＡＲフ ィルム又はクロネックス４ＮＩ’Ｆ１００Ｘ線フィルム（デュポン）に１〜３日 間露光することによりオートラジオグラフを得た。 ハイブリッドの安定性に関する種々の因子の影響を分析して誘導された以下の式 ％式％ （′分子生物学における最新プロトコール”、１９８７−１９８８、オースベル （Ａｕｓｕｂｅｌ）等線） （式中 ｎ−プローブの最小鎖長 Ｃｉ＝イオン強度（Ｍ） Ｇ＋Ｃ＝塩基組成） を我々の実験で検出された相同性を測定するのに用いた。プローブ長を３００塩 基と仮定すると、３００塩基以上の断片内の少なくとも６７％の相同性を示す遺 伝子を検出し得た。相同性の割合を測定する上でシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ）のＧＣ含量は６５％と仮定した（ノーモア（Ｎｏｒｍｏｒｅ）　、 １９７３．　ラスキン（Ｌａｓｋｉｎ）及びレチェバリア（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉ ｅｒ）　（ｍ）　“微生物学ハンドブック１■巻、ＣＲＣブレス、ポカレイトン 、Ｆ　ｌａ）第２２Ａ図はｐＥＴ３のＥｃｏＲＩをハイブリダイズした場合の染 色体ＤＮＡの３ａｌＩ消化物のハイブリダイゼーションパターンを示している。 全んどのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株はりＥＴ３クローンと相 同的遺伝子を含んでいることが分る。Ｐ、フラジ（ｆｌａｇｉ）ＤＢ１０５１　 （レーンＭ）、Ａ、カルコアセチカス（ｃａ　Ｉｃｏａｃｅｔ　１ｃｕｓ）Ｇｒ −Ｖ−３９（レーン０）及びＳ、オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）　（レーンＰ）の 場合、相同的遺伝子は検出されなかった。Ｐ、アルカリゲンス（ａｌｃａｌｉｇ ｅｎｅｓ）　（レーンＥ）、Ｐ、シュードアル力リゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｍａｌ ｉｇｅｎｅｓ）　（レーンＣ及びレーンＤ）、Ｐ−アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎ ｏｓａ）　（レーンＦ及びレーンＧ）には中程度のハイブリダイゼーションシグ ナルが観察されたが、一方、Ｐ、グラジオリ（ｇｌａｄｉｏｌｉ）　（レーンＮ ）には弱ハイブリダイゼーションシグナルが観察された。非常に強いハイブリダ イゼーションシグナルがＰ。 スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）　（レーンＨ−Ｌ）で見られるがこれはｐＥＴ３ が本来Ｐ、スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）Ｔｈａｉ　ＩＶ　１７−１株に由来す るので驚くべきことではない。 第２２Ｂ図はｐＴＭＰｖ１８ＡのＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ挿入物を用いたときのハ イブリダイゼーションパターンを示している。 強いハイブリダイゼーションシグナルがＰ、シュードアル力リゲンス（ｐｓｕｄ ｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　（レーンＣ及びＤ）、Ｐ、　アルカリゲンス（ａ ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　（レーンＥ）及びＰ、スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ） 株（レーンＨ−Ｌ）由来の染色体ＤＮＡから得られることが分る。 Ｐ、アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の染色体ＤＮＡにはより弱いハイブリ ダイゼーションが見られ（レーンＦ及びＧ）、Ｐ、フラジ（ｆｒａｇｉ）　（レ ーンＭ）、Ｐ、　グラジオリ軸１ａｄｉｏｌｉ）　（レーンＮ）。 Ａ、カルコアセチカス（ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）　Ｇｒ−Ｖ　−３９（レ ーン０）及びＳ、オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）　（レーンＰ）の染色体ＤＮＡに はハイブリダイゼーションは全くみられなかった。 例８ 他の微生物由来の相同的リパーゼ遺伝子のクローニングここに公開した本発明の 応用性を示すため、Ｐ、アルカリゲンス（ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　（Ｄ　Ｓ 　Ｍ　５０３４２　）由来の相同遺伝子をクローニングするためのプラスミドｐ ＴＭＰｖ１８Ａの使用を説明する（第２２Ｂ図レーンＥ参照）。 第２２Ｂ図レーンＥにおいて、Ｐ、アルカリゲンス（ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ） は、プローブとハイブリダイズする明確な５．０ｋｂＳａｌＩ断片及び薄い０． ５ｋｂＳａ１１断片を示すことが分る。このことはＰ、アルカリゲンス（ａ　Ｉ ｃａ　１　ｉｇｅｎｅｓ　）がプラスミドｐＴＭＰｖ１８ＡのＸｈｏ　Ｉ　／　 ＥｃｏＲＶ挿入物に対し、３００以上の塩基対断片内に少なくとも６７％の相同 性を有する遺伝子を含むことを示している。 Ｐ、アルカリゲンス（ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）の５．０　ｋｂ　Ｓａｌ　！断 片がリパーゼをコードする遺伝子を含んでいるかどうかを確めるため、５ａｌＩ 断片をクローン化した。５ａｉｌ遺伝子ライブラリーはベクターｐＵｃ１９を用 いて構築し、大腸菌ＪＭ１０９にトランスホームした（ヤニシューペラン（Ｙａ ｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等・ジーン（Ｇｅｎｅ）■（１９８５）１０３−１１ ９）。 遺伝子ライブラリのレプリカフィルターを例７で述べた条件を用い、ｐＴＭＰｖ １８Ａのα３２Ｐラベル化挿入物とハイブリダイズさせた。５．Ｏｋｈの５ａｌ Ｉ断片を含む３個のポジティブクローンをそのライブラリーから単離した；ｐｃ Ｈｌ、ｐＣＨ２及びｐＣＨ３，ｐｃＨｌの５．　Ｏｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ断片を、ク ロラムフェニコール耐性遺伝子中に存在する５ａｌＩ部位を利用してベクターｐ ＫＴ２４８（バグダサリアン（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ ）土工（１９８１）２３７−２４７）に再クローン化した。大腸菌ＪＭ１０９の ストレプトマイシン耐性クロラムフェニコール感受性トランスホーマントを選択 した９期待される５、Ｏｋｂの５ａｌｌ挿入物を含むこれらのトランスホーマン トのうちの１つ、ｐｃＨｌｏｌをシュードモナスアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　２３０２（６−１）ｌｉｐ−株にトランスホ ームした（例５参照）。 コロニーをＮＢ−カルシウムトリオレイン寒天上で増殖させた。 増殖後このプレートを１０℃で保存した。数日後、トランスホームしたコロニー の回りにカルシウムの沈殿が現れ、また抗生物質を含まない同じ寒天プレート上 で増殖したトランスホームしていないＰ、アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） 　２３０２　（６１）　１ｉｐ−株の回りには現れない、我々はクローン化した ５、０ｋｂＳａｌｌ断片がＰ、アルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）２３０２　 （６１）　Ｉｔｐ−株の］　ｉｐ−発現型を相補し、従って適当な宿主内で生産 され得る細胞外リノく−ゼをコードしていると結論する。 ＤＮＡハイブリダイゼーション実験に基づき、これらのリノ々−ゼはＭ−１リパ ーゼとの相同性を示し、かつ結果的にプローブとして用いられるｐＴＭＰｖ１８ Ａ挿入物とハイブリダイズする他のリパーゼに対しても相同性を示すと結論し得 る。Ｐ、ブルカリゲンス（ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）のリパーゼのクローニング の説明はＭ−１リパーゼに対する相同性を示すリパーゼをクローン化する一般的 な応用方法を表わしている。 例９ シュードモナスシェードアルカリゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄ ｏ−ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｍ　−１由来のリパーゼと他のリパーゼのヌク レオチド配列の比較 シュー・ドモナスシュードアルカリゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕ ｄｏ−ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）のＭ−１リパーゼのヌクレオチド配列（第１２ 図）をシュードモナスフラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ）　（Ｉ　 Ｆ　Ｏ−３４５８）のリパーゼ（クギミャ０［ｕｇｉｗｉｙａ）等、バイオケム ・ノイイオフイズ・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｓ、　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。 Ｃｏ＊ｍ、）１４１　（１９８６）１８５　１９０）　、スタフィロコッカスハ イカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｙｉｃｕｓ）のリパーゼ（ボッ（Ｇ ｏｔｚ）等、ヌクレイフクアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、）１主（１９８５）１８９１−１９０３）及びシェードモナスアルギノサ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　Ｐ　Ａ　Ｏ１のリパーゼ （第１４図）のものと比較した６Ｍ−１リパーゼ及びＰ、アルギノサ（ａｅｒｕ ｇｉ−ｎｏｓａ）　Ｐ　Ａ　Ｏ１リパーゼの間には８１％の高い相同性がみられ 、またＭ−１リパーゼとＰ、フラジ（ｆｒａｇｉ）　（ＩＦＯ−３４５８）の間 には６２％の相同性がみられた。しかし、このＰ、フラジ（ｆｒａｇｉ）のリパ ーゼの配列は他の二つのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ−請ｏｎａｓ）のリパー ゼのものよりかなり短かい０Ｍ−１リノく−ゼとスタフィロコッカスハイカス（ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｙｉｃｕｓ）のりノく一ゼの間には相同性が みられなかった。 これらの結果は、ｐＴＭ　Ｐｖ　１８　Ａをプローブとして使用したときシュー ドモナスフラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ）及びスタフイロコンカ スオーリウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）由来の染色体Ｄ ＮＡにハイブリダイズしないという例７で得られたデータを支持している。 Ｐ、シェードアルカリゲンスＭ−１リパーゼのヌクレオチド配列か・ら誘導され るアミノ酸配列も他のリパーゼと比較した。Ｍ−１リパーゼのＰ、アルギノサ（ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　Ｐ　Ａ　Ｏ１リパ一ゼ間の全体にわたる相同性は７８ ％であり、Ｍ−１リノ々−ゼとＰ、フラジ（ｆｒａｇＤリパーゼ間の相同性は４ ８％であることが分った。 Ｍ−１リパーゼとスタフィロコッカスハイカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｊｃｕｓ）リパーゼのアミノ酸配列の間にも相同性はみられなかった。しか し成熟Ｍ−１リパーゼの重要な８７番セリンの領域においては、この４種のリパ ーゼ間には高い相同性がみられた。クギミャ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ）等は、この領 域Ｇ−Ｈ−３−Ｈ−Ｇの配列がリパーゼ酵素の活性中心であると提唱した。 例１１ ０５Ｌテストにおける相同的リパーゼの洗剤適合性この例は現代の洗濯用洗剤中 のこれらの酵素の適合性をテストするＳＬＭテスト修正法に従がい、洗浄プロセ スにおける、Ｍ−１遺伝子と高いＤＮＡ配列相同性を示す、Ｐ、アルギノサ（ａ ｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　、Ｐ、スツゼリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）及びＰ、アルカリ ゲンス（ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）株によって生産されるリパーゼ酵素の性能を 説明している。 使用している洗剤は粉洗剤（ＡＬＬ”ベース、ＥＰ−Ａ−０２１８２７２に報告 されている）及び液体洗剤（液体ＴＩＤＥ”これもＥＰ−Ａ−０２１８２７２に 報告されているがプロテアーゼの不活性化は行っていない）である。これらのリ パーゼ酵素の調製は以下の操作に従かいバクテリアを培養することにより行った ：バクテリアを１００ｔｎｌ！のプレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培 地中、３０℃、２４時間、ロータリーシェーカーを用いて培養することにより接 種培地を調製した。その後、以下に述べる組成の培地ＩＥを含むラボファーメン タ−（２１）に接種した。 培地組成 プレインハートインフュージョン　１８．．５０（ＢＨＩ）（ディフコ） イーストエキストラクト　（ディフコ＞　Ｉｆ）、　００塩化カルシウム・２８ ２０　０．８０ 硫酸マグネシウム・７Ｈ，０３，２０ 硫酸マンガニ／　−）１．０　０．０３０大豆油　５．０ リン酸二カリウム　６・４ 発酵は３０℃で行った。接種から１６時間後、１ｇ／ｈの速度で大豆油を注入し 始め、さらに発酵を続けた。通気速度は６ｏｌ／ｈ及び撹拌速度は７００ｒｐｎ ＋で行った。発酵は計６４時間行った。 発酵後、そのバクテリアを遠心で除去した。その上清を室温で撹拌しながら２． ５倍容のアセトンと迅速に混合した。それからこの混合物を１０分間撹拌してか ら放置し、これを吸引口過した。 口過固形分を７０％アセトンで洗浄後、１００％アセトンで洗浄し、これを減圧 下で乾燥した。 このようにして得たリパーゼ酵素調製物をＳＬＭテスト法でテストした。ＳＬＭ テストの操作はＥＰ−Ａ−０２１８２７２に述べられている。この操作は以下の ように修正して行った。 アセトンに溶かした１０ｍｇのオリーブ油（２５％）を含む溶液をポリエステル スワッチ（３Ｘ３ｃｍ）上にスポツティングし、室温で空気乾燥した。１０ｍｆ の５ＨＷ（標準硬水：０．７５ｍＭＣａＣＡ’、　、０．２５　ｍＭ　ＭｇＣＬ 　）又はＳＨＷに溶がした洗剤からなる洗浄液をスリ栓付三角フラスコ（２５＋ ｎｆ）に入れ、４０℃の振盪水槽中に保持した。テストした洗剤は粉末洗剤（Ａ ＬＬＲベース）及び液体洗剤＜ＴＩＤＥ液）である。ＡＬＬベース洗浄液の濃度 は４ｇ／ｌ　（ｐＨ９，５）で行ない、液体ＴＩＤＥの濃度は１．５ｇ／（！　 （ｐＨ７，５）で行った。洗浄プロセスは酵素調製物を三角フラスコに加え、直 ちに汚れた標本を入れて４０℃で４０分以上振盪した。最終的リパーゼ濃度は２ ＴＬＵ／ｍβであった。 洗浄後、その標本をＳＨＷですすいだ後５５℃で１時間乾燥した。そのように乾 燥した標本を再び新しい洗剤及び酵素液を用いた４０分間の二次洗浄サイクルで 洗浄した。二次洗浄サイクル後、標本を０．０１ＮのＨＣｎで処理し、すすいだ 後に室温で一晩乾燥した。乾燥標本を、５＋＋＋ｆの溶媒（ｎ−ヘキサン／イソ プロピルアルコール／ギ酸；　９７５　：　２５　：２．５　（ｖ／ｖ）　、１ ｍＪ／ｍ１ｎ）を入れたガラス管中で回転させることにより抽出を行った。生成 した残渣のトリグリセリド、ジグリセリド及び遊離脂肪酸を１（ＰＬＣで測定し た。 ＨＰ　Ｌ　Ｃ装置及び条件 カラム二〇Ｐマイクロスフイア−３ｉ　（クロムバック）、１００Ｘ４．６＋１ １１１１ 注入システム：　ウィスブ（ミリボア）１０μ！ポンプ　：　モデル２１５０　 （ＬＫＢ）検出器　：　屈折率モニター（ジョビンジボン）インチグレーター： 　５Ｐ４２７０　（スペクトラフィジス）ｍ出液　：　ｍ−ヘキサン／イソプロ ピルアルコール／ギ酸９７５　：　２５　：　２．５　（ｖ／ｖ）　、１＋ｎｊ ！／ｍｉｎ温度　：　室温 トリオレインの保持時間は１．２分、１，３ジグリセリドは２．５分、１．　２ −ジグリセリドは３．６分及びオレイン酸は１．６分であった。ピーク面積又は ピーク高さをトリグリセリド及び脂肪酸の回収の指標として測定した。非洗浄標 本から抽出したトリグリセリド回収量を１００％とした。トリオレイン及びオレ イン酸の屈折率の比はピーク高さから１．Ｏであることが分った。 これらのＳＬＭテストの結果を以下の表に示す。これらの表にはトリグリセリド 回収率及び全脂質回収率を示した。全脂質回収物とはトリグリセリド、１．２及 び１，３ジグリセリド、及び遊離脂肪酸をたし合せたものである。全脂質回収率 キトリグリセリド回収率の差は、リパーゼの活性及び性能の尺度となる。全脂質 回収率とコントロール（リパーゼ酵素なし）の差は布からの油汚れの除去を示し ており、これらの酵素がＳＬＭテストに模倣された現実的洗浄条件で安定かつ有 効であることを示した。 第３表 液体ＴＩＤＥ組成物中の種々のリパーゼのＳＬＭテストの結果第４表 ＡＬＴ、−ベース組成物における種々のリパーゼのＳＬＭテストの結果 ？：’　＝　！片言に変更なし） 大腸菌　／ｐＵＮ１２１ Ｙ工Ｇ［７ＲＥ２ Ｆ工ＧＵＲＥ３ ＦＩＧＵＲＥ　４ く Ω ＹＩＣ罫こ　５ ＦＩＧＵＲＥ６ の の− Ｆ工ＧＵＲＥ７ ＦＩＧＵＲＥ８ ＦＩＧＵＲＥ　９人 ＦＩＧＵＲＥ　９Ｂ １２３４５６７Ｂ ｒ工σσＲ１？　１１ ＦＩＧＵＲＥ　ＪＬＵ ＬＩＰＡＳＥ　ＭＬ ＦＴＧＩｊぴ　１３ Ｆ工ＧＵＲＥ　：ｔ４ ｕＰＡｓＥ　Ｐ入０１ ＣτＣＧｇＴＡＣＩＱ；丁１ζｇａＴ’ＴＴｏ：ＣａＧＣＥＣＴ１３０ＡＴＨｅ ｃ＝ＴＧＯＣＣＡＧＩＯｒＷＦＧＪ５ＱＩＬＡ１１１１ＯＡＯｆｌＧＥｕＬＬＯ ＯＶＥＥＩＶＡＬ５ α：ＱにＴＴＣＣ１ＧαχＣＡＧ　ＡＴＣα論α刀αππ蕩α＝嘱Ｃ届α講σＣ 口℃ＡＩＩＦＬｋ０１ＰＰ（ｉｓＡＯＩＡＶＬＣＴＴＴＣＣＡＥ＋：Ａ：ＡＧＧ ＧＴＡＣＧＣＩＪＡＡＴＴＣＡＣＴＧＩＸｃＴＣＧＣＴＧＧＡＧｉｃｅＬ５５Ｇ ５ＴＧｒＱＩＳＬＧ５Ｌ（５ ０ｕＣＥ＆ｒＣ＋ＸｔＡＣＣ丁ＣＧＧｏ：ＴＺｇＧＩＡＧＧＣＧＣＣＴＩＪ：Ｍ ｕＧτＣＡＡＣ）ＯＧＩＰＴ５ＡＣ（ｉｌＧＡＹＫＶＮＡＣＡＡＩＣ丁１ｃＣＴ ＣｕＡＴＣＣＧＡＥＱＣＧＣＣＴＴＣＣＴＣＯＤＣＧＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴＧ＾ ＳＣ丁１１ＦＬＤＰＳＤＡｆＬＧＡ５５ＬＴＣ５５１１ＬＯＩＩ　マ　１１＋１ 　れ　Ｙｆｆｉｌｌｌｌ）１ｒｒｃｗＡＣＣｘ：’ｃ’；σ丁ＣＡ’Ｅｆｆｌｃ ＴＡＣＣＦ、ＣＩＧＣＡＣＧＣＣＡＡＣＣｆ；ＣＣ了Ｃ入みＧｒｔτｂトマ５Ｖ １ｋｕｌｌＡＩＩｌｔＬＫｒ ＶＹＶＴＥＣＯＰＶＧｌ１５Ｅ ４　ＡｃｃＡＣＣＲＣＱｊα’：：匡４　ＣＡＣ＋Ｊ！；　（ＡＴ　ＴＣＧ　Ｃ ＡＣＡＣ：ＴＳＶＧＡＰＨＫＧＳＯＴ コ３ｏ３６Ｇ ＴＣＣＣＥσＯ（ＴＣＡＡＣ＾父ｃｔｃ　ＧＧＣｃ−ｔ　ＣＸ　ＡＴＣＡＧＯｎ ｃ５ＧＬＶｌｌＳＬＧＡＬＪＳＦ ５１０　ＭＯ ＧＧＣＧＴＧＡＯＣτＡＴＴＡＣＴＣＣτＧＧＡＧＣＧＧＴτＣ：ＴＣＣＣＣＧ ＣＴＧＧＶＳＴＩＳｌｄ　Ｓ　Ｇ５５ＰＬ 丁１＼：ＡＡＧＡ八〇ＧへＡｃｅＣ−ご：＾ツバ：ＧＡＣＧ：督：ＣＴ、；Ｇ丁 Ｃ：：五ＣＣＦＫＩＩＧＴＡＮＤ（ｉＬＶ（ｉＴ ＬＤｆＹｌｌＯＶＦＧＬＴ５Ｌ 人ＡＦ：ＧＣＣａ；（ＴｄＴＡ； １９自（内宮に変更なし） ＮｄｅＩ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） Ｆ工ＣσＲＥ１９ ＡＢＣＤ 浮口（ｒν３に交Ｚなし） Ｆ工ＧＵＲＥ　２１ Ｍ　ＡＲＣＤ　ＥＦＧＨ Ｆ工ＧＵＲＥ　２２Ａ Ｐ工ＧＵＲＥ　２２Ｂ 平成　年　月　日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）転写の５′−３′方向に、宿主細胞中で機能する転写調節領域及び翻訳開 始領域、脂質分解性酵素をコードするＤＮＡ配列及び宿主細胞中で機能する翻訳 及び転写終止領域を含み、該ＤＮＡ配列の発現が該転写及び翻訳調節領域の制御 下にある発現カセットを含む微生物の形質転換宿主細胞。 （２）前記発現カセットがさらにマーカー遺伝子を含む請求の範囲（１）記載の 形質転換宿主細胞。 （３）前記ＤＮＡ配列が前記脂質分解性酵素をコードする遺伝子に適当な読み枠 で結合するリーダー配列を含む請求の範囲（１）記載の形質転換宿主細胞。 （４）前記宿主細胞が原核細胞である請求の範囲（１）記載の形質転換宿主細胞 。 （５）前記原核細胞がバチルス、大腸菌又はシュードモナス細胞である請求の範 囲（４）記載の形質転換宿主細胞。 （６）前記ＤＮＡ配列がｐＴＭＰｖ１８Ａ中のリパーゼコード化遺伝子と少なく とも６７％のヌクレオチド配列相同性を有する少なくとも３００ｂｐの配列を含 む請求の範囲（１）記載の形質転換宿主細胞。 （７）前記ＤＮＡ配列がｐＥＴ３中のリパーゼコード化遺伝子と少なくとも６７ ％のヌクレオチド配列相同性を有する少なくとも３００ｂｐの断片を含む請求の 範囲（１）記載の形質転換宿主細胞。 （８）前記ＤＮＡ配列が微生物細胞に由来する請求の範囲（６）又は（７）記載 の形質転換宿主細胞。 （９）前記ＤＮＡ配列がシュードモナス又はアシネドバクター種に由来する請求 の範囲（８）記載の形質転換宿主細胞。 （１０）前記ＤＮＡ配列がＰ．スツゼリ、Ｐ．アルカリデンス、Ｐ．シュードモ ナスアルカリデンス、Ｐ．アルギノサ又はＡ．カルコアセチカスに由来する請求 の範囲（９）に由来する形質転換宿主細胞。 （１１）前記ＤＮＡ配列がＰ．スツゼリＴｈａｉ　ＩＶ１７−１株（ＣＢＳ４６ １．８５），ＰＧ−１−３株（ＣＢＳ１３７．８９），ＰＧ−１−４株（ＣＢＳ １３８．８９），ＰＧ−ＩＩ−１１．１株（ＣＢＳ１３９．８９）又はＰＧ−Ｉ Ｉ−１１．２株（ＣＢＳ１４０．８９），Ｐ．アルギノサＰＡＯ（ＡＴＣＣ１５ ６９２），Ｐ．アルカリデンスＤＳＭ５０３４２，Ｐ．シユードアルカリデンス ＩＮＩＩ−５（ＣＢＳ４６８．８５），Ｐ．シュードアルカリデンスＭ−１（Ｃ ＢＳ４７３．８５）又はＡ．カルコアセチカスＧｒＶ−３９（ＣＢＳ４６０．８ ５）に由来する請求の範囲（１０）記載の形質転換宿主細胞。 （１２）ＴＬＵ測定条件下、ｐＨ一定で測定して、８〜１０．５の至適ｐＨを有 し、かつ温度約６０℃以下及びｐＨ７〜１１という洗浄条件下、１０ｇ／ｌまで の濃度で洗剤を含む水溶液中でリパーゼ活性を示すことを特徴とする実質的に純 粋な脂質分解性酵素で、転写の５′−３′方向に、宿主細胞中で機能する転写調 節領域及び翻訳開始領域、前記脂質分解性酵素をコードするＤＮＡ配列、及び宿 主細胞中で機能する翻訳及び転写終止領域を含み、該ＤＮＡ配列の発現が該転写 及び翻訳調節領域の制御下にある発現カセットを含む形質転換微生物宿主から得 られる酵素。 （１３）前記酵素が１０４〜１０７ＴＬＵ／ｇの比活性を有する請求の範囲（１ ２）記載の脂質分解性酵素。 （１４）請求の範囲（１）乃至（１４）記載の形質転換微生物宿主により生産さ れる請求の範囲（１２）記載の脂質分解性酵素。 （１５）ＴＬＵ測定条件下ｐＨ一定での測定で８〜１０．５の至適ｐＨ範囲を有 し、かつ温度約６０℃以下でかつｐＨ７〜１１の洗浄条件下、１０ｇ／ｌまでの 濃度で洗剤を含む水溶液中でリパーゼ活性を示す脂質分解性酵素を調製する方法 で、（イ）栄養培地中、転写の５′−３′の方向に宿主細胞中で機能する転写調 節領域及び翻訳開始領域、前記脂質分解性酵素をコードするＤＮＡ配列及び宿主 細胞中で機能する翻訳及び転写終止領域を含み、該ＤＮＡ配列が該転写及び翻訳 調節領域制御下にある発現カセットを含む宿主細胞を増殖する、（ロ）前記脂質 分解性酵素を単離する 以上のステップを含む方法。 （１６）脂質分解性酵素を生産する方法で、（イ）栄養培地中、請求の範囲（１ ）乃至（１１）記載の形質転換微生物宿主細胞を培養し、リッチブイヨンを作る 、（ロ）該培地から該脂質分解性酵素を単離する、以上のステップを含む方法。 （１７）転写の方向に、微生物宿主細胞中で機能する転写調節領域、ＴＬＵ測定 条件下ｐＨ一定で８〜１０．５の至適ｐＨ範囲を有し、かつ温度約６０℃以下で かつｐＨ７〜１１の洗浄条件下で１０ｇ／ｌまでの濃度の洗剤を含む水溶液中で リパーゼ活性を示す脂質分解性酵素をコードするＤＮＡ配列、及び宿主細胞中で 機能する転写終止調節領域を含むＤＮＡ構築物。 （１８）請求の範囲（１７）記載のＤＮＡ構築物で、さらに選択マーカー遺伝子 及び分泌リーダー配列のうちの１つを含むＤＮＡ構築物。 （１９）ｐＴＭＰｖ１８Ａ又はｐＥＴ３上のリパーゼ遺伝子の１つと少なくとも ６７％のヌクレオチド配列相同性を有する少なくとも３００ｂｐの断片を含む請 求の範囲（１７）又は（１８）記載のＤＮＡ構築物。 （２０）プラスミドｐＡＴ１、ｐＡＴ３、ｐＥＴ１、ｐＥＴ３、ｐＡＭ１、ｐＭ ６−５、ｐＰ５−４、ｐＴＭＰｖ１８Ａ又はｐＳＷ１０３。 （２１）Ｐ．スツゼリＴｈａｉ　ＩＶ１７−１株（ＣＢＳ４６１．８５），ＰＧ −１−３株（ＣＢＳ１３７．８９），ＰＧ−１−４株（ＣＢＳ１３８．８９）， ＰＧ−ＩＩ−１１．１株（ＣＢＳ１３９．８９）又はＰＧ−ＩＩ−１１．２株（ ＣＢＳ１４０．８９），Ｐ．アルギノサＰＡＯ（ＡＴＣＣ１５６９２），Ｐ．ア ルカリデンスＤＳＭ５０３４２，Ｐ．シュードアルカリデンスＩＮＩＩ−５（Ｃ ＢＳ４６８．８５），Ｐ．シュードアルカリデンスＭ−１（ＣＢＳ４７３．８５ ）又はＡ．カルコアセチカスＧｒＶ−３９（ＣＢＳ４６０．８５）由来の脂質分 解性酵素のアミノ酸配列をコードする配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド から選ばれた連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチ ド単離物。 （２２）前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求の範囲（２１）記載のオリ ゴヌクレオチド。 （２３）前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである請求の範囲（２１）記載のオリ ゴヌクレオチド。 （２４）前記オリゴヌクレオチドが放射性ラベルを含む請求の範囲（２１）記載 のオリゴヌクレオチド。 （２５）前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを 含む請求の範囲（２１）記載のオリゴヌクレオチド。