NO307304B1 - Transformert mikrobiell vertcelle og DNA-konstruksjon egnet for fremstilling av et lipolytisk enzym og fremgangsmåte for fremstilling av dette - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling ved rekombinant DNA-teknologi av et enzym for enzymatisk nedbrytning av fettholdige materialer, spesielt et lipolytisk enzym som har visse kjennetegn som gjør det egnet for anvendelse som tilsetningsstoffer for vaskemidler.

Et spesielt problem knyttet til vask av tøy er fjerning av flekker med en fettholdig karakter. Fettinnholdende skitt blir for tiden emulgert og fjernet ved anvendelse av en kombinasjon av forhøyet temperatur og høy alkalinitet. Det eksisterer derimot en sterk tendens mot anvendelse av relativt lave vasketemperaturer, dvs. omtrent 40°C eller lavere, betingelser som er spesielt uegnede for fjerning av fettholdige flekker. Det er derfor nødvendig med tilsetningsstoffer til vaskemidler som er effektive ved lavere vasketemperaturer, stabile i høyalkaliske vaskemiddeloppløs-ninger og stabile under lagringsbetingelser i både faste og flytende vaskemiddelsammensetninger. En gruppe enzymer som hydrolyserer triglyserider er lipaser (E.C. 3.1.1.3). Lipaser er tilstedeværende mange steder, i mange forskjellige prokaryotiske organismer samt eukaryote celler. Avhengig av enzymkilden varierer substratspesifisiteten samt andre kjennetegn omfattende stabilitet under forskjellige betingelser meget. Lipaser er blitt anvendt i vaskemiddelsammensetninger, men de som ble anvendt hadde lav vaskeeffek-tivitet under vaskebetingelsene og i tillegg oppfylte de ikke stabilitetskravene for anvendelse av vaskemidlet.

Lipolytiske enzymer som kan utvise lipaseaktivitet under moderne vaskebetingelser, dvs. at de er stabile og effektive ved høye vaskemiddelkonsentrasjoner ved høy pH og ved lave vasketemperaturer, blir produsert av visse stammer hørende til artene Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas stutzeri og Acinetobacter calcoaceticus (se europeisk patentsøknad EP-A-0218272). Disse artene er derimot poten-sielt patogene for planter og dyr, og lite data er tilgjen-gelig om betingelsene for fermentering som er nødvendig for en effektiv produksjonsprosess for lipase ved anvendelse for disse mikroorganismene.

Det er derfor ønskelig å utvikle en effektiv og trygg måte å produsere lipolytiske enzymer med de ønskede karaktertrekkene for vaskemiddeltilsetningsstoffer. Det er derimot ønskelig at lipasene blir utskilt av vertsorganismen slik at enzymet kan bli isolert direkte fra den ekstracellulære væsken til fermenteringsblandingen.

For lipaser produsert av Pseudomonas-arter er det kjent at kulturbetingelsene sterkt influerer på den endelige beliggen-heten til disse enzymene (Sugiura, In: "Lipases", eds. B. Borgstrom og H.L. Brockman (1984) s. 505-523. Elsevier, Amsterdam). Problemer oppstår ofte ved tilveiebringing av effektiv ekspresjon av heterologe gener i mikroorganismer, inbefattet ukorrekt folding av proteinene som blir dannet, proteinnedbrytning og uriktig beliggenhet av produktene. Harris, i: "Genetic Engineering", Vol. 4 (1983), Academic Press, New York. I E.coli muliggjør anvendelse av sekre-sjonskloningsvektorer generelt transport av heterologe genprodukter inn i periplasmaområdet og produktene blir derimot bare sjeldent funnet i kulturmediet; Lunn et al., Current Topics in Microbiol. and Immunol. 125 (1986) 59-74. Ved anvendelse av E.coli som vertcelle, blir klonede mikrobielle lipaser, beskrevet av Gotz et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 5895-5906, Kugimiya et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 141 (1986) 185-190 og Odera et al., J. Ferment. Technol. 64 (1986) 363-371, utskilt på en dårlig måte i kulturmediet.

Wohlfarth og Vinkler, J. Gen. Microbiol, 134 (1988) 433-440, rapporterer når det gjelder fysiologisk karakterisering av nye isolerte lipase-manglende mutanter fra Pseudomonas aeruginosa-stamme PAO 2302 og når det gjelder kromosomal kartlegging og kloning av det korresponderende genet. Bacillus-arter, spesielt Bacillus subtilis-stammer, er blitt anvendt med varierende grad av vellykkethet som vertsstamme for ekspresjon av både fremmede og endogene gener og for utskilling av de kodede proteinproduktene. For en oversikt, se f.eks. Sarvas, Current Topics in Microbiology and Immunology 125 (1986) 103-125, H.C. Wu og P.C. Tai, eds. Springer Verlag; se også Himeno et al., F.E.M.S. Microbiol. Letters 35 (1986) 17-21.

US-patent nr. 3.950.277 og britisk patent-beskrivelse nr. 1.442.418, beskriver lipaseenzymer kombinert med en aktivator og kalsium og/eller magnesiumioner, respektivt, som blir anvendt for å for-dynke skitne stoffer og for å fjerne triglyceridflekker og skitt fra polyester og polyester/- bomullsfabrikkblandinger, respektivt. Egnede mikrobielle lipaser som er beskrevet, omfatter de som blir avledet fra Pseudomonas, Aspergillus, Pneumococcus, Staphylococcus, Mycobacterium tuberculosis, Mycotorula lipolytica og Sclerotinia.

Britisk patent-beskrivelse nr. 1-372.034 beskriver en vaskemiddel sammensetning omfattende en bakteriell lipase produsert av Pseudomonas stutzeri-stamme ATCC 19154. Patentet beskriver videre at de foretrukne lipolytiske enzymene bør ha et pE-optimum mellom 6 og 10 og bør være aktive i nevnte område, fortrinnsvis melleom 7 og 9. (Denne antatte Pseudomonas stutzeri-stammen er blitt reklassifisert som Pseudomonas aeruginosa).

Europeisk patentskøknad (EP-A- 0130064 beskriver et enzymatisk vaskemiddeltilsetningsstoff omfattende en lipase isolert fra Fusarium oxysporum som har en høyere lipolytisk rensningseffektivitet enn konvensjonelle lipaser. Lipolytiske vaskemiddeltilsetningsstoffer er også beskrevet i f.eks. britisk patent-beskrivelse nr. 1.293.613 og kanadisk patent nr. 835.343.

De europiske patent-søknadene EP-A-0205208 og EP-A-0206396, beskriver anvendelse av Pseudomonoas- og Cromobacter-lipaser i vaskemidler. For en omfattende oversiktsartikkel på lipaser som vaskemiddeltilsetningsstoffer, se Andree et al., J. Appl. Biochem, 2 (1980) 218-229.

Nye sammensetninger omfattende transformerte mikrobielle celler og fremgangsmåte for fremstilling derav, er tilveiebragt og produserer lipolytisk enzym egnet for anvendelse i vaskemiddelsammensetninger. Verts-mikrobielle celler blir transformert ved anvendelse av ekspresjonskasett omfattende en DNA-sekvens som koder for et lipolytisk enzym som er aktivt ved alkalisk pH og stabil under betingelser ved tøyvask. Metoder for fremstilling av lipolytisk enzym omfatter kloning og uttrykking i mikrobielle systemer og screening på basis av DNA-homologi.

Transformert mikrobiell vertcelle som inneholder en DNA-sekvens som koder for et lipolytisk enzym ervervet fra en prokaryot mikroorganisme er tilveiebragt.

Av spesiell interesse for produksjon av lipase, er lipasegenene avledet fra visse Pseudomonas-arter.

Kort beskrivelse av tegningene

Firgur 1: Strategi for den lipolytiske enzymgenklon-ingen. For symboler se teksten i figur 2.

Figur 2:; Restriksjonskart av pATl. Et antall restriksjonsenzymgjenkjenningsseter er blitt bestemt i plasmid pATl.

pUN121 vektor DNA

■■■i: Thai IV 17-1 DNA-Innskudd.

Symbolene som blir anvendt er:

- Ori E.coli: E.coli replikasjonsorigo

- Ap<r>: pUN121 genet kodende for ampicillinresistens; - Tc<r>: pUN121 genet som koder for tetracyklinresistens; - cl: bakteriofag lambda-genet kodende for cl repressoren.

Posisjonen hvor delvis Sau3A-spaltet kromosomalt DNA fra Pseudomonas stutzeri Thai IV 17-1 (CBS 461.85) ble ligert til pUN121, er angitt ved BclI/Sau3A.

Denne posisjon av genet som koder for lipolytisk aktivitet er angitt ved en stiplet linje. Figur 3: Restriksjonskart av pAT3. Symbolene er de samme som de som blir anvendt i figur 2. Figur 4: Restriksjonskart av pETl. Symbolene er de samme som anvendt i figur 2. Figur 5: Restriksjonskart av pET3. Symbolene er de samme som de som blir anvendt i figur 2. Figur 6: Restriksjonskart av pAMl. Symbolene er de samme som de som blir anvendt i figur 2. Figur 7: Restriksjonskart av pM6-5. Symbolene er de samme som de som blir anvendt i figur 2. Figur 8: Restriksjonskart av pP5-4. Symbolene er de samme som de som blir anvendt i figur 2. Posisjonen hvori delvis EcoRI<*>spaltet kromosomalt DNA av Acinetobacter calcoaceticus GR V-39 (CBS 460.85) ble ligert til pUN121 er angitt ved EcoRI/EcoRI<*.>Figur 9: En SDS 10-15$ gradient fastgel (Pharmacia). Figur 9A: Etter farging med Coomassie Brilliant Blue. Figur 9B: Etter farging med p-naftylacetat/Fast Blue

BB.

Kolonne 1; Lysat fra E. coli JM101 hsdS recA-stamme inneholdende pUN121 oppvarmet med SDS i 10 min. ved 95°C. Kolonne 2: Lysat fra E. coli JM101 hshS recA-stamme inneholdende pET3 oppvarmet med SDS i 10 min. ved 95°C. Kolonne 3: Kultursupernatant fra P. stutzeri Thai IV 17-1-stamme oppvarmet med SDS i 10 min ved 95°C.

Kolonne 4: Samme prøve som i kolonne 2, men oppvarmet med SDS i 5 min. ved 95°C.

Kolonne 5: Samme prøve som i kolonne 3, men oppvarmet med SDS i 5 min ved 95°C.

Kolonne 6: Samme prøve som i kolonne 2, men inkubert med SDS i 10 min. i romtemperatur.

Kolonne 7: Samme prøve som i prøve 3, men inkubert med SDS i 10 min. ved romtemperatur.

Kolonne 8: Lave molekylvektsproteinmarkører fra Pharmacia.

Figur 10: SDS 13$ polyakrylamidgel etter farging med Coomassie Brilliant Blue.

Kolonne 1: Renset M-l lipase

Kolonne 2: Lavmolekylvekt proteinmarkører (Pharmacia).

Figur 11: Restriksjonskart av pTMPvl8A.

I: pTZ18R vektor DNA

■HBh M-l DNA Innskudd

Symbolene anvendt er:

-Ori E.coli: E. coli replikasjonsorigo avledet fra pBR322 vektor. -fl ori: replikasjonsorigo fra filamentøs bakteriofag fl -Pt7: promoter til bakteriofag T7 for preparering av in vitro transkripter.

-Ap<r>: Gen kodende for ampicillinresistens

-Lip: Gen kodende for M-l lipase.

Figur 12: viser nukleotidsekvensen (dvs. de første 942 nukleotidene) til M-l lipasegenet og den avledede aminosyresekvensen til M-l lipase. Termineringskodonet TGA er angitt med en stjerne. A-boksen representerer det aktive sentret til lipaseproteinet. Pilen angir antatt signal-peptidase-spaltningssete. Den aminoterminale sekvensen til moden lipaseprotein er understreket.

Firgur 13: Restriksjonskart av pSW103

I pUC19 vektor DNA

PAO 1 DNA-innskudd

Symbolene anvendt er:

Ori E. coli: E. coli replikasjonsorigo avledet fra pBR322 vektor.

^lac: promoter til E. coli lac operon

Ap<r>: gen kodende for ampicillinresistens.

- Lip: gen kodende for PAO 1 lipase

Figur 14: Delvis nukleotidsekvens til PAO lipasegenet (dvs. fra det indre Sali sete) og avledet aminosyresekvens til PAO lipase. Termineringskodon TAG er angitt med en stjerne. A-boksen representerer det aktive sentret til lipaseproteinet. Figur 15: Konstruksjon av plasmidene pBHAMl og pBHCMl. Symbolene anvendt er:

- Bacillus ori: Bacillus replikasjonsorigo.

- Km<r>: pUBHO gen kodende for neomycinresistens.

- Cm: Tn9 transposongen kodende for kloramfenikolresistens.

- Pflpall<1>Hpall promoter til plasmid pUBllO.

Andre symboler er som i figur 11.

Figur 16 viser konstruksjon av plasmid pBHAMlNl. Symbolene er de samme som anvendt i figur 15. Figur 17 illusterer konstruksjon av plasmid pTZNIMl.

Symboler anvend er:

- lac Za: N-terminal del av LacZ gen kodende for a-domene til p-galaktosidase.

"^lac: Promoter til E. coli lac operon.

Andre symboler er som i figur 11.

Figur 18 viser konstruksjon av plasmid pMCTMI. Symbolene anvendt er:

-Cm<r>: gen kodende for kloramfenikolresistens.

~<p>tac: hybrid trp-lac E. coli promoter.

Andre symboler er som i figurene 11 og 15.

Figur 19: Immunoblot-påvisning av M-l lipaseproteinet produsert av transformerte E. coli-celler.

Kolonnene A-D inneholder periplasmafraksjoner av E. coli-cellene inneholdende følgende konstruksjoner:

Kolonne A: pTZ18RN

Kolonne B: pTZNIMl

Kolonne C: pMCTMI

Kolonne D: renset M-l lipase fra Pseudomonas pseudoalcaligenes stamme M-l. Molekylær masse av markørproteinene (Rainbow™ fra Amersham) er angitt i kDa til høyre.

Figur 20: Konstruksjon av plasmid pBHMlNl.

Symbolene er de samme som anvendt i figur 15.

Figur 21: Autoradiograf av<35>g merkede proteiner syntetisert in vitro.

Kolonnene A-D: Immunopresipitasjon av in vitro trans-laterte prøver ved monoklonale antistoffer mot M-l lipase. Kolonnene E-H: In vitro transkripsjon/translasjonsproduk-ter til følgende plasmider:

Kolonnene A og E: pTZ18RN

Kolonnene B og F: pTMPvl8A

Kolonnene C og G: pMCTMI

Kolonnene D og H: pMCTbliMl

Figurene 22A og 22B: Påvisning av lipasekodende sekvenser i bakterielt DNA. Fem nanogrammengder plasmid DNA og fem mikrogram mengder kromosomalt DNA ble kuttet med restriksjonsenzym som angitt, separert på 0,8$ agarosegel blottet på nitrocellulosefiltre og hybridisert med nick-translatert innskudd av pET3 og pTMPvl8A, respektivt. Figur 22A viser autoradiografi etter hybridisering med pET3 EcoRI-innskudd. Figur 22B viser autoradiografi etter hybridisering med pTMPvl8A XhoI-lcoRV-innskudd.

Kolonne A: Hindlll/SStl spaltning av plasmid pTMPvl8A. Kolonne B: EcoRI spaltning av plasmid pET3.

BRL DNA gelmarkør. MW på 0,5, 1,0, 1,6, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7, 8, 9, 10, 11, 12 kb

Kolonne C: Sali kutting av P. pseudoalcaligenes M-l

(CBS 473.85)

Kolonne D: Sali kutting av P.<p>seudoalcaligenes IN II-5 (CBS 468.85)

Kolonne E: Sali kutting av P. alcaligenes DSM 50342 Kolonne F: Sali kutting av P. aeruginosa PAC IR (CBS 136.89)

Kolonne G: Sali kutting av P. aeruginosa PA02302 (6-1)

Kolonne H: Sali kutting av P. stutzeri Thai IV 17-1

(CBS 461.85)

Kolonne I: Sali kutting av P. stutzeri PG-I-3 (CBS 137.89)

Kolonne J: Sali kutting av P. stutzeri PG-I-4 (CBS 138.89 )

Kolonne K: Sali kutting av P. stutzeri PG-II-11,1

(CBS 139.89)

Kolonne L: Sali kutting av P. stutzeri PG-II-11,2

(CBS 140.89)

Kolonne M: Sali kutting av P. fragi serm. DB1051

(= Ferm BP 1051)

Kolonne N: Sali kutting av P. gladioli (CBS 176.86)

Kolonne 0: Sali kutting av A. caloaceticus Gr-V-39

(CBS 460.85)

Kolonne P: Sali kutting av S. aureus (ATCC 27661).

Foreliggende oppfinnelse vedrører transformert mikrobiell vertcelle, kjennetegnet ved at den omfatter en ekspresjonskassett som i sin 5'-3'-retning for transkripsjon inkluderer: (1) en transkripsjonsregulatorisk region og en transla-sjonsinitieringsregion funksjonell i nevnte vertcelle; (2) en DNA-sekvens som koder for et lipolytisk enzym ervervet fra en prokaryotisk mikroorganisme, idet nevnte DNA-sekvens er en 300 bp nukleinsyresekvens av det lipasekodende genet på pTMPvl8A (CBS 142.89) eller pET3 (CBS 155.87); og (3) translasjon og transkripsjonstermineringsregioner funksjonelle i nevnte vertcelle,

hvori ekspresjon av nevnte DNA-sekvens er regulert ved nevnte transkripsjons- og translasjonsregioner, og omfatter eventuelt en ledersekvens koblet i riktig leseramme 5' til et gen som koder for nevnte lipolytiske enzym, og at nevnte ekspresjonskassett eventuelt omfatter et markørgen.

Teknikker anvendt ved isolering av lipasegenet er kjent, og omfatter syntese, isolasjon fra genomisk DNA, preparering fra cDNA eller kombinasjoner derav. De forskjellige teknikkene for manipulering av genet er velkjente og omfatter restrik-sjon, spaltning, reseksjon, ligering, in vitro mutagenese, reparering av primer, anvendelse av linkere og adaptorer o.l. Se Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.

Fremgangsmåten omfatter generelt preparering av et genomisk bibliotek fra en organisme som uttrykker en lipase med de ønskede karaktertrekkene. Eksempler på slike lipaser er de som blir tilveiebragt fra Pseudomonas og Acinetobacter, og spesielt fra stammer hørende til artene Pseudomonas al caligenes, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri og Acinetobacter calcoaceticus. Et antall av disse lipasene og stammene er mere utførlig beskrevet i EP-A-0218272, og beskrivelsen er inkorporert heri ved referanse. Genomet til donormikro-organismen blir isolert og spaltet med et hensiktsmessig restriksjonsenzym, så som Sau3A. De tilveiebragte fragmentene blir koblet til et vektormolekyl som tidligere er blitt kuttet med et kompatibelt restriksjonsenzym. Et eksempel på en egnet vektor er plasmid pUN121 fra E. coli som kan bli kuttet med restriksjonsendonuklease Bell. Aminosyresekvensen kan videre bli anvendt for å konstruere en probe for å screene et cDNA eller et genomisk bibliotek preparert fra mRNA eller DNA fra celler av interesse som donor-celler for et lipasegen.

Ved anvendelse av lipase DNA eller et fragment derav som en hybridiseringsprobe, kan strukturelt relaterte gener som finnes i andre mikroorganismer lett bli klonet. Spesielt isolering av gener fra organismer som uttrykker lipolytisk aktivitet ved anvendélse av oligonukleotidprober basert på nukleotidsekvensen til lipasegener som kan tilveiebringes fra organismene beskrevet i EP-A-0218272. Alternativt kan disse oligonukleotidene bli avledet fra aminosyresekvenser til lipaser av interesse. Slike prober kan være betraktelig kortere enn hele sekvensen, men bør være på minst 10. Lengre oligonukleotider er også nyttige opp til full lengde av genet. Både RNA- og DNA-prober kan anvendes.

Ved bruk blir probene vanligvis merket på en påvisbar måte (f.eks. med 32P, 35S,<3>H, biotin eller avidin) og blir inkubert med enkelttrådet DNA og RNA fra organismen hvori det letes etter et gen. Hybridiseringen blir påvist ved hjelp av markøren etter enkelttrådet og dobbelttrådet (hybridisert) DNA (DNA/RNA) er blitt separert (vanligvis ved anvendelse av nitrocellulosepapir). Hybridiseringsteknikker egnet for anvendelse med oligonukleotider er velkjent for fagfolk.

Til tross for at prober vanligvis blir anvendt med en påvisbar markør som muliggjør enkel identifiskasjon, er også umerkede oligonukleotider nyttige, både som forløpere for merkede prober og for anvendelse i metoder som tilveiebringer direkte påvisning av dobbelt-trådet DNA (eller DNA/RNA). Betegnelsen "oligonukleotidprobe" referer til både merkede og umerkede former.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et lipolytisk enzym, kjennetegnet ved at nevnte metode omfatter: (1) dyrkning i et næringsmedium av en vertcelle som omfatter en ekspresjonskassett som inkluderer i transkripsjonen 5'-3'-retning en transkripsjonsregulatorisk region og en translasjonsinitieringsre-gion funksjonell i nevnte vertcelle; en DNA-sekvens som koder for nevnte lipolytiske enzym ervervet fra en prokaryotisk mikroorganisme; hvorav nevnte DNA-sekvens er en 300 bp nukleinsyresekvens fra det lipasekodende genet på pTMPvl8A (CBS 142.89) eller pET3 (CBS 155.87) og translasjons-og translasjonstermineringsregioner funksjonelle i nevnte vertcelle, hvori ekspresjon av nevnte DNA-sekvens er under regulatorisk kontroll av nevnte transkripsjons- og translasjonsregioner; og (2) isolering av nevnte lipolytiske enzym fra næringsme-diumet.

Oppfinnelsen vedrører videre en rekombinant DNA-konstruksjon, kjennetegnet ved at den omfatter: (1) i transkripsjonsretningen, en transkripsjonen regulatorisk region som er funksjonell i en mikrobiell vertcelle; (2) en DNA-sekvens kodende for et lipolytisk enzym oppnådd fra en prokarytisk mirkoorganisme, nevnte DNA-sekvens er en 300 bp mikleinsyresekvens av det lipasekodende genet på pTMPvl8A (CBS 142.89) eller pET3 (CBS 155.87); og (3) en transkripsjonen termineringsregulatorisk region som er funksjonell i nevnte vertcelle, og at nevnte rekombinante DNA-konstruksjon eventuelt omfatter minst ett av et seleksjonsmarkørgen og én sekretorisk ledersekvens.

Lipaseenzymene til P. aeruginosa og P. stutzeri ble produsert og testet for rensningsegenskaper i SLM-testen. Det ble overraskende funnet at alle enzymene som utviser høye homologinivåer med M-l-lipasegenet også viste overlegen stabilitet, effektivitet og utførelse under betingelsene som simulerer en moderne vaskeprosess. Ifølge Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1987-1988, kan Southern-hybridiseringsteknikken påvise homologi med .dette nivået. Homologiene som ble funnet ble ikke observert med P. gladioli beskrevet i EP-A-0205208 og EP-A-0206390 eller Humicola languinosa-lipase, beskrevet i EP-A 03052216.

Kloner inneholdende det innskutte DNA-fragmentet kan bli identifisert ved anvendelse av en direkte eller positiv seleksjonsprosedyre så som den som er utviklet for E. coli (Kuhn et al., Gene 44 (1986) 253-263) og for B. subtilis (Gryczan og Dubnau, Gene 20 (1982) 459-469). Et eksempel på en slik positiv seleksjonvektor for E. coli. er pUN121 (Nilsson et al., Nucleic Acids Res. 11 (1983) 8019-8030).

I tillegg kan kloner som uttrykker de lipolytiske enzymer bli identifisert, for eksempel ved anvendelse av en egnet indikatorplateanalyse, så som agarmedium inneholdende tributerin eller olivenolje i kombinasjon med rhodamine B (Kouker og Jaeger, Appl. Encv. Microbiol. 53 (1987) 211). Videre kan replikerte kolonier bli screenet ved anvendelse av en tilpasset soft agar-teknikk basert på prosedyren beskrevet for påvisning av esteraseaktivitet (Hilgerd og Spizizen, J. Bacteriol. 114 (1978) 1184). Alternativt kan kloner som uttrykker lipolytiske enzymer bli identifisert ved anvendelse av genetisk komplementasjon i en egnet lipase-negativ mottagerstamme, så som beskrevet av Wohlfarth og Winkler, J. Gen. Microbiol. 134 (1988) 433-440.

Når et fullstendig gen er blitt identifisert, enten som cDNA eller kromosomalt DNA, kan det bli manipulert på forskjellig måte for å tilveiebringe ekspresjon. Mikrobielle verter kan bli anvendt, og som for eksempel omfatter bakterier, gjær og sopp, så som E. coli. Kluyveromvces. Aspergillus. Bacillus og Pseudomonas arter. Når genet skal bli uttrykt i en vert som gjenkjenner villtype transkripsjonene og de translasjonene regulatoriske regionene til lipasen, kan hele genet med dets villtype 5' og 3' regulatoriske regioner bli ført inni en hensiktsmessig ekspresjonsvektor. Forskjellige ekspre-sjonsvektorer eksisterer som anvender replikasjonssystemet fra prokaryotiske celler (se f.eks. Pouwels et al., "Cloning Vector, A Laboratory Manual", Elsevier, 1985. Disse replika-sjonssystemene er blitt utviklet for å tilveiebringe markører som muliggjør seleksjon av transformanter og for tilveiebringing av hensiktsmessig restriksjonsseter hvor genene kan bli satt inn.

Når genet skal uttrykkes i en vert som ikke gjenkjenner de naturlig forekommende villtype-transkripsjonelle og translasjonene regulatoriske regionene, vil ytterligere manipula-sjon være nødvendig. Forskjellige 3'-transkripsjonene regulatoriske regioner er kjente og kan bli satt inn nedstrøms fra stoppkodonene. Den ikke-kodende 5'-regionen oppstrøms fra det strukturelle genet kan bli fjernet ved endonukleaserestriksjon, Bal31 reseksjon e.l. Alternativt, når et hensiktsmessig restriksjonssete er tilstede nær den 5'-terminale enden av det strukturelle genet, kan det strukturelle genet bli spaltet og en adapter anvendt for binding av det strukturelle genet til en promoterregion hvor adapteren tilveiebringer tapte nukleotider til det strukturelle genet.

Forskjellige strategier kan anvendes for tilveiebringing av en ekspresjonskassett, som i 5'-3'-retningen av transkripsjonen har en transkripsjonen regulatorisk region og en translasjonen initieringsregion, som også kan omfatte regulatoriske sekvenser som tillater induksjon av regulerin-gen; en åpen leseramme som koder for et lipolytisk enzym, som helst omfatter en sekretorisk ledersekvens gjenkjent av den foreslåtte vertcellen; og translasjons- og transkripsjonstermineringsregioner. Den uttrykkende kassetten kan i tillegg omfatte minst ett markørgen. Initierins- og terminerings-regionene er funksjonelle i vertcellen og kan være enten homolog (avledet fra den opprinnelige verten) eller heterolog (avledet fra en fremmed kilde eller fra de syntetiske DNA-sekvensene). Ekspresjonskassetten kan dermed være enten i sin helhet eller delvis avledet fra naturlige kilder, og enten helt eller delvis avledet fra kilder som er homologe med vertcellen eller heterologe med vertcellen. De forskjellige DNA-konstruksjonene (DNA-sekvensen, vektorene, plasmidene, ekspresjonskassettene) ifølge oppfinnelsen blir isolert og/eller renset, eller syntetisert og er dermed ikke "natur1ig forekommende".

Valg av hensiktsmessige regulatoriske sekvenser vil ta følgende faktorer som påvirker ekspresjonen med i betraktnin-gen. Med hensyn på at transkripsjonen regulering er mengden og stabiliteten av messenger RNA viktige faktorer som innvirker på ekspresjonen av genproduktene. Mengden RNA blir bestemt av kopiantallet av det bestemte genet, relativt effektive til dets promoter og faktorer som regulerer promoteren, så som enhancere eller repressorer. Stabiliteten til mRNA blir ledet av mottageligheten av mRNA for ribo-nukleaseenzymene. Generelt blir eksonukleasespaltning hemmet av tilstedeværelse av strukturelle motiver i endene av mRNA; palindrome strukturer, endrede nukleotider eller spesifikke nukleotidsekvenser. Endonukleasespaltning antas å oppstå ved spesifikke gjenkjenningsseter innenfor mRNA og stabile mRNA, eller mangle slike seter. Det tyder også på at mRNA med høye translasjonsnivåer også blir beskyttet fra nedbrytning ved tilstedeværelse av ribosomer på mRNAet.

Med hensyn på translasjonsregulering ved tilstedeværelse av mRNA, kan ekspresjon bli regulert ved innvirkning på initieringsgraden (ribosombinding til mRNA), elongeringsgraden (translokasjon av ribosomet langs mRNA), post-translasjonell modifikasjonsgrad og stabiliteten til genproduktet. Elongeringsgraden blir sannsynligvis påvirket av hvilke kodoner som blir anvendt, og anvendelse av kodoner for sjeldne tRNA kan redusere translasjonsgraden. Initiering antas å oppstå i regionen like oppstrøms for begynnelsen av den kodende sekvensen. I prokaryoter inneholder denne regionen i de fleste tilfeller en konsensus nukleotid sekvens AGGA, betegnet Shine-Dalgarno-sekvensen. På grunn av at denne sekvense karakteriserer det ribosomale bindingssetet, er det klart at sekvensene både oppstrøms og nedstrøms kan innvirke på vellykket initiering.

Det tyder også på at tilstedeværelse av nukleotidsekvenser innenfor den kodende regionen som kan påvirke ribosombinding, muligens ved dannelse av strukturelle deler gjennom hvilket ribosomet gjenkjenner initieringssetet. Posisjonen til AGGA-sekvensen med hensyn på det initierende ATG-kodonet kan innvirke på ekspresjonen. Det er dermed interaksjonen av alle disse faktorene som bestemmer en bestemt ekspresjonsgrad. De uttrykte genene har derimot utviklet en kombinasjon av alle disse faktorene for å tilveiebringe en spesiell grad av ekspresjon. Konstruksjon av et ekspresjonssystem for å tilveiebringe høye nivåer av genproduktet må ikke bare ta i betraktning de spesielle regionene som er blitt bestemt å innvirke på ekspresjonen, men også hvordan disse regionene (og dermed deres sekvenser) innvirker på hverandre. Illustrerende transkripsjonene regulatoriske regioner eller promotere omfatter for eksempel sekvenser avledet fra gener som blir overuttrykt i industrielle produksjonsstammer.

Den transkripsjonene regulatoriske regionen kan i tillegg omfatte regulatoriske sekvenser som tillater ekspresjon av det strukturelle genet som skal bli modulert, for eksempel ved tilstedeværelse eller fravær av næringsstoffer eller ekspresjonssprodukter i vekstmediumet, temperatur osv. For eksempel kan ekspresjon av det strukturelle genet i pro-kariote celler bli regulert ved temperatur ved anvendelse av en regulatorisk sekvense omfattende bakteriofag lambda Pl promoteren sammen med bakteriofag lambda Ol operatoren og en temperaturfølsom repressor. Regulering av promoteren blir oppnådd ved interaksjon mellom repressor og operator. Av spesiell interesse er ekspresjonskassetter som kan uttrykke lipolytiske enzym som anvender de regulatoriske sekvensene til Bacillus amylase og proteasegener. Det strukturelle genet av interesse er koblet nedstrøms fra det ribosomale bindingssete, slik at det er under regulatorisk kontroll av den transkripsjonene regulatoriske regionen og den translasjonene initieringsregionen.

I tillegg kan et koblet gen bli preparert ved tilveiebringing av en 5'-sekvens til det strukturelle genet som koder for en sekretorisk leder og et prosesseringssignal. Dersom det er funksjonelt i den valgte vertcellen, kan signalsekvensen til selve lipasegenet også bli anvendt. Illustrerende heterologe sekretoriske ledere omfatter de sekretoriske lederne til penicillinase, amylase, protease og gjær alfa-faktor. Ved fusjon i riktig leseramme med en sekretorisk leder med strukturelle gener av interesse, kan det modne lipolytiske enzymet bli skylt ut i kulturmediumet.

Ekspresjonskassetten kan bli innbefattet innenfor et replikasjonssystem for episomal opprettholdelse i en hensiktsmessig vertsorganisme eller kan bli tilveiebragt uten et replikasjonssystem hvor det kan bli integrert inn i vertsgenomet. Måten for transformasjon av vertsmikroorganis-men med forskjellige DNA-konstruksjoner er ikke kritisk i foreliggende oppfinnelse. DNA kan bli innført i verten i henhold til kjente teknikker så som transformasjon ved anvendelse av kalsiumfosfat-utfelt DNA, konjugasjon, elektroporasjon, transfeksjon ved kontakting av cellene med et virus, mikro-injeksjon av DNA inn i cellene eller lignende. Vertcellene kan være hele celler eller proto-plaster.

Som en vertsorganisme kan hvilken som helst mikroorganisme som er egnet for produksjon og ekstraksjon av et lipolytisk enzym bli anvendt; fortrinnsvis kan vertsorganismen også utskille enzymet bli produsert, idet enzymet kan bli isolert fra den cellefrie fermenteringsvæsken. Vertsorganismen er også fortrinnsvis en ikke-patogen organisme. Eksempler på vertsorganismer som oppfyller kriteriene ovenfor omfatter

E. coli, Pseudomonas putida og Bacillus-stammer, spesielt B. subtllis og B. licheniformis, Streptomyces-stammene og sopp og gjærstammer så som Aspergillus og Kluyveromyces, respektivt.

Vertsstammene kan være laboratorie-stammer eller kan omfatte industrielle mikroorganismestammer. Industrielle stammer er kjennetegnet ved at de er resistente overfor genetisk utveksling, så som fag-infeksjon eller transformasjon. Stammene er stabile og kan eller behøver ikke å kunne danne sporer. De er prototropiske og modifisert for å tilveiebringe høyt utbytte av endogene proteinprodukter, så som enzymene alfa-amylase og forskjellige proteaser. Utbyttet av et endogent proteinprodukt tilveiebragt i en industriell produksjonsprosess kan utgjøre minst 5 g/l (0,5$ w/v). Industrielle stammer utskiller også DNaser, som resulterer i nedbrytning av DNA i mediet og tilveiebringer beskyttelse overfor genetisk utveksling.

Når det strukturelle genet er blitt ført inn i den hensiktsmessige verten, kan vertcellen bli dyrket for å uttrykke det strukturelle genet. Produksjonsnivåene på lipolytisk aktivitet kan være sammenlignbar med, eller høyere enn, de opprinnelige stammene som genene er avledet fra. Vertcellen kan bli dyrket til høy tetthet i et hensiktsmessig medium for å danne en næringsrik kraft. Når promoteren er induserbar, vil tillatte betingelser deretter bli anvendt, for eksempel temperaturforandring, oppbruking eller overskudd av et metabolsk produkt eller næringsmiddel e.l.

Når utskilling er tilveiebragt, kan ekspresjonsproduktet bli isolert fra vekstmediet på konvensjonell måte. Frigjøring av det produserte lipolytiske enzymet kan bli forsterket ved fortynnede overflateaktive oppløsninger. Når utskilling ikke er tilveiebragt, kan vertcellene bli høstet og lysert i henhold til konvensjonelle betingelser. Det ønskede produktet blir deretter isolert og renset i henhold til kjente teknikker så som kromatografi, elektroforese, ekstraksjon av oppløsningsmiddel, faseseparasjon e.l.

De bestemte sammensetningene kan bli anvendt på mange forskjellige måter. De transformerte vertcelleorganismene kan bli anvendt for øket produksjon av lipase som har kjennetegnet som gjør det nyttig i vaskesammensetninger. De klonede lipasegenene kan også anvendes ved screening for lipasegener, inkludert identifikasjon av et lipolytisk gen som en lipase i steden for en esterase.

De kan også bli anvendt for enzymomkons truer ing ved anvendelse av kjente teknikker vedrørende tilfeldig eller sete-rettet mutagenese som resulterer i lipase med de nødvendige endrede kjennetegnene.

De lipolytiske enzymsammensetningene kan bli anvendt i vaskesammensetningene sammen med et vaskemiddel og eventuelt andre ingredienser som vanligvis blir anvendt i vaskesammensetningene. Disse ingrediensene kan omfatte minst en av følgende; vaskemidler, vannbløtningsmidler så som koplekse fosfater, alkalimetallsilikater og bikarbonater; fyllstoff så som alkalimetallsulfat; andre enzymer så som proteaser og amylase; blekemidler; samt uensartede forbindelser så som parfymer, optiske lysende midler osv.

I den enzymatiske rengjøringssammensetningen er lipaseaktivi-teten i området fra 1 til 20.000 TLU/g av sammensetningen, mens den protolytiske enzymaktiviteten er i området på fra 50 til 10.000 Delft enheter/g rengjøringssammensetning. En TLU (sann lipaseenhet) er definert som titrerbare fettsyrer ekvivalent med mengden 1 jjmol NaOH/min frigjort fra olivenol-je/arabisk gummiemulsjon ved pE 8,0, 25°C. Delft-enhetene er definert i J. Amer. Oil Chem. Soc. 60 (1983) 1672.

Rengjøringssammensetningene kan bli fremstilt på vanlig måte, for eksempel ved sammenblanding av komponentene eller ved preparering av en opprinnelig preblanding, som deretter blir ferdiggjort ved blanding med andre ingredienser. Ifølge en mulig fremstillingsvei, blir én eller flere lipasepreparater blandet med én eller flere av de andre forbindelsene for å tilveiebringe et konsentrat med en forutbestemt enzymatisk aktivitet og konsentratet kan deretter bli blandet med de andre ønskede komponentene.

De lipolytiske enzymene er egnet for et enzymatisk vaskemid-deltilsetningsstof f. Dette tilsetningsstoffet kan også inneholde en eller flere andre enzymer, for eksempel en protease og/eller en amylase, som kan bli anvendt i moderne vaskesammensetninger og én eller flere andre komponenter som vanligvis blir anvendt innenfor området, for eksempel et ikke-ionisk salt, stabiliserende middel og/eller blekemiddel. Det enzymatiske rengjøringsmiddelstilsetningsstoffet kan omfatte i tillegg til lipase, en protease og eventuelt en alfa-amylase. De protolytiske enzymene er kompatible med de lipolytiske enzymene i denne formuleringen. De enzymatiske rengjøringstilsetningsstoffene blir vanligvis blandet med en eller flere rengjøringsmidler og andre komponenter kjent innenfor fagområdet for å danne vaskesammensetninger. Det enzymatiske vaskemiddeltilsetningsstoffet blir vanligvis anvendt i området fra IO<2>og IO<7>TLU/g tilsetningsstoff, mens den eventuelt tilstedeværende proteolytiske aktiviteten er i området på fra 5xl0<4>til IO<6>Delft enheter/g.

De enzymatiske vaskemiddeltilsetningsstoffene kan være i form av for eksempel granulater eller priller, fremstilt ifølge metodene som vanligvis blir anvendt innenfor fagområdet. Se for eksempel britisk patent nr. 1.324.116 og 1.362.365 og US-patent nr. 3.519.570, 4.106.991 og 4.242.219.

Det enzymatiske vaskemiddeltilsetningsstoffet kan være i flytende form med en enzymstabilisator, for eksempel propylenglykol. De kan også være i form av organiske eller uorganiske oppslemminger, emulsjoner eller innkapslinger, immobilisert på en oppløselig eller uoppløselig bærer eller i en vandig eller vannfri oppløsning i nærvær av en eller flere stabilisatorer. Slike tilsetningsstoffer blir fortrinnsvis anvendt i flytende detergentsammensetninger.

EKSPERIMENTELT

Generelle kloningsteknikker ble anvendt som beskrevet av Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, CSH, New York. Alle DNA-modifiserende enzymer ble tilveiebragt fra kommersielle forhandlere. De ble anvendt ifølge forhandlerens instruksjoner. Materialer og apparatur for DNA-rensning og separasjon ble anvendt ifølge instruksjonene fra forhandleren.

EKSEMPEL 1

Molekylær kloning av triacvlglyserol- acylhydrolaser

A. DNA- kllde og seleksjonsvektor.

EP-A-0218272 beskriver flere bakteriestammer som produserer lipaser egnet for anvendelse i vaskemidler. Ut av disse ble Acinetobacter calcoaceticus Gr V-39 (CBS 460.85), Pseudomonas stutzeri Thai IV 17-1 (CBS 461.85), Pseudomonas pseudoalcaligenes IN II-5 (CBS 468.85) og Pseudomonas pseudoalcaligenes M-l (CBS 473.85) valgt som en kilde for lipolytiske gener.

Plasmid-vektor pUN121 (Nilsson et al., Nucleic Acids Research 11 (1983) 8019) som bærer et ampicillin resistensgen, et tetracyklinresistensgen og cl-repressorgen til bakteriofag lambda ble tilveiebragt fra Dr. M. Uhlen, Royal Institute of Technology, Department of Biochemistry, Teknikringen 10, S-10044 Stockholm, Sverige. Transkripsjon av tetracyklingenet blir forhindret av cl repressoren. Innsetting av fremmed DNA inn i de unike restriksjonssetene ( Bell. Smal, Hindlll og EcoRI) resulterer i aktivering av tetracyklingenet. Dette muliggjør direkte (positiv) seleksjon av rekombinante transformanter på Luria medium agarskåler inneholdende 8 ug/ml tetracyklln og 50 jig/ml ampicillin.

B. Preparering av genbibliotek (se figur 1)

Plasmid og kromosomalt DNA blir isolert som beskrevet av Andreoli, Mol. Gen. Genet. 199 (1985) 372-380. Kromosomalt DNA isolert fra Thai IV 17-1 og M-l, respektivt, ble delvis Sau3A-kuttet. DNA ble deretter ligert med T4 DNA ligase til Bcll-kuttet pUN121 DNA som beskrevet av Maniatis et al., (ovenfor) og transformert inn i kompetente celler E. coli stamme JM101 hsdS recA (Dagert og Ehrlich, Gene 6 (1979) 23-28). E. coil JM101 hsdS recA ble tilveiebragt fra Phabagen-kolleksjonen (Accession-nummer PC2495), Utrecht, Nederland. Transformanter resistente overfor tetracyklln ved 8 jjg/ml i Luria medium agarskåler ble selektert for.

C. Screening for transformanter

Genbiblioteket tilveiebragt som beskrevet ovenfor ble replika-platet og screenet for lipolytisk aktivitet ved anvendelse av følgende to prosedyrer. I den første prosedyren ble de replikerte koloniene screenet for lipolytisk aktivitet på pepton agarmedia inneholdende tributyrin. Lipolytisk aktivitet ble påvist som en klar sone (ring) rundt en koloni forårsaket av nedbrytning av den turbide lipidemulsjonen. I den andre fremgangsmåten ble replikerte kolonier screenet for esterase-aktivitet ved anvendelse av en soft agar overlegningsteknikk. Metoden var basert på den til Hilgerd og Spizizen, J. Bacteriol. 114 (1987). En blanding bestående av 0,4$ lavtsmeltende agarose, 0,5 M kaliumfosfat (pH 7,5), 0,5 mg/l 3-naftylacetat, løst opp i aceton og 0,5 mg/l Fast Blue BB (se eksempel 2) ble helt over transformantene. I løpet av noen få minutter ble kolonier med esterase eller lipase-aktivitet farvet violett.

Av de 1200 tetracyklinresistente transformantene tilveiebragt fra Thai IV 17-l/pUN121 genbanken, produserte tre ringer på tributyrin agarskåler. Ut i fra 12.000 rekombinante transformanter undersøkt fra M-l/pUN121 genbanken, viste bare én av de testede klonene svak lipolytisk aktivitet.

Tributyrin-positive kloner ble dyrket overnatt i 2TY medium (16 g/l Bacto-trypton, 10 g/l Bacto-gjærekstrakt, 5 g/l NaCl, pH 7,0) medium og analysert for både plasmidinnhold (se under ID) og evnen til å omdanne forskjellige3-naftylsubstrater, en indikasjon på lipolytisk aktivitet (se eksempel 2S).

D. Plasmid- isolering

D.l Inneholdende Thai IV 17- 1 lipasegen

Plasmidene isolert fra Thai IV 17-l/pUN121 tranformantene ble betegnet pATl og pAT3. Strukturen deres er angitt I figurene 2 og 3, respektivt. En tredje klon, betegnet pAT2, inneholdt et plasmid identisk med pATl-konstruksjonen. Genet som koder for den lipolytiske aktivitet, var beliggende innenfor et 2,7 kb EcoRI fragment til pATl (figur 2, striplet linje) og innenfor et 3,2 kb EcoRI fragment til pAT3 (figur 3, stiplet linje). De to EcoRI fragmentene ble subklonet i hensiktsmessige vektorer, begge for DNA sekvensering og for tilveiebringing av høyere utbytte av lipolytisk aktivitet.

Kloning av 2,7 kb EcoRI fragmentet fra pATl i pUN121 vektoren dannet det rekombinante plasmidet pETl (fig. 4). En prøve av E. coli JM101 hsdS recA inneholdende plasmid pETl ble deponert til CBS februar 5, 1987, under nr. CBS 157.87.

Kloning av 3,2 kb EcoRI fragmentet fra pAT3 i pUN121 vektoren dannet det rekombinate plasmidet pET3 (figur 5). En prøve av E. coli JM101 hsdS recA inneholdende plasmid pET3 ble deponert til CBS februar 5, 1987, under nr. CBS 155.87.

D.2 Inneholdende M- l lipasegen

Det rekombinante plasmidet isolert fra M-l/pUN121 tranfor-manten betegnet pAMl, ble isolert ogkarakterisert(figur 6). Biokjemisk karakterisering av den lipolytiske aktiviteten til pAMl viser derimot at dette plasmidet ikke kodet for den ventede lipasen (se også eksemplene 2 og 3). Derfor måtte andre strategier bli utviklet, og disse er illustrert nedenfor.

Plasmidet pAMl i E. coli JM101 hsdS recA ble deponert til CBS februar 5, 1987 under nr. 154.87.

D.3 Inneholdende IN II- 5 lipasegen

Delvis Sau3A kuttet Pseudomonas pseudoalcaligenes IN II-5 DNA fragmentene ble klonet i E. coli K12 DH1 stamme (ATCC 33849) ved anvendelse av plasmidvektor pUN121. Etter ligering og transformasjon til kompetente DHl-celler preparert som beskrevet av Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580, ble omtrent 1500 transformanter resistente overfor 50 ug/ml ampicillin og 8 jig/ml tetracyklin tilveiebragt. Transformanter med evne for hydrolysering av tributyrin og p- naftylacetat ble selektert for som beskrevet under 1C. Ut i fra en positiv klon, ble plasmid DNA isolert ogkarakterisertved bestemming av flere restriksjonsenzymgjenkjenningsposi-sjoner. Det fysiske kartet til dette plasmidet, betegnet pM6-5, er vist i figur 7.

Aktiviteten til E. coli DH1 (pM6-5) til p-naftylestere ble bestemt (tabell 1). En prøve av E. coli DH1 inneholdende plasmid pM6-5 ble depondert til CBS februar 5, 1987, under nr. 153.87.

D.4 Inneholdende Gr V- 39 lipase- gen

Delvis EcoRI<*>kuttet (betingelser ifølge Gardner et al., DNA 1 (/1982) 109-114) Acinetobacter calcoaceticus Gr V-39 DNA ble blandet med EcoRI linearisert pUN121 DNA. Etter resirku-lasjon ved anvendelse av T4polynukletidligase ble DNA-blandingen ført inn i jL_ coli DH1 (ATCC 33849) ved anvendelse av transformeringsprosedyren beskrevet tidligere i dette eksemplet. Alle 1800 tetracyklinresistente transformanter tilveiebragt ble screenet for lipolytisk aktivitet som beskrevet under 1C.

Tre kloner fra dette Gr V-39/pUN121 genbiblioteket produserte et lipolytisk enzym. Plasmid DNA fra en av disse klonene, betegnet det pP5-4, ble isolert ogkarakterisertmed restriksjonsendonuklease. Det fysiske kartet til dette plasmidet pP5-4 er vist i figur 8. Hydrolysen av p<->naftylestere med rå enzympreparater fra E_j. coli DH1 (pP5-4) ble deretter bestemt (tabell 1). Plasmid pP5-4 i E. coli DH1 ble deponert til CBS februar 5, 1987, under nr. 151.87.

EKSEMPEL 2

Karakterisering av klonede lipolytiske enzympreparater

A. Bestemming av lipolytisk aktivitet

Tributyrin-positive JL. coli-kolonier ble inokulert i 500 ml 100 ml 2TY medium inneholdende ampicillin og tetracyklln i en 500 ml konisk flaske. E^.coli-kul turer ble ristet i 40 t ved 30°C i en orbital rister ved 250 rpm. Pseudomonas og Acinetobacter-stammene ble dyrket ved 30°C. Etter 40 t var den optiske tettheten ved 575 nm målt, og kraften ble sentrifugert i en Sorvall RC5B-sentrifuge i en GSA-rotor ved 6.000 rpm i 10 min. Supernatanten ble lagret ved 4°C inntil enzymanalyse ble utført.

Cellene ble resuspendert i 4 ml lysis buffer (25$ sukrose, 50 mM Tris-HCl pH 7,5). Lysozym ble tilsatt, og etter inkubasjon i 30 min. ved 21°C, ble DNase (20 pg/ml) tilsatt og inkubasjonen ble fortsatt i 30 min ved 37°C. Triton-X100 (0,1$ v/v) ble tilsatt og cellesuspensjonene ble sonikert på is med et Labsonic 1510 sett (5 pulser i 30 sek. ved 100 watt med 1 min. intervaller). Celledebriet ble deretter fjernet ved sentrifugering i 15 min. ved 12.000 rpm i en Hettich Mikro Rapid/K-sentrifuge. Den tilveiebragte supernatanten ble deretter analysert for lipolytisk aktivitet. Analysen er basert på at lipolytiske enzymer hydrolyserer p<->naftylestere. p<->naftyl som blir frigjort reagerer med diazoniumsalt Fast Blue BB som produserer et azo-farvestoff absorberende ved 540 nm. Metoden er hovedsakelig som den til McKellar, J. Dairy Res. 53 (1986) 117-127, og ble utført som følger.

Reaksjonsrøret inneholdende i et finalt volum 2,0 ml: 1,8 ml 55 mM TES (N-tris(hydroksy-metyl)metyl-2-aminoetansulfonisk syre, Sigma); 0,02 ml 100 mM p<->naftylester løst opp i dimetylsulfoksyd (DMSO, Merck) eller metyl-cellusolv<R>acetat (Merck), 0,1 ml 120 mM NaTC (Na-taurocholat, Sigma) og 0,1 ml av et enzympreparat.

Kontroller uten enzym og p<->naftyl (Sigma) standarder uten enzym og substrat, ble også anvendt.

Corning sentrifugerør (15 ml) inneholdende reaksjonsblandingen, ble inkubert ved 37°C eller spesifisert temperatur i 30 min. En 0,02 ml 100 mM FB-oppløsning (Fast Blue BB-salt (Sigma), løst opp i DMSO) ble tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt i 10 min. Reaksjonen ble avsluttet med 0,2 ml 0,72 N TCA (trikloreddiksyre, Riedel-De Haen) og det farvede komplekset ble ekstrahert ved kraftig blanding med 2,5 ml 1-butanol (Merck). Lagerne ble separert ved sentrifugering ved 5.000 rpm i 5 min. i en Heraeus Christ minifuge RF. Absorban-sen av topplaget ble målt ved 540 nm ved anvendelse av et LKB ultraspec II spektrofotometer. Etter subtraksjon av kontrol-lene ble avlesningsresultatene omdannet til TLU (riktige lipaseenheter) ved anvendelse av Candida cyllndracea lipase (L1754, Sigma) som en standard. En TLU er definert som den titrerbare fettsyreekvivalenten til mengden av 1 jjmol NaOH/min (se også EP-A-0218272). Resultatene er vist i tabell 1 nedenfor.

Sammenligning av hydrolysedata til p<->naftylesterne, varierende acylkjedelengde fra C4til C^g, indikerer at: 1°. klonene inneholdende pAT3 og pET3 plasmidene produserer sanne lipaser; og 2°. klonene inneholdende pATl, pETl, pAMl, pP5-4 og pM6-5 plasmidene produserer enzymer med vesentlig esteraseaktiviteter. De fleste av de lipolytiske enzymene syntetisert av E. coli inneholdende rekombinante plasmider ble funnet i cellelysatene.

B. Ytterligere karakterisering av klonede lipolytiske

preparater

De klonede lipolytiske enzympreparatene blekarakterisert vedanvendelse av SDS gel-elektroforese på et Phastgel-system (Pharmasia) ved anvendelse av en Phastgel-gradient 10-15$ ifølge forhandlerens instruksjoner. Celle-frie ekstrakter fra E. coli-klonene pET3 og PHI-stammen med pTJN121 vektoren ble sammenlignet med delvis renset enzym fra donorstammen Thai IV 17-1 (Stuer et al., J. Bacteriol. 168 (1986) 1070-1079).

Prøve<p>reparering. Fire volum av en hensiktsmessig fortynning av enzympreparatene ble blandet med en del prøvebuffer inneholdende 10$ SDS, 10$ p<->merkaptoetanol i 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8. Denne oppløsningen ble delt inn i tre like deler. En del ble ikke utsatt for ytterligere behandling, men ble holdt ved romtemperatur inntil gelelektroforesen hadde funnet sted. De andre og tredje porsjonene ble oppvarmet i 5 og 10 min. ved 95°C, respektivt, etterfulgt av avkjøling på is og deretter holdt ved romtemperatur inntil den var kjørt på gelelektroforese.

Elektroforese. De behandlede prøvene, i duplikat, ble kjørt på elektroforese på Phastgelsystemet ved 65 volt/time. En gel ble farvet for protein med Coomassie Brillant Blue ifølge "Pharmacia Development technique file nr. 200". Figur 9A viser polypeptidmønstrene etter farging med Coomassie Brilliant Blue. Den andre gelen ble vasket med 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1$ Triton X-100 for å fjerne SDS og for å reak-tivere enzymaktiviteten, tilstedeværelse av lipolytisk aktivitet i den vaskede gelen ble visualisert ved en soft agar overlegningsteknikk basert på p<->naftylacetat/Fast Blue BB-saltmetoden, beskrevet i eksempel 1C. Etter inkubasjon i 30 min, ved 30°C, ble violette bånd synlige mot en klar bakgrunn. Som vist i figur 9B hadde lipasen fra E. coliPET3klonen og nativ P. stutzeri Thai IV 17-1 lipase (MW 40 kDA) identiske mobiliteter på SDS gelelektroforese. Begge enzymer viser en såkalt varmemodifiserbarhet. En lignende varme modifiserbarhet ble beskrevet for det ytre membranproteinet ( OmpA genproduk) til E. coli K12, Freudl et al., J.Biol. Chem. 261 (1986) 11355-11361.

EKSEMPEL 3

Konstruksjon av et Pseudomonas pseudoalcaligenes gen- bibliotek i bredspektrede vertsvektorer.

Som en alternativ strategi for kloning av lipasegenet fra P. pseudoalcaligenes M-l-stammen, ble et binært bredspektret vertskloningssystem anvendt som muliggjorde at genbanken ble screenet direkte ved komplementasjon mot forskjellige mutante stammer av Pseudomonaceae. To bredsspektrede vertsvektorer pLAFRl (Friedman et al., Gene 18 (1982) 289-296) og pKT248 (Bagdasarian et al., gene 16 (1981) 237-247) ble anvendt. Plasmid pLAFRl er et RH2-avledet kosmid med et bredt vertsområde med tetracyklinresistens og er mobiliserbar men ikke selv-transmisserbar. Plasmid pKT248 er et mobiliserbart R300B-avledet plasmid med et bredt vertsområde med streptomycin og kloramfenikolresistens. Forflytning (mobilisering) av disse vektorene fra E^coli til Pseudomonas ble utført ved hjelp av plasmid pRK2013, som inneholder RK2 overførings-funksjoner (Ditta et al., Proe. Nati. Acad,. Sei. USA 77

(1980) 7347-7351) ifølge den triparentale parringsprosedyren til Friedman et al., (Gene 18 (1982) 289-296). En lipase-negativ mutant 6-1 til P. aeruginosa stamme PAO 2302 (tilveiebragt fra S. Wohlfarth og U.K. winkler, Ruhr Universitåt, Bochum, FRG) ble anvendt som Pseudomonas mottaker (J. Gen. Microbiol. 134 (1988) 433-440).

Prepareringen av in vitro lambda phage-pakkingsekstraktene og pakking av pLAFRl DNA ble utført hovedsakelig som beskrevet av Ish-Horowicz og Burke (Nucleivc Acids Res. 9 (1981 (2989-2998). Totalt P. pseudoalcaligenes M-l DNA ble delvis spaltet med EcoRI eller Sali og ble ligert til enten EcoRI spaltet pLAFRl DNA eller Sali spaltet pKT248 DNA. Forholdet mellom innskudd og vektor var 5:1 for å redusere muligheten av vektor-til-vektor-ligering. Ligert M-l/pLAFl DNA ble pakket in vitro i lambda phage-hoder og injisert i E_j_ coli DH1 (Maniatis et al., supra 1982).

Omtrent 2.500 tetracyklinresistente transduktanter ble tilveiebragt pr. jjg P. pseudoalcali<g>enes M-l. Dersom det antas at P. pseudoalcaligenes har en genomstørrelse på 5.000 kb og at minst 50$ av de tetracyklinresistante transdukanter inneholder et innskudd på 20 kb, var 2.300 uavhengige kloner nødvendige for å forsikre en 99$ sannsynlighet for å finne en bestemt DNA-sekvens (Clark og Carbon, Cell 9 (1976) 91). Siden gen-biblioteket inneholdt mer enn 8.000 forskjellige rekombinante kolonier, var det sannsynlig at det inneholdt hele P.pseudoalcaligenes genomet.

Ligert M-l/pKT248 DNA ble transformert inn i kompetente E. coli-celler som beskrevet i eksempel 1. Transformantene til E. coli JM101 hsdS recA ble selektert for streptomycinresi-stens (Sm<R>) og kontra-selektert for kloramfenikolsensitivitet (Cm<s>).5.000Sm<R>Cm<s->kloner ble tilveiebragt. De to M-l gen-bibliotekene tilveiebragt i E_j_ coli-verten ble replika-platet og screenet for lipolytisk aktivitet som beskrevet i eksempel 1. Ingen av de 13.000 undersøkte rekombinante transformantene viste lipaseaktivitet.

Forflytning av klonen fra E. coli til P. aeruginosa PAO 2302 (6-1) ble derfor utført som følger. Rekombinante plasmider ble overført til Pseudomonas-mottagere ved replika-plating av donorstammer på et teppe av mottagerstammen (PA02302/6-1) og hjelpestammen (E^. coli MC1061 eller DH1 inneholdende pRK2013 plasmid). Etter vekst overnatt av donor, mottaker og hjelpestammen, på en Heart Infusion agarskål, ble ekskonjugater selektert for ved replika-plating på minimal agarmedium inneholdende 0,2$ citrat, metionin (10 jig/ml) og streptomycin eller tetracyklln.

Sitrat blir ikke metabolisert av E^coli. Gjendannelse av lip fenotypen til lipase-defekt mutant 6-1 med rekombinante plasmider ble undersøkt ved replika-plating av P. aeruginosa ekskonjugater på næringsmedium agarskåler inneholdende trioleoylglyserol og fluorescent-farvestoffet rhodamine B som beskrevet av Kouker and Jaeger, Appl. Env. Microbiol. 53

(1987) 211-213.

Fire av de 13.000 screenede ekskonjugatene viste lipase-aktivitet som vist ved utvikling av orange fluorescence-ringer synlig ved 360 nm, rundt de bakterielle koloniene etter 40 t ved inkubasjon ved 37° C. En av disse positive klonene, pALM5, ble valgt for videre karakterisering.

For å bekrefte at lipasen produsert av PAO 2302/6-1 ekskon-juganten inneholdende pALM5, har de ønskede kjennetegnene formidlet av lipasen fra P. pseudoalcaligenes M-l-stammen, ble enzymprøver preparert og utsatt for begge biokjemiske analyser (se eksempel 2) og SLM-testen (som beskrevet nedenfor i eksempel 10). Resultatene tilveiebragt i disse testene indikerte at den lipolytiske aktiviteten til enzymet produsert av pALM5-klonen hadde lignende kjennetegn som de til enzymet tilveiebragt fra foreldre M-l-stammen.

EKSEMPEL 4

Molekylær kloning av Pseudomonas pseudoalcaligenes M- l lipasegen

A. Proteinrensning og sekvensanalyse

Fermentering og preparering av en frysetørret supernatant av Pseudomonas pseudoalcaligenes M-l-stammen er beskrevet i EP-A-0218272. Det lipolytiske enzymet ble renset fra denne supernatanten vesentlig ifølge Wingerder et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 27 (1987) 139-145. Etter rensning var proteinpreparatet mer enn 80$ rent ifølge SDS-polyakrylamidgel-elektroforese med etterfølgende farging ved Coomassie Brilliant Blue (se figur 10).

N-terminal sekvensanalyse ble utført etter SDS gel-elektroforese og elektro-blotting på Immobilon overføringsmembran

(Millipore) ifølge Matsudaira (J. Biol. Chem. 262 (1987) 10035-10038). Denne analysen ga følgende sekvens (ved anvendelse av den konvensjonelle enkeltbokstav aminosyre-koden):

B. Kloning av M- l lipase- genet

To syntetiske 32-mer oligonukleotider:

ble avledet fra aminosyrene 6 til 15 (TGYTKTKYP I) av den N-terminale sekvensen til det modne lipaseproteinet som beskrevet ovenfor, etter at forskjellen i kodonene for Pseudomonaceae og degenererisiteten til den genetiske koden blir tatt med i betraktning. For anvendelse som en hybridiseringsprobe, ble oligonukleotidene endemerket ved anvendelse av T4 polynukleotidkinase.

Kromosomalt DNA blir isolert fra Pseudomonas pseudoalcaligenes M-l-stammen (CBS 473.85) ifølge Andreoli (Mol. Gen. Genet. 199 (1985) 372-380), kuttet med flere restriksjonsendonukleaser og separert på en 0,8$ agarosegel. Southern-blots av disse gelene ved anvendelse av radioaktivt merket 32-mer oligonukleotid som en probe, viste følgende unike hybridiserende DNA-bånd: 1,8 kb Bell. 2,0 kb PvuII og 1,7 Sali. Derfor ble M-l kromosomalt DNA kuttet separat med disse tre restriksjonsendonukleasene, fraksjonert ved 0,8$ agarosegel-elektroforese og de hybridiserende fraksjonene som er beskrevet ovenfor ble isolert ved elektroeluering i et bio-trap BT 1000 apparat fra Schlewicher og Schull.

Den 1,8 kb Bell spaltede fraksjon ble ligert inn i BamEI-kuttet defosforylert vektor pTZ18R/19E (forhandlet fra

Pharmacia, Woerden, Nederland). Den 2,0 kb PvuII spaltede fraksjonen ble ligert inn i Smal-kuttet defosforylert vektor pTZ18R/19R. Den 1,7 kb SalI-spaltede fraksjonen ble ligert inn i Sall-kuttet defosforylert vektor pZT18R/19R. Alle tre ligeringene ble transformert inn i kompetente coli JM101 hsdS recA-celler (som beskrevet av Andreoli, ovenfor) og sådd ut på Luria medium agarskåler som inneholdt ampicillin, X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolyl-g<->D-galaktopyrano-side) og IPTG (isopropyl-p-D-tiogalaktosid).

Omtrent 4xl0<3>hvite kolonier ble plukket på ferske agarskåler og screenet ved kolonihybridisering til radioaktivt merket 32-mer probe. Ved anvendelse av denne metoden ble 12 positive kloner tilveiebragt. Fra hver av disse positive klonene ble et plasmid mini-prep preparert ved den alkaliske lysis-metoden og kuttet med de hensiktsmessige restriksjonsendonukleasene ifølge instruksjonen til forhandleren. Seks plasmider inneholdt de ventede hybridiserende innskuddene. Ett av plasmidene som bare inneholdt 2,0 kb PvuII-fragmentet. betegnet pTMPvl8A, ble valgt for detaljert analyse. En prøve av E_;_ coli JM101 hsdS recA inneholdende plasmid pTMPvl8A, ble deponert til CBS mars 8, 1989, under nr. CBS 142.89.

E. coli pTZ18R/19R rekombinante transformanter tilveiebragt som beskrevet ovenfor, ble replika-platet og screenet for lipolytisk aktivitet som beskrevet i eksempel 2. Ingen av 5xl0<4>coli transformantene som ble undersøkt viste lipolytisk aktivitet. Flere grunner for dette kan nevnes: a) genekspresjonsinitieringssignalene til M-l lipasegenene ble enten ikke gjenkjent av E^. coli transkripsjon/- translasjonssystemet (se f.eks. Jeenes et al., Mol. Gen. Genet. 203 (1986) 421-429), b) en regulatorisk sekvens eller et protein er nødvendig for å aktivere dette M-l lipasegenet, c) riktig folding eller utskilling av M-l lipase i E. coli kan være utilstrekkelig. C. Karakterisering og sekvensering av M- l lipase- genet Plasmid pTMPvl8A ble kuttet med forskjellige restriksjons-enzymer som har 6 bp gjenkjenningssekvens. Analyser av fragmentstørrelsene som er et resultat av disse eksperiment-ene muliggjorde dannelsen av et preliminært restriksjonsendonuklease-kuttingskart av 2,0 kb PvuII innskuddet til pTMPvl8A. Dette kart er vist i figur 11.

pTZ18R/19R-vektorene anvendt tilveiebringer et allsidig "alt-i ett-system" som muliggjør DNA-kloning, dideoksy DNA-sekvensering, in vitro mutagenese og in vitro transkripsjon (Mead et al., Protein Engineering 1 (1986) 67-74). De dobbelt-trådede plasmidene ble omdannet til enkelt-trådet DNA ved superinfeksjon med en hjelper-fag M13K07, tilveiebragt fra Pharmacia.

En DNA-sekvensanalyse av et 0,94 kb DNA-fragment mellom Xhol og EcoRV til pTMPvl8A, er vist i figur 12. Denne DNA-sekvensen viste etter at enhver sekvensert i alle mulige leserammer en stor åpen leseramme som omfatter de NH2-terminale aminosyreresidiene til lipaseproteinet bestemt ved direkte aminosyresekvensering (residue 1 - 24), se dette eksempel under A. Metioninet i posisjon -24 er initieringskodonet til et preprotein på grunn av at metioninet går forut for en rekke aminosyrer som er vanlige for bakterielle signalpeptider (se Von Heijne, J. Mol. Biol. 192 (1986) 287-290). Dette signalpeptidet på 24 aminosyrer blir spaltet av i løpet av utskillingsprosessen etter A E A (-3 til -l) signalpeptidase-gjenkjenningssete. Det er å bemerke at regionen rundt cysteinresidiet til denne signalsekvensen er meget lik et lipoprotein konsensus-signalpeptid (se Von Eeyne, ibid. ).

Aminosyresekvensen bestemt fra DNA-sekvensen indikerer at modent M-l lipase består av et 289 aminosyreprotein som terminerer med TGA stopp-kodon (se figur 12). Den antatte molekylvekten til dette modne proteinet er 30.323 som er i samsvar med molekylvekten bestemt for M-l lipase (MW 31.500) ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (se figur 10).

EKSEMPEL 5

Molekylær kloning av pseudomonas

aeruginosa PAO lipasegenet

Pseudomonas aeruginose-lipasen er et lipidhydrolyserende enzym (EC 3.1.1.3), med en MW på omtrent 29.000, som blir skylt ut i mediet i løpet av den sene eksponensielle vekstfasen (se Stuer et al., J. Bacteriol. 168 (1986) 1070-1074 ).

A. Kloning og karakterisering

For å klone lipasegenet fra Pseudomonas aeruginosa PAO 1 stammen (ATCC 15692), ble et bredspektret vertskloningssystem anvendt som muliggjorde at genbanken ble screenet direkte ved komplementasjon mot forskjellige mutantstammer av Pseudomonaceae. Den bredspektrede vertsvektoren pKT248 (Bagdasarian et al., Gene 16 (1981( 237-247) ble anvendt, og er et flyttbart R300B-avledet plasmid med et bredt vertsområde med resistens overfor streptomycin og kloramfenikol.

Pseudomonas aeroginosa PAO 1 DNA ble delvis kuttet med restriksjonsendonuklease Sal I og ligert inn i det enkelte Sall-setet til pKT248-vektoren. Forholdet mellom innskudd:-vektor var 5:1 for å redusere muligheten av vektor-til-vektor-ligering. Ligert PA0/pKT248 DNA ble transformert inn i kompetente E_j_ coli SK1108 (Donovan og Kushner, Gene 25

(1983) 39-48) som beskrevet i eksempel IB. Transformantene til E_j_ coli SK1108 ble selektert for streptomycin-resistens (Sm<R>og kontraselektert for kloramfemikolsensitivitet (Cm^).

Sekstusen (6.000) Sm<R>Cm<s>kloner ble tilveiebragt og screenet for lipolytisk aktivitet som beskrevet i eksempel 2. Ingen av klonene viste slik aktivitet, og dette var sannsynligvis forårsaket av dårlig gjenkjenning av Pseudomonas-promoterene i E^.coli (Jeenes et al., ovenfor).

Overføring av klonene fra E^coli til Pseudomonas aeruginosa PAO 2302 lipase-negativ mutant 6-1 (Wohlfarth og Vinkler, J. Gen. Microbiol. 134 (1988) 433-440) ble derfor utført som følger; 6.000 kloner ble delt i 120 porsjoner som hver bestod av 50 kloner. Plasmid-preparatet ble tilveiebragt fra hver porsjon for å transformere kompetente celler av PAO 2302 (6-1) lip" mutanten. Kompetente Pseudomonas-celler ble preparert ifølge Olsen et al., J. Bacteriol. 150 (1982) 60-69. Seleksjon ble utført på kalsiumtriolein (CT) agarskåler (Wohlfarth og Vinkler, ovenfor), supplementert med streptomycin (50 jig/ml). Ti av de 5.000 screenede PAO-transf ormant-ene viste lipase-aktivitet og var synlige som hvite krystal-ler på toppen av koloniene. En av disse positive PAO-transf ormantene , pSWl, ble valgt for videre krakterisering.

Plasmidet innbefattet deri, blekarakterisert vedrestrik-sjonsanalyse etterfulgt av elektroforese på agarosegeler og ble funnet å inneholde et Sali innskudd på 3,1 kb bestående av et 1,3 kb, et 0,97 kb og et 0,76 kb Sali subfragment. Disse innskuddene ble subklonet i hensiktsmessige vektorer for DNA-sekvensering og for tilveiebringing av ekspresjon av lipasegenet.

Plasmid DNA fra en pUC19 avledet subklon, betegnet pSV103 (som inneholdt 1,3 og 0,97 kb innskuddene), ble isolert ogkarakterisertmed restriksjonsendonukleaser. Det fysiske kartet til dette plasmidet, pSW103, er vist i figur 13. En prøve av E^coli JM101 hsdS recA inneholdende plasmid pSW103, ble deponert til CBS mars 8, 1989, under nr. 141.89.

B. Sekvensering og karakterisering av Pseudomonas

aeruginosa PAO 1 llpase- gen

2,3 kb Sali innskuddet til pSW103 inneholdende PAO 1 lipasegenet, ble sekvensert ved hjelp av to fremgangsmåter: bådet en "tvunget" kloningssekvensering samt en "shot"-kloningssekvenseringsmetode til Deininger (Anal. Biochem. 129

(1983) 216-223) på M13 bakteriofagderivatene mpl8 og mpl9 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985) 103-119) dideoksy-kjedetermineringsteknikken ifølge Mizusawa et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1319-1324.

I den "tvungede" kloningssekvenseringsprosedyren ble Sall/ Pstl og SalI/ EcoRI fragmentene til 2,3 kb-innskuddene til pSW103 renset og ligert inn i en hensiktsmessig M13mpl8 vektor. Hele sekvensen ble oppnådd ved å slå sammen samlingen av de tilveiebragte stykkene av DNA-sekvensen. Det meste av DNA-sekvensen er blitt bestemt for begge trådene. Denne DNA-sekvensen viser når den blir translatert i alle mulige leserammer at bare 0,97 kb Sal I-fragmentet til pSW103 (se figur 14) koder for den modne PAO 1 lipasen.

1,3 kb SalI-fragmentet til pSW103 subklonen kodet ikke for, når translatert i alle mulige leserammer, de 24 N-terminale aminosyreresidiene til PAO 1 lipaseproteinet som bestemt ved direkte aminosyresekvensering.

Aminosyresekvensen tilveiebragt fra DNA-sekvensen til 0,97 kb SalI-fragmentet viser en interessant domene (betegnet A i figur 14).

Domene A koder for en aminosyresekvens G-H-S-H-G som allerede er definert som det aktive sentret til begge eukaryote lipasene (Wion et al., Science 235 (1987) 1638-1641; Bodmer et al., Biochem. Biophys. Acta 909 (1987) 237-244) og de prokaryotiske lipasene (Kugimiya et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 141 (1986) 185-190).

EKSEMPEL 6

A. Ekspresjon av klonet M- l li<p>ase i bakterier

For å forbedre ekspresjonsnivået til M-l-lipasen i heterologe verter, ble 2,0 kb Knp_I -Hindi 11-fragmentet til pTMPvl8A inneholdende M-l lipasegenet ligert inn i Kpnl og Hindlll-spaltede pBHA/Cl-vektorer. Nukleotidsekvensen til pBHAl- vektoren er beskrevet i EP-A-0275598. pBHCl-vektoren er lik pBHAl-vektoren med unntagelse av forskjellen ved ekspresjon av følgende antibiotikaresistensgener: kloramfenikol-acetyltransferase-genet (Cm) blir uttrykt i E>_ coli-stamme WK6 inneholdende pBHCl-vektoren og beta-laktamasegenet (Ap) blir uttrykt i E^. coli-stamme WK6 inneholdende pBHAl-vektoren. E. coli WK6-stammen er beskrevet av R. Zell og H.J. Fritz, EMBO J. 6 (1987) 1809.

Etter transformasjon av WK6 og analyse av enten de tilveiebragte ampicillin-resistente koloniene (når det gjelder pBHAl) eller de tilveiebragte kloramfenikol-resistente koloniene (når det gjelder pBHCl), ble de respektive plasmidene pBHAM-1 og pBHCM-1 funnet, se figur 15.

Det neste trinnet var innføring av et Ndel-restriksjonsendonuklease-sete på ATG-initieringskodonet til M-l preproteinet. Sete-rettet mutagenese på pBHA/CM-l-plasmidene ble utført som beskrevet av Stanssens et al., i "Protein Engineering and Site-Directed Mutagenesis", 24th harder Conference (1985), Ed. A.R. Fersht og G. Winter.

Etter mutagenese ble potensielle mutanter undersøkt for relevant mutasjon ved både restriksjonsenzymanalyse og sekvensanalyse ved anvendelse av dioksymetoden til Mizusawaet al., se eksempel 5. Etter disse analysene, ble det riktige plasmidet betegnet pBHAMlNl, ble funnet (se figur 16). For å oppnå regulert ekspresjon av M-l-lipase i E^. coli. ble 1,7 kb Ndel- HindiII-fragmentet til pBHAMlNl inneholdende M-l lipasestrukturelt gen isolert og ligert inn i to ekspre-sj onsvektorer; - pTZ18RN, et pTZ18R-derivat som inneholder et unikt Ndel-sete på ATG-initieringskodonet til beta-galaktosidase (se Mead et al., Protein Engineering 1 (1986) 67-74);

pMCTN, et pMC-derivat (se Stanssens et al., ovenfor) Inneholdende et unikt Ndel-sete etter en tac-promoter og ribosomalt bindingssete.

Etter transformasjon av de to ligeringene inn i kompetent E. coli JM-101 hsdS recA-celler. ble tilveiebragte transformantene screenet for lipolytisk aktivitet på tributyrin agarskåler som inneholdt 0,5 mM IPTG (isopropyl-p<->D-tiogalaktosid). Etter inkubasjon av disse tributyrinskålene ble 30°C i 48 t etterfulgt av lagring av platene i kjøleskap i flere dager, dannet noen kolonier en svak ring som viser lipolytisk aktivitet. Plasmidene til disse tributyrinpositive klonene blekarakterisert vedrestriksjonsenzymanalyse. De to plasmidene som det ble lett etter, ble funnet: pTZNIMl som inneholder M-l lipasegenet etter lac-kontroll-sekvensene (se figur 17); og - pMCTMI som inneholder M-l lipasegenet etter tac kontroll-sekvensene (se figur 18).

For å identifisere den lipolytiske aktiviteten produsert av E. coli-transformantene inneholdende plasmidene pTZNlM-1 og pMCTM-1, respektivt, ble disse klonene dyrket overnatt i 100 ml 2 TY medium (16 g/l Bacto tryptone, 10 g/l Bacto-gjærekstrakt, 5 g/l NaCl, pH 7,0) ved 30°C, etterfulgt av inkubasjon i 3 t med 0,5 mM IPTG ved 30° C. ]L_ coli-stamme JM-101 hsdS recA inneholdende pTZ18RN ble anvendt som en negativ kontroll. Cellene ble separert fra kultursupernatanten ved sentrifugering og deretter fordelt i periplasma og membran/- cytoplasmakomponenter ifølge Tetsuaki et al., Appl. Environmental Microbiol. 50 (1985) 298-303. Hver fraksjon ble analysert på SDS-polyakrylamidgeler Ifølge Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685, bestående av en 13$ separerende gel og en 5$ samlende gel. Gelene ble kjørt ved 60 mA helt til Bromophenol Blå (BPB) markøren nådde bunnen av gelen. Prøvepreparering og proteinblottingsprosedyre ble utført som beskrevet i EP-A-0253455. Western-blottet ble analysert ved anvendelse av polyvalent kaninantisera mot renset lipase fra P. pseudoalcaligenes-stamme M-l. Ut fra resultatene vist i figur 19 kan det konkluderes at E_j_ col_i-stammene inneholdende pTZNIMl og pMCTMI, respektivt, kan syntetisere og skylle ut i periplasma-området et M-l lipasespesifikt 31,5 kDa-polypeptid (se figur 19, kolonnene B og C). Den lipolytiske aktiviteten til denne 31,5 kDa polypeptidet ble bekreftet ved soft agar beleggsteknikk basert på p-naftylacetat/Fast Blue BB-saltmetoden, beskrevet i eksempel 1C.

EP-A-0275598 og EP-A-0253455 beskriver en fremgangsmåte for effektiv overføring til Bacillus av en beholder inneholdende et gen av interesse og som resulterer i Bacillus-stammer som effektivt utskiller de ønskede polypeptidproduktene. Denne f remgangmsåten ble anvendt for både Thai IV 17-1 og M-l lipasegenene.

Når det gjelder M-l lipase-genet ble pBHAMlNl-plasmidet (se ovenfor) spaltet med Ndel og religert. Ligeringsblandingen ble transformert inn i Bacillus licheniformis T9 protoplast-er. Et antall neomycinresistente tributyrinpositive kloner ble analysert og det riktige plasmidet ble tilveiebragt. Plasmidet ble betegnet pBHMlNl (se figur 20) med M-l proteinet etter H<p>alI-<p>romoteren til pUBllO (se Zyprian and Matsubara, DNA 5 (1986) 219-225). T9-transformantene inneholdende pBHMlNl-plasmidet ble testet for deres evne til å hydrolysere P-naftylestere etter fermentering i industriell kraft ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2. Resultatene tyder på at den lipolytiske aktiviteten til enzymet produsert av T9-klonene har lignende kjennetegn som det til lipasen tilveiebragt fra foreldre Pseudomonas<p>seudoal-caligenes M-l-stammen.

For ekspresjon i Pseudomonas-verter ble den konstitutive promoteren til p78-genet fra Pseudomonas spesifikt bakteriofag Pf3 anvendt (se R.G.M. Luiten, "The Filamentous Bacteriophage Pf 3: A Molecular Genetlc Study", PhD Thesis 1987, Catholic University of Nijmegen, The Netherlands). Et syntetisk DNA-fragment ble preparert kodende for denne Pf3-promoteren:<*35>*10

Dette fragmentet ble ligert inn i vektor pTZ18R spaltet med EcoRI og Kpnl som tilveiebragte plasmid pTZPf31A.

Plasmdiene pTZPf31A og pMCTMI ble kuttet både med BamHl og Hindlll, ligert og transformert i kompetente E. coli JM-101 hsdS recA-celler. Det riktige plasmidet hvor M-l-lipasegenet plassert under kontroll av Pf3-promoteren, ble tilveiebragt og betegnet pTZPf3Ml.

For å oppnå ekspresjon av det klonede M-l-lipasegenet i pseudomonader, ble M-l-kassettene tilstede i plasmidene pTMPvl8A, pMCTMI og pTZPf3M1, satt inn i plasmider med bredspektrede verter pKT231 (Bagdasarion et al., Gene 16

(1981) 237-247, pLAFR3 (Staskawisz et al., J. Bacteriol. 169 (1987 (5789-5794) og pJRD215 (Davison et al., Gene 51 (1987) 275-280). De tilveiebragte plasmidene med bredspektrede verter inneholdende M-l-ekspresjonskassettene, ble overført ifølge den trlparentale parringsprosedyren til Friedman et al., Gene 18 (10' 982) 289-296) til følgende Pseudomonas-stammer: den lipase negative mutanten 6-1 til P. aeruginose-stammen PAO 2302 (Wohlfarth og Vinkler, ovenfor). den lipase negative P. putlda-stammen KT 2442 (Zeyer et al., Applied Environmental Microbiol. 50 (1985) 1409-1413) the P. pseudoalcaligenes-stammen M-l (CBS 473.85)

P. pseudoalcaligenes-stammen IN II-5 (CBS 468.85).

Som en alternativ fremgangsmåte for overføring av plasmidene med bredspektrede verter fra Ej_ coil til Pseudomonas ble den elektrisk f elt-formidlede transformasjonen ("elektropora sjon") prosedyren anvendt ifølge manualen til Gene Pulser (Bio-rod Laboratories).

De tilveiebragte Psedomonas-transformantene ble testet for deres lipaseproduksjon etter fermentering i olivenolje-basert media som beskrevet av Odera et al., J. Ferment. Technol. 64

(1986) 363-371.

I følgende tabell 2 er den lipolytiske produktiviteten til de forskjellige stammene vist.

Lipasene produsert av disse Pseudomonas-transformantene ble analysert ved SDS gel-elektroforese og migrerte som lipasen produsert fra den opprinnelige P. pseudoalcaligenes-stammen M-l.

Forbedringen oppnådd ved innføring av multiple kopier av M-lekspresjonskassettene i P. pseudoalcaligenes-stammene er 2-4 ganger sammenlignet med nivået av lipase produsert av donorstammen. Det kan videre konkluderes at det opprinnelige genekspresjonsinitieringssignalet eller promoteren til M-l lipasegenet er aktivt i Psedomonas pseudoalcaligenes-stammene i forhold til PAO 1 og KT2442-stammene.

B. In vitro ekspresjon av klonet M- l lipasegenet

In vitro ekspresjon av M-l llpaseinneholdende kloner ble utført ved anvendelse av et prokaryotisk DNA-rettet transla-sjonskit (Amersham International). Dette systemet muliggjør in vitro-ekspresjon av gener innbefattet i et bakterielt plasmid dersom de relevante kontrollsignalene er tilstedeværende. Følgende fire bakterielle plasmider ble analysert: B.l. Plasmid pTMPvl8A (se figur 11) kodende for både M-l lipase og p-laktamasegenproduktene og tilfører ampicillin (Ap) resistens. pTMPvl8A inneholder egne reguleringssig-naler, promoter, Shine-Dalgarno og ledersekvens.

B.2. Plasmid pMCTMI (se figur 18) inneholder M-l lipasegenet og kloroamfenikolresistensgenet (Cm). I denne konstruksjonen blir lipasepromoteren utvekslet med en sterk tac-promoter.

B.3. Plasmid pMCTbliMl inneholder også M-l lipase-genet og kloroamfenikolresistensgenet. I denne konstruksjonen ble lipasesignalsekvensen utvekslet med a-amylasesignal-sekvensen (se EP-A-0224294). Promoteren var den samme som i konstruksjon pMCTMI.

B.4. Plasmid pTZ18RN (se figur 17) ble anvendt som en negativ kontroll.

DNA (0,5 pg) av de nevnte plasmidene ble transkribert in vitro. Denne reaksjonen ble utført ved tilsetning av 0,5 pl av 10xTB/10xNTP-blanding (en blanding av like volumer 20xTB og 20xNTP-blanding; 20xTB inneholder 800 mM Tris HC1 pH 7,5, 120 mM MgCl2og 40 mM spermidin; 20xNTP-blanding inneholder 10 mM ATP, 10 mM CTP, 10 mM GTP og 10 mM UTP), 0,5 pl av 0,IM DTT, 0,5 pl av RNasin (40 u/pl, Promega) og 0,5 pl av T7 RNA polymerase (15 u/pl, Promega) eller 1 pl av E. coli RNA polymerase (1 u/pl, Boehringer). Reaksjonsblandingen ble Inkubert ilt ved 39,5°C.

In vitro-translasjon av RNA-transkrlptene ble utført ifølge Instruksjonene til forhandleren. M-l lipase ble immunopresi-pitert som beskrevet av Van Mourik (J. Biol. Chem. 260 (1985) 11300-11306) ved anvendelse av monoklonale antistoffer mot M-1-lipase.

Som en negativ kontroll ble pTZ18RN anvendt (figur 21, kolonnene A og E). Immunopresipitasjon av pTMPvl8A (kolonne B) viser en ikke-prosessert M-l-lipase på 34 kDa. Immunopresipitasjon av pMCTM-1 (kolonne C) viser en Ikke-prosessert M-1-llpase på 34 kDa og den modne M-l lipasen på 31,5 kDa, mens Immunopresipitasjon av pMCTbliMl (kolonne D) viser den modne M-l-lipasen på 31,5 kDa. Fra in vitro translasjonseksperi-mentene kan det konkluderes at M-l-lipasegenet kan bli uttrykt i S-30 ekstrakter av E. coli-cellene. Data tilveiebragt ved in vitro-transkripsjon/translasjon av pTMPvl8A tyder på fravær av lipolytisk aktivitet på tributyrinskålene (se eksempel 4B) fordi det ikke er noen prosessering av M-l lipase.

EKSEMPEL 7

Molekylær enzvm- screening ved anvendelse av karakteriserte lipasegener som prober.

For å ytterligere demonstrere den generelle anvendbarheten, anvendte vi probene beskrevet i denne søknaden for å lete etter lipasegener med sammenlignbare karaktertrekk, og med opprinnelse fra andre mikroorganismer. Vi demonstrerte at vi kan selektere lipasegenene som koder for lipaser som har lik eller sammenlignbare vaskeanvendbarhet.

Som et eksempel beskriver vi anvendelse av DNA-innskuddene til plasmidene pTMPvl8A og pET3, respektivt, som hybrid!-seringsprober for å vise at homologe gener fra begge er tilstede i de fleste analyserte mikroorganismene. Det er ingen kryss-hybridisering mellom de to lipasegenene (kolonne A og kolonne B) og dette tyder på at hver av disse lipasekodende sekvensene kommer fra forskjellige forfedregener.

I eksempel 8 demonstrerer vi også at denne hybridiseringsteknikken gjør det mulig for oss å klone homologe lipasegener fra andre mikroorganismer.

For å oppnå dette, ble kromosomalt DNA fra følgende stammer, Pseudomonas pseudoalcaligenes M-l (CBS 473.85), P. pseudoalcaligenes IN II-5 (CBS 468.85), P. alcallgenes (DSM 50342) P. aeruglnose (PAC IR (CBS 136.85), P. aeruginosa PAO (ATCC 15692) (Wohlfarth og Vinkler, 1988, J. Gen. Microbiol. 134, 440). P. stutzeri Thai IV 17-1 (CBS 461.85); P. stutzeri PG-1-3 (CBS 137.89), P. stutzeri PG-I-4 (CBS 138.89), P. stutzeri PG-II-11,1 (CBS 139.89), P. stutzeri PG-II-11,2 (CBS 140.89), P. fragi DB1051, P. gladioli (CBS 176.86), Acinetobacter calcoaceticus Gr-V-39 (CBS 460.85) og Staphylococcus aureus (ATCC 27661) isolert, og 5 pg ble spaltet og analysert ved Southern blot-teknikk (Maniatis et al., ovenfor). DNA ble overført til et nitrocellulosefilter (Schléicher & Schuell, BA85; 0,45 mM). Filtrene ble prehybridisert i 6xSSC, 5xDenhardt, 0,5$ SDS og 100 pg/ml denaturert kalvetymus DNA.

Etter to timers preinkubasjon ble<32>P merket Innskudd av respektivt pTMPvl8A eller pET3 tilsatt, og hybridisering ble utført ved 55°C i løpet av 16 timer.

DNA-innskudd ble isolert ved spaltning av pTMPvl8A med Xhol og EcoRV og spaltning av pET3 med EcoRI, etterfulgt av separasjon av fragmentene ved 0,8$ agarosegel elektroforese og isolering av fragmentene ved glassmelkprosedyren (Gene Clean™). Innskuddet til pTMPvl8A, et 1 kb XhoI/EcoRV-fragment og innskuddet til pET3, et 3,2 kb EcoRI-fragment ble merket in vitro til høy, spesifikk aktivitet (2-5 10<8>cpm/jjg) med oc32P ATP ved nick-translasjon (Feinberg og Vogelsteln, Anal. Biochem. 132, 1983, 6-13). Det ble vist at probe-fragmentene har en gjennomsnittlig lengde varierende fra 300-800 baser.

Filtrene ble deretter vasket to ganger i 30' ved 55 °C i 6xSSC, 0,1$ SDS. Filtrene ble tørket ved romtemperatur og autoradiografert i 1-3 dager ved utsetting for KODAK X-omat AR-filmer eller Cronex 4 NIF 100 røntgenfilm (Dupont) med intensiverende skjermer ved -70°C (Cronex-lys pluss GH 220020).

Følgende ligning som er blitt tilveiebragt fra analysering av innvirkningen av forskjellige faktorer på hybridstabilitet-en: Tm = 81 + 16,6 (loglO Ci) + 0,4 ($ G + C) - 600/n -1,5$ feilparring (Current protocols in monecular biology 1987-1988), av Ausubel et al.)

n = lengden på den korteste kjeden til proben Ci = ionestyrke (M)

G+C = basesammensetning

ble anvendt for å bestemme homolog! som kunne bli påvist i våre eksperimenter. Dersom en probelengde var på 300 baser, var det mulig å påvise et homologt gen som minst utviser 67$ homologi med et fragment på 300 baser eller mer. Ved bestemming av prosentandel homologi, ble det antatt at GC-innholdet til Pseudomonas er 65$ (Normore, 1973, i Laskin og Lechevalier (ed), Handbook of microbiology vol. II, CRC press, Inc. Boca Raton. Fla).

Figur 22A viser hybridiseringsmønsteret til SalI-kuttet

kromosomalt DNA når det blir hybridisert med EcoRI-innskudd til pET3. De fleste Pseudomonas-stammene inneholder homologe gener til vår pET3-klon. I P. f ragi DB 1051 (kolonne M), A. calcoacetlcus Gr-V-39 (kolonne 0) og S. aureus (kolonne P) ble ingen homologe gener påvist. Moderate hybridiseringssignaler ble observert i P. alcali<g>enes (kolonne E), P. pseudoalcaligenes (kolonne C og kolonne D), P. aeruginosa (kolonne F og kolonne G) mens det ble observert svak hybridisering i P.<g>ladioli (kolonne N). Veldig sterk hybridisering ble sett i P. stutzeri-stammene (kolonne H til L), og det er ikke overraskende på grunn av at pET3 opprinnelig var avledet fra P. stutzeri Thai IV 17-1.

Figur 22B viser hybridiseringsmønsteret med EcoRV/ XhoI innskudd til pTMPvl8A.

Sterke hybridiseringssignaler ble tilveiebragt fra kromosomale DNA fra P.<p>seudoalcaligenes. (kolonne C og D), P. alcaligenes (kolonne E) og P. stutzeri-stammene (kolonne H til kolonne L). Svakere hybridisering ble oppdaget i kromosomalt DNA fra P. aeru<g>inosa (kolonne F og G) og ingen hybridisering ble funnet med kromosomale DNA fra P. f ragi DB1051 (kolonne M), P. gladioli (kolonne N), A. calcoaceticus Gr-V-39 (kolonne 0) og S. aureus (kolonne P).

EKSEMPEL 8

Kloning av homologelig lipasegener fra andre mikroorganismer For å demonstrere anvendbarheten, er anvendelse av plasmid PTMPvl8A for å klone et homologt gen med opprinnelse fra P. alcaligenes (DSM 50342) (se figur 22B, kolonne E) beskrevet.

I figur 22B, kolonne E, kan det sees at P. alcaligenes viseret klart 5,0 kb Sal I-fragment og et svakt 0,5 kb Sall-fragment, som hybridiserer med proben. Dette viser at P. alcaligenes inneholder et gen som minst har 67$ homologi i et fragment på 300 pasepar eller mer i forhold til XhoI/ EcoRV innskudet til pTMPvl8A plasmidet.

For å avgjøre om 5,0 kb Sal I-fragmentet til P. alcali<g>enes representerer et gen som koder for en lipase, ble Sall-fragmentene klonet. Et Sali genbibliotek ble konstruert ved hjelp av vektor pUC19 og transformert inn i E. coil JM109 (Yanish-Perron et al., Gene 33 (1985) 103-119). Replikafiltre av genbiblioteket ble hybridisert med a<32>P-merket innskudd av pTMPvl8A ved anvendelse av betingelsene som beskrevet i eksempel 7. Tre positive kloner som alle inneholdt et 5,0 kb SalI-fragment ble isolert fra biblioteket: pCHl, pCH2 og pCH3. 5,0 kb Sal I -fragmentet til pCHl ble påny klonet inn i vektor pKT248 (Bagdasarian et al., Gene 16 (1981) 237-247) ved hjelp av Sall-setet. som er beliggende i kloramfenikolresistens-genet. Streptomycinresistente kloramfenikolsensi-tive transformanter ble selektert i E. coli JM109. En av disse transformantene, pCHlOl, som inneholdt det antatt 5,0 kb Sali innskuddet ble transformert inn i Pseudomonas aeru<g>inosa 2302 (6-1) lip- (se eksempel 5).

Kolonier ble dyrket på NB-kalsium trioleinagar. Etter vekst ble platene lagret ved 10°C. Etter flere dager var en kalsiumutfelling synlig rundt de transformerte koloniene og ikke rundt de ikke-transformerte P. aeruginosa 2302 (6-1) lip-, som ble dyrket på lignende agarskåler uten antibiotika. Vi konkluderer med at det klonede 5,0 kg SalI-fragmentet komplementerer lip- fenotypen til P. aeruginosa 2302 (6-1) lip- og derfor koder for en ekstracellulær lipase, som kan bli produsert i en egnet vert.

På basis av DNA hybridiseringseksperimenter kan det konkluderes at denne lipasen viser homologi med M-l lipase og dermed med andre lipaser, som hybridiserer med pTMPvl8A innskuddet anvendt som en probe. Beskrivelsen av kloning av P. alcali<g>enes lipase representerer en generell anvendbar metode for å klone lipasegener som viser homologi med M-l lipase.

EKSEMPEL 9

Sammenligning av nukleotidsekvensen til lipase tilveiebragt fra Pseudomonas pseudoalcaligenes M- l med andre lipaser Nukleotidsekvensen til Psedomonas pseudoalcaligenes M-l lipase (figur 12) ble sammenlignet med den til Pseudomonas fragi (IFO-3458) lipase (Kugimiya et al., Biochem. Boiophys. Res. Commun. 141 (1986) 185-190), Staphvlococcus hvicus lipase (Gotz et al., Nucleic Acids Res. 13, (1985) 1891-1903) og Psedomonas aeru<g>inosa PA01 lipase (figur 14). En homologi på 81$ ble funnet mellom M-l lipase og P. aeru<g>inosa PA01 lipase og en homologi på 62$ ble funnet mellom M-l lipase og P. fragi (IFO-3458). sekvensen til P. fra<g>i lipase er derimot betraktelig kortere enn sekvensen til de to andre Pseudomonoas lipasene. Ingen homologi ble funnet mellom M-l lipase og Staphylococcus hyicus lipase.

Disse resultatene bekrefter data tilveiebragt i eksempel 7, hvor ingen hybridisering ble påvist med (kromosomalt DNA) avledet fra Pseudomonas fragi og Staphylococcus aureus. når pTMPvl8A ble anvendt som en probe.

Aminosyresekvensen tilveiebragt fr.a nukleotidsekvensen til

P. pseudoalcaligenes M-l lipase ble også sammenlignet med andre lipaser. Homologien mellom M-l lipase og P. aeruginosa PA01 lipase ble funnet å være (78$) og mellom M-l lipase P. fragi lipase 48$. Igjen ble ingen homologi funnet mellom aminosyresekvensen til M-l lipase og Sta<p>h<y>lococcus hyicus lipase. Nær homologi eksisterer derimot mellom de fire lipasene i regionen til essensiell serin 87 i moden M-l lipase. Kugimiya et al., (ovenfor), beskrev at sekvensen til denne region G-H-S-H-G er det aktive sentret til lipaseenzymene.

EKSDEMPEL 10

Kompatibiliteten av vaskemiddel til homologe lipaser

i SLM- test

Dette eksemplet illustrerer yteevnen til lipaseenzymene produsert av P. aeru<g>iuosa. P. stutzeri og P. alcaligenes-stammene som viser en høy grad DNA-sekvenshomonologi med M-l-genet, i en vaskeprosess ifølge den modifiserte SLM-test hvor kompatibiliteten til disse enzymene i moderne tøyvaskesammen-setning ble testet.

Vaskesammensetningene som ble anvendt var en pulvervaskemiddelsammensetning (ALL<R->base, beskrevet i EP-A-0218272) og en flytende vaskemiddelformulering (Liquid TIDER, også beskrevet i EP-A-0218272, men uten inaktivering av protease). Lipaseenzymene ble preparert ved dyrking av bakteriene ifølge følgende prosedyre: en inokulum kultur ble preparert ved dyrking av bakteriene i 100 ml hjerne-hjerte-infusjon (BHI) medium i en roterende ristemaskin ved 30"C i 24 timer. En lab-fermentor (2 liter) inneholdende 1,0 liter av et medium med sammensetningen nevnte nedenfor ble deretter inokulert.

Mediesammensetning

Fermentasjonen ble utført ved 30°C. Seksten timer etter inokulasjon ble tilførsel av soyaolje startet i en hastighet på 1 g/t og fortsatt i resten av fermentasjonen. Luftehas-tigheten var 60 l/t og agitasjonshastigheten var 700 rpm. Fermentasjonen ble kjørt i totalt 64 timer.

Etter fermentasjonen ble bakteriene fjernet ved sentrifugering. Supernatanten ble hurtig blandet under omrøring med 2,5 volum aceton ved romtemperatur. Blandingen ble deretter omrørt i 10 minutter, latt sedimentere og filtrert gjennom et glassfilter under sug. Filterkaken ble deretter vasket med 70$ aceton etterfulgt av 100$ aceton og deretter tørket under vakuum.

Lipaseenzympreparatene tilveiebragt på denne måten ble deretter undersøkt i SLM-prosedyren. Prosedyren for SLM-testen er beskrevet i EP-A-0218272. Denne prosedyren ble modifisert som følger: Et volum på 20 pl inneholdende 10 mg olivenolje løst opp i aceton (25$) ble aplisert på et polyesterstykke (3x3 cm) og lufttørket ved romtemperatur. En vaskeoppløsning bestående av 10 ml SHW (standard hardhet vann: 0,75 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2) eller vaskemiddel løst opp i SHW ble plassert i en Erlenmeyer-flaske (25 ml) med en kork, og holdt i et ristevannbad ved 40°C. De testede vaskemidlene var en pulvervaskemiddelsammensetning (ALL<R->base) og en flytende formulering (TIDER<->væske). Konsentrasjonen til ALL-base-vaskeoppløsningen var 4 g/l (pH 9,5). Konsentrasjonen til flytende TIDE var 1,5 g/l (pH 7,5). Oppløsningene ble buffret med 0,1 M Tris/HCl. Vaskeprosessen ble begynt ved tilsetning av enzympreparatet og rett deretter det skitne stykket, til ERlenmeyerflasken og ristet i 40 min. eller lengre ved 40°C. Den endelige lipasekonsentrasjonen var 2 TLU/ml.

Etter vask ble stykket renset med SHW og deretter tørket ved 55°C i en time. De tørkede stykkene ble påny vasket i den andre vaskesyklusen ved anvendelse av et friskt vaskemiddel og enzymoppløsning i 40 minutter. Etter den andre vaskesyklusen ble stykket behandlet med 0.01N HC1 i 5 min., skyllet og tørket ved romtemperatur overnatt. De tørkede stykkene ble ekstrahert ved rotasjon i et glassrør inneholdende 5 ml av et oppløsningsmiddel (n-heksan/isopropylalko- hol/maursyre: 975:25:2,5 (v/v), 1 ml/min.). Gjenværende triglyserid, diglyserid og fri fettsyre som ble dannet ble bestemt ved HPLC.

HPLC- utstyr og betingelser:

Kolonne: CP Microspher-Si (Chrompack), 100x4,6 mm Injeksjonsystem: V/isp (Millipore) 10 pl

Pumpe: Modell 2150 (LKB)

Påvisning: Brytningsindeksmonitor (Jobin Jvon) Integrator: SP 4270 (Spectra Physis)

Elueringsmiddel: n-heksan/isopropylalkohol/maursyre: 975:25:2,5 (v/v), 1 ml/min.

Temperatur: Rom

Retensjonstiden til triolein var 1,2 min., til 1,3 diglyserider var 2,5 min., til 1,2 diglyserldet var 3,6 min. og til oljesyre var 1,6 min. Toppområdet, eller topphøyden, ble bestemt som en Indikasjon på utbyttet av triglyseridet og fettsyren. Utbyttet av triglyseridet etter ekstraksjon fra det uvaskede stykket ble bestemt til 100$. Forholdet mellom brytningsindeksresponsene mellom triolein og oljesyre ble funnet å være 1,0 på basis av topphøyden.

Resultatene til disse SLM-testene er vist i følgende tabeller. I disse tabellene er utbyttet av triglyserider og totale lipider vist. Totalt lipidutbytte er triglyseridet pluss 1,2- og 1,3-diglyserider pluss frie fettsyrer. Forskjellen mellom totalt lipidutbytte og triglyseridutbytte er et mål på lipaseazktivitet og yteevne. Forskjellen mellom total lipidutbytte og kontroll (uten lipaseenzym) viser fjerning av oljeholdig flekk fra stoffet og demonstrerer at disse enzymene er stabile og effektive unde realistiske vaskebetingelser, som simulert i SLM-testen.

Claims (6)

1. Transformert mikrobiell vertcelle,karakterisert vedat den omfatter en ekspresjonskassett som i sin 5 *-3'-retning for transkripsjon inkluderer: (1) en transkripsjonsregulatorisk region og en transla-sjonsinitieringsregion funksjonell i nevnte vertcelle ; (2) en DNA-sekvens som koder for et lipolytisk enzym ervervet fra en prokaryotisk mikroorganisme, idet nevnte DNA-sekvens er en 300 bp nukleinsyresekvens av det lipasekodende genet på pTMPvl8A (CBS 142.89) eller pET3 (CBS 155.87); og (3) translasjon og transkripsjonstermineringsregioner funksjonelle i nevnte vertcelle, hvori ekspresjon av nevnte DNA-sekvens er regulert ved nevnte transkripsjons- og translasjonsregioner, og omfatter eventuelt en ledersekvens koblet i riktig leseramme 5' til et gen som koder for nevnte lipolytiske enzym, og at nevnte ekspresjonskassett eventuelt omfatter et markørgen.;

2. Transformert vertcelle ifølge krav 1,karakterisert vedat vertcellen er en prokariotisk celle.;

3. Transformert vertcelle ifølge krav 2,karakterisert vedat den prokaryote cellen er en Bacillus, E. coli eller Pseudomonas- celle.;

4. Transformert vertcelle ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte DNA-sekvens er ervervet fra P. stutzeri Thai IV 17-1 (CBS 461.85) eller P. pseudoalcaligenes M-l (CBS 473.85).;

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et lipolytisk enzym,karakterisert vedat nevnte metode omfatter: (1) dyrkning i et næringsmedium av en vertcelle som omfatter en ekspresjonskassett som inkluderer i transkripsjonen 5 *-3'-retning en transkripsjonsregulatorisk region og en translasjonsinitieringsre-gion funksjonell i nevnte vertcelle; en DNA-sekvens som koder for nevnte lipolytiske enzym ervervet fra en prokaryotisk mikroorganisme; hvorav nevnte DNA-sekvens er en 300 bp nukleinsyresekvens fra det lipasekodende genet på pTMPvl8A (CBS 142.89) eller pET3 (CBS 155.87) og translasjons-og translasjonstermineringsregioner funksjonelle i nevnte vertcelle, hvori ekspresjon av nevnte DNA-sekvens er under regulatorisk kontroll av nevnte transkripsjons- og translasjonsregioner; og (2) isolering av nevnte lipolytiske enzym fra næringsme-diumet.

6. Rekombinant DNA-konstruksjon,karakterisertved at den omfatter: (1) i transkripsjonsretningen, en transkripsjonen regulatorisk region som er funksjonell i en mikrobiell vertcelle; (2) en DNA-sekvens kodende for et lipolytisk enzym oppnådd fra en prokarytisk mirkoorganisme, nevnte DNA-sekvens er en 300 bp nukleinsyresekvens av det lipasekodende genet på pTMPvl8A (CBS 142.89) eller pET3 (CBS 155.87); og (3) en transkripsjonen termineringsregulatorisk region som er funksjonell i nevnte vertcelle, og at nevnte rekombinante DNA-konstruksjon eventuelt omfatter minst ett av et seleksjonsmarkørgen og én sekretorisk ledersekvens.