FI102295B - Lipolyyttisiä entsyymejä koodaavien geenien molekulaarinen kloonaus ja ilmentyminen - Google Patents

Description

102295

Lipolyyttisiä entsyymejä koodaavien geenien molekulaari-nen kloonaus ja ilmentyminen -

Molekylär kloning och uttryckning av gener, som kodar för lipolytiska enzymer Tämä keksintö koskee entsyymien valmistusta yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla, rasvapitoisten aineiden entsymaattista hajotusta varten, erityisesti sellaisten lipolyyt-tisten entsyymien valmistusta, joilla on ominaisuuksia, jotka tekevät niistä sopivia käytettäväksi detergenttien lisäaineina.

Pyykinpesuun liittyvänä erityisenä ongelmana on rasvaluon-teisten tahrojen poistaminen. Tällä hetkellä rasvaa sisältävä lika emulgoidaan ja poistetaan käyttäen korkean lämpötilan ja korkean alkalisuuden yhdistelmää. Viime aikoina on kuitenkin esiintynyt voimakasta pyrkimystä käyttää suhteellisen alhaisia pesulämpötiloja, nimittäin noin 40eC tai vähemmän, jotka olosuhteet ovat erityisen sopimattomat rasvatahrojen poistamiseen. Siitä johtuen tarvitaan pesuaineiden lisäaineita, jotka ovat tehokkaita alemmissa pe-sulämpötiloissa, pysyviä voimakkaasti aikalisissä pesuai-neliuoksissa ja pysyviä varastointiolosuhteissa sekä kiinteissä että nestemäisissä pesuainekoostumuksissa. Entsyy-miryhmä, joka hydrolysoi triglyseridejä, käsittää lipaasit .···. (E.C. 3.1.1.3.). Lipaasit ovat laajalti levinneitä, esiin- y.·' tyen monissa eri prokaryoottisissa organismeissa, samoin- • · · . kuin eukaryoottisissa soluissa. Entsyymilähteestä riippu- en, substraattispesifisyys, samoin kuin muut ominaisuudet, mukaanlukien pysyvyys erilaisissa olosuhteissa, vaihtele-vat laajasti. Lipaaseja on käytetty pesuainekoostumuksis-sa, käytettyjen lipaasien ollessa kuitenkin puhdistuste-' ' hoitaen alhaisia pesuolosuhteissa, ja lisäksi pysyvyysvaa timuksiltaan riittämättömät käytettäväksi pesuaineissa.

102295 2

Lipolyyttisiä entsyymejä, joihin liittyy kyky osoittaa li-paasiaktiivisuutta nykyaikaisissa pesuolosuhteissa, so., ovat pysyviä ja tehokkaita suurissa pesuainepitoisuuksis-sa, korkeassa pH:ssa ja alhaisissa pesulämpötiloissa, tuottavat tietyt kannat, jotka kuuluvat lajeihin Pseudomonas pseudoalcaliqenes, Pseudomonas stutzeri ja Acineto-bacter calcoaceticus (katso EP-A-0218272). Nämä lajit ovat kuitenkin kasveille ja eläimille potentiaalisesti patogeenisiä, ja käytettävissä on hyvin vähän tietoja koskien fermentointiolosuhteita, joita tarvitaan lipaasien tehokkaassa tuotantoprosessissa käyttäen näitä mikro-organismeja.

Siitä johtuen on edullista kehittää tehokas ja turvallinen tapa lipolyyttisten entsyymien tuottamiseksi, jotka sisältävät pesuaineiden lisäaineille edullisia ominaisuuksia.

Sen lisäksi on edullista, että isäntäorganismi erittää li-paaseja, niin että entsyymi voidaan ottaa suoraan talteen fermentointiseoksen sisältämästä ekstrasellulaarisesta nesteestä.

Pseudomonas-lajien tuottamien lipaasien osalta tiedetään, että viljelyolosuhteet vaikuttavat voimakkaasti näiden entsyymien lopulliseen sijaintipaikkaan (Sugiura, "Lipases", ed. B. Borgstrom ja H.L. Brockman (1984) ss. 505-523, Elsevier, Amsterdam). Ongelmat liittyvät usein hete- ;*··. rologisten geenien tehokkaan ilmentymisen saavuttamiseksi • · · mikro-organismeissa, mukaanlukien ongelmiin muodostuneiden • · · proteiinien virheellinen laskostuminen, proteiinien hajoa- * * minen ja tuotteiden sopimaton sijoittuminen. Harris, • · ♦ :...; "Genetic Engineering", voi. 4 (1983), Academic Press, New .:. York. E. colissa erityskloonausvektoreiden käyttö mahdol- • * « · .·. listaa yleensä heterologisten geenituotteiden kuljetuksen periplasmiseen tilaan, ja tuotteita tavataan vain satunnaisesti kasvualustasta; Lunn et ai., Current Topics in Microbiol, and Immunol. 125 (1986) 59-74. Käytettäessä E.

, 102295 colla isäntäsoluna, kloonatut mikrobiset lipaasit, joita Gotz et ai., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 5895-5906, Kugi-miya et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 141 (1986) 185-190 ja Odera et ai., J. Ferment. Technol. 64 (1986) 363-371, kuvailevat, erittyvät heikosti kasvualustaan.

Wohlfarth ja Winkler, J. Gen. Microbiol. 134 (1988) 4 3 3-440, selostavat fysiologista karakterisointia koskien Pseudomonas aeruginosa-kannan PAO 2302 äskettäin eristettyjä lipaasinegatiivisia mutantteja ja vastaavan geenin kromosomikartoitusta ja kloonausta.

Bacillus-lajeja, erityisesti Bacillus subtilis -kantoja, on käytetty vaihtelevalla menestyksellä isäntäkantoina sekä vieraiden että endogeenisten geenien ilmentämiseen ja kooditettujen proteiinituotteiden erittämiseen. Katso esimerkiksi katsausjulkaisu Sarvas, Current Topics in Microbiology and Immunology 125 (1986) 103-125, H.C. Wu ja P.C. Tai, ed., Springer Verlag; katso myös Himeno et ai., F.E.M.S. Microbiol. Letters 35 (1986) 17-21.

US-patenttijulkaisussa no. 3 950 277 ja GB-patenttijulkaisussa no. 1 442 418 tuodaan esille lipaasientsyymejä liitettynä yhteen aktivaattorin ja kalsium- ja/tai vastaavasti magnesium-ionien kanssa, joita käytetään likaisten kankaiden esiliotukseen ja triglyseriditahrojen ja -lian :*·*: poistamiseen polyesterikankaista tai vastaavasti polyesteri*. ri/puuvilla-sekoitekankaista. Sopiviin esille tuotuihin • · · mikrobilipaaseihin lukeutuvat ne, jotka ovat peräisin mik- * * robeista Pseudomonas, Asperqillus, Pneumococcus, Staphylo- :...: coccus, Mycobacterium tuberculosis, Mycotorula lipolytica .:. ja Sclerotinia.

• · · · GB-patenttijulkaisussa n:o 1 372 034 tuodaan esille pesu-ainekoostumus, joka sisältää bakteerilipaasia, jota Pseudomonas stutzerl -kanta ATCC 19154 on tuottanut. Patentti 4 102295 julkaisussa tuodaan edelleen esille, että edullisten lipo-lyyttisten entsyymien pH-optimin tulisi olla välillä 6-10, ja niiden tulisi olla aktiivisia mainitulla alueella, edullisesti välillä 7-9. (Tämä oletettu Pseudomonas stut-zerl -kanta on luokiteltu uudestaan Pseudomonas aeruqino-saksl).

EP-A-patenttihakemuksessa n:o 0130064 tuodaan esille ent-symaattinen pesuaineiden lisäaine, joka sisältää lipaasia, joka on eristetty Fusarium oxysporumista, jonka lipolyyt-tinen puhdistusteho on korkeampi kuin tavanomaisilla li-paaseilla. Lipolyyttisiä pesuaineiden lisäaineita tuotiin esille myös esim. GB-patenttijulkaisussa n:o l 293 613 ja CA-patentissa n:o 835 343.

Patenttihakemuksissa EP-A-0205208 ja EP-A-0206396 tuodaan esille Pseudomonas- ja Chromobacter-llpaaslen käyttö pesuaineissa. Perusteellisena katsausartikkelina, koskien li-paaseja pesuaineiden lisäaineina, katso Andree et ai., J. Appi. Biochem. 2 (1980) 218-229.

Keksintö koskee uusia koostumuksia käsittäviä transformoi-: tuja mikrobisoluja ja menetelmiä niiden valmistamiseksi, • '·· jotka solut tuottavat lipolyyttisiä entsyymejä, jotka ovat : : : sopivia käytettäväksi pesuainekoostumuksissa. Isäntämikro- • bisoluja transformoidaan käyttämällä ekspressiokasetteja, • ·· · .’j'. jotka sisältävät DNA-sekvenssin, joka koodittaa lipolyyt- tistä entsyymiä, joka on aktiivista alkalisessa pHrssa ja pysyvä pyykinpesuolosuhteissa. Lipolyyttisten entsyymien . . valmistusmenetelmiin kuuluu kloonaus ja ilmentäminen mik- • · · robisysteemeissä ja seulonta perustuen DNA-homologiaan.

• · · • · · : Keksintö koskee myös kahta uutta DNA-sekvenssiä, mainit- • · · · tujen DNA-sekvenssien sisältäessä lipolyyttistä entsyymiä koodittavan geenin, joka on peräisin Pseudomonas pseudoal-callqenes -kannasta ja vastaavasti Pseudomonas aeruqlnosa-*···* kannasta.

102295 5 •f

Erityisenä kiinnostuksen kohteena lipaasituotannon kannalta ovat lipaasigeenit, jotka ovat peräisin tietyistä Pseu-domonas-lajeista.

Kuvio 1: Lipolyyttisen entsyymin geenin kloonausstrategia. Symbolien osalta, katso selitystä kuviossa 2.

Kuvio 2: pATl:n restriktiokartta. Joitakin restriktioent-syymien tunnistuskohtia on määritetty plasmidista pATl.

I 1 : pUN121 vektori-DNA I: Thai IV 17-1 DNA-insertti Käytetyt symbolit ovat: - Ori E. coli: E. colin replikoinnin aloituskohta - Apr: pUN121-geeni, joka koodittaa ampisilliiniresistens-siä; - Tcr: pUN121-geeni, joka koodittaa tetrasykliiniresis-tenssiä; - cl: bakteriofagi-lambdan geeni, joka koodittaa cl-repres-soria.

Bell/Sau3A:11a osoitetaan kohta, jossa Pseudomonas stutze-ri -kannan Thai IV 17-1 (CBC 461.85) osittain Sau3A:lla pilkottu kromosomaalinen DNA liitettiin plasmidiin pUNl2l. Lipolyyttistä aktiivisuutta koodittavan geenin paikka osoitetaan katkoviivalla.

««· • · • · ·· ·

Kuvio 3: pAT3:n restriktiokartta. Symbolit ovat samoja, • · · ——— joita käytettiin kuviossa 2.

• · • · ·

Kuvio 4: pETl:n restriktiokartta. Symbolit ovat samoja, • · joita käytettiin kuviossa 2.

Kuvio 5: pET3:n restriktiokartta. Symbolit ovat samoja, joita käytettiin kuviossa 2.

102295 6

Kuvio 6: pAMl:n restriktiokartta. Symbolit ovat samoja, joita käytettiin kuviossa 2.

Kuvio 7: pM6-5:n restriktiokartta. Symbolit ovat samoja, joita käytettiin kuviossa 2.

Kuvio 8: pP5-4:n restriktiokartta. Symbolit ovat samoja, joita käytettiin kuviossa 2. EcoRI/EcoRI*:llä osoitetaan kohta, jossa Acinetobacter calcoacetlcus -kannan GR v-39 (CBS 460.85) osittain EcoRI*:llä pilkottu kromosomaalinen DNA liitettiin plasmidiin pUN121.

Kuvio 9: 10-15-%:nen SDS-gradientti Phastgel (Pharmacia)

Kuvio 9A: värjäyksen jälkeen värillä Coomassie Brilliant Blue.

Kuvio 9B: värjäyksen jälkeen värillä p-naftyyliasetaatti/-Fast Blue BB.

Kaista 1: lysaatti E. coli -kannasta JM101 hsdS recA, joka sisältää plasmidin pUN121, kuumennettuna SDS:n kanssa 10 minuutin ajan 95eC:ssa.

Kaista 2: lysaatti E. coli -kannasta JM101 hsdS recA, joka sisältää plasmidin pET3, kuumennettuna SDStn kanssa 10 minuutin ajan 95*C:ssa.

Kaista 3: Viljelmän supernatantti P. stutzeri -kannasta .··*. Thai IV 17-1, kuumennettuna SDS:n kanssa 10 minuutin ajan 95°C:ssa.

• · ·

Kaista 4: sama näyte kuin kaistalla 2, mutta kuumennettuna SDS:n kanssa 5 minuutin ajan 95eC:ssa.

• · ♦

Kaista 5: sama näyte kuin kaistalla 3, mutta kuumennettuna « · SDS:n kanssa 5 minuutin ajan 95*C:ssa.

Kaista 6: sama näyte kuin kaistalla 2, mutta inkuboituna SDS:n kanssa 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa.

Kaista 7: sama näyte kuin kaistalla 3, mutta inkuboituna SDS:n kanssa 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa.

102295 7

Kaista 8: pienimolekyylipainoisia proteiinimarkkereita Pharmacialta.

Kuvio 10: 13-%:nen SDS-polyakryyliamidigeeli värjäyksen jälkeen Coomassie Brilliant Bluella.

Kaista 1: puhdistettu M-l -lipaasi

Kaista 2: pienimolekyylipainoisia proteiinimarkkereita (Pharmacia).

Kuvio 11: pTMPvl8A:n restriktiokartta.

pTil8R vektori-DNA M-l DNA-insertti Käytetyt symbolit ovat: - Ori E. coli: E. colln replikoinnin aloituskohta saatuna pBR322-vektorista - fl ori: replikoinnin aloituskohta rihmamaisesta bakteriofagista fl - PT7: bakteriofagin T7 promoottori in vitro -kopioiden valmistamiseksi : - Apr: ampisilliiniresistenssiä koodittava geeni ' ' - Lip: M-l -lipaasia koodittava geeni.

Kuvio 12 esittää M-l -lipaasigeenin nukleotidisekvenssiä (so. ensimmäiset 942 nukleotidiä) ja M-l -lipaasin johdettua aminohapposekvenssiä. Lopetuskodoni TGA osoitetaan :1: tähdellä. Laatikko A esittää lipaasiproteiinin aktiivista ·«· keskusta. Nuoli osoittaa oletettua signaalipeptidaasin • ; katkaisukohtaa. Toimintavalmiin lipaasiproteiinin amino- terminaalinen sekvenssi on alleviivattu.

• · · • * • « • · « • ·

Kuvio 13: pSWl03:n restriktiokartta • * · · • t * · · I ) : pUC19 vektori-DNA : PAO 1 DNA-insertti Käytetyt symbolit ovat: 102295 8 - Ori E. coli: E. colln replikoinnin aloituskohta, joka on saatu pBR322-vektorista - Plac: E. colin lac-operonin promoottori - Apr: ampisilliiniresistenssiä koodittava geeni - Lip: PAO 1 -lipaasia koodittava geeni.

Kuvio 14: PAO-lipaasigeenin osittainen nukleotidisekvenssi (so. sisäisestä Sali-kohdasta lähtien) ja PAO-lipaasin johdettu aminohapposekvenssi. Lopetuskodoni TAG osoitetaan tähdellä. Laatikko A esittää lipaasiproteiinin aktiivista keskusta.

Kuvio 15: Plasmidien pBHAMl ja pBHCMl konstruointi. Käytetyt symbolit ovat: - Bacillus ori: Bacilluksen replikoinnin aloituskohta - Kmr: pUBllO-geeni, joka koodittaa neomysiiniresistenssiä - Cm: Tn9-transposonigeeni, joka koodittaa kloramfenikoli- • « resistenssiä.

- PHpall: plasmidin pUBHO Hpall-promoottori.

• Muut symbolit kuten kuviossa 11.

Kuvio 16 esittää plasmidin pBHAMINl konstruointia. Symbolit ovat samat, joita käytettiin kuviossa 15.

Kuvio 17 esittää plasmidin pTZNIMl konstruointia. Käytetyt ;***; symbolit ovat: ··· .·:·. - lac Za: LacZ-geenin N-terminaalinen osa, joka koodittaa '· · β-galaktosidaasin a-aluetta.

* * - Plac: E. colin lac-operonin promoottori.

Muut symbolit kuten kuviossa 11.

• · ··· .·. : Kuvio 18 esittää plasmidin pMCTMl konstruointia. Käytetyt * « t 11 symbolit ovat: - Cmr: geeni, joka koodittaa kloramfenikoliresistenssiä - Ptac: hybridi trp-lac E. colin promoottori.

Muut symbolit kuten kuvioissa 11 ja 15.

102295 9

Kuvio 19: Transformoitujen E. coll -solujen tuottaman M-l-lipaasiproteiinin immunoblottaus-määritys.

Kaistat A-D sisältävät E. coll -solujen periplasmisia fraktioita, jotka sisältävät seuraavat rakenteet:

Kaista A: pTZlSRN Kaista B: pTZNIMl Kaista C: pMCTMl

Kaista D: puhdistettu M-l -lipaasi Pseudomonas pseudoalca-llqenes -kannasta M-l. Markkeriproteiinien (RainbowTM Amershamilta) molekyylimassa esitetään oikealla kDa-yksik-köinä.

Kuvio 20: Plasmidin pBHMINI konstruointi. Symbolit ovat samoja, joita on käytetty kuviossa 15.

Kuvio 21: In vitro syntetisoitujen, 35S-leimattujen proteiinien autoradiogrammi.

Kaistat A-D: In vitro luettujen näytteiden immunopresipi-taatio monoklonaalisten vasta-aineiden avulla M-l -lipaa-sia vastaan.

Kaistat E-H: seuraavien plasmidien in vitro transkriptio/-translaatio -tuotteita:

Kaistat A ja E: pTZ18RN Kaistat B ja F: pTMPvl8A Kaistat C ja G: pMCTMl Kaistat D ja H: pMCTbliMl • «

Kuviot 22A ja 22B: Lipaasia koodittavien sekvenssien il- • · · | maiseminen bakteeri-DNA:sta. Viiden nanogramman määriä ·:·*: plasmidi-DNA:ta ja viiden mikrogramman määriä kromosomaa- :***; lista DNA:ta pilkottiin restriktioentsyymillä kuten on • · · ·.* osoitettu, erotettiin 0,8-%:sella agaroosigeelillä, bio- • · · ·;··_ tattiin nitroselluloosakalvoille ja hybridisoitiin pET3:n ja pTMPvl8A:n katkotranslaatio-insertin kanssa vastaavasti.

102295 10

Kuvio 22A esittää autoradiogrammia hybridisaation jälkeen pET3:n EcoRI-lnsertin kanssa.

Kuvio 22B esittää autoradiogrammia hybridisaation jälkeen pTMPvl8A:n XhoI-EcoRV -insertin kanssa.

Kaista A: Hindlll/Sstl-digesti plasmidista ρΤΜΡνίβΑ Kaista B: EcoRI-digesti plasmidista pET3.

BRL:n DNA-geelimarkkeri. MP 0,5, 1,0, 1,6, 2,0,

3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ke Kaista C: Sall-digesti P. pseudoalcaliqenes M-l:stä (CBS

473.85)

Kaista D: Sall-digesti P. pseudoalcaliqenes IN II-5:stä (CBS 468.85)

Kaista E: Sall-digesti P. alcaliqenes DSM 50342:sta Kaista F: Sall-digesti P. aeruginosa PAC lR:stä (CBS 136.89)

Kaista G: Sall-digesti P. aeruginosa PA02302:sta (6-1)

Kaista H: Sall-digesti P. stutzeri Thai IV 17-1:stä (CBS

461.85)

Kaista I: Sall-digesti P. stutzeri PG-I-3:sta (CBS 137.89) Kaista J: Sall-digesti P. stutzerl PG-I-4:stä (CBS 138.89) Kaista K: Sall-digesti P. stutzeri PG-II-ll,l:stä (CBS

139.89)

Kaista L: Sall-digesti P. stutzeri PG-II-ll,2:sta (CBS

140.89)

Kaista M: Sall-digesti P. fragista serm. DB1051 (= Ferm BP1051) • · **;.** Kaista N: Sall-digesti P. gladlollsta (CBS 176.86) ♦ * ·

* Kaista O: Sall-digesti A. calcoaceticus Gr-V-39:stä (CBS

·:··: 460.85)

Kaista P: Sall-digesti S. aureuksesta (ATCC 27661).

• · « · ·

Esillä olevan keksinnön mukaisesti annetaan käyttöön uusia '· DNA-rakenteita ja uusia koostumuksia käsittäviä mikrobi- kantoja, jotka tuottavat lipolyyttisiä entsyymejä. Esillä olevan keksinnön mukaisesti kiinnostavien lipaasien pH- 102295 11 optimi on välillä noin 8-10,5, niiden lipaasiaktiivisuuden ollessa tehokas vesipitoisessa liuoksessa, joka sisältää puhdistuskoostumusta pitoisuuksissa aina noin 10 g/1 saakka, pesuolosuhteiden ollessa lämpötilassa 60eC tai vähemmän, edullisesti 30-40eC, ja pH:ssa välillä noin 7-11, ja edullisesti välillä noin 9-10,5. Plasmidirakenteita, jotka sisältävät DNA-sekvenssin, joka koodittaa lipaasigeeniä, joka sisältää edullisia ominaisuuksia, käytetään transformoitaessa isäntäsolu, joka voi olla joko eukaryoottinen tai prokaryoottinen solu. Transformoitua isäntäsolua kasvatetaan sen jälkeen geenin ilmentämiseksi.

Tekniikat, joita käytetään lipaasigeenin eristämiseksi, ovat alalla tunnettuja, mukaanlukien synteesi, eristäminen genomisesta DNA:sta, valmistaminen cDNA:sta, tai niiden yhdistelmiä. Erilaiset tekniikat geenin manipuloimiseksi ovat hyvin tunnettuja, ja niihin kuuluvat restriktio, di-gestio, resektio, ligaatio, in vitro mutageneesi, aluke-korjaus, linkkerien ja adaptorien käyttäminen, ja vastaavat tekniikat. Katso Maniatis et ai., "Molecular Cloning", : : Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New

York, 1982.

Menetelmä käsittää yleensä genomisen kirjaston valmistamisen organismista, joka ilmentää lipaasia, joka sisältää haluttuja ominaisuuksia. Esimerkkejä sellaisista lipaa- ....^ seista ovat sellaiset, joita saadaan suvuista Pseudomonas • · I” ja Acinetobacter, ja erityisesti kannoista, jotka kuuluvat ! lajeihin Pseudomonas alcaliqenes, Pseudomonas pseudoalca- ligenes, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzerl ja Acinetobacter calcoaceticus. Joitakin näistä lipaaseista V ja kannoista kuvaillaan yksityiskohtaisemmin patenttihake- muksessa EP-A-0218272, joka julkaisu liitetään tässä viit-* : teenä. Luovuttavan mikro-organismin genomi eristetään ja katkaistaan sopivalla restriktioentsyymillä kuten Sau3A. Saadut palaset liitetään vektorimolekyyliin, joka on ai 102295 12 kaisemmin katkaistu yhteensopivalla restriktioentsyymillä. Esimerkki sopivasta vektorista on plasmidi pUN12l, joka voidaan pilkkoa restriktioendonukleaasilla Bell. Aminohapposekvenssiä voidaan lisäksi käyttää koettimen konstruoimiseksi, cDNA:n tai geenikirjaston seulomiseksi, jotka on valmistettu mRNArsta tai DNArsta lipaasigeenin kannalta donorisoluina kiinnostavista soluista.

Käyttämällä lipaasi-DNA:ta tai sen osaa lisäksi hybridi-saatiokoettimena, rakenteellisesti läheisiä geenejä, joita tavataan muista mikro-organismeista, voidaan helposti kloonata. Erityisesti on mahdollista eristää geenejä organismeista, jotka ilmentävät lipolyyttistä aktiivisuutta, käyttämällä oligonukleotidikoettimia, jotka pohjautuvat lipaasigeenien nukleotidisekvenssiin, joita on saatavissa patenttihakemuksessa EP-A-0218272 kuvailluista organismeista. Vaihtoehtoisesti näitä oligonukleotidejä voidaan saada kiinnostuksen kohteena olevien lipaasien aminohappo-sekvensseistä. Sellaiset koettimet voivat olla huomattavasti lyhyempiä kuin kokonainen sekvenssi, mutta niiden : tulisi olla pituudeltaan vähintään 10, edullisesti vähin tään 14 nukleotidiä. Pitemmät oligonukleotidit ovat myös käyttökelpoisia, geenin koko pituuteen saakka, edullisesti enintään 500, edullisemmin enintään 300 nukleotidiä pituudeltaan. Sekä RNA- että DNA-koettimia voidaan käyttää.

.···. Käytön yhteydessä koettimet leimataan tavallisesti ilmaisija tavalla tavalla (esim. 32P:llä, 35S:llä, 3H:lla, biotii- nillä tai avidiinillä), ja niitä inkuboidaan yksijuostei-sen DNA:n ja RNA:n kanssa organismista, josta geeniä ol-laan etsimässä. Hybridisoituminen ilmaistaan leiman avulla V sen jälkeen, kun yksijuosteinen ja kaksijuosteinen (hybri- disoitunut) DNA (DNA/RNA) on erotettu toisistaan (käyttäen ‘ ‘ tavallisesti nitroselluloosapaperia). Oligonukleotidien kanssa käytettäväksi sopivat hybridisaatiotekniikat ovat hyvin alaa tuntevien tiedossa.

102295 13

Vaikkakin koettimia yleensä käytetään ilmaistavan leiman kanssa, joka mahdollistaa helpon identifioinnin, leimatto-mat oligonukleotidit ovat myös käyttökelpoisia, sekä leimattujen koettimien prekursoreina että käytettäväksi menetelmissä, joissa käytetään kaksijuosteisen DNA:n (tai DNA/RNA:n) suoraa ilmaisemista. Ilmaus "oligonukleotidi-koetin" tarkoittaa siis sekä leimattuja että leimaamatto-mia muotoja.

Tämän keksinnön mukaisessa edullisessa suoritusmuodossa Pseudomonas pseudoalcallqeneksen lipaasin sekvenssi kloonataan kalinasta CBS 473.85 (M-l). Pseudomonas aeruginosa PAO:n (ATCC 15692) kloonattu lipaasi oli sekvensoinnin jälkeen yllättävästi sekvenssiltään suuressa määrin homologinen M-l:n lipaasigeenin sekvenssin kanssa. Vielä yl-lättävämpää oli, että samankaltaista määrällisesti suurta sekvenssihomologiaa havaittiin M-l -kannan lipaasigeenin sekvenssin ja kromosomaalisen DNA:n välillä muutamasta Pseudomonas stutzerl -eristeestä [nimittäin PG-I-3 (CBS

137.89), PG-I-4 (CBS 138.89), PG-II-11,1 (CBS 139.89), : PG-II-11,2 (CBS 140.89)] ja Pseudomonas alcallgeneksestä ; · DSM 50342. Tässä selityksessä käytettävä ilmaus "korkea- ; : asteinen homologia" määritellään vähintään 300 ep:a sisäl täväksi yhtenäiseksi DNA-jaksoksi, jossa todetaan vähintään 67-%:nen homologia.

.···. P. aeruqinosan ja P. stutzerin lipaasientsyymejä tuotet- tiin, ja niiden puhdistuskyky testattiin SLM-testissä.

*. . Yllättäen todettiin, että kaikki entsyymit, joiden homolo- giataso M-l -lipaasigeenin kanssa oli korkea, osoittautui-vat myös erinomaisen pysyviksi, tehokkaiksi ja suoritusky-V kyisiksi olosuhteissa, joissa simuloitiin nykyaikaista pe- suprosessia. Ausubelin et ai., mukaan, Current Protocols • : in Molecular Biology, 1987-1988, Southern-hybridisaatio- tekniikalla pystytään ilmaisemaan tämäntasoinen homologia. Todettuja homologioita ei havaittu P. qladlolln, jota ku- 102295 14 väillään patenttihakemuksissa EP-A-0205208 ja EP-A-0206390 tai Humicola lanquinosan, jota kuvaillaan patenttihakemuksessa EP-A-0305216, lipaaseilla.

Kloonit, jotka sisältävät liitetyn DNA-palan, voidaan identifioida käyttäen suoraa eli positiivista valikointi-menetelmää, kuten sellaista, joka on kehitelty E. colille (Kuhn et ai., Gene 44 (1986) 253-263) ja B. subtlllkselle (Gryczan ja Dubnau, Gene 20 (1982) 459-469). Esimerkkinä sellaisesta positiivisesta selektiovektorista E. colille on pUN121 (Nilsson et ai.. Nucleic Acids Res. 11 (1983) 8019-8030).

Lipolyyttisiä entsyymejä ilmentäviä klooneja voidaan lisäksi identifioida esimerkiksi käyttämällä sopivaa indi-kaattorimaljamääritystä, kuten agaralustoja, jotka sisältävät tributyriiniä tai oliiviöljyä yhdessä rodamiini B:n kanssa (Kouker ja Jaeger, Appi. Env. Microbiol. 53 (1987) 211). Edelleen, pesäkekopioita voidaan seuloa käyttäen sovellettua pehmytagar-tekniikkaa, joka perustuu menetel-; mään, jota on kuvailtu esteraasiaktiivisuuden ilmaisemista varten (Hilgerd ja Spizizen, J. Bacteriol. 114 (1978) 1184). Klooneja, jotka ilmentävät lipolyyttisiä entsyymejä, voidaan vaihtoehtoisesti identifioida käyttämällä geneettistä komplementaatiota sopivassa lipaasi-negatiivi-sessa resipienttikannassa, kuten Wohlfarth ja Winkler ovat kuvailleet, J. Gen. Microbiol. 134 (1988) 433-440.

• · · « · • · • · ♦ • ·· · Kun kokonainen geeni on identifioitu, joko cDNA:na tai kromosomaalisena DNA:na, sitä voidaan sen jälkeen manipu- .···. loida monella eri tavalla ilmentämisen aikaan saamiseksi.

Voidaan käyttää mikrobi-isäntiä, joihin voi lukeutua esi-merkiksi bakteereja, hiivoja ja sieniä, kuten E. coli, * Kluyveromyces-, Aspergillus-, Bacillus- ja Pseudomonas -lajit. Siitä johtuen, silloin kun geeni on tarkoitus ilmentää isännässä, joka tunnistaa villin tyypin lipaasin 102295 15 transkriptionaaliset ja translaationaaliset säätelyalueet, kokonainen geeni villityyppisine 5'- ja 31-säätelyaluei-neen voidaan siirtää sopivaan ekspressiovektoriin. Erilaisia ekspressiovektoreita on olemassa, joissa käytetään prokaryoottisten solujen replikointisysteemejä. Katso esimerkiksi, Pouwels et ai., "Cloning Vector, A Laboratory Manual", Elsevier, 1985. Nämä replikointisysteemit on kehitetty markkerien aikaansaamiseksi, jotka mahdollistavat transformanttien valikoinnin, samoinkuin sopivien restrik-tiokohtien aikaansaamiseksi, joiden väliin geeni voidaan liittää.

Silloin kun geeni on ilmennettävä isännässä, joka ei tunnista luonnostaan esiintyviä vlllityyppisiä transkriptio-naalisia ja translaationaalisia säätelyalueita, lisämani-pulointia tarvitaan. Suuri määrä 3'-transkriptionaalisia säätelyalueita tunnetaan sopivasti ja voidaan liittää lo-petuskodonien alapuolelle. Ei-koodittava 5'-alue rakenne-geenin yläpuolella voidaan poistaa endonukleaasirestrikti-; on, Bal31 resektion (leikkaamisen) tai vastaavan menetel- : män avulla. Vaihtoehtoisesti, silloin kun sopiva restrik- • · tiopaikka on läsnä rakennegeenin 5'-pään lähellä, rakenne- geeni voidaan katkaista ja käyttää adapteria rakennegeenin kytkemiseksi promoottorialueeseen, jolloin adapteri korvaa rakennegeenin menetetyt nukleotidit.

,···, Erilaisia strategioita voidaan käyttää ekspressiokasetin « · saattamiseksi käyttöön, joka transkription 5'-3'-suunnassa *\ [ sisältää transkriptionaalisen säätelyalueen ja translaa- ”*’* tionaalisen aloitusalueen, joka lisäksi voi sisältää sää- : telysekvenssejä, jotka mahdollistavat säätelyn indusoitu- V misen; avoimen lukukehyksen, joka koodittaa lipolyyttistä entsyymiä, sisältäen edullisesti tavoitteena olevan isän-’ : täsolun tunnistaman erittävän esisekvenssin; ja translaa tionaalisia ja transkriptionaalisia lopetusalueita. Eks-pressiokasetti voi sisältää lisäksi vähintään yhden merk- 102295 16 kigeenin. Aloitus- ja lopetusalueet ovat toiminnallisia isäntäsolussa, ja ne voivat olla joko homologisia (peräisin alkuperäisestä isännästä), tai heterologisia (peräisin alkuperäisestä isännästä), tai heterologisia (peräisin vieraasta lähteestä tai synteettisistä DNA-sekvensseistä). Ekspressiokasetti voi siten olla kokonaan tai osaksi peräisin luonnollisista lähteistä, ja joko kokonaan tai osaksi peräisin isäntäsolulle homologisista lähteistä tai isäntäsolulle heterologisista lähteistä. Keksinnön mukaisia erilaisia DNA-rakenteita (DNA-sekvenssejä, vektoreita, plasmideja, ekspressiokasetteja) eristetään ja/tai puhdistetaan, täi syntetisoidaan eivätkä ne siten ole "luonnostaan esiintyviä".

Sopivien säätelysekvenssien valinnassa otetaan huomioon seuraavat tekijät, jotka vaikuttavat ilmentymiseen. Tran-skriptionaalisen säätelyn puitteissa, lähetti-RNA:n määrä ja pysyvyys ovat tärkeitä tekijöitä, jotka vaikuttavat geenituotteiden ilmentämiseen. mRNA:n määrä määritetään tietyn geenin kopiomäärän, sen promoottorin suhteellisen tehokkuuden ja niiden tekijöiden avulla, jotka säätelevät promoottoria, kuten tehostajaelementit (enhancers) tai repressorit. mRNA:n pysyvyyteen vaikuttaa ratkaisevasti mRNA:n alttius ribonukleaasientsyymeille. Eksonukleaasien aiheuttamaa pilkkoutumista inhiboi yleensä rakenteellisten osien läsnäolo mRNA:n päissä; palindroomiset rakenteet, muuttuneet nukleotidit tai spesifiset nukleotidisekvens-.···. sit. Endonukleaasien aiheuttaman pilkkoutumisen otaksutaan tapahtuvan spesifisissä tunnistuskohdissa mRNA:n sisällä, • » · ja pysyvästä mRNA:sta nämä kohdat puuttuisivat. On olemas- ’·”· sa myös jonkin verran näyttöä siitä, että ne mRNA:t, jotka • · · ^ osallistuvat runsaasti luentaan, ovat myös hajotukselta suojattuja mRNA:n pinnalla läsnäolevien ribosomien vaikutuksesta.

Translaationaalisen säätelyn muodossa, edellyttäen mRNA:n läsnäoloa, ilmentymistä voidaan säädellä vaikuttamalla 102295 17 aloituksen nopeuteen (ribosomin sitoutuminen mRNA:han), ketjunpidennyksen nopeuteen (ribosomin siirtyminen mRNA:n päästä päähän), post-translaationaalisten modifikaatioiden nopeuteen ja geenituotteen pysyvyyteen. Ketjunpidennyksen nopeuteen vaikuttaa luultavasti kodonien kulutus siten, että kodonien käyttö harvinaisiin tRNA-molekyyleihin saattaa alentaa luentanopeutta. Aloituksen uskotaan tapahtuvan alueella, joka on juuri koodaussekvenssin alkuosan yläpuolella. Prokaryooteilla tämä alue sisältää useimmissa tapauksissa AGGA-konsensusnukleotidisekvenssin, jota nimitetään Shine-Dalgarno -sekvenssiksi. Samalla kun tämä sekvenssi karakterisoi ribosomaalista sitoutumiskohtaa, on ilmeistä, että sekä yläpuoliset että alapuoliset sekvenssit voivat vaikuttaa onnistuneeseen aloitukseen.

Aineisto viittaa myös nukleotidisekvenssien läsnäoloon koodausalueen sisällä, jotka voivat vaikuttaa ribosomiin sitoutumiseen, mahdollisesti vaikuttavien rakenteellisten osien muodostuksen avulla, joiden välityksellä ribosomi tunnistaa aloituskohdan. AGGA-sekvenssin paikka ATG-aloi- tuskodoniin nähden voi vaikuttaa ilmentymiseen. Näiden kaikkien tekijöiden vuorovaikutus määrää siten tietyn il- mentyrnisnopeuden. Ilmentyneisiin geeneihin on kuitenkin kehittynyt kaikkien näiden tekijöiden yhdistelmä tietyn ilmentymisnopeuden saavuttamiseksi. Ekspressiosysteemin suunnittelussa, suurten geenituotemäärien saamiseksi, on otettava huomioon ei ainoastaan erityiset alueet, joiden .*·*. on määritetty vaikuttavan ilmentymiseen, vaan myös kuinka • · · nämä alueet (ja siten niiden sisältämät sekvenssit) vai- • · · *· · kuttavat toisiinsa.

« # • « ·

Kuvaavat transkriptionaaliset säätelyalueet tai promootto-rit sisältävät esimerkiksi sellaisia sekvenssejä, jotka ovat peräisin yli-ilmentyvistä geeneistä teollisissa tuo-tantokannoissa.

102295 18

Transkriptionaalinen säätelyalue voi lisäksi sisältää sää-telysekvenssejä, jotka mahdollistavat rakennegeenin ilmentymisen säätelyn, esimerkiksi kasvualustassa läsnäolevien tai siitä puuttuvien ravinteiden tai ekspressiotuotteiden avulla, lämpötilan avulla, jne. Prokaryoottisissa soluissa rakennegeenin ilmentymistä voidaan säädellä esimerkiksi lämpötilan avulla, käyttämällä säätelysekvenssiä, joka sisältää bakteriofagi lambdan PL-promoottorin yhdessä bakteriofagi lambdan OL-operaattorin ja lämpötilalle herkän repressorin kanssa. Promoottorin säätely saadaan aikaan repressorin ja operaattorin välisen vuorovaikutuksen avulla. Erityisen kiinnostavia ovat ekspressiokasetit, jotka pystyvät ilmentämään lipolyyttistä entsyymiä, jossa kasetissa käytetään Bacilluksen amylaasi- ja proteaasigeenien säätelysekvenssejä. Kiinnostuksen kohteena oleva rakenne-geeni on liittynyt ribosomaalisen sitoutumiskohdan alapuolisesta niin että se on transkriptionaalisen säätelyalueen ja translaationaalisen aloitusalueen säätelevässä ohjauksessa.

Lisäksi voidaan valmistaa yhdistetty geeni toimittamalla rakennegeeniin 5'-sekvenssi, joka koodittaa erittävää oh- jaussekvenssiä ja prosessointisignaalia. Jos itse lipaasi- geenin signaalisekvenssi on toimiva valitussa isäntäsolus- sa, sitä voidaan myös käyttää. Kuvaaviin heterologisiin erittäviin ohjaussekvensseihin lukeutuvat penisillinaasin, amylaasin, proteaasin ja hiivan alfa-tekijän erittävät oh- .···. jaussekvenssit. Yhdistämällä erittävä ohjaussekvenssi oi- • · .*!·. keassa lukukehyksessä kiinnostuksen kohteena olevaan ra kennegeeniin, toimintavalmis lipolyyttinen entsyymi voi-daan erittää kasvualustaan.

• ·

Ekspressiokasetti voidaan sisällyttää replikointisystee-miin episomaalista säilyttämistä varten sopivassa isäntä-mikro-organismissa, tai se voidaan tuoda käyttöön ilman replikointisysteemiä, jolloin se voidaan liittää isännän 102295 19 genomiin. Isäntämikro-organismin transformointitapa erilaisilla DNA-rakenteilla ei ole tämän keksinnön kannalta ratkaiseva. DNA voidaan siirtää isäntään tunnetuilla tekniikoilla, kuten transformaatio, kalsiumfosfaatilla seostetun DNA:n käyttäminen, konjugaatio, elektroporaatio, solujen transfektio viruskosketuksen kautta, DNA:n mikro-ruiskutus soluihin, tai vastaavat tekniikat. Isäntäsolut voivat olla kokonaisia soluja tai protoplasteja.

Mitä tahansa mikro-organismia voidaan käyttää isäntäorga-nismina, joka on sopiva lipolyyttisen entsyymin tuotantoon ja ekstrahointiin; isäntäorganismi kykenee edullisesti myös erittämään tuotetun entsyymin, jolloin entsyymi voidaan ottaa talteen soluvapaasta fermentointinesteestä. Isäntämikro-organismi on myös edullisesti ei-patogeeninen organismi. Esimerkkeihin isäntäorganismeista, jotka täyttävät edellä mainitut kriteerit, lukeutuvat E. coli, Pseudomonas putida ja Bacillus-kannat, erityisesti B. subti-lis ja B. llchenlformis, Streptomyces-kannat ja sieni- ja hiivakannat, kuten Aspergillus ja vastaavasti Kluyveromy-V ces.

• Isäntäkannat voivat olla laboratoriokantoja, tai niihin ; voi kuulua mikro-organismien teollisuuskantoja. Teolli- suuskannoille on tunnusomaista se, että ne ovat resistenttejä geneettiseen materiavaihtoon, kuten fagi-infektio tai transformaatio. Kannat ovat pysyviä ja kykeneviä tai ky- .···. kenemättömiä itiönmuodostukseen. Ne ovat prototrofisia ja • · .*··. muunneltuja tuottamaan suuria saantoja endogeenisiä prote- • » · iinituotteita, kuten entsyymejä alfa-amylaasi ja erilaiset proteaasit. Teollisessa tuotantoprosessissa saatavan endo- • · · :...· geenisen proteiinituotteen saanto voi saavuttaa tason vä- hintään 5 g/1 (0,5 % w/v). Teolliset kannat erittävät myös • DNAaseja, mistä seuraa DNA:n hajoaminen alustassa, mikä antaa suojan geneettisen materian vaihdolle.

102295 20

Kun rakennegeeni on siirretty sopivaan isäntään, isäntäso-lua voidaan viljellä rakennegeenin ilmentämiseksi. Lipo-lyyttisen aktiivisuuden tuottotasot voivat olla verrattavissa tai korkeampia kuin alkuperäisillä kannoilla, joista geenit ovat peräisin. Isäntäsoluja voidaan viljellä suureen tiheyteen sopivassa alustassa ravinnerikkaan liemen muodostamiseksi. Silloin kun promoottori on indusoituva, käytetään sallivia olosuhteita, esimerkiksi muutos lämpötilassa, metaboliatuotteen tai ravinteen loppuunkuluttami-nen tai ylimäärä, tai vastaavaa.

Silloin kdn käytettävissä on erittäminen, ekspressiotuote voidaan eristää kasvualustasta tavanomaisilla keinoilla. Tuotetun lipolyyttisen entsyymin irtoamista voidaan tehostaa laimeilla surfaktanttiliuoksilla. Silloin kun erittäminen ei tule kysymykseen, isäntäsolut voidaan ottaa talteen ja hajottaa tavanomaisten olosuhteiden mukaisesti. Tavoiteltu tuote eristetään sen jälkeen ja puhdistetaan tunnetuilla tekniikoilla, kuten kromatografia, elektroforeesi, uuttaminen liuottimilla, faasinerotus, tai vastaa-: vat.

Esillä olevia koostumuksia voidaan käyttää monella eri ta-:V: valla. Transformoitua isäntämikro-organismia voidaan käyt tää lipaasin tehostettuun tuotantoon, jolla on ominaisuuksia, jotka tekevät siitä käyttökelpoisen pesuainekoostu-muksissa. Kloonatut lipaasigeenit voivat myös olla käytet- .···. tävissä seulottaessa lipaasigeenejä, mukaanlukien lipo- • · lyyttisen geenin identifiointi lipaasiksi ennemminkuin es-\ . teraasiksi.

• ·

Niitä voidaan käyttää myös entsyymiteknologiassa, käyttäen V tunnettuja menetelmiä, jotka liittyvät satunnaiseen tai paikkakohdistettuun mutageneesiin, josta on tuloksena li- • paaseja, jotka sisältävät tarvittavia muutettuja ominai suuksia.

< · i 102295 21

Lipolyyttisiä entsyymikoostumuksia voidaan käyttää pesu-ainekoostumuksissa, yhdessä detergentin ja valinnaisesti muiden aineosien kanssa, joita tavallisesti käytetään puh-distuskoostumuksissa. Näihin aineosiin voi kuulua vähintään yksi surfaktantti, veden pehmennin kuten kompleksiset fosfaatit, alkalimetallisilikaatit ja -bikarbonaatit; täyteaineita kuten alkalimetallisulfaatti; muita entsyymejä kuten proteaaseja ja amylaaseja ; valkaisuaineita; samoinkuin erilaisia yhdisteitä kuten hajusteita, optisia kirkasteita jne.

Tämän keksinnön mukaisessa entsymaattisessa puhdistuskoos-tumuksessa lipaasiaktiivisuus on edullisesti alueella 1 -20000 TLU/g koostumusta, kun taas proteolyyttisen entsyymin aktiivisuus on edullisesti alueella 50 - 10000 Delft-yksikköä/g puhdistuskoostumusta. Yksi TLU (todellinen li-paasiyksikkö) määritellään titrattavina rasvahappoina, jotka vastaavat määrällisesti 1 ymoolia NaOH/min vapautuneena oliiviöljy/arabikumi-emulsiosta pH:ssa 8,0, 25°C. Delft-yksiköt määritellään julkaisussa J. Amer. Oil Chem.

; V Soc. 60 (1983) 1672.

Keksinnön mukaisia puhdistuskoostumuksia voidaan valmistaa tavalliseen tapaan, esimerkiksi sekoittamalla yhteen komponentit tai valmistamalla alkuesiseos, joka tehdään jälkeenpäin valmiiksi sekoittamalla muiden aineosien kanssa. Yhden mahdollisen valmistusreitin mukaisesti, yksi tai useampi lipaasivalmiste sekoitetaan yhden tai useamman ♦ · · muun komponentin kanssa konsentraatin valmistamiseksi, jo- • ; ka sisältää ennalta määritellyn entsyymiaktiivisuuden, jo- * ka konsentraatti voidaan sen jälkeen sekoittaa muiden ha- • · · luttujen komponenttien kanssa.

• · : Keksinnön mukaiset lipolyyttiset entsyymit ovat edullises ti entsymaattisen pesuainelisäaineen muodossa. Tämä lisäaine voi sisältää myös yhden tai useamman muun entsyymin, » I · 102295 22 esimerkiksi proteaasin ja/tai amylaasin, joita voidaan käyttää nykyaikaisissa pesukoostumuksissa, ja yhden tai useamman muun komponentin, joita käytetään yleisesti alalla, esimerkiksi ei-ionisen yhdisteen, suolan, stabiloivan aineen ja/tai päällystysaineen. Entsymaattinen pesuaineli-säaine voi sisältää lipaasin lisäksi proteaasin, ja valinnaisesti alfa-amylaasin. Proteolyyttiset entsyymit ovat sekoituskelpoisia lipolyyttisten entsyymien kanssa tässä formulaatiossa. Entsymaattiset pesuainelisäaineet sekoitetaan yleensä yhden tai useamman detergentin ja muun alalla tunnetun komponentin kanssa pesuainekoostumusten muodostamiseksi. Entsymaattista pesuainelisäainetta käytetään yleensä alueella 102 - 107 TLU/g lisäainetta, kun taas valinnaisesti läsnä oleva proteolyyttinen aktiivisuus on alueella 5xl04 - 106 Delft-yksikköä/g.

Keksinnön mukaiset entsymaattiset pesuainelisäaineet voivat olla esimerkiksi rakeiden tai jyvästen muodossa, jotka on valmistettu yleisesti alalla tunnettujen menetelmien mukaisesti. Katso esimerkiksi, GB-patenttijulkaisut n:o l 324 116 ja n:o 1 362 365 ja US-patenttijulkaisut n:o • · 3 519 570, n:o 4 106 991 ja n:o 4 242 219.

: V: Entsymaattinen pesuainelisäaine voi olla nestemäisessä muodossa entsyymistabilaattorin, esim. propyleeniglykolin kanssa. Ne voivat myös olla orgaanisen tai epäorgaanisen lietteen muodossa, emulsioina tai kapseloituina, immobi- ..... lisoituina liukoisen tai liukenemattoman kantajan pintaan, * · tai vesipitoisessa tai vedettömässä liuoksessa yhden tai • · » | useamman stabiloivan aineen läsnä ollessa. Sellaisia lisä- ·:··: aineita käytetään edullisesti nestemäisissä pesuainekoos- tumuksissa.

··« • ·

Seuraavat esimerkit esitetään valaisemisen vuoksi eikä ra-’· · joittamisen vuoksi.

102295 23

Yleisiä kloonausmenetelmiä käytettiin, joita Maniatis et ai. ovat kuvailleet, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, CSH, New York. Kaikki DNA:ta modifioivat entsyymit saatiin kaupallisilta toimittajilta. Niitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Aineita ja laitteita DNA:n puhdistukseen ja erottamiseen käytettiin toimittajien ohjeiden mukaisesti.

Esimerkki 1

Triasyyli^lyserollasyylihydrolaasien molekulaarlnen kloonaus A. DNA:n ja selektiovektorin lähde EP-A-0218272:ssa tuodaan esille useita bakteerikantoja, jotka tuottavat lipaaseja, jotka ovat sopivia käytettäväksi· si pesuaineissa. Näistä valikoitiin lipolyyttisten geenien

lähteeksi Acinetobacter calcoaceticus Gr v-39 (CBS

460.85), Pseudomonas stutzerl Thai IV 17-1 (CBS 461.85), V Pseudomonas pseudoalcallqenes IN II-5 (CBS 468.85) ja

Pseudomonas pseudoalcallqenes M-l (CBS 473.85).

Plasmidivektori pUN121 (Nilsson et ai., Nucleic Acids Research 11 (1983) 8019), joka kantaa ampisilliiniresistens-sigeeniä, tetrasykliiniresistenssigeeniä ja bakteriofagi lambdan cl-repressorigeeniä, saatiin Dr. M. Uhlenilta, Royal Institute of Technology, Department of Biochemistry, Teknikringen 10, S-10044 Stockholm, Sweden, cl-repressori * j estää tetrasykliinigeenin kopioinnin. Vieraan DNA:n liit- ... täminen tunnusomaisiin restriktiokohtiin (Bell, Smal, ’·;·* Hindin ja EcoRl) johtaa tetrasykliinigeenin aktivoitumi- !· seen. Tämä mahdollistaa yhdistelmä-transformanttien suoran (positiivisen) valikoimisen Luria-liemiagarmaljoilla, jotka sisältävät 8 pg/ml tetrasykliiniä ja 50 pg/ml ampisil-liiniä.

102295 24 B. Geenlkirieston valmistaminen (katso kuvio l)

Plasmidi-DNA:ta ja kromosomaalista DNA:ta eristettiin kuten Andreoli on kuvaillut, Mol. Gen. Genet. 199 (1985) 372-380. Kromosomaalista DNA:ta, jota oli eristetty Thai IV 17-1:stä ja vastaavasti M-l:stä, pilkottiin osittain Sau3A:lla. DNA liitettiin sen jälkeen T4 DNA -ligaasin kanssa Bell:llä pilkottuun pUN121:n DNA:hän, kuten Mania-tis et ai. (edellä) on kuvaillut, ja transformoitiin kom-petentteihin E. coli -kannan JM101 hsdS recA soluihin (Dagert ja Ehrlich, Gene 6 (1979) 23-28). E. coli JM101 hsdS recA'saatiin the Phabagen Collection'sta (talletusnu-mero PC2495), Utrecht, Alankomaat. Transformantteja, jotka olivat resistenttejä tetrasykliinille pitoisuudessa 8 yg/ml Luria-liemiagarmaljoilla, valikoitiin.

C. Transformanttlen seulonta

Edellä kuvaillulla tavalla saatu geenikirjasto toistomal-. jättiin ja seulottiin lipolyyttisen aktiivisuuden osalta a käyttäen seuraavaa kahta menetelmää. Ensimmäisessä mene-

* I

[ telmässä kopioidut pesäkkeet seulottiin lipolyyttisen ak tiivisuuden osalta peptoniagaralustoilla, jotka sisälsivät tributyriiniä. Lipolyyttinen aktiivisuus havaittiin kir-kastusvyöhykkeenä (kehänä) pesäkkeen ympärillä, johtuen samean lipidiemulsion hajoamisesta. Toisessa menetelmässä, kopioidut (toistomaljatut) pesäkkeet seulottiin esteraasi-ϊ.,.ϊ aktiivisuuden osalta käyttäen tekniikkaa, jossa pehmytagar :’:*: on päällyskerroksena. Menetelmä perustui Hilgerdin ja

Spizizenin menetelmään, J. Bacteriol. 114 (1987) 1184.

... Pääasiallisesti seosta, joka sisälsi 0,4 % sulamispisteel- • * ***** tään alhaista agaroosia, 0,5 M kaliumfosfaattia (pH 7,5), *!· 0,5 mg/1 β-naftyyliasetaattia, liuotettuna asetoniin, ja 0,5 mg/1 Fast Blue BB:tä (katso esimerkki 2), kaadettiin transformanttlen päälle. Esteraasi- tai lipaasiaktiivi-suutta sisältävät pesäkkeet värjäytyivät muutamassa minuutissa purppuranpunaisiksi.

102295 25 1200:sta tetrasykliiniresistentistä transformantista, jotka saatiin Thai IV 17-l/pUN121 -geenipankista, kolme muodosti kehiä tributyriiniagarmaljoilla. 12000:sta yhdistel-mätransformantista, jotka testattiin M-l/pUN121-geenipan-kista, vain yksi testattu klooni osoitti heikkoa lipolyyt-tistä aktiivisuutta.

Tributyriinipositiivisia klooneja viljeltiin yli yön 2TY-alustassa (16 g/1 Bacto-tryptonia, 10 g/1 Bacto-hiivauu-tetta, 5 g/1 NaCl:a, pH 7,0), ja niistä määritettiin sekä plasmidipitoisuus (katso ID) ja kyky muuttaa erilaisia β-naftyylishbstraatteja, osoitus lipolyyttisestä aktiivisuudesta (katso esimerkki 2A).

D. Plasmidin eristäminen D.l. Sisältäen Thai IV 17-1 lipaaslqeenin

Plasmideja, jotka eristettiin Thai IV 17-l/pUN121 -trans-formanteista, merkittiin koodeilla pATl ja pAT3. Niiden rakenteet esitetään kuvioissa 2 ja vastaavasti 3. Kolmas klooni, merkittynä pAT2:lla, sisälsi plasmidin, joka oli identtinen pATl-rakenteen kanssa. Lipolyyttistä aktiivisuutta koodittava geeni sijaitsi pATl:n 2,7 ke EcoRI-palan sisällä (kuvio 2, katkoviiva) ja pAT3:n 3,2 ke EcoRI-palan sisällä (kuvio 3, katkoviiva). Kyseiset kaksi EcoRI-palaa subkloonattiin sopiviin vektoreihin, sekä DNA:n sekvensointia varten että korkeampien lipolyyttisten aktiivi-suussaantojen saamiseksi.

»·· ;*;* 2,7 ke EcoRI-palan pATl:stä kloonaaminen pUNl21-vektoriin • · · ' muodosti yhdistelmäplasmidin pETl (kuvio 4). Näyte E. co- *:·*: lista JM101 hsdS recA, joka sisälsi plasmidin pETl, talle- t ett iin CBS: ään 5. helmikuuta, 1987, numerolla CBS 157.87.

3,2 ke EcoRI-palan pAT3:sta kloonaaminen pUNl21-vektoriin muodosti yhdistelmäplasmidin pET3 (kuvio 5). Näyte E. co- 102295 26 lista JM101 hsdS recA, joka sisälsi plasmidin pET3, talletettiin CBS:ään 5. helmikuuta, 1987., numerolla CBS 155.87.

D.2. Sisältäen M-l -lipaasiqeenin

Yhdistelmäplasmidi, joka eristettiin M-l pUN121 -transfor-mantista, ollen nimeltään pAMl, eristettiin ja karakterisoitiin (kuvio 6). pAMl:n lipolyyttisen aktiivisuuden biokemiallinen karakterisointi osoitti kuitenkin, että tämä plasmidi ei koodittanut lipaasia, jota tarkoitettiin (katso myös esimerkit 2 ja 3). Siitä johtuen täytyi kehittää muita strategioita, joita kuvaillaan jäljempänä.

Plasmidi pAMl E. colissa JM101 hsdS recA talletettiin CBS:ään 5. helmikuuta, 1987, numerolla 154.87.

D. 3. Sisältäen IN II-5 -lipaasiqeenin

Sau3A:lla osittain pilkotut Pseudomonas pseudoalcaliqenes IN II-5:n DNA-palat kloonattiin E. colin K12 DH1 -kantaan • « (ATCC 33849) käyttäen plasmidivektoria pUN121. Ligoinnin ja transformoinnin jälkeen kompetentteihin DHl-soluihin, • jotka oli valmisteltu kuten Hanahan on kuvaillut, J. Mol.

Biol. 166 (1983) 557-580, saatiin noin 1500 transformant-tia, jotka olivat resistenttejä 50 pg/ml ampisilliinille ja 8 pg/ml tetrasykliinille. Transformantit, jotka kykenivät hydrolysoimaan tributyriiniä ja β-naftyyliasetaattia, .···. valikoitiin kuten lC-kohdassa on kuvailtu. Yhdestä posi- tiivisesta pesäkkeestä eristettiin plasmidi-DNA:ta ja karakterisoitiin määrittämällä useita restriktioentsyymien tunnistuspaikkoja. Tämän plasmidin fysikaalinen kartta, nimeltä pM6-5, esitetään kuviossa 7.

E. colin DH1 (pM6-5) aktiivisuus β-naftyyliestereitä kohtaan määritettiin (taulukko 1). Näyte E. coli DHl:stä, joka 102295 27 sisältää plasmidin pM6-5, talletettiin CBS:ään 5. helmikuuta, 1987, numerolla 153.87.

D.4. Sisältäen Gr V-39 -llpaaslqeenin

Osittain EcoRI*:llä pilkottua (olosuhteet Gardnerin et ai. mukaiset, DNA 1 (1982) 109-114) Acinetobacter calcoacetl-cus Gr V-39:n DNA:ta sekoitettiin EcoRI:llä lineaariseksi tehdyn pUNl2l:n DNA:n kanssa. Uudelleen renkaanmuotoon saattamisen jälkeen, käyttäen hyväksi T4-polynukleotidiki-naasia, DNA-seos siirrettiin E. coli DHl:een (ATCC 33849) käyttäen äikaisemmin tässä esimerkissä kuvailtua transfor-maatiomenettelyä. Kaikki saadut 1800 tetrasykliinille resistenttiä transformanttia seulottiin lipolyyttisen aktiivisuuden suhteen kuten lC-kohdassa on kuvailtu.

Kolme kloonia tästä Gr V-39/pUN121 -geenikirjastosta tuotti lipolyyttistä entsyymiä. Plasmidi-DNA:ta yhdestä näistä klooneista, nimeltä pP5-4, eristettiin ja karakterisoitiin . . restriktioendonukleaasien avulla. Tämän plasmidin pP5-4 fysikaalinen kartta esitetään kuviossa 8. β-naftyylieste-rien hydrolyysi raaoilla entsyymivalmisteilla E. colista DHl (pP5-4) määritettiin sen jälkeen (taulukko 1). Plasmi-’ di pP5-4 E. collssa DHl talletettiin CBS:ään 5. helmikuu ta, 1987, numerolla 151.87.

Esimerkki 2

Kloonattujen lipolyyttlsten entsyymivalmisteiden karakte-risointi A. Lipolyyttisen aktiivisuuden määrittäminen • · **... Tributyriini-positlivisia E. coli -pesäkkeitä siirrostet- tiin 100 ml:aan 2TY-alustaa, joka sisälsi ampisilliiniä ja .·. : tetrasykliiniä 500 ml:n erlenmeyer-kolvissa. E. coli -vil jelmiä ravistettiin 40 tunnin ajan 30oC:ssa pyöriväliik- 102295 28 keisessä ravistelijassa nopeudella 250 rpm. Pseudomonas-ja Acinetobacter-kantoja viljeltiin 30*C:ssa. 40 tunnin kuluttua mitattiin optinen tiheys aallonpituudella 575 nm, ja liemi sentrifugoitiin Sorvali RC5B-sentrifugissa GSA-roottorissa 6000 rpm 10 minuutin ajan. Supernatanttia säilytettiin 4*C:ssa entsyymimääritykseen saakka.

Solut suspendoitiin uudelleen 4 ml:aan hajotuspuskuria (25 % sakkaroosi, 50 mM Tris-HCl pH 7,5). Lysotsyymiä lisättiin, ja 30 min. inkuboinnin jälkeen 21eC:ssa lisättiin DNAasia (20 yg/ml), ja inkubointia jatkettiin 30 minuuttia 37°C:ssa. Triton-X100:aa (0,1 % v/v) lisättiin, ja solu-suspensioita sonikoitiin jäissä Labsonic 1510 sonikaatto-rilaitteella (viisi 30 sek. käslttelyjaksoa 100 watin teholla 1 min. välein). Solujäänteet poistettiin sen jälkeen sentrifugoimalla 15 minuuttia 12000 rpm Hettich Mikro Rapid/K - sentrifugissa. Saadusta supernatantista määritettiin sen jälkeen lipolyyttinen aktiivisuus. Määritys perustuu β-naftyyliesterien hydrolysoitumiseen lipolyyt-tisten entsyymien vaikutuksesta. Vapautunut β-naftyyli reagoi diatsoniumsuolan Past Blue BB kanssa, jolloin muodostuu atsoväriä, joka absorboi 540 nm:ssä. Menetelmä on olennaisesti McKellarin käyttämä menetelmä, J. Dairy Res.

53 (1986) 117-127, ja se suoritettiin seuraavasti.

Reaktioputki sisälsi 2,0 ml:n lopputilavuudessa: 1,8 ml 55 mM TES:a (N-tris(hydroksimetyyli)metyyli-2-aminoetaani-sulfonihappo, Sigma); 0,02 ml 100 mM β-naftyyliesteriä .···. liuotettuna dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Merck) tai Met- hyl-cellusolveR-asetaattiin (Merck), 0,1 ml 120 mM NaTC:a > » * (Na-taurokolaatti, Sigma), ja 0,1 ml entsyymivalmistetta.

« · : Kontrolleja, joista puuttui entsyymi, ja β-naf tyyli (Sig ma)-standardeja, joista puuttuivat entsyymi ja substraatti, käytettiin myös.

102295 29

Corning-sentrifugiputkia (15 ml), jotka sisälsivät reak-tioseoksen, inkuboitiin 371C:ssa tai spesifioidussa lämpötilassa 30 min. ajan. 0,02 ml 100 mM PB-liuosta (Fast Blue BB -suola (Sigma), liuotettuna DMSO:hon) lisättiin, ja inkubointia jatkettiin 10 min. ajan. Reaktio pysäytettiin 0,2 ml:11a 0,72 N TCA:ta (trikloorietikkahappo, Riedel-De Haen), ja värillinen kompleksi uutettiin sekoittaen voimakkaasti 2,5 ml:11a 1-butanolia (Merck). Kerrokset erotettiin sentrifugoimalla nopeudella 5000 rpm 5 min. ajan Heraeus Christ RP -minifugissa. Pintakerroksen absorbanssi mitattiin 540 nm:ssä käyttäen LKB:n Ultraspec II -spektro-fotometriä. Kontrollia'rvojen vähentämisen jälkeen lukemat muutettiin TLU-arvoiksi (True Lipase Units) käyttäen Candida cylindracean lipaasia (L1754, Sigma) standardina. Yksi TLU määritellään titrattavina rasvahappoina, jotka vastaavat määrällisesti 1 pmoolia NaOH/min. (katso myös EP-A-0218272). Tulokset esitetään jäljempänä taulukossa 1.

β-naftyyliesterien hydrolyysitulosten vertailu, joiden asyyliketjun pituus vaihtelee C4 - Cl8, osoittavat, että: le. Kloonit, jotka pitävät sisällään pAT3- ja pET3-plasmi-: deja, tuottavat todellisia lipaaseja; ja 2°. kloonit, jot- *’ ka pitävät sisällään pATl-, pETl-, pAMl-, pP5-4- ja pM6-5- plasmideja, tuottavat entsyymejä, jotka sisältävät pääasi-:.-V allisesti esteraasiaktiivisuuksia. Useimmatlipolyyttisis- tä entsyymeistä, joita yhdistelmäplasmideja kantava E. coll on syntetisoinut, todettiin soluhajotteissa.

· « • · * · · * ·· • · · • · 30 102295

— * I

00 OOOOO^HH VOf'-H I O N in I CN

H >i H VO ΙΟ I CN CN CN I rH

'—H I I

O I I

£ ft II

I JHHNrlHH H H H I Η Γ— rH I in

cn. w I rH m I

I I

I I

I I

I I

I ^molnNN'f n Ίΐηη i n< r- ο ι o

-H CN >1CN N Vi H rH I CO CO N< I CN

C! rH HH I I

(DO 00 II

d U J & I I

Η ίίΗΗ^ιΗΗΗ H H rH | Ν' OV I in

E · Ή I W I rlrl I rH

30 Wl -P ca I I

-P -P II

Ή ΙΌ ta II

•H ·(—1 ΙΟΉΟΙΟΟΟΝΝΟΟνί VO f— H· I O VO O I rH

M U 00 >i VO CO ΓΟ d I H* VO VO I CN

»0 (0 -P —«H rH I I

*0 -P W U I I

E W Λ 'Z, CU I I

•H p I p I CO 00 O I t"

C OI nffl.Mvfvfvfvtvfd H· H* CN | Clind | rH

a) e -h il d w rH il

•H -H >ι I I

P ti Sh-' m I I

-P (0 -p H1 >iO VO O O H1 rH CN CN rH | CD CN 00 I O

. , <D Cn ‘w '-Ή oo vo oo σν I m CN I ·η

E P <0 (X) I I

•H O d 55 ft I I

PI I I 3 CN Cl Vf in Η H rH rH H I in O CO I VO

OO co-camcNcN I incNi

• HP II

O M I I

• · · M H I I

; E ι i — . Ö H — — I I (I)

·.·.· (DP H H H I I -P

Ό Ο Ό p p I I o

PC H HO Η Ο I I TO

OO E N+) Ί1 in (N+i I I (0 WO W HHCOCOHHJ^I ΙΗ,ΧΙ ...| . £>

H (0 QPQI Q P

>WJ H <H<wSdD>Dv2S>l · · · I · >iH

hw cu ft o< ft ft ft ft'-' ft a Pc'— I 5¾¾ I 55 -p o

H W I I -P W

-P H (0 I I <D

.···. M <D -P I I +>

·...· (0 -P W <<<<<<; — I I HH

... -p-π υουυυυ hi i p -p

... d >. <D Φ Φ Φ Φ Φ O H I IP 30 -P

.* * <D 30 -P pppppp h I H I <U 3010 W ti ti <0 CN — OIW ll-P EI0 . h h ia -ph wwmtnwmH p i λ t-- i u w : -p — e 0« ooofoooH -p ic him h >,

Ο -PHP (0 WWWWWWH d ΙΟ I -Q <DH

.···. >1 I O M H x3xsxjx3xix!0 O I E m > ι ο σν

M >lH Ip 30 H P M I O I H I -P CO II II

P H · W -PO HHHHHH-P ^ I Ό H I (D I

h ODd do ooooood ip n η i d >

P ft id 10 30 HHHHHHOHHH I 0) H rt! I H Q

(0 H Eh P w· i w I !5 W i o PS

. Eh J —-P η Wl hhbbbb-öOO I O-SHEh I CO is * I 102295 31 B. Kloonattujen lipolyyttlsten valmisteiden llsäkarakteri-solntl

Kloonattuja lipolyyttisiä entsyymivalmisteita karakterisoitiin käyttäen SDS-geelielektroforeesia Phastgel-systee-millä (Pharmacia), käyttäen 10-15-%:sta Phastgel-gradtenttiä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Soluvapaita ekstrak-teja E. coll -klooneista pET3 ja DH1-kannasta, joka sisältää pUNl21-vektorin, vertailtiin osittain puhdistettuun entsyymiin donorikannasta Thai IV 17-1 (Stuer et ai., J. Bacteriol. 168 (1986) 1070-1079).

Näytteen valmistus

Neljä tilavuutta sopivaa laimennusta entsyymivalmisteista sekoitettiin yhden osan kanssa näytepuskuria, joka sisälsi 10 % SDS:a, 10 % β-merkaptoetanolia 0,5 M Tris-HCl:ssä, pH 6,8. Tämä liuos jaettiin kolmeen yhtäsuureen osaan. Yhtä osaa ei käsitelty enempää, vaan sitä säilytettiin huoneen lämpötilassa geelielektroforeesin suorittamiseen saakka.

: ’’ Toista ja kolmatta osaa kuumennettiin 5 ja 10 min.

i i 95eC:ssa, vastaavasti, jota seurasi jäähdyttäminen jäissä, ; · sen jälkeen pidettiin huoneen lämpötilassa kunnes saatet- : tiin geelielektroforeesiin.

• · ·

Elektroforees i Käsiteltyjä näytteitä, kahtena rinnakkaisena, elektrofo-...t resoitiin Phastgel-systeemillä jännitteessä 65 volttia/h.

Yksi geeli proteiinivärjättiin Coomassie Brilliant Blue- • · · \ [ värillä Pharmacia Development1 in menetelmäohje n:o 200:n *:**! mukaisesti. Kuvio 9A esittää polypeptidikuvioita värjäyk- sen jälkeen Coomassie Brilliant Blue:lla. Toinen geeli V 'pestiin liuoksella 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 % Triton X-100, SDS:n poistamiseksi ja entsyymiaktiivisuuden reak-tivoimlseksi. Lipolyyttisen aktiivisuuden läsnäolo pestys 102295 32 sä geelissä tehtiin näkyväksi tekniikalla, jossa pehmyt-agar on päällyskerroksena, joka perustuu esimerkissä 1C kuvailtuun β-naftyyliasetaatti/Fast Blue BB -suolamenetel-mään. 30 min. inkuboinnin jälkeen 30°C:ssa, purppuranpunaiset vyöhykkeet tulivat näkyviksi kirkasta taustaa vasten. Kuten kuviossa 9B on esitetty, E. colin pET3-kloonin lipaasi ja natiivi P. stutzeri Thai IV 17-I:n lipaasi (MP 40 kDa) liikkuivat identtisesti SDS-geelielektroforee-sissa. Molemmilla entsyymeillä esiintyi niin sanottua läm-pömuuntelevuutta. Samankaltaista lämpömuuntelevuutta kuvailtiin E. colin K12 ulkomembraaniproteiinille (OmpA-gee-nituote), Freudl et ai., J. Biol. Chem. 261 (1986) 11355-11361.

Esimerkki 3

Pseudomonas pseudoalcallqenes -geenlklrjaston konstruointi isäntävallkoimaltaan laajoissa vektoreissa.

Vaihtoehtoisena strategiana lipaasigeenin kloonaukselle P. pseudoalcaliqenes M-l -kannasta käytettiin laajaisäntäistä

* I

kaksoiskloonaussysteemiä, mikä mahdollisti geenipankin suoran seulonnan komplementaation avulla eri Pseudomonada-ceae-mutanttikantoja vastaan. Kahta isäntävalikoimalta laajaa vektoria pLAFRl (Friedman et ai., Gene 18 (1982) 289-296) ja pKT248 (Bagdasarian et ai., Gene 16 (1981) 237-247) käytettiin. Plasmidi pLAFRl on RK2-peräinen isäntävalikoimalta laaja kosmidi, joka antaa resistenssin tet- :***: rasykliinille ja on liikuteltavissa muttei itsesiirtyvä.

• · · :*j*: Plasmidi pKT248 on liikuteltavissa oleva R300B-peräinen • ; isäntävalikoimalta laaja plasmidi, joka antaa resistenssin streptomysiiniä ja kloramfenikolia vastaan. Näiden vekto-"·.·* rien siirtäminen E. colista Pseudomonakseen suoritettiin plasmidin pRK2013 avulla, joka sisältää RK2-siirtotoimin-: · ; toja, (Ditta et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77 (1980) 7347-7351) Friedmanin et ai. triparentaalin pariut- 102295 33 tamismenetelmän mukaisesti, (Gene 18 (1982) 289-296). P. aeruginosa -kannan PAO 2302 (saatu S. Wohlfarthilta ja U.K. Winkleriltä, Ruhr Universität, Bochum, FRG) lipaasi-negatiivista mutanttia 6-1 käytettiin vastaanottavana Pseudomonaksena (J. Gen. Microbiol. 134 (1988) 433-440).

In vitro lambda fagin pakkausuutteiden valmistaminen ja pLAFRl DNA:n pakkaaminen suoritettiin pääasiallisesti kuten Ish-Horowicz ja Burke ovat kuvailleet (Nucleic Acids Res. 9 (1981) 2989-2998). Lyhyesti, P. pseudoalcaliqenes M-l:n kokonaista DNA:ta pilkottiin osittain EcoRI:llä tai Sali:llä ja liitettiin joko EcoRI:llä katkaistuun pLAFRl-DNA:han tai Sali:llä katkaistuun pKT248-DNA:han. Insertin suhde vektoriin oli 5:1 vektori-vektoriin -ligaation mahdollisuuden vähentämiseksi. Ligoitu M-1/pLAFRl-DNA pakattiin in vitro lambda-fagin päihin ja injisoitiin E. coli DHl:een (Maniatis et ai., edellä, 1982).

Suunnilleen 2500 tetrasykliiniresistenttiä transduktanttia saatiin pg:aa kohti P. pseudoalcaliqenes M-l:tä. Oletta-

• I I

! . maila, että P. pseudoalcallgeneksen genomin koko on 5000 / ke, ja että vähintään 50 % tetrasykliiniresistenteistä : transduktanteista sisältää 20 ke sisältävän insertin, 2300 itsenäistä kloonia tarvittiin varmistamaan 99-%:n todennä-köisyys tietyn DNA-sekvenssin löytämiseksi (Clark ja Carbon, Cell 9 (1976) 91). Koska geenikirjasto sisälsi enemmän kuin 8000 erilaista yhdistelmäpesäkettä, oli todennäköistä, että se sisälsi koko P, pseudoalcaliqenes -geno- .·*·. min.

• · • · · • · · • · · • · · *· ; Ligoitu M-l/pKT248 DNA transformoitiin kompetentteihin E.

coli -soluihin kuten esimerkissä 1 on kuvailtu. E. coli · · — ““ JM101 hsdS recA -transformantteja valikoitiin streptomy- • «

siiniresistenssin (SmR) suhteen ja vastavalikoitiin klo-: ramfenikoliherkkyyden (CmS) suhteen. Viisi tuhatta SmR

CmS-kloonia saatiin. E. coli -isännästä saadut kaksi M-l - 102295 34 geenikirjastoa toistomaljättiin ja seulottiin lipolyytti-sen aktiivisuuden suhteen kuten esimerkissä 1 on kuvailtu. Yksikään 13000:sta tutkitusta yhdistelmätransforman-tista ei osoittanut lipaasiaktiivisuutta.

Kloonin siirto E. collsta P. aeruqinosaan PAO 2302 (6-1) suoritettiin sen vuoksi seuraavasti. Yhdistelmäplasmidit siirrettiin Pseudomonas-resiplentteihln toistomaljaamalla donorikannat resipienttikannan (PA02302/6-1) ja auttaja-kannan (E. coll MCI061 tai DH1, joka sisältää pRK2013-plasmidin) muodostamaan kasvustoon. Yön yli kestäneen donor in, reSipientin ja auttajakannan viljelyn jälkeen Heart Infusion -agarmaljalla, ex-konjugantteja valikoitiin toistomalj aamalla minimaaliagaralustalle, joka sisälsi 0,2 % sitraattia, metioniiniä (10 pg/ml) ja streptomysiiniä tai tetrasykliiniä.

E. coll ei metaboloi sitraattia. Lipaasidefektiivisen mu-tantin 6-1 lip-fenotyypin palauttamista yhdistelmäplasmi-

I I

dien avulla testattiin toistomaljaamalla P. aeruqinosa - t 1 exkonjugantteja ravintoliemiagarmaljoille, jotka sisälsivät trioleoyyliglyserolia ja fluoresoivaa väriä rodamiini B, kuten Kouker ja Jaeger ovat kuvailleet, Appi. Env. Mic- / robiol. 53 (1987) 211-213.

• »

Neljä 13000:sta seulotusta ex-konjugantista osoitti lipaasiaktiivisuutta, mikä ilmeni oranssinväristen kehien, näkyvinä 360 nm:ssä, kehittymisenä bakteeripesäkkeiden ympä-rille 40 tunnin inkuboinnin kuluttua 37*C:ssa. Yksi näistä • · · klooneista, pALM5, valittiin lisäkarakterisointia varten.

I ·

Lopuksi, sen varmistamiseksi, että pALM5:n sisältävän PAO

: 2302/6-1 -ex-konjugantin tuottama lipaasi sisältää edulli- * · siä ominaisuuksia, joita P. pseudoalcallqenes M-l -kannan lipaasilla on, entsyyminäytteet valmisteltiin ja saatettiin sekä biokemialliseen analyysiin (katso esimerkki 2) 102295 35 että SLM-testiin (jota kuvaillaan jäljempänä esimerkissä 10). Näissä kokeissa saadut tulokset osoittivat, että pALM5-kloonin tuottaman entsyymin lipolyyttinen aktiivisuus sisältää samankaltaisia ominaisuuksia kuin parentaa-lista M-l -kannasta saadun entsyymin aktiivisuus.

Esimerkki 4

Pseudomonas pseudoalcaliqenes M-l:n llpaasiqeenin moleku-laarinen kloonaus A. Proteiinin puhdistaminen ja sekvenssi

Pseudomonas pseudoalcaliqenes M-l:n fermentointia ja pa-kastekuivatun supernatantin valmistamista siitä kuvaillaan EP-A-0218272:ssa. Lipolyyttinen entsyymi puhdistettiin tästä supernatantista pääasiallisesti Wingerderin et ai. mukaisesti, Appi. Microbiol. Biotechnol. 27 (1987) 139-145. Puhdistuksen jälkeen proteiinivalmiste oli enemmän kuin 80-%:sen puhdasta, määritettynä SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesilla, jota seurasi värjäys Coomassie Brilliant Bluerlla (katso kuvio 10).

N-terminaalinen sekvenssianalyysi suoritettiin SDS-geeli-• elektroforeesin ja elektroblottauksen jälkeen Immobilon siirtomembraanille (Millipore) Matsudairan mukaisesti (J. Biol. Chem. 262 (1987) 10035-10038). Tämä analyysi tuotti seuraavan sekvenssin (käyttäen tavanomaista yksikirjaimista aminohappokoodia): GLFGSTGYTKTKYPIVLTHGMLGF 1 10 20 • · • · · ·...·’ B. M-l -lipaaslqeenin kloonaus

Kaksi synteettistä 32-meeristä oligonukleotidiä: 5'ACC GGC TAC ACC AAG ACC AAG TAC CCC ATC GT-3' ja 102295 36 5'ACC GGC TAC ACC AAG ACC AAG TAC CCG ATC GT-3' johdettiin aminohapoista 6-15 toimintavalmiin lipaasipro-teiinin N-terminaalisesta sekvenssistä, kuten edellä on kuvailtu, sen jälkeen kun oli otettu huomioon Pseudomona-daceaen kodonipoikkeama ja geneettisen koodin degeneroituminen. Hybridisaatiokoettimena käyttöä varten oligonukleo-tidit pääteleimattiin käyttäen T4-polynukleotidikinaasia.

Kromosomaalista DNA:ta eristettiin Pseudomonas pseudoalca-ligenes M-l -kannasta (CBS 473.85) Andreolin mukaisesti (Mol. Gen. Genet. 199 (1985) 372-380), pilkottiin useilla restriktiöendonukleaaseilla, ja erotettiin 0,8-%:sella agaroosigeelillä. Näiden geelien Southern-blotit, käyttäen radioleimattua 32-meeristä oligonukleotidiä koettimena, paljastivat seuraavat tunnusomaiset hybridisoituvat DNA-vyöhykkeet: 1,8 ke Bell, 2,0 ke PvuII ja 1,7 ke Sali. Kromosomaalista M-l -DNA:ta pilkottiin sen vuoksi erikseen näillä kolmella restriktioendonukleaasilla, fraktioitiin 0,8-%:sen agaroosigeelielektroforeesin avulla, ja hybridisoituvat fraktiot, joita edellä on kuvailtu, otettiin talteen elektroeluution avulla BT 1000 -bioloukkulaitteel-. V la Schleicher ja Schilll'lta.

1,8 ke Bell:llä pilkottu fraktio liitettiin BamHI:llä katkaistuun defosforyloituun vektoriin pTZ18R/19R (ostettu Pharmacialta, Woerden, The Netherlands). 2,0 ke Pvull:lla pilkottu fraktio liitettiin Smal:llä katkaistuun defosforyloituun vektoriin pTZ18R/19R. 1,7 ke Sällillä pilkottu fraktio liitettiin Sali:llä katkaistuun defosforyloituun • « « vektoriin pTZ18R/19R. Kaikki kolme ligaatiota transformoi-• · tiin kompetentteihin E. coll JM101 hsdS recA -soluihin * ’ (kuten Andreoli on kuvaillut, edellä) ja maljattiin Luria- • · » liemiagarmaljoille, jotka sisälsivät ampisilliiniä, X-gal:a (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-3-D-galaktopyranosi-di) ja IPTG:a (isopropyyli-B-D-tiogalaktosidi).

102295 37

Suunnilleen 4xl03 valkoista pesäkettä poimittiin tuoreille agarmaljoille ja seulottiin pesäkehybridisaation avulla radioleimatun 32-meerisen koettimen kanssa. 12 positiivista pesäkettä saatiin tätä menetelmää käyttämällä. Jokaisesta näistä positiivisista pesäkkeistä valmistettiin pienen mittakaavan plasmidivalmiste alkalisella hajotusmene-telmällä ja pilkottiin sopivilla restriktioendonukleaa-seilla toimittajan ohjeiden mukaisesti. Kuusi plasmidia sisälsi odotettuja hybridisoituneita inserttejä. Yksi plasmideista, joka sisälsi vain 2,0 ke PvuII-palan, merkittynä pTMPvl8A, valikoitiin yksityiskohtaiseen analyysiin. Näyte E. colista JM101 hsdS recA, joka pitää sisällään plasmidin pTMPvl8A, talletettiin CBS:ään 8. maaliskuuta, 1989, numerolla CBS 142.89.

Edellä kuvaillulla tavalla saatuja E. coll pTZ18R/19R yh-distelmätransformantteja toistomaljattiin ja seulottiin lipolyyttisen aktiivisuuden suhteen kuten esimerkissä 2 on kuvailtu. Yksikään 5x104:stä tutkitusta E. coli -transfor-mantista ei osoittanut lipolyyttistä aktiivisuutta. Tähän epäonnistumiseen voidaan mainita useita syitä: a) E. colin transkriptio/translaatiosysteemi ei joko tunnistanut M-l -lipaasigeenien geenin ilmentämisen aloitussignaaleja (kat-; so esimerkiksi, Jeenes et ai., Mol. Gen. Genet. 203 (1986) 421-429), b) tarvitaan säätelysekvenssi tai proteiini tämän M-l -lipaasigeenin käynnistämiseksi, c) M-l -lipaasin oikea laskostuminen tai erittyminen E. colissa voi olla riittämätöntä.

• · · • · • m .···. C. M-l -lipaasigeenin karakterisointi ja sekvensointi • · · • ·

Plasmidi pTMPvl8A pilkottiin usealla eri restriktioentsyy-millä, joilla on 6 ep tunnistussekvenssejä. Näistä kokeis-ta tuloksena oleva palakokoanalyysi mahdollisti alustavan restriktioendonukleaasien katkaisukartan luomisen pTMPvl8A:n 2,0 ke PvuII-insertistä. Tämä kartta esitetään kuviossa 11.

102295 38 Käytettävät pTZ18R/19R-vektorit antavat käyttöön monipuolisen "kaikki yhdessä -systeemin", DNA-kloonauksen, DNA:n dideoksi-sekvensoinnin, in vitro -mutageneesin ja in vitro -kopioinnin suoritusta varten (Mead et ai., Protein Engineering 1 (1986) 67-74). Kaksijuosteiset plasmidit muutettiin yksijuosteiseksi DNA:ksi superinfektoimalla Pharma-cialta saadun auttajafagin M13K07 kanssa.

DNA-sekvenssianalyysi 0,94 ke DNA-palasesta pTMPvl8A:n XhoI- ja EcoRV-kohtien välistä esitetään kuviossa 12. Tämä DNA-sekvenssi, luettuna kaikissa mahdollisissa lukukehyksissä, paljasti laajan avoimen lukukehyksen, joka sisältää lipaasiproteiinin NH2-terminaaliset aminohappotähteet, määritettynä suoralla aminohapposekvensoinnilla (tähteet 1 - 24), katso tämän esimerkin kohta A. Metioniini paikassa - 24 on preproteiinin aloituskodoni, koska tämä metioniini edeltää bakteerisille signaalipeptideille tyypillistä ami-nohappojaksoa (katso Von Heijne, J. Mol. Biol. 192 (1986) 287-290). Tämä 24 aminohappoa sisältävä signaalipeptidi lohkaistaan pois eritysprosessin aikana A E A (-3 - -1) signaalipeptidaasin tunnistuskohdan jäljestä. On merkille : pantavaa, että tämän signaalisekvenssin kysteiinitähteen ympärillä oleva alue muistuttaa suuresti lipoproteiinin konsensus-signaalipeptidiä (katso Von Heyne, samassa teks-tissä).

DNA-sekvenssistä ennustettu aminohapposekvenssi osoittaa, että toimintavalmis M-l -lipaasi käsittää 289-aminohappoi- .···. sen proteiinin, joka päätetään TGA-lopetuskodonilla (katso ,·|·\ kuvio 12). Tämän toimintavalmiin proteiinin ennustettu • # · *. . molekyylipaino on 30323, joka on hyvin yhtäpitävä molekyy- lipainon kanssa, joka on määritetty M-l -lipaasille (mp.

«·« 31500) SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla \ (katso kuvio 10).

102295 39

Esimerkki 5

Pseudomonas aeruginosan PAO-lipaaslgeenin molekulaarinen kloonaus

Pseudomonas aeruglnosan lipaasi on lipidiä hydrolysoiva entsyymi (EC 3.1.1.3), jonka molekyylipaino on noin 29000, joka erittyy kasvualustaan myöhäisessä logaritmisessa kasvuvaiheessa (katso Stuer et ai., J. Bacteriol. 168 (1986) 1070-1074).

A. Kloonaus ja karakterisointi

Lipaasigeenin kloonaamiseksi Pseudomonas aeruginosa PAO 1-kannasta (ATCC 15692), käytettiin isäntävalikoimalta laajaa kloonaussysteemiä, mikä mahdollisti geenipankin seulonnan suoraan komplementaation avulla eri Pseudomonada-ceae-mutanttikantoja vastaan. Isäntävalikoimalta laajaa vektoria pKT248 (Bagdasarian et ai., Gene 16 (1981) 237-247) käytettiin, joka on siirrettävissä oleva R300B-peräi-nen isäntä-valikoimalta laaja plasmidi, joka antaa streptomysiini- ja kloramfenikoliresistenssin.

Pseudomonas aeruginosa PAO l:n DNA:ta pilkottiin osittain restriktioendonukleaasilla Sali ja liitettiin pKT248-vek-torin yhteen ainoaan Sali-kohtaan. Suhde insertti:vektori oli 5:1 vektori-vektoriin ligaation mahdollisuuden vähentämiseksi. Ligoitu PAO/pKT248-DNA transformoitiin kompe-... tenttiin E. coll SKll08:aan (Donovan ja Kushner, Gene 25 (1983) 39-48) kuten esimerkissä IB on kuvailtu. E. colin * · · *·] ) SK1108 transformantit seulottiin streptomysiiniresistens- ·:♦·: sin (SmR) suhteen ja vastavalikoitiin kloramfenikoliherk- kyyden (CmS) suhteen.

Kuusituhatta (6000) SmRCmS-kloonia saatiin ja seulottiin lipolyyttisen aktiivisuuden suhteen kuten esimerkissä 2 on 102295 40 kuvailtu. Yksikään klooneista ei osoittanut sellaista aktiivisuutta, johtuen luultavasti Pseudomonas-promoottorien heikosta tunnistamisesta E. colissa (Jeenes et ai., edellä) .

Kloonien siirto E. colista Pseudomonas aeruginosa PAO 2302:n lipaasi-negatiiviseen 6-1 -mutanttiin (Wohlfarth ja Winkler, J. Gen. Microbiol. 134 (1988) 433-440) suoritettiin sen vuoksi seuraavasti: 6000 kloonia jaettiin 120 osaan, joista kukin käsitti 50 kloonia. Plasmidivalmistei-ta saatiin jokaisesta osasta, ja niitä käytettiin trans-formoitaeösa kompetentteja PAO 2302 (6-1) lip- -mutantti-soluja. Kompetentteja Pseudomonas-soluja valmistettiin Olsenin et ai. mukaisesti, J. Bacteriol. 150 (1982) 60-69. Valikointi suoritettiin kalsiumtrioleiini (CT) -agarmal-joilla (Wohlfarth ja Winkler, edellä), joihin oli lisätty streptomysiiniä (50 yg/ml). Kymmenen 5000:sta seulotusta PAO-transformantista osoitti lipaasiaktiivisuutta, mikä ilmeni valkoisina kiteinä pesäkkeiden pinnalla. Yksi näistä positiivisista PAO-transformanteista, pSWl, valittiin j . lisäkarakterisointiin.

: Sen sisältämää plasmidia karakterisoitiin restriktioana- lyysillä, jota seurasi elektroforesointi agaroosigeeleil-*.*·· lä, ja sen todettiin sisältävän 3,1 kiloemästä sisältävän

Sall-insertin, joka koostui 1,3 ke, 0,97 ke ja 0,76 ke Sall-alafraqmenteista. Nämä insertit subkloonattiin sopiviin vektoreihin DNA:n sekvensointia varten ja lipaasigee-nin ilmentymisen aikaansaamiseksi.

• · · • · · • · · • · · • ; Plasmidi-DNA:ta pUC19-peräisestä subkloonista, nimeltä * * pSW103 (joka sisälsi 1,3 ja 0,97 ke insertit), eristettiin ja karakterisoitiin restriktioendonukleaaseilla. Tämän j- plasmidin pSWl03 fysikaalinen kartta esitetään kuviossa : 13. Näyte E. colista JM101 hsdS recA, joka piti sisällään plasmidin pSW103, talletettiin CBS:ään 8. maaliskuuta, 1989, numerolla 141.89.

102295 41 B. Pseudomonas aeruginosa PAO l:n llpaasiqeenin sekvensointi ja karakterisointi pSW103:n 2,3 ke Sall-lnserttl, joka sisälsi PAO 1 -lipaa-sigeenin, sekvensoitiin kahdella menetelmällä: sekä "pakotetulla" kloonaussekvensointi-, samoinkuin "shot-gun" -kloonaussekvensointimenetelmillä, Deininger (Anal. Bio-chem. 129 (1983) 216-223) M13-bakteriofagijohdannaisilla mpl8 ja mpl9 (Yanisch-Perron et ai., Gene 33 (1985) 103-119), että dideoksi-ketjunpysäytysmenetelmällä Mizusawan et ai. mukaisesti, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1319-1324.

"Pakotetussa" kloonaussekvensointimenetelmässä pSW103:n 2,3 ke insertin Sall/PstI- ja Sall/EcoRI-palat puhdistettiin ja liitettiin sopivaan M13mpl8-vektoriin. Koko sekvenssi osoitettiin yhdistämällä DNA-sekvenssistä saatujen palojen kokoelma. Suurin osa DNA-sekvenssistä on määritetty molempien juosteiden osalta. Tämä DNA-sekvenssi, luettuna kaikissa mahdollisissa lukukehyksissä, osoitti, että ainoastaan pSW103:n 0,97 ke Sali-pala (katso kuvio 14) koodittaa toimintavalmista PAO 1 -lipaasia.

pSW103 subkloonin 1,3 ke Sali-pala ei koodittanut, luettuna kaikissa mahdollisissa lukukehyksissä, PAO 1 -lipaasi-proteiinin 24:ää N-terminaalista aminohappotähdettä, määritettynä suoralla aminohapposekvensoinnilla.

0,97 ke Sali-palasen DNA-sekvenssistä ennustettu aminohap-posekvenssi osoittaa yhden kiinnostavan alueen (merkitty • · · A:lla kuviossa 14).

• · · ' • ·

Alue A koodittaa aminohapposekvenssiä G-H-S-H-G, *...* mikä jo määriteltiin aktiiviseksi keskukseksi sekä eukary- oottisissa lipaaseissa (Wion et ai.. Science 235 (1987) 1638-1641; Bodmer et ai., Biochem. Biophys. Acta 909 (1987) 237-244) että prokaryoottisissa lipaaseissa (Kugi- 102295 42 miya et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 141 (1986) 185-190).

Esimerkki 6 A. Kloonatun M-l -lipaasin ilmentäminen bakteereissa M-l -lipaasin ilmentymistason parantamiseksi heterologi-sissa isännissä, pTMPvl8A:n 2,0 ke ΚβηΙ-HindiII-pala, joka sisälsi M-l -lipaasigeenin, liitettiin Kpnl:llä ja HindIII:lla pilkottuihin pBHA/Cl-vektoreihin. pBHAl-vekto-rin nukledtidisekvenssiä kuvaillaan EP-A-0275598:ssa. pBHCl-vektori on identtinen pBHAl-vektorin kanssa, lukuunottamatta eroa seuraavien antibioottiresistenssigeenien ilmentymisessä: kloramfenikoliasetyylitransferaasigeeni (Cm) ilmentyy E. coli -kannassa WK6, joka pitää sisällään pBHCl-vektorin, ja beeta-laktamaasigeeni (Ap) ilmentyy E. coli -kannassa WK6, joka pitää sisällään pBHAl-vektorin.

R. Zell ja H.J. Fritz kuvailevat E. coli kantaa WK6, EMBO J. 6 (1987) 1809.

WK6:n transformoinnin jälkeen ja joko saatujen ampisillii-niresistenttien pesäkkeiden (pBHAl:n tapauksessa) tai saatujen kloramfenikoliresistenttien pesäkkeiden (pBHCl:n tapauksessa) analysoinnin jälkeen, todettiin vastaavat plasmidit pBHAM-1 ja pBHCM-l, katso kuvio 15.

Seuraava vaihe oli Ndel-restrlktioendonukleaaslpaikan :***; siirtäminen M-l -preproteiinin ATG-aloituskodoniin. Paik- • · · kakohdennettu mutageneesi pBHA/CM-1 -plasmideilla suori- *· ; tettiin kuten Stanssens et ai. on kuvaillut, "Protein ' * Engineering and Site-Directed Mutagenesis", 24th Harder • · ·

Conference (1985), ed. A.R. Fersht ja G. Winter.

: Mutageneesin jälkeen potentiaalisista mutanteista tarkis tettiin asiaankuuluvan mutaation läsnäolo sekä restriktio- 102295 43 entsyymianalyysillä että sekvenssianalyysillä, käyttäen Mizusawan et ai. dideoksi-menetelmää, katso esimerkki 5. Näiden analyysien jälkeen havaittiin oikea plasmidi, merkittynä pBHAMINl, (katso kuvio 16). M-l -lipaasin säädellyn ilmentymisen aikaansaamiseksi E. collssa, pBHAMINl:n 1,7 ke Ndel-Hindlll-pala, joka sisältää M-l -lipaasin ra-kennegeenin, eristettiin ja liitettiin kahteen ilmentymis-vektoriin; - pTZ18RN, pTZ18R-johdannainen, joka sisältää tunnusomaisen Ndel-kohdan beeta-galaktosidaasin ATG-aloituskodonilla (katso Mead et ai., Protein Engineering 1 (1986) 67-74); - pMCTN, pMC-johdannainen (katso Stanssens et ai., edellä), joka sisältää tunnusomaisen Ndel-kohdan tac-promoot-torin ja ribosomaalisen sitoutumiskohdan takana.

Kyseisten kahden ligaation transformoinnin jälkeen kompe-tentteihin E. coll JM101 hsdS recA -soluihin, saadut transformantit seulottiin lipolyyttisen aktiivisuuden suhteen tributyriiniagarmaljoilla, jotka sisälsivät 0,5 mM IPTG:tä (isopropyyli-p-D-tiogalaktosidi). Näiden tributy-: .·, riinimaljojen inkuboinnin jälkeen 30°C:ssa 48 tunnin ajan, • V jota seu-rasi maljojen säilyttäminen jääkaapissa usean • « päivän ajan, jotkut pesäkkeet muodostivat heikon kehän, mikä osoitti lipolyyttistä aktiivisuutta. Näiden tributy- « ♦ · riinipositiivisten kloonien plasmidit karakterisoitiin restriktioentsyymianalyysin avulla. Etsityt kaksi plasmi-dia todettiin: - pTZNIMl, joka pitää sisällään M-l -lipaasigeenin lac-kontrollisekvenssien takana (katso kuvio 17); ja - pMCTMl, joka pitää sisällään M-l -lipaasigeenin tae- J kontrollisekvenssien takana (katso kuvio 18).

··« • ·

Lipolyyttisen aktiivisuuden identifioimiseksi, jota E. co-;· li -transformantit tuottivat, jotka pitävät sisällään plasmideja pTZNIM-l ja vastaavasti pMCTM-1, näitä klooneja • « viljeltiin yli yön 100 ml:ssa 2 TY -alustaa (16 g/1 Bacto- 102295 44

tryptonia, 10 g/1 Bacto-hiivauutetta, 5 g/1 NaCl:a, pH

7,0) 30°C:ssa, jota seurasi 3 tunnin indusoiminen 0,5 mM IPTGrn kanssa 30°C:ssa. E. colln kantaa JM101 hsdS recA, joka sisältää pTZ18RN:n, käytettiin negatiivisena kontrollina. Solut erotettiin viljelmän supernatantista sentrifu-goimalla ja fraktioitiin sen jälkeen periplasmisiin ja membraani/sytoplasmisiin komponentteihin Tetsuakin et ai. mukaisesti, Appi. Environmental Microbiol. 50 (1985) 298-303. Jokainen fraktio analysoitiin SDS-polyakryyliamidi-geeleillä Laemmlin mukaan, Nature 227 (1970) 680-685, jotka sisälsivät 13-%:sen erotusgeelin ja 5-%:sen konsen-trointigeölin (ylägeelin). Geelejä ajettiin jännitteessä 60 mA, kunnes Bromophenol Blue (BPB)-markkeri saavutti geelin alaosan. Näytteen valmistaminen ja proteiiniblot-tausmenettely suoritettiin kuten EP-A-0253455:ssä on kuvailtu. Westernblotti analysoitiin käyttäen polyvalentti-sia kanin antiseerumeita puhdistettua lipaasia vastaan P. pseudoalcaligenes -kannasta M-l. Kuviossa 19 esitetyistä tuloksista voidaan päätellä, että E. coli -kannat, jotka : pitävät sisällään pTZNlMl:n ja vastaavasti pMCTMl:n, voi vat syntetisoida ja erittää periplasmiseen tilaan M-l -li-paasispesifistä 31,5 kDa polypeptidiä (katso kuvio 19, kaistat B ja C). Tämän 31,5 kDa polypeptidin lipolyyttinen aktiivisuus varmistettiin pehmytagarpintamenetelmällä, jo-

< I

·'·' ka perustui β-naftyyliasetaatti/Fast Blue BB -suolamene- telmään, jota on kuvailtu esimerkissä 1C.

EP-A-0275598:ssa ja EP-A-0253455:ssä tuodaan esille mene-i"’: telmä välikappaleen tehokkaaksi siirtämiseksi Bacilluk- seen, joka välikappale sisältää kiinnostuksen kohteena olevan geenin, josta tuloksena on Bacillus-kantoja, jotka erittävät tehokkaasti tavoiteltuja polypeptidituotteita. Tätä menetelmää käytettiin sekä Thai IV 17-1- että M-l -·· lipaasigeeneille.

M-l -lipaasigeenin tapauksessa, pBHAMINl-plasmidi (katso edellä) pilkottiin Ndel:llä ja religoitiin. Ligaatioseos 102295 45 transformoitiin Bacillus lichenlfortnls T9 -protoplastei-hin. Muutama neomysiiniresistentti, tributyriinipositiivi-nen pesäke analysoitiin, ja oikea plasmidi saatiin. Plas-midi oli nimeltään pBHMINI (katso kuvio 20), M-l -prepro-teiinin ollessa pUB110:n Hpall-promoottorin takana (katso Zyprian ja Matsubara, DNA 5 (1986) 219-225). T9-transfor-manteista, jotka pitävät sisällään pBHMINI-plasmidin, testattiin niiden kyky hydrolysoida β-naftyyliestereitä fer-mentoinnin jälkeen teollisessa liemessä esimerkissä 2 kuvaillun menetelmän mukaisesti. Tulokset osoittavat, että T9-kloonien tuottaman entsyymin lipolyyttinen aktiivisuus sisältää Samanlaisia ominaisuuksia kuin parentaalista Pseudomonas pseudoalcaliqenes M-l -kannasta saadulla li-paasilla.

Ilmentämistä varten Pseudomonas-isännissä, p78-geenin konstitutiivista promoottoria Pseudomonas-spesifisestä bakteriofagista Pf3 käytettiin (katso R.G.M. Luiten, "The Filamentous Bacteriophage Pf3: A Molecular Genetic Study", PhD Thesis 1987, Catholic University of Nijmegen, The : Netherlands). Synteettinen DNA-pala valmistettiin, joka koodittaa tätä Pf3-promoottoria: •35 -10 5' AATTCGATCGCAAAAAGTACITTGCAAIGTTCCCGAAACCCTCTC TAGAGT TCTAGGTGCATCTGAATGGAGCTCGCTAC 3' 3' gctagcgtttttcatg|aacgttJcaagggctttgggacag[atctca|agatccacgtagacttacctcgagc 5' Tämä pala liitettiin EcoRItllä ja Kpnl:llä katkaistuun vektoriin pTZ18R, mistä sai alkunsa plasmidi pTZPf31A.

Plasmidit pTZPf31A ja pMCTMl katkaistiin sekä BamHIrllä että Hindlllilla, ligoitiin ja transformoitiin kompetent- • · · · # teihin E. coli JM101 hsdS recA -soluihin. Oikea plasmidi, jossa M-l -lipaasigeeni sijaitsee Pf3-promoottorin ohjauk-·· sessa, saatiin ja nimettiin pTZPf3Ml :ksi.

Kloonatun M-l - lipaasigeenin ilmentymisen aikaan saamiseksi pseudomonadeissa, M-l -ekspressiokasetteja, joita 102295 46 oli läsnä plasmideissa ρΤΜΡνΙΘΑ, pMCTMl ja pTZPf3Ml, liitettiin isäntävalikoimalta laajoihin vektoreihin pKT231 (Bagdasarion et ai., Gene 16 (1981) 237-247), pLAFR3 (Staskawisz et ai., J. Bacteriol. 169 (1987) 5789-5794) ja pJRD215 (Davison et ai.. Gene 51 (1987) 275-280). Saadut isäntävalikoimalta laajat plasmidit, jotka pitivät sisällään M-l -ekspressiokasetteja, siirrettiin Friedmanin et ai. triparentaalisen pariuttamismenettelyn mukaisesti, (Gene 18 (1982) 289-296) seuraaviin Pseudomonas-kantoihln: - P. aeruginosa -kannan PAO 2302 (Wohlfarth ja Winkler, edellä) lipaasi-negatiivinen mutantti 6-1.

- lipaasi-negatiivinen P. putida -kanta KT2442 (Zeyer et ai., Applied Environmental Microbiol. 50 (1985) 1409-1413) - P. pseudoalcaliqenes -kanta M-l (CBS 473,85) - P. pseudoalcaliqenes -kanta IN II-5 (CBS 468,85)

Vaihtoehtoisena menetelmänä isäntävalikoimalta laajojen plasmidien siirtämiseksi E. colista Pseudomonakseen, säh-kökenttävälitteistä transformaatio ("elektroporaatio")-menettelyä käytettiin Gene Pulser -manuaalin mukaisesti (Bio-Rad Laboratories).

Saaduista Pseudomonas-transformanteista testattiin niiden lipaasituotanto fermentoinnin jälkeen oliiviöljypohjaisis-sa alustoissa kuten Odera et ai. on kuvaillut, J. Ferment. Technol. 64 (1986) 363-371.

Seuraavassa taulukossa 2 esitetään eri kantojen lipolyyt-.···. tinen tuotantokyky.

«•I

ttt • · · • · • « • 1 · t I • · · · 102295 47

Taulukko 2

Lipaasin tuotantokyky tietyillä transformoiduilla Pseudo-monas-kannoilla, jotka sisältävät M-l -lipaasigeenin

Pseudomonas- Isäntävalikoimalta laaja Lipaasin tuotan-kanta vektori, joka sisältää M-l- tokyky, % * ekspressiokasetin, joka on peräisin PA02302 (6-1) ei inserttiä (vektori) 0 PAO2302 (6-1) pTMPvl8A 2 PA02302 (6-1) pMCTMl 40 PA02302 (6-1) pTZPf3Ml 60 KT2442 ei inserttiä (vektori) 0 KT2442 ρΤΜΡνΙβΑ 1 KT2442 pMCTMl 30 KT2442 pTZPf3M1 40 M-l ei inserttiä 100 .·! M-l ρΤΜΡνΙβΑ 340 M-l pMCTMl 240 V M-l pTZPf3M1 260 IN II-5 ei inserttiä (vektori) 100 IN II-5 ρΤΜΡνΙβΑ 420 IN II-5 pMCTMl 350 O IN II-5 pTZPf3M1 270 ♦ · · « · · n — __— — — [ _ _ _ [ | — — — — ^ | | • · · mt\m\ * Lipolyyttinen tuotantokyky määritettiin viljelmän super- • · natanteista käyttäen esimerkissä 2 kuvailtua menetelmää.

• · Näiden Pseudomonas-transformanttien tuottamat lipaasit analysoitiin SDS-geelielektroforeesin avulla, ja ne kulkeutuivat identtisesti alkuperäisen P. pseudoalcaliqenes -kannan M-l tuottamaan lipaasiin nähden.

102295 48

Voidaan havaita, että parannus, joka saadaan aikaan, kun liitetään moninaisia M-l -ekspressiokasettikopioita P. pseudoalcaligenes -kantoihin, on 2-4-kertainen verrattuna lipaasitasoon, jonka donorikanta tuottaa. Lisäksi voidaan päätellä, että M-l -lipaasigeenin alkuperäinen geenin ilmentymisen aloitussignaali tai promoottori on aktiivinen Pseudomonas pseudoalcaligenes -kannoissa, toisin kuin PAO

1- ja KT2442-kannoissa.

B. Kloonatun M-l -lipaasigeenin in vitro -ilmentäminen M-l -lipaäsin sisältävien kloonien in vitro -ilmentäminen suoritettiin käyttäen prokaryoottiseen DNA:hän kohdistuvaa translaatiopakkausta (Amersham International). Tämä systeemi mahdollistaa bakteeriplasmidin sisältämien geenien in vitro -ilmentymisen edellyttäen, että asiaankuuluvat kontrollisignaalit ovat läsnä. Seuraavat neljä bakteeri-plasmidia analysoitiin: B.l. Plasmidi pTMPvl8A (katso kuvio 11), joka koodittaa sekä M-l -lipaasi- että β-laktamaasigeenituotteita, ja aikaansaa ampisilliiniresistenssin (Ap). pTMPvl8A sisältää lisäksi omat säätelysignaalinsa, promoottori-, Shine-Dal-garno- ja ohjaussekvenssit.

B.2. Plasmidi pMCTMl (katso kuvio 18), joka sisältää M-l -lipaasigeenin ja kloramfenikoliresistenssigeenin (Cm).

Tässä rakenteessa lipaasipromoottori on vaihdettu voimakkaaseen tac-promoottoriin.

B.3. Plasmidi pMCTbliMl sisältää myös M-l -lipaasigeenin ja kloramfenikoliresistenssigeenin. Tässä rakenteessa li-paasin signaalisekvenssi vaihdettiin a-amylaasin signaali lisekvenssiin (katso EP-A-0224294). Promoottori oli sama kuin rakenteessa pMCTMl.

B.4. Plasmidia pTZ18RN (katso kuvio 17) käytettiin negatiivisena kontrollina.

Mainittujen plasmidien DNA:ta (0,5 /ui) kopioitiin in vitro. Tämä reaktio suoritettiin lisäämällä 0,5 /ui 10xTB/ 102295 49 ΙΟχΝΤΡ-seosta (seos, joka sisältää yhtä suuret tilavuudet 20xTB:a ja 20xNTP-seosta; 20xTB sisältää 800 mM Tris-HCl:a pH 7,5, 120 mM MgCl2:a ja 40 mM spermidiiniä; 20xNTP-seos sisältää 10 mM ATP:a, 10 mM CTP:a, 10 mM GTP:a ja 10 mM UTP:a), 0,5 /ui 0,1 M DTT:a, 0,5 μΐ RNasiinia (40 u/μΐ, Promega) ja 0,5 μΐ T7 RNA -polymeraasia (15 u/μΐ, Promega) tai 1 μΐ E. colin RNA-polymeraasia (1 u/μΐ, Boehringer). Reaktioseosta inkuboitiin 1 tunti 39,5*C:ssa.

RNA-kopioiden in vitro -luenta suoritettiin valmistajan toimittamien ohjeiden mukaisesti. M-l -lipaasi immunosaos-tettiin kdten Van Mourik on kuvaillut (J. Biol. Chem. 260 (1985) 11300-11306) käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita M-l -lipaasia vastaan.

pTZ18RN:a käytettiin negatiivisena kontrollina (kuvio 21, kaistat A ja E). pTMPvl8A:n immunosaostaminen (kaista B) ilmaisee 34 kDa prosessoimattoman M-l -lipaasin. pMCTM-l:n immunosaostaminen (kaista C) ilmaisee 34 kDa prosessoimattoman M-l -lipaasin ja toimintavalmiin 31,5 kDa M-l -lipaasin, kun taas pMCTbliMl:n immunosaostaminen (kaista D) ilmaisee toimintavalmiin 31,5 kDa M-l -lipaasin. In vitro-luentakokeista voidaan päätellä, että M-l -lipaasigeeni voidaan ilmentää E. coli -solujen S-30 uutteista. pTMPvie-A:n iji vitro -kopioinnista/luennasta saadut tulokset tukevat lipolyyttisen aktiivisuuden puuttumista tributyriini-maljoilla (katso esimerkki 4B), sillä M-l -lipaasin prosessointia ei esiinny.

• · · * · • · · : : : Esimerkki 7 » · • · ...# Molekulaarinen entsyymiseulonta käyttäen karakterisoituja *!*. llpaaslqeenejä koettimina.

Keksinnön yleisen käyttökelpoisuuden edelleen osoittamiseksi, keksinnön mukaisesti käytettiin tässä patenttihake 102295 50 muksessa esille tuotuja koettimia lipaasigeenien löytämiseksi, joilla on vastaavia ominaisuuksia, ja jotka ovat peräisin muista mikro-organismeista. Keksinnön mukaisesti osoitetaan, että on mahdollista valikoida lipaasigeenejä, joilla on samanlainen tai verrattavissa oleva sopivuus pesuun.

Esimerkkinä kuvaillaan plasmidien pET3 ja vastaavasti pTMPvl8A DNA-inserttejä, hybridisaatiokoettimina sen osoittamiseksi, että kummankin homologisia geenejä on läsnä useimmissa analysoiduissa mikro-organismeissa. Näiden kahden li£>aasigeenin välillä ei esiinny ristihybridisaa-tiota (kaista A ja kaista B), mikä viittaa siihen, että kumpikin näistä lipaasia koodittavista sekvensseistä saa alkunsa eri kantageeneistä.

Esimerkissä 8 osoitetaan myös, että tämä hybridisaatiotek-niikka mahdollistaa muiden mikro-organismien homologisten lipaasigeenien kloonauksen.

Tämän saavuttamiseksi, kromosomaalista DNA:ta eristettiin seuraavista kannoista, Pseudomonas pseudoalcaligenes M-l (CBS 473.85), P. pseudoalcaligenes IN II-5 (CBS 468.85),

P. alcallqenes (DSM 50342), P. aeruginosa PAC 1R (CBS

136.89) , P. aeruginosa PAO (ATCC 15692) (Wohlfarth ja Winkler, 1988, J. Gen. Microbiol. 134, 433-440), P. stut-zerl Thai IV 17-1 (CBS 461.85); P. stutzeri PG-I-3 (CBS

137.89) , P. stutzeri PG-I-4 (CBS 138.89), P. stutzeri

····. PG-II-11,1 (CBS 139.89), P. stutzeri PG-II-11,2 (CBS

140.89) , P. fragi DB1051, P. gladioli (CBS 176.86), Aclne- • i tobacter calcoaceticus Gr-V-39 (CBS 460.85) ja Staphylo coccus aureus (ATCC 27661), 5 pg pilkottiin ja analysoi-tiin Southern-blottaustekniikalla (Maniatis et ai., edellä). DNA siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Schleicher & Schdll, BA85; 0,45 ym. Kalvoja esihybridisoitiin liuoksessa, joka sisälsi 6xSSC:a, SxDenhardt:ia, 0,5 % SDS:a ja 100 pg/ml denaturoitua vasikan tyymuksen DNA:ta.

102295 51

Kahden tunnin esi-inkuboinnin jälkeen lisättiin 32P-lei-mattua inserttiä pTMPvl8A:sta tai vastaavasti pET3:sta, ja hybridisaatio toteutettiin 55eC:ssa 16 tunnin aikana.

Insertti-DNA:ta eristettiin pilkkomalla pTMPvl8A:ta XhoI:-llä ja EcoRV:llä, ja pilkkomalla pET3:a EcoRItllä, jota seurasi palasten erottaminen 0,8-%:sella agaroosigeelie-lektroforeesilla ja palasten talteenotto lasimaitomenetel-mällä (Gene Clean™). pTMPvl8A:n insertti, 1 ke XhoI/ EcoRV-pala ja pET3:n insertti, 3,2 ke EcoRI-pala leimattiin Ijn vitro korkeaan spesifiseen aktiivisuuteen (2-5x108 cpm/pg) a$2P-ATP:n kanssa katkotranslaation avulla (Fein-berg ja Vogelstein, Anal. Biochem. 132, 1983, 6-13). Osoitettiin, että koetinpalojen keskimääräinen pituus vaihte-lee välillä 300-800 emästä.

Kalvot pestiin sen jälkeen kahdesti 30 min. ajan 55eC:ssa liuoksessa, joka sisälsi 6xSSC:a, 0,1 % SDS:a. Kalvot kuivattiin huoneen lämpötilassa ja autoradiografoitiin 1-3 päivän aikana valottamalla KODAK X-omat AR -filmeille tai Cronex 4 NIP 100 röntgenfilmille (Dupont) varustettuna vahvistusvarjostimilla -70*C:ssa (Cronex-valaistus plus GH Γ: 220020).

Seuraavaa yhtälöä, joka on johdettu analysoitaessa eri tekijöiden vaikutusta hybridin pysyvyyteen:

Tm = 81 + 16,6 (loglO Ci) + 0,4 (% G + C) - 600/n -1,5 % ... mismatch'iä (ei-sopiva emäsparisuus) (Current protocols in ♦ · *;··* molecular biology 1987-1988, toimittajina Ausubel et ai.).

*·* : n = koettimen lyhimmän ketjun pituus ·:··· Ci = ioni vahvuus (M) .***. G+C = emäskoostumus • · käytettiin homologian määrittämiseksi, joka voitiin il-: maista keksinnön mukaisissa kokeissa. Olettaen koettimen '· " pituudeksi 300 emästä, kyettiin ilmaisemaan homologinen geeni, joka osoitti vähintään 67-%:sta homologiaa 300 102295 52 emästä tai enemmän sisältävän palan sisällä. Homologiapro-sentin määrittämisessä oletettiin, että Pseudomonaksen GC-pitoisuus on 65 % (Normore, 1973, teoksessa Laskin ja Lechevalier (ed.), Handbook of microbiology voi. II, CRC press, Inc. Boca Raton Fla.).

Kuvio 22A esittää Salltllä pilkotun kromosomaalisen DNA:n hybridisaatiokuviota, hybridisoituna pET3:n EcoRI-lnsertln kanssa. Voidaan havaita, että useimmat Pseudomonas-kannat sisältävät pET3:n suhteen homologisia geenejä. P. fraqlssa DB1051 (kaista M), A. calcoaceticuksessa Gr-V-39 (kaista O) ja S. äureuksessa (kaista P) ei havaittu homologisia geenejä. Kohtalaisia hybridisaatiosignaaleja havaittiin P. alcaliqeneksessä (kaista E), P. pseudoalcallqeneksessä (kaista C ja kaista D), P. aeruqinosassa (kaista F ja kaista G), kun taas heikkoa hybridisoitumista todettiin P. gladlollssa (kaista N). Hyvin voimakasta hybridisoitumista todettiin P. stutzeri -kannoilla (kaistat H-L), mikä ei ole yllättävää, koska pET3 saatiin alunperin P. stutze-;··.. rlsta Thai IV 17-1.

Kuvio 22B esittää hybridisaatiokuviota pTMPvl8A:n EcoRV/ Xhol-insertin kanssa.

Voidaan todeta, että voimakkaita hybridisaatiosignaaleita saatiin P. pseudoalcaliqeneksen, (kaistat C ja D), P. al-caliqeneksen (kaista E) ja P. stutzerin kantojen (kaistat H-L) kromosomaalisesta DNA:sta. Heikompaa hybridisoitumis-ta todettiin P. aeruqinosan (kaistat F ja G) kromosomaali-:T: sessa DNA:ssa, ja hybridisaatiota ei todettu lainkaan P.

fraqin DB1051 (kaista M), P. gladloiin (kaista N), A. cal-coaceticuksen Gr-V-39 (kaista O) 1a S. aureuksen (kaista ;·' P) kromosomaalisen DNA:n kanssa.

102295 53

Esimerkki 8

Homologisten lipaasiqeenien kloonaus muista mikro-organismeista Tämän keksinnön käyttökelpoisuuden osoittamiseksi, keksinnön mukaisesti kuvaillaan plasmidin pTMPvl8A:n käyttämistä homologisen geenin kloonaamiseksi, joka on peräisin P. al-caligeneksestä (DSM 50342) (katso kuvio 22B, kaista E).

Kuviosta 22B, kaista E, voidaan todeta, että P. alcallge-nes osoittaa selvän 5,0 ke Sali-palan ja heikon 0,5 ke Sali-palan, jotka hybridisoituvat koettimen kanssa. Tämä osoittaa, että P. alcallgenes sisältää geenin, joka on vähintään 67-%:sesti homologinen 300 emäsparia tai enemmän sisältävän palan alueella pTMPvl8A-plasmidin XhoI/EcoRV-inserttiin nähden.

Sen osoittamiseksi, edustaako P. alcaliqeneksen 5,0 ke Sali-pala geeniä, joka koodittaa lipaasia, Sali-palat kloonattiin. Sall-geenikirjasto konstruoitiin vektorin pUC19 avulla ja transformoitiin E. coliln JM109 (Yanish-Perron et ai., Gene 33 (1985) 103-119). Geenikirjaston kalvokopioita hybridisoitiin pTMPvl8A:n a32P-leimatun in-sertin kanssa, käyttäen esimerkissä 7 kuvailtuja olosuhteita. Kolme positiivista kloonia, joista kaikki sisälsivät 5,0 ke Sali-palan, eristettiin kirjastosta: pCHl, pCH2 ja pCH3. pCHlrn 5,0 ke Sali-pala rekloonattiin vektoriin '···* pKT248 (Bagdasarian et ai., Gene 16 (1981) 237-247) Sali- »*· 1"" " : kohdan avulla, joka sijaitsee kloramfenikoliresistenssi- • · ;··: geenissä. Streptomysiiniresistenttejä, kloramfenikoliherk- .*··. kiä transformantteja valikoitiin E. colissa JM109. Yksi ·’· näistä transformanteista, pCHlOl, joka sisälsi odotetun : 5,0 ke Sall-insertin, transformoitiin Pseudomonas aerugi- ! nosaan 2302 (6-1) lip“ (katso esimerkki 5).

102295 54

Pesäkkeitä viljeltiin NB-kalsiumtrioleiiniagarilla. Viljelyn jälkeen maljoja säilytettiin 10°C:ssa. Usean päivän kuluttua, kalsiumsaostuma oli näkyvissä transformoituneiden pesäkkeiden ympärillä mutta ei ei-transformoituneiden P. aeruginosa 2302 (6-1) lip-:n ympärillä, jota viljeltiin samanlaisilla agarmaljoilla ilman antibiootteja. Keksinnön mukaan päätellään, että kloonattu 5,0 ke Sali-pala täydentää P. aeruqinosan 2302 (6-1) lip“ fenotyyppiä lip“ ja koodittaa siitä johtuen ekstrasellulaarista lipaasia, jota voidaan tuottaa sopivassa isännässä.

DNA-hybridisaatiokokeiden perusteella voidaan päätellä, että tämä lipaasi osoittaa homologiaa M-l -lipaasin suhteen ja niin muodoin muiden lipaasien suhteen, hybridisoi-tuen ρΤΜΡνΐβΑ-insertin kanssa, jota käytettiin koettimena. Kuvaus P. alcallgeneksen lipaasin kloonauksesta edustaa yleisesti käyttökelpoista menetelmää lipaasigeenien kloonaamiseksi, jotka ovat homologisia M-l -lipaasin suhteen.

Esimerkki 9 * t Y Pseudomonas pseudoalcaliqenes M-l:stä saadun lipaasin nuk- leotidlsekvenssln vertaileminen muihin llpaaselhin '·’ Pseudomonas pseudoalcaliqeneksen M-l lipaasin nukleotidi- sekvenssiä (kuvio 12) verrattiin Pseudomonas fraqln (IFO- 3458) lipaasin (Kugimiya et ai., Biochem. Biophys. Res.

Commun. 141 (1986) 185-190), staphylococcus hyicuksen li- :***: paasin (Gotz et ai., Nucleic Acids Res. 13, (1985) 1891- « · · 1903) ja Pseudomonas aeruqinosan PAO 1 lipaasin (kuvio 14) • ; nukleotidisekvensseihin. Läheinen 81-%:nen homologia to- - *··♦ dettiin M-l -lipaasin ja P. aeruqinosan PAO 1 -lipaasin « » *···' välillä, ja 62-%:nen homologia todettiin M-l -lipaasin ja ·· P. fraqln (IFO-3458) lipaasin välillä. Tämän P. fraql -li- paasin sekvenssi on kuitenkin huomattavasti lyhyempi kuin kahden muun Pseudomonas-llpaasin sekvenssi. Yhtään homolo- 102295 55 giaa ei todettu M-l -lipaasin ja Staphylococcus hyicus -lipaasin välillä.

Nämä tulokset tukevat esimerkissä 7 saatuja tuloksia, joissa ei havaittu hybridisaatiota kromosomaalisen DNA:n kanssa, joka oli peräisin Pseudomonas fraglsta ja Staphylococcus aureuksesta, kun pTMPvl8A:ta käytettiin koettime na.

Aminohapposekvenssiä, joka oli johdettu P. pseudoalcall-qeneksen M-l -lipaasin nukleotidisekvenssistä, verrattiin myös muihin lipaaseihin. Kokonaishomologian M-l -lipaasin ja P. aeruginosa PAOlrn lipaasin välillä todettiin olevan 78 % ja M-l -lipaasin ja P. fraqin lipaasin välillä 48 %. Taaskaan ei havaittu homologiaa M-l -lipaasin ja Staphylococcus hyicus -lipaasin aminohapposekvenssien välillä.

Läheistä homologiaa on kuitenkin olemassa neljän lipaasin , välillä toimintavalmiin M-l -lipaasin välttämättömän se- riini-87:n alueella. Kugimiya et ai., edellä, olettivat, että tämän alueen sekvenssi G-H-S-H-Gon lipaasi-entsyymien aktiivinen keskus.

i t < i 1 i ; ' Esimerkki 10 * · I • · fc 4

Homologisten llpaasien deterqenttlyhteensoplvuus SLM-tes-tlssä Tämä esimerkki kuvastaa lipaasientsyymien suorituskykyä, !” 1oita ovat tuottaneet P. aeruqinosa-, P. stutzeri- ja P.

« · · “ 1 " 1 “ 1 "" — \ ’ alcallqenes -kannat, ja jotka osoittavat korkeata DNA-sek- '**i venssihomologiaa M-l -geenin kanssa, pesuprosessissa modi- fioidun SLM-testin mukaan, jossa näiden entsyymien yhteen- *.* sopivuutta nykyaikaisessa pesulapuhdistuskoostumuksessa . \ testattiin.

• · * »i • · Käytetyt puhdistuskoostumukset olivat jauhemainen pesuai-nekoostumus (ALLR-peruspesuaine, kuvailtu EP-A-0218272: 102295 56 ssa) ja nestemäinen pesuainevalmiste (Liquid TIDER, myös kuvailtu EP-A-0218272:ssa, mutta ilman proteaasin inakti-vointia). Lipaasientsyymejä valmistettiin viljelemällä bakteereja seuraavan menettelyn mukaisesti: siirrosviljel-mä valmistettiin viljelemällä bakteereita 100 ml:ssa Brain Heart Infusion (BHI)-alustaa pyöriväliikkeisessä raviste-lijassa 30°C:ssa 24 tunnin ajan. Laboratoriofermentori (2 litraa), joka sisälsi 1,0 litran alustaa, joka sisälsi jäljempänä mainitun koostumuksen, siirrostettiin sen jälkeen.

Alustan kdostumus

Komponentti Pitoisuus (g/kg)

Brain Heart Infusion (BHI) (Difco) 18,50

Hiivauute (Difco) 16,00

Kalsiumkloridi.2H20 0,80

Magnesiumsulfaatti.7H20 3,20

Mangaanisulfaatti.lH20 0,030

Soijaöljy 5,0

Dikaliumfosfaatti 6,40

Fermentointi toteutettiin 30°C:ssa. Kuusitoista tuntia siirrostuksen jälkeen soijaöljyn syöttäminen aloitettiin . . nopeudella 1 g/h, ja sitä jatkettiin fermentoinnin loppu- ajan. Ilmastusmäärä oli 60 1/h ja sekoitusnopeus 700 rpm. Fermentointia ajettiin kaikkiaan 64 tunnin ajan.

Fermentoinnin jälkeen bakteerit poistettiin sentrifugoi-malla. Supernatantti sekoitettiin nopeasti sekoituksessa • · ♦ 2,5 tilavuuden kanssa asetonia huoneen lämpötilassa. Seos- • · · v ·’ ta sekoitettiin sen jälkeen 10 minuuttia, sen annettiin laskeutua, ja se suodatettiin lasisuotimen läpi imussa. Suodinkakkua pestiin sen jälkeen 70-%:sella asetonilla, sen jälkeen 100-%:sella asetonilla ja kuivattiin sitten alipaineessa.

102295 57 Tällä tavalla saadut llpaasientsyymlvalmisteet testattiin sen jälkeen SLM-testausmenetelmällä. SLM-testausmenettelyä on kuvailtu EP-A-0218272:ssa. Tätä menetelmää modifioitiin seuraavasti: 20 μ1:η tilavuus, joka sisälsi 10 mg oliiviöljyä liuotettuna asetoniin (25 %) tahrittiin polyesteritilkulle (3x3 cm) ja ilmakuivattiin huoneen lämpötilassa. Pesuliuosta, joka sisälsi 10 ml SHW:a vakiokovuuden omaavaa vettä (Standard Hardness Water: 0,75 mM CaCl2:a, 0,25 mM MgCl2:a) tai pesuainetta liuotettuna SHW:hen, lisättiin hiostulpalliseen erlenmeyer-kolviin (25 ml) ja pidettiin ravistelevassa vesihauteessa 40*C:ssa. Testatut pesuaineet olivat jauhemainen pesuainekoostumus (ALLR-peruspesuaine) ja nestemäinen valmiste (TIDE^-neste). ALL-peruspesuliuok-sen pitoisuus oli 4 g/1 (pH 9,5). Nestemäisen TIDE:n pitoisuus oli 1,5 g/1 (pH 7,5). Liuokset puskuroitiin 0,1 M Tris/HCl:n avulla. Pesuprosessi aloitettiin lisäämällä entsyymivalmistetta ja välittömästi sen jälkeen liattu tilkku erlenmeyer-kolviin ja ravistellen 40 minuutin ajan ; . tai kauemmin 40eC:ssa. Lopullinen lipaasipitoisuus oli 2 TLU/ml.

·' : Pesun jälkeen tilkku huuhdeltiin SHW:llä, kuivattiin sen jälkeen 55eC:ssa yhden tunnin ajan. Kuivatut tilkut pestiin sellaisenaan jälleen toisessa pesusyklissä, käyttäen tuoretta pesuainetta ja entsyymiliuosta 40 minuutin ajan. Toisen pesusyklin jälkeen tilkkua käsiteltiin 0,01 N HCl:-;*·*. llä 5 minuutin ajan, huuhdeltiin ja kuivattiin huoneen lämpötilassa yli yön. Kuivia tilkkuja uutettiin pyörittä- • · » mällä lasiputkessa, joka sisälsi 5 ml liuotinta (n-heksaa-* : ni/isopropyylialkoholi/muurahaishappo: 975:25:2,5 (v/v), l ml/min.). Muodostunut jäännöstriglyseridi, diglyseridi ja vapaa rasvahappo määritettiin HPLC:n avulla.

58 102295 HPLC-laitteisto ja -olosuhteet:

Kolonni : CP Microspher-Si (Chrompack), 100x4,6 mm

Injektiosysteemi: Wisp (Millipore) 10 μΐ Pumppu : Malli 2150 (LKB)

Detektori : Taitekerroinseuranta (Jobin Jvon)

Integraattori : SP 4270 (Spectra Physis)

Eluentti : n-heksaani/isopropyylialkoholi/muura- haishappo: 975:25:2,5 (v/v), 1 ml/min. Lämpötila : ympäristön vallitseva

Trioleiinin retentioaika oli 1,2 min., 1,3 diglyseridien 2,5 min., 1,2 diglyseridien 3,6 min., ja oleiinihapon retentioaika oli 1,6 min. Piikin pinta-ala tai piikin korkeus määritettiin osoituksena triglyseridin ja rasvahapon talteenotosta. Triglyseridin takaisinsaantia uuttamisen jälkeen pesemättömästä tilkusta pidettiin 100-%:na. Taite-kerroinreaktioiden suhteen trioleiinin ja oleiinihapon välillä todettiin olevan 1,0 piikin korkeuden perusteella.

Näiden SLM-testien tulokset esitetään seuraavissa taulukoissa. Näissä taulukoissa esitetään triglyseridien tal-teensaanti ja kokonaislipidien talteensaanti. Kokonaisli-pidien talteensaanti käsittää triglyseridit, 1,2- ja 1,3-diglyseridit plus vapaat rasvahapot. Ero kokonaislipidien talteensaannin ja triglyseridien talteensaannin välillä on lipaasiaktiivisuuden ja -suorituskyvyn mitta. Ero kokonaislipidien talteensaannin ja kontrollin välillä (ilman lipaasientsyymiä) osoittaa öljymäisen tahran poistumista .···. kankaasta ja osoittaa, että nämä entsyymit ovat pysyviä ja tehokkaita todellisissa pesuolosuhteissa, joita simuloi- • · · ’· · tiin SLM-testissä.

• · 59 102295

— I dP I

I jp I I *— I

MG I '— I dNHfflhHnin (O G I I

© Η © G I rin c-d I 00(--0400000-0-10 bio-hii)-h I in^ino\HHinn © -η © -p ι *<»*«****·.

n CO Φ-Ρ I m^dininoohn GO®G i uidvowHi/uoin

φ ΟΉ+Ι G I O-rl-PO I (nCMO^hCOCOQO

(0 M (XH © I Μ Λ I—I (0 I

Λ! O-H ID id I OH «J n I

p XH-P W I *5 H -P I

£ I f I

3 I I

-P G I Cl

(0 © H I <0 Φ Ή I

0 -H -p I (0 H -P I

Ο Ό G I (0 Ό G I

>! H (0 I Φ Ή (0 I

1 ρ ίο I m p <0 I

Ρ3ΦΜ I οηοωπιπωΐ'Φ ,* Φ ίο i oiooiN^oodn © (0 C I******** 3 W C | Ό >, Φ I dounhnoaio E >< © — ιιηνοοοοπο-οοοο rlrl Φ" I «Tv rl (S N Mn PHD# ICTlCOl^H'VOO-O-O'

Eh O'-Ρ dP I -P θ'-p -- I

-H r~H -— I (0 -H H I

WJ P (0 I O P <0 I

W E-I -P I O EH -P I

Ml Ml

Φ I 10 I

toi G I

•HI PI

*0 to I Φ W I

EG3— I ftGP I

Φ Φ 3 O' I I Φ 3 I

P © W V. I OOOOOOO pS © (0 — I

(Q-P-HD I 00 Λ H d1 f' P» H J +J -H O' I

<D w > j louiNfomonow jto>\ i ooooooo :.:: G-h-he· i o 04 on vo 04 oo o < -η ή π i oo o h h· h . ε h -- I O- <H VD ΓΊ ΓΟ ε -H PI I OlOOfOOirHOOl

4-> Η -P I (0H-PEh I O in OO VO 04 00 O

D DPI I H ON rl ^ I P~ 04 VO 04 on m > ro I in '' η > © ι ::: ai i i «mvf hh m i m hop 0 I HHIIHH O I I PS OO r* - -

H I H H H II rH I HH I I HH

··· 3 IHUIIHH 3 I HHHHH

’ * -P © I I G < O O H H +> © I H O I I I I

•Η -p I I SHOiPiPi I I Η -P I I I G ·< O O H H

-P G II ϋϋ -P G ι I 2 Η Mi( Oi H H

(0 10 I IX 04 (0 © I II

©Hi 1(0 © M 1(0 OO

-P I Φ -P I Φ 04 04

1 I G I I G

SI© SI© J I O' PI I O' .··· m ι h m ι -h

• . I H I H

G I © © G I © © . © ι u (ο © ι u m

·.· · -H I —h O -H -H I —Η Ο-H

00(0 l-H©GP H· (0 l-H©GP

. © IHO -Η © © IHO H ©

·;·*: O© I Η Ό O' N O© I Η Ό O' N

M (X 10 3 3 -p >104 10 3 3 -P

,··· A! -H © IP© P 3 >! -Η © IP© P 3 • · 3 H-P I -P IQ = © -P 3 Η-p l-P(0= © -P = = =

H (0 I G Oi © (0 = = = H (0 I G 0 O (II

3-H-H IO 3 H H IO

©PP I M · · · ©PP I IS · · ·

Eh MM I — 04 = 0404 = = = Eh MH I—04=0404= = =

Claims (12)

102295

1. Transformoitu mikrobi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää ekspressiokasetin, joka sisältää transkription 5'-3'-suunnassa (1) transkriptionaalisen säätelyalueen ja transla-tionaalisen aloitusalueen, jotka ovat toiminnallisia mainitussa isäntäsolussa; (2) DNA-sekvenssin, joka sisältää vähintään 300 bp sisältävän sekvenssin, joka on nukleotidisekvenssiltään vähintään 67%risesti homologinen plasmidissa pTMPvlSA (CBS 142.89) tai pET3 (CBS 155.87) olevan lipaasia koodattavan geenin kanssa, ja joka koodittaa prokaryootti-sesta mikro-organismista saatua lipolyyttistä entsyymiä, jolle on tunnusomaista, (a) pH-optimi välillä 8 - 10,5, mitattuna pH-mitta-rilla TLU-määrityksen olosuhteissa, ja (b) lipaasiaktiivisuus vesipitoisessa liuoksessa, joka sisältää pesuainetta aina noin 10 g/1 konsentraati-oon asti 60 °C:n tai alhaisemman lämpötilan pesuolosuh-teissa ja pH-arvossa 7-11; ja (3) translationaaliset ja transkriptionaaliset lope-tusalueet, jotka ovat toiminnallisia mainitussa isäntä-solussa, jolloin mainittu DNA-sekvenssi on mainittujen tran- ; .·. skriptionaalisten ja translationaalisten alueiden sääte- • · · *!!.* levässä ohjauksessa.

• · · • · • · · • · 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitu isäntäso- lu, tunnettu siitä, että mainittu ekspressiokasetti kä- ·.*.· sittää lisäksi merkkigeenin. • · · • · · t · i

: .·, 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitu isäntäso- lu, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi sisältää ohjaussekvenssin liittyneenä oikeassa lukukehyksessä 5'-suunnassa geeniin, joka koodittaa mainittua lipolyyttistä entsyymiä. 102295

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on prokary-oottinen solu.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu prokaryoottisolu on Bacillus-, E. coli- tai Pseudomonas-solu.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi saadaan Pseudomonas-lajista.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi saadaan P. stutzerista, P. alcaligeneksestä, P. pseudoalcali-geneksestä tai P. aeruginosasta.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi saadaan P. stutzeri -kannasta Thai IV 17-1 (CBS 461.85), PG-1-3 (CBS 137.89), PG—1-4 (CBS 138.89), PG-II-11.1 (CBS 139.89) tai PG-II-11.2 (CBS 140.89), P. aeruginosa -kannasta PAC l R (CBS 136.89), P. aeruginosa -kannasta PAO (ATCC 15692), P. alcaligenes -kannasta DSM 50342, P. pseudoalcaligenes -kannasta IN II-5 (CBS 468.85) tai P. : pseudoalcaligenes -kannasta M-l (CBS 473.85). • · · · • · · • ♦ · • ♦ ·

9. Menetelmä lipolyyttisen entsyymin valmistamiseksi, φ · · * ' jolle on tunnusomaista (a) pH-optimi alueella 8 - 10,5, mitattuna pH-mitta- • ♦ · *·*.* rilla TLU-määrityksen olosuhteissa, ja • · · *.* * (b) lipaasiaktiivisuus vesipitoisessa liuoksessa, ; joka sisältää pesuainetta aina noin 10 g/1 konsentraati- oon asti 60 eC:n tai alhaisemman lämpötilan pesuolosuh-teissa ja pH-arvossa 7-11; tunnettu siitä, että « « · • (1) viljellään ravintoalustassa jonkin patenttivaa- ·...· timuksista 1-8 mukaista isäntäsolua, joka sisältää eks- 102295 pressiokasetin, joka sisältää transkription 5'-3'-suunnassa transkriptionaalisen säätelyalueen ja translationaalisen aloitusalueen, jotka ovat toiminnallisia mainitussa isäntäsolussa; DNA-sekvenssin, joka sisältää vähintään 300 bp sisältävän sekvenssin, joka on nukleotidisekvenssiltään vähintään 67%:isesti homologinen plasmidissa pTMPvlSA (CBS 142.89) tai pET3 (CBS 155.87) olevan lipaasia koodattavan geenin kanssa, ja joka koodittaa mainittua pro-karyoottisesta mikro-organismista saatua lipolyyttistä entsyymiä; ja translationaalisia ja transkriptionaalisia lopetus-alueita, jotka ovat toiminnallisia mainitussa isäntä-solussa, jolloin mainitun DNA-sekvenssin ilmentyminen on mainittujen transkriptionaalisten ja translationaalisten alueiden säätelevässä ohjauksessa; ja (2) eristetään mainittu lipolyyttinen entsyymi ravintoalustasta.

10. Yhdistelmä-DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se käsittää: (1) transkription suunnassa transkriptionaalisen säätelyalueen, joka on toiminnallinen mikrobi-isäntäso-lussa; (2) DNA-sekvenssin, joka koodittaa prokaryoottisesta : .·. mikro-organismista saatua lipolyyttistä entsyymiä, jolle • · · · on tunnusomaista, • · · (a) pH-optimi välillä 8 - 10,5, mitattuna pH-mitta- • · · * ’ rilla TLU-määrityksen olosuhteissa, ja (b) lipaasiaktiivisuus vesipitoisessa liuoksessa, • · · ·*·* joka sisältää pesuainetta aina noin 10 g/1 konsentraati- t·» ·.· * oon asti 60 °C:n tai alhaisemman lämpötilan pesuolosuh- J teissä ja pH-arvossa 7-11; jolloin mainittu DNA-sekvenssi sisältää vähintään 300 bp sisältävän sekvenssin, joka on nukleotidisekvens-siltään vähintään 67%:isesti homologinen plasmidissa pTMPvl8A (CBS 142.89) tai pET3 (CBS 155.87) olevan lipaa- 102295 siä koodittavan geenin kanssa, ja (3) transkriptionaalisen lopetuksen säätelyalueen, joka on toiminnallinen mainitussa isäntäsolussa.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se edelleen käsittää vähintään yhden vali-kointimerkkigeenin ja erityksen ohjaussekvenssin.

12. Plasmidi pETl, joka sisältyy numerolla CBS 157.87 talletettuun E. coli -kantaan, plasmidi pET3, joka sisältyy numerolla CBS 155.87 talletettuun E. coli -kantaan, plasmidi pM6-5, joka sisältyy numerolla CBS 153.87 talletettuun E. coli -kantaan, plasmidi pP5-4, joka sisältyy numerolla CBS 151.87 talletettuun E. coli -kantaan, plasmidi pTMPvl8A, joka sisältyy numerolla CBS 142.89 talletettuun E. coli -kantaan, tai plasmidi pSW103, joka sisältyy numerolla CBS 141.89 talletettuun E. coli -kantaan.