JPS6291181A - 耐熱性α−アミラ−ゼの製造法 - Google Patents
耐熱性α−アミラ−ゼの製造法Info
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- JPS6291181A JPS6291181A JP27340185A JP27340185A JPS6291181A JP S6291181 A JPS6291181 A JP S6291181A JP 27340185 A JP27340185 A JP 27340185A JP 27340185 A JP27340185 A JP 27340185A JP S6291181 A JPS6291181 A JP S6291181A
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- amylase
- restriction enzyme
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- thermostable
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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- Medicinal Chemistry (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、遺伝子組換え技術を用いた耐熱性α−アミラ
ーゼの製造に関する。更に詳しくは、ジクチオグロマス
・サーモフィラムの耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を組み
入れたプラスミドを挿入することにより形質転換された
菌株を培養し、培養菌体から耐熱性α−アミラーゼを製
造する方法に関する。
ーゼの製造に関する。更に詳しくは、ジクチオグロマス
・サーモフィラムの耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を組み
入れたプラスミドを挿入することにより形質転換された
菌株を培養し、培養菌体から耐熱性α−アミラーゼを製
造する方法に関する。
従来技術
α−アミラーゼ（ＥＣ３，２，１，１）は、醸造、澱粉
加工及び織物工業等の多方面で盛んに使用されており、
特に澱粉工業においては、耐熱性のα−アミラーゼが用
いられている。耐熱性α−アミラーゼとしては、枯草菌
由来のα−アミラーセカ従来から知られており、最近に
おいては、枯草菌α−アミラーゼの生産性をより高める
ために遺伝子組換え技術も導入されはじめた。例えば特
開昭５６−１２８７９６号には、バチルス・コアギユラ
ンス（Ｂ、ｃｏａｇｕｌａｎｓ ）のα−アミラーゼ遺
伝子をプラスミド又はλファージのベクターと結合させ
、大腸菌又は枯草菌に形質転換させ、α−アミラーゼを
大量生産する方法が記載されており、特開昭５６−１１
３２９３号には、バチルス・アミロリクエファシェンス
（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ４＋ｓ ）のα
−アミラーゼ遺伝子をバクテリオファージのベクターと
結合させ、枯草菌に形質転換させることが記載されてお
り、更には、特開昭５７−１３９０９７号には、バチル
ス・ステアロサーモフィラス（Ｂ、ｓｔａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ）の耐熱性α−アミラーゼの遺伝子
を大腸菌又は枯草菌プラスミドのベクターと結合させ、
枯草菌又は大腸菌に形質転換させることが記載されてい
る。一方、バチルス属菌の耐熱性α−アミラーゼに比し
てより高い耐熱性α−アミラーゼを生産する菌の存在す
ることが知られている。例えば特開昭６０−２１８２号
には好熱性嫌気性菌Ｈ−６屈菌が高度の耐熱性α−アミ
ラーゼを産生ずることが記載されている。
加工及び織物工業等の多方面で盛んに使用されており、
特に澱粉工業においては、耐熱性のα−アミラーゼが用
いられている。耐熱性α−アミラーゼとしては、枯草菌
由来のα−アミラーセカ従来から知られており、最近に
おいては、枯草菌α−アミラーゼの生産性をより高める
ために遺伝子組換え技術も導入されはじめた。例えば特
開昭５６−１２８７９６号には、バチルス・コアギユラ
ンス（Ｂ、ｃｏａｇｕｌａｎｓ ）のα−アミラーゼ遺
伝子をプラスミド又はλファージのベクターと結合させ
、大腸菌又は枯草菌に形質転換させ、α−アミラーゼを
大量生産する方法が記載されており、特開昭５６−１１
３２９３号には、バチルス・アミロリクエファシェンス
（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ４＋ｓ ）のα
−アミラーゼ遺伝子をバクテリオファージのベクターと
結合させ、枯草菌に形質転換させることが記載されてお
り、更には、特開昭５７−１３９０９７号には、バチル
ス・ステアロサーモフィラス（Ｂ、ｓｔａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ）の耐熱性α−アミラーゼの遺伝子
を大腸菌又は枯草菌プラスミドのベクターと結合させ、
枯草菌又は大腸菌に形質転換させることが記載されてい
る。一方、バチルス属菌の耐熱性α−アミラーゼに比し
てより高い耐熱性α−アミラーゼを生産する菌の存在す
ることが知られている。例えば特開昭６０−２１８２号
には好熱性嫌気性菌Ｈ−６屈菌が高度の耐熱性α−アミ
ラーゼを産生ずることが記載されている。
発明が解決すべき問題点
枯草菌α−アミラーゼは耐熱性であるというものの、特
開昭５７−１３９０９７号に記載されているように９０
℃、４５分処理によって約４０％も失活してしまい、十
分安定性を保持しているとはいえないのであり、殿粉業
界においてはより耐熱性のα−アミラーゼが求められて
いるのが現状である。
開昭５７−１３９０９７号に記載されているように９０
℃、４５分処理によって約４０％も失活してしまい、十
分安定性を保持しているとはいえないのであり、殿粉業
界においてはより耐熱性のα−アミラーゼが求められて
いるのが現状である。
一方■４−６属菌（本属菌はその後所属新種のジクチオ
グロマス・サーモフィラムと命名されたので、本願では
）（−６［菌を以下ジクチオグロマス・サーモフィラム
と称する。）の生産する耐熱性α−アミラーゼはカルシ
ウムイオン存在下、９０°Ｃ１６０分処理において全く
失活せず、むしろ活性化されているほど耐熱性は高いけ
れども本菌は、高度好熱性絶対嫌気性菌であるので嫌気
的条件下で培養する必要があること、史には７０℃の高
温下で培養する必要があること等の欠点があり、このま
までは実用的ではなかった。
グロマス・サーモフィラムと命名されたので、本願では
）（−６［菌を以下ジクチオグロマス・サーモフィラム
と称する。）の生産する耐熱性α−アミラーゼはカルシ
ウムイオン存在下、９０°Ｃ１６０分処理において全く
失活せず、むしろ活性化されているほど耐熱性は高いけ
れども本菌は、高度好熱性絶対嫌気性菌であるので嫌気
的条件下で培養する必要があること、史には７０℃の高
温下で培養する必要があること等の欠点があり、このま
までは実用的ではなかった。
問題点を解決するための手段
そこで本発明者らは、ジクチオグロマス・サーモフィラ
ム原菌の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を取り出し、これ
を適当なプラスミドに挿入し、宿主に形質転換すること
を試みた。そして鋭意検討した結果、プラスミドとして
合成コンセンサスプロモーターベクターのｐＹＥＪＯＯ
ｌを用い、ジクチオグロマス・サーモフィラムの耐熱性
α−アミラーゼ遺伝子を連結し、連結した組換え体ＤＮ
Ａを大腸菌に形質転換したところ、形質転換株は常温で
好気的に培養でき、かつ菌体内に親菌株ジクチオグロマ
ス・サーモフィラムと同じ耐熱性を有するα−アミラー
ゼを蓄積していることを知り、培養菌体から耐熱性α−
アミラーゼを採取することにより本発明を完成したので
ある。
ム原菌の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を取り出し、これ
を適当なプラスミドに挿入し、宿主に形質転換すること
を試みた。そして鋭意検討した結果、プラスミドとして
合成コンセンサスプロモーターベクターのｐＹＥＪＯＯ
ｌを用い、ジクチオグロマス・サーモフィラムの耐熱性
α−アミラーゼ遺伝子を連結し、連結した組換え体ＤＮ
Ａを大腸菌に形質転換したところ、形質転換株は常温で
好気的に培養でき、かつ菌体内に親菌株ジクチオグロマ
ス・サーモフィラムと同じ耐熱性を有するα−アミラー
ゼを蓄積していることを知り、培養菌体から耐熱性α−
アミラーゼを採取することにより本発明を完成したので
ある。
作用
耐熱性α−アミラーゼ生産菌であるジクチオグロマス・
サーモフィラム（Ｄｉｃｔｉｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒ
ｍｏ−ｐｈｉｌｕｍ） Ｈ６１２ＦＥＲＭ−Ｐ＆、７１
１４は熊本県の杖立温泉より単離された高度好熱性でか
つ絶対嫌気性細菌であり、その菌学的性質は特開昭６０
−２１８２号に示されている。まず本発明者らはジクチ
オグロマス・サーモフィラムＨ，−６−１２ＦＥｌ’ｌ
ｌ’ｌ−Ｐ階７１１４の染色体より耐熱性α−アミラー
ゼ遺伝子を取り出し、次いで常法通り、この遺伝子をシ
ョットガンクローニング法によってベクターｐＢＲ３２
２と連結したのち、宿主菌である大腸菌に形質転換する
ことを試みたが、得られた形質転換株はいずれもα−ア
ミラーゼの生産能を有していなかった。本発明者らはジ
クチオグロマス・サーモフィラムＨ−６−１２ＦＥＲＭ
−Ｐ階７１１４の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子のプロモ
ーターはそのままでは大腸菌内で機能しにくいことに起
因するのではないかと考え、次に強力なプロモーターを
組換え点の上流にもつプラスミドである合成コンセンサ
スプロモーターベクターｐＹＥＪ００１を用いることに
した。そしてジクチオグロマス・サーモフィラムＨ−６
−１２ＦＥＲＭ−１％７１１４の耐熱性α−アミラーゼ
遺伝子を合成コンセンサスプロモーターヘククーｐＹＥ
Ｊ００１と連結したのち、このものを宿主菌である大腸
菌に形質転換させたところ、予期したとおりα−アミラ
ーゼ活性を示す形質転換株が得られたのである。更に形
質転換株の培養菌体を集菌し、超音波破砕した試料につ
いて各温度で酵素活性を測定したところジクチオグロマ
ス・サーモフィラムＨ−６−１２ＦＥＲＭ−Ｐ階７１１
４由来の耐熱性α−アミラーゼ同様至適温度が９０°Ｃ
であることにより形質転換出来たことを確認するととも
に、サザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｒ
＋ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法によってこのアミ
ラーゼ遺伝子がジクチオグロマス・サーモフィラムＨ−
６−１２由来であることが確認された。しかしながら、
こうして得られた形質転換株中に組み込まれた耐熱性α
−アミラーゼ遺伝子の大きさは５．２Ｋｂであり、耐熱
性α−アミラーゼ以外に余分のものを組み込んでいるこ
とが予想された。そこで本発明者らは、これら余分の遺
伝子を除くことによってジクチオグロマス・サーモフィ
ラムｆ（−６−１２ＦＥＲＭ−Ｐ階７１１４由来の耐熱
性α−アミラーゼ遺伝子を純化し、かつ又形質転換株の
α−アミラーゼ生産能を上昇させることを試みた。その
結果、本発明者らは形質転換株に組み込まれた耐熱性α
−アミラーゼ遺伝子を制限酵素により切断することによ
って最終的には２、６５Ｋｂの大きさまでジクチオグロ
マス・サーモフィラムＨ−６−１２ＦＥＲＭ−Ｐ寛７１
１４の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
削減できたのである。純化された耐熱性α−アミラーゼ
遺伝子はＨ４ｎｄＩＩ［認識部位を２箇所、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＶ認識部位を１箇所、制限酵素Ｒｓａ ［認識部
位を１箇所、制限酵素Ａｃｃ Ｉ認識部位をＩＷＪ所及
び制限酵素Ｂｇｌ［Ｉ認識部位を１箇所有している。本
発明の耐熱性α−アミラーゼ潰伝子の形質転換株である
ニジエリシア・コリ （ε、ｃｏｌｉ ） Ｃ６００ｒ
ｋ−ｍｋ−（ｐＤＴ９０１）は工業技術院微生物工業技
術研究所にＦＥＲＭ−Ｐ隘８２８０として寄託されてい
る。このＥ、ｃｏｌｉＣ６００ｒｋ−ｍｋ−（ｐＤＴ９
０１） ＦＥＲＭ−ＰＮＩ ８２８０をＬ−ブロス培地
で３７℃で好気的に培養し、培養後、菌体を集菌し、破
砕してｉＭられる耐熱性α−アミラーゼ粗酵素の酵素化
学的性質は次の通りである。
サーモフィラム（Ｄｉｃｔｉｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒ
ｍｏ−ｐｈｉｌｕｍ） Ｈ６１２ＦＥＲＭ−Ｐ＆、７１
１４は熊本県の杖立温泉より単離された高度好熱性でか
つ絶対嫌気性細菌であり、その菌学的性質は特開昭６０
−２１８２号に示されている。まず本発明者らはジクチ
オグロマス・サーモフィラムＨ，−６−１２ＦＥｌ’ｌ
ｌ’ｌ−Ｐ階７１１４の染色体より耐熱性α−アミラー
ゼ遺伝子を取り出し、次いで常法通り、この遺伝子をシ
ョットガンクローニング法によってベクターｐＢＲ３２
２と連結したのち、宿主菌である大腸菌に形質転換する
ことを試みたが、得られた形質転換株はいずれもα−ア
ミラーゼの生産能を有していなかった。本発明者らはジ
クチオグロマス・サーモフィラムＨ−６−１２ＦＥＲＭ
−Ｐ階７１１４の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子のプロモ
ーターはそのままでは大腸菌内で機能しにくいことに起
因するのではないかと考え、次に強力なプロモーターを
組換え点の上流にもつプラスミドである合成コンセンサ
スプロモーターベクターｐＹＥＪ００１を用いることに
した。そしてジクチオグロマス・サーモフィラムＨ−６
−１２ＦＥＲＭ−１％７１１４の耐熱性α−アミラーゼ
遺伝子を合成コンセンサスプロモーターヘククーｐＹＥ
Ｊ００１と連結したのち、このものを宿主菌である大腸
菌に形質転換させたところ、予期したとおりα−アミラ
ーゼ活性を示す形質転換株が得られたのである。更に形
質転換株の培養菌体を集菌し、超音波破砕した試料につ
いて各温度で酵素活性を測定したところジクチオグロマ
ス・サーモフィラムＨ−６−１２ＦＥＲＭ−Ｐ階７１１
４由来の耐熱性α−アミラーゼ同様至適温度が９０°Ｃ
であることにより形質転換出来たことを確認するととも
に、サザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｒ
＋ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法によってこのアミ
ラーゼ遺伝子がジクチオグロマス・サーモフィラムＨ−
６−１２由来であることが確認された。しかしながら、
こうして得られた形質転換株中に組み込まれた耐熱性α
−アミラーゼ遺伝子の大きさは５．２Ｋｂであり、耐熱
性α−アミラーゼ以外に余分のものを組み込んでいるこ
とが予想された。そこで本発明者らは、これら余分の遺
伝子を除くことによってジクチオグロマス・サーモフィ
ラムｆ（−６−１２ＦＥＲＭ−Ｐ階７１１４由来の耐熱
性α−アミラーゼ遺伝子を純化し、かつ又形質転換株の
α−アミラーゼ生産能を上昇させることを試みた。その
結果、本発明者らは形質転換株に組み込まれた耐熱性α
−アミラーゼ遺伝子を制限酵素により切断することによ
って最終的には２、６５Ｋｂの大きさまでジクチオグロ
マス・サーモフィラムＨ−６−１２ＦＥＲＭ−Ｐ寛７１
１４の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
削減できたのである。純化された耐熱性α−アミラーゼ
遺伝子はＨ４ｎｄＩＩ［認識部位を２箇所、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＶ認識部位を１箇所、制限酵素Ｒｓａ ［認識部
位を１箇所、制限酵素Ａｃｃ Ｉ認識部位をＩＷＪ所及
び制限酵素Ｂｇｌ［Ｉ認識部位を１箇所有している。本
発明の耐熱性α−アミラーゼ潰伝子の形質転換株である
ニジエリシア・コリ （ε、ｃｏｌｉ ） Ｃ６００ｒ
ｋ−ｍｋ−（ｐＤＴ９０１）は工業技術院微生物工業技
術研究所にＦＥＲＭ−Ｐ隘８２８０として寄託されてい
る。このＥ、ｃｏｌｉＣ６００ｒｋ−ｍｋ−（ｐＤＴ９
０１） ＦＥＲＭ−ＰＮＩ ８２８０をＬ−ブロス培地
で３７℃で好気的に培養し、培養後、菌体を集菌し、破
砕してｉＭられる耐熱性α−アミラーゼ粗酵素の酵素化
学的性質は次の通りである。
１）作用・基質特異性：澱粉に液化性に作用し、分解産
物として主にマルトースを蓄積する。
物として主にマルトースを蓄積する。
２）至適ｐＨ：５．５ （第１図に示される。）３）
至適温度：９０℃〜９５°Ｃ（第２図に示される。）４
）温度安定曲線： （第３図に示される。）以下に本発
明を実施例にて具体的に説明する。
至適温度：９０℃〜９５°Ｃ（第２図に示される。）４
）温度安定曲線： （第３図に示される。）以下に本発
明を実施例にて具体的に説明する。
なおα−アミラーゼ活性の測定法は次の通りである。
アミラーゼ活性測定法：
０．２％可溶性澱粉０．５−１ｂｕｆｆｅｒｏ、２５ｍ
Ｅを２連準備し、一方は試料添加直後に１．５Ｎ酢酸１
ｍｌを加え反応を停止させ、他方は試料添加後８０℃、
３０分反応させた後１．５Ｎ酢酸を１ｍｌ加え反応を停
止させる。両方に〔０，１％■２．１％ＫＩ）溶液８ｍ
Ｅを加えＯＤ ６９０を計る。ヨード殿粉反応の青色を
３０分で１割減少させる活性を１ｕｎｉｔと定義し、次
式に従って計算した。
Ｅを２連準備し、一方は試料添加直後に１．５Ｎ酢酸１
ｍｌを加え反応を停止させ、他方は試料添加後８０℃、
３０分反応させた後１．５Ｎ酢酸を１ｍｌ加え反応を停
止させる。両方に〔０，１％■２．１％ＫＩ）溶液８ｍ
Ｅを加えＯＤ ６９０を計る。ヨード殿粉反応の青色を
３０分で１割減少させる活性を１ｕｎｉｔと定義し、次
式に従って計算した。
アミラーゼ活性−
なお、可溶性椴松（メルク社製品、ジアスターゼ定量用
）は末端還元糖の１元基を除く処理をしたものを用いた
。
）は末端還元糖の１元基を除く処理をしたものを用いた
。
実施例１ 耐熱性α−アミラーゼ遺伝子の分離ジクチオ
グロマス・サーモフィラムＨ−６−１２ＦＥＲＭ−Ｐ階
７１１４の染色体ＤＮＡは斉藤、三浦の方法〔ハイオチ
ミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ
、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ） ７２巻、 ６１
９頁（１９６３年）〕に準じて調製し、このものの制限
酵素旧ｎｄＩ［Ｉで部分分解して得られる断片と合成コ
ンセンサスプロモーターベクターであるｐＹＥＪＯＯｌ
（ファルマシアＰ−Ｌハイオケミカルズ社製品）を
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ （宝酒造社製品）で完全分解
し、アガロース電気泳動にかけ大きい断片を回収後、ア
ルカリホスファクーゼ（宝酒造社製品）処理して得られ
る断片とを連結し得られた組換え体ＤＮＡを大腸菌（Ｆ
２．ｃｏｌｉ Ｃ６００ｒｋ−ｍｋ−）に形質転換した
。こうして得られたアンピシリン耐性形質転換株につい
て以下のようにアミラーゼ活性発現の検出を行った。ア
ンピシリン５０ｐｇ／祿を含むＬ−ブロス寒天プレート
上に滅菌したろ紙をのせ、これにアンピシリン耐性形質
転換株をレプリカし、−晩培逐後溶菌酵素含有緩ｉｈ液
（５０ｍＭト’Ｊスー塩酸緩衝液（ｐｌ＋７．５）、０
．１％トリトンＸ −１００及び２ ｍｇ ／ ｍ、ｅ
リプチームからなる。〕をろ紙にしみ込ませ３７°Ｃ１
１時間静置後、可溶性殿粉含有プレート（０，２％可溶
性澱粉、クロラムフェニコール１１００Ｉｔ ／ −及
び４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０） ］に溶菌させ
、コロニーが下になるようにしてろ紙にのせ、これを６
０°Ｃで一晩反応させＩ２蒸気で染色したところ、ヨー
ド澱粉反応によるハローを形成する菌株がとれた。この
菌株をアンピシリン５ｈｇ ／ ｍを含むし一ブロス（
１％ハクトドリプトン、 ０．５％酵母エキス、０．５
％食塩、０．１％グルコースを含みｐｌ＋７．３に調整
したもの。）に植菌後、−晩培養し、集菌後１０ｍＭ
）リス−塩酸緩衝液（ｐｔ！７．３）で洗浄し、１．５
ｍｊの１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，３）に懸
濁後超音波処理し、遠心した試料につきアミラーゼ活性
測定（８５℃、３０分）を行い形質転換されていること
を確認した。この形質転換株からプラスミドを常法によ
り鋼製した復旧ｎｄＩＩ［で切断すると２．５５Ｋｂ、
１．９０Ｋｂ、０．７５Ｋｂの３断片が生じ計５．３Ｋ
ｂが挿入されていることがわかった。
グロマス・サーモフィラムＨ−６−１２ＦＥＲＭ−Ｐ階
７１１４の染色体ＤＮＡは斉藤、三浦の方法〔ハイオチ
ミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ
、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ） ７２巻、 ６１
９頁（１９６３年）〕に準じて調製し、このものの制限
酵素旧ｎｄＩ［Ｉで部分分解して得られる断片と合成コ
ンセンサスプロモーターベクターであるｐＹＥＪＯＯｌ
（ファルマシアＰ−Ｌハイオケミカルズ社製品）を
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ （宝酒造社製品）で完全分解
し、アガロース電気泳動にかけ大きい断片を回収後、ア
ルカリホスファクーゼ（宝酒造社製品）処理して得られ
る断片とを連結し得られた組換え体ＤＮＡを大腸菌（Ｆ
２．ｃｏｌｉ Ｃ６００ｒｋ−ｍｋ−）に形質転換した
。こうして得られたアンピシリン耐性形質転換株につい
て以下のようにアミラーゼ活性発現の検出を行った。ア
ンピシリン５０ｐｇ／祿を含むＬ−ブロス寒天プレート
上に滅菌したろ紙をのせ、これにアンピシリン耐性形質
転換株をレプリカし、−晩培逐後溶菌酵素含有緩ｉｈ液
（５０ｍＭト’Ｊスー塩酸緩衝液（ｐｌ＋７．５）、０
．１％トリトンＸ −１００及び２ ｍｇ ／ ｍ、ｅ
リプチームからなる。〕をろ紙にしみ込ませ３７°Ｃ１
１時間静置後、可溶性殿粉含有プレート（０，２％可溶
性澱粉、クロラムフェニコール１１００Ｉｔ ／ −及
び４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０） ］に溶菌させ
、コロニーが下になるようにしてろ紙にのせ、これを６
０°Ｃで一晩反応させＩ２蒸気で染色したところ、ヨー
ド澱粉反応によるハローを形成する菌株がとれた。この
菌株をアンピシリン５ｈｇ ／ ｍを含むし一ブロス（
１％ハクトドリプトン、 ０．５％酵母エキス、０．５
％食塩、０．１％グルコースを含みｐｌ＋７．３に調整
したもの。）に植菌後、−晩培養し、集菌後１０ｍＭ
）リス−塩酸緩衝液（ｐｔ！７．３）で洗浄し、１．５
ｍｊの１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，３）に懸
濁後超音波処理し、遠心した試料につきアミラーゼ活性
測定（８５℃、３０分）を行い形質転換されていること
を確認した。この形質転換株からプラスミドを常法によ
り鋼製した復旧ｎｄＩＩ［で切断すると２．５５Ｋｂ、
１．９０Ｋｂ、０．７５Ｋｂの３断片が生じ計５．３Ｋ
ｂが挿入されていることがわかった。
このプラスミドをｐＤＴ６２２と命名（第４図に示され
る。）した。ｐＤＴ６２２を１ＩｉｎｄＩ［Ｉで切断後
アガロースゲル電気泳動にかけ、ヘクターに挿入されて
いる３断片を回収し、これをニックトランスレーション
（了マシャム社製キット）により〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴ
Ｐでラヘルしサザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ ｔｌｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行ったと
ころプラスミドｐＹＥＪ００１に挿入されたＤＮＡ断片
は確かにジクチオグロマス・サーモフィラムＨ−６−１
２ＦＥＲＭ−ＰＮ［Ｌ ７１１４の染色体ＤＮＡに由来
することが示された。
る。）した。ｐＤＴ６２２を１ＩｉｎｄＩ［Ｉで切断後
アガロースゲル電気泳動にかけ、ヘクターに挿入されて
いる３断片を回収し、これをニックトランスレーション
（了マシャム社製キット）により〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴ
Ｐでラヘルしサザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ ｔｌｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行ったと
ころプラスミドｐＹＥＪ００１に挿入されたＤＮＡ断片
は確かにジクチオグロマス・サーモフィラムＨ−６−１
２ＦＥＲＭ−ＰＮ［Ｌ ７１１４の染色体ＤＮＡに由来
することが示された。
次にｐＤＴ６２２を制限酵素５ｐｈＩ にューイングラ
ンドハイオラボ社製品）で切断し、３．８Ｋｂ断片を回
収し、このＳｐｈ ｒ断片を合成コンセンサスフロモー
ターのできるだけ直下につなくために、ｐＹＥＪＯＯｌ
をｌ１ｉｎｄｌＩＩで切断し、大きい方の断片を回収、
再連結し、Ｓｐｈ ｒで切断したものへ連結した。こう
して得られた組換え体ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ Ｃ６００
に形質転換した形質転換株も前記と同様にアミラーゼ活
性測定（８５℃、３０分）したところ酵素活性が認めら
れた。調整されたプラスミドを本発明者らはｐＤＴ８０
１（第５図に示される。）と命名した。ｐＤＴ８０１を
制限酵素ＥｃｏＲＶにて３箇所切断して得られる断片の
うち、大きい断片Ａ、Ｂを回収したのち再連結しこれを
用いてＥ、ｃｏｌｉ Ｃ６００を形質転換したところ、
得られた形質転換株は、ｐＤＴ６２ＭＤＴ８０１保持菌
株と同様にα−アミラーゼ活性（８５℃、３０分反応）
を有していることが認められた。調製されたプラスミド
を本発明者らはｐＤＴ９０１と命名した。ｐＤＴ９０１
及びｐＤＴ９０１に組み込まれたＤＮＡのいくつかの制
限酵素切断部位は第６図に示されている。
ンドハイオラボ社製品）で切断し、３．８Ｋｂ断片を回
収し、このＳｐｈ ｒ断片を合成コンセンサスフロモー
ターのできるだけ直下につなくために、ｐＹＥＪＯＯｌ
をｌ１ｉｎｄｌＩＩで切断し、大きい方の断片を回収、
再連結し、Ｓｐｈ ｒで切断したものへ連結した。こう
して得られた組換え体ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ Ｃ６００
に形質転換した形質転換株も前記と同様にアミラーゼ活
性測定（８５℃、３０分）したところ酵素活性が認めら
れた。調整されたプラスミドを本発明者らはｐＤＴ８０
１（第５図に示される。）と命名した。ｐＤＴ８０１を
制限酵素ＥｃｏＲＶにて３箇所切断して得られる断片の
うち、大きい断片Ａ、Ｂを回収したのち再連結しこれを
用いてＥ、ｃｏｌｉ Ｃ６００を形質転換したところ、
得られた形質転換株は、ｐＤＴ６２ＭＤＴ８０１保持菌
株と同様にα−アミラーゼ活性（８５℃、３０分反応）
を有していることが認められた。調製されたプラスミド
を本発明者らはｐＤＴ９０１と命名した。ｐＤＴ９０１
及びｐＤＴ９０１に組み込まれたＤＮＡのいくつかの制
限酵素切断部位は第６図に示されている。
実施例２ 大腸菌での耐熱性α−アミラーゼ裂造法
実施例１に準じて調製されたプラスミドｐＤＴ９０１を
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｃ６００に形質転換し、得られた形質転
換株ＩＥ、ｃｏｌｉ Ｃ６００ｒｋ−ｍｋ−（ｐＤＴ９
０１） ＦＥＲＭ−Ｐｔ’ｈ８２８０をアンピシリン５
０１ｊｇ ／ ｍｅを含むＬ−ブロス培地１０ｍ１’に
植菌後−晩３７°Ｃで培養後、集菌し、培養上澄を菌体
外画分とし、菌体を１０ｍＭＭＪスー塩酸緩衝液（ｐＨ
７，３）で洗浄し１．５ｍｅの１０ｍＭ ）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，３）に懸濁後、超音波処理し遠心分離
して菌体破片を除いた上澄を菌体内画分としてそれぞれ
のアミラーゼ活性を測定したところ菌体内画分にのみα
−アミラーゼ活性が認められ、その活性は２３．６ｕ／
ｄであった。
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｃ６００に形質転換し、得られた形質転
換株ＩＥ、ｃｏｌｉ Ｃ６００ｒｋ−ｍｋ−（ｐＤＴ９
０１） ＦＥＲＭ−Ｐｔ’ｈ８２８０をアンピシリン５
０１ｊｇ ／ ｍｅを含むＬ−ブロス培地１０ｍ１’に
植菌後−晩３７°Ｃで培養後、集菌し、培養上澄を菌体
外画分とし、菌体を１０ｍＭＭＪスー塩酸緩衝液（ｐＨ
７，３）で洗浄し１．５ｍｅの１０ｍＭ ）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，３）に懸濁後、超音波処理し遠心分離
して菌体破片を除いた上澄を菌体内画分としてそれぞれ
のアミラーゼ活性を測定したところ菌体内画分にのみα
−アミラーゼ活性が認められ、その活性は２３．６ｕ／
ｄであった。
Ｌ−ブロス培地（ｐＨ７，３） ニ
ドリプトン（Ｄｉｆｃｏ社ｍ） １．０％酵母エキス（
Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％塩化すトリウム
０．５％ グルコース ０．１％ 発明の効果 本発明は、高度好熱性絶対嫌気性菌ジクチオグロマスー
サーモフイラムＨ−６−１２ＦＩＥＲ？ｌ−Ｐ嵐７１１
４の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を大腸菌に形質転換可
能ならしめたものであり、これによって、これまで嫌気
的条件でかつ高温で生産していた耐熱性α−アミラーゼ
を好気的条件下でしかも常温培養によって製造すること
が可能となった。
Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％塩化すトリウム
０．５％ グルコース ０．１％ 発明の効果 本発明は、高度好熱性絶対嫌気性菌ジクチオグロマスー
サーモフイラムＨ−６−１２ＦＩＥＲ？ｌ−Ｐ嵐７１１
４の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を大腸菌に形質転換可
能ならしめたものであり、これによって、これまで嫌気
的条件でかつ高温で生産していた耐熱性α−アミラーゼ
を好気的条件下でしかも常温培養によって製造すること
が可能となった。
第１図、第２図及び第３図は本発明の遺伝子組換えによ
って大腸菌より製造された耐熱性α−アミラーゼの主通
ｐＨ１至適温度及び温度安定曲線を示すものであり、第
４図及び第５図はプラスミドｐＹＥＪ００１に耐熱性ア
ミラーゼ遺伝子を連結して得られるプラスミドｐＤＴ６
２２、及びｐＤＴ８０１の各種制限酵素による切断地図
をそれぞれ示すものである。 第６図は、プラスミドｐＤＴ９０１及びプラスミドｐＤ
Ｔ９０１に組み込まれた耐熱性α−アミラーゼ遺伝子の
各種制限酵素による切断地図を示すものである。又、ｐ
ＤＴ９０１に組み込まれた耐熱性α−アミラーゼ遺伝子
を含む２．６Ｋｂ Ｄ Ｎ Ａ断片は反復して挿入され
ている。図中太線はジクチオグロマス・サーモフィラム
由来のＤＮＡであることを示す。
って大腸菌より製造された耐熱性α−アミラーゼの主通
ｐＨ１至適温度及び温度安定曲線を示すものであり、第
４図及び第５図はプラスミドｐＹＥＪ００１に耐熱性ア
ミラーゼ遺伝子を連結して得られるプラスミドｐＤＴ６
２２、及びｐＤＴ８０１の各種制限酵素による切断地図
をそれぞれ示すものである。 第６図は、プラスミドｐＤＴ９０１及びプラスミドｐＤ
Ｔ９０１に組み込まれた耐熱性α−アミラーゼ遺伝子の
各種制限酵素による切断地図を示すものである。又、ｐ
ＤＴ９０１に組み込まれた耐熱性α−アミラーゼ遺伝子
を含む２．６Ｋｂ Ｄ Ｎ Ａ断片は反復して挿入され
ている。図中太線はジクチオグロマス・サーモフィラム
由来のＤＮＡであることを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ジクチオグロマス・サーモフィラムの耐熱性α−ア
ミラーゼ遺伝子を組み入れたプラスミドを宿主細菌に挿
入することにより形質転換された菌株を培養後、培養菌
体を集菌し、該菌体より耐熱性α−アミラーゼを採取す
ることを特徴とする耐熱性α−アミラーゼの製造法。 ２ ジクチオグロマス・サーモフィラムの耐熱性α−ア
ミラーゼ遺伝子が制限酵素ＨｉｎｄIII認識部位を２箇
所、制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位を１箇所、制限酵素Ｒ
ｓａ I 認識部位を１箇所、制限酵素Ａｃｃ I 認識部位
を１箇所及び制限酵素ＢｇｌII認識部位を１箇所有する
遺伝子であるところの特許請求の範囲第１項記載の耐熱
性α−アミラーゼの製造法。 ３ プラスミドが合成コンセンサスプロモーターベクタ
ーｐＹＥＪ００１である特許請求の範囲第１項記載の耐
熱性α−アミラーゼの製造法。 ４ 宿主細菌が大腸菌である特許請求の範囲第１項記載
の耐熱性α−アミラーゼの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60-121536 | 1985-06-06 | ||
| JP12153685 | 1985-06-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6291181A true JPS6291181A (ja) | 1987-04-25 |
Family
ID=14813673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27340185A Pending JPS6291181A (ja) | 1985-06-06 | 1985-12-06 | 耐熱性α−アミラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6291181A (ja) |
-
1985
- 1985-12-06 JP JP27340185A patent/JPS6291181A/ja active Pending
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