JPS635076B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はアミラーゼ遺伝子に関する。詳しく
は、バチルス サーキユランス由来のアミラーゼ
遺伝子に関する。

発明の構成 本発明者等は、遺伝子組換え技術を用いて微生
物に有用物質を生産させるための新しいベクター
の探索・開発を意図して研究を行い、さきにバチ
ルス サーキユランス由来のアミラーゼ遺伝子を
含む新しい複合プラスミドを開発したが、更に引
続き研究の結果、該アミラーゼ遺伝子の構造を確
認し、本発明を達成した。即ち、本発明の要旨
は、第１図におけるDNA塩基配列877−3326とし
て示されるアミラーゼ遺伝子に存する。

本発明を以下詳細に説明する。第１図−１〜７
は、後述する本発明のアミラーゼ遺伝子を含む複
合プラスミドpTN603の特定の制限酵素による
DNA断片の塩基配列を示す。アミラーゼ遺伝子
は第１図における塩基配列中877−3326に該当す
るDNA断片中にある。即ち、第１図の塩基配列
には、1207−1209（ATG、開始信号）で始まり
2791−2793（TGA）に終る1587の塩基対からなる
オープンリーデイングフレーム（これらは528個
のアミノ酸からなるタンパク質をコードする）が
存在する。1207−1209以外にもATG（開始信号）
はいくつか見られるが、リボゾーム結合部位であ
るシヤイン−ダルガーノ（Shine−Dalgarno）配
列に類似した塩基配列が存在すること、またこの
アミラーゼ酵素は分泌酵素であるところからシグ
ナル・ペプチドを有するはずであり、シグナル・
ペプチドに多く含まれるはずの疎水性アミノ酸残
基の配列から1207〜−1209（ATG）がアミラーゼ
遺伝子の翻訳開始点と考えられる。また、1207の
上流の933−938（TTGACA）及び957−962
（TAAAAT）に、夫々プロモーター構造の‘−
35'領域及び‘−10'領域に対応する塩基配列が存
在している。

本発明のアミラーゼ遺伝子は例えばバチルス
サーキユランス（Bacillus circulans）F2株に由
来し、その染色体DNA上に存在する。

バチルス サーキユランスF2株は、アグリカ
ルチユラル アンド バオロジカル ケミストリ
ー（Agricultural and Biological Chemistry）
46巻、2107〜2115頁（1982年）に記載されてお
り、バチルス属のバチルス サーキユランスの一
菌株で次の菌学的性質を有する。

形態：長さ2.5μｍ×巾0.5μｍ、グラム陽性、胞子
形成能あり、側鞭毛あり。

生育温度：37℃で良好に生育し、65℃では生育せ
ず。

食塩濃度：0.5％で生育し、５％以上では生育せ
ず。

生化学的性質：カタラーゼ反応陽性、好気性、硝
酸還元能なし、インドール生産なし。

ニユートリエント・ブロスと酵母エキスとグルコ
ース 培地での生育：それぞれ0.8％、0.5％、１％で良
好に生育。

このバチルス サーキユランスF2株の染色体
DNAが生産するアミラーゼは、Agricultural
and Biological Chemistry、47巻、３号、518頁
の記載によれば、Aerobacter aerogenesのエキ
ソマルトヘキサオハイドロラーゼ（酵素番号
EC3.2.1.98）と近い性質を有するが、マルトヘキ
サオースの分解活性がより強いとされている。

バチルス サーキユランスF2株の染色体DNA
上のアミラーゼ遺伝子をクローニングする方法に
ついて説明するに、まず、バチルス サーキユラ
ンスF2株を培養、集菌し、常法により処理して
染色体DNA標品を採取する。染色体DNAを
Sau3Alで部分切断し、一方、第２図に示し、後
記実施例の方法で調製したプラスミドpLS330−
４をBglで切断し、両者を混合してT4DNAリ
ガーゼで連結する。

上記に得た複合プラスミドからアミラーゼ遺伝
子を含む複合プラスミドを選択、採取するため
に、これを形質転換法により、予めpLS310△６
を導入したバチルス サテイリス（Bacillus
subtilis）MO7−２−31（aro I906 metB amyR₂
amyEO7）株（TN106株という）に導入してア
ミラーゼ活性を示す形質転換株（TN501株とい
う）をスクリーニングする。なお、上記バチルス
サテイリスMO7−２−31株は、ジヤーナル
オブ バクテリオロジー（Journal of
Bacteriology）136巻、818〜821頁（1978年）に
記載されている。TN501株を培養し、アミラー
ゼ活性を示す単一コロニーを分離して複合プラス
ミドを採取し、これをバチルス サテイリス
MO7−２−31株に導入して、アミラーゼ生産性
の形質転換株バチルス サテイリスTN603株
（微工研究寄第7660号、以下TN603株という）を
得る。ついで、TN603株からアミラーゼ遺伝子
を含む複合プラスミド（pTN603という）を単離
する。

以上のようにして得られた複合プラスミド
pTN603の分子量は、アガロースゲル電気泳動分
析により測定した結果、約6.8メガダルトン
（10.4kb）であり、そのうち、アミラーゼ遺伝子
を含むDNA断片の分子量は2.3メガダルトン
（3.5kb）であつた。pTN603の制限酵素地図を第
３図に示す。第３図において、太線で示した部分
（Bglによる切断部位からSau3Alによる切断部
位までの部分）はアミラーゼ遺伝子を含むDNA
部分であり、その制限酵素地図を第４図に示す。

上記pTN603のBglによる切断部位から
Sau3Alによる切断部位までのDNA断片の塩基配
列をマキサム−ギルバート（Maxam−Gilbert）
法により決定した。その結果を第１図−１〜７に
示す。第１図における塩基配列877−3326として
示されるヌクレオチドが本発明のアミラーゼ遺伝
子を含んでいる。

発明の効果 上述の本発明のアミラーゼ遺伝子を含む
pTN603は、バチルス サーキユランスのアミラ
ーゼを枯草菌中で生産させることができ、枯草菌
における分泌ベクターとしての用途が期待され
る。

実施例 以下実施例について説明するが、本発明は以下
の実施例に限られるものではない。

実施例 １ (1) バチルス サーキユランスF2株DNAの採取
バチルス サーキユランスF2株を、メソツズ
イン エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）65巻、348〜350頁（1979年）に
記載の方法に従つて、37℃で一夜間培養後、集
菌し、TES緩衝液〔20ｍＭのトリス塩酸（PH
8.0）、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）および20ｍＭの塩化ナトリウムから
なる〕で２回洗滌後、同緩衝液に懸濁する。つ
いで、リゾチーム処理、リボヌクレアーゼ処
理、プロナーゼおよび界面活性剤処理を行なつ
て溶菌してDNAを抽出し、フエノールによる
除蛋白処理を３回行なつた後、DNAをエタノ
ールで沈澱させ、これを再びTES緩衝液に懸
濁し、同緩衝液に対し４℃で４時間透析を行つ
て染色体DNA標品を得た。

(2) 染色体DNAのpLS330−４への挿入（複合プ
ラスミドの調製） 前記(1)で得た染色体DNA20μｇを、1.5単位
のSau3Alを用いて37℃で30分間反応させた。
一方、第１図に示す後記(8)の方法により調製し
たプラスミドpLS330−４（4.5Md、6.9kb）3μ
ｇを５単位の制限酵素Bglを用い37℃で１時
間反応させた。Sau3Alで切断した染色体DNA
標品2.4μｇを、Bglで切断したpLS330−４の
3μｇと混合し、T4DNAリガーゼ0.5単位を用
い８℃で48時間反応させて連結した。

(3) TN106株（pLS310△６を含むバチルス サ
テイリスMO7−２−31株）の調製 バチルス サテイリスMO7−２−31株をペ
ンアツセイ ブロス培地中で一夜間培養後、そ
の0.1mlを、必要な栄養を補足した５mlのＣ
培地（1.4％のリン酸二カリ、0.6％のリン酸一
カリ、0.2％の硫安、0.1％のクエン酸ナトリウ
ム、５ｍＭの硫酸マグネシウム、0.5％のグル
コース、0.02％のカザミノ酸を含む）に加え、
37℃で振盪培養する。定常期に入る直前（４〜
５時間後）に集菌し、10mlのＣ培地（カザミ
ノ酸の濃度が0.01％、補給アミノ酸の濃度が1/
１０である以外はＣ培地と同じ組成）に移し、
37℃で１時間培養する。この培養液0.9mlに、
後述する(8)の方法で調製したpLS310△６の溶
液0.1ml（1.75μｇDNA）を加え37℃で１時間
保持後、遠心分離により集菌し、１mlのペンア
ツセイブロス培地に懸濁し、37℃で２時間培養
する。このものをカナマイシン（5μｇ／ml）
を含むペンアツセイブロス培地に塗布し、37℃
で１夜間培養し、生じたコロニーを単離し、
TN106株（pLS310△６を含むバチルス サテ
イリスMO−７−２−31株）を得た。

(4) TN106株への複合プラスミドの導入
（TN501株の調製） 前記(2)で調製した複合プラスミドを、通常の
形質転換法によつて前記(3)のTN106株へ導入
した。即ち、複合プラスミド溶液0.1ml（1.5μ
ｇDNA）に、コンピテントなTN106懸濁液0.9
mlを混合し、37℃で１時間保持した後、集菌
し、ペンアツセイブロスで１回洗滌後、２mlの
ペンアツセイブロス培地に懸濁し、37℃で２時
間保持した。ついでこれをエリスロマイシン
（20μｇ／ml）を含むニユートリエントブロス
澱粉培地に塗布し、37℃で一夜培養した。生じ
たコロニーにヨード液（0.02％のヨードを含む
0.2％ヨウ化カリ溶液）を噴霧し、アミラーゼ
活性を検定した結果、アミラーゼ活性を示す形
質転換株一株を得て、これをTN501株と名付
けた。

(5) アミラーゼ遺伝子を含む複合プラスミドの分
離 前記(4)で得たTN501株をエリスロマイシン
を含むニユートリエントブロス澱粉培地に塗布
し、単一コロニーを分離した。アミラーゼ活性
を持つコロニーを選び、エリスロマイシンを含
むペンアツセイブロス培地に植菌し、37℃で一
夜間培養し、集菌し、複合プラスミド単離の材
料とした。

複合プラスミドの単離は、アドバンスド バ
クテリアル ジエネテイクス（Advanced
Bacterial Genetics）120〜121頁（コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory）刊行）に記載さ
れた方法に準じて行なつた。即ち、菌体を、15
％蔗糖を含む50ｍＭのトリス塩酸および50ｍＭ
のEDTAに懸濁し、リゾチーム処理および界
面活性剤処理を行う。ついで、5Mの酢酸カリ
ウムを最終濃度0.5Mとなるように加え、０℃
で１時間保持後、遠心分離により上清を分取
し、フエノール抽出、エタノール沈澱処理し、
沈澱を10μｇ／mlのリボヌクレアーゼを含む10
ｍＭのトリス塩酸および１ｍＭのEDTAに溶
解して複合プラスミド溶液を得た。

(6) アミラーゼ遺伝子を含む複合プラスミド
（pTN603）の精製 上記複合プラスミドを、前記(3)のバチルス
サテイリスMO7−２−31株中に、プロトプラ
スト形質転換法〔モレキユラー アンド ジエ
ネラル ジエネテイクス（Molecular and
General Genetics）168巻、111〜115頁（1979
年）に記載の方法〕により導入した。即ち、中
期対数増殖期にあるバチルス サテイリス
MO7−２−31株（クレツト値70〜80）細胞を
集め、1/10容のSMMP緩衝液〔0.5Mの蔗糖、
0.02Mのマレイン酸、0.02Mの塩化マグネシウ
ム（PH6.5）を含むペンアツセイブロス〕に懸
濁し、200μｇ／mlのリゾチームを加え、３℃
で２時間保持する。生じたプロトプラストを、
3000r.p.m、15分間の遠心分離により集め、
SMMP緩衝液で洗滌後、等容量の同緩衝液に
懸濁する。その250μに、前記(5)で得た複合
プラスミドを含むSMMP緩衝液50μを加え、
引続き1.5mlの40％ポリエチレングリコール
＃6000を含むSMM緩衝液（SMMPからペンア
ツセイブロスを除いたもの）を加え２分間混合
する。ついで５mlのSMMP緩衝液を加え、混
合、遠心して集菌し、１mlのSMMP緩衝液に
懸濁して30℃で２時間培養する。

培養液の0.1mlを、エリスロマイシン（20μ
ｇ／ml）を含むDM3澱粉培地〔0.8％の寒天、
0.5Mのコハク酸ナトリウム（PH7.3）、0.5％の
カザミノ酸、0.5％の酵母エキス、0.35％のリ
ン酸二カリ、0.15％のリン酸一カリ、0.01％の
ブドウ糖、１％の澱粉、20ｍＭの塩化マグネシ
ウムおよび0.01％の牛血清アルブミンを含む〕
に塗布し、37℃で培養する。生じたコロニーに
ヨード液を噴霧し、アミラーゼ活性を示す形質
転換株（TN603株）を得た。TN603株はエリ
スロマイシン耐性、カナマイシン感受性を示し
た。

TN603株から、前記(5)の方法により複合プ
ラスミドpTN603を単離した。これを再びプロ
トプラスト形質転換法によりバチルスサテイリ
スMO7−２−31株中に導入し、アミラーゼ活
性を示す形質転換株を検定した。このプラスミ
ドの分子量をアガロースゲル電気泳動で測定し
た結果6.8メガダルトン（10.4kb）であり、そ
のうち、アミラーゼ遺伝子を含むDNA断片の
分子量は2.3メガダルトン（3.5kb）であつた。
pTN603の制限酵素地図を第３図に示す。第４
図は、第３図におけるBglによる切断部位か
らSau3Alによる切断部位までのDNA部分（太
線で表示）、即ち、アミラーゼ遺伝子を含む
DNA断片の制限酵素地図である。第４図に示
すように、アミラーゼ遺伝子を含むDNA断片
はHpaによる切断部位が１個所、EcoR、
Dde、及びClaによる切断部位が各２個所、
SalとHindによる切断部位が各３個所存在
した。

上記pTN603のBglによる切断部位から
Sau3Alによる切断部位までのDNA断片の塩基
配列をマキサム−ギルバート法により決定し
た。その結果を第１図−１〜７に示した。

前記(2)に記載したpLS330−４はつぎの方法
で調製した。

(7) pLS330−４の調製 (イ) pLS310−２の調製 1μｇのpBR322および1μｇのpUB110を、
それぞれEcoRを用いて37℃で30分間処理
して切断し、両者を混合してT4DNAリカー
ゼを用い、８℃で48時間処理して連結した。
得られた複合プラスミドを前記(5)の方法によ
り単離し、通常の形質転換法により、イー・
コリC600株中に導入した。即ち、単離した
複合プラスミドを0.1Mのトリス塩酸に懸濁
し、その0.1mlを、０℃に保持したイー・コ
リC600株の塩化カルシウム懸濁液0.1mlと混
合して10分間保持し、ついで37℃で２分間処
理した後、１mlのLB培地を加え、37℃で20
分間培養する。形質転換株から、アンピシリ
ン耐性（Ap^r）、カナマイシン耐性（Km^r）
株を選択した。連結方法の相違による２種の
プラスミドpLS310−１およびpLS310−２の
うち、pLS310−２（5.8Md）を、形質転換株
から、前記(5)の方法に準じて採取した。

(ロ) pLS310△６の調製 バチルス サテイリス（Bacillus
subtilis）MI112株〔モレキユラー アンド
ゼネラル ゼネテイクス（Molecular and
General Genetics）165巻、269〜276頁
（1978年）〕の染色体DNAを前記(1)の方法に
準じて採取し、Hindで切断した断片
（1.4Md）を、上記(イ)のpLS310−２のHind
による断片とT4DNAリガーゼを用いて連結
し、得られた複合プラスミドをイー・コリ
C600株に導入し、形質転換株から複合プラ
スミドを単離して、これを前記バチルス サ
テイリスMI112株に導入し、形質転換株から
テトラサイクリン耐性遺伝子およびpLS310
−２断片領域に欠失部をもつ、プラスミド
pLS310△６（5.4kb、3.5Md）を採取した。

(ハ) pLS330−４の調製 スタフイロコツカス アウレウス
（Staphylococcus aureus）のプラスミド
pE194（3.7kb、2.4Md）〔プラスミド
（Plasmid）１巻、468〜479頁（1978年）；
Plasmid4巻、256〜260頁（1980頁）〕を、
Sau3Alで部分切断し、また上記pLS310△６
をBamHIで切断し、両者を混合し、
T4DNAリガーゼで連結した。得られた複合
プラスミドを前記(ロ)と同様にしてイー・コリ
C600株中に導入し、アンピシリン耐性、エ
リスロマイシン耐性株を選択し、複合プラス
ミドを採取して第２図に示すpLS330−４
（6.9kb、4.5Md）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図−１〜７はプラスミドpTN603のBgl
による切断部位からSau3Alによる切断部位まで
のDNA断片の塩基配列を示し、第２図はプラス
ミドpLS330−４の構成ルートを示す模式図、第
３図はプラスミドpTN603の制限酵素地図、第４
図はアミラーゼ遺伝子を含むDNA部分の制限酵
素地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次のDNA塩基配列で示されるアミラーゼ遺
   伝子。 【表】 【表】 【表】