JPH0571227B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の目的） 産業上の利用分野 本発明はバシルス・ステアロサーモフイラスの
耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む新規組
換えプラスミドPHG5およびpHG5を保持する枯草
菌に関する。 β−ガラクトシダーゼは乳糖をガラクトースと
グルコースに加水分解する酵素で、低乳糖牛乳の
製造に用いられたり、チーズ製造の際副産物とし
て大量に生成する乳清（Whey）中の乳糖からガ
ラクトース又はグルコースを製造するために用い
られる等食品加工に広く利用されている。 食品加工に利用する酵素は加工中の微生物汚染
を防ぐ観点から高温使用に耐え得るものが望まし
い。 又、この酵素は乳糖不耐症を治療するための医
薬品としても利用されており、この場合でも耐熱
性の優れている方が製剤の安定性の点で好まし
い。 本発明は、これらの要望に答えるため、耐熱性
の優れたβ−ガラクトシダーゼを工業的有利に製
造する方法を確立することを目的とするものであ
る。 従来の技術及び問題点 好熱性のバシルス（Bacillus）属細菌が耐熱性
β−ガラクトシダーゼを産生すること、及びその
微生物菌体を固定化して牛乳処理を行い低乳糖牛
乳を得ることは、例えば次の，及びの文献
に記載されている。 アール・イー・グツドマン等；カナデイアン
ジヤーナル オブ ミクロバイオロジー22巻、
817−825頁（1976年）〔R.E.Goodman，et
al；Canadian Journal of Microbiology，２，
817−825（1976）〕 エム・ダブリユー・グリフイツス，等；ジヤ
ーナル オブ ザ サイエンス オブ フツド
アンド アグリカルチヤー，29巻，753−761
頁（1978年）〔M.W.Griffiths，et al；Journal
of the Science of Food and Agriculture，
29，753−761（1978）〕及び特開昭54−163889号
公報 テイー・コバヤシ，等；ジヤーナル オブ
フアーメンテーシヨン テクノロジイー，56
巻，309−314頁（1978）〔T.Kobayashi，et
al；Journal of Fermentation Technology，
56，309−314（1978）〕 しかしながら、これらの従来法では酵素の生産
性が低く、酵素自体の基質（乳糖）に対する親和
力が小さく、耐熱性も充分でない等の問題があつ
た。 本発明者等は、先きに、遺伝子組換技術を利用
して、バシルス・ステアロサーモフイラス
IAMll001の耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子
をベクターを介して大腸菌に導入することに成功
し、この遺伝子組換え大腸菌〔エシエリヒア・コ
リ 294−43（PHG2）、微工研菌寄第7233号〕の培
養による耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造法を
完成し、特許出願した。（特願昭58−171077号）。 この方法によれば、耐熱性の非常に優れたβ−
ガラクトシダーゼを取得出来、しかもこの方法に
よる酵素は単純な加熱処理で高度に精製されるこ
とから、工業生産に於ける精製工程の簡略化を可
能にしたが、酵素の生産量がやや低い欠点があつ
た。 （発明の構成） 本発明者は、バシルス・ステアロサーモフイラ
スIAM11001の耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝
子を含むDNA断片をベクタープラスミドに組込
んだ新規組換えプラスミドPHG5を調製すること
に成功し、さらにPHG5を保持する新規かつ有用
な枯草菌バシルス・ズブチリスMI111（PHG5）を
得ることに成功し、本発明を完成するに至つた。
従つて、本発明は、次の各発明を包含している。 (1) バシルス・ステアロサーモフイラスの耐熱性
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む2.9kbの
EcoRI断片を枯草菌用ベクタープラスミド
pUB110のEcoRI部位に組込んだ第１図の制限
酵素地図を有する新規組換えプラスミドPHG5。 (2) 組換えプラスミドPHG5を保持する新規な枯
草菌。 本発明を実施するにあたり、耐熱性β−ガラク
トシダーゼの遺伝子を含むDNA（以下、染色体
DNAと称する）のバシルス・ステアロサーモフ
イラスからの単離精製は常法に従つて行うことが
できる。例えば、ビオキム・ビオフイズ・アク
タ、72巻、619−629頁（1963年）〔Biochim.
Biophys.Acta.72，619−629頁（1963）〕に記載
のフエノール法により行うことができる。 この染色体DNAのベクターDNAへの組込みは
染色体DNAおよびベクターDNAを制限酵素で切
断して染色体DNA断片およびベクターDNA断片
を調製したのち、両者の混合物をDNAリガーゼ
で処理することにより行うことができる。ここで
用いられるベクターDNAとしては、枯草菌で複
製できるベクタープラスミド例えばpUB110，
pE194，pC194，pBD9，pTP4等があげられる。 また、制限酵素としてはBamHI，BgI，
EcoRI，Pst，MIu，SaI，Xho等があげ
られる。 さらに、DNAリガーゼとしてはT4フアージ由
来のDNAリガーゼが好適に用いられる。 上記方法で得られた組換えプラスミドの枯草菌
への導入はプロトプラスト形質転換法、モノクユ
ラー アンド ジエネラル ゲネテイクス、168
巻、111−115頁（1979年）〔Molecular and
General Genetics，168，111−115（1979）〕によ
り行うことが出来る。 組換えプラスミド（すなわち、耐熱性β−ガラ
クトシダーゼの遺伝子を含むDNA断片を組込ん
だベクタープラスミド）を有する菌株の選択方法
は、当該組換えプラスミドを調製するのに際して
使用した制限酵素やベクタープラスミドの種類に
よつても異なるが、例えば、制限酵素として
EocRIを用い、ベクタープラスミドとして
pUB110を用いた場合には、次のようにして行う
ことができる。すなわち菌株を５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（以下Xgalという）とカナマイシンを含
むDM3を寒天培地に培養し、青色を呈するコロ
ニーを選択し、最終的にはβ−ガラクトシダーゼ
活性の有無を確認する。 次いで、上記方法で得られた組換えプラスミド
含有菌株より組換えプラスミドを単離する。組換
えプラスミドの単離は常法に従つて行うことがで
きる。例えば、ヌクレイツク アシツド リサー
チ、７巻，1513−1523頁（1979年）〔Nucleic
Acids Research，７，1513−1523（1979）〕に記
載のアルカリ抽出法により行うことができる。こ
の様にして得られた組換えプラスミドを枯草菌に
導入すれば、組換えプラスミドを保持する枯草菌
を調製することができる。組換えプラスミドを保
持する枯草菌はカナマイシンとXgalを含むDM3
寒天培地に出現する青色コロニーとして取得する
ことができる。 なおDM3寒天培地は次の８溶液を混合して調
製する。 １ ４％寒天 200ml ２ 1Mコハク酸ナトリウム（PH7.3） 500ml ３ ５％カザミノ酸 100ml ４ 10％酵母エキス 50ml ５ 3.5％リン酸２カリウム＋1.5％リン酸１カリ
ウム 100ml ６ 20％グルコース 25ml ７ 1MMgCl₂ 20ml ８ ２％牛血清アルブミン ５ml 以上のようにして得られた新規組換えプラスミ
ドを保持する枯草菌は、その代表菌株としてバシ
ルス・ズブチリスMI111（PHG5）が工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研条寄第911号
（FERM BP−911）として寄託されている。 本発明の枯草菌による耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼの製造は、上記のようにして得られた新規な
遺伝子組換え枯草菌を常法により培養し、集菌し
たのち、常法により菌体を破砕し、無細胞抽出液
をとることにより行われる。かくして得られた耐
熱性β−ガラクトシダーゼの精製は、熱処理およ
び通常のタンパク質の精製法、例えばイオン交換
クロマトグラフイー、ゲル濾過等の方法により行
われるが、特に熱処理が有効である。この熱処理
による精製法はバシルス・ステアロサーモフイラ
スやサーマス・サーモフイラスから耐熱性β−ガ
ラクトシダーゼを取得するための従来方法とは異
なり、新規かつ有効な方法である。 即ち、好熱菌の生産する蛋白質は全て熱安定性
が良いため、細胞抽出液を熱処理した場合、全蛋
白質が徐々に変性するのみで、特にβ−ガラクト
シダーゼのみが精製されることはない。 これに対し、常温菌の枯草菌に好熱菌の遺伝子
を組込んだ本発明の新規微生物が産生するβ−ガ
ラクトシダーゼは熱安定性の点で、元の枯草菌の
蛋白質とは大差があり、約70℃、15〜30分程度の
加熱処理で枯草菌の蛋白質は大部分変性して沈殿
となるが、β−ガラクトシダーゼはほとんど変性
せず熱処理液中に溶解している。 この熱処理液を遠心分離するだけで、上清に純
度の上昇したβ−ガラクトシダーゼが得られる。 この熱処理による簡便かつ効率の良いβ−ガラ
クトシダーゼの精製法は本発明の枯草菌を使用す
ることで初めて可能となつたものである。 次に本発明を詳細に説明するため実施例を示
す。なお、以下に示す実施例はDNA供与体とし
て、バシルス・ステアロサーモフイルス
IAM11001の耐熱性β−ガラクトシダーゼの遺伝
子を含むDNA断片を組込んだ組換えプラスミド
PHG2を保持する大腸菌、エシエリヒア・コリ294
−43（PHG2）、（微工研菌寄第7233号）を、ベクタ
ーDNAとしてpUB110を、宿主枯草菌としてバ
シルス・ズブチリスMI111、｛テイー・イマナカ
等；ジヤーナル オブ バクテリオロジー、146
巻、1091−1097頁（1981年）〔T.IMANAKA，et
al；Journal of Bacteriology，146，1091−1097
（1981）〕に記載の公知の枯草菌｝を、それぞれ利
用して行つた例である。 実施例１ 耐熱性β−ガラクトシダーゼの遺伝情
報を担うプラスミドDNAの調製と切断 エシエリヒア・コリ294−43（PHG2）をM9培地
（Na₂HPO₄5.8ｇ／，KH₂PO₄3ｇ／，NaCl5
ｇ／，NH₄Cl1ｇ／，CaCl₂11mg／，
MgSO₄95mg／，FeCl₃1.6mg／，カザミノ酸
５ｇ／，グルコース４ｇ／，）150ml中、37℃
で培養液の600nmの吸光度が0.6−1.0になるまで
培養後、200μｇ／mlのクロラムフエニコールを
添加して一夜培養を続けた。菌体を集洗菌後、２
mg／mlのリゾチームを含む25mM Tris−HCl（PH
8.0），50mMグルコース，10mM EDTA，15ml
に懸濁し、０℃で30分間放置後、0.2N NaOH，
１％SDS（ラウリル硫酸ナトリウム）30mlを加え
溶菌させ、０℃で５分間放置した。次いで3M酢
酸ナトリウム（PH4.8）22.5mlを加え、０℃で１
時間放置後、遠心分離（8000rpm，20分）して上
清を得た。上清に2.5倍量のエタノールを加え、
DNAを沈殿させた後、５mlの10mM Tris−HCl
（PH7.5）、1mM EDTA（以下TE緩衝液と称す）
に溶かした。このDNA溶液をエチジウムブロマ
イド−塩化セシウム平衡密度勾配遠心にかけ、PH
G2プラスミド500μｇを得た。プラスミドDNAを
ベクターDNAと耐熱性β−ガラクトシダーゼの
遺伝情報を担うバシルス・ステアロサーモフイル
スの染色体DNAとに分離するため5μｇのDNAに
対し、5UのPstを加え、20mM Tris−HCl（PH
7.5）、10mM MgCl₂，50mM（NH₄）₂SO₄，0.1
mg／ml牛血清アルブミンの反応液50μ中で37℃
にて３時間切断を行つた。65℃、10分間加熱して
Pstを失活させ、DNAをエタノール沈殿させた
後、20μのTE緩衝液にとかした。 実施例２ 耐熱性β−ガラクトシダーゼの遺伝子
を含むDNA断片末端のPst部位からEcoRI部
位への変換 実施例１で得た耐熱性β−ガラクトシダーゼの
遺伝情報を担うDNA断片をベクター
DNApUB110に連結するため、末端のPst部位
を下記の方法でEcoRI部位へ変換した。実施例１
で得たPst切断DNA5μｇを20mM Tris−HCl
（PH8.0），600mM NaCl、12mM CaCl₂，1mM
EDTAの反応液25μ中で、エキソヌクレアーゼ
BAL−31（New England Biolabs社製）0.2Uで
30℃、６分間反応させた。フエノール処理により
BAL−31を失活させ、エタノール沈殿後、26μ
のTE緩衝液にとかした。5′末端をT4−ポリヌク
レオチドキナーゼでリン酸化したEcoRIリンカー
（GGAATTCC）（宝酒造製）25pmolを加えて、
66mM Tris−HCl（PH7.5）、10mM−MgCl₂，
10mMジチオスレイトール、1mMATPの反応液
40μ中で1UのT4−DNAリガーゼにより、15
℃、16時間反応させた。65℃、20分間加熱し、
T4−DNAリガーゼを失活させた後、14μのTE
緩衝液と6μの1MNaClを加えた反応液60μ
中、50UのEcoRIで37℃、３時間反応させた。65
℃、20分間加熱し、EcoRIを失活させた後、エタ
ノール沈殿を行い、40μのTE緩衝液にとかし
た。 実施例３ ベクターDNAの調製と切断 カナマイシン耐性を有するpUB110プラスミド
のDNAを下記のようにして調製した。pUB110
をプラスミドとして持つ公知の枯草菌、バシル
ス・ズブチリスMI111をＬ培地（トリブトン１
％、酵母エキス0.5％、NaC0.5％、グルコース0.2
％、PH7.0）500ml中、37℃で培養液の600nmの吸
光度が２〜３になるまで振とう培養し、菌体を集
洗菌後、２mg／mlのリゾチームを含む25mM
Tris−HCl（PH80）、50mMグルコース、10mM
EDTA50mlに懸濁し、37℃で30分間放置する。
0.2N NaOH、１％SDS100mlを加え溶菌させ、
０℃で５分間放置した。次いで3M酢酸ナトリウ
ム（PH4.8）75mlを加え、０℃で１時間放置後、
遠心分離（8000rpm、20分）して上清を得た。上
清に2.5倍量のエタノールを加え、DNAを沈殿さ
せた後、５mlのTE緩衝液に溶かした。このDNA
溶液をエチジウムブロマイド・塩化セシウム平衡
密度勾配遠心にかけ、pUB110プラスミド
DNA50μｇを得た。ベクターDNAを切断するた
め、pUB110 1μgに対して5UのEcoRIを加え、
10mM Tris−HCl（PH7.5），100mM NaCl，
10mM MgCl₂の反応液75μ中で37℃、２時間反
応を行つた。65℃で10分間加熱し、DNAをエタ
ノール沈殿させた後、10μのTE緩衝液にとか
した。 実施例４ 耐熱性β−ガラクトシダーゼの遺伝子
を含むDNA断片のベクターDNAへの挿入 実施例２で得たDNAのEcoRI断片5μｇと実施
例３で得たベクターDNAのEcoRI断片1μｇを混
合し、66mM Tris−HCl（PH7.5），10mM
MgCl₂，10mMジチオスレイトール，1mMATP
の反応液50μ中で0.2UのT4−DNAリガーゼに
より４℃、16時間反応させた。65℃、10分間加熱
してT4−DNAリガーゼを失活させ、DNAをエ
タノール沈殿させた後、100μのTE緩衝液に溶
かし、DNA溶液とした。 実施例５ 組換えプラスミドによる枯草菌の形質
転換と、耐熱性β−ガラクトシダーゼ産生能を
有する枯草菌の選択分離 バシルス・ズブチリスMI111をPenassay
broth（肉エキス0.15％、酵母エキス0.15％、ペプ
トン0.5％、グルコース0.1％、NaCl0.3％、リン
酸２カリウム0.37％、リン酸１カリウム0.13％、
PH7.0）20ml中37℃で、570nmの吸光度が0.8−1.0
になるまで振とう培養し、集菌する。２mg／mlの
リゾチームを含むSMMP溶液（２倍濃度のSMM
溶液と４倍濃度のPenassay brothを等量混合し
た溶液）2.5mlに懸濁し、37℃で２時間、おだや
かに振とうしながらプロトプラストを調製する。
プロトプラストを遠心分離（4000rpm、15分）で
集めSMMP溶液で洗浄後、再度遠心分離し、２
mlのSMMP溶液に懸濁する。 なお、SMM溶液は0.5Mシヨ糖、20mMマレイ
ン酸（PH6.5）、20mM MgCl₂よりなる混合液で
ある。 実施例４で得たDNA溶液30μと２倍濃度の
SMM溶液30μの混合液に対し、このプロトプ
ラスト懸濁液0.5ml、および1.5mlの40％ポリエチ
レングルコール溶液（100ml中にポリエチレング
ルコース6000を40ｇ、２倍濃度のSMM溶液50ml
を含む）を加え、２分間放置後、５mlのSMMP
溶液を加え、プロトプラストを遠心分離で回収し
た。プロトプラストを１mlのSMMP溶液に懸濁
し、30℃で1.5時間振とう培養後、カナマイシン
（１mg／ml）及びXgal（40μｇ／ml）を含むDM3
再生用寒天培地に塗布した。37℃で２日間培養す
ると、β−ガラクトシダーゼ産生能を有する枯草
菌のコロニーは青色を呈する。 かくして得られた新規な枯草菌はバシルス・ズ
ブチリスMI111（PHG5）と名付け、工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託した。この寄託番号は
微工研条寄第911号である。 なお、この新規枯草菌、バシルス・ズブチリス
MI111（PHG5）の菌学的性質は、カナマイシン耐
性及び耐熱性β−ガラクトシダーゼ生産性を示す
以外は普通の枯草菌の性質とほぼ同一である。 実施例６ β−ガラクトシダーゼの製造及び耐熱
性試験 バシルス・ズブチリスMI111（PHG5）をカナマ
イシン5μｇ／mlを含むLL培地（トリブトン１％、
酵母エキス0.5％、NaCl0.5％、乳糖0.2％、PH7.0）
150ml中で、37℃、16時間振とう培養し、集菌後、
Ｚ緩衝液（0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0），10mM
KCl，1mM MgSO₄，50mM2−メルカプトエタ
ノール）３mlに懸濁する。超音波処理後、遠心分
離（15000rpm、15分）して得た上清を細胞抽出
液とした。 この細胞抽出液の70℃、30分間の熱処理前後の
β−ガラクトシダーゼ活性を、基質としてＯ−ニ
トロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以
下ONPGと称す）を用いて下記のようにして測
定した。 0.8mg／mlのONPGを含むＺ緩衝液２mlと酵素
液0.4mlを混合し、65℃で一定時間放置後、1M
Na₂CO₃1mlを加えて氷冷し、反応により生じた
Ｏ−ニトロフエノールの量を420nmの吸光度によ
り測定した。１分間に1μmolのＯ−ニトロフエノ
ールを遊離する酵素量を1Uとした。 比較のため、エシエリヒア・コリ294−43（PH
G2）をテトラサイクリン（5μｇ／ml）を含むLL
培地で培養し、上記と同様にして得た細胞抽出液
およびバシルス・ステアロサーモフイルス
IAM11001をLL培地で55℃で培養して得た細胞
抽出液を用い、同様に試験した。 その結果は第１表の通りである。 【表】 第１表から明らかなように、本発明及び比較１
のβ−ガラクトシダーゼは70℃、30分の加熱処理
後の活性残存率が90％及び81％であり、比較２の
場合の33％に比較し、著しく高い値を示し、耐熱
性が非常に優れていた。 加熱処理による各酵素の精製効果についてみれ
ば、本発明及び比較１の酵素は比活性が3.2倍及
び4.5倍向上したのに対し、比較３の場合は逆に
0.8倍に低下した。 各微生物の耐熱性酵素の生産性（加熱後の活性
（Ｕ／ml）〕についてみれば、本発明によれば比較
１の約29倍、又は比較２の20倍収率が向上した。 なお、加熱処理による本酵素の精製効果をさら
に詳しく調査するため、本発明微生物、バシル
ス・ズブチリスMI111（pHG5）とその宿主微生
物、バシルス・ズブチリスMI111（pBU110）に
ついて、細胞抽出液及びそれぞれを70℃、15分熱
処理した液を試料として、SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動〔U.K.Laemmli，Nature227，
680−685（1970）．〕を行つた。 この試験に於いて、標準品として精製β−ガラ
クトシダーゼを用い、分子量マーカー蛋白質とし
て、RNA−ポリメラーゼ（165000，155000，
39000）、牛血清アルブミン（68000）、トリブシン
インヒビター（21500）の混合物を使用した。泳
動後、0.02％クマシ−ブリリアントブルーR250
で染色した結果を第１図に示す。 第１図に於いて、レーン１〜６はそれぞれ次の
通りである。レーン 試 料 １ 分子量マーカー ２ 精製β−ガラクトシダーゼ ３ 本発明微生物の細胞抽出液 ４ 同上を70℃、15分熱処理した液 ５ 宿主微生物の細胞抽出液 ６ 同上を70℃、15分熱処理した液 第１図から明らかなように、本発明微生物の細
胞抽出液（レーン３）と宿主微生物の細胞抽出液
（レーン５）の成分は前者がβ−ガラクトシダー
ゼを含み、後者がそれを含まない点を除けば、ほ
ぼ同一の多種類の成分を含んでいる。 これら多種類のβ−ガラクトシダーゼ以外の成
分は、70℃、15分熱処理した試料（レーン４及び
レーン６）からほぼ完全に消失した。 また、別の試験で、本発明による耐熱性β−ガ
ラクトシダーゼ精製品の活性の半減期を測定した
結果、60℃に於ける半減期が150時間であり、前
記文献の７分及び文献の450分に比較して著
しく長く、本酵素は新規なβ−ガラクトシダーゼ
であることが判明した。 実施例７ 枯草菌の保持する組換えプラスミドの
解析 実施例５で得た形質転換株をカナマイシン
（5μｇ／ml）を含むＬ培地500ml中で37℃で培養
し、実施例３と同様にしてプラスミドDNA50μ
ｇを得た。このプラスミドDNAを用いてバシル
ス・ズブチリスMI111を実施例５と同様な方法で
形質転換したところ、得られた形質転換株は全て
カナマイシン耐性で、β−ガラクトシダーゼ産生
能を有していた。 このことは、プラスミドDNAにβ−ガラクト
シダーゼの遺伝子を含むDNA断片が組込まれて
いることを示している。 また、このプラスミドDNAを実施例２と同様
の方法で制限酵素EcoRIで切断し、耐熱性β−ガ
ラクトシダーゼの遺伝情報を担うDNA断片の大
きさを１％アガロースゲル電気泳動により測定し
たところ、2.9キロ塩基対（kb）であつた。 なお、このプラスミドPHG5の構造図（制限酵
素地図）は第１図で示した。 同図には、比較のため、特願昭58−171077号の
先願発明で調製したプラスミドPHG2の構造図も
併わせ示した。

【図面の簡単な説明】

第２図はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動の結果を示すもので、各レーンの試料は次の通
りである。レーン 試 料 １ 分子量マーカー ２ 精製β−ガラクトシダーゼ ３ 本発明微生物の細胞抽出液 ４ 同上を70℃、15分熱処理した液 ５ 宿主微生物の細胞抽出液 ６ 同上を70℃、15分熱処理した液 第１図は本発明の新規組換えプラスミドPHG5
及び特願昭58−171077号の発明のプラスミドPH
G2の制限酵素地図を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ バシルス・ステアロサーモフイラスの耐熱性
   β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む2.9kbのEcoR
   断片を枯草菌用ベクタープラスミドpUB110の
   EcoR部位に組込んだ下記の制限酵素地図を有
   する新規組換えプラスミドPHG5。 ２ バシルス・ステアロサーモフイラスの耐熱性
   β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む2.9kbのEcoR
   断片を枯草菌用ベクタープラスミドpUB110の
   EcoR部位に組込んだ下記の制限酵素地図を有
   する新規組換えプラスミドpHG5を保持する新規
   な枯草菌。