JPS6178386A - アミラ−ゼ遺伝子 - Google Patents
アミラ−ゼ遺伝子Info
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- JPS6178386A JPS6178386A JP20043684A JP20043684A JPS6178386A JP S6178386 A JPS6178386 A JP S6178386A JP 20043684 A JP20043684 A JP 20043684A JP 20043684 A JP20043684 A JP 20043684A JP S6178386 A JPS6178386 A JP S6178386A
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- Japan
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- strain
- plasmid
- amylase gene
- dna
- bacillus
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
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- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はアミラーゼ遺伝子に関する。詳しくは、バチル
ス サーキュランス由来のアミラーゼ−゛コ遺伝子に関
する。
ス サーキュランス由来のアミラーゼ−゛コ遺伝子に関
する。
、発明の構成
勺 本発明者等は、遺伝子組換え技術を用いて微更に
引続き研究の結果、該アミラーゼ遺伝子の構造を確認し
、本発明を達成した。即ち、本発明の要旨は、第１図に
おけるＤＮＡ塩基配列、！’７７−３３２乙として示さ
れるアミラーゼ遺伝子−に存する。
引続き研究の結果、該アミラーゼ遺伝子の構造を確認し
、本発明を達成した。即ち、本発明の要旨は、第１図に
おけるＤＮＡ塩基配列、！’７７−３３２乙として示さ
れるアミラーゼ遺伝子−に存する。
本発明を以下詳細に説明する。第１図−（１）〜（７）
は、後述する本発明のアミラーゼ遺伝子を含む複合プラ
スミドｐＴＮＡＯ３の特定の制限酵素によるＤＮＡ断片
の塩基配列を示す。アミラーゼ遺伝子は第７図における
塩基配列中ざ７７−３３２ｔに該当するＤＮＡ断片中に
ある。即ち、第１図の塩基配列には、／２０７−／２０
り（ＡＴＧ。
は、後述する本発明のアミラーゼ遺伝子を含む複合プラ
スミドｐＴＮＡＯ３の特定の制限酵素によるＤＮＡ断片
の塩基配列を示す。アミラーゼ遺伝子は第７図における
塩基配列中ざ７７−３３２ｔに該当するＤＮＡ断片中に
ある。即ち、第１図の塩基配列には、／２０７−／２０
り（ＡＴＧ。
開始信号）で始まり２７７／−２７７３（ＴＧＡ ）に
終る／３１７の塩基対からなるオープンリーディングフ
レーム（これらは３．２ｇ個のアミノ酸からなるタンパ
ク質をコードする）が存在す、でこのアミラーゼ酵素は
分泌酵素であるところか・・１１； 、ｌ：らシグナル・ペプチドを廟するはずであり、ン□
・：、・１．、ヵｙｂ 、＜ ７・ｆ ）’に多、□わ
、□。オよ□アミノ酸残基の配列から／ 、！ ０７−
／ 、２０り（ＡＴＧ）がアミラーゼ遺伝子の翻訳開始
点と考えられる。
終る／３１７の塩基対からなるオープンリーディングフ
レーム（これらは３．２ｇ個のアミノ酸からなるタンパ
ク質をコードする）が存在す、でこのアミラーゼ酵素は
分泌酵素であるところか・・１１； 、ｌ：らシグナル・ペプチドを廟するはずであり、ン□
・：、・１．、ヵｙｂ 、＜ ７・ｆ ）’に多、□わ
、□。オよ□アミノ酸残基の配列から／ 、！ ０７−
／ 、２０り（ＡＴＧ）がアミラーゼ遺伝子の翻訳開始
点と考えられる。
また、／２０７の上流の７３３−タ３ 、！’ （ＴＴ
ＧＡＯＡ ）及びりｊ７−タｔ２ （ＴＡＡＡＡＴ）に
、夫々プロモーター構造の゛−３ｊ′領域及び−１０′
領域に対応する塩基配列が存在している。
ＧＡＯＡ ）及びりｊ７−タｔ２ （ＴＡＡＡＡＴ）に
、夫々プロモーター構造の゛−３ｊ′領域及び−１０′
領域に対応する塩基配列が存在している。
本発明のアミラーゼ遺伝子は例えばバチルスサーキュラ
ンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｊｒｃｕｌａｎｓ ） １
．２株に由来し、その染色体ＤＮＡ上に存在する。
ンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｊｒｃｕｌａｎｓ ） １
．２株に由来し、その染色体ＤＮＡ上に存在する。
バチルス ｔ−キ＋−ランスＦ２株は、巻、、２１０７
〜．２／／ｊ頁（／９１）年）に記載されており、バチ
ルス属のバチルス サーキュランスの一菌株で次の菌学
的性質を有する。
〜．２／／ｊ頁（／９１）年）に記載されており、バチ
ルス属のバチルス サーキュランスの一菌株で次の菌学
的性質を有する。
形 態：長さ２ｊμｍ×巾０．５μｍ、ダラム陽
性。
性。
胞子形成能あり、側鞭毛あり。
生育温度：３７℃で良好に生育し、ｔｓ℃では生育せず
。
。
食塩濃度二〇、ｊ％で生育し、ｊ％以」二では生育せず
。
。
生化学的性質：カタラーゼ反応陽性、 ０−ｆ気性、硝
酸還バチルス サーキュランスＦ２株の染色体１） Ｎ
Ａ上のアミラーゼ遺伝Ｔ−ヲクローニングする方法につ
いて説明するに、捷ず、バチルスブーキュランスフ。２
株を培養、集菌し、常法により処理して染色体ＤＮＡ標
品を採取する。染色体Ｉ）ＮＡを５ａｕ３Ａ］で部分切
断し、一方、第２図に示し、後記実施例の方法で調製し
たプラスミドｐＬｓ ３３θ−弘をＢｇｌ ［で切断し
、両者を混合してＴ４’ＤＮＡリカーゼで連結する。
酸還バチルス サーキュランスＦ２株の染色体１） Ｎ
Ａ上のアミラーゼ遺伝Ｔ−ヲクローニングする方法につ
いて説明するに、捷ず、バチルスブーキュランスフ。２
株を培養、集菌し、常法により処理して染色体ＤＮＡ標
品を採取する。染色体Ｉ）ＮＡを５ａｕ３Ａ］で部分切
断し、一方、第２図に示し、後記実施例の方法で調製し
たプラスミドｐＬｓ ３３θ−弘をＢｇｌ ［で切断し
、両者を混合してＴ４’ＤＮＡリカーゼで連結する。
上記に得た複合プラスミドからアミラーゼ遺伝子を含む
枠台プラスミドを選択、採取するために、これを形質転
換法により、予めｐＬｓ３１０へｔを導入したバチルス
サテイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｊｓ
） ＭＯ７−２−３／ （ａｒｏ Ｉ？ＯＡ ｍｅｔＢ
ａｍｙＲ，２ａｍｙＥＯ７）株（Ｔ Ｎ ／ Ｏｔ株
という）に導入してアミラーゼ活性を示す形質転換株（
ＴＮｊＯ１株という）をスクリーニＭＯ７−２−３／株
は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
／３６巻、ｔｒｉｒ−♂、２／頁（１９７１年）に記載
されている。ＴＮ！０／株を培養し、アミラーゼという
）を単離する。
枠台プラスミドを選択、採取するために、これを形質転
換法により、予めｐＬｓ３１０へｔを導入したバチルス
サテイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｊｓ
） ＭＯ７−２−３／ （ａｒｏ Ｉ？ＯＡ ｍｅｔＢ
ａｍｙＲ，２ａｍｙＥＯ７）株（Ｔ Ｎ ／ Ｏｔ株
という）に導入してアミラーゼ活性を示す形質転換株（
ＴＮｊＯ１株という）をスクリーニＭＯ７−２−３／株
は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
／３６巻、ｔｒｉｒ−♂、２／頁（１９７１年）に記載
されている。ＴＮ！０／株を培養し、アミラーゼという
）を単離する。
以上のようにして得られた複合プラスミドｐＴＮＡＯ３
の分子量は、アガロースゲル電気泳動分析により測定し
た結果、約＆Ｊメガダルトン（／ ｏ、ｔｉ ｋｂ ）
であり、そのうち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片
の分子量は２．３メガダルトン（３，ｓ ｋｂ ）であ
った。ｐＴＮ ６０３の制限酵素地図を第３図に示す。
の分子量は、アガロースゲル電気泳動分析により測定し
た結果、約＆Ｊメガダルトン（／ ｏ、ｔｉ ｋｂ ）
であり、そのうち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片
の分子量は２．３メガダルトン（３，ｓ ｋｂ ）であ
った。ｐＴＮ ６０３の制限酵素地図を第３図に示す。
第３図において、太線で示した部分（Ｂｇｌ ＩＩによ
る切断部位からＳａｕ ３ Ａｌによる切断部位までの
部分）Ｖｉアミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ部分であり、
その制限酵素地図を第１図に示す。
る切断部位からＳａｕ ３ Ａｌによる切断部位までの
部分）Ｖｉアミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ部分であり、
その制限酵素地図を第１図に示す。
上記ｐＴＮＡＯ３のＢｇｌ ｌによる切断部位から５ａ
ｕ３ Ａｌによる切断部位までのＤＮＡ断片の塩基配列
をマキサム−ギルバー１− （ＭａＸａｍ −Ｇｉｌｂ
ｅｒｔ ）法によ匂決定した。その結果を第７上述の本
発明のアミラーゼ遺伝子を含むｐＴＮ６０３は、バチル
ス サーキュランスのアミラーゼを枯草菌中で生産させ
ることができ、枯草菌における分泌ベクターとしての用
途が期待される。
ｕ３ Ａｌによる切断部位までのＤＮＡ断片の塩基配列
をマキサム−ギルバー１− （ＭａＸａｍ −Ｇｉｌｂ
ｅｒｔ ）法によ匂決定した。その結果を第７上述の本
発明のアミラーゼ遺伝子を含むｐＴＮ６０３は、バチル
ス サーキュランスのアミラーゼを枯草菌中で生産させ
ることができ、枯草菌における分泌ベクターとしての用
途が期待される。
実施例
以下実施例について説明するが、本発明は以下の実施例
に限られるものではない。
に限られるものではない。
実施例／
（１） バチルス サーキュランス７２株ＤＮＡの採
取（／９７り年）に記載の方法に従って、３７℃で一夜
間培養後、集菌し、ＴＢＳ緩衝液（，２０ｍＭのトリス
塩酸（ｐＨＪ’、０ ）、／ ｍＭのエチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）および２０ ｍＭの塩化ナトリウム
からなる〕で２回洗滌後、同緩衝液に懸濁する。ついで
、リゾチーム処理、リボヌクレアーゼ処理、プロナーゼ
および界面活性剤処理を行なって溶菌してＤＮＡを抽出
し、フェノールによる除蛋白処理を３回行なった後、Ｄ
ＮＡをエタノールで沈澱させ、これを再びＴＥＳ緩衝液
に懸濁し、同緩衝液に対し＋℃でｔ時間透析を行って染
色体ＤＮＡ標品を得た。
取（／９７り年）に記載の方法に従って、３７℃で一夜
間培養後、集菌し、ＴＢＳ緩衝液（，２０ｍＭのトリス
塩酸（ｐＨＪ’、０ ）、／ ｍＭのエチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）および２０ ｍＭの塩化ナトリウム
からなる〕で２回洗滌後、同緩衝液に懸濁する。ついで
、リゾチーム処理、リボヌクレアーゼ処理、プロナーゼ
および界面活性剤処理を行なって溶菌してＤＮＡを抽出
し、フェノールによる除蛋白処理を３回行なった後、Ｄ
ＮＡをエタノールで沈澱させ、これを再びＴＥＳ緩衝液
に懸濁し、同緩衝液に対し＋℃でｔ時間透析を行って染
色体ＤＮＡ標品を得た。
（２） 染色体ＤＮＡのｐＬＳ ３３０−グへの挿入
（複合プラスミドの調製） 前記（１）で得た染色体ＤＮＡ、２０μノを、ｉ、ｓ単
位のＳａｕ ３ Ａｌを用いて３７℃で３０分間反応さ
せた。一方、第１図に示す後記（８）の方法により調製
したプラスミドｐＬｓＪｊθ−グ（４′・５Ｍｄ・ｆ９
ｋｂ ） ３μ？金ｊ単位の制限酵素Ｂｇｌ ｌを用
い３７℃で７時間反応させた。
（複合プラスミドの調製） 前記（１）で得た染色体ＤＮＡ、２０μノを、ｉ、ｓ単
位のＳａｕ ３ Ａｌを用いて３７℃で３０分間反応さ
せた。一方、第１図に示す後記（８）の方法により調製
したプラスミドｐＬｓＪｊθ−グ（４′・５Ｍｄ・ｆ９
ｋｂ ） ３μ？金ｊ単位の制限酵素Ｂｇｌ ｌを用
い３７℃で７時間反応させた。
Ｓａｙ ３ Ａｌで切断した染色体ＤＮＡ標品２．ＩＩ
μ２を、Ｂｇｌ １１で切断したｐＩ、Ｓ ３３０−４
’の３μ？と混合し、Ｔ４Ｚ Ｄ Ｎ ＡリガーゼＯ，
Ｓ単位を用いｇ℃でＩＩｇ時間反応させて連結した。
μ２を、Ｂｇｌ １１で切断したｐＩ、Ｓ ３３０−４
’の３μ？と混合し、Ｔ４Ｚ Ｄ Ｎ ＡリガーゼＯ，
Ｓ単位を用いｇ℃でＩＩｇ時間反応させて連結した。
（３） Ｔ Ｎ １０乙株（ｐＬｓ ３ ／ Ｏ△Ａ
を含むバチ／ｌ、 スサティリスＭＯ７−，２−３／株
）の調製バチルス サティリスＭＯ７−，２−ｊ ／
株ヲペンアツ士イ ブロス培地中で一夜間培養後、その
ｏ、ｉｍｌを、必要な栄養を補足したｊｍどのＣＩ培地
（／、ｔＩ％のリン酸二力ＩＪ 、 Ｑ、１％のリン酸
−力ＩＪ 、 ０．．２％の硫安、０．７％のクエン酸
ナトリウム、３ｍＭの硫酸マグネ／ラム。
を含むバチ／ｌ、 スサティリスＭＯ７−，２−３／株
）の調製バチルス サティリスＭＯ７−，２−ｊ ／
株ヲペンアツ士イ ブロス培地中で一夜間培養後、その
ｏ、ｉｍｌを、必要な栄養を補足したｊｍどのＣＩ培地
（／、ｔＩ％のリン酸二力ＩＪ 、 Ｑ、１％のリン酸
−力ＩＪ 、 ０．．２％の硫安、０．７％のクエン酸
ナトリウム、３ｍＭの硫酸マグネ／ラム。
０．５％のグルコース、 ０，０．２％のカザミノ酸を
含む）に加え、３７℃で撮盪培養する。定常期に入る直
前（７〜５時間後）に集菌し、１０ｍ１のＣ１培地（カ
ザミノ酸の濃度が０．０７チ、補給アミノ酸の濃度がユ
である以外はＣ１培地と同じ組成）に移し、３７℃で７
時間培養する。この培養液０３７ｍ１に、後述する（８
）の方法で調製したｐＬＳ３１０△６の溶液θ、／ｍｌ
（／、７３８ｇ ＤＮＡ ）を加え３７℃で７時間保
持後、遠心分離により集菌し、／ ｍｌのペンアッセイ
ブロス培地に懸濁し、３７℃で２時間培養する。このも
のをカナマイシン（６ａ？／ｍｌ ）を含むペンアッセ
イブロス培地に塗布し、３７℃で一夜間培養し、生じた
コロニーを単離し、ＴＮ／Ｑｔ株（ｐＬＳ３１０△６を
含むバチルス サテイリスＭＯ７−２−３７株）を得た
。
含む）に加え、３７℃で撮盪培養する。定常期に入る直
前（７〜５時間後）に集菌し、１０ｍ１のＣ１培地（カ
ザミノ酸の濃度が０．０７チ、補給アミノ酸の濃度がユ
である以外はＣ１培地と同じ組成）に移し、３７℃で７
時間培養する。この培養液０３７ｍ１に、後述する（８
）の方法で調製したｐＬＳ３１０△６の溶液θ、／ｍｌ
（／、７３８ｇ ＤＮＡ ）を加え３７℃で７時間保
持後、遠心分離により集菌し、／ ｍｌのペンアッセイ
ブロス培地に懸濁し、３７℃で２時間培養する。このも
のをカナマイシン（６ａ？／ｍｌ ）を含むペンアッセ
イブロス培地に塗布し、３７℃で一夜間培養し、生じた
コロニーを単離し、ＴＮ／Ｑｔ株（ｐＬＳ３１０△６を
含むバチルス サテイリスＭＯ７−２−３７株）を得た
。
（４） Ｔ Ｎ ｌｏ を株への複合プラスミドの導
入（ＴＮｊθ／株の調製） 前記（２）で調製した複合プラスミドを、通常の形質転
換法によって前記（３）のＴＮｌＯｔ株へ導入した。即
ち、複合プラスミド溶液θ、／ｍｌ（／、ｊμ？ＤＮＡ
）に、コンピテントな’ｆＮ１０１゜懸濁液０．７ｍｌ
を混合し、３７℃で７時間保持した後、集菌し、ペンア
ッセイブロスで７１０１洗滌後、２ ｍｌのペンアッセ
イブロス培地に懸濁し、３７℃で２時間保持した。つい
でこれをエリスロマイシン（，２０μ？／ｍｌ ）
ヲ含ｂ ニュートリエンドブロス澱粉培地に塗布シ、３
７℃で一夜培養した。生じたコロニーにヨード液（０，
０，２％のヨードを含む０１．２％ヨウ化カリ溶ｉ）を
噴霧し、アミラーゼ活性を検定した結果、アミラーゼ活
性を示す形質転換株−株を得て、これをＴＮ！；０／株
と名付けた。
入（ＴＮｊθ／株の調製） 前記（２）で調製した複合プラスミドを、通常の形質転
換法によって前記（３）のＴＮｌＯｔ株へ導入した。即
ち、複合プラスミド溶液θ、／ｍｌ（／、ｊμ？ＤＮＡ
）に、コンピテントな’ｆＮ１０１゜懸濁液０．７ｍｌ
を混合し、３７℃で７時間保持した後、集菌し、ペンア
ッセイブロスで７１０１洗滌後、２ ｍｌのペンアッセ
イブロス培地に懸濁し、３７℃で２時間保持した。つい
でこれをエリスロマイシン（，２０μ？／ｍｌ ）
ヲ含ｂ ニュートリエンドブロス澱粉培地に塗布シ、３
７℃で一夜培養した。生じたコロニーにヨード液（０，
０，２％のヨードを含む０１．２％ヨウ化カリ溶ｉ）を
噴霧し、アミラーゼ活性を検定した結果、アミラーゼ活
性を示す形質転換株−株を得て、これをＴＮ！；０／株
と名付けた。
（５） アミラーゼ遺伝子を含む複合プラスミドの分
離 前記（４）で得たＴＮ５０／株をエリスロマイシンを含
むニュートリエンドブロス澱粉培地に塗布し、単一コロ
ニーを分離した。アミラーゼ活性ヲ持つコロニーを選ヒ
、エリスロマイシンを含むペンアッセイブロス培地に植
菌し、３７℃で一夜間培養し、集菌し、複合プラスミド
単離の材料とした。
離 前記（４）で得たＴＮ５０／株をエリスロマイシンを含
むニュートリエンドブロス澱粉培地に塗布し、単一コロ
ニーを分離した。アミラーゼ活性ヲ持つコロニーを選ヒ
、エリスロマイシンを含むペンアッセイブロス培地に植
菌し、３７℃で一夜間培養し、集菌し、複合プラスミド
単離の材料とした。
れた方法に準じて行なった。即ち、菌体を、７５％蔗糖
を含む３０ ｍＭのトリス塩酸および３０ ｍＭのＥＤ
ＴＡに懸濁し、リゾチーム処理および界面活性剤処理を
行う。ついで、ｊＭの酢酸カリウムを最終濃度０．！；
Ｍとなるように加え、０℃で７時間保持後、遠心分離
にまり上清を分取し、フェノール抽出、エタノール沈澱
処理し、沈澱を１０１ｉｔ／ｍｌのりボヌクレアーゼを
含む／ ＯｍＭのトリス塩酸および／ ｍＭのＥＤＴＡ
に溶解して複合プラスミド溶液を得た。
を含む３０ ｍＭのトリス塩酸および３０ ｍＭのＥＤ
ＴＡに懸濁し、リゾチーム処理および界面活性剤処理を
行う。ついで、ｊＭの酢酸カリウムを最終濃度０．！；
Ｍとなるように加え、０℃で７時間保持後、遠心分離
にまり上清を分取し、フェノール抽出、エタノール沈澱
処理し、沈澱を１０１ｉｔ／ｍｌのりボヌクレアーゼを
含む／ ＯｍＭのトリス塩酸および／ ｍＭのＥＤＴＡ
に溶解して複合プラスミド溶液を得た。
（６） アミラーゼ遺伝子を含む複合プラスミド（ｐ
ＴＮＡＯＪ）の精製 上記複合プラスミドを、前記（３）のバチルスサテイリ
スＭＯ７−２−３／株中に、プロドプラＧｅｎｅｔｉｃ
ｅ ／ ６ｇ巷、ｌ／ ｌ＋−ｌ ｌＳ貝（ｉｙ’／
”ｌ’＋）に記載の方法〕により導入しな。即ち、中期
対数増殖期にあるバチルス ヤテイリスＭＯ７−２−３
／株（クレット値７０−にＯ）細胞を集め、−容ｌのＳ
Ｍ Ｍ Ｐ緩衝液（０，３Ｍ］Ｏ の蔗糖、θ、０２ Ｍのマレイン酸、０．０２ Ｍの塩
化マグネシウム（ｐＨ６，３） を含むペンアッセイプ
ロス〕に懸濁し、２０θμ？／ｍｌ のリゾチームを加
え、３７℃で２時間保持する。
ＴＮＡＯＪ）の精製 上記複合プラスミドを、前記（３）のバチルスサテイリ
スＭＯ７−２−３／株中に、プロドプラＧｅｎｅｔｉｃ
ｅ ／ ６ｇ巷、ｌ／ ｌ＋−ｌ ｌＳ貝（ｉｙ’／
”ｌ’＋）に記載の方法〕により導入しな。即ち、中期
対数増殖期にあるバチルス ヤテイリスＭＯ７−２−３
／株（クレット値７０−にＯ）細胞を集め、−容ｌのＳ
Ｍ Ｍ Ｐ緩衝液（０，３Ｍ］Ｏ の蔗糖、θ、０２ Ｍのマレイン酸、０．０２ Ｍの塩
化マグネシウム（ｐＨ６，３） を含むペンアッセイプ
ロス〕に懸濁し、２０θμ？／ｍｌ のリゾチームを加
え、３７℃で２時間保持する。
生じたプロトプラストを、３０００ ｒ、ｐｏｍ 、
／ ｊ分間の遠心分離により集め、ＳＭＭＰ緩衝液で洗
滌後、等容量の同緩衝液に懸濁する。その２３０μｔに
、前記（５）で得た複合プラスミドを含むＳＭＭＰ緩衝
液Ｓ漬液ｔを加え、引続きｉ、ｓｍｌのりθ％ポリエチ
レングリコールｔｔ−ｔｏｏｏ′ｆｒ：含む８ＭＭ緩衝
液（ＳＭＭＰからペンアッセイ ブロスを除いたもの）
を加え２分間混合する。ついで３ｍｌのＳＭＭＰ緩衝液
を加え、混合、遠心して集菌し、／ ｍｌのＳＭＭＰ緩
衝液に懸濁して３０℃で２時間培養する。
／ ｊ分間の遠心分離により集め、ＳＭＭＰ緩衝液で洗
滌後、等容量の同緩衝液に懸濁する。その２３０μｔに
、前記（５）で得た複合プラスミドを含むＳＭＭＰ緩衝
液Ｓ漬液ｔを加え、引続きｉ、ｓｍｌのりθ％ポリエチ
レングリコールｔｔ−ｔｏｏｏ′ｆｒ：含む８ＭＭ緩衝
液（ＳＭＭＰからペンアッセイ ブロスを除いたもの）
を加え２分間混合する。ついで３ｍｌのＳＭＭＰ緩衝液
を加え、混合、遠心して集菌し、／ ｍｌのＳＭＭＰ緩
衝液に懸濁して３０℃で２時間培養する。
培養液のｏ、７ｍｌを、エリスロマイシン（２θμｆ／
／ｍｌ ）を含むＤＭ、？！粉培地（ｏ、ｓ’％の寒
天、０．６ Ｍのコノ・り酸ナトリウム（ｐＨ７，３）
１０、ｊ％のカザミノ酸、 Ｏ，Ｓ％の酵母エキス。
／ｍｌ ）を含むＤＭ、？！粉培地（ｏ、ｓ’％の寒
天、０．６ Ｍのコノ・り酸ナトリウム（ｐＨ７，３）
１０、ｊ％のカザミノ酸、 Ｏ，Ｓ％の酵母エキス。
０．３ｊ％のリン酸二カリ、 ０．／ ６％のリン酸−
カリ、０．θ１％のブドウ糖、７％の澱粉。
カリ、０．θ１％のブドウ糖、７％の澱粉。
２０ ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．０７％の牛血
清アルブミンを含む〕に塗布し、３７℃で培饗する。生
じたコロニーにヨード液を噴霧し、アミラーゼ活性を示
す形質転換株（ＴｋＪｔ０３株）を得た。ＴＮｔ０３株
はエリスロマイシン耐性、カナマイシン感受性を示した
。
清アルブミンを含む〕に塗布し、３７℃で培饗する。生
じたコロニーにヨード液を噴霧し、アミラーゼ活性を示
す形質転換株（ＴｋＪｔ０３株）を得た。ＴＮｔ０３株
はエリスロマイシン耐性、カナマイシン感受性を示した
。
ＴＮｔＯ３株から、前記（５）の方法により複合プラス
ミドｐＴＮｔ０３ｆ単離した。これを再びプロトプラス
ト形質転換法によりバチルスサテイリスＭＯ７−２−３
／株中に導入し、アミラーゼ活性を示す形質転換株を検
定した。
ミドｐＴＮｔ０３ｆ単離した。これを再びプロトプラス
ト形質転換法によりバチルスサテイリスＭＯ７−２−３
／株中に導入し、アミラーゼ活性を示す形質転換株を検
定した。
このプラスミドの分子量をアガロースゲル電気泳動で測
定した結果約＆Ｊメガダルトン（／ ０．ＩＩ ｋｂ
）であり、そのうち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片の分子量は２．３メガダルトン（３，ｓ ｋｂ ）で
あった。ｐＴＮｌ、０３の制限酵素地図を第３図に示す
。第を図は、第３図におけるＢｇｌ ［１による切断部
位からＳａｕ ３ Ａｌによる切断部位捷でのＤＮＡ部
分（太線で表示）、即ち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の制限酵素地図である。第を図に示すように、ア
ミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片はＨｐａ ｌによる切
断部位が／個所、ＥＣ０ＲＩＩＤｄｅＩ、及びＣ１ａｌ
による切断部位が各−個所、Ｓａｌ ｌとＨｉｎｄ ｉ
ｌｌによる切断部位が各３個所存在した。
定した結果約＆Ｊメガダルトン（／ ０．ＩＩ ｋｂ
）であり、そのうち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片の分子量は２．３メガダルトン（３，ｓ ｋｂ ）で
あった。ｐＴＮｌ、０３の制限酵素地図を第３図に示す
。第を図は、第３図におけるＢｇｌ ［１による切断部
位からＳａｕ ３ Ａｌによる切断部位捷でのＤＮＡ部
分（太線で表示）、即ち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の制限酵素地図である。第を図に示すように、ア
ミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片はＨｐａ ｌによる切
断部位が／個所、ＥＣ０ＲＩＩＤｄｅＩ、及びＣ１ａｌ
による切断部位が各−個所、Ｓａｌ ｌとＨｉｎｄ ｉ
ｌｌによる切断部位が各３個所存在した。
上記ｐＴＮ Ａ ０３のＢｇＩ ■による切断部位から
５ａｕ３ Ａｌによる切断部位捷でのＤＮＡ断片の塩基
配列をマキサム−ギルバート法により決定した。その結
果を第７図−（１）〜（り）に示した。
５ａｕ３ Ａｌによる切断部位捷でのＤＮＡ断片の塩基
配列をマキサム−ギルバート法により決定した。その結
果を第７図−（１）〜（り）に示した。
前記（２）に記載したｐＬＳ ３３０−ＩＩはつぎの方
法で調製した。
法で調製した。
（７） ｐＬｓ ３ ｊ Ｏ−グの調製（イ）
ｐＩ、Ｓ ３ ／ ０−２ の 調 隼ン／
μ２のｐＢＲｊ、２．２および／μ２のｐＵＢ／１０を
、それそねＥｃｏＲｌを用いて３７℃で３００分間処理
て切断し、両者を混合してＴグＤ Ｎ Ａリカ〜ゼを用
い、ｇ℃でｙ−ｇ時間処理して連結した。得られた複合
プラスミドを前記（５）の方法により単離し、通常の形
質転換法により、イー・コ＋）ｃｔｏｏ株中に導入し７
り。即ち、単離した複合プラスミドを０．７Ｍのトリス
塩酸に懸濁し、そのｏ、／ｍｉを、０℃に保持したイー
・コリＣｔ００株の塩化カルシウム懸濁液０．／ ｍｌ
と混合して７０分間保持し、ついで３７℃で２分間処理
した後、／ ｍｅのＬＢ培地を加え、３７℃で２θ分間
培養する。形質転換株から、アンピシリン耐性（Ａｐｒ
）、カナマイシン耐性（Ｋｍｒ）株を選択した。連結方
法の相違による。２柚のプラスミドｐＬｓ３１０−／お
よびｐＬＢ３１０−２のうち、ｐＬｓ ３１０−２（３
；、ｇ Ｍｄ ） を、形ＴＪ転換株から、前記（５
）の方θミに準じて採取した。
ｐＩ、Ｓ ３ ／ ０−２ の 調 隼ン／
μ２のｐＢＲｊ、２．２および／μ２のｐＵＢ／１０を
、それそねＥｃｏＲｌを用いて３７℃で３００分間処理
て切断し、両者を混合してＴグＤ Ｎ Ａリカ〜ゼを用
い、ｇ℃でｙ−ｇ時間処理して連結した。得られた複合
プラスミドを前記（５）の方法により単離し、通常の形
質転換法により、イー・コ＋）ｃｔｏｏ株中に導入し７
り。即ち、単離した複合プラスミドを０．７Ｍのトリス
塩酸に懸濁し、そのｏ、／ｍｉを、０℃に保持したイー
・コリＣｔ００株の塩化カルシウム懸濁液０．／ ｍｌ
と混合して７０分間保持し、ついで３７℃で２分間処理
した後、／ ｍｅのＬＢ培地を加え、３７℃で２θ分間
培養する。形質転換株から、アンピシリン耐性（Ａｐｒ
）、カナマイシン耐性（Ｋｍｒ）株を選択した。連結方
法の相違による。２柚のプラスミドｐＬｓ３１０−／お
よびｐＬＢ３１０−２のうち、ｐＬｓ ３１０−２（３
；、ｇ Ｍｄ ） を、形ＴＪ転換株から、前記（５
）の方θミに準じて採取した。
（ロ） ｐＩ、Ｓ ３ ／ ｏ △乙 の 計句
製バチルス サテイリス（Ｂａｃｊｌｌｕｓ ｏｕｂ
ｔｎ］ｓ）の染色体ＤＮＡ’ｊｚ前記（１）の方法に準
じて採取し、Ｈｉｎｄｌｌｌで切断した断ハ（／、ｔＩ
−Ｍｄ）′ｆ、上記（イ）のｐＬｓ ３ ／ ０−．２
のＨｉｎｄｌｌｌによる断ハと’］’１ＤＮＡリカーゼ
を用いて連結し、得られた仲介プラスミドをイー・３９
０６００株に導入し、形η転換株から複合プラスミドを
単離して、これを前記バチルスサテイリスＭＩ／／、２
株に導入し、形質転換株からテトラサイクリン耐性遺伝
子およびｐ Ｌ ３３／θ−２断片領域に欠失部をもつ
、プラスミドｐＬｓ ３ ／ ０△乙（ｊ、！ ｋｂ
、 ３．！ Ｍｄ ） を採取した。
製バチルス サテイリス（Ｂａｃｊｌｌｕｓ ｏｕｂ
ｔｎ］ｓ）の染色体ＤＮＡ’ｊｚ前記（１）の方法に準
じて採取し、Ｈｉｎｄｌｌｌで切断した断ハ（／、ｔＩ
−Ｍｄ）′ｆ、上記（イ）のｐＬｓ ３ ／ ０−．２
のＨｉｎｄｌｌｌによる断ハと’］’１ＤＮＡリカーゼ
を用いて連結し、得られた仲介プラスミドをイー・３９
０６００株に導入し、形η転換株から複合プラスミドを
単離して、これを前記バチルスサテイリスＭＩ／／、２
株に導入し、形質転換株からテトラサイクリン耐性遺伝
子およびｐ Ｌ ３３／θ−２断片領域に欠失部をもつ
、プラスミドｐＬｓ ３ ／ ０△乙（ｊ、！ ｋｂ
、 ３．！ Ｍｄ ） を採取した。
（ハ） ｐＬｓ３３０−グの調製
スタフィロコッカスアウレウス（Ｓ ｔａｐｈｙｌｏ
−−〕５− ＣＯＣＣｕ８ ａｕｒｅｕｓ ）のプラスミドｐＥ／タ
グー４７２頁（／り７ｇ年） ； Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍ
巻。
−−〕５− ＣＯＣＣｕ８ ａｕｒｅｕｓ ）のプラスミドｐＥ／タ
グー４７２頁（／り７ｇ年） ； Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍ
巻。
、２ｊ＆ 〜２ｔＯ頁（／りｇＯ年）〕を、５ａｕＪＡ
１で部分切断し、また上記ｐＬＳ ３ ／ ０△６をＢ
ａｍＨＩで切断し、両者を混合し、Ｔ４１！ＤＮＡリカ
ーゼで連結した。得られた複合プラスミドを前記（ロ）
と同様にしてイー・コリｃｔｏｏ株中に導入し、アンピ
シリン耐性。
１で部分切断し、また上記ｐＬＳ ３ ／ ０△６をＢ
ａｍＨＩで切断し、両者を混合し、Ｔ４１！ＤＮＡリカ
ーゼで連結した。得られた複合プラスミドを前記（ロ）
と同様にしてイー・コリｃｔｏｏ株中に導入し、アンピ
シリン耐性。
エリスロマイシン耐性株を選択し、複合プラスミドを採
取して第２図に示すｐＬｓ３３０−グ（Ｘ、りｋｂ、
ｔｉ、ｓ Ｍａ ） を得た。
取して第２図に示すｐＬｓ３３０−グ（Ｘ、りｋｂ、
ｔｉ、ｓ Ｍａ ） を得た。
第１図−（１）〜（７）はプラスミドｐＴＮｌ、０３の
Ｂｇｌ ｌによる切断部位からＳａｕ ３ Ａｌによる
切断部位までのＤＮＡ断片の塩基配列を示し、第一図は
プラスミドｐＬｓ３３０−４１の構成ルートを示す模式
図、第３図はプラスミドｐＴＮ６０３□の制限酵素地図
、第ｙ図はアミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ部分の制限酵
素地図である。 ヒ ＣＤ ＯＵ リ （、Ｏ＜Ｑ ヒ く ） −＜り＜ ヒ く Ｑ ヒ ヒ Ｑ リ Ｑ （１）（りＱ Ｑ く く ヒ Ｑ （ン リ
Ｑ ヒ ト ヒ ０＜００ ■ ｏ Ｑ Ｑ（ＬＱ ヒ
く Ｑ ０ リ ｏｑｕ （Ｌ Ｑ Ｑ く Ｑヒ ヒ
く Ｑ ヒ （Ｊ （ン Ｖ （リ１− ／ｎ
］ Ｕ（ＤＱ（ＪＵ （） （５く （１） ヒ くＱ
く く （ ○ く く Ｑ く Ｑ ｌ−Ｑ く ○ （） Ｕ ｌ−Ｕ ）−ｑ−ｑｏヒ し く’Ｊ
Ｂｇｌ ｌによる切断部位からＳａｕ ３ Ａｌによる
切断部位までのＤＮＡ断片の塩基配列を示し、第一図は
プラスミドｐＬｓ３３０−４１の構成ルートを示す模式
図、第３図はプラスミドｐＴＮ６０３□の制限酵素地図
、第ｙ図はアミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ部分の制限酵
素地図である。 ヒ ＣＤ ＯＵ リ （、Ｏ＜Ｑ ヒ く ） −＜り＜ ヒ く Ｑ ヒ ヒ Ｑ リ Ｑ （１）（りＱ Ｑ く く ヒ Ｑ （ン リ
Ｑ ヒ ト ヒ ０＜００ ■ ｏ Ｑ Ｑ（ＬＱ ヒ
く Ｑ ０ リ ｏｑｕ （Ｌ Ｑ Ｑ く Ｑヒ ヒ
く Ｑ ヒ （Ｊ （ン Ｖ （リ１− ／ｎ
］ Ｕ（ＤＱ（ＪＵ （） （５く （１） ヒ くＱ
く く （ ○ く く Ｑ く Ｑ ｌ−Ｑ く ○ （） Ｕ ｌ−Ｕ ）−ｑ−ｑｏヒ し く’Ｊ
Claims (1)
- 第１図におけるＤＮＡ塩基配列８７７−３３２６として
示されるアミラーゼ遺伝子
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20043684A JPS6178386A (ja) | 1984-09-27 | 1984-09-27 | アミラ−ゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20043684A JPS6178386A (ja) | 1984-09-27 | 1984-09-27 | アミラ−ゼ遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6178386A true JPS6178386A (ja) | 1986-04-21 |
| JPS635076B2 JPS635076B2 (ja) | 1988-02-02 |
Family
ID=16424258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20043684A Granted JPS6178386A (ja) | 1984-09-27 | 1984-09-27 | アミラ−ゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6178386A (ja) |
-
1984
- 1984-09-27 JP JP20043684A patent/JPS6178386A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS635076B2 (ja) | 1988-02-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |