JPH02227083A

JPH02227083A - 新規プラスミド

Info

Publication number: JPH02227083A
Application number: JP1049547A
Authority: JP
Inventors: Kunio Yamane; 山根　國男; Kunihiko Yamashita; 邦彦山下; Takayuki Ikeda; 池田　隆幸; Hisato Yamazaki; 山崎　久人
Original assignee: M&D Research Co Ltd
Current assignee: M&D Research Co Ltd
Priority date: 1989-02-28
Filing date: 1989-02-28
Publication date: 1990-09-10
Anticipated expiration: 2010-08-02
Also published as: JPH0771497B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、宿主細胞内でα−アミラーゼを高発現させる
クローニングベクターとして有用な新規プラスミドに関
する。

［従来の技術と発明が解決しようとする課題］バチルス
（Ｂａｃｉ　ｌ　Ｉｕｓ）属の細菌である枯草菌（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｌｌｓ）はα−アミラーゼ、プ
ロテアーゼ等を菌体外に多量に分泌生産するので、発酵
や洗剤等に用いる酵素生産菌として工業的に広く利用さ
れている。またこの枯草菌は、エンドトキシン等を生産
せず、しかも人や動物に病原微生物として寄生したり共
生することがないので、大腸菌に比べて安全性が高く、
遺伝子組換えの宿主菌として大腸菌に次いで遺伝的解析
が進んでいる。

この枯草菌の代表的な菌体外酵素であるα−アミラーゼ
は、枯草菌の場合、遺伝子の発現を制御する制御部位が
、塩基配列の違いにより　ａｍｙＲｌ、ａｍｙＲ２およ
びａｏ＋ｙＲ３の３つのタイプに分類されており、ａｍ
ｙＲ２タイプの制御部位が最も活性が高いとされている
。また枯草菌の場合、そのデンプン分解活性によりマー
バーブ（Ｍａｒｂｕｒｇ）型（以下、Ｍタイプという）
とナラトウ（Ｎａｔｔｏ　）型（以下、Ｎタイプという
）とアミロサッカリティカス型（以下、Ｓタイプという
）に分類される。

そして、これらのα−アミラーゼのクローニゲとその遺
伝的機作に関する多くの報告があり、その構造も明らか
になっている。例えばアミラーゼ遺伝子（ａｆｆｌｙＲ
ｌ−Ｍタイプ）のクローニングとシーフェンスによる遺
伝子構造（Ｍａｒｉａ　Ｙａｎｇ、　ＮｕｃＩｅｌｃ　
　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、１１．Ｎ
ｕｍｂｅｒ　　２．２３７−２４９　（１９８３））や
、α−アミラーゼ高発現性株Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｓ　ＮＡ３４由来のα−アミラーゼの制御
遺伝子ａ■ＦＲ２と構造遺伝子ａＩＩｌｙＥをクローニ
ングし、更に多コピープラスミドｐＵＢ１１０に再クロ
ーニングすることが報告されている（　Ｙａｍａｚａｋ
ｉθｔａ１．　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５８
．３２７−３３７　（１９８３））。

またＭタイプとＮタイプとＳタイプα−アミラーゼとの
違いは、翻訳停止が、α−アミラーゼ遺伝子の異なる部
位で起ることに起因していると報告されている（Ｙａａ
＋ａｎｅ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、、　
９６゜１８４９−１８５８　（１９８４））、さらには
Ｂ、　５ｕｂｔｌｌｓ　２６３３のα−アミラーゼ遺伝
子を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａｃｏｌｉ）にクロ
ーニングし、α−アミラーゼ遺伝子を含む組換体プラス
ミドｐＡＭ２６をＢ、　５ｕｂｔｌｌｓ６１６０に導入
すると、ａｆｌｌｙＲＳタイプのプロモータに起因して
、α−アミラーゼが高発現することが報告されている（
Ｅｍｏｒｌ　ｅｔ　ａｔ、　Ａｇｒｌｃ、　Ｂｌｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　５２　（２）、　３９９−４０８．１９
８８）。

またバチルス・チューリンゲネス（Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ
ｇｉｅｎｓｌｓ）のクリスタルプロティン（ｃｒｙ）遺
伝子から得られたターミネータをバチルス・リヘニホル
ミス（Ｂ、　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のベリ
シリナーゼ遺伝子等と連結し、宿主内での機能を検討し
た結果、ターミネータがｍＲＮＡの安定性に寄与するこ
と（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、
　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、　８３．３２３３−３２３７、　
Ｍａｙ　（１９８Ｂ））や、バチルＸ争７ミｏｌＪ＋７
１シエンス（Ｂ、　ａＢｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｌｅｎｓ
）中性プロテアーゼのプロモータの下流に、ヒト成長ホ
ルモンを連結し、更にその下流に中性プロテアーゼ遺伝
子のターミネータ−を連結すると、ターミネータ−が存
在しない場合に比べて、その発現分泌が増大することが
報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｌｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、　８．１２３−１３４　（１９８８）
）。

しかしながら、α−アミラーゼの発現性を高めるため、
最も活性が強いとされるａ■ｙＲ２タイプの制御部位を
有するα−アミラーゼ遺伝子を、枯草菌の多コピープラ
スミドであるｐＵＢ　１１０にクローニングしても、プ
ラスミドのコピー数が約４０〜５０コピー存在している
にも拘らず、α−アミラーゼ活性は染色体供与体の約２
０倍程度にしかならない。

従って、本発明の目的は、宿主に導入し、宿主細胞内で
α−アミラーゼを効率的に多量に生産させる上で有用な
新規プラスミドを提供することにある。

［発明の構成］本発明者らは、α−アミラーゼ構造遺伝子の下流に存在
するステム・アンド・ループ構造を含む特定の塩基配列
がα−アミラーゼ活性に大きく影響することを見出し、
本発明を完成した。すなわち、本発明は、制御遺伝子ａ
ｍｙＲの下流に、α−アミラーゼ構造遺伝子ａｍｙＥと
、ステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列とを有す
る環状プラスミドであって、ステム・アンド・ループ構
造を含む塩基配列が下記式（１）％式％ＴＧＡＴＧＡＡ　ＣＡＡＡＣ（１）（式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）で表される新規プラスミドにより、上記
課題を解決するものである。

また本発明は制御遺伝子ａｍｙＲ２又はａ■ｙＲ３の下
流に、α−アミラーゼ構造遺伝子ａｍｙＥと、ステム・
アンド・ループ構造を含む塩基配列とを有する環状プラ
スミドであって、ステム・アンド・ループ構造が、少な
くとも下記式（１１％式％）（式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）で表されるステム・アンド・ループ構造
を含む塩基配列とを有する新規プラスミドにより、上記
課題を解決するものである。

なお、ａ−アミラーゼ活性を高めるには、ステム・アン
ド・ループ構造を含む塩基配列が式（Ｉ）で表される塩
基配列を有するのが好ましい。

本明細書において、塩基配列における核酸の表示はＩ　
ＵＰＡＣにより採択されている表示法に従うものとする
。

本発明のプラスミドの制御遺伝子ａ■ＦＲは、特に限定
されず、前記ａｍｙＲ１タイプ、ａｓｙＲ２タイプ及び
ａｍｙＲａタイプのいずれであってもよい。

これらの制御遺伝子は公知の菌株に存在し、プロモータ
として機能する。上記制御遺伝子ａ＊ｙＲ１は、例えば
、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｌｓ　１８ｇ及びＢ、　５ｕｂｔ
ｌｌｉｓ８１８０株等に由来する。制御遺伝子ａｓｙＲ
２は、例えばＢ、　ｎａｔｔｏ　ＩＡＭ１２１２、Ｂ、
　５ｕｂｔｌｌｉｓ　Ｎ７、Ｂ、　５ｕｂｔ１１１ｓ　
１Ａ４１２株（オハイオ大学のＴｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　Ｇｅｎｅｔｌｃ　５ｔｏｃｋ　ｃｅｎｔｅｒより入
手可能である）等に工業技術研究所に微工研菌寄第３３
４４号、第３３４５号として寄託されている）等に由来
する。

これらの制御遺伝子ａｍｙＲのうちα−アミラーゼ活性
の高い制御遺伝子ａｍｙＲ２及びａＩｌｙＲ３が好まし
い。制御遺伝子ａｍｙＲ２は、α−アミラーゼ遺伝子上
流にステム・アンド・ループ構造の下記塩基配列ＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴ　　ＴＴＴＴＴＧＴＴＴ（式中、
矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりうる部位を
示す）を有する（　Ｙａｓａｚａｋｌ　ｅｔａｌ、　Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５８．３２７−８８７
　（１９８３）参照）。

上記制御遺伝子の下流にはα−アミラーゼ構造遺伝子ａ
■ｙＥが近接して存在する。α−アミラーゼ構造遺伝子
ａｍｙＥは前記Ｍタイプの構造遺伝子ａ■ＦＥ■であっ
てもよいが、α−アミラーゼ活性の点で４７７アミノ酸
からなるα−アミラーゼをコードする構造遺伝子が好ま
しい。この４７７アミノ酸からなるα−アミラーゼをコ
ードする構造遺伝子には、前記Ｎタイプの構造遺伝子ａ
■ｙＥｎ及びＳタイプの構造遺伝子ａｍｙＥｓが含まれ
る。

そして、α−アミラーゼ構造遺伝子ａｎｙ　Ｅの下流に
は、前記式（Ｉ）で表されるステム・アンド・ループ構
造を含む塩基配列が存在する。このステム・アンド・ル
ープ構造が存在すると、α−アミラーゼ活性が著しく高
まる。

なお、制御遺伝子がａｓｙＲ２又はａｓｙＲｉｌタイプ
であり、α−アミラーゼ構造遺伝子がα−アミラーゼ構
造遺伝子ａａｙＥ、特に４７７アミノ酸からなるα−ア
ミラーゼをコードする構造遺伝子ａ■ｙＥｎ及び構造遺
伝子ａｍｙＥｓである場合、少なくとも前記式〔Ｉ〕で
表されるステム・アンド・ループ構造を有する塩基配列
、特に前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ループ
構造を含む塩基配列が好ましい。なお、このステム・ア
ンド・ループ構造の塩基配列はターミネータとして機能
するようである。

なお、制御部位を構成する制御遺伝子ａｍｙＲ以外の制
御遺伝子には、アミラーゼ及びプロテアーゼの産生を同
時に制御する遺伝子ｐａｐ　、抗生物質チュニカマイシ
ン（ｔｕｎｉｅａＩｙｃｉｎ）抵抗性をコードする耐性
遺伝子ｔ■ｒ１遺伝子５ａｃＵやオペレータ等が含まれ
る。

さらには、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に、シャイン・
アンド・ダルガーノ（ＳＤ）塩基配列が存在していても
よく、制御部位は約−１０領域のプリブノーボックス（
Ｐｒｉｂｎｏｗ　ｂｏｘ）やこれと相同の塩基配列ＴＡ
ＡＡＡＴ　（ａｎｙ　Ｒｌの場合はＴＴＡＡＡＴ）、約
−３５領域やこれと相同の塩基配列ＴＴＧＡＴＡを含ん
でいる。また翻訳開始コドンの下流側にはオーブン・リ
ーディング・フレームが存在していてもよい。

構造遺伝子ａｍｙＥは翻訳終止コドンＴＡＡ、ＴＡＧＳ
ＴＧＡに近接している。なお、終止コドンとステム・ア
ンド・ループ構造との間にはスペーサが介在していても
よい。

第１図に本発明の新規プラスミドｐＭＤ４９０（１９８
９年２月２−３日付けにて微生物工業技術研究所に寄託
された微工研菌寄第１０５５９号）の制限酵素地図、第
２図に本発明の他の新規プラスミドｐＴＵＢ１２５の制
限酵素地図を示す。なお、これらの制限酵素地図は、ベ
クターとして用いたｐＵＢ１１０上のＥｃｏＲＩサイト
を起点として示している。またＥｃｏＲＩサイトを起点
とする上記制限酵素地図において断片の分子量は約±０
．２Ｋｂの範囲内に収まる。

本発明の新規プラスミドは、次のような特徴を有する。

（１）アガロースゲル電気泳動法による分子量＝（Ａ）
プラスミドｐＭＤ４９０は約８．８Ｋｂ。

（Ｂ）プラスミドｐＴＵＢ１２５は約８．ＩＫｂの分子
量を有する。

（２）制限酵素による切断性：（Ａ）プラスミドｐＭＤ４９００と２，６ＫｂにＥｃｏＲＩ切断部位が存在する。

制限酵素ＥｃｏＲＩで処理することにより、約２゜６Ｋ
ｂと約６．２Ｋｂの２つの断片に切断される。

制限酵素Ｂｅ１ｌで約２．ＩＫｂと約６．７Ｋｂの２つ
の断片に切断される。

（Ｂ）プラスミドｐＴＵＢ１２５０と１．９ＫｂにＥｃｏＲＩ切断部位が存在する。

制限酵素ＥｃｏＲＩで処理することにより、約１゜９Ｋ
ｂと約６．２Ｋｂの２つの断片に切断される。

（３）薬剤耐性：いずれのプラスミドもカナマイシンに
対して抵抗性を示す。従って、本発明のプラスミドを導
入した宿主は、１５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有す
る培地、例えばＬＢ培地で生育可能である。

（４）コピー数：本発明のプラスミドのコピー数はいずれも約４０〜５０
である。

なお、ｐＴＵＢ１２５において翻訳終止コドンＴＧＡ以
降の下流領域のステム・アンド・ループ構造を含む塩基
配列は下記式圓に示される通りである。

ＴＧＡ　ＴＣＡＡＣＴＧＡＣＧ　ＡＴＴＡＣＣＴＴＧＣ
ＧＴＧＣＡＡＡＴＧＣＧＡＡＴＡＣＡＡＣＡ　　Ａ＾＾
ＧＣＣＧＴＴＴ　　ＡＴＣＡＡＡＴＣＡＡ　　ＴＡＡＴ
ＧＧＡＣＣＡ　　ＧＡＧＡＣＧＧＣＧＴ　　ＴＴＡＡＧ
ＧＡＴＧＧ　　ＡＧＡＴＣＡＡＴＴＣＡＣＡＡＴＣＧＧ
ＡＡ　　ＡＡＧＧＡＧＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＣＡＡ　
　ＡＡＣＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴＡＡ　　ＡＡ
ＧＧＡＡＣＧＡＡ　　ＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴ　　ＧＴＡ
ＡＣＧＡＧＧＧ　　ＣＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＧＧＣＴ
ＡＴＣＡＡＡ　　ＡＴＣＣＧＡＡＴＣＡ　　ＴＴＧＧＡ
ＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴ　　ＡＴＡＴＣＴＡＴ
ＡＡ　　ＡＣＡＴＧＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＡ　　ＴＴＧＡＡＴＴＧＡＣＣＧＧＡＴＣＴＴＧＧ　　
ＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＣＡＣＴＡＡ　　ＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴ　　ＧＧＡＡＴＴＴＡ
ＣＡ　　ＣＧＣＴＧＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＡＴＡＣＡＡ　　ＣＣＡＡＣＧＣＣ
ＡＡ　　ＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＣＣＡＡＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡ　　ＣＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＧＴＴ
ＴＡＴＡＴＡＡＴＧＡＣＴＣＧＧＧＣＴＴＡＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＡＧＡＴＴＴＴ　　ＧＴＴＣＡＴＡＡＡＴ　　ＣＡＧＡＣＡＡ
ＡＡＣＴＴＴＴＣＣＣＴＴＧ　　ＣＡＡＡＡＴＡ　　Ｃ
ＡＧＣＴＴＴＧＴＴ　　ＡＡＡＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＣ
ＴＴＣＧＧＣＣＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧ　　ＴＧＡＡＧＧ
ＧＴＴＧ　　ＣＡＣＡＡＴＡＴＡＡ　　ＡＴＧＴＧＡＡ
ＡＴＡ　　ＣＴ÷−一一一一−−−− ＴＣＡＣＡＡＡＧ　　ＡＡＡＡＡＧＡＣＧＡ　　ＴＣＡ
ＡＡＧＡＧＡＧ　　ＡＣＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＡ
ＴＧＡＴ　　ＴＡＡＴＧＡＴＧＡＡ　　ＣＡＡＡＣＡＴ
ＧＴＡ　　ＡＡＴＡＡＡＧＴＡＧＣＴＴＴＡＡＴＣＧＧ
ＡＣＧＴＴＴＴ圓本発明の新規プラスミドを、宿主内に
導入すると、染色体中にα−アミラーゼ遺伝子を１コピ
ー有するα−アミラーゼ遺伝子供与株の１００倍以上の
α−アミラーゼを生産させることができる。

なお、ｐＴＵＢ１２５にクローニングされた断片のうち
前記式圓で表されるステム・アンド・ループ構造を含む
側の末端から０．９Ｋｂ欠失させた環状プラスミド、す
なわち前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ループ
構造を含む塩基配列を有する環状プラスミドはα−アミ
ラーゼ活性が高い。

これに対して前記式圓の下流側末端から１．ＩＫｂ欠失
させると、前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ル
ープ構造の塩基配列が欠失し、α−アミラーゼ活性が著
しく低下する。

本発明の新規プラスミドが導入される宿主としては、菌
体外にα−アミラーゼを多量に分泌生産する枯草菌が好
ましい。

本発明の新規プラスミドは、従来公知のバチルス番ズブ
チリス（Ｂａｅｌｌｌｕｓ　５ｕｂｔ１１ｓ）　１．：
属する菌株のうち、制御遺伝子ａｍｙＲ及びα−アミラ
ーゼ構造遺伝子ａｍｙＥを有する菌株のＤＮＡ断片と、
構造遺伝子ａＢＥ及び前記式（１）又は（ＩＩ）で表さ
れるステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列を有す
る菌株のＤＮＡ断片とを連結することにより調製できる
。

より具体的には、本発明の新規プラスミドのうち、制御
遺伝子ａｍｙＲ３と構造遺伝子ａｍｙＥｓと前記式〔Ｉ
〕で表されるステム・アンド・ループ構造を含む塩基配
列とを有するプラスミドｐＴＵＢ１２５は、Ｂ、　５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ　Ｔ２Ｎ２８株（微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第３３４５号として寄託されている）の染色
体ＤＮＡを多コピープラスミドに組込むことにより調製
できる。

Ｂ、　５ｕｂｔｌｌｓ　Ｔ２Ｎ２８株からの染色体ＤＮ
Ａの抽出は、菌株を培養した後、集菌し、慣用の方法、
例えば、斉藤・三浦法（Ｈ，５ａ１ｔｏ、　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｂｌｏｃｈｅｓ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　ａｃｔａ
、、　７２．８１９　（１９６８）　）により行なうこ
とができる。なお、抽出された染色体ＤＮＡは、制御遺
伝子ａｍｙＲ８と構造遺伝子ａｍｙＥｓと前記式〇）で
表されるステム・アンド・ループ構造の塩基配列を含ん
でいる。

次いで、α−アミラーゼ染色体ＤＮＡをクローニングす
るため、上記染色体ＤＮＡを制限酵素で部分消化する。

制限酵素による部分消化は、慣用の方法で行なうことが
できる。また部分消化した染色体ＤＮＡを単離する。染
色体ＤＮＡは、有機溶媒、例えばフェノール、クロロホ
ルム、イソアミルアルコールやこれらの混合溶媒で抽出
し、エタノール、イソプロパツール等の低級アルコール
で沈澱させることにより単離できる。

一方、クローニングベクターとして抗生物質耐性マーカ
ーを有する多コピープラスミドを用い、該クローニング
ベクターを、制限酵素で消化、分解し、単離した上記染
色体ＤＮＡをＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４　ＤＮＡ
リガーゼで連結する。

なお、クローニングベクターとしては、公知のＢ。

ｓｕｂ口ｌｓ株を抗生物質を含む培地で培養し、菌体か
らアルカリ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、
　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｌｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｌｓ、　ｐ９０．
　（１９８２））で抽出した種々の公知のベクターが使
用できるが、例えばカナマイシン耐性遺伝子を有するｐ
ＵＢＩＩＯが好ましい。ｐＵＢｌｌｏは、Ｂ、　５ｕｂ
ｔ１１ｓ　ＩＯ２株（オハイオ大学のＴｈｅ　Ｂａｃｌ
ｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　ｃｅｎｔｅｒ
より入手可能である）から抽出して得られる分子量４．
５Ｋｂの公知の多コピープラスミドであり、米国シグマ
社から販売されている。

連結したＤＮＡを宿主に導入し、α−アミラーゼ遺伝子
を有する形質転換菌株をスクリーニングする。宿主とし
てはα−アミラーゼ折損株であれば特に制限されず、例
えば枯草菌、大腸菌、酵母などの菌株から適宜選択でき
る。上記宿主のうちＢ、　５ｕｂｔｌｌｓ　ｌＡ２８９
株（オハイオ大学のＴｈｅ　Ｂａｃｌｌｌｕｓ　Ｇｅｎ
ｅｔｌｃ　５ｔｏｃｋ　ｃｅｎｔｅｒより入手可能であ
る）が有利である。宿主へのＤＮＡの導入は、例えば、
プロトプラストトランスフォーメーション法（Ｓ。

Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、
　Ｇｅｎｅｔ、、　１８８．１１１（１９７９））等の
慣用の方法で行なうことができる。

またスクリーニングは、抗生物質を含む培地で培養し、
抗生物質に対する耐性、アミラーゼ生産性ａｍ）ｌ’十
を示す株をコロニーとして選択することにより行なわれ
る。

このようにして調製したプラスミドｐＵＴＢ１２５を制
限酵素ＥｃｏＲＩで切断した断片のうち、約６．２Ｋｂ
の断片は、α−アミラーゼ遺伝子の下流部分と翻訳終止
部位から約１．６Ｋｂ下流までを含む断片である。

また本発明の新規プラスミドのうち制御遺伝子ａｓｙＲ
２と４７７アミノ酸からなるα−アミラーゼをコードす
る構造遺伝子と前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド
φループ構造とを有するプラスミドであるｐＭＤ４９０
は、上記プラスミドｐＵＴＢ１２５と、Ｂ、　５ｕｂｔ
ｉｌｓ　ｌＡ４１２株（オハイオ大学のＴｈｅ　Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　ｃｅｎｔｅ
ｒより入手可能である）の染色体ＤＮＡを上記多コピー
プラスミドｐＵＢ１１０に組込んだプラスミドｐＤＣＡ
１００とをそれぞれ制限酵素で処理して切断し、得られ
た断片を組換えてＴ４　ＤＮＡリガーゼで連結すること
により製造できる。

なお、プラスミドｐＤｃＡ１００は、前記Ｂ、　５ｕｂ
ｔｉｌｓ　Ｔ２Ｎ２６株に代えてＢ、　５ｕｂｔｌｌｓ
　１Ａ４１２株を用いる以外、上記プラスミドｐＴＵＢ
１２５の調製と同様にして調製することができる。なお
、上記Ｂ、　５ｕｂｔｌｌｓ　１Ａ４１２株から抽出さ
れた染色体ＤＮＡは、制御遺伝子ａｓｙＲ２と構造遺伝
子ａｍｙＥ■とを含んでいる。プラスミドｐＤｃＡ１０
０の分子量は約７．５Ｋｂであり、制限酵素ＥｅｏＲＩ
で約２゜６Ｋｂの断片と約４．９Ｋｂの断片に切断され
る。

約２．６Ｋｂの断片は制御遺伝子ａｙｒｙＲ２を含むα
−アミラーゼ遺伝子の上流部分の断片である。

そして、プラスミドｐＵＴＢ１２５を含む株とプラスミ
ドｐＤｃＡ１００を含む株とを培養し、プラスミドを抽
出し、それぞれ制限酵素ＥｅｏＲＩで切断する。次いで
ｐＴＵＢ１２５の約６．２Ｋｂの断片とｐＤｃＡｌｏｏ
の約２．６Ｋｂの断片とを、分離、精製し、単離する。

そして、上記断片をＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４　
ＤＮＡリガーゼを用いてインキエベートして連結し、α
−アミラーゼ欠損株である前記と同様の宿主にプロトプ
ラストトランスフォーメーション法等により導入し、前
記と同様にして、抗生物質耐性及びアミラーゼ生産性ａ
ｌｙ＋を示す株をスクリーニングすることにより、キメ
ラ型α−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＭＤ４９
０が得られる。

なお、制限酵素により消化及び切断された断片の分離、
精製には、従来公知の分離、精製法、例えば、塩析、溶
媒沈澱法などの溶解度差を利用する方法、透析法、限外
濾過法、ゲル濾過法、５ＤＳ−アガロースゲル電気泳動
法、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主
として分子量差を利用する方法、電気溶出（ｅｌｅｃｔ
ｒｏ　ｅｌｕｔｌｏｎ）法、イオン交換クロマトグラフ
ィー等の荷電差を利用する方法、アフィニティークロマ
トグラフィー等の親和性を利用する方法、逆相高速液体
クロマトグラフィー等の疎水性差を利用する方法等や、
これらを組合せた方法が利用できる。

本発明の新規プラスミドの塩基配列は、従来慣用の塩基
配列決定法、例えば、マキサム−ギルバート法（Ｍａｘ
ａｇ＋−Ｇｉｌｂｅｒｔ、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、、　　８５゜４９９−５６０　（１９８Ｇ）
）　、ジデオキシ鎖終結法（Ｓａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ、
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ１．、　Ｕ
ＳＡ　７４．５４１１：ｌ−５４８７（１９７７））な
どの方法で決定することができる。

なお、上記の例ではプラスミドｐＴＵＢ１２５及びｐＭ
Ｄ４９０の場合を例にとって説明したが、制御遺伝子ａ
ｓ＋ｙＲ，構造遺伝子ａ■ＦＥ及び前記式〔Ｉ〕で表さ
れるステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列に対応
した遺伝子を含む菌株を用い、上記と同様に処理するこ
とにより、種々の遺伝子の組合せからなるプラスミドを
構築できる。

また前記式〔Ｉ〕で表されるステム争アンドーループ構
造を含む塩基配列を有するプラスミドは、上記のように
して得られたプラスミドのうち弐〇】で表されるステム
・アンド・ループ構造を含む塩基配列の下流を制限酵素
、例えば制限酵素旧ｎｄｍやＫｐｎ　Ｉ等で切断し、所
定領域欠失させ、ＤＮＡ断片を除去すると共に、従来慣
用の方法で末端を連結することにより構築できる。なお
、欠失には、例えばエキソヌクレアーゼｍ、Ｓ＋　ヌク
レアーゼ、Ｂａ１８１エキソヌクレアーゼ等が使用でき
る。また制限酵素旧ｎｄＩ［［やにｐｎｌ等の認識部位
が存在しない場合、例えば、上記制限酵素の認識部位を
有する合成りＮＡを連結し、合成りＮＡを制限酵素旧ｎ
ｄｌｌＩ等で切断し、上記エキソヌクレアーゼ■等で欠
失させてもよい。また切欠した末端を、従来慣用の方法
、例えば、ヌクレアーゼで平滑末端化し、クレノーフラ
グメントで修飾し、リガーゼで連結してもよい。

［発明の効果］以上のように、本発明の新規プラスミドによれば、ステ
ム・アンドΦループ構造を含む塩基配列を有するので、
宿主に導入することにより、宿主細胞内でα−アミラー
ゼを効率よく多量に生産させることかできる。

［実施例〕以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する
。

実施例１プラスミドｐＴＵＢ１２５の構築（１）染色体の抽出Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｓ　Ｔ２Ｎ２６株（微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第３３４５号として寄託されている
）をＬＢ培地（バクトドリブトン（Ｂａｃｔｏｔｒｙｐ
ｔｏｎｅ）１重量％、イースト抽出物０．５重量％、塩
化ナトリウム０．５重量％含有）１０ｍｌで１６時間培
養し、温度４℃、回転数３００Ｏｒｐｍで２０分間遠心
分離して集菌した。得られた菌体から前記斉藤・三浦法
で染色体ＤＮＡを抽出した。

（２）制限酵素５ａｕｌＡＩによる部分消化α−アミラ
ーゼ遺伝子をクローニングするため、得られた染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素５ａｕＳＡＩ　（ＴＡＫＡＲＡ酒造■製
）で次のようにして部分消化した。すなわち、得られた
染色体ＤＮＡ３μｇを、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７
，５）　、７ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭの塩
化ナトリウムからなる緩衝溶液１００μＪに懸濁し、１
０Ｕ（単位）の制限酵素５ａｕａＡＩを加え、温度３７
℃で１〜５分間インキユベションした。次いで試料と等
量のフェノール１００μＪを加え撹拌した後、回転数１
５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上層を容器（エッ
ベルドルフチューブ）に採取し、フェノール抽出した。

上層をエタノールで沈澱させ、回転数１５０００ｒｐ■
で２０分間遠心分離し、上清を捨て、乾固し、ＴＥ緩衝
溶液（１０ｍＭのトリス塩酸−１ｍＭのＥＤＴＡ　（ｐ
Ｈ７，５））１００μＪに懸濁した。

（３）枯草菌プラスミドｐＵＢ１１０の調製ベクターと
して用いたプラスミドｐＵＢ１１０の保持菌株であるＢ
、　５ｕｂｔｌｌｓ　１０６株はオハイオ大学のＴｈｅ
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　ｃ
ｅｎｔｅｒより入手した。このＢ、　５ｕｂｔＩＬｓ　
ＩＦ５株を、カナマイシン（Ｋｍ）を終濃度１５μｇ／
Ｊとなるように添加したＩＪのＬＢ培地で、０Ｄ６００
ｎｓ＋が０，５〜０．８になるまで培養し、得られた菌
体から前記アルカリ法によりプラスミドベクターｐＵＢ
１１０を抽出した。

（４）ベクターＤＮＡの制限酵素Ｂａｇ旧による消化と
分解５μｇのプラスミドベクターｐＵＢ１１０を、１０ｍＭ
のトリス塩酸（ｐＨ８，０）　、７ｍＭの塩化マグネシ
ウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭの２−メル
カプトエタノール、ｏ、ｏｉ重量％のウシ血清アルブミ
ンからなる１衝溶液に懸濁した。１０Ｕ（単位）の制限
酵素ＢａｍＨＩ　　（ＴＡＫＡＲＡ酒造■製）を添加し
、温度３０℃で２時間反応させ、さらにＩＵ（単位）の
アルカリフォスファターゼを加え、温度６５℃で３０分
間加熱した。

フェノール抽出を３回行ない、エタノールで沈澱させ、
１００μＪのＴＥ緩衝溶液に懸濁し、ベクターＤＮＡと
した。

（５）染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　−５ａｕ８Ａ１部分消化物と
ベクターＤＮＡとの連結ベクターＤＮＡ　１８　ｇ、染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　−５ａ
ｕａＡ１部分−消化物１μｇを６６ｍＭのトリス塩酸（
ｐＨ７．６）　、６．６ｍＭの塩化マグネシウム、１０
ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰからなる緩衝溶液に
懸濁し、３５０Ｕ　（単位）のＴ４　ＤＮＡリガーゼを
添加し、温度１６℃で１６時間反応させた。

（６）枯草菌宿主への導入とα−アミラーゼ遺伝子のス
クリーニング上記（５）で得たＤＮＡをα−アミラーゼ欠損株である
Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｓ　ｌＡ２８９株（オハイオ大学の
ＴｈｅＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ
　ｃｅｎｔｅｒより入手可能である）に前記プロトプラ
ストトランスフォーメーション法により導入し、カナマ
イシン１５０μｇ／　ｍｌ　、可溶性デンプン１重量％
を含むＤＭ３プレート上で、カナマイシン耐性Ｋｍ’　
、アミラーゼ生産性ａｍ）ｌ＋を示す株をスクリーニン
グした。約５０００株のＫｍ’株から１株のアミラーゼ
生産株を得た。

このようにして得た株より、ａｍｙＲｉｌタイプの制御
部位を有するアミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＴＵ
Ｂ１２５を得た。

このプラスミドｐＴＵＢ１２５は約３．６Ｋｂの染色体
遺伝子断片がクローニングされており、各種制限酵素に
よる消化及びＤＮＡシークエンスの結果、ａｓｙＲ１１
タイプの制御部位を有し、４７７のアミノ酸からなるＳ
タイプのα−アミラーゼ遺伝子の存在が確認された。プ
ラスミドｐＴＵＢ１２５は前記式圓で表される塩基配列
を有していた。第２図にプラスミドｐＴＵＢ１２５の制
限酵素地図を示す。

実施例２プラスミドｐＤｃＡ１００の調製上記実施例１のステップ〔Ｉ〕で用いたＢ、　５ｕｂｔ
ｉＩｓ　Ｔ２Ｎ２８株に代えて、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｓ
　１Ａ４１２株（オハイオ大学のＴｈｅ　Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　ｃｅｎｔｅｒより
入手可能であるを用いる以外、上記プラスミドｐＴＵＢ
１２５の調製と同様の手順でプラスミドｐＤｃＡ１００
を調製した。

このプラスミドｐＤｃＡ１００は約３．ＯＫｂの染色体
遺伝子断片がクローニングされており、各種制限酵素に
よる消化及びＤＮＡシークエンスの結果、ａｍｙＲＺタ
イプの制御部位を有し、５６１のアミノ酸からなるＭタ
イプのα−アミラーゼ遺伝子の存在が確認された。第３
図にプラスミドｐＤｃＡ１００の制限酵素地図を示す。

プラスミドｐＭＤ４９０の構築（１）プラスミドの抽出プラスミドｐＴＵＢ１２５を含む株とプラスミドｐＤｃ
Ａ１００を含む株とをそれぞれ１０１００Ｏ培養し、前
記アルカリ法によりプラスミドを抽出した。

（２）制限酵素ＥｅｏＲ１による切断１０μｇのプラスミドｐＴＵＢ１２５を、１００ｍＭの
トリス塩酸（ｐＨ７，５）　、７ｍＭの塩化マグネシウ
ム、５０　ｍ　Ｍの塩化ナトリウム、７ｍＭの２−メル
カプトエタノール、０．０１重量％のウシ血清アルブミ
ンからなる緩衝溶液１００μＪに懸濁した。次いで、５
０Ｕ（単位）の制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（ＴＡＫＡＲＡ
酒造■製）を添加し、温度３７℃で３時間かけて切断し
たところ、約１．９Ｋｂの断片と約６，２Ｋｂの断片に
切断されていた。

上記断片のうちα−アミラーゼ構造遺伝子の下流部分と
、さらにその下流部分、すなわちステム・アンド・ルー
プ構造とを含む断片は約６．２Ｋｂの断片であった。

またプラスミドｐＤｃＡ１００も同様にして制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断したところ、約２．６Ｋｂの断片と、約
４．９Ｋｂの断片に切断されていた。

上記断片のうちａｍｙＲＺタイプの制御部位とα−アミ
ラーゼ構造遺伝子の上流部分とを含む断片は、約２．６
Ｋｂの断片であった。

そこで、０．８重量％アガロースゲル電気泳動により、
上記断片を分離し、透析膜を用いた電気溶出（ｅｌｅｃ
ｔｒｏ　ｅｌｕｔｉｏｎ）法により、目的とする断片を
単離した。なお、アガロースゲル電気泳動及び電気溶出
は、常法に従って行なった。

次いで、ｐＴＵＢ１２５の約６．２Ｋｂの断片とｐＤｃ
Ａｌｏｏの約２．６Ｋｂの断片とを、６６ｍＭのトリス
塩酸（ｐＨ７，６）　、６．６ｍＭの塩化マグネシウム
、１０ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰｌｏｏｍｌか
らなる緩衝溶液に懸濁し、７００Ｕ　（ユニット）の７
４　ＤＮＡリガーゼ（ＴＡＫＡＲＡ酒造■製）を添加し
、温度１６℃で１６時間インキュベートした。

得られた連結サンプルを宿主Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｓ　ｌ
Ａ２８９株に前記プロトプラストトランスフォーメーシ
ョン法により導入し、前記と同様にして、カナマイシン
耐性Ｋｍｒ、アミラーゼ生産性ａｓｙ＋を示す株をスク
リーニングし、プラスミドｐＭＤ４９０を得た。このプ
ラスミドｐＭＤ４９０は制限酵素ＥｃｏＲＩにより、約
２．６Ｋｂと約６．２Ｋｂに切断された。プラスミドｐ
ＭＤ４９０は前記式圓で表される塩基配列を有していた
。第１図にプラスミドｐＭＤ４９０の制限酵素地図を示
し、第４図にプラスミドｐＤｃＡ１００とプラスミドｐ
ＴＵＢ１２５とからプラスミドｐＭＤ４９０を構築する
工程図を示す。

なお、前記各実施例における制限酵素５ａｕ３ＡＩ、Ｂ
ａａ旧、ＥｃｏＲＩの活性は、各酵素反応液５ＯｕＪ中
、温度３７℃、１時間で１μｇのλＤＮＡを完全に分解
する酵素量をＩＵとした。アルカリフ矛スファターゼの
活性は、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを基質として
、温度２５℃、ｐＨ８，０において１分間に１μ■ｏｌ
ｅのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素活性をＩＵ
とした。またＴ４ＤＮＡリガーゼの活性は、６μｇ／２
０μＪのλＤ　Ｎ　Ａ　−Ｈ１ｎｄｍ分解物を、温度１
６℃で３０分間に９０％以上連結させる酵素活性をＩＵ
とした。

実施例３欠失変異プラスミドを導入した株の調製ステム・アンド
・ループ構造の有用性を確認するため、実施例１で得た
プラスミドｐＴＵＢ１２５のうち前記式圓で表されるス
テム・アンド・ループ構造を含む塩基配列を次のように
して欠失させた。第５図にプラスミドｐＴＵＢ１２５か
らプラスミドｐＴＵＢ１２５ＨＫと欠失変異株ｐＴＵＢ
１２５ＨＫｄを構築する工程図を示す。

（１）ｐＴＵＢ１２５への合成りＮＡの連結先ず、ｐＴ
ＵＢ１２５を、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，５）　
、７ｍＭの塩化マグネシウム、６０ｍＭの塩化ナトリウ
ム、７ｍＭの２−メルカプトエタノールからなる緩衝溶
液に懸濁し、プラスミドｐＴＵＢ１２５のうちブセスミ
ドｐＵＢ１１０に由来する切断部位を制限酵素Ｓｐ旧、
Ｐｖｕ　Ｕで切断し、前記実施例１のステップ（４）と
同様にしてＤＮＡ断片を単離し、ベクターＤＮＡとした
。

一方、制限酵素旧ｎｄｍ、Ｋｐｎｌの切断部位を有する
合成りＮＡをアブライドバイオシステムズ社のＤＮＡ合
成装置（モデル３８１Ａ）を用いて合成した。この合成
りＮＡは下記の塩基配列を有する。

５°　　　　　　ＡＡＡＧＣＴＴＣＧＡ　　ＡＧＧＴＡ
ＣＣＣＡＧ　　　３’８’　　　ＧＴＡＣＴＴＴＣＧＡ
ＡＧＣＴ　　ＴＣＣＡＴＧＧＧＴＣ５゜次いで、上記Ｄ
ＮＡ断片１μｇと合成りＮＮＡ３０ｎとを、実施例１の
ステップ（５）と同様にして、３５０Ｕ　（単位）のＴ
４　ＤＮＡリガーゼで連結させた。

（２）枯草菌宿主への導入とスクリーニング前記実施例
１のステップ（６）と同様にして、連結したＤＮＡを枯
草菌Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｓ　１Ａ２８９株に導入すると
共に、カナマイシン耐性Ｋｍ’　、°アミラーゼ生産性
ａｍｙ＋を示す株をスクリーニングし、プラスミドｐＴ
ＵＢ　１２５ＨＫを得た。なお、得られたプラスミドｐ
ＴＵＢ１２５ＨＫは、上記合成りＮＡのうち制限酵素旧
ｎｄｍ、にｐｎｌの認識部位で切断されることを予め確
認した。

（３）制限酵素にｐｎｌ、ＨｌｎｄＩＩＩによる切断プ
ラスミドｐＴＵＢ１２５ＨＫ１０μｇを１０ｍＭのトリ
ス塩酸（ｐＨ７，５）　、７ｍＭの塩化マグネシウム、
７ｍＭの２−メルカプトエタノール緩衝溶液１００μノ
に懸濁し、２００Ｕ　（単位）の制限酵素Ｋｐｎ　Ｉを
添加して、温度３７℃で４時間インキュベーションした
。またアガロースゲル電気泳動法により分別し、前記実
施例１のステップ（２）と同様にしてフェノール抽出、
エタノール沈澱処理を施しＴＥ緩衝溶液４５０μＪに懸
濁した。

次いで、１０°ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，５）、７ｍ
Ｍの塩化マグネシウム、６０ｍＭの塩化ナトリウムの緩
衝溶液と、１００Ｕ　（単位）の制限酵素旧ｎｄＩＩＩ
とを加えた。また温度３７℃で４時間イン’Ｐユベーシ
ョンして切断した後、前記実施例１のステップ（２）と
同様にしてフェノール抽出、エタノール沈澱処理を施し
、５０　ｍ　Ｍのトリス塩酸（ｐＨ８，０）　、５ｍＭ
の塩化マグネシウム及び１０ｍＭの２−メルカプトエタ
ノールの緩衝溶液１００μＪに懸濁した。

（４）３’末端の欠失１８０Ｕ　（単位）のエクソヌクレアーゼ■を添加し、
消化処理時間１分、２分、３分、３．５分、４分、５分
、５．５分、６分、７分毎に１０μＪサンプリングし、
３０　ｍ　Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）　、１０
０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの酢酸亜鉛、１０％の
グリセロールの緩衝溶液１００μＪに注入し、温度６５
℃で５分間処理した。次いで、各試料に１０Ｕ（単位）
のマングビーンヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｎ
ｕｃｌｅａｓｅ）を添加し、温度３７℃で２５分間かけ
て、末端平滑化処理した後、前記実施例１のステップ（
２）と同様にしてフェノール抽出、エタノール沈澱処理
を施し、洗浄し乾固した。

各試料に、６７ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７゜４）　
、６．７ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭの２−メルカ
プトエタノール及び３３μＭのｄＮＴＰｓの緩衝溶液５
０μＪを加え、２Ｕ（単位）のクレノーフラグメント（
Ｋｌｅｎｏｖ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ）を添加し、温度３７
℃で１０分間処理し、末端修飾した。

次いで、前記と同様にしてエタノール沈澱処理を施し、
洗浄し乾固し、ＴＥ緩衝溶液２０μＪに懸濁させた。

（５）連結上記ステップ（４）で得られた各り、ＮＡ１５μノに、
６６ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，６）　、６゜６ｍＭの
塩化マグネシウム、１０ｍＭのＤＴＴ。

０．１ｍＭのＡＴＰの緩衝溶液５ｔｔＪ、滅菌水２５μ
Ｊ及び１６５０Ｕ　（単位）のＴ４　ＤＮＡリガーゼを
添加し、温度１６℃で１６時間インキュベーションし、
末端を連結した。

（６）枯草菌宿主への導入とスクリーニング前記実施例
１のステップ（Ｂ）と同様にして、連結したＤＮＡを枯
草菌Ｂ、　５ｕｂｔｌｌｓ　ｌＡ２８９株に導入すると
共に、カナマイシン耐性Ｋｍ　　、アミラーゼ生産性ａ
ｍｙ＋を示す株をスクリーニングし、欠失度の異なるプ
ラスミドｐＴＵＢ１２５ＨＫｄ（ｄは欠失Ｎｏ、を示す
）を含む菌株を得た。

また塩基配列決定法により各プラスミドの塩基配列を決
定し、合成りＮＡの下流から１．ＩＫｂ欠失したプラス
ミド、すなわち前記式〔Ｉ〕で表される塩基配列が欠失
されていないプラスミドｐＴＵＢ１２５）ＩＫ１６を含
む菌株、合成りＮＡΦ下流から１．３Ｋｂ欠失したプラ
スミド、すなわち前記式〔Ｉ〕で表される塩基配列が欠
失したプラスミドｐＴＵＢ１２５ＨＫ１５を含む菌株を
選択した。

α−アミラーゼ生産性得られた５つのプラスミドｐＤｃＡ１００、ｐＴＵＢ１
２５、ｐＭＤ４９０、ｐＴＵＢ１２５ＨＫ、ｐＴＵＢ１
２５）ＩＫ１６、ｐＴＵＢ１２５ＨＫ１５を含む菌株の
α−アミラーゼ生産性を次のようにして調べた。

各プラスミドを含む菌株を５　ｍｌのＬＢ培地で１２時
間培養した後、１００　ｍｌのＬＢ培地（５００ｍｌ坂
ロフラスコ使用）に１％植菌し、温度３７℃、回転数１
２　Ｏｒｐｍの条件で１２時間往復振盪培養した。次い
で、１　ｍｌの培養液を１５００Ｏｒｐｍの回転数で５
分間遠心分離し、上清を酵素液とした。

酵素液中のα−アミラーゼ活性は可溶性デンプンを基質
とし、Ｈ，Ｐｕｗａ　（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、、　
４２．５８３（１９５４）の方法に従って測定した。な
お、α−アミラーゼ活性は、１分間に、基質としたスタ
ーチ（Ｓｔａｒｃｈ）の１％を消化する酵素活性をＩＵ
（単位）とした。結果を表及び第６図に示す。

表表より、前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ルー
プ構造を含む塩基配列を有するプラスミドはα−アミラ
ーゼを高発現することが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の新規プラスミドｐＭＤ４９０の制限酵
素地図、第２図に本発明の他の新規プラスミドｐＴＵＢ１２５の
制限酵素地図、第３図はプラスミドｐＤｃＡ１００の制限酵素地図、第４図はプラスミドｐＤｃＡ１００とプラスミドｐＴＵ
Ｂ１２５とからプラスミドｐＭＤ４９０を構築する工程
図、第５図はプラスミドｐＴＵＢ１２５からプラスミドｐＴ
ＵＢ１２５ＨＫ、欠失変異プラスミドｐＴＵＢ１２５Ｈ
Ｋｄを構築する工程図、第６図は各実施例におけるα−
アミラーゼ生産性の結果を示すグラフである。特許出願人　エム・デイ・リサーチ株式会社代　　理　
　人　　弁理士　　鍬　　　１）　　充　　　生図手続補正書（自発）平成１年４月２１日第図平成１年特許願第４９５４７号２、発明の名称新規プラスミド３、補正をする者事件との関係

Claims

【特許請求の範囲】１、制御遺伝子￥ａｍｙＲ￥の下流に、α−アミラーゼ
構造遺伝子￥ａｍｙＥ￥と、ステム・アンド・ループ構
造を含む塩基配列とを有する環状プラスミドであって、
ステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列が下記式〔
I 〕【遺伝子配列があります】〔 I 〕（式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）で表されることを特徴とする新規プラス
ミド。２、制御遺伝子￥ａｍｙＲ２￥または￥ａｍｙＲ３￥の
下流に、α−アミラーゼ構造遺伝子￥ａｍｙＥ￥と、ス
テム・アンド・ループ構造を含む塩基配列とを有する環
状プラスミドであって、ステム・アンド・ループ構造が
、少なくとも下記式〔II〕【遺伝子配列があります】〔
II〕（式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）で表されるステム・アンド・ループ構造
を含む塩基配列を有することを特徴とする新規プラスミ
ド。３、ステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列が式〔
I 〕で表される塩基配列である請求項２記載の新規プ
ラスミド。