JPS6024186A - 複合プラスミド - Google Patents
複合プラスミドInfo
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- JPS6024186A JPS6024186A JP5242583A JP5242583A JPS6024186A JP S6024186 A JPS6024186 A JP S6024186A JP 5242583 A JP5242583 A JP 5242583A JP 5242583 A JP5242583 A JP 5242583A JP S6024186 A JPS6024186 A JP S6024186A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
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- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は複合プラスミドに関する。
分子生物学の最近の進歩によって、種々の酵素やホルモ
ン等が遺伝子組換え技術により微生物内で生産される可
能性が生じた。本発明者等は、この技術を用いて微生物
に有用物質を生産させるだめの新しいベクターの探索・
開発を意図して研究の結果、バチルスサーキュランス由
来のアミラーゼ遺伝子を含む新しい複合プラスミドを開
発し、本発明を達成した。即ち、本発明の要旨は、バチ
ルスサーキュランス Ｆ２株、のアミラーゼ遺伝子を含
むＤＮＡを含有する複合プラスミドに存する。
ン等が遺伝子組換え技術により微生物内で生産される可
能性が生じた。本発明者等は、この技術を用いて微生物
に有用物質を生産させるだめの新しいベクターの探索・
開発を意図して研究の結果、バチルスサーキュランス由
来のアミラーゼ遺伝子を含む新しい複合プラスミドを開
発し、本発明を達成した。即ち、本発明の要旨は、バチ
ルスサーキュランス Ｆ２株、のアミラーゼ遺伝子を含
むＤＮＡを含有する複合プラスミドに存する。
本発明の詳細な説明するに、本発明におけるアミラーゼ
遺伝子は、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ） Ｆ ２株由来のものである
。
遺伝子は、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ） Ｆ ２株由来のものである
。
バチルスサーキュランス Ｆ、２株ｉｄ、巻、コ１０’
７〜．２／／！ｉ頁（／９ｇ、２年）に記載されてオシ
、バチルス属のバチルスサーキュランスの一菌株で次の
菌学的性質を有する。
７〜．２／／！ｉ頁（／９ｇ、２年）に記載されてオシ
、バチルス属のバチルスサーキュランスの一菌株で次の
菌学的性質を有する。
胞子形成能あり、側鞭毛あり。
生育温度 ＝ ３７℃で良好に生育し、Ａ５℃では生育
せず。
せず。
食塩濃度 ＝０．５飴で生育し、３％以上では生育せず
。
。
生化学的性質 −カタラーゼ反応陽性、好気性、硝酸還
元能なし、インドール生産ない ニュートリエンド・プロスト酵母エキスとグルコース培
地での生育 ：それぞれｏ、ｇ％、ｏ、ｓ％、７％で良
好に生育。
元能なし、インドール生産ない ニュートリエンド・プロスト酵母エキスとグルコース培
地での生育 ：それぞれｏ、ｇ％、ｏ、ｓ％、７％で良
好に生育。
本発明の複合プラスミドは、上記バチルスサーキュラン
スＦ、２株の染色体ＤＮ−Ａ上のアミラーゼ遺伝子を適
当なベクタープラスミドに挿入したものである。
スＦ、２株の染色体ＤＮ−Ａ上のアミラーゼ遺伝子を適
当なベクタープラスミドに挿入したものである。
適当なベクターとしては、例えば第１図に示すプラスミ
ドｐＬＢ３３０−’Ｉが挙げられる。ｐＬＥ１３．３０
−’ｌは、具体的には、後記実施例に示すようにして調
製される。即ち、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２およ
び枯草菌のプラスミドｐＵＢ／１０を、それぞれ制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断し、両者を混合し、Ｔ４ＤＮＡＩＪ
ガーゼで連結してプラスミドｐＬｓ３１０−２を調製す
る。ついでこれを枯草菌中に導入して、その一部が欠失
したプラスミドｐＬＳ ３ ／ ０△乙を採取し、制限
酵素Ｂａｍ Ｈ工で切断し、一方、黄色ブドウ状球菌の
１１ｍンスＰ２株のアミラーゼ遺伝子を挿入して゛本発
明の複合プラスミドを調製する方法につい、て説明する
に、まず、バチルス サーキュランスＦ２株を培養、集
菌し、常法により処理して染色体ＤＮＡ標品を採取する
。染色体ＤＮＡをＳａｕ ３ Ａで部分切断し、一方、
ｐＬｓ、？、？θ−ヶを５ｇ１■で切断し、両者を混合
してＴｌＤＮＡリガーゼで連結する。
ドｐＬＢ３３０−’Ｉが挙げられる。ｐＬＥ１３．３０
−’ｌは、具体的には、後記実施例に示すようにして調
製される。即ち、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２およ
び枯草菌のプラスミドｐＵＢ／１０を、それぞれ制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断し、両者を混合し、Ｔ４ＤＮＡＩＪ
ガーゼで連結してプラスミドｐＬｓ３１０−２を調製す
る。ついでこれを枯草菌中に導入して、その一部が欠失
したプラスミドｐＬＳ ３ ／ ０△乙を採取し、制限
酵素Ｂａｍ Ｈ工で切断し、一方、黄色ブドウ状球菌の
１１ｍンスＰ２株のアミラーゼ遺伝子を挿入して゛本発
明の複合プラスミドを調製する方法につい、て説明する
に、まず、バチルス サーキュランスＦ２株を培養、集
菌し、常法により処理して染色体ＤＮＡ標品を採取する
。染色体ＤＮＡをＳａｕ ３ Ａで部分切断し、一方、
ｐＬｓ、？、？θ−ヶを５ｇ１■で切断し、両者を混合
してＴｌＤＮＡリガーゼで連結する。
上記に得た複合プラスミドからアミラーゼ遺伝子を含む
複合プラスミドを選択、採取するために、これを形質転
換法により、予めｐＬＳ３ 、／ ０△６を導入したバ
チルスサテイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔ’１ｌ
ｉｓ ） ＭＯ？−２−、？ ／ （ａｒｏ 工９０乙
ｍｅｔＢ ａｍｙＲｕ ａｍｙＥＯ？ ）株（ＴＮ１
０乙株という）に導入してアミラーゼ活性を示す形質転
換株（ＴＮ！ｉ０／株という）をスクリーニング〜ｇ２
／頁（／ｑｑｇ年）に記載されている。ＴＮ！ｒＯ１株
を培養し、アミラーゼ活性を示す単一コロニ漠１分離、
複合プラスミドの採取、バチルスサ１１； −テイリスＭＯ？−２−３／株に導入し、形質転換株を
検定して、アミラーゼ遺伝子を含む本発明の複合プラス
ミド（ｐＭＡＳ１０／という）を確認し技術研究所に微
工研菌寄第６９９ｒ号として寄託されている。
複合プラスミドを選択、採取するために、これを形質転
換法により、予めｐＬＳ３ 、／ ０△６を導入したバ
チルスサテイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔ’１ｌ
ｉｓ ） ＭＯ？−２−、？ ／ （ａｒｏ 工９０乙
ｍｅｔＢ ａｍｙＲｕ ａｍｙＥＯ？ ）株（ＴＮ１
０乙株という）に導入してアミラーゼ活性を示す形質転
換株（ＴＮ！ｉ０／株という）をスクリーニング〜ｇ２
／頁（／ｑｑｇ年）に記載されている。ＴＮ！ｒＯ１株
を培養し、アミラーゼ活性を示す単一コロニ漠１分離、
複合プラスミドの採取、バチルスサ１１； −テイリスＭＯ？−２−３／株に導入し、形質転換株を
検定して、アミラーゼ遺伝子を含む本発明の複合プラス
ミド（ｐＭＡＳ１０／という）を確認し技術研究所に微
工研菌寄第６９９ｒ号として寄託されている。
以上のようにして得られた複合プラスミドｐＭＡｓ １
０／の分子量は、アガロースゲル電気泳動分析によシ測
定した結果、約５．９メガダルトン（？、０ｋｂ）であ
り、そのうち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の分
子量は／、ｌＩメガダルトン（，２，／ｋｂ）であった
。ｐＭＡＳ １０／の制限酵素地図を第２図に示す。第
２図において、二重線で示した部分（Ｂｇ：ｉｌｌによ
る切断部位からＳａｕ ３ Ａによる切断部位までの部
分）はアミンではない。
０／の分子量は、アガロースゲル電気泳動分析によシ測
定した結果、約５．９メガダルトン（？、０ｋｂ）であ
り、そのうち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の分
子量は／、ｌＩメガダルトン（，２，／ｋｂ）であった
。ｐＭＡＳ １０／の制限酵素地図を第２図に示す。第
２図において、二重線で示した部分（Ｂｇ：ｉｌｌによ
る切断部位からＳａｕ ３ Ａによる切断部位までの部
分）はアミンではない。
実施例／
（１） バチルスサーキュランスＦ２株ＤＮＡの採取イ
ン エンザイモロジー ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ａ ５巻、 ３’１ｇ
〜３！ｒＯ頁（／９’７９年）に記載の方法に従って、
３７℃で一夜間培養後、集菌し、ＴＥＳ緩衝液（ｕＯｍ
Ｍのトリス塩酸（ｐＨｇ、０ ） ／ ｍＭのエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および２０ ｍＭの塩化ナ
トリウムからなる〕で２回洗滌後、同緩衝液に懸濁する
。ついで、リゾチーム処理、リボヌクレア−ゼ処理、プ
ロナーゼおよび界面活性剤処理を行なって溶菌してＤＮ
Ａを抽出し、フェノールによる除蛋白処理を３回行なっ
た後、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、これを再びｊＥ
Ｓ緩衝液に懸濁し、同緩衝液に対しグ℃でグ時単位のＳ
ａｕ ３ Ａを用いて３７℃で３０分間反応させた。一
方、第１図に示す後記（８）の方法により調製したプラ
スミドｐＬｓ３３０−り（グ、５Ｍａ）、？μｇを５単
位の制限酵素Ｂｇ１■を用い３７℃で７時間反応させた
。Ｓａｕ ３ Ａで切断した染色体ＤＮＡ標品コ、りμ
Ｉを、：５ｇ１（Ｊで切断したｐＬｓ 、？ ３０−’
Ｉ （０３Ａｌｌと混合し、ＴＦ ＤＮＡリガーゼ０汀
単位を用い３℃でｉｔｇ時間反応させて連結した。
ン エンザイモロジー ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ａ ５巻、 ３’１ｇ
〜３！ｒＯ頁（／９’７９年）に記載の方法に従って、
３７℃で一夜間培養後、集菌し、ＴＥＳ緩衝液（ｕＯｍ
Ｍのトリス塩酸（ｐＨｇ、０ ） ／ ｍＭのエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および２０ ｍＭの塩化ナ
トリウムからなる〕で２回洗滌後、同緩衝液に懸濁する
。ついで、リゾチーム処理、リボヌクレア−ゼ処理、プ
ロナーゼおよび界面活性剤処理を行なって溶菌してＤＮ
Ａを抽出し、フェノールによる除蛋白処理を３回行なっ
た後、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、これを再びｊＥ
Ｓ緩衝液に懸濁し、同緩衝液に対しグ℃でグ時単位のＳ
ａｕ ３ Ａを用いて３７℃で３０分間反応させた。一
方、第１図に示す後記（８）の方法により調製したプラ
スミドｐＬｓ３３０−り（グ、５Ｍａ）、？μｇを５単
位の制限酵素Ｂｇ１■を用い３７℃で７時間反応させた
。Ｓａｕ ３ Ａで切断した染色体ＤＮＡ標品コ、りμ
Ｉを、：５ｇ１（Ｊで切断したｐＬｓ 、？ ３０−’
Ｉ （０３Ａｌｌと混合し、ＴＦ ＤＮＡリガーゼ０汀
単位を用い３℃でｉｔｇ時間反応させて連結した。
（３） Ｔ Ｎ ／ ｏ ｂ株（ｐＬｓ ３ ／ Ｏ△
Ａを含むバチ／ｌ／メサティリスＭＯ？−，２−３／株
）の調製バチルスサテイリスＭＯ’７−−−３７株をペ
ンアッセイブロス培地中で一夜間培養後、その０．／ｍ
！、を、必要な栄養を補足した３ｍｌのｃｌ培地（ハｌ
／、％のリン酸二カリ、０．６係のリン酸−カリ、θ、
２％の硫安、０．７％のクエン酸ナトリウム、、ｔｍＭ
の硫酸マグネシウム。
Ａを含むバチ／ｌ／メサティリスＭＯ？−，２−３／株
）の調製バチルスサテイリスＭＯ’７−−−３７株をペ
ンアッセイブロス培地中で一夜間培養後、その０．／ｍ
！、を、必要な栄養を補足した３ｍｌのｃｌ培地（ハｌ
／、％のリン酸二カリ、０．６係のリン酸−カリ、θ、
２％の硫安、０．７％のクエン酸ナトリウム、、ｔｍＭ
の硫酸マグネシウム。
０．５％のグルコース、０．０２％のカザミノ酸を含む
）に加え、３７℃で振盪培養する。定常期に入る直前（
１１，〜り時間後）に集菌し、１０づのｃｌ培地（カザ
ミノ酸の濃度が０．θ／係、補給アミノ酸の濃度が−
である以外は０ ＣＩ 培地と同じ組成）に移し、３７℃で７時間培養す
る。この培養液０．９コに、後述する（８）の方法で調
製したｐＬｓ Ｊ ／ ０△乙の溶液０．／ｌｎｌ （
／、７４ μｇＤＮＡ ）を加え３７℃で７時間保持後
、遠心分離により集菌し、／ｍｌのペンアッセイブロス
培地に懸濁し、３７℃で２時間培養する。このものをカ
ナマイシン（Ｓμｇ／−）を含むペンアッセイブロス培
地に塗布し、３７℃で一夜間培養し、生じたコロニーを
単離し、ＴＮ／θ乙株（ｐＬＳ ３ ／ ０△６を含む
）（チリスサテイリスＭＯ？−２−３／株）を得た。
）に加え、３７℃で振盪培養する。定常期に入る直前（
１１，〜り時間後）に集菌し、１０づのｃｌ培地（カザ
ミノ酸の濃度が０．θ／係、補給アミノ酸の濃度が−
である以外は０ ＣＩ 培地と同じ組成）に移し、３７℃で７時間培養す
る。この培養液０．９コに、後述する（８）の方法で調
製したｐＬｓ Ｊ ／ ０△乙の溶液０．／ｌｎｌ （
／、７４ μｇＤＮＡ ）を加え３７℃で７時間保持後
、遠心分離により集菌し、／ｍｌのペンアッセイブロス
培地に懸濁し、３７℃で２時間培養する。このものをカ
ナマイシン（Ｓμｇ／−）を含むペンアッセイブロス培
地に塗布し、３７℃で一夜間培養し、生じたコロニーを
単離し、ＴＮ／θ乙株（ｐＬＳ ３ ／ ０△６を含む
）（チリスサテイリスＭＯ？−２−３／株）を得た。
（４） ＴＮ／θ６株への複合プラスミドの導入（ＴＮ
！０７株の調製） 前記（２）で調製した複合プラスミドを、通常の形質転
換法によって前記（３）のＴＮｌＯＡ株へ導入した。即
ち、複合プラスミド溶液０．／ ｍｌ（／、ＳμｇＤＮ
Ａ）に、コンピテントなＴＮ１０Ａ懸濁液０％９ｍｌを
混合し、３７℃で７時間保持した後、集菌し、ペンアッ
セイブロスで７回洗滌後、’２ｍｌのペンアッセイブロ
ス培地に懸濁し、３７℃で２時間保持した。ついでこれ
をエリスロマイシン（２０μＥｌ／ｍｌ ） ヲ含ｔｒ
−＝−ニー） ＩＪエンドブロス澱粉培地に塗布し、
３７℃で一夜培養した。生じたコロニーにヨード液（０
，０２％のヨードを含む０．２％ヨウ化カリ溶液）を噴
霧し、アミラーゼ活性を検定した結果、アミラーゼ活性
を示す形質転換株−株を得て、これをＴＮ、ｔｏ／株と
名付けた。
！０７株の調製） 前記（２）で調製した複合プラスミドを、通常の形質転
換法によって前記（３）のＴＮｌＯＡ株へ導入した。即
ち、複合プラスミド溶液０．／ ｍｌ（／、ＳμｇＤＮ
Ａ）に、コンピテントなＴＮ１０Ａ懸濁液０％９ｍｌを
混合し、３７℃で７時間保持した後、集菌し、ペンアッ
セイブロスで７回洗滌後、’２ｍｌのペンアッセイブロ
ス培地に懸濁し、３７℃で２時間保持した。ついでこれ
をエリスロマイシン（２０μＥｌ／ｍｌ ） ヲ含ｔｒ
−＝−ニー） ＩＪエンドブロス澱粉培地に塗布し、
３７℃で一夜培養した。生じたコロニーにヨード液（０
，０２％のヨードを含む０．２％ヨウ化カリ溶液）を噴
霧し、アミラーゼ活性を検定した結果、アミラーゼ活性
を示す形質転換株−株を得て、これをＴＮ、ｔｏ／株と
名付けた。
（５） アミラーゼ遺伝子を含む複合プラスミドの分離
前記（４）で得だＴＮｊＴＯ，７株をエリスロマイシ、
ンを含むニュートリエンドブロス澱粉培地に塗布し、単
一コロニーを分離した。アミラーゼ活性を持つコロニー
を選び、エリスロマイシンを含むペンアッセイブロス培
地に植菌し、３７℃で一夜間培養し、集菌し、複合プラ
ス複合プラスミドの単離は１．ＡａｖａｎｃθｄＢ；
ｇ１’ｅ’ｒ’ｉ”ａ、奪ｎｅｔ エ′。’８ ／ ２
０〜／ ；ｉ ７頁（ｃｏ、ａスプリング ハーバ−ラ
ボラトリ− ８ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊
行）に記載された方法に準じて行なった。即ち、菌体を
、ｌＳ係蔗糖を含む３０ ｍＭのトリス塩酸および５０
ｍＭのＥＤＴＡに懸濁し、リゾチーム処理および界面活
性剤処理を行う。ついで、３Ｍの酢酸カリウムを最終濃
度０．３Ｍとなるように加え、０℃で７時間保持後、遠
心分離により上清を分取し、フェノール抽出、エタノー
ル沈澱処理し、沈澱を／θμ９／ｍｌのリボヌクレアー
ゼを含む１０ｍＭのトリス塩酸および／ ｍＭのＥＤＴ
Ａに溶解して複合プラスミド溶液を得た０アミラーゼ遺
伝子を含む複合グラスミド（ｐＭＡｓ １０／）の精製 上記複合プラスミドを、前記（３）のバチルスサテイリ
スＭＯ７−２−３／株中に、プロドプラＧｅｎｅｔｉｃ
ｅ ／乙ｇ巻、／／／〜／／３頁（／９７９年）に記載
の方法〕により導入した。即ち、中期対数増殖期にある
バチルスサテイリスＭＯ’７−２−．？／株（クレット
値７０〜ｇｏ）細胞を集め、−容０ のＳ Ｍ Ｍ Ｐ緩衝液〔０，３Ｍの蔗糖、０．０２
Ｍのマレイン酸、０．０２Ｍの塩化マグネシウム（’ｐ
ＨＡ、３ ）を含むペンアッセイブロス〕に懸濁し、２
０ Ｏｌｔｇ／ｒｎｌｌのリゾチームを加え、３７℃で
２時間保持する。生じたプロトプラストを、３０θＯｒ
、ｐ、ｍ 、 ／ ３分間の遠心分離によシ集め、ＳＭ
ＭＰ緩衝液で洗滌後、等容量の同緩衝液に懸濁する。そ
の２ＳＯμｔに、前記（５）で得た複合プラスミドを含
むｆ９ＭＭＰ緩衝液ＳＯμｔ を加え、引続き７．５−
の１Ｉ−Ｏ％ポリエチ（Ｓ Ｍ Ｍ Ｐからペンアッセ
イブロスを除いたも、の）を加えλ分間混合する。つい
でＳ−のＳＭＭＰ緩衝液を加え、混合、遠心して集菌し
、／−のＳ’ Ｍ Ｍ Ｐ緩衝液に懸濁して３０℃で２
時間培養する。
前記（４）で得だＴＮｊＴＯ，７株をエリスロマイシ、
ンを含むニュートリエンドブロス澱粉培地に塗布し、単
一コロニーを分離した。アミラーゼ活性を持つコロニー
を選び、エリスロマイシンを含むペンアッセイブロス培
地に植菌し、３７℃で一夜間培養し、集菌し、複合プラ
ス複合プラスミドの単離は１．ＡａｖａｎｃθｄＢ；
ｇ１’ｅ’ｒ’ｉ”ａ、奪ｎｅｔ エ′。’８ ／ ２
０〜／ ；ｉ ７頁（ｃｏ、ａスプリング ハーバ−ラ
ボラトリ− ８ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊
行）に記載された方法に準じて行なった。即ち、菌体を
、ｌＳ係蔗糖を含む３０ ｍＭのトリス塩酸および５０
ｍＭのＥＤＴＡに懸濁し、リゾチーム処理および界面活
性剤処理を行う。ついで、３Ｍの酢酸カリウムを最終濃
度０．３Ｍとなるように加え、０℃で７時間保持後、遠
心分離により上清を分取し、フェノール抽出、エタノー
ル沈澱処理し、沈澱を／θμ９／ｍｌのリボヌクレアー
ゼを含む１０ｍＭのトリス塩酸および／ ｍＭのＥＤＴ
Ａに溶解して複合プラスミド溶液を得た０アミラーゼ遺
伝子を含む複合グラスミド（ｐＭＡｓ １０／）の精製 上記複合プラスミドを、前記（３）のバチルスサテイリ
スＭＯ７−２−３／株中に、プロドプラＧｅｎｅｔｉｃ
ｅ ／乙ｇ巻、／／／〜／／３頁（／９７９年）に記載
の方法〕により導入した。即ち、中期対数増殖期にある
バチルスサテイリスＭＯ’７−２−．？／株（クレット
値７０〜ｇｏ）細胞を集め、−容０ のＳ Ｍ Ｍ Ｐ緩衝液〔０，３Ｍの蔗糖、０．０２
Ｍのマレイン酸、０．０２Ｍの塩化マグネシウム（’ｐ
ＨＡ、３ ）を含むペンアッセイブロス〕に懸濁し、２
０ Ｏｌｔｇ／ｒｎｌｌのリゾチームを加え、３７℃で
２時間保持する。生じたプロトプラストを、３０θＯｒ
、ｐ、ｍ 、 ／ ３分間の遠心分離によシ集め、ＳＭ
ＭＰ緩衝液で洗滌後、等容量の同緩衝液に懸濁する。そ
の２ＳＯμｔに、前記（５）で得た複合プラスミドを含
むｆ９ＭＭＰ緩衝液ＳＯμｔ を加え、引続き７．５−
の１Ｉ−Ｏ％ポリエチ（Ｓ Ｍ Ｍ Ｐからペンアッセ
イブロスを除いたも、の）を加えλ分間混合する。つい
でＳ−のＳＭＭＰ緩衝液を加え、混合、遠心して集菌し
、／−のＳ’ Ｍ Ｍ Ｐ緩衝液に懸濁して３０℃で２
時間培養する。
培養液の０．７−を、エリスロマイシン（，２０μｇ／
ｍｌ）を含むＤＭＪ澱粉培地〔０１ｇ％の寒天、０．５
Ｍのコハク酸ナトリウム（ＰＨ７，、、？）。
ｍｌ）を含むＤＭＪ澱粉培地〔０１ｇ％の寒天、０．５
Ｍのコハク酸ナトリウム（ＰＨ７，、、？）。
０．５％のカザミノ酸、０．５％の酵母エキス。
０．３Ｓ％のリン酸二カリ、 ０．／ ３％のリン酸−
力ＩＪ 、 ０．０７％のブドウ糖、７％の澱粉。
力ＩＪ 、 ０．０７％のブドウ糖、７％の澱粉。
、２０ ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．０７％の牛
血清アルブミンを含む〕に塗布し、３７℃で培養する。
血清アルブミンを含む〕に塗布し、３７℃で培養する。
生じたコロニーにヨード液を噴霧し、アミラーゼ活性を
示す形質転換株（ＴＮ乙０３株という）を得た。ＴＮ６
０３株はエリスロマイシン耐性、カナマイシン感受性を
示した０ ＴＮＡ０３株から、前記（５）の方法により複合プラス
ミドを単離し、これを、イー・コリＣＡＯＯ株に導入し
た。即ち、弘０７！の中期対数増殖期にあるイー・コＩ
Ｊ Ｏ４０θ株菌体を集め、！；ＯｍＭの塩化カルシウ
ム溶液；１０ｍ１に懸濁し、θ℃で６０分間保持した後
、遠心分離によシ集菌し、再び同じ塩化カルシウム溶液
、２−に懸濁し、０℃で１．０分間保持した。
示す形質転換株（ＴＮ乙０３株という）を得た。ＴＮ６
０３株はエリスロマイシン耐性、カナマイシン感受性を
示した０ ＴＮＡ０３株から、前記（５）の方法により複合プラス
ミドを単離し、これを、イー・コリＣＡＯＯ株に導入し
た。即ち、弘０７！の中期対数増殖期にあるイー・コＩ
Ｊ Ｏ４０θ株菌体を集め、！；ＯｍＭの塩化カルシウ
ム溶液；１０ｍ１に懸濁し、θ℃で６０分間保持した後
、遠心分離によシ集菌し、再び同じ塩化カルシウム溶液
、２−に懸濁し、０℃で１．０分間保持した。
一方、ＴＮＡＯ３株から単離した複合プラスミドを０，
７Ｍのトリス塩酸に懸濁し、その０．７−を、上記イー
・コＩＪ Ｏ４００株菌体の懸濁液０．７ツと混合し、
θ℃で７０分間保持し、ついで３７℃で一分間処理した
後、／コのＬＢ培地（ｏ、ｓ ％酵母エキス、／係のト
リプトン。
７Ｍのトリス塩酸に懸濁し、その０．７−を、上記イー
・コＩＪ Ｏ４００株菌体の懸濁液０．７ツと混合し、
θ℃で７０分間保持し、ついで３７℃で一分間処理した
後、／コのＬＢ培地（ｏ、ｓ ％酵母エキス、／係のト
リプトン。
０．５％の食塩および／係のブドウ糖を含む）上記イー
・コ！Ｊ Ｔｙｑｏ２株から、前記（５）の方法により
複合プラスミドを単離し、これを再び前記（６）のプロ
トプラスト形質転換法によ導入し、アミラーゼ活性を示
す形質転換株をこの複合プラスミドをｐＭＡｓ １０／
と名付けた。
・コ！Ｊ Ｔｙｑｏ２株から、前記（５）の方法により
複合プラスミドを単離し、これを再び前記（６）のプロ
トプラスト形質転換法によ導入し、アミラーゼ活性を示
す形質転換株をこの複合プラスミドをｐＭＡｓ １０／
と名付けた。
ｐＭＡＳ１０／の大量調製
前記（６）におけるイー・コリＴＮ？θコ株を、：ｌｔ
のＬＢ培地中において３７℃で一夜間培゛癲しだ。集菌
後、５０ ｍＭのトリス塩酸で洗滌ように加えて氷水中
で／！ｉ分間保持した後、０．２３ＭのＥＤＴＡ２’ｌ
艷を加え、氷水中でＳ分間保持した。ついで、７％のブ
リッジ。
のＬＢ培地中において３７℃で一夜間培゛癲しだ。集菌
後、５０ ｍＭのトリス塩酸で洗滌ように加えて氷水中
で／！ｉ分間保持した後、０．２３ＭのＥＤＴＡ２’ｌ
艷を加え、氷水中でＳ分間保持した。ついで、７％のブ
リッジ。
ｏ、ｑ ％のデオキシコール酸および４λ、５ ｍＭの
ＥＤＴＡを含む！； ＯｍＭのトリス塩酸９乙ゴを混和
して７０分間保持した後、ｔｔＣで７時間遠心処理（３
０’０００ｒ、ｐ、ｍ）Ｌ、上清を集め、’１ｍ１ｌの
飽和塩化セシウム溶液を加えて７℃で−０時間遠心処理
（２０００Ｏｒ、ｐ、ｍ）Ｌだ。沈澱を塩化セシウムに
懸濁し、密度がハｋＡとなるように塩化セシウム及び１
０ｒｑ／ｍｌの臭化エチジウムを加え、／！ｉ℃でｌ１
ｇ時間遠心処理（３ｇ０００ｒ、ｐ、ｍ）した。複合プ
ラ・スミドのバンドを集め、再び塩化セシウムおよび臭
化エチジウムと混合して遠心処理を繰返して複合プラス
ミドのバンドを集め、コニプタノールで臭化エチジウム
を抽出除去し、ＴＥ緩衝を含む複合プラスミドｐＭＡｓ
１０／を調製した。
ＥＤＴＡを含む！； ＯｍＭのトリス塩酸９乙ゴを混和
して７０分間保持した後、ｔｔＣで７時間遠心処理（３
０’０００ｒ、ｐ、ｍ）Ｌ、上清を集め、’１ｍ１ｌの
飽和塩化セシウム溶液を加えて７℃で−０時間遠心処理
（２０００Ｏｒ、ｐ、ｍ）Ｌだ。沈澱を塩化セシウムに
懸濁し、密度がハｋＡとなるように塩化セシウム及び１
０ｒｑ／ｍｌの臭化エチジウムを加え、／！ｉ℃でｌ１
ｇ時間遠心処理（３ｇ０００ｒ、ｐ、ｍ）した。複合プ
ラ・スミドのバンドを集め、再び塩化セシウムおよび臭
化エチジウムと混合して遠心処理を繰返して複合プラス
ミドのバンドを集め、コニプタノールで臭化エチジウム
を抽出除去し、ＴＥ緩衝を含む複合プラスミドｐＭＡｓ
１０／を調製した。
このプラスミドの分子量をアガロースゲル電気泳動で測
定した結果約ｓ、ｑメガダルトン（ｑ、０ｋｂ）であり
、そのうち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の分子
量は／、ダメガダルトン（２，／ｋｂ）であった。ｐＭ
Ａｓ１０／ノ制限酵素地図を第２図に示す。第３図は、
第２図における８ｇ１■による切断部位から５ａｕ３Ａ
による切断部位までのＤＮＡ部分（２重、線で表示）、
即ち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地
図である。第３図に示すように、アミラーゼ遺伝子を含
むＤＮＡ断片は、Ｈｐａ ｌ 、 Ｉ’ｖｕ ■、 Ｃ
１ａ ｌおよびＨｉｎｄ ｉｌｌによる切断部位が谷／
個所、ｇｃｏＲｌによる切断部位が２個所、５ａＩＩに
よる切断部位か３個所存在した。
定した結果約ｓ、ｑメガダルトン（ｑ、０ｋｂ）であり
、そのうち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の分子
量は／、ダメガダルトン（２，／ｋｂ）であった。ｐＭ
Ａｓ１０／ノ制限酵素地図を第２図に示す。第３図は、
第２図における８ｇ１■による切断部位から５ａｕ３Ａ
による切断部位までのＤＮＡ部分（２重、線で表示）、
即ち、アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地
図である。第３図に示すように、アミラーゼ遺伝子を含
むＤＮＡ断片は、Ｈｐａ ｌ 、 Ｉ’ｖｕ ■、 Ｃ
１ａ ｌおよびＨｉｎｄ ｉｌｌによる切断部位が谷／
個所、ｇｃｏＲｌによる切断部位が２個所、５ａＩＩに
よる切断部位か３個所存在した。
前記（２）に記載したｐＬＳ３．３０−’ｌはつぎの方
法で調製した。
法で調製した。
（８） ｐＬＳ３ＪＯ−ＩＩの調製
（イ） ｐＬＳ３ ／ ０−スの調製
／μｙのｐＢＲ３２ユおよび／μＩのｐＵＢ／／θを、
それぞれＥｃｏＲ（を用いて３７℃で３０分間処理して
切断し、両者を混合してＴ／Ｉ。
それぞれＥｃｏＲ（を用いて３７℃で３０分間処理して
切断し、両者を混合してＴ／Ｉ。
Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼを用い、８℃でｑｇ時間処理し
て連結した。得られた複合プラスミドを前記（５）の方
法により単離し、通常の形質転換法により、イー・３９
０６００株中に導入した。即ち、単離した複合プラスミ
ドを０．７Ｍのトリス塩酸に懸濁し、その０．７−を、
０℃に保持したイー・コリ０４００株の塩化カルシウム
懸濁液０．／−と混合して７０分間保持し、ついで３７
℃で２分間処理した後、／ＴｒＩＪ２のＬＢ培地を加え
、３７℃で２ａ分間培養する。形質転換株から、アンピ
シリン耐性（Ａｐｒ）、カナマイシン耐性（Ｋｍｒ）株
を選択した。連結方法の相違による２種のプラスミドｐ
ＬＳ３１０−／ およびｐＬＳ１３ ／ Ｏ−一のうち
、ｐＬＳ ３ ／ ０−２ （ｊ−、、？Ｍａ）を、形
質転換株から、前記（５）の方法に準じて採取した。
て連結した。得られた複合プラスミドを前記（５）の方
法により単離し、通常の形質転換法により、イー・３９
０６００株中に導入した。即ち、単離した複合プラスミ
ドを０．７Ｍのトリス塩酸に懸濁し、その０．７−を、
０℃に保持したイー・コリ０４００株の塩化カルシウム
懸濁液０．／−と混合して７０分間保持し、ついで３７
℃で２分間処理した後、／ＴｒＩＪ２のＬＢ培地を加え
、３７℃で２ａ分間培養する。形質転換株から、アンピ
シリン耐性（Ａｐｒ）、カナマイシン耐性（Ｋｍｒ）株
を選択した。連結方法の相違による２種のプラスミドｐ
ＬＳ３１０−／ およびｐＬＳ１３ ／ Ｏ−一のうち
、ｐＬＳ ３ ／ ０−２ （ｊ−、、？Ｍａ）を、形
質転換株から、前記（５）の方法に準じて採取した。
（ロ） ｐＬＥｔ ３ ／ ０△乙の調製Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ／乙Ｓ巻９．２乙？−ｚ２７６頁（１９７８年）
の染色体ＤＮＡを前記（１）の方法に準じて採取し、Ｈ
ｌｎｃｌ ｌｌ［で切断した断片（ハＩＩＭｄ）を、上
記（／１）のｐＬｓ３１０−．２のＨｉｎｃｌｌｌｌに
よる断片とＴ’＋ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、得ら
れだ複合プラスミドをイー・コリＣ乙００、株に導入し
、形質転換株から複合プラスミドを単離して、これを前
記バチルスサテイリスＭ工／／λ株に導入し、形質転換
株からテトラサイクリン耐性遺伝子およびｐＬＳ、？１
０−２断片領域に欠失部をもつ、プラスミドｐＬＳ Ｊ
／θ△乙（３，ｙＭａ）を採取した。
ｃｓ ／乙Ｓ巻９．２乙？−ｚ２７６頁（１９７８年）
の染色体ＤＮＡを前記（１）の方法に準じて採取し、Ｈ
ｌｎｃｌ ｌｌ［で切断した断片（ハＩＩＭｄ）を、上
記（／１）のｐＬｓ３１０−．２のＨｉｎｃｌｌｌｌに
よる断片とＴ’＋ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、得ら
れだ複合プラスミドをイー・コリＣ乙００、株に導入し
、形質転換株から複合プラスミドを単離して、これを前
記バチルスサテイリスＭ工／／λ株に導入し、形質転換
株からテトラサイクリン耐性遺伝子およびｐＬＳ、？１
０−２断片領域に欠失部をもつ、プラスミドｐＬＳ Ｊ
／θ△乙（３，ｙＭａ）を採取した。
（ハ） ｐＬＳ３３θ−グの調製
スタフィロコッカスアウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）のプラスミドＰＥ／９４’（，
２，ｌＩ−Ｍｄ）（Ｐｌａｓｍｉｄ ／巻、ｌＩｔ、ｇ
’−’１７９頁（１９７ｇ年）；ＰｌａＳｍｉｄ ’７
巻、、２．３Ａ〜２乙０頁（７９ｇ０年）〕を、Ｓａｕ
３ Ａで部分切断し、捷だ上記ｐＬｓ３１０△乙をＢ
ａｍ ＨＩで切断し、両者を混合し、Ｔ４ＤＮＡＩＪガ
ーゼで連結した。得られた複合プラスミドを前記（ロ）
と同様にしてイー・コリｃｔｏｏ株中に導入し、アンピ
シリン耐性、エリスロマイシン耐性株を選択し、複合プ
ラスミドを採取して第２図に示すｐＬＳ３３０−ケ（＋
、、ｔＭａ）を得た。
ｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）のプラスミドＰＥ／９４’（，
２，ｌＩ−Ｍｄ）（Ｐｌａｓｍｉｄ ／巻、ｌＩｔ、ｇ
’−’１７９頁（１９７ｇ年）；ＰｌａＳｍｉｄ ’７
巻、、２．３Ａ〜２乙０頁（７９ｇ０年）〕を、Ｓａｕ
３ Ａで部分切断し、捷だ上記ｐＬｓ３１０△乙をＢ
ａｍ ＨＩで切断し、両者を混合し、Ｔ４ＤＮＡＩＪガ
ーゼで連結した。得られた複合プラスミドを前記（ロ）
と同様にしてイー・コリｃｔｏｏ株中に導入し、アンピ
シリン耐性、エリスロマイシン耐性株を選択し、複合プ
ラスミドを採取して第２図に示すｐＬＳ３３０−ケ（＋
、、ｔＭａ）を得た。
第１図はプラスミドｐ！ＩＳ 、 ３３．０．−、 ’
Ｉの構成ル−出 願 人 工業技術院長 石 坂 誠
−手続補正書（自発） 昭和５９年６月２２日 讐庁長官若杉和夫殿 ／ 事件の表示 昭和ｓ、ｒ年誓願第！２グ、２ｓ号 コ 発明の名称 複合プラスミド ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号１００ 明細書の特許請求の範囲及び発明の詳細な説明の欄及び
図面 Ｓ 補正の内容 （１）明細書の特許請求の範囲を別紙の通シ訂正（２）
明細書簡り頁下からコ行〜第ｊ頁／３行のし、「アミラ
ーゼ活性を示す・・・・・とじて寄託されている。」を
削除し、代シに天文を挿入する。 「アミラーゼ活性を示す単一コロニーを分離して複合プ
ラスミドを採取し、これをバテルスサテイリスＭＯ？−
２−ｊ／株に導入して、アミラーゼ生産性の形質転換株
バテルスサテイリスＴＮ、ｇθ３株（微工研菌寄第 ７
６６０ 号、以下ＴＮ６０３株という）を得る。ついで
ＴＮ６θ３株からアミラーゼ遺伝子を含む複合プラスミ
ド（ｐＴＮ乙θ３という）を単離する。」（３）同第５
頁下から６行、同頁下から一行、第７、貞λ行、第７５
頁下から３行及び第７９７頁３〜Ｚ行の［ｐＭＡｓ１０
／Ｊを１ｐＴＮ乙０３Ｊと訂正する。 （４） 同第５頁下からｊ−り行及び第１ｊ頁下から６
〜ｊ行の「５．９メガダルトン（９，０ｘｂ） Ｊを「
６・♂メガダルトン（／θ。ＫＫｂ）Ｊと訂正する。 （５）同第５頁下から３〜２行及び第１！頁下か（力
同第１−！頁末性〜第１ｊ頁７３行の「プラスミドを単
離し、・・・・・を調製した。」を削除し、代シに次文
を挿入する。 「プラスミドｐＴＮ６０３を単離した。これを再びプロ
トプラスト形質転換法によシバチルスサテイリスＭＯ７
−２−３／株中に導入し、アミラーゼ活性を示す形質転
換株を検定した。」（８）同第１乙貞Ｊ行〜♂行の（−
Ｈｐａｌ、・・・・存在した。」を削除し代シに次文を
挿入する。 ｒＨｐａｌによる切断部位が／個所、ＥＣｏＲｌ、Ｄ（
１θ１１及びＯｌａ ｌによる切断部位が各２個所、Ｓ
ａｌ ｌとＨｉｎａ ｌ による切断部位が各３個所存
在した。Ｊ （９）添付図面第一図及び第３図を削除し、代シに別紙
第２図及び第３図を特徴する 特許請求の範囲 （１）Ａｆルス”ｊ−キュランス２２株のアミラーゼ遺
伝子を含むＤＮＡを含有する複合プラスミド。 （２） アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の分子量が
２．３メガダルトン（３，６ｋｂ）である特許請求の範
囲第１項記載の複合プラスミド。 手続ネ市正書（方式ン 昭和５９年２月）５日 特許庁長官 志賀 学 殿 １ 事件の表示 昭和５８年特許願第５２４２５号２
発明の名称 複合プラスミド ４ 補正命令の日付 昭和５９年７月３１日（発送日）
５ 補正の対象 昭和５９年６月２２日で提出した手続補正書の差出書６
補正の内容 別紙の通り。 手続補正書輸ブｔ） 昭和５９年 ６月２２日 特許庁長官 若杉 和犬 殿 １ 事件の表示 昭和５８年特許願第５２４２５号２
発明の名称 複合プラスミド ５ 補正の内容
Ｉの構成ル−出 願 人 工業技術院長 石 坂 誠
−手続補正書（自発） 昭和５９年６月２２日 讐庁長官若杉和夫殿 ／ 事件の表示 昭和ｓ、ｒ年誓願第！２グ、２ｓ号 コ 発明の名称 複合プラスミド ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号１００ 明細書の特許請求の範囲及び発明の詳細な説明の欄及び
図面 Ｓ 補正の内容 （１）明細書の特許請求の範囲を別紙の通シ訂正（２）
明細書簡り頁下からコ行〜第ｊ頁／３行のし、「アミラ
ーゼ活性を示す・・・・・とじて寄託されている。」を
削除し、代シに天文を挿入する。 「アミラーゼ活性を示す単一コロニーを分離して複合プ
ラスミドを採取し、これをバテルスサテイリスＭＯ？−
２−ｊ／株に導入して、アミラーゼ生産性の形質転換株
バテルスサテイリスＴＮ、ｇθ３株（微工研菌寄第 ７
６６０ 号、以下ＴＮ６０３株という）を得る。ついで
ＴＮ６θ３株からアミラーゼ遺伝子を含む複合プラスミ
ド（ｐＴＮ乙θ３という）を単離する。」（３）同第５
頁下から６行、同頁下から一行、第７、貞λ行、第７５
頁下から３行及び第７９７頁３〜Ｚ行の［ｐＭＡｓ１０
／Ｊを１ｐＴＮ乙０３Ｊと訂正する。 （４） 同第５頁下からｊ−り行及び第１ｊ頁下から６
〜ｊ行の「５．９メガダルトン（９，０ｘｂ） Ｊを「
６・♂メガダルトン（／θ。ＫＫｂ）Ｊと訂正する。 （５）同第５頁下から３〜２行及び第１！頁下か（力
同第１−！頁末性〜第１ｊ頁７３行の「プラスミドを単
離し、・・・・・を調製した。」を削除し、代シに次文
を挿入する。 「プラスミドｐＴＮ６０３を単離した。これを再びプロ
トプラスト形質転換法によシバチルスサテイリスＭＯ７
−２−３／株中に導入し、アミラーゼ活性を示す形質転
換株を検定した。」（８）同第１乙貞Ｊ行〜♂行の（−
Ｈｐａｌ、・・・・存在した。」を削除し代シに次文を
挿入する。 ｒＨｐａｌによる切断部位が／個所、ＥＣｏＲｌ、Ｄ（
１θ１１及びＯｌａ ｌによる切断部位が各２個所、Ｓ
ａｌ ｌとＨｉｎａ ｌ による切断部位が各３個所存
在した。Ｊ （９）添付図面第一図及び第３図を削除し、代シに別紙
第２図及び第３図を特徴する 特許請求の範囲 （１）Ａｆルス”ｊ−キュランス２２株のアミラーゼ遺
伝子を含むＤＮＡを含有する複合プラスミド。 （２） アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の分子量が
２．３メガダルトン（３，６ｋｂ）である特許請求の範
囲第１項記載の複合プラスミド。 手続ネ市正書（方式ン 昭和５９年２月）５日 特許庁長官 志賀 学 殿 １ 事件の表示 昭和５８年特許願第５２４２５号２
発明の名称 複合プラスミド ４ 補正命令の日付 昭和５９年７月３１日（発送日）
５ 補正の対象 昭和５９年６月２２日で提出した手続補正書の差出書６
補正の内容 別紙の通り。 手続補正書輸ブｔ） 昭和５９年 ６月２２日 特許庁長官 若杉 和犬 殿 １ 事件の表示 昭和５８年特許願第５２４２５号２
発明の名称 複合プラスミド ５ 補正の内容
Claims (2)
- （１） バチルスサーキュランス Ｆ、２株のアミラー
ゼ遺伝子を含むＤＮＡを含有する複合プラスミ ド。 - （２） アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の分子量が
／、’ｉ’メガダルトン（２，／ｋｂ）である特許請求
の範囲第１項記載の複合プラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5242583A JPS6024186A (ja) | 1983-03-30 | 1983-03-30 | 複合プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5242583A JPS6024186A (ja) | 1983-03-30 | 1983-03-30 | 複合プラスミド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6024186A true JPS6024186A (ja) | 1985-02-06 |
Family
ID=12914423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5242583A Pending JPS6024186A (ja) | 1983-03-30 | 1983-03-30 | 複合プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6024186A (ja) |
-
1983
- 1983-03-30 JP JP5242583A patent/JPS6024186A/ja active Pending
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