JPS6232888A - アルカリ性プロテア−ゼ並びにハイブリツドベクタ−および形質転換微生物の調製 - Google Patents
アルカリ性プロテア−ゼ並びにハイブリツドベクタ−および形質転換微生物の調製Info
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- JPS6232888A JPS6232888A JP61184101A JP18410186A JPS6232888A JP S6232888 A JPS6232888 A JP S6232888A JP 61184101 A JP61184101 A JP 61184101A JP 18410186 A JP18410186 A JP 18410186A JP S6232888 A JPS6232888 A JP S6232888A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、バチルス属の微生物を、ズブチリシン・カー
ルスベルク（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒ
ｇ）プロテアーゼおよびその変種を産生ずる味に形質転
換する方法に関する。この目的のために、本発明には、
ズブチリシン・カールスベルクまたはその変種のみをコ
ード化する二本鎖デオキシリボ核酸；先導（ｌｅａｄｅ
ｒ）タンパク質の構造遺伝子、作動配列内の開始および
終止コドン、リボソーム結合部位およびプロモータと共
に上記の単離された二本鎖デオキシリボ核酸を含有する
ハイブリッドベクター；並びにこのようなハイブリッド
プラスミド用バチルス属微生物宿主の調製が記載されて
いる。
ルスベルク（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒ
ｇ）プロテアーゼおよびその変種を産生ずる味に形質転
換する方法に関する。この目的のために、本発明には、
ズブチリシン・カールスベルクまたはその変種のみをコ
ード化する二本鎖デオキシリボ核酸；先導（ｌｅａｄｅ
ｒ）タンパク質の構造遺伝子、作動配列内の開始および
終止コドン、リボソーム結合部位およびプロモータと共
に上記の単離された二本鎖デオキシリボ核酸を含有する
ハイブリッドベクター；並びにこのようなハイブリッド
プラスミド用バチルス属微生物宿主の調製が記載されて
いる。
［従来技術］
微生物、とりわけ細菌および真菌によって産生され、能
動輸送によって細胞から排出されて培地に蓄積される数
種のプロテアーゼが知られている。
動輸送によって細胞から排出されて培地に蓄積される数
種のプロテアーゼが知られている。
この種の多くの酵素は、タンパク質の分解を要する分野
において既に商業的に用いられている。重要な分野とし
て、例えば、洗剤および清浄剤並びに動物の餌が挙げら
れる。プロテアーゼは、通例、至適活性を示すｐＨ域に
よって分類され、従って、アルカリ性、中性および酸性
プロテアーゼとして知られている。洗剤および清浄剤に
おいては、アルカリ性プロテアーゼが特に重要である。
において既に商業的に用いられている。重要な分野とし
て、例えば、洗剤および清浄剤並びに動物の餌が挙げら
れる。プロテアーゼは、通例、至適活性を示すｐＨ域に
よって分類され、従って、アルカリ性、中性および酸性
プロテアーゼとして知られている。洗剤および清浄剤に
おいては、アルカリ性プロテアーゼが特に重要である。
例えば、ズブチリシンとして知られる種類が重要である
。
。
この名称は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌ
’ｉｓ）に由来するが、これはとりわけこの種の株がズ
ブチリシンを産生じ得るからである。近年、研究者らは
、天然に産生じた種々のズブチリシソを相互に分離し、
その構造を解明することに成功した（イー・エル・スミ
ス（Ｅ、 Ｌ、 Ｓｍ１ｔｈ）ら、ザ・ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂ１０１゜
Ｃｈｅｍ、）（１９６８）２４３（９）、２１８４）。
’ｉｓ）に由来するが、これはとりわけこの種の株がズ
ブチリシンを産生じ得るからである。近年、研究者らは
、天然に産生じた種々のズブチリシソを相互に分離し、
その構造を解明することに成功した（イー・エル・スミ
ス（Ｅ、 Ｌ、 Ｓｍ１ｔｈ）ら、ザ・ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂ１０１゜
Ｃｈｅｍ、）（１９６８）２４３（９）、２１８４）。
これに関連して、２種の°ズブチリシン、すなわち、ズ
ブチリシンＢＰＮ’およびズブチリシン・カールスベル
クが、実際上特に重要であることが見出されている。ズ
ブチリシンＢＰＮ’は、しばしばバチルス・アミロリク
エファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）から得られ、ズブチリンンーカール
スベルクは、例えば、バチルス・リヘニフォルミス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株の培
養によって得られる。多くのバチルス株は、しばしば、
両方のプロテアーゼを中性プロテアーゼ（メタロプロテ
アーゼ）との混合物として排出する。
ブチリシンＢＰＮ’およびズブチリシン・カールスベル
クが、実際上特に重要であることが見出されている。ズ
ブチリシンＢＰＮ’は、しばしばバチルス・アミロリク
エファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）から得られ、ズブチリンンーカール
スベルクは、例えば、バチルス・リヘニフォルミス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株の培
養によって得られる。多くのバチルス株は、しばしば、
両方のプロテアーゼを中性プロテアーゼ（メタロプロテ
アーゼ）との混合物として排出する。
酵素の工業的重要性の見地（ズブチリシンＢＰＮ′プロ
テアーゼよりもズブチリシンカールスペルクプロテアー
ゼの方が重要性がいくぶん高いと見なし得る）から、１
種の酵素らしくは他の酵素またはその混合物を産生じ、
かつ生成物の工業的な調製に適当でもある株を見出すた
めの多くの試みが既に為されている。これに関連して、
以下の西独公開特許または特許明細書を引用する：西独
公開特許第１９４Ｑ４８８号、同第２０１８４５１号、
同第２０４４１６１号、同第２１０１８０３号、同第２
１２１３９７号および同第２９２５４２７号、並びに英
国特許第１２６３７６５号、米国特許第３６２３９５７
号、米国特許第４２６４７３８号および欧州特許出願公
開第６６３８号。
テアーゼよりもズブチリシンカールスペルクプロテアー
ゼの方が重要性がいくぶん高いと見なし得る）から、１
種の酵素らしくは他の酵素またはその混合物を産生じ、
かつ生成物の工業的な調製に適当でもある株を見出すた
めの多くの試みが既に為されている。これに関連して、
以下の西独公開特許または特許明細書を引用する：西独
公開特許第１９４Ｑ４８８号、同第２０１８４５１号、
同第２０４４１６１号、同第２１０１８０３号、同第２
１２１３９７号および同第２９２５４２７号、並びに英
国特許第１２６３７６５号、米国特許第３６２３９５７
号、米国特許第４２６４７３８号および欧州特許出願公
開第６６３８号。
前記特許出願または特許は、突然変異および選択工程を
何度も繰り返すことによって、最終的に収量および性質
が最適となった株を得る古典的突然変異法に関する。こ
のような突然変異は統計的に起こり、そのために客観的
に可能な最高の性質を有する「仕立て」た株を得ること
が困難で弗ろうことば、当業者に既知である。更に、こ
のような培養株は、復帰突然変異を起こし易い。すなわ
ち、少なくとも幾つかの望ましい性質を失って、「野生
」型となる。
何度も繰り返すことによって、最終的に収量および性質
が最適となった株を得る古典的突然変異法に関する。こ
のような突然変異は統計的に起こり、そのために客観的
に可能な最高の性質を有する「仕立て」た株を得ること
が困難で弗ろうことば、当業者に既知である。更に、こ
のような培養株は、復帰突然変異を起こし易い。すなわ
ち、少なくとも幾つかの望ましい性質を失って、「野生
」型となる。
大きな進歩は、遺伝子組換え操作によってなされた（米
国特許第４２３７２２４号）。この方法は、プラスミド
を適当に開環し、それに異種の二本鎖デオキシリボ核酸
を連結し、閉環して再び環状とし、適当な宿主に入れる
ことによって、ある微生物中における異種の遺伝子の発
現および増殖を可能にする。この基本的な方法に従って
、欧州特許出願公開第０１３０７５６号には、−万では
ズブチリシンＢＰＮ’を、他方では中性プロテアーゼ（
メタロ−プロテアーゼ）をコード化する二本鎖デオキン
リボ核酸の単離が記載されている。二本鎖デオキンリボ
核酸のベクターへの挿入およびその修飾ら記載されてい
る。加水分解酵素（すなイつち、プロテアーゼ、他のア
ミラーゼ、エステラーゼなと）の遺伝子操作による製造
および修飾が、特許請求の範囲に含まれているが、ズブ
チリシンＢＰＮ°という特定の例に関して説明されてい
る方法を、発明的な手を加えずに他の系に応用すること
が可能であるとは考えられない。先に引用した欧州特許
出願には、加水分解酵素をコード化する遺伝子の、出発
生物の遺伝子プールからの分離は、標識したオリゴヌク
レオチド鎖（このオリゴヌクレオチド鎖は、加水分解酵
素をコード化する配列の部分配列に相当し、遺伝コード
により決められるために種々の可能性がある）の使用に
よって行うと記載されているので、なおさらのことであ
る。
国特許第４２３７２２４号）。この方法は、プラスミド
を適当に開環し、それに異種の二本鎖デオキシリボ核酸
を連結し、閉環して再び環状とし、適当な宿主に入れる
ことによって、ある微生物中における異種の遺伝子の発
現および増殖を可能にする。この基本的な方法に従って
、欧州特許出願公開第０１３０７５６号には、−万では
ズブチリシンＢＰＮ’を、他方では中性プロテアーゼ（
メタロ−プロテアーゼ）をコード化する二本鎖デオキン
リボ核酸の単離が記載されている。二本鎖デオキンリボ
核酸のベクターへの挿入およびその修飾ら記載されてい
る。加水分解酵素（すなイつち、プロテアーゼ、他のア
ミラーゼ、エステラーゼなと）の遺伝子操作による製造
および修飾が、特許請求の範囲に含まれているが、ズブ
チリシンＢＰＮ°という特定の例に関して説明されてい
る方法を、発明的な手を加えずに他の系に応用すること
が可能であるとは考えられない。先に引用した欧州特許
出願には、加水分解酵素をコード化する遺伝子の、出発
生物の遺伝子プールからの分離は、標識したオリゴヌク
レオチド鎖（このオリゴヌクレオチド鎖は、加水分解酵
素をコード化する配列の部分配列に相当し、遺伝コード
により決められるために種々の可能性がある）の使用に
よって行うと記載されているので、なおさらのことであ
る。
該欧州特許出願に記載の方法を行う場合、当業者は、相
当の実験的努力をしなければならない。換言すれば、数
種のオリゴヌクレオチド鎖を、適当な純度で合成しなけ
ればならない。更に、この方法においては、所望の生成
物のアミノ酸配列が予測されることが前提となる。
当の実験的努力をしなければならない。換言すれば、数
種のオリゴヌクレオチド鎖を、適当な純度で合成しなけ
ればならない。更に、この方法においては、所望の生成
物のアミノ酸配列が予測されることが前提となる。
［発明の構成］
本発明者らは、ズブチリシン・カールスベルクを産生じ
得る微生物株を見出すべく研究を行った（ズブチリシン
・カールスベルクとは、とりわけ２種の修飾を行った変
種の酵素をも包含する）。
得る微生物株を見出すべく研究を行った（ズブチリシン
・カールスベルクとは、とりわけ２種の修飾を行った変
種の酵素をも包含する）。
また、本発明者らは、バチルス属の微生物に挿入するこ
とができ、その微生物内で安定なズブチリシン・カール
スベルクの産生および排出をコード化する適当なハイブ
リッドプラスミドを提供すべく研究を行った。最後に、
本発明者らは、ズブチリシン・カールスベルクをコード
化し、その酵素の産生および排出に必要なヌクレオチド
配列を有する、作動し得る（機能し得る）、単離された
二本鎖デオキシリボ核酸を提供しようとした。更に、本
発明者らは、カールスベルク陽性微生物の選択において
予め形成し、標識したオリゴヌクレオチド配列の使用に
よる欧州特許出願第０１３０７５６号に記載の単離方法
よりも簡単な免疫検出法を用いることを研究した。
とができ、その微生物内で安定なズブチリシン・カール
スベルクの産生および排出をコード化する適当なハイブ
リッドプラスミドを提供すべく研究を行った。最後に、
本発明者らは、ズブチリシン・カールスベルクをコード
化し、その酵素の産生および排出に必要なヌクレオチド
配列を有する、作動し得る（機能し得る）、単離された
二本鎖デオキシリボ核酸を提供しようとした。更に、本
発明者らは、カールスベルク陽性微生物の選択において
予め形成し、標識したオリゴヌクレオチド配列の使用に
よる欧州特許出願第０１３０７５６号に記載の単離方法
よりも簡単な免疫検出法を用いることを研究した。
従って、第１の態様において、本発明は、ポリペプチド
のコード化のみを行う構造遺伝子、作動配列における開
始および終止コドン、リボソーム結合部位、 プロモーター から成る単離された二本鎖デオキシリボ核酸であって、
以下の構造： バチルス属微生物のＲＮＡポリメラーゼによって認識さ
れるプロモーター、 リボソーム結合部位、 開始コドン、 ズブチリシン・カールスベルクまたはそのタンパク質分
解活性サブユニットもしくはタンパク質分解活性変種を
コード化する、先導配列を含む構造遺伝子、 終止コドン を有し、４００を越えない塩基対を有する特定の発現効
果を伴イつないＤＮＡ配列が両端に存在していることも
ある二本鎖デオキシリボ核酸に関する。
のコード化のみを行う構造遺伝子、作動配列における開
始および終止コドン、リボソーム結合部位、 プロモーター から成る単離された二本鎖デオキシリボ核酸であって、
以下の構造： バチルス属微生物のＲＮＡポリメラーゼによって認識さ
れるプロモーター、 リボソーム結合部位、 開始コドン、 ズブチリシン・カールスベルクまたはそのタンパク質分
解活性サブユニットもしくはタンパク質分解活性変種を
コード化する、先導配列を含む構造遺伝子、 終止コドン を有し、４００を越えない塩基対を有する特定の発現効
果を伴イつないＤＮＡ配列が両端に存在していることも
ある二本鎖デオキシリボ核酸に関する。
本発明の単離された二本鎖デオキシリボ核酸は、作動配
列内に副配列を有する。即ち、個々の副配列は、互いに
機能的に関連している。これは、ＲＮＡポリメラーゼの
認識配列を得するプロモーターが存在し、次いでリボソ
ーム結合点が存在することを意味する。次いで、バチル
ス内で作動可能な開始コドン、好ましくは開始トリブレ
ットＧＴＧが存在する。開始トリプレットの次（°こは
、先導タンパク質を暗号化する実際の暗号配列に次いで
、成熟ズブチリシン・カールスベルクまたはその変種も
しくはサブユニットをコード化する配列が存在する。先
導配列は、好ましくは細胞からの酵素の排出を司る前（
プロ）配列、先（プレ）配列または萌−／先導配列であ
ると理解される。最後に、構造配列は、バチルスにより
認識される終止コドン、好ましくは終止トリブレット、
例えばＴＡＡによって終止される。これに終止配列が続
いていてよい。
列内に副配列を有する。即ち、個々の副配列は、互いに
機能的に関連している。これは、ＲＮＡポリメラーゼの
認識配列を得するプロモーターが存在し、次いでリボソ
ーム結合点が存在することを意味する。次いで、バチル
ス内で作動可能な開始コドン、好ましくは開始トリブレ
ットＧＴＧが存在する。開始トリプレットの次（°こは
、先導タンパク質を暗号化する実際の暗号配列に次いで
、成熟ズブチリシン・カールスベルクまたはその変種も
しくはサブユニットをコード化する配列が存在する。先
導配列は、好ましくは細胞からの酵素の排出を司る前（
プロ）配列、先（プレ）配列または萌−／先導配列であ
ると理解される。最後に、構造配列は、バチルスにより
認識される終止コドン、好ましくは終止トリブレット、
例えばＴＡＡによって終止される。これに終止配列が続
いていてよい。
自身で対をなすことができ、そのためにループを形成（
ステム・ループの形成）する終止配列が好ましい。この
ような終止配列の機能は、特定の遺伝子生成のためのメ
ツセンジャーＲＮＡの合成を終止することである。
ステム・ループの形成）する終止配列が好ましい。この
ような終止配列の機能は、特定の遺伝子生成のためのメ
ツセンジャーＲＮＡの合成を終止することである。
前記単離された二本鎖デオキシリボ核酸の両端に、好ま
しくは特定の発現効果を伴わない配列がさらに続いてい
てよい。
しくは特定の発現効果を伴わない配列がさらに続いてい
てよい。
成熟酵素をコード化する配列を、本発明の範囲内で修飾
し得る。第１の態様において、ズブチリシン・カールス
ベルクをコード化する配列が提供されている。好ましい
配列は、バチルスに通例存在するコドンのみから成る配
列である。本発明の好ましい一態様においては、成熟酵
素をコード化する以下の配列を含んで成る単離されたデ
オキシリボ核酸が挙げられる： ＋０ ２０ ３０ ４０・・・ＧＣ
ＧＣＡＡＡ ＣＣＧＴＴＣＣＴＴＡ ＣＧＧＣＡＴＴＣ
ＣＴ ＣＴＣＡＴＴＡＡＡＧＣＧＧＡＣＡＡＡＧＴ Ｇ
ＣＡＧＧＣＴＣＡＡ ＧＧＣＴＴＴＡＡＧＧ ＧＡＧＣ
ＧＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＣＣＧＴＣＣＴＧＧＡＴ
Ａ ＣＡＧＧＡＡＴＣＣＡ ＡＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣ
ＧＧＡＣＴＴＧＡ ＡＣＧＴＡＧＴＣＧＧ ＣＧＧＡＧ
ＧＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡ
ＴＡＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＧＡＣＡＣＧＧ
ＣＡＣＡＣＡＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴ ＡＣＡＧＴＡＧＣ
ＴＧ ＣＧＣＴＴＧＡＣＡＡ ＴＡＣＡＡＣＧＧＧＴＧ
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ＴＣＣＴＴＧ ＴＡＣＧＣＧＧＴＴ＾ＡＡＧＴＡＣＴＧ
ＡＡ ＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡ ＡＧＣＧＧＡＴＣＡＴ
ＡＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＧＴＡＡＧＣＧＧＡ ＡＴＣＧ
ΔＧＴＧＧＧ ＣＧＡＣＡＡＣＡＡＡ ＣＧＧＣＡＴＧ
ＧＡＴＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡ ＴＧＡＧＣＣＴＴＧＧ
ＧＧＧＡＧＣＡＴＣＡ ＧＧＣＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＴ
ＧＡΔＡＣＡ ＧＧＣＡＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＣＡＴＡ
ＴＧ ＣＡＡＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡ Ｇ
ＣＴＧＣＡＧＣＡＧ ＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧ ＡＴＣＴ
ＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＡＡ ＣＡＡＴＴＧＧ
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Ｔ終止 ＧＡＴＣＡＡＴＧＴＣＧＡＡＧＣＴＧＣＣＧ ＣＴＣＡ
Ａ ＴＡＡ・・・・この配列は、アミノ酸配列中の１５
８位および１６１位が代わったズブチリシン・カールス
ベルクをコード化する。
し得る。第１の態様において、ズブチリシン・カールス
ベルクをコード化する配列が提供されている。好ましい
配列は、バチルスに通例存在するコドンのみから成る配
列である。本発明の好ましい一態様においては、成熟酵
素をコード化する以下の配列を含んで成る単離されたデ
オキシリボ核酸が挙げられる： ＋０ ２０ ３０ ４０・・・ＧＣ
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Ｔ ＣＡＣＡＡＧＴＣＣＧ ＣＡＡＣＣＧＴＣＴＣＴＣ
ＣＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴ ＧＧＧＡＡＧ
ＣＴＡＡ ＴＴＣＴＡＣＴＡＴＧ ＧＧＡＡＡＧＧＴＣ
Ｔ終止 ＧＡＴＣＡＡＴＧＴＣＧＡＡＧＣＴＧＣＣＧ ＣＴＣＡ
Ａ ＴＡＡ・・・・この配列は、アミノ酸配列中の１５
８位および１６１位が代わったズブチリシン・カールス
ベルクをコード化する。
本発明の他の態様においては、特許請求の範囲に記載さ
れた、単離された二本鎖デオキシリボ核酸は、非修飾ズ
ブチリシンカールスベルクをコード化する。すなわち、
１６１位においてアミノ酸セリンの代わりにアミノ酸ア
スパラギンを、１５８位においてアミノ酸アスパラギン
の代わりにアミノ酸セリンを有する。従って、バチルス
において通常これらのアミノ酸を暗号化する基本トリゾ
ルット（遺伝子コード）が、対
応する単離デオキシリボ核酸中に存在しなければならな
い。
れた、単離された二本鎖デオキシリボ核酸は、非修飾ズ
ブチリシンカールスベルクをコード化する。すなわち、
１６１位においてアミノ酸セリンの代わりにアミノ酸ア
スパラギンを、１５８位においてアミノ酸アスパラギン
の代わりにアミノ酸セリンを有する。従って、バチルス
において通常これらのアミノ酸を暗号化する基本トリゾ
ルット（遺伝子コード）が、対
応する単離デオキシリボ核酸中に存在しなければならな
い。
本発明の他の好ましい態様においては、単舵二本鎖デオ
キシリボ核酸は、開始トリプレットと成熟酵素をコード
化する配列との間で先導タンパク質をコード化する配列
を含んで成る。
キシリボ核酸は、開始トリプレットと成熟酵素をコード
化する配列との間で先導タンパク質をコード化する配列
を含んで成る。
本発明は、バチルス属微生物のハイブリッドプラスミド
であって、上記本発明の作動型二本鎖ＤＮＡを少なくと
も１種含んで成るハイブリッドプラスミドにも関する。
であって、上記本発明の作動型二本鎖ＤＮＡを少なくと
も１種含んで成るハイブリッドプラスミドにも関する。
本発明によると、このようなハイブリッドプラスミドは
、以下のような構造を有することが意図されている。ハ
イブリッドプラスミドは、任意の１種の耐性マーカー（
遺伝標識）を有すべきであり、特異的制限酵素による酵
素的切断点を、各制限酵素当たり少なくとも１個、かつ
可能な限り少なく（すなわち、４個を越えない、好まし
くは１個を越えない）含んで成るべきである。換言すれ
ば、ハイブリッドプラスミドは、特異的酵素の使用によ
って線状にされ得ることが意図されている。
、以下のような構造を有することが意図されている。ハ
イブリッドプラスミドは、任意の１種の耐性マーカー（
遺伝標識）を有すべきであり、特異的制限酵素による酵
素的切断点を、各制限酵素当たり少なくとも１個、かつ
可能な限り少なく（すなわち、４個を越えない、好まし
くは１個を越えない）含んで成るべきである。換言すれ
ば、ハイブリッドプラスミドは、特異的酵素の使用によ
って線状にされ得ることが意図されている。
耐性マーカーの機能は、このようにして形質転換された
ハイブリッドプラスミドを有する微生物を、その耐性に
よって、このようなハイブリッドプラスミドを持たない
微生物から識別できるようにすることである。種々の出
発プラスミドが、当業者に入手可能である。これらは、
例えば、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフ
ェニコールまたは他の抗生物質に対する耐性マーカーを
有する。ハイブリブトプラスミドの調製に使用可能な種
々の出発プラスミドのうち、バチルス属の微生物に適当
なものを選択すべきである。従って、本発明のハイブリ
ッドプラスミドは、バチルスに適当なハイブリッドプラ
スミドを導くような出発プラスミドから最も良く得られ
る。このような種々の出発プラスミドは、専門文献に記
載されている。多種の適当なプラスミドが、例えば、バ
チルス・ノエネティック・ストック・センター（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ
ｒ）から分譲されている。適当な出発プラスミドは、例
えば、ｐＢＣＥ１６、ｐｃ １９４、ｐＵＢｌｌｏ、ｐ
Ｅ ｌ ９４、ｐＳＡ２１００、ｐＰＬ６０８およびｐ
ＢＤ６４である。これらのプラスミドについては、以下
の文献に記載されている・ ベルンハルト、カー（Ｂｅｒｎｈａｒｄ、 Ｋ、）、シ
ュレンジ。バー（Ｓｃｈｒｅｍｐｆ、 Ｈ，”）および
チーベル、ヴエー（Ｇｏｅｂｅｌ、 胃、）、 ｌ９７８、ジャーナル・オン・バクテリオロジ−（Ｊ、
Ｂａ（Ｌｅｒｉｏｌ、）上３３： ８９７〜９０３グリ
クツアン、チー・ヨツト（Ｇｒｙｃｚａｎ、 Ｔ、 Ｊ
、）％コンテンテ、ニス（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ、 Ｓ、）
およびドウブナウ、デー（Ｄｕｂｎａｕ、 Ｄ、）、 １９７８、ジャーナル・オン・バクテリオロジー＋３４
： ３１８〜３２９ ウィリアムズ、ディー・エム（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、 Ｄ
、 Ｍ、）、ドゥヴアール、イー・ジエイ（Ｄｕｖａｌ
ｌ、 Ｅ、 Ｊ、）およびログエツト。ピー・ニス（Ｌ
ｏｖｅｔｔ、 Ｐ、 Ｓ、）、１９８１、ジャーナル・
オン・バクテリオロジ−１４６： １１６２〜１１６
５ グリクツアン、チー（Ｇｒｙｃｚａｎ、 Ｔ、）、シヴ
アクマー、アー・チー（Ｓｈｉｖａｋｕｍａｒ、 Ａ、
Ｇ、）およびドウブナウ、デー、 １９８０、ジャーナル・オン・バクテリオロジー１４１
・２４６〜２５３ エーリッヒ、ニス・デー（Ｅｈｌｉｃｈ、 Ｓ、 Ｄ、
）、ブルスヂンーベテグリュー、バー（Ｂ ｕｒｓｚ
ｔｙｎ −Ｐｅｔｔｅｇｒｅｗ、 Ｈ，）、ストロイツ
ブスキー、ヨツト（Ｓｔｒｏｙｎｏｗｓｋｉ、 Ｊ、）
およびレーダーベルク、ヨツト（Ｌｅａｄｅｒｂｅｒｇ
、 Ｊ、）、１９７７、リコンビナント・モレキュー
ルズ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ）
：インパクト・オン・サイエンス・アンド・ソサエティ
（Ｉｍｐａｃｔ ｏｎＳｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ５ｏｃ
ｉｅｔｙ）、６９〜８０頁、チーベン・プレス（Ｒａｖ
ｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークヴアイスブルム、ベ
ー（Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、 Ｂ、）、グラノＡム、エム・
ワイ（Ｇｒａｈａｍ、 Ｍ、 Ｙ、）、グリクツアン。
ハイブリッドプラスミドを有する微生物を、その耐性に
よって、このようなハイブリッドプラスミドを持たない
微生物から識別できるようにすることである。種々の出
発プラスミドが、当業者に入手可能である。これらは、
例えば、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフ
ェニコールまたは他の抗生物質に対する耐性マーカーを
有する。ハイブリブトプラスミドの調製に使用可能な種
々の出発プラスミドのうち、バチルス属の微生物に適当
なものを選択すべきである。従って、本発明のハイブリ
ッドプラスミドは、バチルスに適当なハイブリッドプラ
スミドを導くような出発プラスミドから最も良く得られ
る。このような種々の出発プラスミドは、専門文献に記
載されている。多種の適当なプラスミドが、例えば、バ
チルス・ノエネティック・ストック・センター（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ
ｒ）から分譲されている。適当な出発プラスミドは、例
えば、ｐＢＣＥ１６、ｐｃ １９４、ｐＵＢｌｌｏ、ｐ
Ｅ ｌ ９４、ｐＳＡ２１００、ｐＰＬ６０８およびｐ
ＢＤ６４である。これらのプラスミドについては、以下
の文献に記載されている・ ベルンハルト、カー（Ｂｅｒｎｈａｒｄ、 Ｋ、）、シ
ュレンジ。バー（Ｓｃｈｒｅｍｐｆ、 Ｈ，”）および
チーベル、ヴエー（Ｇｏｅｂｅｌ、 胃、）、 ｌ９７８、ジャーナル・オン・バクテリオロジ−（Ｊ、
Ｂａ（Ｌｅｒｉｏｌ、）上３３： ８９７〜９０３グリ
クツアン、チー・ヨツト（Ｇｒｙｃｚａｎ、 Ｔ、 Ｊ
、）％コンテンテ、ニス（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ、 Ｓ、）
およびドウブナウ、デー（Ｄｕｂｎａｕ、 Ｄ、）、 １９７８、ジャーナル・オン・バクテリオロジー＋３４
： ３１８〜３２９ ウィリアムズ、ディー・エム（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、 Ｄ
、 Ｍ、）、ドゥヴアール、イー・ジエイ（Ｄｕｖａｌ
ｌ、 Ｅ、 Ｊ、）およびログエツト。ピー・ニス（Ｌ
ｏｖｅｔｔ、 Ｐ、 Ｓ、）、１９８１、ジャーナル・
オン・バクテリオロジ−１４６： １１６２〜１１６
５ グリクツアン、チー（Ｇｒｙｃｚａｎ、 Ｔ、）、シヴ
アクマー、アー・チー（Ｓｈｉｖａｋｕｍａｒ、 Ａ、
Ｇ、）およびドウブナウ、デー、 １９８０、ジャーナル・オン・バクテリオロジー１４１
・２４６〜２５３ エーリッヒ、ニス・デー（Ｅｈｌｉｃｈ、 Ｓ、 Ｄ、
）、ブルスヂンーベテグリュー、バー（Ｂ ｕｒｓｚ
ｔｙｎ −Ｐｅｔｔｅｇｒｅｗ、 Ｈ，）、ストロイツ
ブスキー、ヨツト（Ｓｔｒｏｙｎｏｗｓｋｉ、 Ｊ、）
およびレーダーベルク、ヨツト（Ｌｅａｄｅｒｂｅｒｇ
、 Ｊ、）、１９７７、リコンビナント・モレキュー
ルズ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ）
：インパクト・オン・サイエンス・アンド・ソサエティ
（Ｉｍｐａｃｔ ｏｎＳｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ５ｏｃ
ｉｅｔｙ）、６９〜８０頁、チーベン・プレス（Ｒａｖ
ｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークヴアイスブルム、ベ
ー（Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、 Ｂ、）、グラノＡム、エム・
ワイ（Ｇｒａｈａｍ、 Ｍ、 Ｙ、）、グリクツアン。
チーおよびドウブナウ、デー、
１９７９、ジャーナル・オン・バタテリオロジ−１３７
・６３５〜６４３ 適当な出発プラスミドの選択に際して、特異的制限酵素
によって、その特性を失うことなく線状になり得るもの
を選択することが重要である。出発プラスミドの特性は
、バチルスにおける複製能力性、耐性および発現能力を
含むと理解される。
・６３５〜６４３ 適当な出発プラスミドの選択に際して、特異的制限酵素
によって、その特性を失うことなく線状になり得るもの
を選択することが重要である。出発プラスミドの特性は
、バチルスにおける複製能力性、耐性および発現能力を
含むと理解される。
適当な出発プラスミドを線状にし得る通常の特異的制限
酵素は、例えば、Ｂａｍ ＨＩｓ Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉ
ｎｄ［およびＰｓｔ Ｉである。
酵素は、例えば、Ｂａｍ ＨＩｓ Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉ
ｎｄ［およびＰｓｔ Ｉである。
本発明のハイブリットプラスミドは、そのような１個ま
たはそれ以上の切断点に挿入された二本鎖単離デオキシ
リボ核酸を含んで成る。例えば、本発明の目的に特に適
当な出発プラスミドｐＢＣＥ１６は、ＢａｍＨＩによっ
て線状とされ、次いで本発明の二本鎖デオキシリボ核酸
の挿入後に閉環して再び環を形成する。本発明の他の態
様は、閉環ハイブリッドプラスミドだけでなく、対応す
る開環型ハイブリッドプラスミドおよび２．３またはそ
れ以上の開環ハイブリッドプラスミド付加物をも意図す
る。
たはそれ以上の切断点に挿入された二本鎖単離デオキシ
リボ核酸を含んで成る。例えば、本発明の目的に特に適
当な出発プラスミドｐＢＣＥ１６は、ＢａｍＨＩによっ
て線状とされ、次いで本発明の二本鎖デオキシリボ核酸
の挿入後に閉環して再び環を形成する。本発明の他の態
様は、閉環ハイブリッドプラスミドだけでなく、対応す
る開環型ハイブリッドプラスミドおよび２．３またはそ
れ以上の開環ハイブリッドプラスミド付加物をも意図す
る。
本発明は、特許請求の範囲第２〜５項に記載のハイブリ
ッドプラスミドを有するバチルス属の微生物株にも関す
る。適当な微生物株を生産または形質転換するために、
当業者は、ハイブリッドプラスミドを組み込むことがで
き、このようなハイブリッドプラスミドがその中で十分
な安定性を示す味を選択する。枯草菌、バチルス・リヘ
ニフォルミス、バチルス串アミロリクエファシェンスま
たはセレウス菌の株を、有利に形質転換することができ
る。これに関連して、形質転換株は、生成したプロテア
ーゼを、例えば後述の免疫学的方法を用いて検出するこ
とによって、非形質転換株から識別することができる。
ッドプラスミドを有するバチルス属の微生物株にも関す
る。適当な微生物株を生産または形質転換するために、
当業者は、ハイブリッドプラスミドを組み込むことがで
き、このようなハイブリッドプラスミドがその中で十分
な安定性を示す味を選択する。枯草菌、バチルス・リヘ
ニフォルミス、バチルス串アミロリクエファシェンスま
たはセレウス菌の株を、有利に形質転換することができ
る。これに関連して、形質転換株は、生成したプロテア
ーゼを、例えば後述の免疫学的方法を用いて検出するこ
とによって、非形質転換株から識別することができる。
本発明の一態様において、形質転換される殊は、それ自
体プロテアーゼを産生じ得ないバチルス株、例えば枯草
菌株である。このような株は、寄託機関から入手可能で
ある。このようにして、所望のズブチリシン・カールス
ベルクまたはその前記変種のみを産生じ得る株を得るこ
、とが可能である。
体プロテアーゼを産生じ得ないバチルス株、例えば枯草
菌株である。このような株は、寄託機関から入手可能で
ある。このようにして、所望のズブチリシン・カールス
ベルクまたはその前記変種のみを産生じ得る株を得るこ
、とが可能である。
しかし、他のプロテアーゼまたはアミラーゼに加えてズ
ブチリシン・カールスベルクをこのように排出する株を
得ることも同様に可能である。とりわけ、選択によって
、酵素産生能が特に高い株を得ることが可能である。
ブチリシン・カールスベルクをこのように排出する株を
得ることも同様に可能である。とりわけ、選択によって
、酵素産生能が特に高い株を得ることが可能である。
本発明の二本鎖デオキシリボ核酸は、バチルス・リヘニ
フォルミスのプロテアーゼ産生株から単離される。その
ような株のうち、例えば以下の株が適当である；バチル
ス・リヘニフォルミス：ＡＴＣＣ１０７１６、ＤＳＭ６
４１並びにＤＳＭ３０４６およびＤＳＭ３４０７（ｒＡ
４４１Ｊおよび「Ａ４５３Ｊ）。これらの株を、西独特
許第２９２５４２７号に記載のように培養する。次いで
細胞を集める。集めた細胞を、原形質のみにする（すな
わち、ムレイン細胞壁を適当な酵素、特にリゾチームで
破壊した後、洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムで細
胞膜を破壊する）。このようにして生成した溶菌液を、
まずＲＮＡ分解酵素（ＲＮアーゼ）および／またはプロ
テア−ゼＫによる処理に付す。次いでＤＮＡを単離する
。
フォルミスのプロテアーゼ産生株から単離される。その
ような株のうち、例えば以下の株が適当である；バチル
ス・リヘニフォルミス：ＡＴＣＣ１０７１６、ＤＳＭ６
４１並びにＤＳＭ３０４６およびＤＳＭ３４０７（ｒＡ
４４１Ｊおよび「Ａ４５３Ｊ）。これらの株を、西独特
許第２９２５４２７号に記載のように培養する。次いで
細胞を集める。集めた細胞を、原形質のみにする（すな
わち、ムレイン細胞壁を適当な酵素、特にリゾチームで
破壊した後、洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムで細
胞膜を破壊する）。このようにして生成した溶菌液を、
まずＲＮＡ分解酵素（ＲＮアーゼ）および／またはプロ
テア−ゼＫによる処理に付す。次いでＤＮＡを単離する
。
染色体ＤＮＡを単離するいくつかの方法が、当業者に知
られている。このような方法を、単独で、または組み合
わせて行い得る。重要な一方法において、まず溶菌液を
、エタノール中で分別沈澱に付すと、高分子ｆｆ１ＤＮ
Ａフラグメントめ分離が可能になり、単離される。密度
勾配による分離方法もある。この目的のために、塩化セ
シウム／ＤＮＡ溶液中で密度勾配を作る。全量を種々の
分画に分けて、ＤＮＡが集まった特定の分画を分離し、
次の工程に付すことができる。多くの場合、クロロホル
ム／イソアミルアルコール混合物を用いた抽出によるＤ
ＮＡの単離の前、または単離時に、はとんどのタンパク
質を除去することが最も良い。
られている。このような方法を、単独で、または組み合
わせて行い得る。重要な一方法において、まず溶菌液を
、エタノール中で分別沈澱に付すと、高分子ｆｆ１ＤＮ
Ａフラグメントめ分離が可能になり、単離される。密度
勾配による分離方法もある。この目的のために、塩化セ
シウム／ＤＮＡ溶液中で密度勾配を作る。全量を種々の
分画に分けて、ＤＮＡが集まった特定の分画を分離し、
次の工程に付すことができる。多くの場合、クロロホル
ム／イソアミルアルコール混合物を用いた抽出によるＤ
ＮＡの単離の前、または単離時に、はとんどのタンパク
質を除去することが最も良い。
基本的には、プラスミド−ＤＮＡを同様に分離し得るの
であるが、この場合には、塩化セシウム密度勾配にエチ
ジウムプロミド（インターカレーションし得る赤色色素
）を導入して、プラスミドと染色体ＤＮＡを区別するこ
とが最もよい。
であるが、この場合には、塩化セシウム密度勾配にエチ
ジウムプロミド（インターカレーションし得る赤色色素
）を導入して、プラスミドと染色体ＤＮＡを区別するこ
とが最もよい。
精製した単離デオキシリボ核酸を、次いで、適当な緩衝
液（ｐＨ７〜７．５）中、制限酵素で切断する。適当な
制限酵素は、例えばＢａｍＨＩ％５ａｕ３Ａまたは特異
的部位でＤＮＡを切断し得る他の酵素である。染色体Ｄ
ＮＡを、プラスミドＤＮＡの場合と同じ酵素で処理して
も、異なる酵素で処理してもよい。いずれの場合におい
ても、損なわれていない構造遺伝子を確実に含む十分な
長さのフラグメントを得るために、染色体ＤＮＡを（切
断し得る全箇所で）完全には切断してしまわないことが
重要である。好ましくは染色体デオキシリボ核酸を線状
プラスミドの重量よりら大過剰に使用して、単離二本鎖
デオキシリボ核酸と線状プラスミドを混合する。好まし
くはｌ：２〜ｌ：２０、特に好ましくは、１：５〜１・
１０の比で用いる。
液（ｐＨ７〜７．５）中、制限酵素で切断する。適当な
制限酵素は、例えばＢａｍＨＩ％５ａｕ３Ａまたは特異
的部位でＤＮＡを切断し得る他の酵素である。染色体Ｄ
ＮＡを、プラスミドＤＮＡの場合と同じ酵素で処理して
も、異なる酵素で処理してもよい。いずれの場合におい
ても、損なわれていない構造遺伝子を確実に含む十分な
長さのフラグメントを得るために、染色体ＤＮＡを（切
断し得る全箇所で）完全には切断してしまわないことが
重要である。好ましくは染色体デオキシリボ核酸を線状
プラスミドの重量よりら大過剰に使用して、単離二本鎖
デオキシリボ核酸と線状プラスミドを混合する。好まし
くはｌ：２〜ｌ：２０、特に好ましくは、１：５〜１・
１０の比で用いる。
混合したデオキンリボ核酸（約０ 、２ ｍｇ／ ｍ（
ｌの蟲度で存在すべきである）を、次の工程においてＤ
ＮＡリガーゼで結合させる。
ｌの蟲度で存在すべきである）を、次の工程においてＤ
ＮＡリガーゼで結合させる。
このようにして得られた結合混合物を、バチルス属（例
えば枯草菌またはバチルス・リヘニフォルミス）の感応
細胞（コンピテント細胞）の形質転換に使用する。うま
く形質転換された株を、それがプロテアーゼを産生ずる
ことによって見分けたい場合には、元来プロテアーゼを
産生じ得ない、または少なくともズブチリシン・カール
スベルクを産生じ得ない味を形質転換することが好まし
い。
えば枯草菌またはバチルス・リヘニフォルミス）の感応
細胞（コンピテント細胞）の形質転換に使用する。うま
く形質転換された株を、それがプロテアーゼを産生ずる
ことによって見分けたい場合には、元来プロテアーゼを
産生じ得ない、または少なくともズブチリシン・カール
スベルクを産生じ得ない味を形質転換することが好まし
い。
しかし、プロテアーゼを産生じ得る出発法を形質転換し
てもよい。感応細胞を得るために、形質転換したい株を
第１の最少培地中で培養して定常期に達せしめ、次いで
、第２の希釈最少培地中で更に培養する。次いで、通例
緩衝液中でこのように前処理した微生物にハイブリッド
プラスミドをそのまま入れる。その後、完全培地中で増
殖（発育期）を行わせろ（カーン、エフ・エッチ（Ｃａ
ｈｎ、 ＦＩｌ、）およびフｔ ックス、エム・ニス（
Ｆａｘ、 Ｍ、 Ｓ、）（１９６８）ツヤ−ナル・才ブ
・バクテリオロジー、９５： ８６７〜８７５）。こ
のようにして得られた微生物を、次いで選択工程に付す
。この工程において、通例まずハイブリッドプラスミド
が耐性を示す抗生物質含有培地で培養する。このように
して、実質的にハイブリッドプラスミドを１コピーまた
はそれ以上含有する生惣が第１の１選択工程において得
られる。次いで、他の選択工程において、ズブチリノン
・カールスベルクを産生じ得る微生物を選択する。
てもよい。感応細胞を得るために、形質転換したい株を
第１の最少培地中で培養して定常期に達せしめ、次いで
、第２の希釈最少培地中で更に培養する。次いで、通例
緩衝液中でこのように前処理した微生物にハイブリッド
プラスミドをそのまま入れる。その後、完全培地中で増
殖（発育期）を行わせろ（カーン、エフ・エッチ（Ｃａ
ｈｎ、 ＦＩｌ、）およびフｔ ックス、エム・ニス（
Ｆａｘ、 Ｍ、 Ｓ、）（１９６８）ツヤ−ナル・才ブ
・バクテリオロジー、９５： ８６７〜８７５）。こ
のようにして得られた微生物を、次いで選択工程に付す
。この工程において、通例まずハイブリッドプラスミド
が耐性を示す抗生物質含有培地で培養する。このように
して、実質的にハイブリッドプラスミドを１コピーまた
はそれ以上含有する生惣が第１の１選択工程において得
られる。次いで、他の選択工程において、ズブチリノン
・カールスベルクを産生じ得る微生物を選択する。
免疫学的方法を、この選択工程に有利に用い得る。好ま
しい方法は、ブルームおよびギルバートの研究に基づく
（ブルーム、ニス（Ｂｒｏｏｍｅ、 Ｓ、）およびギル
バート、ダブリュ（Ｇｉｌｂｅｒｔ、 Ｌ）（１９７８
）、プロシーディ、ングス・オン・ナショナル・アカデ
ミ−・オン・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
しい方法は、ブルームおよびギルバートの研究に基づく
（ブルーム、ニス（Ｂｒｏｏｍｅ、 Ｓ、）およびギル
バート、ダブリュ（Ｇｉｌｂｅｒｔ、 Ｌ）（１９７８
）、プロシーディ、ングス・オン・ナショナル・アカデ
ミ−・オン・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、米国）、７５．２７４６〜２７
４９）。
４９）。
この方法において、ブッケルによる記載のように、まず
兎を免疫することによってズブチリシン・カールスベル
クに対する抗体が得られる（ブッケル、ピー（Ｂｕｃｋ
ｅｌ、 Ｐ、 ）およびゼーライン、ニー（Ｚｅｈｅｌ
ｅｉｎ、 Ｅ、）（１９８１）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、
１６．１４９〜１５９）。抗体のいくつかは、硫酸アン
モニウムを用いた沈澱およびＤＥＡＥ−クロマドグ与フ
ィーによって濃縮し、他の抗体は、活性セファロ−７！
、４Ｂｔ−用いたアフィニティークロマトグラフィーに
よってさらに濃縮する。
兎を免疫することによってズブチリシン・カールスベル
クに対する抗体が得られる（ブッケル、ピー（Ｂｕｃｋ
ｅｌ、 Ｐ、 ）およびゼーライン、ニー（Ｚｅｈｅｌ
ｅｉｎ、 Ｅ、）（１９８１）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、
１６．１４９〜１５９）。抗体のいくつかは、硫酸アン
モニウムを用いた沈澱およびＤＥＡＥ−クロマドグ与フ
ィーによって濃縮し、他の抗体は、活性セファロ−７！
、４Ｂｔ−用いたアフィニティークロマトグラフィーに
よってさらに濃縮する。
ズブチリシン・カールスベルクの存在は、以下のように
証明し得る。
証明し得る。
ＰＶＣフィルムに、ズブチリシン・カールスベルクに対
する抗体を塗布する。塗布したフィルムを、検査する細
菌の培地上に配置する。ズブチリシン・カールスベルク
が存在すれば、抗体が結合する。次の工程で、アフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製し、予めパーオ
キシダーゼを結合させたズブチリシン・カールスベルク
抗体を、抗体−ズブチリシン・カールスベルク複合体に
結合させる。
する抗体を塗布する。塗布したフィルムを、検査する細
菌の培地上に配置する。ズブチリシン・カールスベルク
が存在すれば、抗体が結合する。次の工程で、アフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製し、予めパーオ
キシダーゼを結合させたズブチリシン・カールスベルク
抗体を、抗体−ズブチリシン・カールスベルク複合体に
結合させる。
検出は、パーオキシダーゼ基質としてテトラメチルベン
ジジンを用いて行う。サブチリジンカールスペル夕陽性
クローンが存在すると、青緑色に発色する。
ジジンを用いて行う。サブチリジンカールスペル夕陽性
クローンが存在すると、青緑色に発色する。
前記免疫学的分離方法は、本発明において非常に有利で
ある。すなわち、これは、実質的にズブチリシン・カー
ルスベルクを産生ずる株の特異的な認識を可能にする。
ある。すなわち、これは、実質的にズブチリシン・カー
ルスベルクを産生ずる株の特異的な認識を可能にする。
このことは、免疫学的方法に応答しない他の代謝産物を
も含む株を使用する場合には、特に重要である。大量の
形質転換株および非形質転換株から、クローンを損なわ
ずに単離し得ることも、この検出方法の利点である。
も含む株を使用する場合には、特に重要である。大量の
形質転換株および非形質転換株から、クローンを損なわ
ずに単離し得ることも、この検出方法の利点である。
このようにして単離された、本発明のハイブリッドプラ
スミドを含むクローンから、前記のように、細胞溶解に
次いでエチジウムプロミド存在下に密度勾配分離を行う
ことによって、ハイブリッドプラスミドを単離し得る。
スミドを含むクローンから、前記のように、細胞溶解に
次いでエチジウムプロミド存在下に密度勾配分離を行う
ことによって、ハイブリッドプラスミドを単離し得る。
このようにして、精製したハイブリットプラスミドが得
られる。存在することが望ましくないエチジウムプロミ
ドは、イソプロパツールで抽出することによって分離し
得る。
られる。存在することが望ましくないエチジウムプロミ
ドは、イソプロパツールで抽出することによって分離し
得る。
精製したハイブリッドプラスミドを、前記条件下に、池
のバチルス株に挿入することができる。
のバチルス株に挿入することができる。
本発明の他の態様においては、感応細胞でなく、プロト
プラストを用いて形質転換を行い得る。この目的のため
に、バチルス属微生物のムレイン細胞壁を適当な酵素で
破壊しすることによってプロトプラストをまず調製し、
次いで、好ましくは緩衝液中で、ハイブリッドプラスミ
ドをポリエチレングリコールと共にプロトプラストに作
用させる。
プラストを用いて形質転換を行い得る。この目的のため
に、バチルス属微生物のムレイン細胞壁を適当な酵素で
破壊しすることによってプロトプラストをまず調製し、
次いで、好ましくは緩衝液中で、ハイブリッドプラスミ
ドをポリエチレングリコールと共にプロトプラストに作
用させる。
次いで、プロトプラストを再生培地上でさらに培養し、
このようにして得られた、本発明のハイブリットプラス
ミドを含む無傷の（損なわれていない）微生物を、前記
分離方法によって他の株から分離する。
このようにして得られた、本発明のハイブリットプラス
ミドを含む無傷の（損なわれていない）微生物を、前記
分離方法によって他の株から分離する。
［実施例］
バチルス・リヘニフォルミスＤＳＭ６４１またはＡＴＣ
Ｃｌ０７１６の染色体ＤＮＡを、マーマーの方法（文献
１）を以下のように改良して単離した リゾチーム１
ｍｇ／ ｌ ｍＱ含有１０ｍＭ）リス−塩酸塩（ｐＨ７
，５、サッカロース２５％含有）中、水中で細胞を２０
分間インキュベートした後、ＥＤＴＡおよびドデンル硫
酸ナトリウムを加えた。
Ｃｌ０７１６の染色体ＤＮＡを、マーマーの方法（文献
１）を以下のように改良して単離した リゾチーム１
ｍｇ／ ｌ ｍＱ含有１０ｍＭ）リス−塩酸塩（ｐＨ７
，５、サッカロース２５％含有）中、水中で細胞を２０
分間インキュベートした後、ＥＤＴＡおよびドデンル硫
酸ナトリウムを加えた。
クロロホルム−イソアミルアルコールによる抽出を１回
だけ行った。
だけ行った。
パーティカルローターを用いて、ＤＮＡを、密度勾配（
密度１ 、７１ ｇ／ａｍ３）において、４２．００Ｏ
ｒｌ）ｍ／２０°Ｃで２０時間遠心分離して、他の細胞
成分から分離し、ドリッピング・アウト（ｄｒｉｐｐｉ
ｎｇｏｕｔ）によって分別した。
密度１ 、７１ ｇ／ａｍ３）において、４２．００Ｏ
ｒｌ）ｍ／２０°Ｃで２０時間遠心分離して、他の細胞
成分から分離し、ドリッピング・アウト（ｄｒｉｐｐｉ
ｎｇｏｕｔ）によって分別した。
枯草菌のプラスミドＤ Ｎ Ａを、ベルンハルトの方法
（文献２）によって、密度勾配におけろ遠心分離工程後
、プラスミドＤＮＡを、カニユーレによって引き抜くこ
とによって単離した。
（文献２）によって、密度勾配におけろ遠心分離工程後
、プラスミドＤＮＡを、カニユーレによって引き抜くこ
とによって単離した。
枯草菌ＢＲ１５１（文献３）中でのクローニングのため
のベクタープラスミドとしてｐＢｃＥ１６（文献２．４
）を用いた。
のベクタープラスミドとしてｐＢｃＥ１６（文献２．４
）を用いた。
ズブチリシン・カールスベルクの遺伝子を損なわずに得
るために、バチルス・リヘニフォルミスＤＳＭ６４１ま
たはＡＴＣＣ１０７１６の染色体ＤＮＡを、制限エンド
ヌクレアーゼ５ａｕ３Ａによって部分的に切断した。
るために、バチルス・リヘニフォルミスＤＳＭ６４１ま
たはＡＴＣＣ１０７１６の染色体ＤＮＡを、制限エンド
ヌクレアーゼ５ａｕ３Ａによって部分的に切断した。
５ａｕ３Ａは４配列を認識し、ＢａｍＨＩは６配列を認
識する（すなわち、５ａｕ３Ａの方が切断頻度が高い）
ので、５ａｕ３Ａを用いて染色体ＤＮＡを不完全に切断
する切断部位の方が、ＢａｍＨＩによる切断部位よりも
一様に分布している。
識する（すなわち、５ａｕ３Ａの方が切断頻度が高い）
ので、５ａｕ３Ａを用いて染色体ＤＮＡを不完全に切断
する切断部位の方が、ＢａｍＨＩによる切断部位よりも
一様に分布している。
以下の全場合において、マニアナイス（文献５）のハン
ドブックによる条件下に切断を行った。ただし、不完全
な切断を行い、ベクターｐＢｃＥ１６の大きさく約３Ｍ
ｄ）に重心的に匹敵する切断生成物を得るために、通例
１時間のインキュベート時間を、適当に短縮した。ＤＮ
Ａ ｌμｇ当たり、酵素約１単位を使用した。ベクター
ｐＢｃＥ１６を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨｒ（
Ｓａｕ ３Ａを用いた場合と重複する端をも生成する）
で線状にした。
ドブックによる条件下に切断を行った。ただし、不完全
な切断を行い、ベクターｐＢｃＥ１６の大きさく約３Ｍ
ｄ）に重心的に匹敵する切断生成物を得るために、通例
１時間のインキュベート時間を、適当に短縮した。ＤＮ
Ａ ｌμｇ当たり、酵素約１単位を使用した。ベクター
ｐＢｃＥ１６を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨｒ（
Ｓａｕ ３Ａを用いた場合と重複する端をも生成する）
で線状にした。
インキュベート後、酵素を、半量（容量）のフェノール
で２回抽出した後、ＢａｍＨＩで切断したｐＢＣＥ １
６および５ａｕ３Ａで切断した染色体ＤＮＡを１：１０
の比で混合し、混合物を、同容量のエーテルで５回抽出
し、次いで２倍容量のエタノールと共に一７０℃で２０
分間インキュベートした後、遠心分離によってＤＮＡを
ペレット化した。
で２回抽出した後、ＢａｍＨＩで切断したｐＢＣＥ １
６および５ａｕ３Ａで切断した染色体ＤＮＡを１：１０
の比で混合し、混合物を、同容量のエーテルで５回抽出
し、次いで２倍容量のエタノールと共に一７０℃で２０
分間インキュベートした後、遠心分離によってＤＮＡを
ペレット化した。
乾燥後、以下の緩衝液にＤ Ｎ Ａを溶解した＝ ６６
ｍＭ）リス＝（ヒドロキンメチル）−アミノメタン、５
ｍＭ ＭｇＣ（ｂ、０ 、３ ｍＭアデノシン三リン酸
、１．５ｍＭジチオトレイトールおよび０．０７ｍｇ／
ｍρ牛血清アルブミン。
ｍＭ）リス＝（ヒドロキンメチル）−アミノメタン、５
ｍＭ ＭｇＣ（ｂ、０ 、３ ｍＭアデノシン三リン酸
、１．５ｍＭジチオトレイトールおよび０．０７ｍｇ／
ｍρ牛血清アルブミン。
ＤＮＡａ度を２００ μｇ／ｍＱに調節し、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼを、ＤＮＡＩμｇ当たりＩＵ加えた。リガー
ゼ反応を、１６℃で約１８時間行った。
Ａリガーゼを、ＤＮＡＩμｇ当たりＩＵ加えた。リガー
ゼ反応を、１６℃で約１８時間行った。
連結混合物（すなわちＴ４−ＤＮＡリガーゼて連結され
たＤＮＡフラグメント）を、次いて、枯草菌ＢＲＩ５１
の感応細胞の形質転換に使用した。
たＤＮＡフラグメント）を、次いて、枯草菌ＢＲＩ５１
の感応細胞の形質転換に使用した。
枯草菌ＢＲＩ５１の感応細胞を、カーノおよびフォック
スが記載しているように、レアード（しａｉｒｄ）の方
法によって調製した（文献６）。
スが記載しているように、レアード（しａｉｒｄ）の方
法によって調製した（文献６）。
０．１Ｍ ＭｇＣ（！２（０，１８ｍの、０ 、０５
Ｍ ＣａＣ（ｔ（０，Ｉ３ｍＣ）およびｌ ＯＯｍＭ
ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス−２−アミノエチ
ルエーテル−Ｎ 、 Ｎ 、Ｎ ’ 、 Ｎ ’−テト
ラアセテート）（ｐＨ７、３）（０，１３ｍＱ）を感応
細胞０．８２ｍＣに加えて混合し、３０°Ｃて５分間穏
やかに震とうした後、連結混合物１０μρまたはＩＯμ
ｇを加えた。３０℃で３０分間穏やかに震とう（６０ｒ
ｐｍ）した後、２ＸＨＧＰ（１σ当たりカゼイン由来ペ
プトノＩＯｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎａ０２５ｇおよびグ
ルコース５ ｇ） Ｉ ｍρを加えた。
Ｍ ＣａＣ（ｔ（０，Ｉ３ｍＣ）およびｌ ＯＯｍＭ
ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス−２−アミノエチ
ルエーテル−Ｎ 、 Ｎ 、Ｎ ’ 、 Ｎ ’−テト
ラアセテート）（ｐＨ７、３）（０，１３ｍＱ）を感応
細胞０．８２ｍＣに加えて混合し、３０°Ｃて５分間穏
やかに震とうした後、連結混合物１０μρまたはＩＯμ
ｇを加えた。３０℃で３０分間穏やかに震とう（６０ｒ
ｐｍ）した後、２ＸＨＧＰ（１σ当たりカゼイン由来ペ
プトノＩＯｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎａ０２５ｇおよびグ
ルコース５ ｇ） Ｉ ｍρを加えた。
１６０ｒｐｍ／３０℃で９０分間震とう後、細胞をガラ
スのへらで、形質転換細胞を選択する目的のために、カ
ゼイン０５％およびテトラサイクリン１５μｇ／ｍＱを
加えたカルンウムー力ゼイネートー寒天（フランツイア
（Ｆｒａｎｚｉｅｒ）およびルップ（Ｒｕｐｐ）により
改良されたしの一メルク（Ｍｅｒｃｋ））上に塗り付け
た（プレート１枚当たり１００μｍ２）。
スのへらで、形質転換細胞を選択する目的のために、カ
ゼイン０５％およびテトラサイクリン１５μｇ／ｍＱを
加えたカルンウムー力ゼイネートー寒天（フランツイア
（Ｆｒａｎｚｉｅｒ）およびルップ（Ｒｕｐｐ）により
改良されたしの一メルク（Ｍｅｒｃｋ））上に塗り付け
た（プレート１枚当たり１００μｍ２）。
プレートを、３７℃で４８時間インキュベートした。
ノエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ）を用いた
クロマトグラフィーによって精製したズブチリシン・カ
ールスベルク特異的抗体を、ベーリンガー／マンハイム
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製「
テスト・キット・フォー・ノ・イムノロジカル・デテク
ンヨン・オン・スペシフィック・ジーン・エクスプレッ
ション・イン・ミクロオーガニズムズ（ｔｅｓｔ ｋｉ
ｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ ５ｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｓ）Ｊと組み合わせて用い、全形質転換細胞的３２
．０００個のうちプロテアーゼ陽性クローン６ｇを検出
することができた。接種を繰り返すと、そのうち１個の
クローンが、更に研究を進めるのに十分な安定性を示し
た。ズブチリシン・カールスベルクの検出は、以下のよ
うに行った： 油分を除去するために、ＰＶＣフィルムをイソプロパツ
ールで２分間洗った後、乾燥した。次いで、フィルム１
５枚を被覆するために、ＤＥＡＥ精製ズブチリシン・カ
ールスベルク特異的抗体ＩｇＧフラクション０ 、６
ｍｆｆを含有する０、２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９，２）４０ｍ（２中で１０分間インキュベートした。
クロマトグラフィーによって精製したズブチリシン・カ
ールスベルク特異的抗体を、ベーリンガー／マンハイム
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製「
テスト・キット・フォー・ノ・イムノロジカル・デテク
ンヨン・オン・スペシフィック・ジーン・エクスプレッ
ション・イン・ミクロオーガニズムズ（ｔｅｓｔ ｋｉ
ｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ ５ｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｓ）Ｊと組み合わせて用い、全形質転換細胞的３２
．０００個のうちプロテアーゼ陽性クローン６ｇを検出
することができた。接種を繰り返すと、そのうち１個の
クローンが、更に研究を進めるのに十分な安定性を示し
た。ズブチリシン・カールスベルクの検出は、以下のよ
うに行った： 油分を除去するために、ＰＶＣフィルムをイソプロパツ
ールで２分間洗った後、乾燥した。次いで、フィルム１
５枚を被覆するために、ＤＥＡＥ精製ズブチリシン・カ
ールスベルク特異的抗体ＩｇＧフラクション０ 、６
ｍｆｆを含有する０、２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９，２）４０ｍ（２中で１０分間インキュベートした。
フィルムを乾燥せずに以下のアフターコーチイブ浴に移
し、１０分間放置した： ＰＢＳ緩衝液樹液 ４０ 吋牛グロブリ
ン ＋４．８ｍｇ牛血清アルブミン
＋４０ｍｇ＊）ｐＨ７，５、組成・０．０５Ｍ
ＫＨｚＰ ０４；０．１ＭＮａＣ１２ 次いで、フィルムをペーパータオルにはさんで乾燥した
。
し、１０分間放置した： ＰＢＳ緩衝液樹液 ４０ 吋牛グロブリ
ン ＋４．８ｍｇ牛血清アルブミン
＋４０ｍｇ＊）ｐＨ７，５、組成・０．０５Ｍ
ＫＨｚＰ ０４；０．１ＭＮａＣ１２ 次いで、フィルムをペーパータオルにはさんで乾燥した
。
次いで、ＩｇＧ被覆フィルムで寒天プレートを覆い、室
温で２時間インキュベートした。フィルムを除去し、付
着細胞を冷水道水で濯ぎ落とした後、フィルム両面を６
０℃のＰＢＳＪＩ衝液＋０樹液％牛血清アルブミンで濯
いだ。乾燥せずに、フィルムを５０ｍ（２複合浴（０，
１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ緩衝液５０ｍＱ＋パー
オキンダーゼを結合させた抗ズブチリシン・カールスベ
ルクＩｇＧ抗体ｌμＱ、）に移し、室温で４時間放置し
た。
温で２時間インキュベートした。フィルムを除去し、付
着細胞を冷水道水で濯ぎ落とした後、フィルム両面を６
０℃のＰＢＳＪＩ衝液＋０樹液％牛血清アルブミンで濯
いだ。乾燥せずに、フィルムを５０ｍ（２複合浴（０，
１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ緩衝液５０ｍＱ＋パー
オキンダーゼを結合させた抗ズブチリシン・カールスベ
ルクＩｇＧ抗体ｌμＱ、）に移し、室温で４時間放置し
た。
次いでフィルムを冷水道水で濯いだ後、両面を６℃のＰ
ＢＳ緩衝液＋０．０５％トウィーン２０十０．１％牛血
清アルブミンで濯いだ。フィルムをペーパータオルには
さんで乾燥後、パーオキシダーゼ複合体の基質（ベーリ
ンガー・ジェンーエクスプレッシオンスキット（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｇｅｎ −Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｋ
ｉｔ）、商標、ベーリンガー・マンハイム社製にｍ６１
１）上でインキュベートした。この基質は、ゼラチンベ
ースに溶解したテトラメチルベンジジンであった。室温
で１０〜３０分間インキュベート後、陽性クローン（す
なわちズブチリシン・カールスベルク）が存在する場合
には青緑に発色した。
ＢＳ緩衝液＋０．０５％トウィーン２０十０．１％牛血
清アルブミンで濯いだ。フィルムをペーパータオルには
さんで乾燥後、パーオキシダーゼ複合体の基質（ベーリ
ンガー・ジェンーエクスプレッシオンスキット（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｇｅｎ −Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｋ
ｉｔ）、商標、ベーリンガー・マンハイム社製にｍ６１
１）上でインキュベートした。この基質は、ゼラチンベ
ースに溶解したテトラメチルベンジジンであった。室温
で１０〜３０分間インキュベート後、陽性クローン（す
なわちズブチリシン・カールスベルク）が存在する場合
には青緑に発色した。
このようにして、安定なズブチリノン・カールスベルク
陽性クローンのプラスミド−ＤＮＡ（ｐＣ５０）を単離
した。
陽性クローンのプラスミド−ＤＮＡ（ｐＣ５０）を単離
した。
ｐｃ５０−ＤＮＡの特徴を調べるために、種々の制限酵
素（Ａｖａ ＩＳＢａｍ Ｈ［、Ｂａｔ ｔ、 Ｅｃ
。
素（Ａｖａ ＩＳＢａｍ Ｈ［、Ｂａｔ ｔ、 Ｅｃ
。
ＲＩ、ＨｐａＩＩ、Ｐｓｔ Ｉおよび５ｓｔＩ）各々に
よって、およびそれらを組み合わせて切断した。
よって、およびそれらを組み合わせて切断した。
パーティカルアガロースゲル電気泳動（文献７）によっ
て分離された切断生成物の分析の結果を、添付図面のプ
ラスミド地図に示す。
て分離された切断生成物の分析の結果を、添付図面のプ
ラスミド地図に示す。
クローンされたフラグメントに関連するＥｃ。
Ｒ１／ＰｓＬ［フラグメントおよび左側に参入したＥｃ
ｏＲＩフラグメントの両方を配列決定用ベクターｐＥＭ
ＢＬ８およびｐＥＭＢＬ９（文献８）に挿入し、チェー
ンターミネーションジデオキシ法（文献９）によって配
列を決定した。
ｏＲＩフラグメントの両方を配列決定用ベクターｐＥＭ
ＢＬ８およびｐＥＭＢＬ９（文献８）に挿入し、チェー
ンターミネーションジデオキシ法（文献９）によって配
列を決定した。
［文献］
１．７−７−、ノエイ（Ｍａｒｍｕｒ、 Ｊ、Ｘｌ ９
６１ ）ツヤ−ナル・オン・モレキュラー・バイオロジ
ー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）３ ： ２０８−
２１８２ ベルンハルト、カー（Ｂｅｒｎｈａｒｄ、
Ｋ、）、バー・ンユレンブ（Ｉｔ、’ Ｓｃｈｒｅｍｐ
ｆ）およびヴエー・チーベル（ＩＩ、 ＧｏｅｂｅｌＸ
ｌ ９７８）ジャーナル・オン・バタテリオロジ−（Ｊ
、 Ｑａｃｔｅｒｉｏｌ、）１３３： ８９７〜９０３ ３、バチルス・フェネティツク・ストック・センター（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓ′ｔｏｃｋ Ｃ
ｅｎｔｅｒ）Ｎｏ、Ａ４０ ４ バチルス・フェネティツク・ストック・センターＮ
ｏ、 Ｉ Ｅ ９ ５．７ニアテイス、ティー（〜Ｉａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ
）、イー・エフ・フリノノユ（Ｅ、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ）、ノエイ・サンプルツク（Ｊ、 Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋＸ Ｉ ９８２ ）、コールド・スプリング・ハーバ
−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ ｔｌａｒｂｏｒ） ６ カーン、エフ・エッヂ（Ｃａｈｎ、 Ｆ、 Ｉｔ、
）およびフォックス、エム・ニス（ＦＯＸ、 Ｍ、 ５
）（１９６８）ジャーナル・才ブ・バクテリオロノー、
９５： ８Ｃｉ７〜８７５ ７、メイヤーズ、ジェイ（Ｍｅｙｅｒｓ、 Ｊ、）、デ
ィー・サンチェス（Ｄ、 ５ａｎｃｈｅｚ）、エル・エ
ルウェル（Ｌ、 Ｅｌｗｅｌｌ）およびニス・ファルコ
ウ（Ｓ。
６１ ）ツヤ−ナル・オン・モレキュラー・バイオロジ
ー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）３ ： ２０８−
２１８２ ベルンハルト、カー（Ｂｅｒｎｈａｒｄ、
Ｋ、）、バー・ンユレンブ（Ｉｔ、’ Ｓｃｈｒｅｍｐ
ｆ）およびヴエー・チーベル（ＩＩ、 ＧｏｅｂｅｌＸ
ｌ ９７８）ジャーナル・オン・バタテリオロジ−（Ｊ
、 Ｑａｃｔｅｒｉｏｌ、）１３３： ８９７〜９０３ ３、バチルス・フェネティツク・ストック・センター（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓ′ｔｏｃｋ Ｃ
ｅｎｔｅｒ）Ｎｏ、Ａ４０ ４ バチルス・フェネティツク・ストック・センターＮ
ｏ、 Ｉ Ｅ ９ ５．７ニアテイス、ティー（〜Ｉａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ
）、イー・エフ・フリノノユ（Ｅ、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ）、ノエイ・サンプルツク（Ｊ、 Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋＸ Ｉ ９８２ ）、コールド・スプリング・ハーバ
−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ ｔｌａｒｂｏｒ） ６ カーン、エフ・エッヂ（Ｃａｈｎ、 Ｆ、 Ｉｔ、
）およびフォックス、エム・ニス（ＦＯＸ、 Ｍ、 ５
）（１９６８）ジャーナル・才ブ・バクテリオロノー、
９５： ８Ｃｉ７〜８７５ ７、メイヤーズ、ジェイ（Ｍｅｙｅｒｓ、 Ｊ、）、デ
ィー・サンチェス（Ｄ、 ５ａｎｃｈｅｚ）、エル・エ
ルウェル（Ｌ、 Ｅｌｗｅｌｌ）およびニス・ファルコ
ウ（Ｓ。
Ｆａｌｋｏｗ）（１９７５）ジャーナル・才ブ・バクテ
リオロノー、１２７： １５２９〜１５３７８、ダン
テ、エル（Ｄａｎｔｅ、 Ｌ、）、チー・カサレニ（Ｇ
、 Ｃａ５ａｒｅｎｉ）およびアール・コルテーゼ（Ｒ
，ＣｏｒｔｅｓｅＸ Ｉ ９８３ ）、ヌクレイツク・
アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓ１ｄｓ Ｒ
ｅ５ｅｒｃｈ）１上： １６４５〜１６５５ ９、エフ・サンガー（Ｆ、 Ｓａｎｇｅｒ）、ニス・ニ
ックレン（Ｓ、 Ｎ１ｃｋｌｅｎ）およびエイ・アール
・コウルソン（Ａ、 Ｒ，ＣｏｕｌｓｏｎＸｌ ９７７
）プロシーディンゲス・オン・ナショナル・アカデミ−
・オン・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃ
ａｄ。
リオロノー、１２７： １５２９〜１５３７８、ダン
テ、エル（Ｄａｎｔｅ、 Ｌ、）、チー・カサレニ（Ｇ
、 Ｃａ５ａｒｅｎｉ）およびアール・コルテーゼ（Ｒ
，ＣｏｒｔｅｓｅＸ Ｉ ９８３ ）、ヌクレイツク・
アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓ１ｄｓ Ｒ
ｅ５ｅｒｃｈ）１上： １６４５〜１６５５ ９、エフ・サンガー（Ｆ、 Ｓａｎｇｅｒ）、ニス・ニ
ックレン（Ｓ、 Ｎ１ｃｋｌｅｎ）およびエイ・アール
・コウルソン（Ａ、 Ｒ，ＣｏｕｌｓｏｎＸｌ ９７７
）プロシーディンゲス・オン・ナショナル・アカデミ−
・オン・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃ
ａｄ。
Ｓｃｉ、）米国、７４： ５４６３〜５４６７
第１図は、プラスミドｐｃ５０を含んで成るサブチロペ
プチダーゼＡの制限地図を示す模式図である。 特許出願人 ヘンケル・コマンディットゲゼルシャフト
・アウフ・アクチェン
プチダーゼＡの制限地図を示す模式図である。 特許出願人 ヘンケル・コマンディットゲゼルシャフト
・アウフ・アクチェン
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ポリペプチドのコード化のみを行う構造遺伝子、 作動配列における開始コドンおよび終止コドン、リボソ
ーム結合部位、 プロモーター から成る単離された二本鎖デオキシリボ核酸であって、
以下の構造： バチルス属微生物のＲＮＡポリメラーゼによって認識さ
れるプロモーター、 リボソーム結合部位、 開始コドン、 ズブチリシン・カールスベルクまたはそのタンパク質分
解活性サブユニットもしくはタンパク質分解活性変種を
コード化する、先導配列を含む構造遺伝子、 終止コドン を有することを特徴とし、４００を越えない塩基対を有
する特定の発現効果を伴わないＤＮＡ配列が両端に存在
していることもある二本鎖デオキシリボ核酸。 ２、第１項記載の作動型二本鎖ＤＮＡを少なくとも１種
含むことを特徴とする、バチルス属微生物用ハイブリッ
ドプラスミド。 ３、耐性マーカー、および外来性ＤＮＡ挿入のための少
なくとも１個の酵素特異的切断部位を有し、好ましくは
、制限酵素当たりの開裂部位が１個を越えないことを特
徴とする第２項記載のハイブリッドプラスミド。 ４、耐性マーカー、および外来性ＤＮＡ挿入のための好
ましくは４個を越えないＤＮＡ切断酵素特異的切断部位
を有し、より好ましくは各制限酵素当たりの開裂部位が
１個であることを特徴とする第２項または第３項記載の
ハイブリッドプラスミド。 ５、ｐＢＣＥ１６から誘導され、挿入体として第１項記
載のデオキシリボ核酸をＢａｍ Ｈ I 切断部位に含ん
でいる第２〜４項のいずれかに記載のハイブリッドプラ
スミド。 ６、第２〜５項のいずれかに記載のハイブリッドプラス
ミドを有する微生物株の選択方法であって、 第１の選択工程において、ハイブリッドプラスミドによ
って得られた耐性を利用して、ハイブリッドプラスミド
を有する株を有さない株から分離し、ズブチリシン・カ
ールスベルクに対する抗体を塗布したフィルムで平板培
地を被覆し、抗体−ズブチリシン・カールスベルク複合
体を、パーオキシダーゼを結合させた他の抗ズブチリシ
ン・カールスベルク抗体に結合させた後、パーオキシダ
ーゼによる発色反応を行うことによって、ズブチリシン
・カールスベルク産生株を該耐性株から選択する ことを含んで成る方法。 ７、第１〜６項のいずれかに記載のハイブリッドプラス
ミドを有するバチルス属の微生物株。 ８、枯草菌またはバチルス・リヘニフォルミスに属する
第７項記載の微生物株。 ９、第７項または第８項に記載の微生物株を培養するこ
とを含んで成るズブチリシン・カールスベルクの調製方
法。 １０、１５８位においてアミノ酸アスパラギンの代わり
にアミノ酸セリンを有し、１６１位においてセリンの代
わりにアスパラギンを有する修飾ズブチリジン・カール
スベルクの調製方法。
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