JPH0257186A - バチルスにおけるズブチリシン・カールスベルク生産用ハイブリッドプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、アルカリ性プロテアーゼであるズブチリシン
・カールスベルク、および関連するタンパク質分解酵素
を、バチルスにおいて、より多量に発現し得る新規なハ
イブリッドプラスミドに関するものである。

［従来技術］ 微生物、とりわけ細菌および真菌によって産生され、能
動輸送によって細胞から排出されて培地に蓄積される数
種のプロテアーゼが知られている。

この種の多くの酵素は、タンパク質の分解を要する分野
において既に商業的に用いられている。重要な分野とし
て、例えば、洗剤および清浄剤並びに動物の餌が挙げら
れる。プロテアーゼは、通例、至適活性を示すｐＨ域に
よって分類され、従って、アルカリ性、中性および酸性
プロテアーゼとして知られている。洗剤および清浄剤に
おいては、アルカリ性プロテアーゼが特に重要である。

例えば、一般名、ズブチリシンの名で知られる種類が重
要である。この名称は、バチルス・ズブチリス（枯草菌
）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する
が、これはとりわけこの種の株がズブチリシンを産生じ
得るからである。近年、研究者らは、天然の種々のズブ
チリシンを相互に分離し、その構造を解明することに成
功した（イー・エル・スミス（Ｅ、　Ｌ、　Ｓｍ１ｔｈ
）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）（１９６８）
２４３（９）、２］８４）。これに関連して、２種のズ
ブチリシン、すなわち、ズブチリシンＢＰＮ’およびズ
ブチリシン・カールスベルクが、実際上特に重要である
ことが見出されている。ズブチリシンＢＰＮ”は、しば
しばバチルス・アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）から得
られ、ズブチリシン・カールスベルクは、例えば、バチ
ルス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種の株の培養によって得ることが
できる。

多くのバチルス株は、しばしば、アルカリ性プロテアー
ゼを中性プロテアーゼ（メタロプロテアーゼ）との混合
物として排出する。

酵素の工業的重要性の見地（ズブチリシンＢＰＮ”プロ
テアーゼよりもズブチリシン・カールスペルクプロテア
ーゼの方が重要性がいくぶん高いと見なし得る）から、
一種の酵素もしくはその他の酵素を産生じ、かつ生成物
の工業的な製造に適当でもある株を見出すために多くの
試みが既に為されている。これに関連して、以下の西独
公開特許または特許明細書を引用する：西独公開特許第
１９４０４８８号、同第２０１８４５１号、同第２０４
４１６１号、同第２１０１８０３号、同第２　］、　２
１３９７号および同第２９２５４２７号、並びに英国特
許第１２６３７６５号、米国特許第３６２３９５７号、
米国特許第４２６４７３８号および欧州特許出願公開第
６６３８号。これらの特許出願または特許は、突然変異
および選択工程を何度も繰り返すことによって、最終的
に収量または生成物の性質が最適となった株を得る古典
的突然変異法に関する。このような突然変異は統計的に
起こり、そのために客観的に可能な最高の性質を有する
「仕立て」た株を得ることが困難であろうことは、当業
者に既知である。更に、このような培養株は、復帰突然
変異を起こし易い。すなわち、少なくとも幾つかの望ま
しい性質を失って、「野生」型となる傾向がある。

西独公開特許第３５２７９１３号は、以下の構造： バチルス属の微生物のＲＮＡポリメラーゼによって認識
されるプロモーター、−リボソーム結合部位、開始コド
ン、ズブチリシン・カールスヘルクマタはタンパク質分
解活性のあるサブユニットまたはタンパク質分解活性の
あるその変種をコードする、そのリーダー配列を含む構
造遺伝子、終止コドン、両末端に存在することもある特
定の発現効果を持たない４００を越えない塩基対を含ん
でいるオリゴヌクレオチド鎖 を有する２本鎖ＤＮＡを含有するバチルス属の微生物か
らのハイブリッドプラスミドを記載している。

この先行技術の背景に対し、本発明者らが取り組んだ問
題は、ズブチリシン・カールスベルクを更に多量に産生
じ得る、より好適なハイブリッドプラスミドおよびこの
様なハイブリッドプラスミドを含有している新規な微生
物を得ることであった。

従って、本発明は、バチルス属微生物用ハイブリッドプ
ラスミドであって、制限酵素ＡｖａＩのための１または
それ以上の制限部位を有するバチルスに好適な出発プラ
スミド、および所望により耐性マーカー、および バチルス属の微生物のＲＮＡポリメラーゼによって認識
されるプロモーター −リボソーム結合部位 開始コドン ズブチリシン・カールスペルクまたはそのタンパク質分
解活性のあるサブユニットまたはそのタンパク質分解活
性のある変種のみをコードする、そのリーダー配列を含
む構造遺伝子 終止コドン を含んでいる、出発プラスミドに挿入された単離された
２本鎖ＤＮＡからなり、特定の発現効果を持たない４０
０を越えない塩基対を含むオリゴヌクレオチド鎖が終止
コドンの下流に存在していることもあるハイブリッドプ
ラスミドであって、該挿入された２本鎖ＤＮＡが、バチ
ルス・リヘニフオルミスからのズブチリシン・カールス
ベルクのプロモーターおよび構造遺伝子を含有し、かつ
プロ／プレ−ズブチリシンの開始コドンから数えて２２
７位の位置で始まり、ＡｖａＩ開裂部位の始まりに至る
ことを特徴とするバチルス属微生物用ハイブリッドプラ
スミドに関するものである。

本発明によるハイブリッドプラスミドは、少なくとも１
箇所であって、好ましくは数箇所ではないＡｖａＩ制限
部位を有する、バチルスに好適な出発プラスミドを、Ａ
ｖａＩとは異なる制限酵素で開環し、開環したプラスミ
ドに、自体既知の方法によって、ズブチリシン・カール
スベルクまたはそのタンパク質分解活性のあるサブユニ
ットまたはその変種の発現に必要な全ての情報、並びに
プロ／プレ−領域の前にＡｖａＩ制限部位を有するＤＮ
Ａを挿入することによって調製することができる。次い
で、このプラスミドを閉環し、ＡｖａＩで２回切断し、
相当するライゲーション酵素で再結合させる。

一般に、ＡｖａＩの代わりに他の制限酵素を使用するこ
とができる。この点について、既知の部位特異的突然変
異誘発の手法を使用し、発現に必要なりＮＡ配列の外側
に適当な切断部位を設けることは当業者に周知である。

本発明が基礎とする方法は、科学的にまだ説明されたこ
とがない。プラスミドのサイズが小さくなると、事実上
、発現性が上昇するということは知られているが、発現
効率のこの様な上昇が、制限酵素ＡｖａＩ部位を有する
比較的小さなサブユニットの除去によって得られるであ
ろうとは予想されていなかった。従って、本発明によっ
て除去されるＡｖａＩ制限部位間のＤＮＡが、そのゲス
ト菌株におけるズブチリシン・カールスベルクの過剰産
生を阻止し得る調節エレメントを含んでいると推測され
る。

出発プラスミドに挿入されるのが好適な単離された２本
鎖ＤＮＡは、発現に重要な個々のサブ配列を機能し得る
順序で含んでいる。即ち、サブ配列は互いに機能的な関
係にある。このことは、ＲＮＡポリメラーゼのための認
識配列を有するプロモーターが存在し、これに−リボソ
ーム結合部位が続いていることを意味する。次ぎに、バ
チルスにおいて作動可能な開始コドン、好ましくは開始
のトリプレット、ＡＴＧが続く。開始トリプレットに次
いで、リーダータンパク質、次ぎに成熟ズブチリシン・
カールスベルクまたはその変種またはサブユニットのた
めの実際のシグナル配列が続く。

リーダー配列は、プロ配列、細胞からの酵素の排出に好
適に役立つプレ配列またはプレ−／プロ配列であると考
えられる。最後に、構造遺伝子の配列は、終止コドン、
好ましくはバチルスに認識される終止トリプレット、例
えばＴＡＡで終わる。

これに、ターミネータ−配列が続くことができ、好まし
い配列は、それ自身対合し得、従ってループ（ステムル
ープ）を形成する配列である。この様なターミネータ−
配列の機能は、特定の遺伝子産物のためのメツセンジャ
ーＲＮＡの合成を終止することである。

この単離２本鎖デオキシリボ核酸の両末端に更に別の配
列、好ましくは特定の発現効果がもたらされ得ない配列
が結合していてもよい。これらの配列は、他のＡｖａＩ
制限部位を含有すべきではない。

成熟酵素のための配列には、本発明の範囲内において、
ある種の変更を加えてもよい。第１の態様では、ズブチ
リシン・カールスベルクまたはその変種をコードしてい
る配列を提供する。好ましい配列は、バチルスに典型的
なコドンのみで構成された配列である。本発明の好まし
い態様の１つは、成熟酵素のための以下の配列： ＣＣＴＣＧＧＧＡＣＣＴＣＴ７ＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧ
ＣＴＧＡＡＧＣＧＧτＣＴＡＴＴＣＡＴＡＣＴＣＧＡＡ
ＣＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＡＣＡＱＴＴＡＴ
ＴＡＡＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧ
τ（（を含有している単離デオキシリボ核酸である。

この配列は、公開されたアミノ酸配列（Ｅ、Ｌ。

Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、（１９６８）２４３（９）、２１８４）のアミノ酸配
列中の１５７位および１６０位が変更されたズブチリシ
ン・カールスベルクをコードしている。

本発明の他の態様においては、非修飾ズブチリシン・カ
ールスベルク、すなわち、１５７位のアミノ酸セリンの
代わりにアミノ酸アスパラギンを、１６０位のアミノ酸
アスパラギンの代わりにアミノ酸セリンを含有するズブ
チリシン・カールスベルクをコードしている単離２本鎖
デオキシリボ核酸を使用することができる。このことか
ら、バチルスにおいて通常これらのアミノ酸をコードす
る塩基トリプレット（遺伝子コード）が、対応する単離
デオキシリボ核酸中に存在しなければならない。

上記のデオキシリボ核酸を、制限酵素ＡｖａＩのための
１箇所、好ましくは数箇所ではない制限部位を有してい
なければならない自体既知の出発プラスミドに挿入する
。また、出発プラスミドは１またはそれ以上の耐性マー
カーを含有しているのが好ましい。

耐性マーカーの機能は、このようにして形質転換された
、ハイブリッドプラスミド含有微生物を、その耐性によ
って、このようなハイブリッドプラスミドを含有しない
微生物から識別できるようにすることである。種々の出
発プラスミドが、当業者に入手可能である。これらは、
例えば、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフ
ェニコールまたは他の抗生物質に対する耐性マーカーを
有する。ハイブリッドプラスミドの調製に使用可能な種
々の出発プラスミドのうち、バチルス属の微生物に適当
なものを選択すべきである。従って、本発明のハイブリ
ッドプラスミドは、バチルスに適当な出発プラスミドか
ら得るのが最も好ましい。

このような種々の出発プラスミドは、専門文献に記載さ
れている。多種の適当なプラスミドが、例えば、バチル
ス・ジェネティック・ストック・センター（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）
のような寄託機関から入手可能である。好適な出発プラ
スミドは、例えば、ｐＢＣＥ１６、ｐｃ　１９４、ｐＵ
Ｂｌｌｏ、ｐＥ１９４、ｐｓＡ２１００、ｐＢＬ６０８
およびｐＢ　Ｄ　６４であり、これらは実際に適当なＡ
ｖａＩ制限部位を含有している。これらのプラスミドは
、以下の文献に記載されている：ベルンハルト、カー（
Ｂｅｒｎｈａｒｄ、　Ｋ、）、シュレンプ、　ハ（Ｓｃ
ｈｒｅｍｐｆ、　Ｈ，）およびデーベル、ヴ工−（Ｇｏ
ｅｂｅｌ、　Ｗ、）、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）±３３：　　８９
７〜９０３．１９７８゜ グリクツアン、チー・ヨツト（Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、
　Ｊ、　）、コンテンテ、ニス（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ、　
ｓ、　）およびドゥブナウ、デー（Ｄｕｂｎａｕ、　Ｄ
、）、ジャーナル・オブ・バクテリオロン−上λ４：　
３１８〜３２９．１９７８゜ウィリアムズ、デイ−・エ
ム（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｄ、Ｍ、）、ドゥヴアール、
イー・ジェイ（Ｄｕｖａｌｌ、　Ｅ、　　Ｊ、）および
口ヴエット、ピー・ニス（Ｌｏｖｅｔｔ、　ｐ、　Ｓ、
）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−１４６：　　
１１６２〜１１６５．１９８１゜ グリクツアン、チー（Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、）、シヴ
アクマー、アー・デー（Ｓｈｉｖａｋｕｍａｒ、　Ａ、
　Ｇ、）およびドゥブナウ、デー、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジ−１４１：　　２４６〜２５３．１９８
０゜エーリッヒ、ニス・デー（Ｅｈｌｉｃｈ、　Ｓ、　
Ｄ、　）、プルスチンーペテグリュコハ−（Ｂ　ｕｒｓ
ｚｔｙｎＰｅｔｔｅｇｒｅｗ＋　Ｈ，）、ストロイツブ
スキー、ヨツト（Ｓｔｒｏｙｎｏｗｓｋｉ、　Ｊ、）お
よびレーダーベルクツヨツト（Ｌｅａｄｅｒｂｅｒｇ、
　Ｊ、）、リコンビナント・モレキュールズ（Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ）：インパクト０
オン・サイエンス・アンド・ソサエティ（Ｉｍｐａｃｔ
ｏｎ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｏｃｉｅｔｙ）、６
９〜８０頁、ラーペンφプレス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓ
ｓ）、ニューヨーク、１９７７゜ ヴアイスブルム、ベー（Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、　Ｂ、）、
グラハム、エム・ライ（Ｇｒａｈａｍ、　Ｍ、　Ｙ、）
、グリクツアン。

チーおよびトウブナウ、デー、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジーーＬ迂７：　６３５〜６４３．１９７９゜ 適当な出発プラスミドの選択に際して、特定の制限酵素
によって、その特性を失うことなく線状になり得るもの
を選択することが重要である。出発プラスミドの特性は
、バチルスにおける複製能、耐性および発現能を含むと
理解される。適当な出発プラスミドを線状にし得る通常
の特異的制限酵素は、例えば、Ｂａｍ　ＨＬ　Ｅｃｏ　
ＲＬ　Ｈ４ｎｄ　ＩＩＩおよびＰｓｔ　　Ｉである。

本発明のハイブリッドプラスミドは、そのような１また
はそれ以上の切断部位に挿入された２本鎖単離デオキシ
リボ核酸を含んで成る。例えば、本発明の目的に特に適
当な出発プラスミドｐＢＣＥ１６は、ＢａｍＨＩによっ
て線状とされ、次いで本発明の２本鎖デオキシリボ核酸
の挿入後に閉環され得る。

ズブチリシン・カールスベルクをコードしているＤＮＡ
と出発プラスミドからの構築物のサイズを、挿入ＤＮＡ
フラグメントが、出発物質である酵素プラスミド中の制
限部位およびプレ−／プロ領域の前の制限部位の両者に
沿って切断される様な条件下でプラスミドに制限酵素Ａ
ｖａＩを作用させることによって減少させる。この様に
して形成された末端を、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼの様
な適当な酵素で再ライゲートすると、本発明のハイブリ
ッドプラスミドが得られる。

本発明はまた、特許請求の範囲の請求項１または２に記
載の種類のハイブリッドプラスミドを有するバチルス属
の微生物株に関するものである。

適当な微生物株を調製または形質転換するために、当業
者は、ハイブリッドプラスミドを組み込むことができ、
このようなハイブリッドプラスミドがその中で十分な安
定性を示す株を選択する。枯草菌、バチルス・リヘニフ
ォルミス、バチルス・アミロリクエファシエンスまたは
バチルス・セレウス種の株を、有利に形質転換すること
ができる。

これに関連して、形質転換株は、生成したプロテアーゼ
を、例えば後述の免疫学的方法を用いて検出することに
よって、非形質転換株から識別することができる。

本発明の一態様において、形質転換される株は、それ自
体プロテアーゼをわずかしか産生しないバチルス株、例
えば枯草菌株である。このような株は、寄託機関から入
手可能である。このようにして、所望のズブチリシン・
カールスベルクまたはズブチリシン・カールスベルクの
前記変種のみを産生じ得る株を得ることが可能である。

しかし、他のプロテアーゼまたはアミラーゼに加えてズ
ブチリシン・カールスベルクを排出する株を得ることも
同様に可能である。とりわけ、選択によって、酵素産生
能が特に高い株を得ることが可能である。

出発プラスミドに挿入される２本鎖ＤＮＡは、バチルス
・リヘニフォルミスのプロテアーセ産生株から単離され
るのが好ましく、そのような株のうち、例えば以下の株
が適当である：バチルス・リヘニフォルミス：ＡＴＣＣ
１０７１６、ＤＳＭ６４１並びにＤＳＭ３４０６および
ＤＳＭ３４０７株。これらの株を、西独国特許第２９２
５４２７号に記載のように培養する。次いで細胞を集め
る。集めた細胞を、プロトプラスト化する。すなわち、
ムレイン細胞壁を適当な酵素、特にリゾチームで破壊す
る。次いで、洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムで細
胞膜を破壊する。このようにして得たリゼートを、まず
ＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）および／またはプロテア
−ゼＫによる処理に付す。次いでＤＮＡを単離する。

染色体ＤＮＡを単離するいくつかの方法が、当業者に知
られている。このような方法を、単独で、または組み合
わせて行い得る。重要な一方法では、まずリゼートを、
エタノール中で分別沈澱に付すと、高分子量ＤＮＡフラ
グメントの分離が可能になり、単離される。密度勾配に
よる分離方法もある。この目的のために、塩化セシウム
／　Ｄ　Ｎ　Ａ　溶液中で密度勾配を作る。全量を種々
の分画に分けて、ＤＮＡが集まった特定の分画を分離し
、次の工程に付すことができる。多くの場合、クロロホ
ルムおよびイソアミルアルコール混合物などを用いた抽
出により、ＤＮＡの単離の前、または単離時に、はとん
どのタンパク質を除、去することが最も良い。

基本的には、ベルンハルトの方法（文献２）に従い、プ
ラスミドＤＮＡを同様に分離し得るのであるが、この場
合には、塩化セシウム密度勾配にエチジウムプロミド（
インターカレーションし得る赤色色素）を導入して、プ
ラスミドと染色体ＤＮＡの密度の差を人為的に確立する
ことが最もよい。

次に、精製した単離デオキシリボ核酸を、適当な緩衝液
（ｐＨ７〜７．５）中、制限酵素で切断する。

適当な制限酵素は、例えばＢａｍ　ＨＩ、　Ｓａｕ　３
Ａまたは特異的部位でＤＮＡを切断し得る他の酵素であ
る。染色体ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡの場合と同じ酵
素で処理しても、異なる酵素で処理してもよい。いずれ
の場合においても、損なわれていない構造遺伝子を実質
上確実に含む十分な長さのフラグメントを得るために、
染色体ＤＮＡを（切断し得る全箇所で）完全には切断し
てしまわないことが重要である。更に、次のＤＮＡリガ
ーゼによる結合を確実にするために、切断された染色体
とプラスミドＤＮＡの末端が互いに相捕的であることが
重要である。好ましくは染色体デオキシリボ核酸を線状
プラスミドの重量よりも大過剰に使用して、単離２本鎖
デオキシリボ核酸と線状プラスミドを混合する。好まし
くは１：２〜１：２０、特に好ましくは、１：５〜１：
１０の比で用いる。

混合したデオキシリボ核酸（約０．２ｍｇ／ｍρの濃度
で存在すべきである）を、次の工程においてＤＮＡリガ
ーゼでライゲートさせる。

出発プラスミド、とりわけ好ましくは出発プラスミドｐ
ＢＣＥ１６に挿入された２本鎖ＤＮＡは、好ましくはズ
ブチリシン・カールスペルクブロテアーゼのための、そ
のリーダー配列を含む構造遺伝子の開始コドンから数え
て一２２２位、プロ／プレ−領域の前に、ＡｖａＩ酵素
のための制限部位を有している。

このようにして得たライゲーション混合物を、バチルス
属、例えば枯草菌またはバチルス・リヘニフォルミスの
コンピテントな細胞の形質転換に使用する。うまく形質
転換された株を、それがプロテアーゼを産生ずることに
よって見分けたい場合には、元来プロテアーゼを産生じ
得ない、または少なくともズブチリシン・カールスベル
クを産生じ得ない株を形質転換することが好ましい。し
かし、出発株を形質転換してもよい。コンピテントな細
胞を得るためには、形質転換したい株を第１の最少培地
中で培養して定常期に達せしめ、次いで、第２の希釈最
少培地中で更に培養する。次いで、通例緩衝液中でこの
ように前処理した微生物にハイブリッドプラスミドをそ
のまま入れる。

その後、完全培地中で増殖（発育期）を行わせる（カー
ン、エフ・エッチ（Ｃａｈｎ、　Ｆ、　Ｈ，）およびフ
ォックス、エム・ニス（ＦＯＸ、　Ｍ、　Ｓ、）（１９
６８）ジャーナル・オブ・バタテリオロジー、９５：　
８６７〜８７５）。次いで、このようにして得られた微
生物を選択工程に付す。この工程では、通常バイブリッ
ドプラスミドが耐性を示す抗生物質含有培地でまず培養
する。このようにして、実質的に／％イブリッドプラス
ミドを１コピーまたはそれ以上含有する生物が第１の選
択工程において得られる。

次いで、他の選択工程において、ズブチリシン・カール
スベルク産生能について微生物を選択する。

免疫学的方法を、この選択工程に用いるのが好都合であ
ることがある。好ましい免疫学的方法は、ブルームおよ
びギルバートの方法に基づく西独国特許出願第３５２７
９１３号に記載されている。

（ブルーム、ニス（Ｂｒｏｏｍｅ、　Ｓ、　）およびギ
ルバート。

ダブリ−（Ｇｉｌｂｅｒｔ、　Ｗ、　）（１９７８）、
プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、、米国）、７５．２７４６〜２７４９）
。この方法では、ブツケル（Ｂ　ｕｃｋｅｌ）により記
載されているように、まず兎を免疫することによってズ
ブチリシン・カールスベルクに対する抗体を得る（ブッ
ケル、ヒー（Ｂｕｃｋｅｌ、　Ｐ、　）およびゼーライ
ン、ニー（Ｚｅｈｅｌｅｉｎ。

Ｅ、Ｘ１９．８１）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１６．１４
９〜１５９）。抗体のいくつかは、硫酸アンモニウムを
用いた沈澱およびＤＥＡＥクロマトグラフィーによって
濃縮し、他の抗体は、活性セファロース４Ｂを用いたア
フィニティークロマトグラフィーによってさらに濃縮す
る。

ズブチリシン・カールスベルクの存在は、以下のように
証明し得る： ＰｖＣフィルムに、ズブチリシン・カールスベルクに対
する抗体を塗布する。塗布したフィルムを、検査する細
菌の培地上に配置する。ズブチリシン・カールスベルク
が存在すれば、抗体が結合する。次の工程で、アフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製した、予めパー
オキシダーゼを結合させたズブチリシン・カールスベル
ク抗体を、抗体／ズブチリシン・カールスベルク複合体
に結合させる。

検出は、パーオキシダーゼ基質としてテトラメチルベン
ジジンを用いて行う。ズブチリシン・カールスベルク陽
性クローンが存在すると、青緑色に発色する。

この方法は、実際にズブチリシン・カールスベルクを産
生ずる株の特異的な認識を可能にする。

このことは、免疫学的方法に応答しない他の代謝産物を
も含む株を使用する場合には、特に重要である。大量の
形質転換株および非形質転換株から、完全にクローンを
単離し得ることも、この検出方法の利点である。

プロモーター領域で欠失を起こさせるためには、まず、
本発明のハイブリッドプラスミドの前駆体を比較的大量
に調製することが最も好適である（前記）。

次いで、本発明のプラスミドの前駆体を単離し、Ａｖａ
Ｉで切断する。次に、Ｔ４リガーセで環を閉じ、その後
、このＤＮＡを、例えば枯草菌またはバチルス・リヘニ
フォルミスであるバチルス株のコンピテントな細胞にト
ランスフオームすることができる（前記）。

別法として、コンピテントな細胞でなく、プロトプラス
トを用いて形質転換を行い得る。この目的のためには、
バチルス属微生物のムレイン細胞壁を適当な酵素で破壊
することによってまずプロトプラストを調製し、次いで
、好ましくは緩衝液中で、ハイブリッドプラスミドとポ
リエチレングリコールをプロトプラストに作用させる。

次いで、プロトプラストを再生培地上でさらに培養し、
このようにして得られた、本発明のハイブリッドプラス
ミドを含む無傷のく損なわれていない）微生物を、前記
選択方法によって他の株から分離する。

［実施例］ 実施例１　西独国特許出願第３５２７９１３号の方法に
よる、本発明ハイブリッドプラスミドの前駆体の調製 バチルス・リヘニフォルミスＤＳＭ６４１またはＡＴＣ
Ｃ１０７１６の染色体ＤＮＡを、マーマーの方法（文献
ｌ）を以下のように改良して単離した：　リゾチーム１
　ｍｇ／　１　ｍ１２含有１０　ｍＭ　トリス塩酸（ｐ
Ｈ７，５、シュクロース２５％含有）中、水中で細胞を
２０分間インキ−ベートした後、ＥＤＴＡおよびドデシ
ル硫酸ナトリウムを加えた。クロロホルム−イソアミル
アルコールによる抽出ヲ１回だけ行った。

パーティカルローターを用い、密度勾配（密度１　、７
１　ｇ／　ａｍ’）において、４２．００Ｏｒｐｍ／　
２０°Ｃで２０時間遠心して、ＤＮＡを他の細胞成分か
ら分離し、ドリッピング・アウト（ｄｒｉｐｐｉｎｇ　
　ｏｕｔ）によって分別した。

枯草菌のプラスミドＤＮＡを、ベルンハルトの方法（文
献２）に従い、密度勾配における遠心分離工程後、カニ
ユーレによって引き抜くことによって単離した。

枯草菌ＢＲ１５１（文献３）におけるクローニングのた
めのベクタープラスミドとしてｐＢＣＥ１６（文献２，
４）を用いた。

ズブチリシン・カールスベルクの遺伝子を損なわずに得
るために、バチルス・リヘニフォルミスＤＳＭ６４１ま
たはＡＴＣＣ１０７１６の染色体ＤＮＡを、制限エンド
ヌクレアーゼ５ａｕ３Ａによって部分的に切断した。

５ａｕ３Ａは４配列を認識し、ＢａｍＨＩは６配列を認
識する（すなわち、５ａｕ３Ａの方が切断頻度が高い）
ので、５ａｕ３Ａを用いて染色体ＤＮＡを不完全に切断
する切断部位の方が、ＢａｍＨＩによる切断部位よりも
一様に分布している。

以下の全ての場合において、マニアティス（文献５）の
ハンドブックによる条件下に切断を行った。ただし、不
完全切断の場合は、ベクターｐＢＣ，Ｅ１６（約３Ｍｄ
）に重心的に匹敵する切断生成物を得るために、通例１
時間のインキュベート時間を、適当に短縮した。ＤＮＡ
　ｌμｇ当たり、酵素約１単位を使用した。ベクターｐ
ＢＣＥ１６を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ　ＨＩ（
Ｓａｕ　３Ａを用いた場合に形成されるものと重複する
端を生成する）で線状にした。

インキュベート後、酵素を、半量（容量）のフェノール
で２回抽出した後、ＢａｍＨＩで切断したｐＢＣＥ１６
および５ａｕ３Ａで切断した染色体ＤＮＡを１１０の重
量比で混合し、混合物を、同容量のエーテルで５回抽出
し、次いで２倍容量のエタノールと共に一７０°Ｃで２
０分間インキュベートした後、遠心によってＤＮＡをペ
レット化した。

乾燥後、以下の緩衝液にＤＮＡを溶解した＝６６ｍＭト
リスー（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、５　ｍＭ
　Ｍ　ｇ　Ｃ（２ｔ、０．３ｍＭアデノシン三リン酸、
１．５ｍＭジチオトレイトールおよび０．０７１１Ｉｇ
／ｍＱ牛血清アルブミン。

ＤＮＡ濃度を２００μｇ／ｍＱに調節し、Ｔ４−ＤＮＡ
リガーゼを、ＤＮＡ　ｌμｇ当たりＩＵの濃度で加えた
。リガーゼ反応を、１６℃で約１８時間行った。次いで
、ライゲーション混合物（すなわちＴ４−ＤＮＡリガー
ゼでライゲートされたＤＮＡフラグメント）を、枯草菌
ＢＲ１５１のコンピテントな細胞の形質転換に使用した
。

枯草菌ＢＲ１５１のコンピテントな細胞は、カーノおよ
びフォックスが記載しているように、レアード（Ｌａｉ
ｒｄ）の方法によって調製した（文献６）。

０．１Ｍ　ＭｇＣ１２ｔ（０，１８ｍの、０．０５Ｍ　
ＣａＣＱ。

（０，１３ｎ＋のおよび１００ｍＭ　ＥＧＴＡ（−ｃチ
レングリコールービス−２−アミノエチルエーテルＮ、
Ｎ、Ｎ“　Ｎ　ｌ−テトラアセテートＸｐＨ７、３Ｘ０
１１３ｍのをコンピテントな細胞０．．８２ａ＋＋２に
加えて混合し、３０°Ｃで５分間穏やかに振盪した後、
ライゲーション混合物１０μＱまたは２μｇを加えた。

３０℃で３０分分間中かに振盪（６０ｒｐｍ）　Ｌり後
、２ＸＨＧＰ（カゼイン由来ペット２１０ｇ１酵母エキ
ス５ｇ、ＮａＣ（２５ｇおよびグルコース５ｇ）Ｉｎ＋
（！を加えた。

１６０ｒｐｉｎ／　３０°Ｃで９０分間振盪後、形質転
換細胞を選択する目的で、ガラスのへらを用い、０．５
％カゼインおよび１５Ｍｇ／ｍ１２テトラサイタリンを
含有しているカルシウム−カゼイネート−寒天（フラン
ツイア（Ｆｒａｎｚｉｅｒ）およびルツプ（Ｒｕｐｐ）
により改良されｔこもの一メルク（Ｍｅｒｃｋ））上に
細胞を塗り付けた（プレ−ト１枚当たり１００μｅ）。

プレ−トを、３７°Ｃで４８時間インキュベートした。

ジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ）を用いた
クロマトグラフィーによって精製したズブチリシン・カ
ールスベルク特異的抗体を、ベーリンガー／マンハイム
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／　Ｍａｒｔｎｈｅｉｍ）社製
［微生物における特異的遺伝子発現の免疫学的検出のた
めの試験用キット（ｔｅｓｔ　ｋｉｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ
　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　
ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ　ｉｎ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）Ｊと組み
合わせて用い、全形質転換細胞的３２，０００個のうち
プロテアーゼ陽性クローン６個を検出することができた
。

接種を繰り返すと、そのうち１個のクローンが、更に研
究を進めるのに十分な安定性を示した。ズブチリシン・
カールスベルクの検出は、以下のように行った： 油分を除去するために、ＰｖＣフィルムをインプロパツ
ール中で２分間洗った後、乾燥した。次いで、フィルム
１５枚を被覆するために、ＤＥＡＥ精製ズブチリシン・
カールスベルク特異的抗体ＩｇＧフラクション０．６ｍ
（！を含有する０、２Ｎ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９
，２）４０ｍＮ！中で１０分間インキュベートした。フ
ィルムを乾燥せずに以下のアフターコーチイブ浴に移し
、１０分間放置した： ＰＢＳ緩衝液＊　　　　　　　　４０ｍ（１牛グロブリ
ン　　　　　　　＋４．８ｍｇ牛血清アルブミン　　　
　　＋４０ｍｇ＊）ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７，５：　０．０
５ＭＫ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４・０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ０次に、
フィルムをペーパータオルにはさんで乾燥した。

次いで、■ｇＧ被覆フィルムを被覆寒天プレ−ト上に置
き、室温で２時間インキュベートした。

フィルムを除去し、付着細胞を冷水道水で濯ぎ落とした
後、フィルム両面を６°Ｃに調節したＰＢＳ緩衝液＋０
．１％牛血清アルブミンで濯いだ。乾燥せずに、フィル
ムを５０ｍρのコンジュゲート浴（０，１％牛血清アル
ブミン含有ＰＢＳ緩衝液５０ｍＱ＋パーオキシダーゼを
結合させた抗ズブチリシン・カールスベルクＴｇＧ抗体
１μのに移し、室温で４時間放置した。

次いでフィルムを冷水道水で濯いだ後、両面を６℃に調
節したＰＢＳ緩衝液＋０．０５％トウィーン２０＋０．
１％牛血清アルブミンで濯いだ。

フィルムをペーパータオルにはさんで乾燥した後、結合
しているパーオキシダーゼの基質（ベーリンガー・ジェ
ンーエクスプレッシオンスキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ　Ｇｅｎ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｋｉｔ）、商標、
ベーリンガー・マンハイム社製Ｇｍ６１１）上でインキ
ュベートした。この基質は、ゼラチンベースに溶解した
テトラメチルベンジジンであった。室７１Ａで１０〜３
０分間インキュベートすると、陽性コロニーが存在する
場合（すなわちズブチリシン・カールスベルクが存在す
る場合）には青緑に発色した。

このようにして、安定なズブチリシン・カールスベルク
陽性クローンのプラスミドＤＮＡ（ｐＣ５０）を単離し
た。

ｐｃ５０−ＤＮＡの特徴を調べるために、種々の制限酵
素（Ａｖａ　Ｉ、ＢａｍＨＪ、Ｂａｌ　　ＩＸＥｃ。

ＲＬ　Ｈｐａ　ＩＩ、Ｐｓｔ　Ｔ、　Ｓｓｔ　Ｉおよび
５ｔｕｂ）各々によって、およびそれらを組み合わせて
切断した。

パーティカルアガロースゲル電気泳動（文献７）によっ
て分離された切断生成物の分析の結果を、添付の第１図
（プラスミド地図）に示す。

ｐＣ５０からのプロテアーゼ遺伝子の適当なフラグメン
トを配列決定用ベクターｐＥＭＢＬ８またはｐＥＭＢＬ
９（文献８）に再クローニングした後、チェーン・ター
ミネーション・ジデオキシ法（文献９）によってその配
列を決定した。

本発明のハイブリッドプラスミドの前駆体の回収プラス
ミドｐＣ５０のＤＮＡを、前記の様にして単離した。

ｐＣ５０（２μｇ）を６単位のＡｖａＩまたは６単位の
ＡｖａＩと６単位の５ｔｕＩで切断した。ＡｖａＩ／Ｓ
ｔｕ’ｌ二重消化の場合は、ＡｖａＩ切断による突出末
端を、２５ミリモルの４種のデオキシヌクレオチド三リ
ン酸および２単位／μ９のフレノウポリメラーゼと一緒
に室温で１５分間インキュベートすることによって、平
滑にした。７０°Ｃで１０分間インキュベートすること
によって、ポリメラーゼを不活化した。１単位／μ９の
Ｔ４リガ−ゼで再ライゲーションした後、ライゲーショ
ン混合物を、枯草菌２０２のコンピテントな細胞（参考
文献６に従って調製した０２００ｍのにトランスフオー
ムした。テトラサイタリン耐性形質転換体のプラスミド
ＤＮＡ（７，５μｇ／７１１１２）をバーンボイムおよ
びドリーズの方法（文献１０）によって処理し、Ｅｃｏ
ＲＩまたはＡｖａＩで切断して調べた。

それぞれのクローンを正しい切断パターンに基づいて選
択した。ｐＫＬｌにおいては、Ａｖａｒフラグメントが
欠失しくＡｖａＩ制限部位はそのまま残る）　；　ｐＫ
　Ｌ　２においては、ＡｖａＩ／５ｌｕｒフラグメント
が失われる（第３図）。

欠失構築物ｐＫＬｌおよびｐＫ　Ｌ　２が依然としてプ
ロテアーゼ遺伝子を発現させるか否かを調べるために、
枯草１２０２（ｐｃ５０）、２０２（ｐＫＬｌ）、２０
２（ｐＫＬ２）および負の対照としての２０２（ｐＢＣ
Ｅ１６）株を前記免疫学的試験に付した。

ズブチリシン・カールスベルクの存在を表すペルオキシ
ダーゼ−コンジュゲートした抗原／抗体複合体の青緑色
は、２０２（ｐｃ５０）、２０２（ｐＫＬＩ）の場合の
み形成され、２０２（ｐＫＬ２）および２０２（ｐＢＣ
Ｅ１６）は、免疫反応を全く示さなかった。

亀上人　免疫学的定性試験 抗ズブチリシン 奉カールスベル ク抗体との反応 」− Ｂ、リヘニフォルミスＤＳＭ６４１ Ｂ　ズブチリシン２０２ Ｂ、ズブチリシン２０２（ｐＢＣＥ１６）Ｂ　ズブチリ
シン２０２（ｐｃ５０） Ｂ、ズブチリシン２０２（ｐＫＬｌ）　　　　　　＋Ｂ
、ズブチリシン２０２（ｐＫＬ２） 十 この結果は、枯草菌におけるズブチリシン・カールスベ
ルクの発現のための重要な領域がＡｖａＩ制限部位とＳ
　ｔｕ　Ｉ制限部位の間に存在していることを示す。こ
のことはまた、ヤコブ等（文献１１）が、５ｔｎｌ制限
部位からプロテアーゼ構造遺伝子の方向のプロテアーゼ
ＤＮＡのみを含有するハイブリッドプラスミドを用いて
も枯草菌における発現を見い出し得なかった理由を説明
する。

プラスミドｐＫＬ１を含有しているバチルス・リヘニフ
ォルミス株は、ｐＣ５０を含有している株と比較して、
振とうフラスコ中、より多量のプロテアーゼの産生を示
した。

［文献］ １．７−７＋、　　ジェイ（Ｍａｔｍｕｒ、　Ｊ、）（
１９６１）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）３　：　２０８〜
２１８２、ベルンハルト、カー（Ｂｅｒｎｈａｒｄ、　
Ｋ、）、バー・シュレンプ（１，Ｓｃｈｒｅｍｐｆ）お
よびヴエー・デーベル（Ｗ、　Ｇｏｅｂｅｌ）（１９７
８）ジャーナル・オブ・バタテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、）ユ□３３：　　８９７〜９０３ ３、バチルス・ジェネティック・ストック・センター（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅ
ｎｔｅｒ）Ｎｏ。

Ａ４０ ４、バチルス・ジェネティック・ストック・センターＮ
ｏ、ＩＦ５ ５、マニアテイス、ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ）
、イー・エフ・フリッシュ（Ｅ、　Ｐ、　Ｆｒ１ｔｓｃ
ｈ）、ジエイ・サンプルツク（Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ
）（１９８２）、コールド・スプリング・バー”’−（
、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ） ６、カーン、エフ・エッチ（Ｃａｈｎ、　Ｆ、　ｌ（、
）およびフォックス、エム・ニス（Ｆａｘ、　Ｍ、　Ｓ
、　）（１９６８）ジャーナル・オブ・バタテリオロジ
ー、ｌ１：８６７〜８７５ ７、メイヤーズ、ジェイ（Ｍｅｙｅｒｓ、　Ｊ、）、デ
イ−・サンチェス（Ｄ、　５ａｎｃｈｅｚ）、エル・エ
ルウェル（Ｌ、　Ｅｌｗｅｌｌ）およびニス・ファルコ
ウ（ＳＰａｌｋｏｗＸ　１９７５　）ジャーナル・オブ
・ノくクテリオロジー、１２７：　　１５２９〜１５３
７８、デンテ、エル（Ｄｅｎｔｅ＋　Ｌ、）、デー・カ
サレニ（Ｇ、　Ｃａ５ａｒｅｎｉ）およびアール・コル
テーゼ（Ｒ，Ｃｏｒｔｅｓｅ）（ｔ　９８３　）、ヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｓ
１ｄｓ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ）１１：　　１６４５〜１６５
５ ９、エフ・サンガー（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ）、ニス・二
・ソ＝４０ クレン（Ｓ、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ）およびエイ・アール・
コウルソン（Ａ、　Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ）（１９７７）
プロシーデインゲス・オブ舎ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、）米国、ヱ４：　５４６３〜５４６７１０、エ
イチ・シー・バーンポイム（）１式、　Ｂｉｒｎｂ。

ｉｍ）およびジェイ・ドリー（Ｊ、　Ｄｏｌｙ）（１９
７９）ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ。

Ａｓ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）７　：　　１５１３１１、エム
・ヤコブ（Ｍ、　Ｊａｃｏｂｓ）、エム・エリアソン（
Ｍ、　Ｅｌｉａｓｓｏｎ）、エム・ウーレン（Ｍ、　ｕ
ｈ＋ｅｎ）およびジェイ・ジェイ・フロック（Ｊ、　Ｊ
、　ＦｌｏｃｋＸｌ　９８５）ヌクレイツク・アシッズ
・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｓ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　１
３　：　８９１３

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐｃ　５０の制限および機能地図
であり、第２図は、プラスミドｐＫＬ１の制限および機
能地図であり、第３図は、プラスミドｐＫＬ２の制限お
よび機能地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチルス属微生物用ハイブリッドプラスミドであっ
   て、ＡｖａＩの様な制限酵素のための１またはそれ以上
   の制限部位を有するバチルスに好適な出発プラスミド、
   および所望により耐性マーカー、および 一バチルス属の微生物のＲＮＡポリメラーゼによって認
   識されるプロモーター −リボソーム結合部位 −開始コドン −ズブチリシン・カールスベルクまたはそのタンパク質
   分解活性のあるサブユニットまたはそのタンパク質分解
   活性のある変種のみをコードする、そのリーダー配列を
   含む構造遺伝子 −終止コドン を含んでいる、出発プラスミドに挿入された単離された
   ２本鎖ＤＮＡからなり、特定の発現効果を持たない４０
   ０を越えない塩基対を含むオリゴヌクレオチド鎖が開始
   コドンの下流に存在していることもあるハイブリッドプ
   ラスミドであって、該挿入された２本鎖ＤＮＡが、バチ
   ルス・リヘニフォルミスからのズブチリシン・カールス
   ベルクのプロモーターおよび構造遺伝子を含有し、かつ
   プロ−／プレ−ズブチリシンの開始コドンから−２２７
   位の位置から始まることを特徴とするバチルス属微生物
   用ハイブリッドプラスミド。 ２、挿入された２本鎖ＤＮＡがプレ−／プロ−領域の前
   のＡｖａＩ制限部位で始まる、バチルス・リヘニフォル
   ミスからのズブチリシン・カールスベルクのプロモータ
   ーおよび構造遺伝子を含有し、ハイブリッドプラスミド
   のサイズが、制限酵素ＡｖａＩで２回切断することによ
   り、出発プラスミド側のＡｖａＩ切断部位と挿入ＤＮＡ
   のプレ−／プロ−領域の上流の制限部位の間に存在する
   ＤＮＡフラグメント分だけ減少していることを特徴とす
   る、請求項１に記載のハイブリッドプラスミド。 ３、プラスミドｐＢＣＥ１６から誘導されることを特徴
   とする請求項１または２に記載のハイブリッドプラスミ
   ド。 ４、少なくとも１種の耐性マーカーを含むことを特徴と
   する請求項１〜３のいずれかに記載のハイブリッドプラ
   スミド。 ５、バチルスに好適なプラスミドを開環し、ＡｖａＩ制
   限部位およびズブチリシン・カールスベルクの生産に必
   要な情報を含有する単離ＤＮＡを挿入し、切断し、Ａｖ
   ａＩ両制限部位で再ライゲートすることを特徴とする請
   求項３または４に記載のハイブリッドプラスミドの製造
   方法。 ６、構造遺伝子の開始コドンから−２２２位にＡｖａＩ
   制限部位を有する、リーダー配列を含むＤＮＡを使用す
   ることを特徴とする請求項５に記載の方法。 ７、請求項１、２、３または４に記載のハイブリッドプ
   ラスミドを含有するバチルス属の微生物株。 ８、枯草菌またはバチルス・リヘニフォルミス種に属す
   ることを特徴とする請求項７に記載の微生物株。 ９、請求項７または８に記載の微生物株を培養すること
   を特徴とするズブチリシン・カールスベルクの製造方法
   。 １０、１５７位のアミノ酸アスパラギンの代わりにアミ
   ノ酸セリンを含有し、１６０位のセリンの代わりにアス
   パラギンを含有している修飾ズブチリシン・カールスベ
   ルクが産生されることを特徴とする請求項９に記載の製
   造方法。