DE3928046A1 - Hybridplasmide zur erzeugung von subtilisin carlsberg in bacillus - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue Hybridplasmide, die es ermöglichen, die alkalische Protease Subtilisin Carlsberg und damit verwandte pro­ teolytische Enzyme in erhöhten Mengen in Bacillus zu exprimieren.

Es sind zahlreiche Proteasen bekannt, die von Mikroorganismen, ins­ besondere Bakterien und Pilzen gebildet werden und durch aktiven Transport aus der Zelle ausgeschleust werden, so daß sie sich im Kulturmedium sammeln. Zahlreiche Enzyme dieser Art finden bereits technische Anwendung in Verfahren, bei denen es darum geht, Proteine abzubauen. Wichtige Anwendungen sind beispielsweise Wasch- und Rei­ nigungsmittel oder auch Tiernahrungsmittel.

Aufgrund der technischen Bedeutung der Enzyme, die für die Protease Subtilisin Carlsberg etwas höher anzusetzen ist als für die Protease Subtilisin BPN′, hat es in der Vergangenheit bereits zahlreiche Ver­ suche gegeben, Stämme aufzufinden, die das eine oder andere Enzym produzieren und die sich zur technischen Gewinnung der Produkte eignen. Verwiesen sei beispielsweise auf die folgenden deutschen Offenlegungs- oder Patentschriften: DE 19 40 488, DE 20 18 451, DE 20 44 161, DE 21 01 803, DE 21 21 397 und DE 29 25 427 sowie auf GB 12 63 765, US 36 23 957, US 42 64 738 und EP-A 6 638. Bei den genannten Anmeldungen bzw. Patenten handelt es sich um klassische Mutationsverfahren, bei denen durch die häufige Wiederholung von Mutations- und Selektionsschritten letztendlich Produktionsstämme gewonnen werden, die im Hinblick auf Ausbeute oder Produktqualität optimiert sind. Es ist dem Fachmann bekannt, daß ein derartiger Mutationsprozeß statistisch abläuft, so daß kaum zu erwarten ist, daß dabei maßgeschneiderte Stämme entstehen, die das objektiv höchstmögliche Leistungsniveau aufweisen. Darüber hinaus können derartige Zuchtstämme auch zu Rückmutationen neigen, d. h. sie ver­ lieren ihre günstigen Eigenschaften, zumindest teilweise und ver­ wildern.

In der deutschen Offenlegungsschrift DE 35 27 913 werden Hybrid­ plasmide für Mikroorganismen der Gattung Bacillus beschrieben, die eine doppelsträngige DNA enthalten, die den folgenden Aufbau auf­ weist: Promotor, der von der RNA-Polymerase von Mikroorganismen der Gattung Bacillus erkannt wird, Ribosomenbindungsstelle, Startcodon, Strukturgen, das für Subtilisin Carlsberg oder dessen Teilstücke mit proteolytischer Aktivität oder Varianten mit proteolytischer Akti­ vität einschließlich deren Leader-Sequenzen codiert, Stopcodon. Ein derartiges Konstrukt, bei dem die eingefügte DNA-Sequenz aus Bacil­ lus licheniformis stammt und für Subtilisin Carlsberg kodiert und der restliche Plasmidteil von pBC16 stammt, wird Plasmid pC50 ge­ nannt.

In der deutschen Patentanmeldung P 38 21 491 wird beschrieben, daß Plasmide, die eine noch höhere Protease-Expression bewirken, dadurch erhalten werden können, daß man das DNA-Stück, das in pC50 zwischen zwei relativ benachbarten AvaI-Schnittstellen steht, und einen Teil des Promotors beinhaltet, durch Schneiden mit AvaI und Ligieren entfernt.

Vor dem Hintergrund dieses Standes der Technik ist es Aufgabe der Erfindung Plasmide zu liefern, die eine noch höhere Protease- Expression bewirken.

Gegenstand der Erfindung sind daher Hybridplasmide zur Erzeugung von Protease in Bacillus, bestehend aus einem Bacillus-gängigen Grund­ plasmid und einer DNA-Sequenz, die für eine Protease vom Typ Subti­ lisin Carlsberg kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease- Sequenz eine DNA Sequenz eingefügt ist, die für eine Protease vom Typ Subtilisin Carlsberg kodiert und up-stream durch die dem Struk­ turgen am nächsten benachbarte AvaI-Schnittstelle, down-stream durch die am nächsten benachbarte SstI-Schnittstelle begrenzt ist.

Bevorzugt ist jedenfalls das Schnittstück zwischen der SstI-Schnitt­ stelle und der dieser Schnittstelle am nächsten benachbarten AvaI- Schnittstelle in einem Ausgangsplasmid wie pC50. Besonders bevor­ zugtes Ausgangsmaterial ist ein Plasmid pC50 gemäß DE 35 27 913. Hier gilt, daß wenn die in Beziehung zur Leserichtung vor dem Pro­ teasegen und ihm am nächsten liegende Aval-Schnittstelle am Basen­ paar 1 schneidet, so schneidet die Restriktionsendonuclease SstI am Basenpaar 1539 hinter dem Proteasegen bzw. hinter seinem Transcrip­ tions-Terminator.

Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Plasmide wird von Plasmiden ausgegangen, die das Strukturgen von Subtilisin Carlsberg oder einem Subtilisin Carlsberg ähnlichen Enzym enthalten.

Unter einem Subtilisin Carlsberg ähnlichen Enzym werden hier solche Enzyme verstanden, die in bis zu 1% der Aminosäuren von Subtilisin Carlsberg abweichen und ebenfalls Proteaseaktivität im vergleichba­ ren Umfang aufweisen, wobei die Strukturgene die genannten Schnitt­ stellen aufweisen müssen.

Bevorzugtes Ausgangsmaterial ist ein Plasmid pC50, hergestellt aus einem pBC16-Anteil und dem Strukturgen von Subtilisin Carlsberg aus Bacillus licheniformis DSM641 oder aus Bacillus licheniformis DSM 5440. Das entsprechende Ausgangsplasmid trägt die Bezeichnung pC50.

Um mehrere zusätzliche Restriktionsenzym-Spaltstellen für Umklo­ nierungen zur Verfügung zu haben, wurde das Subtilisin Carlsberg- Proteasegen umfassende AvaI/SstI-Fragment aus pC50 (Fig. 1) in die Multiple Cloning site des E. coli Vektors pUC19 (1) kloniert.

Hierfür wurde pC50 mit AvaI und SstI und pUC19 (Fig. 2) mit Xmal und Sstl gespalten. Um die Klonierung des Vektorteils aus pC50 in pUC19 zu verhindern, wird pC50 zusätzlich mit PvuII gespalten, das das den Proteasegenteil tragende AvaI/SstI-Fragment intakt läßt, aber den pBC16-Vektorteil 2mal schneidet. Nach der Inkubation wurden die Enzyme 2mal mit der halben Volumen Phenol, bezogen auf DNA-Lö­ sung, extrahiert, dann im mengenmäßigen Verhältnis von 1 : 1 ge­ mischt, das Gemisch 5mal mit gleichem Volumen Ether extrahiert und sodann mit doppeltem Volumen Ethanol 20 Minuten bei -20°C inkubiert und die DNA durch Zentrifugation pelletiert. Nach Trocknen wurde die DNA in geeignetem Puffer gelöst. Die DNA-Konzentration wurde auf 20 µg/ml eingestellt und T4-DNA-Ligase in einer Konzentration von 1 U/µg eingesetzter DNA zugegeben. Die Ligasereaktion wurde ca. 18 h bei 6°C durchgeführt.

1 µg der mittels T4-DNA-Ligase verknüpften DNA-Fragmente wurden dann zur Transformation kompetenter Zellen (2) von Escherichia coli JM103 (3) benutzt. Selektioniert wurde auf LB-Medium (Luria-Broth) mit 1% Agar mit 100 µg/ml Ampicillin.

In Schnell-Lysaten wurde durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym PstI, das sowohl im Insert als auch im pUC19-Vektorteil im Multiple Cloning-Bereich spaltet, anhand des korrekten Spaltmusters der richtige Klon ausgewählt und als pH9 (Fig. 3) bezeichnet.

Die DNA wurde nach der SDS-NaCl-Methode von Guerry et al. (4), mit nachfolgender Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation gewon­ nen.

Als Vektoren für die Klonierung des AvaI/SstI-Proteasegenfragments wurden die Bacillusvektoren pUB110 (5; Fig. 4) und pBC16 (6; Fig. 5) verwendet. Diese beiden Plasmide sind weitgehend homolog und un­ terscheiden sich im wesentlichen nur in der Resistenz-Determinante (Kanamycin für pUB110 und Tetracyclin für pBC16). Zum Zwecke der Klonierung wurden sowohl pH9 als auch pUB110 und pBC16 mit BamHI und EcoRI gespalten, wobei bei letzterem die EcoRI-Spaltung nur unvoll­ ständig erfolgen darf, da zwei EcoRI-Spaltstellen in pBC16 vorhanden sind, von denen die Spaltstelle in Pos. 1 wie die entsprechende EcoRI-Spaltstelle in pUB110 für die lnsertion des EcoRI/BamHI-P300- Protease-Fragments genutzt werden soll. BamHI- und EcoRI-Spaltstel­ len in pH9 stammen aus der Multiple Cloning site von pUC19. Auch im Falle des pH9 muß die EcoRI-Spaltung unvollständig vorgenommen wer­ den, da eine zusätzliche EcoRI-Spaltstelle im Proteasegen existiert.

Für die Ligation wurde pH9 zu pUB110 bzw. pBC16 im mengenmäßigen Verhältnis 2 : 1 eingesetzt. Die Gesamt-DNA-Konzentration betrug 200 µg/ml.

Die Transformation erfolgte in beiden Fällen in Bacillus subtilis SB202 (7).

Die Transformanten wurden auf Vollmediumagarplatten mit 15 µg/ml Tetracyclin für die Ligation mit pBC16 als Vektor, und 10 µg/ml Kanamycin für die Ligation mit pUB110 als Vektor, selektioniert. Für die Selektionierung Protease-produzierender Klone wurde eine immu­ nologische Methode eingesetzt, die auf einem Verfahren von Broome und Gilbert basiert (8, 9). Diese Methode wurde bereits bei der ursprünglichen Klonierung des Subtilisin Carlsberg Proteasegens in der Offenlegungsschrift DE 35 27 913 A1 angewandt.

Immunologisch positive Klone wurden mittels Restriktionsanalyse von Schnell-Lysaten identifiziert und der pBC16-Abkömmling als pC51 (Fig. 6) sowie das pUB110-Derivat als pH70 (Fig. 7) bezeichnet.

Beispiel 1: Expression von Subtilisin Carlsberg Protease in Bacillus subtilis

Bacillus subtilis SB202 pC51 und Bacillus subtilis SB202 pH70 wurden bei 37°C vergleichend zu Bacillus subtilis SB202 in Schüttelkolben in einem für Proteaseproduktion geeigneten Komplexmedium (9,1 g/l KH₂PO₄, 11,81g/l K₂HPO₄, 1 g/l MgSO₄×7H₂O, 0,5 g/l MnSO₄×2H₂O, 0,2 g/l CaCl₂x2H₂O, 3 g/l Sojamehl, 18 g/l Casein nach Hammarsten, 180 g/l Amylase-behandelte Kartoffelstärke) angezogen. Zu verschie­ denen Zeitpunkten wurden Proben zur Bestimmung der Proteaseaktivität genommen. Die Proteaseaktivität wurde mittels Cenco-Autoanalysator (Firma Skalar) gemessen. Dabei wird die enzymhaltige Lösung mit dem Substrat Dimethylcasein inkubiert. Es entstehen durch Proteolyse primäre Aminogruppen, die unter Bildung eines stabilen gelben Kom­ plexes mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure reagieren. Die Farbmes­ sung erfolgt im kontinuierlichen Durchfluß bei 420 nm.

Stamm
relative Proteaseaktivität
Bacillus subtilis SB202
1
Bacillus Subtilis SB202pC51	ca. 2
Bacillus subtilis SB202pH70 (DSM 5479)	60-80

Beispiel 2: Transformation von Bacillus licheniformis DSM 5440

Von den Stämmen Bacillus subtilis SB202pC51 und Bacillus subtilis SB202pH70 (DSM 5479) wurde Plasmid-DNA aufgearbeitet (10) und Protoplasten von Bacillus licheniformis DSM5440 hiermit trans­ formiert. Die Transformanten wurden auf DM3-Agar (11) mit 15 µg/ml Tetracyclin für die Selektionierung von pC51 und auf Mannitol-Agar (12) mit 10 µg/ml Neomycin für die Selektionierung von pH 70 selek­ tioniert.

Gewachsene Kolonien wurden auf Calcium-Caseinat-Agar (Merck) mit 15 µg/ml Tetracyclin (pC51) bzw. 10 µg/ml Kanamycin (pH70) über­ impft. Transformanten, die nach Wachstum einen gegenüber E312 grö­ ßeren Lysehof auf diesen Platten aufwiesen, wurden nach Restrikti­ onsenzymanalyse von Schnell-Lysaten auf ihre Übereinstimmung mit den für die Transformation verwendeten Plasmid-DNAs überprüft.

Beispiel 3: Expression von pC51/pH70 in Bacillus licheniformis DSM5440

Bacillus licheniformis DSM5440, der die Plasmide pC50, pC51 oder pH 70 enthält, wurde in Schüttelkolben in einem für Proteaseproduk­ tion geeigneten Komplexmedium (2,4 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄×7H₂O, 0,5 g/l MnSO₄×2 H₂O, 0,2 g/l CaCl₂×2 H₂O, 3 g/l Sojamehl, 12/g/l Casein nach Hammarsten, 120 g/l Amylase-behandelte Kartoffelstärke) bei 39°C und 34°C angezogen. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben zur Bestimmung der Proteaseaktivität genommen. Die Protease­ messungen wurden mit N-CBZ-valin-p-nitrophenylester als Substrat durchgeführt, wobei das Substrat in N-CBZ-Aminosäure und p-Nitro­ phenol gespalten wird. Die Bildung des p-Nitrophenols wurde als Maß für die Aktivität der Protease bei 340 nm im Photometer gemessen (13).

Bei 34°C kommt es unter den angegebenen Bedingungen offensichtlich zu einer besseren Proteaseausbeute mit den rekombinaten Plasmiden pC50, pC51 und pH70; was vermutlich auf die bessere Sauerstoffver­ sorgung der Stämme bei gleichzeitig langsamerem Wachstum und höherer Stabilität der Plasmide zurückzuführen ist.

Methoden

Wenn im Text nicht andere Angaben gemacht wurden, wurde insbesondere für folgende Methoden das Handbuch von Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) zugrun­ degelegt:

* Phenolisierung von DNA
* Ethanolfällung von DNA
* Ligation von DNA

Literatur

1. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. & Messing, J., Gene 33: 103 (1985)
Kommerziell erhältlich durch z. B. Biolabs New England
2. Mandel, M. & Higa, A., J. Mol. Biol. 52: 154 (1970)
3. Messing, J., Crea, J. R. & Seeburg, P. H., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981)
4. Guerry, P., LeBlanc, D. J. & Falkow, S., J. Bacteriol. 116: 1064 (1973)
5. Bacillus Genetic Stock Center Nr. 1E6
6. Bacillus Genetic Stock Center Nr. 1E9/DSM 402
7. Copeland, J. C. Marmur, J. Bacteriol. Rev. 32: 302-312 (1968)
8. Broome, S. & Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sc. U.S.A. 75- 2746 (1978)
9. Buckel, P. & Zehelein, E., Gene 16: 149 (1981)
10. Godson, G. N. & Vapnek, D., Biochim. Biophys. Acta 299: 516 (1973)
11. Chang, S. & Cohen, S. N., Molec. Gen. Genet. 168: 111 (1979)
12. Bourne, N., Dancer, B. N., J. Gen. Microbio. 132: 251 (1986)
13. Dupaix, A., Bechet, J.-J. & Roncons, C., Biochem. Biophys. Res. Commun. 41: 464 (1979)

Claims (5)

1. Hybridplasmide zur Erzeugung von Protease in Bacillus, bestehend aus einem Bacillus-gängigen Grundplasmid und einer DNA-Sequenz, die für eine Protease vom Typ Subtilisin Carlsberg kodiert, da­ durch gekennzeichnet, daß als Protease-Sequenz eine DNA Sequenz eingefügt ist, die für eine Protease vom Typ Subtilisin Carls­ berg kodiert und up-stream durch die dem Strukturgen am nächsten benachbarte AvaI-Schnittstelle, down-stream durch die am näch­ sten benachbarte SstI-Schnittstelle begrenzt ist.

2. Hybridplamid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Grundplasmid das Bacillus-Plasmid pBC16 enthalten ist (Plasmid pC51).

3. Hybridplasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Grundplasmid das Bacillus-Plasmid pUB110 enthalten ist (Plasmid pH70).

4. Transformierte Stämme der Gattung Bacillus subtilis und/oder licheniformis enthalten Plasmide nach den Ansprüchen 1 bis 3.

5. Transformierte Stämme Bacillus subtilis SB202 pH70 (DSM5479) und Bacillus licheniformis pC51 (DSM5478).