DE69229336T2

DE69229336T2 - Residuelle protease-iii

Info

Publication number: DE69229336T2
Application number: DE69229336T
Authority: DE
Inventors: Janice Pero; Gerald Rufo; Alan Sloma
Original assignee: OmniGene Bioproducts Inc
Current assignee: OmniGene Bioproducts Inc
Priority date: 1991-03-19
Filing date: 1992-02-26
Publication date: 1999-12-30
Anticipated expiration: 2012-02-27
Also published as: EP0576606A1; EP0576606A4; DE69229336D1; DK0576606T3; WO1992016642A1; US5294542A; EP0576606B1

Description

Diese Erfindung betrifft Bacillus-Stämme, die zur Expression und Sekretion gewünschter Polypeptide ("Polypeptid", wie hier verwendet, meint jede verwendbare Kette von Aminosäuren, einschließlich Proteinen) verwendbar sind.
Bacillus-Stämme sind als Wirte genutzt worden, um heterologe Polypeptide von gentechnischen Vektoren zu exprimieren. Die Verwendung eines Gram-positiven Wirtes wie Bacillus vermeidet einige der Probleme, die mit der Expression heterologer Gene in Gramnegativen Organismen, wie etwa E. coli, verbunden sind. Beispielsweise produzieren Gramnegative Organismen Endotoxine, die schwer vom gewünschten Produkt abzutrennen sein können. Ferner können Gramnegative Organismen wie E. coli nicht leicht an die Sekretion fremder Produkte angepaßt werden, und die Rückgewinnung der innerhalb der Zellen abgesonderten Produkte ist zeitaufwendig, ermüdend und möglicherweise problematisch. Zudem sind Bacillus-Stämme nicht pathogen, und sie sind in der Lage, Proteine über gut bekannte Mechanismen zu sekretieren.
Ein generelles Problem bei der Verwendung von Bacillus-Wirtsstämmen in Expressionssystemen ist, daß diese große Mengen von Proteasen produzieren, welche die heterologen Polypeptide abbauen können, bevor sie aus dem Kulturmedium gewonnen werden können. Die Produktion der meisten dieser Proteasen erfolgt gegen Ende der exponentiellen Wachstumsphase. Zu diesem Zeitpunkt herrschen Nährstoffmangelbedingungen vor, und die Zellen bereiten sich auf die Sporenbildung vor. Die beiden hauptsächlichen extrazellulären Proteasen sind eine basische Serinprotease (Subtilisin), das Produkt des apr-Gens, und eine neutrale Metalloprotease, das Produkt des npr-Gens. Die Sekretion dieser Proteasen erfolgt in das Medium, wohingegen die hauptsächliche intrazelluläre Serinprotease, Isp-I, innerhalb der Zellen produziert wird. Andere Forscher haben genetisch veränderte Bacillus-Stämme erzeugt, die subnormale Niveaus einer oder mehrerer dieser drei Proteasen produzieren. Diese Stämme produzieren immer noch ausreichend große Mengen an Protease, um den Abbau heterologer Genprodukte vor der Reinigung zu verursachen.
Stahl et al. (J. Bact., 1984, 158, 411) offenbaren eine Bacillus-Proteasemutante, in der das chromosomale Subtilisin-Strukturgen durch eine in vitro herbeigeführte Deletionsmutation ersetzt wurde. Die diese Mutation tragenden Stämme wiesen nur 10% der extrazellulären Produktion an Serinproteaseaktivität des Wildtyps auf. Yang et al. (J. Bact., 1984, 160, 15) offenbaren eine Bacillus-Proteasemutante, in der das chromosomale Gen für die neutrale Protease durch ein Gen mit einer ein in vitro herbeigeführten Deletionsmutation ersetzt worden war. Fahnestock et al. (WO 86/01825) beschreiben die Konstruktion von Bacillus-Stämmen ohne Subtilisinaktivität durch Austausch der natürlichen chromosomalen Gensequenz mit einer teilweise homologen DNA-Sequenz, die einen eingebauten inaktivierenden Abschnitt enthält. Kawamura et al. (J. Bact., 1984, 160, 442) offenbaren Bacillus-Stämme, welche Läsionen in den npr- und apr-Genen enthalten. Diese Stämme exprimieren weniger als 4% des extrazellulären Proteaseaktivitätsniveaus, das in Wildtyp-Stämmen beobachtet wird. Koide et al. (J. Bact., 1986, 167, 110) offenbaren die Klonierung und Sequenzierung des isp-1-Gens und die Konstruktion einer Isp-1-Negativmutante durch chromosomalen Einbau eines künstlich deletierten Gens.
Sloma et al., 1990 J. Bact. 172: 1024-1029, haben B. subtilis mit Deletionen für die drei Hauptproteasen (apr, npr, isp) eingesetzt, um drei weitere Nebenproteasen (epr, bpr, mpr) zu identifzieren. Blackburn et al., WO 89/10976, verwendeten ebenfalls zur Sporenbildung befähigte apr, npr-Stämme, um das zu isolieren, was, wie sie behaupten, eine residuelle Serinprotease (rsp) sein soll, die keine aminoterminale Homologie zu bekannten Bacillus-Proteasen aufweist.
Genetisch veränderte Stämme, bei welchen sowohl die hauptsächlichen extrazellulären Proteasegene (apr und npr) als auch die drei residuellen Proteasegene (epr, hpr, mpr) deletiert sind, produzieren praktisch keine detektierbaren Niveaus von Proteaseaktivität in Standardproteasetests. Ein Resorutin-markiertes Kasein-Substrat kann jedoch zur Detektierung geringster Proteaseaktivitäten, die für den Abbau einiger heterologer Polypeptide und Proteine verantwortlich sind, verwendet werden.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine Bacillus-Zelle zur Verfügung gestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine Mutation im rp-III-Gen (ver-Gen) enthält, welches für die Aminosäuresequenz aus Fig. 4 kodiert, was zur Inhibierung der Produktion von proteolytisch aktivem RP-III-Gen-Produkt durch diese Zelle führt.
Gemäß einem zweiten, und alternativen, Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptides in einer Bacillus-Zelle zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren die Einführung eines Gens in diese Zelle umfaßt, welches für das heterologe Polypeptid kodiert und so modifiziert ist, um in der Zelle exprimiert zu werden, wobei die Bacillus-Zelle Mutationen im rp-III-Gen (ver-Gen), welches für die Aminosäuresequenz aus Fig. 4 kodiert, im apr-Gen und im ppg-Gen enthält, wobei die Mutation im rp-III-Gen (ver-Gen) die Produktion von proteolytisch aktivem RP-III-Gen-Produkt inhibiert.
Gemäß weiterer alternativer Aspekte der Erfindung werden gereinigte DNA, umfassend ein Bacillus-rp-III-Gen (ver-Gen), das für die Aminosäuresequenz aus Fig. 4 kodiert, ein Vektor, umfassend ein Bacillus-rp-III-Gen (vpr-Gen), das für die Aminosäuresequenz aus Fig. 4 und regulatorische DNA, die funktionsmäßig mit dem Gen verbunden ist, kodiert, sowie im wesentlichen reine Bacillus RP-III-Protease, die die Aminosäuresequenz aus Fig. 4 aufweist, zur Verfügung gestellt.
Die beschriebenen Zellen enthalten vorzugsweise auch Mutationen in einer oder mehreren oder jeder Kombination von extrazelluläre Protease kodierenden apr-, npr-, epr-, bpr- und mpr-Genen, was zur Inhibierung der Produktion dieser Proteasen durch die Zelle führt. Die bpr- und mpr-Gene sind auch bekannt als rp-I bzw. rp-II.
Die Mutation liegt vorzugsweise im rp-III-Gen (kürzlich ypr genannt), welches die Produktion des proteolytisch aktiven RP-III durch die Zelle inhibiert. (Mutation, wie hierin verwendet, kann sich auf eine Deletion innerhalb, oder der gesamten kodierenden Region eines Gens, einer Substitution eines oder mehrerer Basenpaare mit einem oder mehrerer natürlich vorkommender Basenpaare, oder eine Insertion eines oder mehrerer Basenpaare in die kodierende Region eines Gens beziehen.) Die erfindungsgemäße Mutation ist besonders bevorzugt eine Deletion innerhalb der kodierenden Region des Gens, einschließlich der Deletion der gesamten kodierenden Region; alternativ kann die Mutation in einer Substitution eines oder mehrerer Basenpaare durch natürlich vorkommende Basenpaare oder in einer Insertion innerhalb der für die Protease kodierenden Region bestehen.
Die hier beschriebenen Bacillus-Zellen können ebenso eine Mutation im ispI-Gen enthalten, welches die intrazelluläre Serinprotease I kodiert, und sie können zusätzliche eine Mutation enthalten, welche die Sporenbildung blockiert und so die Fähigkeit der Zelle zur Produktion sporenbildungsabhängiger Proteasen reduzieren; vorzugsweise blockiert diese Mutation die Sporenbildung in einem frühen Stadium, und besonders bevorzugt ist diese Mutation die (unten beschriebene) spoOA-Mutation. Ebenso wird ein Verfahren zur Herstellung stabiler heterologer Polypeptide in einer Bacillus-Wirtszelle beschrieben, durch Modifizierung des Wirts derart, daß er Mutationen in den apr-, npr- und rp-III-Genen und in einem oder mehreren der das epr-Gen, das bpr-Gen und das mpr(rp-II)-Gen einschließenden Gene enthält. Das Verfahren kann die Einführung eines ein heterologes Polypeptid kodierenden Gens in die Bacilluswirtszelle umfassen, das so modifiziert ist, um in dem Bacillus-Wirt exprimiert werden zu können; derartige Genmodifikationen können kompatible Promotersequenzen, Enhancer- Sequenzen und 1 oder Ribosombindungsstellen einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Gereinigte DNA, DNA-enthaltende Expressionsvektoren und mit RP-III kodierender DNA transformierte Bacillus-Wirtszellen werden ebenfalls beschrieben; die DNA ist vorzugsweise von Bacillus subtilis abgeleitet.
Ebenfalls beschrieben ist die Isolierung einer im wesentlichen reinen, bisher nicht charakterisierten residuellen Protease (RP-III); "im wesentlichen rein", wie hier verwendet, meint zu mehr als 90% rein, bezogen auf das Gewicht.
Der hier verwendete Begriff "rp-III-Gen" meint das jeweilige, dem dieser Bezeichnung in Bacillus subtilis entsprechende Gen und die evolutionären Homologen dieses Gens in anderen Bacillus-Spezies, wobei von den Homologen erwartet werden kann, wie das der Fall bei anderen Bacillusproteinen ist, daß sie in geringer Weise von Spezies zu Spezies variieren. In vielen Fällen ist die Sequenzhomologie zwischen evolutionären Homologen groß genug, so daß ein von einer Spezies abgeleitetes Gen als Hybridisierungssonde verwendet werden kann, um unter Verwendung von Standardtechniken die evolutionären Homologen anderer Spezies zu erhalten. Ferner beinhalten diese Begriffe natürlich auch Gene, in denen der Austausch von Basen stattgefunden hat, welche, wegen der Redundanz des genetischen Kodes, den kodierten Aminosäurerest nicht verändern, oder welche konservative Veränderungen (an einer Aminosäure mit ähnlicher Hydrophobizität oder Ladungsverteilung) an einigen wenigen Aminosäuren bewirken.
Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren wurden Bacillus-Stämme hergestellt, deren Fähigkeit zur Herstellung von Proteasen deutlich reduziert ist, und die daher als Wirte für die Expression heterologer Polypeptide ohne signifikanten Abbau nützlich sind, die in das Kulturmedium abgesondert werden können. Es wurde gefunden, daß diese Bacillus-Zellen, obwohl sie einige Mutationen in Genen enthalten, welche verwandte Aktivitäten kodieren, nicht nur lebensfähig, sondern auch gesund sind.
Jedes gewünschte Polypeptid kann exprimiert werden; zum Beispiel medizinisch verwendbare Proteine, wie etwa Hormone, Impfstoffe, antivirale Proteine, Antitumorproteine, Antikörper oder Gerinnungsproteine; sowie landwirtschaftlich und industriell verwendbare Proteine wie etwa Enzyme oder Pestizide, und jedes andere Polypeptid, das normalerweise durch RP-III abgebaut wird.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen ersichtlich.
Das hier beschriebene rpIII-Gen wurde in der Literatur in vpr umbenannt; ebenso wurde die RP-III-Protease in Vpr umbenannt.

Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 zeigt einen Vergleich der N-terminalen Sequenz von RP-III mit einer zusammengesetzten N-terminalen Sequenz, abgeleitet aus bekannten B. subtilis Serinproteasesequenzen, die durch apr, epr, bpr und isp-1 kodiert werden.
Fig. 2 zeigt die N-terminale Sequenz von RP-III und der entsprechenden Sequenz der "guess-mer"-Oligonucleotidsonde, die zur Identifizierung des rp-III-Gens verwendet wurde.
Fig. 3 stellt eine Restriktionskarte eines die für rp-III kodierende Region enthaltenden DNA-Fragments dar und zeigt die ungefähren Orte der m-III-Subklone.
Fig. 4 zeigt die DNA-Sequenz der DNA, welche das rp-III-Gen kodiert. Ebenso gezeigt ist eine Aminosäureübersetzung dieser Sequenz.
Um die in B. subtilis nach Entfernung anderer bekannter Proteasen verbleibende residuelle Proteaseaktivität zu ermitteln, muß ein Stamm konstruiert werden, dem die bekannten Proteasen fehlen. Ein von extrazellulärer proteolytischer Aktivität im wesentlichen freier Bacillus-Stamm wird in EP 0 369 817 A2 von Sloma et al. beschrieben.
Ein ähnlicher Stamm, der multiple Mutationen enthält, welche apr, npr, isp-1 epr, kpr und mpr inaktivieren, wurde unter Verwendung von Resorufin-markiertem Kasein (Boehringer- Mannheim) als Substrat für residuelle Serinproteaseaktivität hergestellt und getestet. Residuelle Serinprotease RP-III wurde in dem vielfach mutierten Stamm detektiert; die Aktivität dieses Stammes wurde unter Verwendung des gleichen Substrats während der gesamten Reinigung überwacht. Die Reinigung und Charakterisierung von RP-III und die Isolierung des Gens, welches RP-III kodiert, sind unten beschrieben, zusammen mit einem Verfahren zur Erzeugung eines Bacillus-Stammes, welcher eine das RP-III kodierende Gen inaktivierende Mutation enthält.
Die Konstruktion eines vielfach mutierten Bacillus-Stammes wird von Sloma et al. in EP 0 369 817 A2 beschrieben. Die Isolierung der chromosomalen DNA von B. subtilis wurde von Dubnau et al. beschrieben (1971, J. Mol. Biol., 56, 209). B. subtilis Stämme wurden auf Tryptose-Blut-Agar-Base (TBAB) (Difco Laboratoirs) oder Minimalglucosemedium kultiviert und nach dem Verfahren von Anagnostopoulos et al. (J. Bact., 1961, 81, 741) kompetent gemacht. E. coli JM107 wurde nach dem Verfahren von Hanahan (J. Mol. Biol., 1983, 166, 587) kultiviert und kompetent gemacht. Plasmid-DNA von B. subtilis und E. coli wurde nach der Lyse-Methode von Birnboim et al. (Nucl. Acid. Res., 1979, 7, 1513) isoliert. Die Plasmid-DNA-Transformation in B. subtilis wurde durchgeführt, wie von Gryczan et al. (J. Bact., 1978, 134, 138) beschrieben.
Resorufin-markiertes Kasein oder ¹&sup4;C-Kasein wurde für die RP-III-Tests verwendet. Kulturüberstand-Proben wurden entweder 2 oder 20 Stunden in stationärer Phase getestet. Inhibitoren wurden mit dem Überstand für 30 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. Wo eine sehr geringe Menge an residueller Proteaseaktivität gemessen werden sollte, wurden ¹&sup4;C-Kasein oder Resorufin-markiertes Kasein als Substrat verwendet.
Im ¹&sup4;C-Kaseintest wurde der Kulturüberstand (100 ul) zu 100 ul 50 mM Tris, 5 mM CaCl&sub2;, pH 8, zugegeben, welches 1 · 10&sup5; cpm an ¹&sup4;C-Kasein (New England Nuclear) enthielt. Die Lösungen wurden bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktionsmischungen wurden dann auf Eis gegeben, und 20 ug BSA wurde als Trägerprotein zugesetzt. Kalte 10%ige TCA (600 ul) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde für 10 Minuten auf Eis gehalten. Die Lösungen wurden zentrifugiert, um ausgefallenes Protein abzutrennen, und die Überstände wurden in einem Szintillationszähler gezählt.
Der Resorufin-markierte Kaseintest schloß die Inkubation des Kulturüberstandes mit dem gleichen Volumen an Resorufin-markiertem Kasein in 50 mM Tris, 5 mM CaCl&sub2;, pH 8,0 bei 45ºC für 1 Stunde ein. Nach der Inkubation wird nichthydrolisiertes Substrat mit TCA prazipitiert und zentrifugiert. Der Überstand (400 ul) wurde mit 500 mM Tris (pH 8, 8) alkalisch gemacht, und der resultierende chromogene Überstand wurde spektrophotometrisch bei 574 nm quantifiziert.
Eine Reihe von Bacillus-Stämmen wurde für die Stämme der vorliegenden Erfindung als Quellen genutzt.
Stamm GP216, der Deletionen in den vier Proteasegenen (apr, ppr, isp- 1 und epr) enthält, und Stamm GP240, der Deletionen in den fünf Proteasegenen (apr, npr, isp- 1, epr und bfr (rp-)) enthält, wurden wie von Sloma et al., EP 0 369 817 A2, beschrieben hergestellt. Der Stamm GP241, isogen zu GP240 mit Ausnahme des hpr-Gens, wurde aus dem Stamm GP216 durch Transformation von GP216 mit einem Plasmid (pUC-Derivat genannt pJMhpr2, Perego and Hoch, J. Bacteriology 170, 2560, 1988) konstruiert, das ein mutiertes hpr-Gen und ein cat-Gen enthält hpr kodiert einen Repressor der Proteaseproduktion in Bacillus. GP216 wurde mit pJMhpr2 transformiert, und die Transformanten wurden auf Chloramphenicol selektiert. Chromosomale DNA wurde aus chloramphenicolresistenten Kolonien extrahiert und mittels Southern-Hybridisierung analysiert. Es wurde ein Klon gewonnen, der zwei Kopien des hpr-2-Gens enthielt, was aus einem doppelten Crossover zwischen homologen Sequenzen auf dem Vektor und in dem Chromosom resultierte. Der Klon wurde ohne Antibiotika-Selektion gezüchtet, und eine chloramphenicolsensitive Kolonie wurde als BI114 bezeichnet. Der Stamm GP241 wurde durch Einführung des deletierten bpr (rp-I)-Gens in BI114 unter Verwendung des Plasmids pKT3 in gleicher Weise, wie bei Sloma et al. (EP 0 369 817 A2) für die Einführung des deletierten bpr (rp-I)-Gens in GP216 zur Erzeugung von GP240 beschrieben, konstruiert.
Der eine Mutation im mpr tragende Stamm GP263 wurde aus GP241 wie folgt hergestellt. Das Plasmid pCR125, welches das in ein deletiertes mpr-Gen inserierte Phleomycin-Resistenz- Gen (Sloma et al., EP 0 369 817 A2) trägt, wurde mit EcoRI verdaut, und die lineare Plasmid-DNA wurde für die Transformation von GP241 zu Phleomycinresistenz verwendet. Resistente Transformanten wurden durch Ausplattieren der transformierten Zellen auf TBAB-Platten mit einem Gradienten von 0 ug/ml bis 5 ug/ml Phleomycin entlang der Platte selektiert. Transformanten, die gegenüber etwa 2,5 ug/ml Phleomycin auf den Platten resistent waren, wurden auf TBAB-Phleomycinplatten als Einzelkolonien gereinigt und danach auf TBAB ohne selektives Antibiotikum gezüchtet. Eine Transformante, die im Anschluß an diese Behandlung isoliert wurde, wurde als GP263 bezeichnet.
GP263 wurde zur Erzeugung von zwei weiteren Stämmen, GP264 und GP275, verwendet. GP264 weist das sacQ*-Regulationselement auf, das via Transformation mit dem Plasmid pDP104, wie von Sloma et al., EP 86 308 356.4, beschrieben, chromosomal eingebaut wurde. GP275 wurde durch vollständige Deletion des bereits inaktivierten mpr (rp-II)-Gens aus GP263 hergestellt. Da die Inaktivierung von mpr einer Einführung des Phleomycinresistenz-Gens in das mir zuzuschreiben war, wurde die Deletion des mpr durch Transformation von GP263 mit einem Plasmid, welches ein deletiertes mpr-Gen und Chloramphenicolresistenz-Gene in benachbarter Reihe enthält, erreicht. Die Transformanten wurden auf Chloramphenicol selektiert. Danach wurden ohne Selektion isolierte Kolonien gezüchtet und Replica-plattiert. GP275 wurde als sowohl Chloramphenicol- als auch Phleomycinsensitiv isoliert.
In Kulturüberständen von Bacillus-Stämmen, die nicht die Proteasen exprimieren, welche von den sechs nichtessentiellen Proteasegenen apr, npr, isp-1, epr, bpr und mpr kodiert werden, sind die extrazellulären Proteaseniveaus vernngert. Wenn diese Deletionen in einem Spo+-Wirt vorhanden sind, ergibt sich eine etwa 99%ige Reduktion der extrazellulären Proteaseniveaus im Vergleich zum Wildtyp-Stamm. Um auf effiziente Weise in Bacillus proteaselabile Produkte herzustellen, ist es wünschenswert, die verbleibende 1%ige residuelle Proteaseaktivität zu vermindern oder zu eliminieren.
Unter Verwendung des Tests mit Resorufin-markiertem Kasein wurde eine neue Protease identifiziert, die einen Hauptbestandteil der residuellen Aktivität in GP264 darstellt. Diese Protease kann aufgrund ihrer quantitativen Hemmung durch Phenylmethylsulfonylfluorid als eine Serinprotease klassifiziert werden.
Zur Isolierung der RP-III-Protease aus erschöpften Kulturflüssigkeiten wurde ein einfaches und effizientes Reinigungsschema entwickelt. Die Kulturen wurden in modifiziertem MRS-Lactoßacillusmedium (Difco, mit Maltose im Austausch für Glucose) gezüchtet, und etwa auf das zwanzigfache konzentriert, wobei ein Amicon CH2PR-System ausgestattet mit einer S2Y10-Spiralkartusche verwendet wurde, und vor Ort gegen 50 mM MES pH 5,5 dialysiert, und über Nacht bei 0ºC bis 4ºC inkubiert. Der konzentrierte, ausgefallenes Protein enthaltende Rohüberstand wurde zentrifugiert (Sorvall GSA Rotor, 9000 U/min. 30 Minuten), und das resultierende Pellet, welches 80% bis 100% der RP-III-Proteaseaktivität enthält, wurde in 100 mM Tris, pH 8, resuspendiert. Das rekonstituierte Pellet wurde dann auf eine 500 ul Superflo (Sepragen) Säule aufgebracht, die mit Q-Sepharose (Pharmacia), equilibriert mit 100 mM Tris bei pH 8, gepackt war. Das gebundene Protein, welches die RP-III-Protease enthielt, wurde von der Säule mittels einer 50 mM MES, 2,5 M KCl, pH 5,5 Schrittelution wiedergewonnen.
Die Proteaseaktivität enthaltenden Fraktionen mit hohem Salzgehalt wurden vereinigt, konzentriert und gegen 50 mM MOPS, pH 7, dialysiert, anschließend auf eine 250 ml Superflo-Säule mit Benzamidinsepharose (Pharmacia) Affinitätsharz, equilibriert mit dem gleichen Puffer, aufgebracht. Die gebundene RP-III-Protease wurde in einem Schritt mit 50 mM MOPS, 1 M KCl, pH 7, von dem Harz eluiert. Proteolytisch aktive Fraktionen mit hohem Salzgehalt, welche die RP-III-Protease enthielten, wurden vereinigt, konzentriert und einer HPLC-Größenausschlußchromotographie über eine semipräparative SW3000-Säule zugeführt, die mit 50 mM MES, 200 mM KCl, pH 6,8, equilibriert wurde. Proteaseaktivität wurde ausschließlich im Volumen der mobilen Phase gefunden, was anzeigt, daß die RP-III-Protease als Teil eines Großaggregats vorkommt. Schließlich wurden die nach Größe ausgeschlossenen vereinigten RP-III-Fraktionen konzentriert, gegen 20 mM Natriumphosphat, 1 M NaCl, 1 mM Imidazol, pH 7,5, dialysiert und über eine mit Cu&spplus;&spplus; beladene Progel-TSK- Chelat-SPW-HPLC-Säule fraktioniert. Die Aktivität wurde mit einem linearen Imidazolgradienten zu 20 mM eluiert.
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ergab, daß der finale Pool von RP-III-Protease drei hauptsächliche Coomassie-gefärbte Banden enthielt: eines bei 38,4 kDa und eine Doppelbande bei 28,5 und 27,1 kDa. Jede dieser Banden wurde elektrophoretisch transferiert auf und ausgeschnitten aus einem Blatt PVDF-Membran und einer aminoterminalen Sequenzanalyse unterzogen. Die Sequenz des 28,5 kDa-Proteins zeigte eine beachtliche Homologie (81%) zu einer zusammengesetzten Sequenz aus vier anderen B. subtilis-Serinproteasen (apr, Subtilisin; euer, extrazelluläre Protease; bfr, Bacillopeptidase F, und isp-1, intrazelluläre Protease 1) wie auch zu Bacillopeptidase F selbst (65% Homologie). Auf die proteolytische Aktivität dieser Bande wird hier als RP-III Bezug genommen. Fig. 1 zeigt die aminoterminale Sequenz von RP-III und den Vergleich dieser Sequenz mit einer zusammengesetzten Sequenz, abgeleitet aus den Aminosäuresequenzen der vorher genannten B. subtilis-Serinproteasen.
Alle fünf Proteasen enthalten sechs identische Reste, die innerhalb der N-Termini exakt gleich beanstandet sind, einschließlich des mutmaßlichen aktiven Zentrums des Asparaginsäure- Restes. Eine Sequenzanalyse der unteren 27,1 kDa-Bande ergab, daß es sich dabei höchstwahrscheinlich um ein proteolytisches Fragment der oberen 28,4 kDa-Bande handelt, da beide Proteine identische aminoterminale Sequenzen von Rest 10 bis Rest 29 aufweisen. Der Verlust der Reste 1 bis 9 bei der niedrigeren 27,1 kDa-Bande ist für deren schnelleres Laufverhalten in der SDS-PAGE im Vergleich zur oberen 28,4 kDa-Bande verantwortlich.
Fig. 2 zeigt die vom RP-III erhaltene aminoterminale Sequenz und die Sequenz der oligomeren Sonde, die zur Identifizierung des Gens, das für das RP-III kodiert, konstruiert wurde.
Genomische DNA wurde aus Bacillus subtilis GP275 isoliert, und 10 ug wurden in erschöpfender Weise mit HindIII verdaut und mit dem in Fig. 2 gezeigten "guess-mer" hybridisiert. Die Sonde hydrisierte an ein 1 kb Fragment der HindIII-verdauten genomischen DNA; daher wurde unter Verwendung von pUC19 als Vektor eine 1 kb genomische Bibliothek aus nach Größe selektierten Fragmenten von 0,8 kb bis 1,5 kb hergestellt. Ein das rp-III-Gen tragender Klon wurde unter Verwendung von Standard-Hybridisierungstechniken (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York) sowie der in Fig. 2 gezeigte guess-mer-Sonde in der 1 kb-Bibliothek identifiziert. Das aus diesem Klon isolierte Plasmid wurde als pLLP1 bezeichnet.
Southern-Blot-Analyse wurde verwendet, um den Ort verwendbarer Restriktionsschnittstellen innerhalb des m-III-Gens zu bestimmen (Fig. 3). Unter Verwendung von Restriktionsverdauen von genomischer DNA aus GP275 und einer das 1 kb-HindIII-Fragment aus pLLP1 umfassenden Sonde wurden Southern-Blots durchgeführt. Diese Ergebnisse führten zur Herstellung von größenselektierten EcoRI-, EcoRI / BglIII-, EcoRI / HindIII- und BglII-Bibliotheken aus genomischer DNA von GP275. Bibliotheken, welche verwendbare Klone ergaben, wurden entweder in plC20H- oder in pUC 19-Vektoren hergestellt, welche mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut worden waren. pLLP4 und pLLP5 wurden aus 3 kb bzw. 0,5 kb bis 0,8 kb EcoRI / BglII-pIC20H-Bibliotheken durch Screenen mit dem 1 kb HindIII-Fragment aus pLLP1 isoliert. pLLP8 wurde durch Screenen mit dem 630 bp BglII-Fragment von pLLP5 aus einer 0,5 kb bis 0,8 kb EcoRI / HindIII pUC19- Bibliothek isoliert.
Diese Klone wurden zum Aufbau einer Restriktionskarte des rp-III-Gens verwendet, nachdem die das 1 kb HindIII-Fragment flankierenden Bereiche identifiziert wurden. Die DNA-Sequenz wurde zwischen der 5' BglII-Schnittstelle von pLLp5 und etwa 1 kb hinter der 3' HindIII-Schnittstelle von pLLP4 bestimmt (Fig. 3 und 4).
Es wurde ein offenes Leseraster gefunden, das sich 2457 Nukleotide downstream von der 5' BgII-Schnittstelle erstreckt. Ein mutmaßliches Translationsinitiationscodon (Fig. 4, unterstrichene Nukleotide 40 bis 42) mit einer begleitenden Ribosombindungsstelle (Fig. 4, unterstrichene Nukleotide 25 bis 32) wurde identifiziert. Die aminoterminale Sequenz des reifen Proteins entsprechend der Sequenz in Fig. 2 wurde beim Nukleotid 520 gefunden und ist in Fig. 4 unterstrichen. Aus den Sequenzdaten der Fig. 4 geht hervor, daß davon auszugehen ist, daß das reife Protein, welches durch das rp-III-Gen kodiert wird, 646 Aminosäuren enthält. Da das isolierte Protein ein scheinbares Molekulargewicht von 28.000 Da aufweist, würde dies darauf hindeuten, daß rp-III einem starken C-terminalen Processing oder Proteolyse unterliegt. Die Identifizierung der chromosomalen Position des rp-III-Gens kann durch Standardmethoden erreicht werden, im wesentlichen wie von Sloma et al. in EP 0 369 817 A2 für andere Gene beschrieben. Kürzlich wurde der Ort des rp-III-Gens auf dem B. subtilis- Chromosom durch Einbau eines Antibiotikumresistenzmarkers in das Chromosom an der Stelle des rp-III und unter Verwendung einer Phage PBS1-vermittelten Transduktion zur Bestimmung des Ortes des Antibiotikumresistenzgens kartiert. Ein Fragment mit einem Neomycinresistenzgen (neo) wurde in die BglII-Schnittstelle innerhalb der aminoterminalen kodierenden Region von rp-III geklont, wie unten beschrieben, um das Plasmid pLLP2 zu erhalten, das zur Erzeugung von GP279 verwendet wurde. Southern Blot-Techniken und Hybridisierung wurden verwendet, um zu bestätigen, daß das neo-Gen in das Chromosom integriert worden war und dadurch das rp-III-Gen unterbrach. Dann wurden Kartierungsexperimente verwendet, um mittels PBSI-Transduktion zu zeigen, daß das eingebaute neo-Gen und rp-III an die bekannten genetischen Loci von Bacillus, sacA ctr und epr gekoppelt ist.
Es ist oft nützlich, die Produktion funktionaler RP-III-Protease in Mikroorganismen zu inaktivieren, besonders dann, wenn ein gewünschtes Protein erzeugt wird, welches gegenüber RP-III-Proteolyse anfällig ist. Die hier zur Verfügung gestellte rp-III-Gensequenz ermöglicht die Eliminierung von RP-III-Aktivität durch eine Reihe von Standardverfahren; einschließlich der Inaktivierung durch Insertion von Nucleotidsequenzen in das Gen oder durch Deletion eines Teils oder des gesamten nativen Gens. Im allgemeinen können homologe rekombinante Verfahren angewandt werden; siehe zum Beispiel Sloma et al., EP 0 369 817 A2.
Das rp-IIL-Gen wurde durch Erzeugung einer Insertionsmutation innerhalb des natürlichen Gens inaktiviert. Ein 2,4 kb SmaI- bis SmaI-Fragment, welches das gesamte Neomycinresistenz-Gen enthält, wurde in die mit Klenow zu blunt-Enden aufgefüllte BglII-Schnittstelle des pLLP1 eingeführt, um das Plasmid pLLP2 zu ergeben. pLLP2 wurde dann durch Scal-Verdau linearisiert und zur Transformation des Bacillus-Stammes GP275 verwendet. Die Neomycin-resistenten Stämme aus dieser Transformation wurden GP279 genannt und enthielten ein inaktiviertes rp-III-Gen. Die Inaktivierung des rp-III wurde wie oben beschrieben durch einen Proteaseaktivitätstest bestätigt. Die Stämme mit der Insertionsmutation waren im übrigen normal in Hinsicht auf Sporenbildung und Wachstum. Zellen, in denen das rp-III-Gen inaktiviert worden ist, können zur Exprimierung nützlicher heterologer Proteine verwendet werden. Solche Proteine können typischerweise von medizinischer, landwirtschaftlicher oder industrieller Bedeutung sein. Um jedwede potentielle proteolytische Beschädigung des heterologen Proteins zu minimieren, werden bevorzugte Zellen auch für apr, npr, epr, bpr und mpr inaktiviert. Die Inaktivierung zusätzlicher Gene, wie etwa isp-I und spoOA kann auch nützlich sein.
DNA, welche die gewünschten heterologen Proteine kodiert, sollte so verändert werden, daß sie die geeigneten regulatorischen Sequenzen einschließlich Promotor, Ribosombindungsstelle und Transkriptionsterminationssignale enthält. Im allgemeinen sollte die das Protein und seine begleitenden regulatorischen Sequenzen kodierende DNA-Sequenz mit der Expression in der erfindungsgemäßen Bacillus-Wirtszelle kompatibel sein. Die eingeführte DNA, welche die Expressionssequenzen enthält, kann in der Zelle in Plasmidform vorliegen, oder mehr bevorzugt in das Chromosom integriert sein.
Die folgenden Quellen sind hiermit per Bezugnahme einbezogen: Anleiltungen und Quellen für die heterologe Proteinexpression und Selektion geeigneter Bacillus-Regulationselemente sind angegeben in Ganesan et al., 1986, "Bacillus Molecular Genetics and Biotechnology Applications", Academic Press, Seiten 367 bis 493. Nützliche Verfahren für die Konstruktion von Expressionsvektoren sind angegeben bei Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, das RP-III kodierende Gen eher zu exprimieren als zu mutieren oder zu deletieren, zum Beispiel wenn die Protease für Zwecke wie die Verbesserung der Reinigungswirksamkeit von Waschmitteln zur Verwendung in industriellen Prozessen hergestellt wird. Dies kann entweder durch Einfügung regulatorischer DNA (jeder geeignete Bacillus-Promotor und, falls gewünscht, Ribosombindungsstelle und / oder signalkodierende Sequenz) upstream des proteasekodierenden Gens erfolgen, oder alternativ durch Einbau des proteasekodierenden Gens in einen Bacillus-Expressions- oder -sekretionsvektor; der Vektor kann dann zur Produktion (oder Sekretion) der Protease, die dann nach herkömmlichen Methoden isoliert wird, in einen Bacillus-Stamm transformiert werden. Alternativ kann die Protease durch Einbau einer oder mehrerer Kopien des Proteasegens auf einem Vektor in einen Wirtsstamm, welcher ein regulatorisches Gen wie etwa sacQ* enthält, überproduziert werden.

Claims

1. Bacillus-Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Mutation im rp-III-Gen (vpr-Gen) enthält, welches die Aminosäuresequenz aus Fig. 4 kodiert, was zur Inhibierung der Produktion von proteolytisch aktivem RP-III-Genprodukt durch diese Zelle führt.

2. Bacillus-Zelle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin eine Mutation in jedem von einem oder mehreren Protease kodierenden Genen, ausgewählt aus apr, npr, epr, bpr und mpr, umfaßt, wobei jede Mutation zur Inhibierung der Produktion von proteolytisch aktiver Protease, die durch das Gen kodiert wird, durch diese Zelle führt.

3. Bacillus-Zelle gemäß Anspruch 2, ferner dadurch gekennzeichnet, daß jede Mutation eine Deletion innerhalb der kodierenden Region des Gens umfaßt.

4. Bacillus-Zelle gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle ferner eine Mutation im isp-1-Gen enthält, welches eine intrazelluläre Protease kodiert.

5. Bacillus-Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle ferner eine Mutation enthält, welche die Fähigkeit der Zelle zur Produktion von einer oder mehreren sporenbildungsabhängigen Proteasen vernngert.

6. Bacillus-Zelle gemäß Anspruch 5, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die sporenbildungsabhängige Proteasemutation die Sporenbildung in einem frühen Stadium blockiert.

7. Bacillus-Zelle gemäß Anspruch 6, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die sporenbildungsblockierende Mutation in dem spoOA-Gen liegt.

8. Bacillus-Zelle gemäß Anspruch 7, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle Bacillus subtilis ist.

9. Bacillus-Zelle gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner ein Gen umfaßt, welches ein heterologes Polypeptid kodiert.

10. Bacillus-Zelle gemäß Anspruch 9, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Polypeptid ein medizinisch, landwirtschaftlich oder industriell verwendbares Protein ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptids in einer Bacillus-Zelle, wobei das Verfahren das Einführen eines Gens in die Zelle umfaßt, welches das heterologe Polypeptid kodiert und modifiziert ist, um in der Zelle exprimiert zu werden, wobei die Bacillus-Zelle Mutationen in dem die Aminosäuresequenz aus Fig. 4 kodierenden rp-III-Gen (vpr-Gen), in dem apr-Gen und in dem npr-Gen enthält, wobei die Mutation in dem rp-III-Gen (ver-Gen) die Produktion von proteolytisch aktivem RP-III-Genprodukt inhibiert.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle ferner Mutationen in einem oder mehreren der Gene euer, bpr oder mpr enthält.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle ferner eine Mutation im isp-1-Gen enthält, welches intrazelluläre Protease I kodiert.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle ferner eine Mutation enthält, welche die Fähigkeit der Zelle zur Produktion von einer oder mehreren sporenbildungsabhängigen Proteasen verringert, wobei die Mutation im spoOA-Gen liegt.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine Bacillus subtilis-Zelle ist.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Polypeptid ein medizinisch, landwirtschaftlich oder industriell verwendbares Protein ist.

17. Gereinigte DNA, umfassend ein Bacillus-rp-III-Gen (ver-Gen), welches die Aminosäuresequenz aus Fig. 4 kodiert.

18. Vektor, umfassend ein Bacillus-rp-III-Gen (ver-Gen), das die Aminosäuresequenz aus Fig. 4 kodiert, und regulatorische DNA, welche funktionsmäßig mit dem Gen verbunden ist.

19. Bacillus-Zelle, transformiert mit dem Vektor aus Anspruch 18.

20. Im wesentlichen reine Bacillus-RP-III-Protease mit der Aminosäuresequenz aus Fig. 4.

21. Gereinigte DNA gemäß Anspruch 17, ferner dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleinsäuresequenz aus Fig. 4 umfaßt.