JPH01281090A - セルラーゼ遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔腫業上の利用分野〕 本発明はセルラーゼ遺伝子に関するもので６９．待に、
アルカリ側−に於いて最適な増殖を示す所謂好アルカリ
性（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　）ノセチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　）属＃ｌ菌由来のアルカリセルラーゼ遺伝
子、並びに当該遺伝子を含むＤＮＡ分子、史には当該ｆ
）ｔ’ＪＡ分子を有する倣生吻に関する。

〔従来の技術及びその課題」 従来、セルラーゼはセルロース金グルコース、又はセロ
ビオース、或いはセロオリゴ循まで分解する＃＃素反応
を触媒する複雑な＃素群として理解されておシ、その作
用ｍ構により、ＣＩ酵索　Ｃｘ酵素と！−グルコシダー
ゼ、或いはエキンーＩ−グルカナーゼ、エンド−β−グ
ルカナーゼ、セロビオースなどの名称で呼ばれる酵素を
含有すると言われる。過去数十年のセルラーゼの研究は
主としてバイオマス資源の有効利用を図るという観点か
ら、例えばトリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレ
モニウム属、フミコーラ属等のカビの類にその供給源を
求められてきた。

また、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤組成物に関するものが挙げられる。しかしながら、
上記のカビ金含めて微生宵が生殖するセルラーゼは、そ
の大部分が中性乃至酸性−において最適且つ安定な酵素
活性を有する、所祠中性若しくは酸性セルラーゼと称芒
れるものであった。即ち、衣料用洗浄剤組成物としての
必要条件でるるアルカリ性癖領域で最高活性を示し、且
つ安定な、所謂アルカリセルラーゼの存在は僅かに、バ
チルス属及びストレプトマイセス属の細菌由来のものが
知られているのみである。そこで、本発明者らが、アル
カリ、セルラーゼを生殖する微生吻の探索を行ったとこ
ろ、好アルカリ往側−の一種でろるバチルス　エスピー
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ、　　ン　■く二５ｙｘ−
６３５（ＦＥム（ＭＢＰ−１４８５）が衣料用洗浄剤組
成物として通し九アルカリセルラーゼに＝ｉ者量に生殖
することを見出した（待頴昭６１−２５７７７５号）。

−万、近年になって、細鴎由来のセルラーゼ遺伝子、具
体的には、クロストリゾクム属、セルロモナス属、バチ
ルス属、ストレプトマイセス属及びルミノコッヵス属等
の遺伝子が遺伝子操作技術を用いて単離されている。こ
れらの遺伝子のうち、クロストリジウム　サーモ上２ム
（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ
ｌｌ・暉・■・時・１２１１”０１１・１・・・―・・
２，。

（Ｂｅｇｕｉｎ、　Ｐ、、　Ｃｏｒｎｅｔ、　Ｐ、、　
ａｎｄ　Ａｕｂｅｒｔ、　Ｊ。

Ｐ、、　Ｊ、　１３ａｃｔｅｒｉｏ１．、１６２．１０
２．　（１９８５）、Ｊｏｌｉｆｆ、　Ｇ、、　Ｂｅｇ
ｕｉｎ、　Ｐ、、　ａｎｄ　Ａｕｂｅｒｔ、　Ｊ、Ｐ、
。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　ｌ　４　、
８６０５　、　（１９８’６）及びＧｒｅｐｉｎｅｔ、
　０．、　ａｎｄ　８ｅｇｕｉｎ、　Ｐ、、　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄａ　Ｒｅｓ、、　１４　、１７９１　、
　（１９８６）　）　）ｓセ（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、　Ｋ、
　Ｒ，、Ｇｅｒｈａｒｄ、　Ｂ、　、　Ｇｕｏ、　Ｚ、
　Ｍ、　。

Ｋ１１ｂｕｒｎ、　ｌ）、　Ｇ、、　Ａｎｔｈｏｎｙ　
Ｒ，、Ｗａｒｒｅｎ、　Ｊ、。

ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｋ、　Ｃ，Ｊ、　、　Ｇｅｎ
ｅ、　４４　、３１５　。

ｕｄａ　（Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｋ、、　ＩＶＩｉｓａ
ｗａ、　Ｎ、　、　ａｎｄＫｉｔａｍｕｒａ、　Ｋ、、
　Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　４　、２４７　。

（１９８６）））、枯草陶（バチルス　スプチリＭｃｃ
ｏｎｎｅｌｌ、　Ｄ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｃａｎｔｗｅ
ｌｌ、　Ｂ、　Ａ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｇｅｍ、、　！　２　、
５３５５　、　（１９８４）、Ｒｏｂｓｏｎ、　Ｌ、　
Ｍ、　、　ａｎｄ　Ｃｈａｍｂｌｉｓｓ、　Ｇ、　Ｌ、
　Ｊ。

Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、　１６９　、２０１７　、　（
１９８７）、Ｍａｃｋａｙ、　Ｋ、　ｆＶｌ、　、　Ｌ
ｏ、　Ａ、　、　Ｗｉｌｌｉｃｋ、　Ｇ、　、　Ｚｕｋ
ｅｒ。

ｒＶｌ、、　Ｂａ１ｒｄ、　Ｓ、、　Ｉ）ｏｖｅ、　↓
ｖ１．．　ｔＶｉｏｒａｎｅｌｌｉ、　Ｆ、。

ａｎｄ　Ｓｅｌｉｇｙ、　Ｖ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｗａｓ、、　１４　。

９１５９、（１９８６）及びＮａｋａｍｕｒａ、　Ａ、
、　Ｕｏｚｕｍｉ。

Ｔ、　ａｎｄ　Ｂｅｐｐｕ、　Ｔ＋、　ｇｕｒ、　Ｊ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１６４．３１７．（１９８７）））ｖ及び好アルカリ性
バチルスＪＩ１４細菌（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ　、　Ｆ、　
、　５ａｓｈｉｈａｒａ。

Ｎ、、　Ｋｕｄｏ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｍｏｒｉｋｏｓｈ
ｉ、　Ｋ、、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６８　、４７９　、　（１
９８６）及びＦｕｋｕｍｏｒｉ、　Ｆ、、　ＫｕｄＯ，
Ｔ、、　Ｎａｒａｈａｓｈｉ、　Ｙ。

ａｎｄ　Ｍｏｒｉｋｏｓｈｉ、に、、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ。

１３２．２３２９．（１９８６））　由来の遺伝子に関
しては既にヌクレオチド配列が決定され、コードするア
ミノ酸配列も知られている。

ところ゛で、遺伝子操作技術を用いてセルラーゼ遺伝子
を単離し、そのヌクレオチド配列を決定する試みは、遺
伝学的アノローチによる生産−の育種及びプロティン　
エンジニアリングの手法によるセルラーゼ機能及び特性
の改良等を考慮した場曾、極めて意義のめることである
。しかしながら、これまでのところセルラーゼ一般につ
いての立体構造や活性中心に関する知見は殆ど皆無であ
り、前述の目的を達成する為には機能や特性が異なる、
よシ多くのセルラーゼに関するヌクレオチド配列及びア
ミノ酸配列等の情報が必要とされている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は、先に遺伝子操作の手法を用いてアルカリセ
ルラーゼｆｃ−ｉ！Ｆ量に生殖する組換えエシェリヒア
（ｊ；５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）属ｉ！！１８株を調製
した。当該菌株のうちｌ休よジアルカリセルラーゼ遺伝
子の活性必須填域を含む約４、ＱＫｂのＤＮＡ断片全単
離し、解析を行った結果、独自の制限地図をゼする新規
なりＮＡ断片でめることが判明した（時順昭６１−２５
９９２３号）。また、別の１株からは上述のＤＮＡ断片
を含へ且つ、当該遺伝子の全領域を含む約６、６Ｋｂ　
ｃＤ　ＤＮＡ　ｔｒ片を単離した。そこで、更に当該遺
伝子の全ヌクレオチド配列及びコードされるアルカリセ
ルラーゼのアミノ酸配列を決定し、これらをこれまでに
知られているバチルス属／ＩａｌｖＩ由来の他のセルラ
ーゼ遺伝子のヌクレオチド配列及びコードするアミノ酸
配列と比較したＭｉ来、本発明のＤＮＡ断片は独自のヌ
クレオチド配列を有しており、且つ、コードするアルカ
リセルラーゼのアミノ酸配列も他と異なることを見出し
、本発明を完成した。

従って、本発明はアルカリセルラーゼ遺伝子を提供する
ものであり、更に当該遺伝子を含むＤＮＡ分子を提供す
るものである。また、不発明はアルカリセルラーゼ遺伝
子を含有する微生物′ｆｒ：提供するものでめる。

本発明に於いて、アルカリセルラーゼ遺伝子の供与体と
なる微生物としては、例えば、好アルカリ性バチルス属
ａｍの一種、バチルス　エスピー　ＫＳＭ−６３５を用
いることができる。本―株は本発明者らが、菌体外に著
量のアルカリセルラーゼＫを生産する菌株として栃木県
芳賀郡の土壊よシ分艦したものであり、倣工研条寄第１
４８５号として寄託されている。Ｋ、＄ＶＩ　−６３５
分類学的性ＪＸは、本発明者らによる昭和６１年１０月
２８日付出願の昭和６１年荷許頴第２５７７７５号に詳
述されている。

供与菌株から染色体ＤＮＡを得る方法としては、例えば
、マーマーの方法（庵ｒｍｕｒＪ、。

ＭＯＬ　Ｂｉａｌ、、　３　、２０８　、　（１９６１
））や斉藤と三浦の方法（５ａｉｔｏ、　Ｈ，ａｎｄ　
Ｌｖｉｉｕｒａ、　Ｋ、　Ｘ、。

Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　７
２　、６１９　。

（１９６３））等が挙げられるが、他の類似な方法を用
いることもできる。斯くシて得られた染色体ＤＮＡを制
限酵素で切断することによって、アルカリセルラーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片をｔＪＩＡ製するが、用いる制限
酵素の種類としては、当該遺伝子を分断しないものでろ
れば、如何なるものでも使用できる。このよつな制限酵
素の例として、ｊ（ｃｏＲＩ％ｊ；ｃｏＲＶ或いはＢａ
ｍＨＩ等の制限酵素が挙げられる。また、用いる制限＃
素が当該遺伝子による酵素活性発現に必須な憤域金分断
しなければ、当該遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を調製
できる“。

更に、当該遺伝子或いは活性必須領域を切断する制限酵
素を用いる場合においても、部分切断の条件を用いるこ
とによって目的を達成できる。例えば、制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌｌ′ｔ−用いる場合、完全切断条件を用いれば、当
該遺伝子の活性必須領域金言む約４．ＱＫｂのＤＮＡ断
片を調製することができ、また、部分切断の場合には、
当該遺伝子の全憤域を含む、約５．５　ＫｂのＤＮＡ断
片を調製することが可能でるる。

−万、用いるイａ主・ベクター系としては、省主因抹が
アルカリセルラーゼ遺伝子を発現させることができ、ま
た、組換えＤＮＡ分子が宿主間中で４ｉ、襄’ａｆ北で
あジ、組み込んだ当該遺伝子を安定に保持できるもので
あれば、如何なるものも使用することができる。例えば
、−１２ｍを宿主とするＥＫ系やバチルス　ズブチリｘ
　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｔｓ　）　Ｍａｒ
ｂｕｒｇ株を宿主とする８Ｍ系等が挙げられるが、好適
には。

遺伝学的に最もよく研究されており、ベクターの種類が
豊富であるＥＫ系を用いると良い結果が得られる。宿主
陶体の具体例として、ＥＫ系では）１８１０１休、Ｃ６
００休、ＪＭ１０９株等、８Ｍ系ではＢＤ１７０休、Ｍ
Ｉ　１１２株等が挙げられる。ベクターとしては、上記
の記述に加えて、染色体ＩＪＮＡを切断した制限酵素に
よって唯一ケ所で切断されるシラスミドベクターを用い
れば染色体ＤＮＡ断片との結付の際に便利である。具体
的には、染色体ＵＮＡ　ｆ　Ｈｉｎｄ瓜で切断し、ＥＫ
系ではｐＢＲ３２２やｐＬＪｃ　１２、ｐＵｃ　１８等
のベクター、また１３Ｍ系ではｐｃ１９４やｐＢＤ　８
等のベクターを用いることができる。

また、供与染色体ＤＮＡを切断する制限酵素が用いるベ
クターを切断しない場合についても、仕成リンカ−を用
いる方法やホモ？リマー結合法（Ｎｅ１ｓｏｎ、　Ｔ、
　ａｎｄ　８ｒｕｔｌａｇ、　Ｌ）、、　Ｍａｔｈｏｄ
ａｉｎ　ｊ；ｎｚｙｒｎｏｌｏｇｙ、　６８　、４１　
、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｏｓ−ａ。

Ｎｅｗ　Ｙａｒｋ　（１９８０））等を用いることによ
って、実施することができる。

上記の染色体ｍＡ断片と制限酵素によって切断したベク
ター窃仇分子を結付烙せ２組換えＤＮＡ分子金作襄する
が、結付の方法としては１例えばｓ　ＤＮＡ　リガーゼ
を使用する方法やホモ前リマー結合法等を用いることが
できる。

組換えＤＮＡ分子による宿主陶体の形質転換の方法は特
に限定されないが、例えば、　ＥＫ系宿主園株の場合、
塩化カルシウム法 （Ｍａｎｄｅｌ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｈｉｇａ、　Ａ、、
　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

５３．１５９　、（１９７０））や塩化ルビジウム＠　
（Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｂａｃｋｍａｎ、
　Ｋ、　、　Ｍｅｔｈｏｄｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、　６８　、２５３　、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
　（１９７９）　　）　等％　またＢＭ系宿主園株の場
合には、コンブテント・セル法（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ。

Ｓ、　ａｎｄ　Ｄａｂｎａｕ、υ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅ
ｎ、　ｕｅｎｅｔ、。

１７７．４５９　、（１９７９）ｌやゾロトゲラスト法
（Ｃｈａｎｇ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　
Ｎ、　、　１ｖ１ｏ１．、Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅ　ｔ　、ｔ　１６８．１１　ｍ　＋　（１９７
８）ン等金用いることかできる。組換え微生物の選択は
、先ずベクターＤＮＡ分子上にコードされている抗生物
質耐性等の形質のつち、外来染色体ＤＮＡ断片の挿入に
よって失活しない形質を指標として、ベクター由来のＤ
ＮＡ断片を含むＤＮＡ分子によって形質転換されたもの
を一次選択する。具体的には、例えばベクターとしてＥ
Ｋ系のｐＢＲ３２２ｅ用い、こノ、ｔ−１ｉｎａｔｕ切
断部位に染色体ＤＮＡ　（ＤＭｉｎｄ　ｆｉｌ断片を挿
入した場合には、テトラサイクリン耐性遺伝子が失活す
るので、遺伝子中にＭｉｎｄ　ｍ切断部位を持たないア
ンピシリン耐性を指標として一次選択を行えば艮い。

次にこれを２％のカルボキシメチルセルロース（ＱＶＩ
Ｃ）を含む適当な寒天層地にレゾリカ法によって移植し
て、培誉金行い、コロニーが出現した後に、例えばコン
ゴ−・レッドｆｚ　（Ｔｅａｔｈｅｒ、　Ｒ，ＭＬ、　
ａｎｄ　Ｗｏｏｄ、　Ｐ、　Ｊ、、　Ａｐｐｌ。

Ｗｎｖｉｒｏｎ、　１ｖｉｉｃｒｏｂｉｏ１．、４３　
、７７７　、　（１９８２）　）等によってコロニー周
辺のＣＭＣを分解した菌株を目的の組換え微生物として
選択することができる。

斯くしで得られた組換え微生物が保持する組換えＤＮＡ
分子は通常のノラスミド調製法或いは７７−ゾＤＮＡ　
０４製ｉ　（ＭＪＬｎｉａｔｉｌｌ、　Ｔ、。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ　Ｅ、　Ｆ、　、　ａｎｄ　５ａｒｎｂ
ｒｏｏｋ、　Ｊ、　、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）等）を用いて抽出し、
各種制限酵素による切断・９ターンを電気原動法等によ
って解析することにより、組換えＤＮＡ分子がベクター
υｉ’ＪＡ分子とアルカリセルラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ　Ｆ！ｆｒ片が結合したものであることを確認できる
。

本発明に於けるアルカリセルラーゼ遺伝子は、第３図に
示した制限地図を有する約ａ６ＫｂのＤＮＡ　ｌｆｒ片
に含まれておυ、特にその中の太線で示した約１５　Ｋ
ｂの部分に存在している。

また、約６．６　ＫｂのＤＮＡＷＴ片を構成しておシ、
その両端がｆ（ｉｎｄ　ｍ切断点でるる２つのＤＮＡ断
片のうち、−万の約４．ＯＫｂ′ｓｆｒ片中に当該遺伝
子の活性必須領域が含まれており、これは更に細線で示
した約２，４Ｋｂにまで切り縮めることができる。これ
ら約４　Ｑ　Ｋｂ及び約１４Ｋｂのα仏断片は：１ＰＪ
４図及び第５図に示した制限地図をＭしている。

次いで、アルカリセルラーゼ遺伝子を含む約３．５　Ｋ
ｂの部分のヌクレオチド配列をＭ１３ファーゾベクター
（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　、　Ｍ１３ｔｈｏｄｓｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　ｌ　０１　、２０　、　（１９
８３）　）を用いたサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、
、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ。

Ｓ、ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｅｉ、　ＵＳＡ、　７４　、５４６３　、　（１９７
７））によって決定したところ、＠６図に示した配列を
有することが明らかとなった。本配列は第３図に示した
約λ５Ｋｂ部分の右側から左側に向けての配列を５′か
ら３′の方向に示したものであり。

またヌクレオチド番号１番から７４Ｉｒまでの配列はサ
ブクローニングの際に用いた合成リンカ−（ファルマシ
ア社製）由来のものである。

従って、これを除いた３４９８ｂのヌクレオチド配列が
ＫＳＭ−８３５株の染色体りぬ由来のものでろるが、本
配列中にヌクレオチド番号６１２番のＡＴＧから翻訳を
開始し、第２図に記載のアミノｆｉ９４１残基の配列を
コードするオーシン・リーディング・フレームが認めら
れた。オーノン・リーディング・フレームのｓｂ（ペー
ス）上流に枯草＃ｌ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ　）の１６Ｓすメゾームｍの３′末端の配列（ｍｃＬ
ａｕｇｈｌｉｎ、　Ｊ、　Ｌ、　Ｍｕｒｒａｙ、　Ｃ，
Ｌ。

ａｎｄ　Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ、　Ｊ、　Ｃ，、Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２５６．１１２８３．（１９８１））と相補性が高いＧ
ＧＧＡＧＧ配列が存在し、更に上流には、制限酵素Ｓａ
ｐ　Ｉによる切断点近傍に６４４型グロモーターの共通
配列（Ｇｉｔｔ、　Ｍ、　、　Ｗａｎｇ、　Ｌｌ、　Ｆ
’。

ａｎｄ　Ｌ）ｏｉ、　Ｒ，Ｈ，、Ｊ、　Ｂｉａｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、、　２６０　。

７１７８、（１９８５３等）と相同性の高いＴＡＧＡＣ
Ｇ−−１７ｂ−ＴＡＴＴＡＴ配列が認められた。また、
ヌクレオチド番号３４３５番の翻訳終止コドンＴＡＡの
下流には転写ターミネータ−と思われるインバーチイツ
ト・リピート配列（第６図中　（・・・・）　の箇所）
が存在した。

本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子をこれまでにα仏配
列及びコードするセルラーゼのアミノ酸配列が決定され
た細菌由来のセル２−ゼ遺伝子と比較したところ、本遺
伝子は独自のＤＮＡ配列を有しており、且つコードされ
るアミノ酸の配列も上記のセルラーゼのものとは異なっ
ておシ新規なものであった。

アルカリセルラーゼ遺伝子の余憤域を含む組換えＤＮＡ
分子の好適な例とし°Ｃ，７’ラスミドｐＢｃ　１００
　（第７図）等が挙けられる。本プラスミドはベクター
プラスミドｐＢＲ３２２の）ｉｉｎｄ　１１切断部位に
邸Ｍ−６３５株由来でろシ％４３図に示した約６．６Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を挿大したものである。尚、　ＫＳＮＩ
　−６３５株の染色体ＤＮＡ上において、この約６．６
ＫｂのＤＮＡ断片を構成する２つのＨｉｎｄ　ｍ断片が
隣接しで存在することは、２つのＭｉｎｄ　ｉｌｌ断片
をゾローブとしたサザン・ハイブリダイゼーション法を
用いて確認されている。また、当該遺伝子の活性必須領
域を官む組換えＤＮＡ分子の好適な例としては、組換え
グラスミドｐＢＣ１０１５ｐＢｃ　１０２、ｐＢｃ、ｌ
　１１、及びｐＢＣ１１２、等が挙げられる。これらの
グラスミドはいずれもベクターグラスミドｐｔ３Ｒ３２
２の出ａｄ瓜切断部位にｋｃｓＭ　−６３５休由来のＩ
）ＮＡ断片を挿入したものでメジ、それぞれの挿入α仏
断片はｐＢｃ　ｉ　０１及びｐＢｃ　１０２の場合は第
４図に示した約４．ＱＫｂの、また、ｐｔ３ｃ　１１１
及びｐＢｃ　１１２では第５図に示した約２．４Ｋｂの
ＤＮＡ断片でおる。約Ｚ　４　Ｋｂ　Ｏα仏断片の場＆
、それらの一端には五ｊｎｄｕ［切断部位が存在しない
為、ベクターシラスミドと納会の際に合成Ｍｉｎｄ　Ｉ
ＩＩリンカ−を付与した。第８図、第９図、第１０図、
及び第１１図にそれぞれ示した様に％　　ｐＢＣＩＯＩ
とｐＢＣ１０２及びｐＢＣｌｌｌとｐＢＣ１１２ではそ
れぞれベクターグラスミドｐＢｇ　３２２に対する挿入
Ｊ仏断片の方向が逆向きでるる。いずれの場合も、宿主
一体中で当該遺伝子を発現させることができる。

組換えＤＮＡ分子を含有する組換え倣生物の好適な例と
しては、エシェリヒア　コ＋７）ｉＢｌ　０１　（ｐＢ
Ｃ１００）、ＨＢＩＯＩ（ｐＢｃｌｏｌ）、）ｆＢｌｏ
ｌ　　（ｐＢｃ１０２）　、　ｌコＩＢＩＯＩ　　（ｐ
Ｂｃｌｌｌ）　％及び）ＩＢＩＯＩ（ｐＢｃｉ１２）　
　の各株等が挙けられる。これらの菌株はエシェリヒア
　コリ）ｉＢ１０１株に上述の組換えシラスミドを通常
の形質転換法を用いて導入したものであり、エシェリヒ
ア属細陶の培養に通常用いられる層地で培黛することに
よシ一体内にアルカリセル２−ゼを生産する。生産され
た当該酵素の最適度１５　ｐＨは９〜１０でめり、遺伝
子の供与菌株でろるバチルス　ニス♂−Ｍ　−６３５（
ＦＥｋＬＮＩ　Ｐ−８８７２）が生産するアルカリセル
ラーゼＫ（Ｄ櫃と良く一致し、加えて１両者の生産する
当該酵素の免疫学的同一性が免疫拡散試験によってａｇ
された。

上記の岨換えグラスミドからアルカリセルラーゼ遺伝子
の全領域或いは活性必須領域を含むＤＮＡ断片を単離す
る方法としては、組換えｆ：７スミドを制限酵素Ｍｉｎ
ｄ　ｍによって部分的に或いは完全に切断した後、７ガ
ロースグル電気泳動法によって、）仏断片を分離し、グ
ルより抽出・精製することによって実施できる。グルか
らＤＮＡ断片を抽出・精製する方法としては、電気溶出
法（Ｍｃｊ）ｏｎｎｅｌｌ　、　Ｍ、Ｗ、　。

Ｓｉｍｏｎ、　Ｍ、　Ｎ、　ａｎｄ　５ｔｕｄｉｅｒ、
　Ｆ、　Ｗ、、　Ｊ、　ｆＶｌｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、　１１０　、１１９　、　（１９７７））
？低融点アガロースゲルｆ用いる方法（ｖｖｅｉｓｌａ
ｎｄｅｒ、　Ｌ、。

Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９８　、３０５　、
　（１９７９））などが挙げられる。

〔実施例〕

以下、実画例で具体的に本発明を説明する。

なお、アルカリセルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は以下
の様に測定した。即ち、ＣＭＣ（２−５％）０．２ｒｒ
１１，０．５Ｍグリシン緩（１ｆｆ（ｐｔ１９．０）０
．１−及び脱イオン水０．１　ｍからなる基質溶液に酵
素液ｏ、ｉ−２カロえ、４０℃反応した後、生成した還
元糖を３，５−ゾニトロザリチルｙｌ　（３、５−ｄｉ
ｎｉｔｒｏ　５ａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ
））法（Ｓｕｍｎｅｒ、　Ｊ、　Ｌ　ａｎｄ　Ｓｏｍｅ
ｒａ、　Ｇ、　Ｆ、。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ
　ＢｉｏｌｏｇｔｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ
。

３４　、（１９４４））によって定量した。＃素力価は
、上記の条件下で１分間に１μｒｎｏｌ　のグルコース
に相当する還元Ｓを生成する酵素量′ｆ！：１単位とし
た。また、蛋白定量はバイオ・ラド　プロティン　アッ
セイ　キット（バイオ・ラド社製）を用いて行い、牛血
漿アルブミンを標準蛋白として算出した。

実施例１ アルカリセルラーゼに全生産する好アルカリ性バチルス
　エスピー　ＫＳｉＶｌ　−６３５（Ｆ應ＢＰ−１４８
５）を、５−のＭＹＧ場地（肉エキス（ラブ・レムコノ
−ウダー　オキンイド社展）１．０％、酵母エキス（デ
イフコ社製）　０．５　％、ＮａＣ１１，０％、ＫＨ２
ＰＵ、　０．１％、Ｎａ、ＣＯ３１，０％　（別滅國）
）に接種し、３０℃で２日間振盪培養を行った後、これ
を５００−の同培地に接種し、史に３０時間３０Ｃで振
盪培養した。この後、遠心分離によって菌体を集め、斉
藤と三浦の方法（５ａｉｔｏ、　Ｈ。

ａｎｄ　Ｍｉｕｒａ、　Ｋ、　１．、　Ｈｉｏｃｈｉｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ａｃｔａ。

７２．６１９．（１９６３））に従って約３００μ？の
ｆ＃製染色体ＤＮＡを得た。

実ゐ例２ 実施例１で得られた染色体ＤＮＡ　１０μｆを制限酵素
反応ｇ　（Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ト’Ｊスー塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）、ｌ　Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣＩｔｚ、　５０　ｍＭ
Ｎ＆Ｃ１。

１　ｍＭゾチオスレイトール）に尋解し、これに制限ｇ
４７１　Ｍｉｎｄ　１１　（ベーリンガー　マンハイム
社製）１０単位を加えて３７℃で２Ｑ間インキュベーシ
ョンし％染色体ＤＮＡの切ｌ＃ｉ′ｆｃ行った。フェノ
ール処理によって制限酵素を除去したのち、同じ（１４
ｉｎｄ　ｉｌｌで切断したベクタープラスミドｐＢＲ３
２２（ベーリンガー　マンハイム社製）１μ？を加え、
エタノール沈澱を行った。得られたＤＮＡの沈澱をリガ
ーゼ反応液（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）、１０　ｍＭ　ＮｌｇＣｈ　、　　１０　ｍＭゾチオ
スレイトール、１　ｍＭ　ＡＴＰ）　５０　μｇに溶解
した。これにＴ４ＤＮＡ　＋）　カーゼ（ヘ−！Ｊンガ
ー　マンハイム社製）２単位ｔ−加え、１６Ｃで１２時
間反応を行い、染色体ＤＮＩＬ断片とベクターシラスミ
ドを結合させて組換えシラスミドを作製した。

実施例３ 実施例２で作製した組換えシラスミドによル大１１＃ｌ
陶の形質転侯は塩化カルシウム法（Ｍａｎｄｅｌ、　Ｍ
、　ａｎｄ　Ｍｉｇａ、　Ａ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ
ｉｏｌ、。

５３．１５９　、（１９７０））に従って行った。

）ｉＢ　１０１株（ｌｅｕ、　ｐｒｏ、　ｔｈｉ、　Ｒ
ａｃｙ、　ａｒａ　ｌ　４　。

ｇａｌＫ　２　、　ｘｙｌ　５　、　ｍｔｌ　ｌ　、　
５ｔｒＡ、　ｒｅｃＡ　。

５ｕｐＥ４４　、　ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、　ｅｎｄ　Ｉ
　　）を用いた。

形質転換処理を行った劇懸濁液をアンピシリン（ナトリ
ウム塩、シグマ社製）５０μｍ／１１１を含むＬＢＢ天
培地（トリジトン（デイフコ社製ン１．０％、酵母エキ
ス（デイフコ社製）０、５％、ＮａＣ５１，０％、バク
ト寒天（デイ７コ社製）１．５％）に塗抹し３７℃で２
４時間培養した。出現１−た約１００００個の形質転換
体のコロニーをアンピシリン５０μｆ／ｍｌ　トＣＭＣ
２％を含むＬＢ寒寒天電池レノリカ法によって移植し゛
、更に３７℃で４８時間培養した。培５＃後、集落周辺
のＣＭＣｔ−分解する菌体紫コンゴ−・レッド法（Ｔｅ
ａｔｈｅｒ、　Ｒ，Ｍ、　ａｎｄ　Ｗｏｏｄ。

Ｐ、　Ｊ、、　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　ｈＶｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、、　４３　。

７７７　、（１９８２））を用いて選択し、目的の組換
え微生物′ｆＩ：８株分離した。

実施例４ 実施例３で得られた８株の組換え微生物を、アンピシリ
ン（５０μｔ／ｍｌ）’に含む１０−のＬＢ培地（トリ
ジトン（デイフコ社製）１０％、酵母エキス（デイフコ
社製）０．５％、ＮａＣ１１，０％）にそれぞれ接種し
、３７Ｃで一夜装置培養した恢、これを５００−のＭ９
ＣＡ培地（Ｎａ２ＲＰＯ４０，６％、ＫＨ２Ｐ０．０．
３％、Ｎａ（４０，０５％、ＮＨ４Ｃ７Ｑ、　１％、カ
ザミノば（デイフコ社製）０．２％、Ｍｇ５０４２ｍＭ
　（別滅菌）、ＣａＣｇ、　０．１　ｍＭ　（別滅薗）
、グルコース０．２％（別減困）、アンピシリン５０μ
ｔ／−（除―））に移植し、３７℃で４〜５時間振盪層
養シた。これにクロラムフェニコール１７０ηを添加し
、更に３７℃で１５時間振盪培養した。この層養液よシ
遠心分離によって菌体を集め、アルカリｍ画法（Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ。

ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄａ　Ｒｅｓ、、　７　。

１５１３、（１９７９））とセシウム　クロライド−エ
チジウム　プ０？イド（ｃｅｓｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｆｄ
ｅ　−ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ　）　ｖＭ度
勾配遠心＠　（Ｒａｄｌｏｆｆ。

Ｌ、　Ｂａｕｅｒ、　Ｗ、　ａｎｄ　Ｖｉｎｏｇｒａｄ
、　Ｊ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　５７　、１５１
４．　（１９６７）　）を組み合わせた方法（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔａｃｈ。

Ｅ、　Ｆ、　、　ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　
、　１Ｖ１ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２））に従って
、組換えシラスミドを調製し之。得られた８種の組換え
シラスミドについて常＠　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、
、　Ｆｒ１ｔａｃｈ、　Ｅ。

Ｆ、、ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）等）に従って
、制限酵素切断地図を作製し友ところ、いずれのシラス
ミドにも第３図に示した約４．ＯＫｂ　ｏｎｉｎｄ　ｎ
ｉ　Ｗｒ片が含まれていることが明らかになった。これ
らのうち、２つのシラスミドがこの約、ＬＯＫｂのαＵ
断片のみがベクターグラスミドｐＢＲ３２２と結合した
ものであり、第８図、及び第９図に示した様に、両者で
ベクターシラスミドに対する挿入方向が逆向きとなって
いた。得られた組換えシラスミドをそれぞれｐＢＣ１０
１及びｐＢｃ　１０２と語基した。また、ｐＢＣ１０１
或いはｐＢｃ　１０２によって形′Ｘ転換されたエシェ
リヒア　コリ　）ｉＢ　１０１株金ＨＢ１０１（ＰＲＣ
１０１）或いは８８１０１　（ｐＢｃ１０２）と命名し
た。更に、別の１つのｆ−ｙスミドは第７図に示したよ
うに、約４０　Ｋｂ　Ｃ１断片の他に約Ｚ６ＫｂのＭｉ
ｎｄ　ｍ断片が含まれておシ、コレｔｐａｃ　ｉ　ｏ　
ｏト命名ｔ、、’＊り、ＰＲＣｌｏｏによって形質転換
されたＨＢ　ｉ　ｏ　ｉ株ｔ−１−ＩＢＩＯＩ（ｐＢＣ
１００）と命名した。

実施例５ 組換えシラスミドｐＢｃ　１０１１μｔを５０μＩの１
０　ｍＭ　ＭｇＣ１５と１　ｍＭゾチオスレイトールを
含むｌＱｍＭ）リス塩酸緩（１１’［（１１７，５）に
溶解し、これに制＠酵素ＫｐｎＺ２単位を加えて３７℃
で２時間反応させ、ｐＢｃｌｏｌを直、鎖状とした。フ
ェノール処理によってＫｐｎ　Ｉを除去し、エタノール
沈澱を行った後、沈澱を１０　ｍＭ　ＭｇＳＯ４とＯ９
ｌ　ｍＭゾチオスレイトールを含む５０ｆｎＭト！Ｊス
塩酸緩衝液５０μｌに溶解した。これに１．２５単位の
ヌクレアーゼＢａｌ　３１を加えて２２℃で１５分間反
応後、フェノール処理によって反応を停止し、更にエタ
ノール沈澱を行った。沈澱ｆ　５０　ｍＭＮｈＣ１％１
０　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ及び１ｍＭゾチオスレイトールを
含む１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｔｆｉ７．５）に溶解
し、制限酵素Ｍｉａｄ　Ｉｌｌ　１単位を加えて。

３７℃で２時間反応した後、アガロースゲル電気泳動を
行い、グルから電気溶出法 （１Ｖ１ｃｉＪｏｎｎｅｌｉ、　Ｍ、　Ｗ、、　５ｉｒ
ｎｏｎ、　Ｍ、　Ｎ、　ａｎｄＳｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、
　Ｗ、、　Ｊ、　ＭＯｌ、　８ｉｏ１．、１１０　。

１１９　、　（１９７７））によってｔ４５図に示した
約Ｚ４ＫｂのＤＮＡ断片を単離した。このα仏断片１１
２　ｐｔ、　Ｈｉｎｄ　１１１によって切断したｐＢＲ
３２２０，２μｊ’及び合ｇＨｉｎｄｌｌｌリンカ−０
、０２０Ｄ、、、単位をリガーゼ反応液（２０ｍＭトリ
ス−塩ｆ８Ｒ緩８６　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣ
１５ｓ　　１０　ｍＭゾチオスレイトール、１ｍＭＡＴ
Ｐ）２０μｌに溶解した。これにＴ４必Ｊ／１リガーゼ
（ペーリンガー　マンハイム社製）２単位を加え、１６
Ｃで１２時間の結合反応を行った後、実施例３０方法に
よって大腸園）１１３１０１休の形質転換を行い、得ら
れた形質転換株のアルカリセルラーゼ生産性の有無を調
べた。また、形質転換株から、実施例４と同様の方法を
用いてシラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片がベクタ
ープラスミドｐＢＲ３２２に挿入されていることを確認
した。この結果、第５図に示した約２，４ＫｂのＤ崩、
断片とベクターシラスミドを結合し九組換えシラスミド
を有する岨換え微生物は挿入ＤＮＡ断片の挿入方向に関
わらず、セルラーゼの生産性が認められた。約Ｚ　４　
ＫｂのＤＮＡ断片に合成Ｍｉｎｄ　ＩＩリンカ−を付与
した後、ベクタープラスミドｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌ
ｉｌ切断部位に挿入した組換えシラスミドをｐＢＣ１１
１及びｐｔ５ｃ　１１２と命名した（第１０図及び＄１
１図）。また、それぞれの組換えシラスミドによって形
質転換されたエシェリヒア　コリ　）ｉＢ　１０１休ｔ
−１−ＩＢｌ　０１　（ｐＢｃ　１１１　）及びＭＢＩ
ＯＩＰＢＣ１１２）とそれぞれ命名した。

実施例６ １０−のり、Ｂ２Ｏ地で一晩靜ｌｔｆ＠養した）ＩＢ１
０１（ｐＢＣ１００）及びＨＨＩＯＩ　（ｐＢｃ１０２
）各法のｗＩ髪液液１を１００−のＬＢ培地（アンピシ
リン５０μｔ／ｌｄを含む）に接種し、３７℃で２４時
間振盪培誉した。培養後、培養液を遠心分離し、沈澱し
た一体を１０−のリン酸緩衝Ｑ　（ｍ　７．０　）に懸
濁後、超音波破砕を行った。再度、遠心分離によって不
ｆ＃＠を沈澱として取り除き、得られた上清液のＣＭＣ
アーゼ活性の作用−範囲及び最適作用−を求めたところ
（＠１２図）、本＃素は−４〜１２の広い範囲で作用し
、−９〜１０に最適作用−を有することが明らかとなり
、アルカリセルラーゼ遺伝子の供与体であるバチルス　
エ、ｘ、　ｅ　−ＫＳＭ　−６３５（Ｆ’ＥＲＭ　０Ｐ
−１４８５）株が生産するアルカリセルラーゼにの性質
と良く一致した。

また、二重免疫拡散法（０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　、Ｏ
，。

Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　
Ｉｍｎｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓａｔ、　Ｐｕｂｌ、　、　０ｘ
ｆｏｒｄ、　　（Ｉ　９６７　））によってＨＢｌｏｉ
ｐＢＣｌｏｏ）株のアルカ・リセル２−ゼはＫＳＭ　−
６３５の培養液から精製され、（ｃＭｃアーゼＩの抗血
清（参考側参照）の間に沈降ＩＶ１１ｔ−形成し、且つ
ＣＭＣアーゼ！による沈降線と完全に融合し、両酵素の
免役学的同一性が示された（第１３図）。

実施例７ 約５Ａｆのｐｔ３ｃ１００ｔ−制限酵素Ｈｉｎｄ　ｍに
よって切ｖＩＲ後、アガロース・グル電気泳動を行い、
実施例５と同様にして約Ｚ６Ｋｂ及び約４０Ｋｂ（２）
２）のＨｉｎｄ　ＩＩＩＩ片約０．５μＦをそれぞれ単
離した。この２つのＨｉｎｄ　ｍ断片ｔ−〔α−ｓｚ　
ｐ　）ｄｃＴＰ　　（アマジャム社製）及びニックトラ
ンスレーションキット（宝酒造社製）を用いてニックト
ランスレーション法（ＲｉｇｂｙｔＰ、　Ｗ、　Ｊ、、
　Ｄｉｅｃｌａｎａｎｎ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、
　Ｐ、、　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１１３　、２３７　、　（１
９７７）　）によるラベル化を行い、約ＺＯＸＩＯ’ｅ
ｐｎｘ／μｔのプローブＤＮＡを調製した。−万、Ｘｂ
ａｌ、及びＰｖｕ　［によってそれぞれ単独に切断した
シラスミドｐＢｃ　１００　（各０．５μｆ）及び遍−
６３５株由来の染色体ＤＮＡ　（各３μｔ）をアガロー
スゲル電気泳動後、α仏バンドをサザ７ＣＤ方法（５ｏ
ｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ
ｏｌ、。

９８．５０３　、（１９７５））によってゼータ・プロ
ーブｒｓ（バイオ・ラド社ｌ１ｌ）に移し、前述のプロ
ーブ）仏とのハイブリダイゼーションを行った。

この結果、第１４図に示したように、松逼−６３５株由
来の染色体ＤＮＡのＸｂａＩ切断物及びＰｖｕｌＩ切断
物には約λ６　Ｋｂと約４　Ｑ　Ｋｂの２つのプローブ
必仄の両方とハイブリダイズするそれぞれ約ＬＩ　Ｋｂ
及び約α７　［ｂｑ）　ＤＮＡ断片が存在することが明
らかとなった。ｐＢＣｌｏｏの挿入ＤＮＡ断片において
Ｘｂａ　Ｉ　Ｌ　Ｉ　Ｋｂ及びＰｖｕ　ｕ　Ｏ，７Ｋｂ
は２つのＨｉｎｄ　ｉｌｌ断片の接点でろるＭｉｎｄ　
ｍ切断部位を鋏む形で存在しておシ、更に２つのｆ′１
ｉｎｄｕｌ断片は互いにノ・イブリダイズしない。以上
のことから、ｐＢｃｌｏｏの約ａ　６　Ｋｂの挿入ＤＮ
Ａ　＠片を構成する２つのＭｉｎｄｎｌ断片は心爛−６
３５株の染色体かへ上においても隣接して存在すること
が明らかとなった。

実施例８ 第３図において太線で示した約３．５Ｋｂの部分のヌク
レオチド配列をＭ１３ファーゾペクｊｌ　−（ｆｕｓｓ
ｉｎｇ、　Ｊ、、　ｍｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、
　１０１　。

２０　、（１９８３１）の１橿ｍｐ　１８及びｍｐ　１
９（ペーリンガー　マンハイム社製）を用いたサンガー
の方法（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ
。

ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、　Ｋ、、　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、　７４　、５４６３　
、　（１９７７））によって決定した。尚、Ｍ１３ファ
ーゾの宿主大腸菌としてはＪＭＩ　０９ａ　（ｒｅｃＡ
ｌ　、Δｌａｃ　−ｐｒｏ、　ｅｎｄＡＩ　、　ｇｙｒ
Ａ９６　、　ｔｈｉ−１、ｈａｄＲ１７。

ｒｅｌＡ　１　、　ＦＶｔｒａＤ３６　、　ｐｒｏＡＢ
　　、　１ａｃＩ’　ｇＺΔＭ１５）を用い、また、Ｍ
１３シークエンシングキット（宝酒造社製）及び〔α−
３２Ｐ〕ｄＣＴＰ　　（アマジャム社ｍ）′ｆ：用いた
。この結果、アルカリセルラーゼ遺伝子はｐＢＣ１００
の挿入掛払断片を構成する２つのＨｉｎｄＩＩＩ断片の
両方に跨がる様に存在し、第６図に示したヌクレオチド
配列を有することが明らかとなった。決定したヌクレオ
チド配列を解析すると、２８２３ｂｐから成り、第２図
に示した９４１残基のアミノ酸配列をコードしているオ
ーブンリーディングフレームが認められた。一方、ノラ
スミドｐＢｃ　１０１、ｐＢｃ　１０２、ｐ１３ｃ１１
１、及びｐＢＣｉ　１２の場合、形質転換株のアルカリ
セル２−ゼ生産性は認め・られるものの、当該遺伝子の
下流領域である約１６　Ｋｂのｆ（ｉｎｄ　ｌｌｌ断片
を有していないことから、第４図及び第５図に示した約
４０　Ｋｂ及び約Ｚ４ＫｂのＤＮＡ断片は当該遺伝子の
活性必須領域を含んでいることが明らかとなった。この
活性必須領域は第１図記載の５８４残基のアミノ酸配列
をコードしていた。

参考例１ 栃木県芳賀郡市貝町の土壊１？を戚（至）生理食塩水１
０−に懸濁し、８ＯＣで３０分間熱処理した。この熱処
理敲を適当に希釈してマスターグレート（肉エキス（オ
キンイド社製）１％、バクトペゾトン（デイフコ社製）
１％、ＮａＣ４１％、ＫＨ２Ｐ０．０．１　％、Ｎａ１
ＣＯ３０，５％（別＃ｌＷ）、バクト寒天１．５％）に
塗抹し３０℃で３日間培養し、集落を形成させた。

レプリカ法によシ、マスターグレートド同シ組成の培地
に２％ＣＭＣｔ−加えたｅＲ菌寒天培地に移植し、３０
Ｃで３〜４日間培養して集落を形成させた後、コンゴ−
・レッド法例よって、集落周辺のＣｎ２Ｏ＝２分解する
能力のある菌株を検出した。当該する集落をマスタープ
レートより選択し、　ＣＭＣアーゼ生産生産分離した。

上述の手法によシ、バチルス　エスピー造通−６３５（
ＦＥ脹１３Ｐ−１４８５）を取得した。

参考例２ バチルス　エスピー　邸Ｍ−６３５を１．５％肉エギス
、０．５％酵母エキス、１％ＣＭＣ。

０、１％ＫＭ！ＰＯ４、Ｑ、　７５％Ｎａ２ＣＯ３（別
６！［１）からなる液体培地中、３４℃で２日間好気培
賽した。その珊貢上ｆＩｔ液１ｊに対して３！の冷エタ
ノール（−ｉｏｃｔ−徐々に加えて蛋白沈澱音生じ嘔せ
、得られる沈澱物を最少型の滅菌脱イオン水に溶解し、
希酢酸で中和した後、流水に対して１５時間透析し、凍
結乾床粉木としてアルカリセルラーゼに９．６ｒｉ４た
。

参考例３ ＫＳＭ　−６３，５が培地中に生産したアルカリセルラ
ーゼにの精製は以下の様に行った。即ち、培養液から遠
心分離によって一体を除いた上清液にストレプトマイシ
ン処理、硫安分画（３０〜７５％飽和沈澱画分）を行っ
た後。

分取高速液体クロマトグラフィー（ＳＷ３００００カツ
ム、東洋ｄ遅）Ｄルリートヨノ９−ル（東洋口達）クロ
マトグラフィー、ヒドロキシアノＱタイト（生化学工業
）クロマドグ２フイー、そして再度ＤＥＡＥ　−）コノ
９−ルクｑマトグ２フイーを行った。２回目のＤＥ）Ｅ
　−トヨノＱ−ルクロマトグラフイーの際にＮａＣｊ（
７）直線ａ度勾配（０，２５Ｍ−０，３５Ｍ）ニヨル溶
出を行うことによって％　２橿のＣＭＣアーゼ（ＣＩＶ
ＩＣアーゼｌ及びＣＭＣアーゼ■）に分画された。両酵
素はデービスの方法（１）ａｖｉｓ、　Ｄ。

Ｊ、、　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
、　１２１　、４０４　。

（１９６４））Ｋ従って電気泳動を行い、コマシー　ブ
リリアント　ブルーで染色したところ、単一のバンドを
与えた。

ＣＭＣアーゼ■の抗血清は常法に従って上記の精＃ＩＣ
ｂ／Ｉｃアーゼ１をクサイに注射（１回当たりＩ　Ｑ　
）することによって調製した。

（アルカリセルラーゼにの物理化学的性質）本発明に於
けるアルカリセル２−ゼ遺伝子の供与体であるＢａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｐ、　ＫＳＭ　−６３５が生産するアルカ
リセルラーゼにの物理化学的性質は次の通シである。

（１）　　作用 カルボキシメチルセルロース氷解活性（ＣＸ酵素活性）
１−有するほか、弱いＣｔｌｌ素活性、Ｉ−グルコシダ
ーゼ活性を有する。

（２）基質特異性 カルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、アビ
セル、セロビオース及びｐ−二トロフェニルセロビオシ
ドに対して作用する。

（３）作用−範囲及び最適作用− 作用−範囲は５〜１２、最適作用−は９〜１０でろる。

（４）　　安定−範囲 ５℃で１６時間放置した時の安定−範囲は、６、０〜Ｉ
ＬＯである。

（５）　　作用温度範囲及び最適作用温度１５〜６０℃
の広い範囲で作用するが、最適作用温度は約４０℃に認
められる。

（６）　　キレート剤の影響 Ｈｌ）’Ｉ’Ａ１ＥＧＴＡ％ＮＴ人、５ＴＰＰ及びゼオ
ライトは活性を阻害しない。

（７）界面活性剤の影響 層状アルキルベンゼンスルホン域ナトリウム（ＬＡＳ　
）　、アルキル硫醒エステルナトリウム塩（ＡＳ）％ｚ
リオキシエチレンアルキル奮ｍ（ａＳ）％α−オレフイ
／スルホン酸ナトリウム（ＡＯ８）　、　α−スルホン
化脂１１７ｉｒＲエステルｆトリ＝）ム塩（α−；３Ｆ
Ｅ　）　、アルキルスルホン酸ナトリウム（ＳＡＳ　）
　、メリオキシエチレン七カンダリーアルキルエーテル
、脂肪酸塩（ナトリウム塩）及びジメチルジアルキルア
ンモニウムクロライド等の界面活性剤によって殆ど活注
阻吾は受けない。

（８）　　プロテアーゼの影響 プロテアーゼに対し、彌い耐性ｔ−イする。

【図面の簡単な説明】

、；１４１図及び第２図はアルカリセルラ・−ゼのアミ
ノ酸配列を示す図面でめる。 ５ｇ３図はアルカリセルラーゼ遺伝子を含む約６．６Ｋ
ｂのＤＮＡ断片の制限地図である。太線部分にアルカリ
セルラーゼ遺伝子の全領域、また細線部分に活性必須領
域が含まれる。 第４図はアルカリセルラーゼ遺伝子の活性必須領域ｆｔ
官む約４．ＯＫｂのＤＮＡ　ｑ片の制限地図である。 第５図はアルカリセルラーゼ遺伝子の活性必須領域ｔ−
宮む約λ４ＫｂのＤＮＡ断片のＤＮＡ配列である。 第６図は第３図において太線で示した約３．５　Ｋｂの
部分のヌクレオチド配列でるる。 第７図、第８図、第９図、Ｉ＠１０図及び第１１図はそ
れぞれ組換えシラスミドｐＢｃ　１００、ｐＢｃ　１０
１、ｐＢｃ　１０２、ｐＢｃ　１１　Ｉ及びＰＢＣ１１
２の制限地図であ夛、細線部分はベクターＢＲ３２２由
来、太線部分は／Ｓチルスエスビー　ｋ通−６３５由来
のＤＮＡ断片を示している。 第１２図は１−ＩＢｌｏｌ　（ｐＢＣ１００）及び）Ｉ
Ｂｌ　０１　（９８Ｃ１０１）６株が菌体内に生産する
アルカリセルラーゼの作用−範囲及び最適作用−を示す
グラフで委る。Ｑは１−１８１０１（ｐＢｃ　１００　
）−・はＭＢＩＯＩ　（ｐＢｃ１０２）白米、またムは
バチルス　エスピー　心通−６３５株白米のセルラーゼ
のデーターである。 ＠１３図はＨｊ３１０１（Ｐｉ幻１００）アルカリセル
ラーゼとバチルス　エスピー　−１−６３５の精製ＣＭ
Ｃアーゼ！との二ム免疫拡敏試績でめ９．１は［ｇ　Ｃ
１ｖｉｃ　７−ゼ１の抗血清、２は楕ｇｃｍｃアーゼエ
、３はＨＢＩＯＩＰＢＣｌｏｏ）株が生殖し九アルカリ
セルラーゼである。 第１４図は約１６Ｋｂ（Ａ）　及び約４０Ｋｂ（８）の
出ｎｄｕｌｌ／ｉ片をフローツとしたサザンノ１イプリ
ダイゼーショ／後のオートラジオグラフィーの結果でめ
る。各レーンは１がＫＳＭ　−６３５株由来の染色体Ｄ
ＮＡのＰｖｕｌｌ切断物、２はＰＢＣ１００（１）Ｐｖ
ｕ■切ｗＲ？、　３は染色体ＤＮＡのＸｂａ１９Ｊ１１
吻及び４はｐｔ５Ｃ１００のＸｂａ　Ｉ切ｌ＃？物であ
る。 以上 弁理士　小　野　信　夫「−丁コ ゾ′ 一二−二、−（ｊ 第１図 Ｔｈｔ　Ｌｙｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｔ　Ｇｌｎ　ｌｉ＠Ｌｙ
ｓ　Ｇｉｎ　Ｅａｒ　Ｌｅｕ　　Ｓａｔ　Ｌａｗ　Ｌｓ
ｔ＋　Ｌｅｕ　Ｉｔｓ　ＩＩｓ　Ｔｋｒ　Ｌｍ　＋ｌｅ
　ＭｅｔＳａｒ　Ｌｅｕ　Ｉ％ｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　ｋ
ｔ　Ａｌａ　Ｓｓｒ＾１１＾８ｉ翫＾ｓｎ　Ｇｌ＋＋　
ｈｒ　Ｌｇ　ｈｒ＾ｓｍ　Ａｌａ　Ｐｈｓ　ＰｒｏＰｈ
ａＳｅｒＡｓｐＶａｌＬｙＡＬｙｅＴｈｒｈｒ丁ｒｐＳ
ｅｔＰｍＰｒｏＴｙｒＩＩｓＬｙｓＡｓｓＬｍＴｙｒＧ
ｌｖＧｉｎＧｌｕ　Ｖｍｌ　ＩＩ＠Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔ
ｈｒ　Ｓａｔ　Ａｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｍ　Ｓａｒ
　Ｆ’ｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｍｐ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ
　Ａｒｍ＾１１ＧｉｎＰｈ＠丁ｈｒＶａｌ７１ｅｔＬｅ
ＩＩＴｈｒＡｒｇＧｌｙＬａｕＧｌｙＬＪＩＧｌｌｌ＾
ｌａＳｅｒＳｅｔＬｙｓｂｙＴｙｒＰｒｏＰｈ＊Ｌｙｓ
ＡｓｐＡｒｇＬｙｅＡｓ＋＋ＴｒｐＡｌａ丁ｙｒＬｙｓ
ＧｌｕＩｌ＠ＧｉｎＡｌａ＾１１丁ｙｒＧＩａ＾ＩｎＧ
ｌｙＩＩｓＶａｌ丁ｈｒＧｌｙＬｙｓＴｈｒｈ＋＋Ｇｌ
ｙＧｌｕＰｈｓＡｌａＰｎ＾ｓｅＧＩ＋＋Ａｕ＋Ｉ！＠
丁ｈｒ＾ｒｇＧｌｕＧｌａｋ！ＡｌｍＡｌａＭｅｔ＾１
１νｍｌｋｇＡｌａ丁ｙｒＧｌｕＴｙｒＬ＠ＱＧｉｌｌ
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　ＥＡ　Ｅｆ第４図 ０　　　　＋　、０　　２．０　　３．０　　４．０に
ｂ第５図 第７図 Ｂａｌ　Ｉ　　Ｋｐｎ　１ 第８図 第９図 ＥｃｏＲＶ　　　Ｂ９１　ｎ 第１０図 第１１図 ＥｃｏＲＩ 相対５針１（’／、） 第１３図 ■　　■ 第１４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図に示すアミノ酸配列を有する、セルラーゼを
   コードするＤＮＡ断片。 ２、第２図に示すアミノ酸配列を有する、セルラーゼを
   コードするＤＮＡ断片。 ３、特許請求の範囲第１項記載のアミノ酸配列のカルボ
   キシ末端にアミノ酸或いはポリペプチドを付加した配列
   を有するセルラーゼをコードするＤＮＡ断片。 ４、特許請求の範囲第１項、第２項及び第３項のいずれ
   か一項に記載のアミノ酸配列に対して、アミノ酸の置換
   、欠失、逆位、及び挿入などによつて関連づけられてお
   り、且つセルラーゼ活性を有する蛋白をコードする天然
   、合成、或いは半合成のＤＮＡ断片。 ５、特許請求の範囲第１項、第２項、第３項及び第４項
   のいずれか一項に記載のＤＮＡ断片が、遺伝子の発現調
   節の為ＤＮＡ配列を含有することを特徴とするＤＮＡ断
   片。 ６、特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第５項及
   び第４項のいずれか一項に記載のＤＮＡ断片を分子内に
   含むことを特徴とするＤＮＡ分子。 ７、特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡ断片を含有する
   微生物。