JPH03232494A - バチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコ由来のプロテアーゼ遺伝子、その単離方法及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はバチルス・サーモプロテオリティカス−ｏツコ
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒ＋ｇｏｐｒｏｔｅｏｌｙ
ｔｆｃｕｓ　ｒｏｋｋｏ）由来のサーそりシン遺伝子の
クローニング、大腸菌属及びバチルス属中へのこの遺伝
子の移入並びに遺伝子産物の製造に関する。

バチルス−サーモプロテオリティカスΦロッコ株由来の
中性プロテアーゼのサーモリシンは３１６アミノ酸を有
する一本鎖ポリベブチドを含み、その触媒活性にＺｎ’
＆びその顕著な熱安定性に４つのカルシウムイオンを要
する〔フォンタナ。

Ａ、、バイオフィジカル・ケミストリー、第２９巻、第
１８１−１９３頁、１９８８年（Ｆｏｎｔ、ａｎａ。

＾、、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
２９，１８１−１９３（１９８８））］。

このタンパク質の完全なアミノ酸配列も公表された〔チ
タニら、ネーチャー、第２３８巻、第３５３７頁、１９
７２年（Ｔｉｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ。

２３８．３５−３７（１９７２）））。

バチルス・サーモプロテオリティカスから得ることが可
能な酵素と多かれ少なかれ顕著な類似性を示すプロテア
ーゼは他のい（つかのバチルス種、特にバチルスやステ
アロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　％バチルス９アミロリク
エファシェンス（Ｂａｃ　ｌ　ｌ　Ｉ　ｕｓａｓｙｌｏ
ｌｌｑｕｅｆ’ａｃｌｅｎｓ）、バチルスΦサブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス
・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）によっ
て産生される。各々の酵素をコードする遺伝子は例えば
Ｂ、ステアロサーモフィラス、Ｂ、サブチリス及びＢ、
アミロリクエファシェンスからクローニングされ、配列
決定された〔タカギら、ジャーナル・サブ・バクテリオ
ロジ−（〕、　Ｂａｃｔ、）、第１６３巻、第８２４−
８３１頁、１９８５年；ヤング、　Ｍ、　Ｙ、　（Ｙａ
ｎｇ。

Ｍ、Ｙ、）ら、ジャーナル・サブ・バクテリオロジー第
１６０巻、第１５−２１頁、１９８４年；バサンタ（Ｖ
ａｓａｎｔｈａ゛）ら１　ジャーナル・サブ・バクテリ
オロジー、第１５９巻、第８１１−８１９頁。

１９８４年〕。

バチルス拳す−モプロテオリティカス争ロッコ由来の中
性プロテアーゼに関する遺伝子が今や発見された。従っ
て本発明は２３２アミノ酸を含んだバチルス◆サーモプ
ロテオリティカス・ロツコ由来の中性プロテアーゼに関
する遺伝子及びそのプレプロ配列に関する。そのプレプ
ロ配列を有する遺伝子は第１表に示されたＤＮＡ配列を
有する。

プレプロ配列は３２８位で始まり１０２３位で終わる。

天然サーモリシンをコードする遺伝子部分は１０２４位
で始まり１９７４位で終わる。天然サーモリシンに関す
る遺伝子のＤＮＡ配列の中の各個々のトリプレットの第
３位における非常に低いＧ＋Ｃ含有量は特に注目すべき
である。意外にも、放出される最終サーモリシン酵素に
関してＤＮＡ配列から導かれうるアミノ酸配列はこれま
で推定されていた配列とは２つの位置で異なり、即ちＡ
ｓｐの代わりに３７Ａｓｎ及びＧｌｕの代わりに１１９
０１ｎとなっている。

バチルス・サーモプロテオリティカス・ロツコ由来の中
性プロテアーゼに関する本発明による遺伝子は下記のよ
うに単離することができる、全ＤＮＡは常法でバチルス
・サーモプロテオリティカス・ロッコから単離され、様
々な制限エンドヌクレアーゼ、例えばＤｒａ　Ｉ、Ｃ１
ａ　Ｉ　５Ｈｐａｌ及びＨｉｎｄｍで様々なサイズの断
片に切断され、しかる後アガロースゲル電気泳動で分別
される。これらの断片がフィルター上に移された後、ハ
イブリダイゼーションはサーモリシンの既知アミノ酸配
列に従い化学合成しつる放射性標識オリゴヌクレオチド
プローブで行われる。下記配列のオリゴヌクレオチドが
特にこの操作に適しており、アミノ酸配列上の数値はプ
ロセシングされたサーそりシンに関して用いられる数値
に関する。

５５　　　　　　　　　　　　　　６゜−Ｔｒｐ−Ａｉ
ｍ−Ａｓｐ−Ａｌｍ−＾ｓｐ−＾ｍｎ−Ｃ１ｎ−Ｐｈｅ
−Ｐｈｅ−Ａｌ　ｍ−、ＴＧＧ−ＯＣＡ−ＧＡＴ−１１
４−ＧＡＴ−ＡＡｃ−ｃｙ−’ｍ−ｍ−ｃｃτ　　ＣＴ
ＣＴ　　　　　　ＣＣ １１０：Ｌｉ２ −　Ｇｌｎ−にｌ　ｙ−Ｔｙｒ−Ａａ＋ｎ−Ａｓｎ−Ａ
Ｘ　ａ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｃ１ｙ−−ＣＡＡ−
ＯＣＡ−ＴＡＴ−人入Ｔ−ＡＡＣ−（４−”！ＴＴ−τ
（，６人ＡＣ−ＧＧ’！’ＣＣＴ　　　τ　　ＣＴ これらは混合オリゴヌクレオチドであって、その場合に
双方の可能なヌクレオ千闘がｎ宇六れた位置の各々で用
いられた。双方の場合において、結果はプローブの１２
８倍縮重を起こし、各々は２９ヌクレオチドからなる。

個々のバッチにおいて前記制限酵素によるバチルス・サ
ーモプロテオリティカス・ロツコＤＮＡの完全消化後、
ハイブリダイゼーションで同定された断片はエレクトロ
エル−ジョン （ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によりアガロースか
ら単離し、プラスミドベクターと結合することができる
。リガーゼ混合物は適切な宿主株に形質転換され、クロ
ーンが選別され、所望の断片がこれらのクローンから同
定される。

断片は配列決定ベクター、例えばｐＵＣ８又はそれに由
来するｐＳＶＢ系のベクターへ直接クロニングにより配
列決定することができる〔アーノルド及びピューラ−１
ジーン、第７０巻第１７１−１７９頁、１９８８年（Ａ
ｒｎｏｌｄ　ａｎｄＰｊｈｌｅｒ、Ｇｅｎｅ、７０，１
７１−１７９（１９８８））　）　。クローン化断片の
全領域をカバーすることは、更なるサブクローニング段
階又はクローン化断片内における特定の欠失により可能
である。構造遺伝子並びに付加５′及び３′領域はコン
ピュータプログラムによる不明瞭性なしに同定すること
ができる。

完全なサーモリシン遺伝子を含むＤＮＡ断片は発現のた
めにバチルスベクター又はバチルスシャトルベクター、
例えばｐＲ８２７３（ブリュツクナー（Ｂｒｊｃｋｎｅ
ｒ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、第３２巻第１５１−６
０頁、１９８４年〕及びｐＵＢｌｌｏ　〔グリクザン（
Ｇｒｙｃｚａｎ）ら１第１３４巻。

第３１８頁、１９７８年〕にクローニングする。

これらのベクターによる形質転換及び適切な培地中にお
ける株の増殖後、プロセシングされたサーモリシンタン
パク質をこれらから単離することができる。

意外にも、サーモリシンの発現は大腸菌でも可能であり
、大腸菌の栄養溶液中にプロセシングされた酵素をみつ
けうろことがわかった。

大腸菌内でサーモリシン遺伝子を発現させるために、天
然サーモリシン及びそのプレプロ配列に関する遺伝子を
含むＤＮＡ断片をベクター、例えばｐＢＲ３２２又はｐ
ＵＣに由来するベクターｐＳＶＢ２６もしくｉ；！ｐＳ
Ｖ８２３と結合し、ＨＢＩＯＩ、ＭＭ２９４又はＤＨＩ
のような大腸菌に１２株に形質転換する。更に、その遺
伝子の前にプロモーターを導入することもできる。ここ
で挙げられる例は１ａｃＳｔａｃ又はＲＰ２プロモータ
ーである。勿論、大腸菌で使用しつる他のすべてのプロ
モーターが適用可能である。

下記例は本発明を更に説明するものである。パーセンテ
ージデータは他に指摘のないかぎり重量に関する。

例１ サーモリシン遺伝子を有するＤＮＡ断片のロー力うイゼ
ーション ハチルスーサーモプロテオリティカス・ロッコの全ＤＮ
Ａを単離し、制限酵素Ｄｒａｌ、Ｃ１ａｌ、Ｈｐａｌ及
びＨｉｎｄｍで消化し、ゲル電気泳動で分別した。

断片をサザンプロットでフィルター上に移し、下記配列
を有する放射性同位元素で標識された化学合成オリゴヌ
ク１／オチド〔ホスホルアミダイト法；ビューケージ及
びカルザース、テトラヘドロン・レターズ　第２２巻、
第１８５９頁。

１９８１年（Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈ
ｅｒｓＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２
．１８５９（１９８１））］　と７１イブリダイズさせ
、しかる後オートラジオグラフィーに付した。

５５　　　　　　　　　　　６０ −　Ｔｒｐ−Ａｍ　ａ−Ａｓｐ−Ａｌ　ａ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｎ−Ｃ１ｎ−！’ｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌ　ｍ−−Ｔ６０
ＣＡ−ＣＡＴ−０ＣＡ−０ＡＴ−ＡＡＣ−ＣＡＡ−ＴＴ
Ｔ−Ｔ’！’Ｔ−ＧＣＴＣＴＣＴ　　　　　ＣＣ １１０１１５ −Ｇｉｎ−に１ｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａユａ−
Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ａｇｎ−Ｇｌｙ−−ＣＡＡ−にＧＡ−
ＴＡＴ−人ＡＴ−人ＡＣ−にＣＡ−τ丁子−’ｒｃｃ−
ＡＡＣ−ｃｃＴＯＣＴＴＣτ 下記サイズを視覚化された断片に定めることができた： Ｄｒａ　Ｉ　：　１．２ｋｂ Ｈｐａ　Ｉ　：　２．４ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ：３．７ｋｂ Ｃ１ａ！＋４．８ｋｂ 断片をプラスミドｐＳＶＢ２３又は２６にクロニングし
、全部又は一部配列決定する。完全な遺伝子、すなわち
天然サーモリシン及びそのプレプロ配列に関する遺伝子
はＣ１ａｌ断片に存在していた。

例２ フィルター結合ＤＮＡのハイブリダイゼーションハイブ
リダイゼーションはギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ
）により発行された“フォーカス”（Ｆｏｃｕｓ）　、
第９巻、第２号、１９８７年の出版物中節１−２頁で記
載されるように本質的に行った。

フィルターを６５℃で少なくとも２時間プレノ１イブリ
ダイゼーション緩衝液（５ＸＳＳＣ，２０ｍＭリン酸ナ
トリウム（ｐＨ７，０）、１０×デンハーツ（Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔｓ）　　（水５００ｍ１中フィコール（非イオ
ン系合成スクロースポリマー、ＭＷ４０００）Ｉｇ、ポ
リビニルピロリドンＩｇ、牛血清アルブミン１ｇ〕、７
％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ　、サ
ケ精子ＤＮＡは水中で１５分間煮沸することで変性され
た）で洗浄した。

次いで前加熱硫酸デキストラン溶液（５０％）を加えて
最終濃度１０％にし、放射性同位元素標識オリゴヌクレ
オチドを加えてハイブリダイゼーション溶液の濃度１〜
５　ｎｇ／ｍｌとした。次いで混合物を穏やかに振盪し
ながら少なくとも１６時間水浴シェーカー中でインキュ
ベートした。

ハイブリダイゼーションとその後の洗浄の温度は５０〜
５５℃であった。

インキュベート終了後、ハイブリダイゼーション溶液を
注ぎ出したが、これは次のハイブリダイゼーション実験
用になおも適していた。フィルターからできるだけ完全
に残留ハイブリダイゼーション溶液を除去し、しかる後
ハイブリダイゼーション温度に前加熱された洗浄緩衝液
Ｉ ［：３ＸＳＳＣ，１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，
０）　、ＩＯＸデンハーツ、５％　５ＤＳ）を加えた。

ハイブリダイゼーション温度で１時間振盪後、洗浄緩衝
液Ｉは洗浄緩衝液ＩＩ　（ＩＸＳＳＣ。

１％５ＤＳ）に代えられるが、これは３０分間後に変え
た。

新鮮洗浄緩衝液■中で３０分間後、湿潤フィルターをク
リングフィルム（ｃ１１ｎｇｆｉｌ■）でラップし、カ
セット（例えば、コダックＸ５１）内でＸ線感受性フィ
ルムに露出させた。露出時間は一８０℃で４時間〜５日
間であった。非特異的照射のバックグラウンドが高すぎ
た場合には、その後で／％イブリダイゼーションの場合
よりも高い温度で１時間にわたりフィルターを洗浄緩衝
Ｉｎで再度洗浄することができた。次いで再度オートラ
ジオグラフィーを行った。

例３ コロニーハイブリダイゼーションによる同定寒天プレー
ト上で増殖された細菌のコロニーを冷蔵庫内で数時間４
℃で冷却した。次いて直径か寒天プレートの場合よりも
わずかに小さいプラーク／コロニースクリーンフィルタ
ー〔コロニー／プラークスクリーンＴＭ、ＮＥＮリサー
チφプロダクツ（ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ）　、カタログＮｏ。

ＮＥＦ−９７８／９７８Ａ）をその上におき、フィルタ
ーの位置をボールペン及び刺し跡でマークした。２〜３
分間後にフィルターをはがして、細菌の付着コロニーが
最初１０％強度ＳＤＳに含浸されたワットマン（Ｗｈａ
ｔｍａｎ）　３　Ｍ　Ｍ紙上に上に面するよう５分間お
く。次いでフィルターを予め０．５Ｍ　　ＮａＯＨ，１
，５Ｍ　　ＮａＣ１に含浸されたワットマン３ＭＭ紙に
５分間移した。予めｐＨ８，０の０．５ＭトリスＨＣＩ
、１．５ＭＮａＣ１に含浸されたワットマン３ＭＭ紙上
に更こ５分間移した後、最後に乾燥ワットマン３ＭＭ紙
上に移した。乾燥後、残留付着コロニーを除去するため
フィルターを６５℃で数時間緩衝液（３ＸＳＳＣ，０，
１％５ＤＳ）中で振盪した。

緩衝液を数回交換した。これでフィルターはノ＼イブリ
ダイゼーションの準備ができた。

例４ バチルスの形質転換 コンピテント細胞を得るため、Ｂ、サブチリスの一夜培
養物をＨ３培地〔二重蒸留水６６．５ｍｌ。

１０×Ｓベ一ス１０ｍ１２０％グルコース２．５ｍｌ、
Ｄ、Ｌ−）ワットファン５　ｍｌ　（１ｕ／　ｍｌ）、
２０・６力ゼイン加水分解産物１ｍｌ、２％酵母エキス
５　ｍｌ　％アミノ酸混合物（８％アルギニン、０．４
％ヒスチジン）１０ｍｌ；すべでの成分は別々にオート
クレーブ処理又は濾過滅菌し、しかる後混合された〕で
増殖させた。ｌ０ＸＳベース〔スピジゼン（Ｓｐｉｚｉ
ｚｅｎ）の塩〕　＝　（ＮＨ４）２ＳＯ４２ｇ、Ｋ　　
ＨＰＯ１４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４６ｇ、クエン４ 酸ナトリウムＸ　２　Ｈ２０１ｇは二重蒸留水で１００
ｍ１に調製し、オートクレーブ処理後濾過滅菌された１
Ｍ　ＭｇＳＯ４溶液０．１ｍｌを加え、混合物は０，１
の初期０Ｄ５７８となるように新鮮Ｈ５培地５０ｍ１で
希釈する。細胞を３７℃でインキュベートし、定常相へ
の移行を予めプロットされた増殖曲線との比較から決定
した。このポイントは選択された条件下で約４〜５時間
後に達した。

この時点で懸濁液５ｍｌを除去し、滅菌グリセロール０
．５ｍｌと十分に混合し、一部の０．５ｍｌ又は１ｍｌ
を一８５℃で凍結した。一方、細胞は下記形質転換にお
いてグリセロールの添加なしに直接用いてもよい。

形質転換のために、凍結細胞１ｍｌを３７℃で解凍し、
３０℃で２時間ＬＳ培地〔二重蒸留水８０ｍ１．ｌ０Ｘ
Ｓベ一ス１０ｍ１２０％グルコース２．５ｍｌ、Ｄ、Ｌ
−トリプトファン０．５ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）　、２％
カゼイン加水分解産物０．５ｍｌ、２％酵母エキス５ｍ
Ｌ　Ｉ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃ１２０，２５ｍｌ、ＩＭ　　
ＣａＣｌ２０．０５ｍｌ）２０ｍｌ中でインキュベート
した。次いでこのインキュベート混合物１ｍｌを１０ｍ
１プラスチツクチユーブ〔グレイナ−（Ｇｒｅｉｎｅｒ
）　〕中に入れ、０．１Ｍ　　ＥＧＴＡ溶液１０μｌを
加えた。室温で５分間のインキュベート後、形質転換さ
れるプラスミドＤＮＡ、即ちベクターｐＲ２７３中の４
．　８ｋｂＣｌ　ａ　！断片を加え（０，５〜５μｇ）
、混合物を３７℃で更に２時間インキュベートした。次
いて細胞を遠心沈降させ（１０ｍ１ｎ　、６０００ｒｐ
ｍ　、ヘレウス・パイオフユージ（Ｈｅｒａｅｕｓ　Ｂ
ｉｏｆｕｇｅ）　）　、上澄的１００μｌに再懸濁した
。この濃縮懸濁液をカナマイシン１０μｇ／ｍｌ含有Ｌ
Ｂプレート（栄養ブロス１０ｇ５ＮａＣ１５ｇ、酵母エ
キス５ｇ）上に分配した。３７℃で一夜インキュベート
後、耐性コロニーを確認することができた。

例５ 大腸菌での発現 大腸菌でサーモリシン遺伝子を発現させるため、完全サ
ーモリシン遺伝子を含むサイズ４．８１（ｂのＣ１ａｌ
断片をベクターｐＢＲ３２２と結合させ、公知方法でＨ
ＢＩＯＩ、ＭＭ２９４及びＤＨＩのような大腸菌に１２
株に組み込んで形質転換させた。ｐＵＣに由来するベク
ターｐＳＶＢ２６又は２３を用いることも可能であった
。適切なりローンをプロテアーゼ基質〔修飾フラジア及
びラップ（Ｆｒａｚｌｅｒ　ａｎｄ　Ｒｕｐｐ）カルシ
ウムカゼイネート寒天。

品Ｎｏ、２２４８．西独ダームスタットのＥ、メルク（
Ｅ、Ｍｅｒｃｋ）製〕の存在により濁ったプレート上で
画線した場合には、画線部分周囲に寒天の明確な清澄化
か存在した。Ｌブロス上で増殖し始めたコロニーを切出
して寒天ブロックで試験寒天上においた場合、ブロック
周囲に明確な清澄化が同様にみられた。この実験におい
て、溶解の領域のサイズはバチルス・サーモプロテオリ
ティカス・ロツコの切出しコロニーかその上におかれた
場合に観察されたサイズにほぼ相当した。液体Ｌブロス
培地にサーモリシン発現大腸菌の単一コロニーを接種し
、細菌を一夜振盪した。細菌を遠心沈降させ、上澄をＳ
ＤＳ　　ＰＡＧＥで試験した。大腸菌の上澄はＳＤＳケ
ル上の移動特性からＢ、サーモプロテオリティカス・ロ
ツコ由来の高度精製かつ市販サーモリシンと同一のタン
パク質を含有することかわかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１表に示された配列を有するバチルス・サーモプ
   ロテオリティカス・ロッコ由来のサーモリシン及びその
   プレプロ配列をコードする遺伝子。 ２、第１表に示された１０２４位で始まり１９７４位で
   終わる配列を有するバチルス・サーモプロテオリティカ
   ス・ロッコ由来の天然サーモリシンをコードする遺伝子
   。 ３、請求項１又は２に記載された遺伝子を有するハイブ
   リッドベクター。 ４、請求項３に記載されたハイブリッドベクターを有す
   るバチルス属又は大腸菌属の株。