WO2019026827A1 - サーモリシン液剤 - Google Patents

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WO2019026827A1
WO2019026827A1 PCT/JP2018/028409 JP2018028409W WO2019026827A1 WO 2019026827 A1 WO2019026827 A1 WO 2019026827A1 JP 2018028409 W JP2018028409 W JP 2018028409W WO 2019026827 A1 WO2019026827 A1 WO 2019026827A1
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thermolysin
solution
concentration
activity
stability
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PCT/JP2018/028409
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English (en)
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Inventor
和寛 古川
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天野エンザイム株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24027—Thermolysin (3.4.24.27)

Definitions

  • the present invention relates to thermolysin solutions. More specifically, the present invention relates to thermolysin solutions with improved stability.
  • Thermolysin is known, for example, as an endo-type protease (EC 3.4.24.27) derived from the thermophilic bacterium Geobacillus stearothermophilus (Former: Bacillus stearothermophilus).
  • Thermolysin is classified as a metalloprotease and catalyzes a protein-based hydrolysis reaction.
  • Thermolysin has excellent heat resistance, and in particular, exhibits activity even at high temperatures near 80 ° C. in the presence of a calcium salt.
  • Thermolysin is widely known to be stable at pH 5.0 to 8.0, or pH 6.0 to 9.0 (see, for example, Patent Document 1 and Non-patent Document 1), and pH 6.0 to 9. It is also widely known that the stability significantly decreases on the pH side higher than 0 (see, for example, Non-Patent Document 1). For this reason, in preparation of a liquid containing thermolysin, it is usually prepared at pH 5.0 to 9.0 in order to obtain stability.
  • Patent Document 1 the pH of a solution containing thermolysin is adjusted to 10.5 or more to dissolve crystals, and from this, a final concentration of 15 to 30% of a salt is allowed to coexist and the pH It is disclosed to produce a liquid product of thermolysin by lowering to 8, preferably 6 to 7, specifically 6.0.
  • Patent Document 2 discloses that thermolysin is stabilized by coexistence with a specific salt in the presence of a buffer salt capable of maintaining the pH in the range of 4.5 to 9.
  • thermolysin is stable at pH 5.0-9.0. Therefore, in order to obtain a liquid containing thermolysin in a stable state, preparation at such a pH of 5.0 to 9.0 has been a major premise.
  • Patent Documents 1 and 2 in order to obtain a liquid containing thermolysin as a stable one, examination of the production process and examination of salt conditions are made, but the pH of the liquid containing thermolysin which is the final product Are also adjusted in the range of 5.0 to 9.0.
  • these techniques have many manufacturing and compositional limitations and are not suitable for industrial production.
  • thermolysin has a problem of causing autolysis in a solution of pH 5.0 to 9.0. Even if the problem of autolysis is to be avoided, there is a strong technical common sense that thermolysin is stabilized at pH 5.0-9.0, and the stability of the liquid containing thermolysin is still pH 5.0-9. There was nothing else other than 0 to consider. That is, for those skilled in the art, the stability at higher pH of the liquid containing thermolysin was not open to examination.
  • an object of the present invention is to provide a thermolysin solution having further improved stability.
  • the present inventors focused on the pH that was not open to the person skilled in the art in the study of the stability of the liquid containing high concentration of thermolysin. As a result, it has been surprisingly found that if the liquid contains a predetermined high concentration of thermolysin, the stability is improved by adjusting to a pH higher than the pH which has been made stable.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • the present invention includes the following inventions.
  • Item 1 Thermolysin solution containing thermolysin at a concentration of 0.1 mg / mL or more, and adjusting the pH to over 9.0.
  • Item 2. The thermolysin solution according to item 1, wherein the pH is 9.5 to 11.5.
  • Item 3. The thermolysin solution according to item 1 or 2, which contains sodium chloride at a concentration of 0.01 mM to 1 M.
  • Item 4. The thermolysin solution according to any one of Items 1 to 3, which contains calcium chloride at a concentration of 0.01 mM to 1 M.
  • Item 5. The thermolysin solution according to Item 1 or 2, substantially free of any salt other than the buffer salt.
  • thermolysin powder comprising the step of drying the thermolysin solution according to any one of items 1 to 5.
  • Item 7. The thermolysin dry formulation whose pH at the time of making it melt
  • Item 8. A method for improving the stability of thermolysin solution, comprising adding thermolysin to a thermolysin solution at a concentration of 0.1 mg / mL or more, and adjusting the pH to over 9.0.
  • thermolysin solution having a further improved stability is provided.
  • thermolysin solution obtained in Experiment 1 It is a graph which shows the relationship of the stability (residual activity) with respect to pH of the thermolysin solution obtained in Experiment 1. It is a graph which shows the relationship of the stability (residual activity) with respect to pH of the thermolysin solution obtained in Experiment 2. It is a graph which shows the relationship of the stability (residual activity) with respect to pH of various concentrations of thermolysin solution obtained in Test Example 3. The HPLC chromatogram of the thermolysin solution of each pH obtained in Experiment 4 is shown.
  • thermolysin solution The present invention provides thermolysin solutions.
  • the thermolysin solution of the present invention contains thermolysin in water at a specific concentration, and is adjusted to a specific pH and stabilized.
  • Thermolysin is a heat-resistant neutral metalloproteinase and exhibits protease activity at an optimum temperature of 65 to 85 ° C. and an optimum pH of 5.0 to 8.5. During the protease activity of thermolysin, the N-terminus of the hydrophobic amino acid residue is specifically cleaved. Thermolysin has one zinc ion at the active site for enzyme activity expression and four calcium ions in the structure for structure maintenance. Thermolysin is classified under EC number 3.4.24.27 and is well known as registered under CAS Registry Number 9073-78-3.
  • thermolysin contained in the thermolysin solution of the present invention is not particularly limited as long as thermolysin having the above-mentioned protease activity can be produced.
  • thermolysin-derived bacteria include Bacillus thermoproteolyticus, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus amyloliquefaciens, and Bacillus subtilis. And Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, and similar bacteria thereof.
  • thermolysin contained in the thermolysin solution of the present invention is not particularly limited as long as it has the above-mentioned protease activity.
  • one or more amino acids in the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of obtaining more preferable stability at high pH described later Is a deleted, substituted, inserted or added amino acid sequence, and includes a protein having the above-mentioned protease activity, more preferably a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • thermolysin is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more, as long as it has the above-mentioned protease activity. It may be an amino acid sequence having the identity of
  • identity means an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm is one of the sequences for optimal alignment or It means the ratio (%) of identical amino acid residues to total overlapping amino acid residues in which the introduction of gaps in both can be considered.
  • thermolysin is, for example, 34000 to 38000, preferably 34300 to 37500.
  • the thermolysin solution includes thermolysin in addition to substantially undegraded thermolysin.
  • the thermolysin solution of the present invention effectively suppresses autolysis, the amount of thermolysin degradation products is suppressed.
  • the ratio of substantially unresolved thermolysin to total thermolysin is the amount detected by UV 280 nm by high performance liquid chromatography (chromatography The detection peak area in gram) is, for example, 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and still more preferably 90% or more.
  • the degradation product of thermolysin is allowed to include a degradation product having no such activity.
  • the protease activity of the thermolysin degradation product is not particularly limited as long as the activity is detected.
  • thermolysin solution of the present invention contains thermolysin (refers to the whole thermolysin, that is, the sum of substantially non-degraded thermolysin and thermolysin-degraded product) at a high concentration of 0.1 mg / mL or more.
  • the whole thermolysin is preferably 0.2 mg / mL or more, more preferably 0.4 mg / mL or more, still more preferably 0.8 mg / mL or more
  • it is 1.6 mg / mL or more, still more preferably 2.4 mg / mL or more, still more preferably 3.2 mg / mL or more.
  • the upper limit is not particularly limited, and may be a saturation concentration at the storage temperature of the thermolysin solution, but from the viewpoint of suppression of recrystallization of thermolysin, for example, 6.6 mg / mL or less, preferably 5.8 mg / mL or less More preferably, it is 5.0 mg / mL or less, More preferably, 4.2 mg / mL or less is mentioned.
  • thermolysin More specific concentrations of thermolysin are 0.1 to 6.6 mg / mL, 0.2 to 6.6 mg / mL, 0.4 to 6.6 mg / mL, 0.8 to 6.6 mg / mL, 1.6 to 6.6 mg / mL, 2.4 to 6.6 mg / mL, 3.2 to 6.6 mg / mL, 0.1 to 5.8 mg / mL, 0.2 to 5.8 mg / mL, 0.4 to 5.8 mg / mL, 0.8 to 5.8 mg / mL, 1.6 to 5.8 mg / mL, 2.4 to 5.8 mg / mL, 3.2 to 5.8 mg / mL, 0.1 to 5.0 mg / mL, 0.2 to 5.0 mg / mL, 0.4 to 5.0 mg / mL, 0.8 to 5.0 mg / mL, 1.6 to 5.0 mg / mL, 2.4 to 5.0 mg / mL,
  • the total concentration of thermolysin in the thermolysin solution of the present invention can also be derived from the protein amount of thermolysin solution and thermolysin purity.
  • the amount of protein can be measured by a known method. For example, it can be calculated using absorptiometry, BCA method, Biuret method or the like. Preferably, the BCA method is mentioned.
  • the overall purity of thermolysin can be derived from known measurement methods. For example, the purity of total thermolysin can be calculated from the sum of the ratio of the peak area of substantially unresolved thermolysin and thermolysin degradation product to the total peak area in the chromatography method.
  • thermolysin solution contains substantially no protein other than whole thermolysin
  • concentration of whole thermolysin in deriving the concentration of whole thermolysin, set the absorbance at 280 nm to 1.765 in water (pH 7.0) of 1 mg / mL whole thermolysin be able to.
  • thermolysin of the thermolysin solution is not particularly limited, but from the viewpoint of keeping stability and / or quality constant, the purity of UV 280 nm detection by high performance liquid chromatography is preferably 50% or more, more preferably 70% or more More preferably, it is 80% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more.
  • the thermolysin solution of the present invention has a pH adjusted to over 9.0.
  • pH is a value measured under a temperature condition of 25 ° C.
  • the thermolysin solution of the present invention is stabilized at a high pH range of pH 9.0 or more by being prepared at the high concentration described above.
  • the pH of the thermolysin solution is more than 9.0 and not more than 11.8, not less than 9.0 and not more than 11.5, not less than 9.0 and not more than 11.0, and not less than 9.5 and not more than 11 Or less), 9.5 to 11.5, 9.5 to 11.0, 10.0 to 11.8, 10.0 to 11.5, 10.0 to 11.0, 10.5 to 11 .8, 10.5-11.5, 10.5-11.0.
  • the pH is preferably 9.5 to 11.8, more preferably 9.5 to 11.5, still more preferably 10.0 to 11.5, still more preferably 10 And 5 to 11.0.
  • thermolysin solution of the present invention is adjusted to more than 9.0, whereby autolysis is suppressed more than at lower pH. Furthermore, at pH 9.5 or higher at which better stability can be obtained, the effect of suppressing autolysis is higher, and at pH 10.0 or higher at which even better stability can be obtained, almost no autolysis is observed.
  • thermolysin solution of the present invention may contain a salt.
  • Salts include buffer salts and salts other than buffer salts.
  • the buffer salt may be added during the production process of the thermolysin solution, for example, used to adjust the thermolysin solution to be adjusted to a predetermined pH in order to adjust the thermolysin concentration based on the absorbance. Can be mentioned. Thus, the buffer salt does not have to be buffering at the pH (above 9.0) of the thermolysin solution of the invention.
  • BES N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid
  • tris tris (hydroxymethyl) aminomethane), bis tris (bis (2-hydroxy) Ethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methane), bis trispropane (1,3-bis (tris (hydroxymethyl) methylamino) propane), HEPES (N- (2-hydroxyethyl) -piperazine-N'-2 -Ethanesulfonic acid), MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid), MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid), MOPSO (3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid), PIPES (PIPES) Piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid), TAPS (N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid), TES (N-
  • the salt other than the buffer salt is not particularly limited.
  • sodium chloride is preferably mentioned as a salt other than the buffer salt.
  • the content of sodium chloride in the thermolysin solution of the present invention is not particularly limited, but it is, for example, 0.01 mM to 1 M, preferably 1 mM to 1 M, more preferably 5 mM to 500 mM, from the viewpoint of obtaining better recrystallization suppression effect. And more preferably 10 mM to 400 mM.
  • calcium chloride is preferably mentioned as a salt other than the buffer salt from the viewpoint of improving the stability of thermolysin.
  • the content of calcium chloride in the thermolysin solution of the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint of obtaining the effect of improving the stability of thermolysin better, for example, 0.01 mM to 1 M, preferably 0.01 mM to 200 mM, more preferably 0.05 mM to 100 mM, more preferably 0.1 mM to 50 mM, more preferably 0.1 mM to 30 mM, still more preferably 0.1 mM to 20 mM, particularly preferably 0.1 to 10 mM.
  • thermolysin solution of the present invention since the thermolysin solution of the present invention has a high pH, it is stable without substantially containing a salt.
  • the thermolysin solution of the present invention may be substantially free of salts.
  • Salts that may not be substantially contained include salts other than buffer salts.
  • Salts other than buffer salts in this case include sodium chloride and calcium chloride as described above.
  • substantially free of salt means that the total concentration of the salt is, for example, 0.001 mM or less, preferably 0.0001 mM or less, more preferably 0.00001 mM or less, particularly preferably 0 mM.
  • thermolysin solution of the present invention may contain other components in addition to the components described above.
  • Other components include, for example, albumin as a stabilizer, maltose, sucrose, trehalose, glycerin and the like.
  • albumin as a stabilizer
  • maltose sucrose
  • trehalose sucrose
  • glycerin glycerin
  • One of these stabilizers may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • thermolysin solution of the present invention is preferably low in bacterial-derived byproducts such as endotoxin, particularly when used in the field of regenerative medicine.
  • the endotoxin amount measured by a known endotoxin test is, for example, 1 EU / mg or less, preferably 0.1 EU / mg or less, more preferably 0.01 EU / mg or less, still more preferably, detection limit It is preferable to be suppressed to 0.001 EU / mg or less that is.
  • thermolysin solution of the present invention is not particularly limited as long as its protease activity is utilized.
  • it may be used for analysis of the primary structure of a protein, may be used for dispersing tissue cells in the field of regenerative medicine, or may be used for food processing (eg, production of amino acid seasonings, peptides Production, improvement of physical properties of protein, improvement of taste of extract, reduction of allergen, etc.) may be used.
  • thermolysin solution can contain the thermolysin at a concentration of 0.1 mg / mL or more, and the pH can be adjusted to more than 9.0 to improve the stability of the thermolysin solution. Therefore, the present invention is further a method of improving the stability of thermolysin solution, comprising incorporating thermolysin into the thermolysin solution at a concentration of 0.1 mg / mL or more, and adjusting the pH to over 9.0. Provide a way to improve stability.
  • the components, amounts used, activities, uses of thermolysin solution, etc. used in the thermolysin solution in this method for improving stability are as described in the above-mentioned section “1. Thermolysin solution”.
  • thermolysin solution The method for producing the thermolysin solution of the present invention is not particularly limited.
  • the thermolysin which is a starting material used in the method of preparing the thermolysin solution of the present invention can be appropriately produced by the person skilled in the art from known organisms described in the above-mentioned "1-1.
  • Thermolysin by a known method.
  • the medium is heat-killed (eg, for about 30 minutes) and then cooled (eg, to about 55 ° C.) using a suitable medium (eg, liquefied starch, soybean meal, medium containing casein, etc.), and then the inoculum is ingested.
  • a suitable medium eg, liquefied starch, soybean meal, medium containing casein, etc.
  • thermolysin A method of production by aeration and agitation culture at 53 to 55 ° C. can be mentioned (specifically, the method described in Non-patent Document 1 can be referred to).
  • a method of expressing a thermolysin gene after transferring a vector incorporating a thermolysin gene cloned from the above-mentioned derived bacterium into Bacillus genus or E. coli using genetic recombination technology (for example, JP-A-3-232494). Can be referred to).
  • Geobacillus stearothermophilus-derived thermolysin it can be produced using a deposited strain such as Accession No. NBRC12550, No. NBRC12983, No. NBRC13737 or No. NBRC100862.
  • commercially available thermolysin for example, thermolysin provided by Amano Enzyme Inc. may be used as a starting material.
  • Thermolysin can, for example, be first suspended in an aqueous suspension solution and prepared as a thermolysin suspension.
  • Aqueous suspensions include water and buffers, preferably buffers.
  • the buffer can be appropriately selected by those skilled in the art according to the pH to be prepared of the thermolysin suspension, and examples thereof include aqueous solutions of the above-mentioned buffer salts.
  • the pH of the suspension is not particularly limited, but may be adjusted to, for example, the neutral region, specifically 7.0 to 8.0.
  • the amount of thermolysin in the suspension can be adjusted by measuring the absorbance and adjusting the liquid amount and / or the amount of thermolysin so as to obtain a predetermined absorbance.
  • the absorbance at 280 nm in water (pH 7.0) of 1 mg / mL whole thermolysin is set to 1.765, and the pH of the suspension is adjusted to 7.0 as described above.
  • the amount of thermolysin can be adjusted so as to obtain a predetermined absorbance giving the thermolysin concentration of the present invention described in “1-2.
  • thermolysin suspension is raised in pH with base and adjusted to pH> 9.0. Specifically, it is adjusted to the pH (preferably 10.0 to 11.5, more preferably 10.5 to 11.0) described in the above-mentioned "1-3. PH".
  • a base a strong base such as potassium hydroxide, sodium hydroxide and / or calcium hydroxide, and / or ammonia and the like can be used in the state of an aqueous solution.
  • the acid include inorganic acids such as hydrochloric acid and / or sulfuric acid, and / or organic acids such as acetic acid and / or formic acid. This gives a crude thermolysin solution with adjusted pH.
  • thermolysin is firstly added to a pH above 9.0, specifically to the pH described in the above-mentioned "1-3. PH" May be directly dissolved in a basic aqueous solution adjusted to 10.0 to 11.5, more preferably 10.5 to 11.0).
  • the basic aqueous solution include aqueous solutions of strong bases such as potassium hydroxide, sodium hydroxide and calcium hydroxide, and / or ammonia.
  • the acid include inorganic acids such as hydrochloric acid and / or sulfuric acid, and / or organic acids such as acetic acid and / or formic acid. This gives a crude thermolysin solution with adjusted pH.
  • thermolysin dry preparation and thermolysin dry preparation
  • the invention also provides a method of producing a thermolysin dry formulation.
  • the thermolysin dry preparation is produced by subjecting the above-mentioned thermolysin solution to a drying step.
  • the thermolysin solution of the present invention is stable in liquid form, but it can be dried directly from the high pH (over 9.0) liquid and has excellent activity when it is dissolved again in water at the time of use, even in the form of a dry preparation. It turned out that it was possible to play. That is, it was found that the thermolysin solution of the present invention was not adversely affected by the activity of thermolysin during the drying step.
  • thermolysin dry preparation is preferred to the liquid preparation in terms of transportation and storage, since the volume and weight are reduced.
  • form of the thermolysin dry preparation is not particularly limited, and examples thereof include forms such as powder, fine granules, granules, tablets and the like.
  • thermolysin dry formulation also provides a thermolysin dry formulation.
  • the thermolysin dry preparation of the present invention is obtained by drying the above-mentioned thermolysin solution.
  • the pH of the aqueous solution is more than 9.0; specifically, 9.0 to 11.8 or less, 9.0 to 11.5 or less, 9.0 to 11.0 or less, 9.5 to 11.8 (9.5 to 11.8 or less), 9.5 to 11 .5, 9.5 to 11.0, 10.0 to 11.8, 10.0 to 11.5, 10.0 to 11.0, 10.5 to 11.8, 10.5 to 11.5
  • it is 9.5 to 11.5, more preferably 10.0 to 11.5, and still more preferably 10.5 to 11.0.
  • the activity value of the thermolysin dry preparation of the present invention is not particularly limited because it varies depending on the salts and the like contained, but the activity value per unit mass is, for example, 100 PU / mg or more, preferably 500 PU / mg or more, more preferably 1000 PU / Mg or more, more preferably 2000 PU / mg or more, more preferably 3000 PU / mg or more.
  • the upper limit is not particularly limited, and examples thereof include 15000 PU / mg or less, preferably 12000 PU / mg or less, more preferably 10000 PU / mg or less, and still more preferably 8000 PU / mg or less.
  • thermolysin dry preparation Specific activity values per unit mass of the thermolysin dry preparation are 100 to 15000 PU / mg, 500 to 15000 PU / mg, 1000 to 15000 PU / mg, 2000 to 15000 PU / mg, 3000 to 15000 PU / mg, 100 to 12000 PU / mg, 500 to 12000 PU / mg, 1000 to 12000 PU / mg, 2000 to 12000 PU / mg, 3000 to 12000 PU / mg, 100 to 10000 PU / mg, 500 to 10000 PU / mg, 1000 to 10000 PU / mg, 2000 to 10000 PU / mg, 3000 to 10000 PU / mg, 100 to 8000 PU / mg, 500 to 8000 PU / mg, 1000 to 8000 PU / mg, 2000 to 8000 PU / mg, 3000 to .
  • the activity value can be measured by the casein degradation method.
  • casein In the casein decomposition method, casein is used as a substrate and the hydrolysis reaction is performed at pH 7.5 at 35 ° C., and the non-proteinaceous substance generated is measured by the Folin color method, and a non-proteinaceous substance corresponding to 1 ⁇ g of tyrosine per minute
  • the amount of enzyme that liberates is calculated as 1 PU (Protease Unit). Since the thermolysin dry preparation of the present invention is obtained from a thermolysin solution which is not adversely affected by thermolysin activity in the drying step, it exhibits excellent activity even after being dissolved in water.
  • thermolysin solutions of pH 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0 were obtained. Since the obtained thermolysin solution contained substantially no protein other than thermolysin, the thermolysin concentration was determined from the absorbance at 280 nm to be 3.7 mg / mL. 4. The stability was examined by allowing the thermolysin solution at each pH to stand at 25 ° C. for 7 hours under a controlled pH environment. 5. The activity of the thermolysin solution at each pH after standing was measured using the casein degradation method. In addition, the activity of the thermolysin solution at each pH after standing is derived from the obtained activity value as a relative value with 100% of the activity value before standing measured in advance and the relative value being the remaining value. It was derived as activity (%).
  • casein decomposition method casein is used as a substrate and the hydrolysis reaction is performed at pH 7.5 and 35 ° C., and the nonproteinaceous substance produced is measured by the Folin coloration method, and the nonprotein equivalent to 1 ⁇ g of tyrosine per minute.
  • the amount of enzyme releasing the sex substance was calculated as 1 PU (Protease Unit).
  • thermolysin solution having a pH of 7.0, 8.0, or 9.0 the activity decreased as the pH increased.
  • thermolysin solution having a pH of 10.0 and 11.0 a remarkable improvement in stability was observed.
  • thermolysin solution of pH 11.0 which has higher pH, had higher stability.
  • thermolysin liquid agent of pH 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5 was obtained. Since the obtained thermolysin solution contained substantially no protein other than thermolysin, the thermolysin concentration was determined from the absorbance at 280 nm to be 3.7 mg / mL. 4. The stability was examined by allowing the thermolysin solution at each pH to stand at 25 ° C. for 3 hours under the adjusted pH environment. 5. The activity of the thermolysin solution at each pH after standing was measured using the casein degradation method. In addition, the activity of the thermolysin solution at each pH after standing is derived from the obtained activity value as a relative value with 100% of the activity value before standing measured in advance and the relative value being the remaining value. It was derived as activity (%).
  • thermolysin solution having a pH of 9.5, 10.0, 10.5, 11.0 as in FIG. 1 of Test Example 1, the tendency that the higher the pH, the better the stability was observed. Also, thermolysin solution having a pH of 11.5 had high stability. On the other hand, the thermolysin solution having a pH of 12.0 or 12.5 did not have stability.
  • thermolysin solution at pH 9.5, 11.5. Since the obtained thermolysin solution substantially does not contain any protein other than thermolysin, the thermolysin concentration was determined from the absorbance at 280 nm, and as a result, 0.1 mg / mL, 0.4 mg / mL, 1.6 mg / mL, and 3.7 mg / mL, respectively. mL, it was 5.0 mg / mL. 4. The stability of each thermolysin concentration and each pH was examined by allowing the thermolysin solution at each pH to stand at 25 ° C. for 7 hours under the adjusted pH environment. 5. The activity of each thermolysin solution after standing was measured using a casein degradation method. The activity of each thermolysin solution after standing is derived from the obtained activity value as a relative value with 100% being the activity value before standing measured in advance and the relative value being the remaining activity ( Derived as%).
  • thermolysin solution obtained in Test Example 1 was subjected to HPLC under the following conditions to measure the degree of autolysis.
  • HPLC conditions> Column: YMC-triart C18 (150 ⁇ 4.6 mm) (YMC Corporation) A buffer: 0.1% trifluoroacetic acid in ultrapure water B buffer: 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile gradient conditions (B buffer ratio to A buffer): 0-60% (0-20 minutes), 100% (20-25 minutes)
  • Flow rate 1 mL / min
  • Detector Ultraviolet Spectrophotometer (280 nm)
  • thermolysin The results are shown in FIG. In FIG. 4, the peak at 13 to 14 minutes is substantially unresolved thermolysin, and the peak at 12 to 13 minutes is a degraded thermolysin. Amount of each of substantially non-degraded thermolysin and thermolysin-degraded product to total thermolysin (that is, the sum of substantially non-degraded thermolysin and thermolysin-degraded product) is detected in UV 280 nm (detection in chromatogram) The results derived based on the peak area) are shown in Table 1. From these results, by setting the pH of the thermolysin solution to more than 9.0, it was possible to make the proportion of substantially undigested thermolysin 79% or more. That is, the autolysis of thermolysin could be effectively suppressed.
  • thermolysin solutions of pH 8.0, 9.0, 10.0 and 11.0 were obtained. 4.
  • the thermolysin solution was subjected to microfiltration to remove insolubles. 5.
  • the activity of the resulting thermolysin solution was measured using a casein degradation method. 6.
  • the thermolysin solution was lyophilized to obtain a thermolysin dry formulation. 7.
  • the activity of the obtained thermolysin dry preparation was measured using a casein degradation method. The said measurement was performed with respect to the thermolysin aqueous solution which dissolved the thermolysin dry formulation so that it might become 2.5 w / v% concentration in water.
  • thermolysin aqueous solution was 10, 9, and 8, respectively.
  • the obtained activity value was calculated as a relative value based on 100% of the activity value of the thermolysin solution, and the relative value was derived as the remaining activity (%).
  • thermolysin dry formulation good activity was obtained when it was redissolved in water. Therefore, it has been confirmed that even when the thermolysin solution of the present invention is once dried and made into a thermolysin dry preparation, good activity can be obtained when it is dissolved again in water thereafter.

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Abstract

安定性をより向上させたサーモリシン液剤を提供する。サーモリシンを、０．１ｍｇ／ｍＬ以上となる濃度で含み、且つｐＨが９．０超、好ましくは、ｐＨが９．５～１１．５に調整されているサーモリシン液剤とすることで、安定性をより向上させることができる。

Description

サーモリシン液剤
　本発明は、サーモリシン液剤に関する。より具体的には、本発明は、安定性が向上したサーモリシン液剤に関する。
　サーモリシンは、例えば高温細菌の一種Geobacillus stearothermophilus(Former: Bacillus stearothermophilus)由来のエンド型プロテアーゼ （EC 3.4.24.27）として知られている。サーモリシンは、金属プロテアーゼに分類され、タンパク質を基質とした加水分解反応を触媒する。サーモリシンは、優れた熱耐性を有しており、特にカルシウム塩存在下において８０℃近くの高温でも活性を発揮する。
　サーモリシンは、ｐＨ５．０～８．０、又はｐＨ６．０～９．０で安定であることが広く知られており（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）、ｐＨ６．０～９．０より高ｐＨ側では顕著に安定性が低下することも広く知られている（例えば、非特許文献１参照）。このため、サーモリシンを含む液体の調製においては、安定性を得るために通常ｐＨ５．０～９．０で調製される。
　例えば、特許文献１には、サーモリシンを含む液のｐＨを１０．５以上に調整して結晶を溶解させた後、そこから終濃度で１５～３０％となる塩類を共存させてｐＨを５～８、好ましくは６～７、具体的には６．０まで下げて、サーモリシンの液状製品を製造することが開示されている。また、特許文献２には、ｐＨ４．５～９の範囲にｐＨを維持しうるバッファ塩の存在下、サーモリシンを、特定の塩と共存させることで安定化させることが開示されている。
特開平6-46844号公報 特開2010-051314号公報
発酵工学雑誌、第４０巻、第７号、ｐ．３４６－３５３、１９６２年、Ｆｉｇ．８
　上述のように、サーモリシンはｐＨ５．０～９．０で安定であるということが一般的な技術常識である。このため、サーモリシンを含む液体を安定な状態で得るためには、そのようなｐＨ５．０～９．０で調製することが大前提となっていた。特許文献１及び２に開示されるように、サーモリシンを含む液体を安定なものとして得るため、製造工程の検討や、塩の条件の検討がなされるものの、最終物であるサーモリシンを含む液体のｐＨは、やはり５．０～９．０の範疇で調整されている。しかしながらこれらの技術では製造上及び組成上の制限事項が多く、工業的製造には適さない。
　そのうえ、サーモリシンは、ｐＨ５．０～９．０の溶液中で自己消化を起こす問題もある。仮に当該自己消化の問題を回避しようとしても、サーモリシンがｐＨ５．０～９．０で安定化するという技術常識上の拘束が極めて強く、サーモリシンを含む液体の安定性は依然としてｐＨ５．０～９．０で検討されるほかにない状況であった。つまり、当業者にとって、サーモリシンを含む液体のより高ｐＨにおける安定性については検討の余地がなかった。
　そこで本発明の目的は、安定性をより向上させたサーモリシン液剤を提供することにある。
　本発明者は、高濃度のサーモリシンを含む液体の安定性の検討にあたり、これまで当業者にとって検討の余地がなかったｐＨに着目した。その結果、驚くべきことに、所定の高濃度のサーモリシンを含む液体であれば、これまで安定とされてきたｐＨよりも高いｐＨに調整することで安定性が向上することを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成された。
　本発明は以下の発明を含む。
項１．　サーモリシンを、０．１ｍｇ／ｍＬ以上となる濃度で含み、且つｐＨが９．０超に調整されている、サーモリシン液剤。
項２．　ｐＨが９．５～１１．５である、項１に記載のサーモリシン液剤。
項３．　塩化ナトリウムを０．０１ｍＭ～１Ｍの濃度で含む、項１又は２に記載のサーモリシン液剤。
項４．　塩化カルシウムを０．０１ｍＭ～１Ｍの濃度で含む、項１～３のいずれかに記載のサーモリシン液剤。
項５．　緩衝塩以外の塩を実質的に含まない、項１又は２に記載のサーモリシン液剤。
項６．　項１～５のいずれかに記載のサーモリシン液剤を乾燥させる工程を含む、サーモリシン粉末剤の製造方法。
項７．　２．５w/v％濃度になるように水に溶解させた場合のｐＨが９．０超である、サーモリシン乾燥製剤。
項８．　サーモリシン液剤の安定性向上方法であって、サーモリシン液剤に、サーモリシンを０．１ｍｇ／ｍＬ以上となる濃度で含有させ、且つ、ｐＨを９．０超に調整する、安定性向上方法。
　本発明によれば、安定性をより向上させたサーモリシン液剤が提供される。
試験例１において得られた、サーモリシン液剤のｐＨに対する安定性（残存活性）の関係を示すグラフである。 試験例２において得られた、サーモリシン液剤のｐＨに対する安定性（残存活性）の関係を示すグラフである。 試験例３において得られた、各種濃度のサーモリシン液剤のｐＨに対する安定性（残存活性）の関係を示すグラフである。 試験例４において得られた、各ｐＨのサーモリシン液剤のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
［１．サーモリシン液剤]
　本発明は、サーモリシン液剤を提供する。本発明のサーモリシン液剤は、サーモリシンを特定濃度で水中に含み、且つ、特定ｐＨに調整されて安定化されたものである。
［１－１．サーモリシン］
　サーモリシンは、耐熱性の中性メタロプロテイナーゼであり、至適温度６５～８５℃、至適ｐＨ５．０～８．５でプロテアーゼ活性作用を示す。サーモリシンのプロテアーゼ活性作用時においては、疎水性アミノ酸残基のＮ末端を特異的に切断する。サーモリシンは、活性部位に酵素活性発現のための１個の亜鉛イオンと、構造内に構造維持のための４個のカルシウムイオンとを有する。サーモリシンは、ＥＣ番号３．４．２４．２７に分類され、ＣＡＳ登録番号９０７３－７８－３として登録されているものがよく知られている。
　本発明のサーモリシン液剤に含まれるサーモリシンの由来については、上述のプロテアーゼ活性を有するサーモリシンを産生可能である限り特に限定されない。サーモリシンの由来菌としては、たとえば、バチルス・サーモプロテオリティカス（Bacillus thermoproteolyticus）、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtills）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）及びそれらの類似菌等が挙げられる。
　本発明のサーモリシン液剤に含まれるサーモリシンのアミノ酸配列は、上述のプロテアーゼ活性を有する限り特に限定されない。後述の高ｐＨでの安定性をより好ましく得る観点から、好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、上述のプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられ、より好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、上述のプロテアーゼ活性を有する限り、サーモリシンのアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってよい。なお、同一性とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する、同一アミノ酸残基の割合（％）を意味する。
　サーモリシンの分子量としては、たとえば３４０００～３８０００、好ましくは３４３００～３７５００が挙げられる。
　本発明において、サーモリシン液剤には、実質的に分解されていないサーモリシンに加え、サーモリシンの分解物も含む。しかしながら、本発明のサーモリシン液剤は自己消化が効果的に抑制されているため、サーモリシンの分解物の量が抑えられている。具体的には、サーモリシン全体（実質的に分解されていないサーモリシンとサーモリシンの分解物との和）に対する実質的に分解されていないサーモリシンの割合は、高速液体クロマトグラフィーによるＵＶ２８０ｎｍでの検出量（クロマトグラムにおける検出ピーク面積）として、例えば７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、一層好ましくは９０％以上である。なお、サーモリシンの分解物には、上述のプロテアーゼ活性を有する分解物に加え、当該活性を有さない分解物が含まれることを許容する。サーモリシンの分解物のプロテアーゼ活性については活性が検出されていれば特に限定されるものではない。
［１－２．サーモリシン濃度］
　本発明のサーモリシン液剤は、サーモリシン（サーモリシン全体をいう。つまり実質的に分解されていないサーモリシンとサーモリシン分解物との和をいう。）を、０．１ｍｇ／ｍＬ以上となる高濃度で含む。サーモリシン液剤の高ｐＨでの安定性をより好ましく得る観点から、サーモリシン全体は、好ましくは０．２ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．４ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは０．８ｍｇ／ｍＬ以上、一層好ましくは１．６ｍｇ／ｍＬ以上、より一層好ましくは２．４ｍｇ／ｍＬ以上、更に一層好ましくは３．２ｍｇ／ｍＬ以上が挙げられる。また上限としては特に限定されず、サーモリシン液剤の保存温度における飽和濃度であってもよいが、サーモリシンの再結晶化抑制の観点から、例えば６．６ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは５．８ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５．０ｍｇ／ｍＬ以下、更に好ましくは４．２ｍｇ／ｍＬ以下が挙げられる。より具体的なサーモリシンの濃度としては、０．１～６．６ｍｇ／ｍＬ、０．２～６．６ｍｇ／ｍＬ、０．４～６．６ｍｇ／ｍＬ、０．８～６．６ｍｇ／ｍＬ、１．６～６．６ｍｇ／ｍＬ、２．４～６．６ｍｇ／ｍＬ、３．２～６．６ｍｇ／ｍＬ、０．１～５．８ｍｇ／ｍＬ、０．２～５．８ｍｇ／ｍＬ、０．４～５．８ｍｇ／ｍＬ、０．８～５．８ｍｇ／ｍＬ、１．６～５．８ｍｇ／ｍＬ、２．４～５．８ｍｇ／ｍＬ、３．２～５．８ｍｇ／ｍＬ、０．１～５．０ｍｇ／ｍＬ、０．２～５．０ｍｇ／ｍＬ、０．４～５．０ｍｇ／ｍＬ、０．８～５．０ｍｇ／ｍＬ、１．６～５．０ｍｇ／ｍＬ、２．４～５．０ｍｇ／ｍＬ、３．２～５．０ｍｇ／ｍＬ、０．１～４．２ｍｇ／ｍＬ、０．２～４．２ｍｇ／ｍＬ、０．４～４．２ｍｇ／ｍＬ、０．８～４．２ｍｇ／ｍＬ、１．６～４．２ｍｇ／ｍＬ、２．４～４．２ｍｇ／ｍＬ、３．２～４．２ｍｇ／ｍＬが挙げられる。
　本発明のサーモリシン液剤におけるサーモリシン全体の濃度は、サーモリシン液剤のタンパク質量とサーモリシン純度とから導出することもできる。タンパク質量は公知の方法にて測定することができる。例えば、吸光光度法、BCA法、Biuret法等を用いて算出することができる。好ましくはBCA法が挙げられる。サーモリシン全体の純度は、公知の測定方法から導出することができる。例えば、サーモリシン全体の純度は、クロマトグラフィー法において、クロマトグラムにおける全ピーク面積に対する実質的に分解されていないサーモリシン及びサーモリシン分解物のピーク面積の割合の和から算定する方法が挙げられる。例えば、試験例４に記載の方法が挙げられるが、夾雑するタンパク質に応じて当業者であれば適宜使用するカラムや分離条件を設定できる。サーモリシン液剤が実質的にサーモリシン全体以外のタンパク質を含まない場合、サーモリシン全体の濃度の導出においては、１ｍｇ／ｍＬのサーモリシン全体の水中（ｐＨ７．０）での２８０ｎｍにおける吸光度を１．７６５と設定することができる。サーモリシン液剤のサーモリシン全体の純度は特に限定されないが、安定性及び／又は品質を一定に保つ観点から、高速液体クロマトグラフィーによるＵＶ２８０ｎｍ検出の純度として、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、より一層好ましくは９０％以上、更に一層好ましくは９５％以上が挙げられる。
［１－３．ｐＨ］
　本発明のサーモリシン液剤は、ｐＨが９．０超に調整されたものである。本発明においてｐＨは、２５℃の温度条件下で測定される値である。本発明のサーモリシン液剤は、上述の高濃度で調製されることによりｐＨ９．０超という高ｐＨ領域で安定化する。具体的なサーモリシン液剤のｐＨとしては、９．０超１１．８以下、９．０超１１．５以下、９．０超１１．０以下、９．５～１１．８（９．５以上１１．８以下）、９．５～１１．５、９．５～１１．０、１０．０～１１．８、１０．０～１１．５、１０．０～１１．０、１０．５～１１．８、１０．５～１１．５、１０．５～１１．０が挙げられる。サーモリシン液剤の安定性をより良好に得る観点から、好ましいｐＨとして９．５～１１．８、より好ましくは９．５～１１．５、更に好ましくは１０．０～１１．５、一層好ましくは１０．５～１１．０が挙げられる。
　本発明のサーモリシン液剤は、ｐＨが９．０超に調整されることで、それより低いｐＨにおける場合よりも自己消化が抑制される。さらに、より良好な安定性が得られるｐＨ９．５以上では自己消化の抑制効果がより高く、より一層良好な安定性が得られるｐＨ１０．０以上では、殆ど自己消化が認められなくなる。
［１－４．塩］
　本発明のサーモリシン液剤には、塩を含んでよい。塩としては、緩衝塩、及び緩衝塩以外の塩が挙げられる。
　緩衝塩としては、サーモリシン液剤の製造過程において加えられ得るものであって、例えば、吸光度に基づくサーモリシン濃度を調整するために、濃度調整すべきサーモリシン液を所定ｐＨに調整する目的で用いられたものが挙げられる。したがって、緩衝塩は、本発明のサーモリシン液のｐＨ（９．０超）で緩衝作用を示すものである必要はない。具体的には、緩衝塩としては、BES（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）、トリス（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン）、ビストリス（ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ-トリス(ヒドロキシメチル)メタン）、ビストリスプロパン（1,3-ビス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)プロパン）、HEPES（N-(2-ヒドロキシエチル)-ピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸）、MES（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、MOPS（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、MOPSO（3-モルホリノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、PIPES（ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)）、TAPS（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸）、TES（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸）、TEA（トリエタノールアミン）およびトリシン（N-(2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル)グリシン）、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。
　緩衝塩以外の塩としては特に限定されない。例えば、サーモリシンの再結晶化抑制の観点から、緩衝塩以外の塩として塩化ナトリウムが好ましく挙げられる。本発明のサーモリシン液剤中の塩化ナトリウムの含有量は特に限定されないが、再結晶化抑制効果をより良好に得る観点から、例えば０．０１ｍＭ～１Ｍ、好ましくは１ｍＭ～１Ｍ、より好ましくは５ｍＭ～５００ｍＭ、更に好ましくは１０ｍＭ～４００ｍＭが挙げられる。また例えば、サーモリシンの安定性を向上させる観点から、緩衝塩以外の塩として塩化カルシウムが好ましく挙げられる。本発明のサーモリシン液剤中の塩化カルシウムの含有量は特に限定されないが、サーモリシンの安定性向上効果をより良好に得る観点から、例えば０．０１ｍＭ～１Ｍ、好ましくは０．０１ｍＭ～２００ｍＭ、より好ましくは０．０５ｍＭ～１００ｍＭ、更に好ましくは０．１ｍＭ～５０ｍＭ、一層好ましくは０．１ｍＭ～３０ｍＭ、より一層好ましくは０．１ｍＭ～２０ｍＭ、特に好ましくは０．１～１０ｍＭが挙げられる。
　一方、本発明のサーモリシン液剤は高ｐＨであるため、塩を実質的に含まなくとも安定である。従って、本発明のサーモリシン液剤は、塩を実質的に含まなくてもよい。実質的に含まなくてもよい塩としては、緩衝塩以外の塩が挙げられる。この場合における緩衝塩以外の塩としては、上述のとおり、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムが挙げられる。なお、塩を実質的に含まないとは、当該塩の濃度が総量で例えば０．００１ｍＭ以下、好ましくは０．０００１ｍＭ以下、より好ましくは０．００００１ｍＭ以下、特に好ましくは０ｍＭであることをいう。
［１－５．その他の成分］
　本発明のサーモリシン液剤には、上述の成分以外に、他の成分を含んでもよい。他の成分としては、例えば、安定化剤としてのアルブミン、マルトース、スクロース、トレハロース、グリセリンなどが挙げられる。これらの安定化剤は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　また、本発明のサーモリシン液剤は、特に再生医療分野で用いられる場合においては、エンドトキシンといったバクテリア由来の副次物が少ないことが好ましい。たとえば、公知のエンドトキシン試験（いわゆるリムルス法）によって測定されるエンドトキシン量が、例えば１ＥＵ／ｍｇ以下、好ましくは０．１ＥＵ／ｍｇ以下、より好ましくは０．０１ＥＵ／ｍｇ以下、さらに好ましくは、検出限界である０．００１ＥＵ／ｍｇ以下に抑えられていることが好ましい。
［１－６．用途］
　本発明のサーモリシン液剤の用途としては、そのプロテアーゼ活性を利用する限り特に限定されない。たとえば、タンパク質の一次構造の解析のために用いられてもよいし、再生医療分野における組織細胞の分散のために用いられてもよいし、食品加工（例えば、アミノ酸系調味料の製造、ペプチドの製造、蛋白質の物性改良、エキスの呈味性向上、低アレルゲン化など）のために用いられてもよい。
［２．サーモリシン液剤の安定性向上方法］
　上述のように、サーモリシン液剤において、サーモリシンを０．１ｍｇ／ｍＬ以上となる濃度で含有させ、且つ、ｐＨを９．０超に調整することで、サーモリシン液剤の安定性を向上させることができる。従って、本発明は、更に、サーモリシン液剤の安定性向上方法であって、サーモリシン液剤に、サーモリシンを０．１ｍｇ／ｍＬ以上となる濃度で含有させ、且つ、ｐＨを９．０超に調整する、安定性向上方法を提供する。この安定性向上方法において、サーモリシン液剤に使用する成分、使用量、活性、サーモリシン液剤の用途等については、上述の「１．サーモリシン液剤」の欄に示す通りである。
［３．サーモリシン液剤の製造方法］
　本発明のサーモリシン液剤の製造方法としては特に限定されない。本発明のサーモリシン液剤の調製方法に用いる出発原料のサーモリシンは、上述の「１－１．サーモリシン」に記載した由来生物から公知の方法で当業者によって適宜製造することができる。例えば、適当な培地（例えば、液化澱粉、大豆粕、カゼインを含む培地等）を用い、培地を加熱殺菌（例えば３０分程度）した後冷却（たとえば５５℃程度まで）した後、種菌を摂取し５３～５５℃で通気撹拌培養することによって製造する方法が挙げられる（具体的には、非特許文献１に記載の方法を参照することができる）。また、遺伝子組み換え技術を用い、上述の由来菌からクローニングしたサーモリシン遺伝子を組みこんだベクターをバチルス属又は大腸菌属に移入した後、サーモリシン遺伝子を発現させる方法も挙げられる（例えば、特開平３－２３２４９４号公報に記載の方法を参照することができる）。なお、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来サーモリシンを得る場合は、寄託番号No.NBRC12550、No.NBRC12983、No.NBRC13737又はNo.NBRC100862等の寄託菌株を用いて製造することができる。また、市販のサーモリシン（例えば、天野エンザイム株式会社が提供するサーモリシン）を出発原料に用いてもよい。
　サーモリシンは、例えば、まず水性の懸濁用液中に懸濁し、サーモリシン懸濁液として調製することができる。水性の懸濁用液としては、水及び緩衝液が挙げられ、好ましくは緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、サーモリシン懸濁液の調整すべきｐＨに応じて当業者が適宜選択することができ、例えば、上述した緩衝塩の水溶液が挙げられる。懸濁液のｐＨは特に限定されないが、たとえば中性領域、具体的には７．０～８．０に調整されていてよい。サーモリシン懸濁液は、吸光度を測定し、所定の吸光度となるように液量及び／又はサーモリシンの量を調整することで、懸濁液中のサーモリシン量を調整することができる。より具体的には、例えば、１ｍｇ／ｍＬのサーモリシン全体の水中（ｐＨ７．０）での２８０ｎｍにおける吸光度を１．７６５に設定し、懸濁液のｐＨを７．０に調整することによって、上述の「１－２．サーモリシン濃度」に記載の本発明のサーモリシン濃度を与える所定の吸光度となるようにサーモリシン量を調整することができる。
　サーモリシン懸濁液は、塩基を用いてｐＨが上昇させられ、ｐＨ９．０超に調整される。具体的には上述の「１－３．ｐＨ」に記載のｐＨ（好ましくは１０．０～１１．５、より好ましくは１０．５～１１．０）に調整される。塩基としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及び／又は水酸化カルシウムといった強塩基、並びに／若しくは、アンモニア等を水溶液状態で用いることができる。また、ｐＨの最終調整のために、適宜酸を組み合わせて用いてもよい。酸としては、塩酸及び／又は硫酸等の無機酸、並びに／若しくは、酢酸及び／又はギ酸等の有機酸が挙げられる。これによって、調整されたｐＨを有するサーモリシン粗精製液を得る。
　或いは、水性の懸濁用液中に懸濁した後にｐＨを上昇させる代わりに、サーモリシンを、まず、ｐＨ９．０超、具体的には上述の「１－３．ｐＨ」に記載のｐＨ（好ましくは１０．０～１１．５、より好ましくは１０．５～１１．０）に調整された塩基性水溶液に直接溶解してもよい。塩基性水溶液としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムといった強塩基、及び／又はアンモニア等の水溶液が挙げられる。また、塩基性水溶液のｐＨの最終調整のために、適宜酸を組み合わせて用いてもよい。酸としては、塩酸及び／又は硫酸等の無機酸、並びに／若しくは、酢酸及び／又はギ酸等の有機酸が挙げられる。これによって、調整されたｐＨを有するサーモリシン粗精製液を得る。
　上述の調整されたｐＨを有するサーモリシン粗精製液は、そのままサーモリシン液剤として得ることもできるが、必要に応じてろ過などにより不溶物や雑菌の除去を行う精製処理を行った後にサーモリシン液剤として得てもよい。ろ過のための具体的な方法としては特に限定されないが、例えば、精密ろ過及び限外ろ過が挙げられる。
［４．サーモリシン乾燥製剤の製造方法、及びサーモリシン乾燥製剤］
　本発明は、サーモリシン乾燥製剤の製造方法も提供する。本発明のサーモリシン乾燥製剤の製造方法では、上述のサーモリシン液剤を乾燥工程に供することによって、サーモリシン乾燥製剤を製造する。本発明のサーモリシン液剤は液状で安定であるが、当該高ｐＨ（９．０超）の液体から直接乾燥させて一旦乾燥製剤の態様としても、使用時に再び水中に溶解させた時に優れた活性を奏することができることが判明した。つまり、本発明のサーモリシン液剤が乾燥工程中に、サーモリシンの活性に悪影響を受けないことが判明した。乾燥の方法としては特に限定されず、例えば、凍結乾燥法、スプレードライ法、減圧濃縮乾燥法等が挙げられる。得られたサーモリシン乾燥製剤は、容積や重量が減るため、運搬や保管の面で液剤よりも好ましい。サーモリシン乾燥製剤の形態は特に限定されないが、例えば、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤などの形態が挙げられる。
　つまり、本発明は、サーモリシン乾燥製剤も提供する。本発明のサーモリシン乾燥製剤は、上述のサーモリシン液剤を乾燥させることで得られるものである。具体的には、本発明のサーモリシン乾燥製剤は、当該サーモリシン乾燥製剤を２．５w/v％となるように水に溶解させたときに、水溶液のｐＨが９．０超；具体的には、９．０超１１．８以下、９．０超１１．５以下、９．０超１１．０以下、９．５～１１．８（９．５以上１１．８以下）、９．５～１１．５、９．５～１１．０、１０．０～１１．８、１０．０～１１．５、１０．０～１１．０、１０．５～１１．８、１０．５～１１．５、１０．５～１１．０；好ましくは９．５～１１．５、より好ましくは１０．０～１１．５、更に好ましくは１０．５～１１．０となるものである。
　本発明のサーモリシン乾燥製剤の活性値は、含有する塩類などによって異なるため、特に限定されないが、単位質量当たりの活性値として、例えば１００ＰＵ／ｍｇ以上、好ましくは５００ＰＵ／ｍｇ以上、より好ましくは、１０００ＰＵ／ｍｇ以上、更に好ましくは２０００ＰＵ／ｍｇ以上、一層好ましくは３０００ＰＵ／ｍｇ以上が挙げられる。また上限としては特に限定されないが、例えば１５０００ＰＵ／ｍｇ以下、好ましくは１２０００ＰＵ／ｍｇ以下、より好ましくは１００００ＰＵ／ｍｇ以下、更に好ましくは８０００ＰＵ／ｍｇ以下が挙げられる。具体的なサーモリシン乾燥製剤の単位質量当たりの活性値としては、１００～１５０００ＰＵ／ｍｇ、５００～１５０００ＰＵ／ｍｇ、１０００～１５０００ＰＵ／ｍｇ、２０００～１５０００ＰＵ／ｍｇ、３０００～１５０００ＰＵ／ｍｇ、１００～１２０００ＰＵ／ｍｇ、５００～１２０００ＰＵ／ｍｇ、１０００～１２０００ＰＵ／ｍｇ、２０００～１２０００ＰＵ／ｍｇ、３０００～１２０００ＰＵ／ｍｇ、１００～１００００ＰＵ／ｍｇ、５００～１００００ＰＵ／ｍｇ、１０００～１００００ＰＵ／ｍｇ、２０００～１００００ＰＵ／ｍｇ、３０００～１００００ＰＵ／ｍｇ、１００～８０００ＰＵ／ｍｇ、５００～８０００ＰＵ／ｍｇ、１０００～８０００ＰＵ／ｍｇ、２０００～８０００ＰＵ／ｍｇ、３０００～が挙げられる。当該活性値は、カゼイン分解法により測定することができる。カゼイン分解法では、カゼインを基質に、ｐＨ７．５、３５℃で加水分解反応を行い、生成する非タンパク性物質をＦｏｌｉｎ呈色法で測定し、１分間にチロシン１μｇに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を１ＰＵ（Protease Unit)として算出する。本発明のサーモリシン乾燥製剤は、乾燥工程でサーモリシン活性に悪影響されないサーモリシン液剤から得られているため、水に溶解させた後も優れた活性を示す。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下において、波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ280）の測定には分光光度計（島津製作所製、型番UV-2500PC）を用いた。また、１ｍｇ／ｍＬのサーモリシンの水中（ｐＨ７．０）での２８０ｎｍにおける吸光度を１．７６５と設定した。
［試験例１］
　以下の方法でサーモリシン液剤を調製した。
１．　０．７ｇのサーモリシン（天野エンザイム株式会社）を、３０ｍＭ　ＨＥＰＥＳと９ｍＭ塩化カルシウムと３６０ｍＭ塩化ナトリウムとを含むｐＨ７．０の水溶液１００ｍＬに懸濁させた。
２．　得られた懸濁液を、Ａ280＝６．９となるように液量調整することでサーモリシン濃度を調整した。
３．　濃度調整したサーモリシン液を、２５℃環境下で、１Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１１．３に調整した後、１Ｎ　酢酸水溶液を用いてｐＨ７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０にそれぞれ調整した。これによって、ｐＨ７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０のサーモリシン液剤を得た。得られたサーモリシン液剤はサーモリシン以外のタンパク質を実質含まないため、２８０ｎｍの吸光度からサーモリシン濃度を求めた結果、３．７ｍｇ／ｍＬであった。
４．　各ｐＨのサーモリシン液剤を、調整したｐＨ環境下で２５℃で７時間静置することで安定性を調べた。
５．　静置後の各ｐＨのサーモリシン液剤の活性を、カゼイン分解法を用いて測定した。なお、静置後の各ｐＨのサーモリシン液剤の活性は、得られた活性値を、予め測定しておいた静置前の活性値を１００％とする相対値で導出し、当該相対値を残存活性（％）として導出した。
　なお、カゼイン分解法では、カゼインを基質に、ｐＨ７．５、３５℃で加水分解反応を行い、生成する非タンパク性物質をＦｏｌｉｎ呈色法で測定し、１分間にチロシン１μｇに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を１ＰＵ（Protease Unit)として算出した。
　結果を図１に示す。ｐＨが７．０、８．０、９．０のサーモリシン液剤では、ｐＨが上がるにつれて活性が下がった。これに対し、ｐＨが１０．０、１１．０のサーモリシン液剤では、顕著な安定性の向上が認められた。この中でも、より高ｐＨであるｐＨ１１．０のサーモリシン液剤がより高い安定性を備えていた。
［試験例２］
　以下の方法でサーモリシン液剤を調製した。
１．　０．７ｇのサーモリシン（天野エンザイム株式会社）を、３０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬに懸濁した。
２．　得られた懸濁液を、Ａ280＝６．９となるように液量調整することでサーモリシン濃度を調整した。
３．　濃度調整したサーモリシン液を、２５℃環境下で、１Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１１．３に調整した後、１Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液又は１Ｎ　酢酸水溶液を用いて、ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５にそれぞれ調整した。これによって、ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５のサーモリシン液剤を得た。得られたサーモリシン液剤はサーモリシン以外のタンパク質を実質含まないため、２８０ｎｍの吸光度からサーモリシン濃度を求めた結果、３．７ｍｇ／ｍＬであった。
４．　各ｐＨのサーモリシン液剤を、調整したｐＨ環境下で２５℃で３時間静置することで安定性を調べた。
５．　静置後の各ｐＨのサーモリシン液剤の活性を、カゼイン分解法を用いて測定した。なお、静置後の各ｐＨのサーモリシン液剤の活性は、得られた活性値を、予め測定しておいた静置前の活性値を１００％とする相対値で導出し、当該相対値を残存活性（％）として導出した。
　結果を図２に示す。ｐＨが９．５、１０．０、１０．５、１１．０のサーモリシン液剤では、試験例１の図１と同様に、高ｐＨほど安定性が向上する傾向が認められた。また、ｐＨ１１．５のサーモリシン液剤でも、高い安定性を備えていた。一方、ｐＨ１２．０、１２．５のサーモリシン液剤では、安定性は備わっていなかった。
［試験例３］
　以下の方法でサーモリシン液剤を調製した。
１．　０．０２ｇ～１．０ｇのサーモリシン（天野エンザイム株式会社）を、３０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬに懸濁した。
２．　得られた懸濁液を、Ａ280＝０．２、０．８、３．０、６．９、９．３となるように液量調整することでサーモリシン濃度を調整した。
３．　濃度調整したサーモリシン液を、２５℃環境下で、１Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１１．３に調整した後、１Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液又は１Ｎ　酢酸水溶液を用いて、ｐＨ９．５、１１．５にそれぞれ調整した。これによって、ｐＨ９．５、１１．５のサーモリシン液剤を得た。得られたサーモリシン液剤はサーモリシン以外のタンパク質を実質含まないため、２８０ｎｍの吸光度からサーモリシン濃度を求めた結果、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、３．７ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬであった。
４．　各サーモリシン濃度、各ｐＨのサーモリシン液剤を、調整したｐＨ環境下で２５℃で７時間静置することで安定性を調べた。
５．　静置後の各サーモリシン液剤の活性を、カゼイン分解法を用いて測定した。なお、静置後の各サーモリシン液剤の活性は、得られた活性値を、予め測定しておいた静置前の活性値を１００％とする相対値で導出し、当該相対値を残存活性（％）として導出した。
　結果を図３に示す。サーモリシン濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、３．７ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬのいずれの場合でも、ｐＨが９．５、１１．５で、試験例２の図２と同様に、高い安定性を備えていた。
［試験例４］
　試験例１で得られた各サーモリシン液剤について、以下の条件でＨＰＬＣに供し、自己消化の程度を測定した。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム: ＹＭＣ－ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８ (１５０×４．６ｍｍ) （株式会社ＹＭＣ）
Ａバッファー:０．１％ トリフルオロ酢酸ｉｎ超純水
Ｂバッファー:０．１％ トリフルオロ酢酸ｉｎアセトニトリル
グラジエント条件（Ａバッファーに対するＢバッファー比率）: ０－６０％ (０－２０分)、１００％ (２０－２５分)
流速: １ｍＬ/ｍｉｎ
検出器：紫外吸光光度計（２８０ｎｍ）
　結果を図４に示す。図４において、１３～１４分にあるピークが実質的に分解されていないサーモリシンで、１２～１３分にあるピークがサーモリシンの分解物である。実質的に分解されていないサーモリシン及びサーモリシン分解物それぞれの、サーモリシン全体（つまり、実質的に分解されていないサーモリシンとサーモリシン分解物との和）に対する割合を、ＵＶ２８０ｎｍでの検出量（クロマトグラムにおける検出ピーク面積）に基づいて導出した結果を表１に示す。これらの結果から、サーモリシン液剤のｐＨを９．０超にすることで、実質的に分解されていないサーモリシンの割合を７９％以上にすることができた。つまり、サーモリシンの自己消化を効果的に抑制することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［試験例５］
　以下の方法でサーモリシン乾燥製剤を調製した。
１．　０．７ｇのサーモリシン（天野エンザイム株式会社）を、３０ｍＭ　ＨＥＰＥＳと９ｍＭ塩化カルシウムと３６０ｍＭ塩化ナトリウムとを含むｐＨ７．０の水溶液１００ｍＬに懸濁させた。
２．　得られた懸濁液を、Ａ280＝６．９となるように液量調整することでサーモリシン濃度を調整した。
３．　濃度調整したサーモリシン液を、２５℃環境下で、１Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１１．３に調整した後、１Ｎ　酢酸水溶液を用いてｐＨ８．０、９．０、１０．０、１１．０にそれぞれ調整した。これによって、ｐＨ８．０、９．０、１０．０、１１．０のサーモリシン液剤を得た。
４．　サーモリシン液を精密ろ過に供して不溶物を除去した。
５．　得られたサーモリシン液剤の活性を、カゼイン分解法を用いて測定した。
６．　サーモリシン液剤を凍結乾燥させ、サーモリシン乾燥製剤を得た。
７．　得られたサーモリシン乾燥製剤の活性を、カゼイン分解法を用いて測定した。当該測定は、サーモリシン乾燥製剤を２．５w/v％濃度となるように水に溶解させたサーモリシン水溶液に対して行った。（なお、ｐＨ１１のサーモリシン液剤から得られた乾燥製剤を上述の濃度で水に溶解させると、サーモリシン水溶液のｐＨは１１となった。同様に、ｐＨ１０、９、及び８それぞれのサーモリシン液剤から得られた乾燥製剤を上述の濃度で水に溶解させると、サーモリシン水溶液のｐＨはそれぞれ１０、９、及び８となった。）
得られた活性値を、サーモリシン液剤の活性値を１００％とする相対値で算出し、当該相対値を残存活性（％）として導出した。
　結果を表２に示す。このように、いずれのサーモリシン乾燥製剤についても、再び水中に溶解させた場合に良好な活性が得られた。したがって、本発明のサーモリシン液剤を一旦乾燥させてサーモリシン乾燥製剤としても、その後再び水中に溶解させた場合に良好な活性が得られることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (8)

  1. 　サーモリシンを、０．１ｍｇ／ｍL以上となる濃度で含み、且つｐＨが９．０超に調整されている、サーモリシン液剤。
  2. 　ｐＨが９．５～１１.５である、請求項１に記載のサーモリシン液剤。
  3. 　塩化ナトリウムを０．０１ｍＭ～１Ｍの濃度で含む、請求項１又は２に記載のサーモリシン液剤。
  4. 　塩化カルシウムを０．０１ｍＭ～１Ｍの濃度で含む、請求項１～３のいずれかに記載のサーモリシン液剤。
  5. 　緩衝塩以外の塩を実質的に含まない、請求項１又は２に記載のサーモリシン液剤。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載のサーモリシン液剤を乾燥させる工程を含む、サーモリシン乾燥製剤の製造方法。
  7. 　２．５w/v％濃度になるように水に溶解させた場合のｐＨが９．０超である、サーモリシン乾燥製剤。
  8. 　サーモリシン液剤の安定性向上方法であって、サーモリシン液剤に、サーモリシンを０．１ｍｇ／ｍＬ以上となる濃度で含有させ、且つ、ｐＨを９．０超に調整する、安定性向上方法。
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