SI21617A - Krajši fragment 6-fosfofrukto-1-kinaze - Google Patents

Abstract

Izum se nanaša na krajši fragment 6-fosfofrukto-1-kinaze (PFK1) z molsko maso od 49 kDa do 55 kDa, ki ni pomembno inhibiran s citronsko kislino in/ali soljo te kisline in je lahko posttranslacijsko modificiran. Aktivnost 49-52 kDa fragmenta, ki nastane po posttranslacijski modifikaciji glivinega encima ima ohranjene pozitivne regulatorne lastnosti, tako da se aktivira ob prisotnosti specifičnih aktivatorjev, ni pa več občutljiv na inhibicijo s citronsko kislino kot pomembno substanco, ki pri višjih organizmih deluje kot inhibitor povratne zveze. Izum se nanaša tudi na postopek, ki vključuje vnos gena, ki kodira krajši fragment, v evkarionstske celice, z namenom, da pride do povečanega pretoka metabolizma preko glikoze ter povečano sintezo primarnih in sekundarnih metabolitov. Izum se nanaša tudi na uporabo krajšega fragmenta v biotehnoloških postopkih pridobivanja primarnih in sekundarnih metabolitov.ŕ

Description

KRAJŠI FRAGMENT 6-FOSFOFRUKTO-l-KINAZE

Predmet izuma je krajši fragment 6-fosfofrukto-l-kinaze (PFK1) z molsko maso od 49 do 55 kDa, ki ni pomembno inhibiran s citronsko kislino, ter uporaba krajšega fragmenta za povečanje hitrosti sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov.

Izum spada na področje mikrobne biotehnologije in biokemije.

Pri biotehnoloških procesih ima odločilni vpliv za končno ceno produkta hitrost sinteze produkta. Pri izboljšavah procesov tako vedno stremijo za optimizacijo tako mikroorganizma, kot pogojev gojenja, kjer bi se v čim krajšem času predelalo čim več substrata v končni produkt.

Pri industrijskih mikroorganizmih, ki so sposobni izločati določene biotehnološke produkte s povečano produktivnostjo in visokimi dobitki, so izrednega pomena anaplerotske reakcije, ki vodijo do povečane koncentracije intermediatov cikla trikarboksilnih kislin. Citronski cikel ali cikel trikarboksilnih kislin predstavlja osrednje mesto metabolizma, kamor se steka večina produktov oksidacije ogljikovih hidratov, maščobnih kislin in amino kislin, iz njega pa izvira tudi cela vrsta prekurzorjev za različne biosintetske poti. Cikel tako predstavlja kritično povezavo med katabolnimi in anabolnimi procesi v celici. Z dvigom nivoja intermediatov cikla trikarboksilnih kislin, s pospeševanjem t.i. anaplerotskih reakcij, povečamo sintezo ključnih celičnih gradbenih elementov, kot so na primer lipidi, amino kisline in porforini, s tem pa posredno tudi sintezo primarnih in sekundarnih metabolitov, ki imajo pogosto biotehnološko vrednost.

Več specifičnih metabolnih reakcij prištevamo k anaplerotskim reakcijam, vendar pa je neomejen pretok metabolitov preko glikolitične poti razgradnje glukoze najbolj pomemben. Pri tem igra pomembno vlogo encim 6-fosfofrukto-l-kinaza (PFK1), ki predstavlja ključno regulatomo točko. Pri evkariontskih organizmih je encim preko inhibicije povratne zveze reguliran s citratom, kar pomeni, da njegova aktivnost pade, ko se v celici prekomerno dvigne nivo citronske kisline, kot intermediata cikla trikarboksilnih kislin (Voet in Voet, 1995). Tako dejansko negativna regulacija encimske aktivnosti zmanjšuje učinkovitost anaplerotskih reakcij in s tem posredno hitrost sinteze končnih produktov. Izredno povečanje hitrosti tvorjenja bioproduktov bi dosegli, če bi imeli nemoten pretok preko glikolize, to pa bi bilo mogoče, če bi bil na voljo encim 6fosfofrukto-1-kinaza, ki bi ohranil pozitivne lastnosti regulacije, izgubil pa bi negativno regulacijo.

V preteklosti je bilo opisanih več primerov, ko so poskušali pospešiti metabolni pretok preko glikolize, s ciljem da bi povečali dobitke ali hitrost sinteze končnih produktov, vendar so se takšni projekti slabo končali. Da bi dvignili metabolni pretok preko glikolize so iz glive Aspergillus niger sistematično izolirali tri gene, ki kodirajo regulatome encime te poti, med drugim tudi gen za 6-fosfofrukto-l-kinazo (PFK1). Gene so vrnili v celice istega seva v povečanem številu kopij, s ciljem, da bi dobili večjo koncentracijo omenjenih encimov in posredno hitrejšo pretvorbo metabolitov preko glikolize, vendar natančna analiza transformant ni potrdila pričakovanih rezultatov. Pričakovana pospešitev metabolnega pretoka pridobljena z gensko manipulacijo je bila izničena s spremenjenimi regulatomimi mehanizmi (Ruijter et al., 1996). Pri istem mikroorganizmu so enak efekt želeli doseči z naključnimi mutacijami, kjer so želeli spremeniti PFK1 tako, da ne bi bila več občutljiva na inhibicijo s citratom. Uspeli so izolirati mutanto, kije dejansko imela nekoliko zmanjšano občutljivost na citat, vendar pa je encim pri nekoliko povečani koncentraciji inhibitorja (lOmM) deloval le z 20% maksimalne aktivnosti. Delno povečana odpornost na inhibitorno delovanje citrata tudi ni bistveno pripomogla h končnemu cilju, to je dvigu hitrosti sinteze končnega produkta (Schreferl et al., 1986). Encim z nekoliko znižano občutljivostjo na inhibicijo« citratom so uspeli dokazati s proteolitičnim odcepom 8 aminokislinskih ostankov na C terminalnem delu PFK1 izolirane iz zajčje mišice. Modificiran encim je popolnoma izgubil aktivnost šele ob prisotnosti 10 mM citrata, medtem ko je bil izhodni encim neaktiven že pri 2,5 mM inhibitorja (Valaitis et al., 1987).

V primerjavi z PFK1 opisanimi pri drugih organizmih ima encim pri glivi Aspergillus niger nekoliko večjo rezistenco na inhibicijo s citratom, kljub temu pa 10 mM koncentracija citrata popolnoma zavre delovanje encima. Fiziološke vrednosti citronske kisline v normalnih celicah dosegajo vrednost nekaj mM, v celicah glive Aspergillus niger pa koncentracija citronske kisline lahko naraste celo do 10 mM (Legiša in Kidrič, 1989). Encim PFK1 so pri glivi Aspergillus niger že večkrat poskusili natančno opisati (Habison et al., 1979; Habison et al., 1983; Schreferel et al. 1986; Arst et al., 1987), izolirali pa so tudi gen, ki kodira omenjeni encim in določili njegovo nukleotidno zaporedje. Analiza gena je pokazala, da gre za 85 kDa velik protein (EMBL accession number pjkA Z79690), medtem ko je študij kinetike na delno prečiščenem encimu, ki pa mu niso določili molske mase (!), pokazal, da encim aktivirajo AMP, fruktoza-2,6-bifosfat in amonijevi ioni, medtem ko ga citrat inhibira (Habison et al., 1983). Ugotovljeno je bilo, da prisotnost amonijevih ionov inhibicijo encimske aktivnosti s citratom le nekoliko omili, ne pa prepreči (Habison et al., 1983, Arst et al., 1987). V literaturi smo opisali primer, ko smo pri glivi Aspergillus niger odkrili nekoliko krajši protein, z molsko maso 48 kDa, ki pa prvotno ni bil aktiven in se je ponovno aktiviral šele po fosforilaciji proteinske molekule (Legiša in Benčina 1994a). C.P. Kubicek, kije vodil raziskave meijenja encimske kinetike pri istem encimu (Habison et al., 1979; Habison et al., 1983; Scheferel et al. 1986; Arst et al., 1987), je kategorično zavrnil, da bi v njegovem laboratoriju našli protein z 48 kDa, ki bi kazal znake aktivnosti PFK1 (Legiša in Benčina, 1994b). V dveh diplomskih delih (Smerkolj, 2000) je bil opisan tudi postopek za izolacijo 48 kDa fragmenta PFK1 in proces po katerem 48 kDa fragment v celicah glive A. niger verjetno nastane s posttranslacijsko modifikacijo (Mesojednik, 2003). Kinetika encimske aktivnosti 49-52 kDa fragmenta PFK1 glive Aspergillus niger do sedaj ni bila opisana, nedavno pa smo tudi ugotovili, da pri glivi A. niger ne gre za 48 kDa protein temveč nekoliko večji fragment.

Ob uporabi gojišča s povišano začetno koncentracijo sladkorja (do 30%) in naknadno hipno razredčitvijo po 36 urah rasti, smo uspeli pri glivi Aspergillus niger inducirati hitrejše izločanje produkta (Legiša in Gradišnik-Grapulin, 1995, Legiša in Gradišnik-Grapulin, EU Patent, 1999). Ugotovili smo, da gre v tem primeru, istočasno z razredčitvijo, ki predstavlja hipoosmotski šok, za močno aktivacijo PFK1, ki odločilno pripomore k močnejšemu metabolnemu pretoku preko glikolize, kar vodi do hitrejše tvorbe in akumulacije citronske kisline kot primarnega produkta. Do sedaj iz micelija, ki je bil podvržen hipoosmotskemu šoku, encim PFK1 še ni bil izoliran.

V literaturi ni zaslediti opisa, da bi PFK1 katerega koli organizma imela ohranjeno pozitivno in izgubljeno negativno regulacijo. Prileganje aminokislinskih zaporedij PFK1 pri glivi Aspergillus niger, kvasovki S. cerevisiae, človeku (H. sapiens) in bakteriji E. coli (Slika 7) kaže na relativno konzervativen centralni del proteina pri vseh evkariontskih encimih. Vezalna mesta za aktivacij ske molekule se nahajajo po večini na Nterminalnem delu, le citrat za uspešno vezavo na protein potrebuje nekatere aminokislinske ostanke, ki so locirani tako na N kot tudi na C terminalnem delu (Kemp in Gunasekera, 2002; Hansen et al., 2002, Li et al., 1999).

Glede na znano stanje tehnike, predstavljen problem povratne inhibicije s citronsko kislino ni zadovoljivo rešen. Naloga in cilj izuma je rešiti predstavljen problem s postopkom, ki zaobide inhibicijo s citronsko kislino.

Da bi dosegli čim hitrejšo sintezo končnih biotehnoloških produktov, bi v produkcijskih mikrobnih celicah morali imeti popolnoma deregulirano glikolizo, kar bi lahko dosegli s prisotnostjo modificirane 6-fosfofrukto-l-kinaze (PFK1), ki bi bila neobčutljiva na inhibicijo s citratom, po drugi strani pa bi obdržala pozitivne lastnosti regulacije encima, tako da bi prisotnost določenih efektoijev povečala njeno aktivnost.

Po izumu je naloga rešena z neodvisnimi patentnimi zahtevki.

Izum se nanaša na krajši fragment encima 6-fosfofrukto-l-kinaze, katerega molska masa je več kot 49 kDa, prednostno v območju od 49 do 55 kDa, zaželjeno v območju od 49 do 52 kDa, za katerega je značilno, da encimska aktivnost krajšega fragmenta ni pomembno inhibirana s citronsko kislino in solmi citronske kisline. Izum se sklicuje na krajši fragment, za katerega je značilno, da encimska aktivnost krajšega fragmenta ni pomembno inhibirana v območju nad 0 mM do 15 mM citronske kisline in solmi citronske kisline. Izum se nanaša tudi na omenjeni krajši fragment, ki se v prisotnosti citronske kisline in/ali njenih soli še vedno aktivira z nekaterimi celični metaboliti, kot sta fruktoza-2,6-bifosfat in amonijevi ioni. Omenjeni krajši fragment predstavlja proteinski preostanek, ki ne vsebuje N- in/ali C terminalnega dela izvorne 6-fosfofrukto-l-kinaze. Izum se tudi nanaša na zgoraj omenjeni fragment, ki je opcijsko posttranslacijsko spremenjen in se posttranslacijka sprememba nanaša na proteazno cepitev in/ali fosforilacijo krajšega fragmenta, ki je lahko in vivo ali in vitro in je katalizirana s proteinskimi kinazami kot so: proteinska kinaza C, cAMP-odvisna proteinska kinaza, kalcij/kalmodulin odvisna proteinska kinaza in druge.

Izum se nanaša na krajši fragment encima 6-fosfofrukto-l-kinaze, katerega priprava vključuje izolacijo izvornega encima oziroma gena 6-fosfofrukto-l-kinaze iz celic mikrobnega ali živalskega izvora, oziroma je pripravljen sintetično ali je rekombinantnega izvora. Izvorni encim oziroma gen je krajšan z odcepitvijo N- in/ali C-terminalnega dela izvornega proteina oziroma 5' in/ali 3' dela izvornega gena, da dobimo krajši fragment, ki ima lastnosti opisane zgoraj ali krajši gen, ki nosi zapis za krajši fragment opisan zgoraj. Prednostno se priprava nanaša na krajši fragment 6-fosfofrukto-l-kinaze rekombinantnega izvora in izvira oziroma je pripravljen iz izvornega gena in/ali proteina iz evkariontskih celic, prednostno iz gliv, prednostno iz gliv vrste Aspergillus.

Predstavljen izum je zasnova na odkritju, da gen, ki kodira za krajši fragment 6fosfofrukto-1-kinaze in le ta ni inhibiran s citronsko kislino in/ali solmi citronske kisline, z vnosom v celico poveča hitrost sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov.

Na podlagi teh odkritij je izum tudi postopek, ki vključuje uporabo krajšega fragmenta, oziroma vnos homolognega ali heterolognega rekombinantnega gena v celico in s tem povečanje hitrosti sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov zaradi povečanja hitrosti glikolize, ki ni podvržena inhibiciji s citronsko kislino in/ali solmi le te.

OPIS SLIK

Slika 1: Model evolucije PFK1: zgoraj - prokariontski PFKldimer, spodaj evkariontski PFK1 monomer, ki je nastal z združitvijo dveh prokariontskih genov. Istočasno so se razvila alosterična mesta za vezavo F-2,6- P2, AMP/ADP, citrata in ATP kot inhibitorja. Katalitična in alosterična mesta so prikazana s kvadrati in krogi, kamor se vežejo ustrezni substrati (F-6-P in ATP) in efektorji (Kemp in Gunasekera, 2002).

Slika 2: SDS-PAGE elektroforeza nativnega proteina in 49-52 kDa fragmenta, ki izražata PFK1 aktivnost, v primerjavi s standardnimi proteini z znano molsko maso (levo).

Slika 3: Aktivnost izoliranega nativnega proteina PFK1 brez in ob prisotnosti posameznih efektorjev v sistemu.

Slika 4: Aktivnost nativnega 85kDa encima PFK1 ob različnih koncentracijah citronske kisline.

Slika 5: Aktivnost nativnega 85kDa encima PFK1 ob različnih koncentracijah citronske kisline in ob dodatku 10 mM amonijevih ionov ter 2 μ fruktoze-2,6-difosfata.

Slika 6: Aktivnost izoliranega 49-52 kDa fragmenta PFK1 brez in ob prisotnosti posameznih efektorjev v sistemu.

Slika 7: Aktivnost 49-52 kDa fragmenta PFK1 ob naraščajoči koncentraciji citronske kisline merjeno brez in ob prisotnosti efektorjev.

Slika 8: SDS-PAGE elektroforeza 49-52 kDa fragmenta (levo), kot edinega proteina, ki izraža PFK1 aktivnost, v miceliju, ki je bil podvržen hipoosmotskemu šoku. Na desni strani slike gela so prikazane lise proteinov z znano molsko maso.

Slika 9: Aminokislinsko prileganje PFK glive Aspergillus niger, kvasovke Saccharomyces cerevisiae, človeka Homo sapiens in bakterije Escherichia coli. Vezalna mesta za aktivacij ske molekule se nahajajo po večini na N-terminalnem delu, le citronska kislina in/ali citrat za uspešno vezavo na protein potrebuje nekatere aminokislinske preostanke, ki so locirani na C terminalnem delu.

Slika 10 A, B: Analiza po Southemu. Večje število signalov v primerjavi z A60 dokazuje prisotnost vsaj 5 novih genov v transformiranih sevih 2, 3, 4 in 5.

DEFINICIJE

Okrajšava PFK1 se nanaša na encim 6-fosfofrukto-l-kinazo.

OkrajšavapfkN se nanaša na gen, ki kodira 6-fosforukto-l-kinazo.

Izraz krajši fragment se nanaša na protein ali gen, katerega število enot, aminokislin ali nukleotidov je manjše, kot pri proteinu ali gen iz katerega izhaja.

Izraz krajši fragment 6-fosfofrukto-l-kinaze se nanaša na protein ali gen, ki nosi zapis za 6-fosfofrukto-l-kinazo katerega število aminokislin oziroma deoksiribonuleotidov je manjše, kot pri izvornem encimu 6-fosfofrukto-l-kinazi ali genu, ki kodira za 6-fosfofrukto-l-kinazo, ki se nahaja v živi celici, ki ni genetsko spremenjena.

Izraz 6-fosfofrukto-l-kinaza se nanaša na encim, ki ob prisotnosti adenozin trifosfata pretvarja fruktozo-6-fosfat v fruktozo-1,6-difosfat in je encim v procesu glikolize.

Izraz inhibicija s citronsko kislino se nanaša na negativni vpliv citronske kisline in soli citronske kisline kot so citrati, na encimsko aktivnost 6-fosfofrukto-l-kinaze.

Izraz aktivacija se nanaša na povečanje aktivnosti encima nad osnovno vrednost ob prisotnosti aktivacijskih komponent: kot so celični metaboliti, na primer fruktoza-2,6bifosfat in amonijevi ioni.

Izraz N- in/ali C terminalni del proteina se sklicuje na del proteina od NH2oziroma začetka proteina proti notranjosti proteina in od notranjosti proteina do COOHoziroma zaključka proteina.

Izraz posttranslacijska modifikacija se nanaša na spremembo osnovne aminokislinske sekvence proteina s skrajšanjem proteina s proteazami oziroma z adicijo spojin na aminokislinsko sekvenco, kot je na primer dodatek fosfata s fosforilacijo s proteinsko kinazo. Posttranslacijake modifikacije so opisane v strokovni literaturi.

Izraz metaboliti se nanaša na produkte celičnega metabolizma.

Izraz izvorni ali nativni encim oziroma gen se nanaša na encim 6-fosfofrukto-l kinazo in gen encima, ki je prisoten v celicah divjega tipa, to so clice, ki se nahajajo v naravi.

Izraz rekombinantni izvor se nanaša na gen oziroma protein, ki je prilagojen in pridobljen laboratorijsko s tehnikami poznanimi strokovnjakom s področja.

Izraz sintetičnega izvora se nanaša na sintetično pridobljen gen oziroma protein, kije pridobljen laboratorijsko s tehnikami poznanimi strokovnjakom s področja. Sintetični protein lahko predstavlja kombinacijo živalskega in mikrobnega proteina.

Izraz cepitev 5' in/ali 3' dela izvornega gena se nanaša na odstranitev dela gena od 5' proti notranjosti in/ali odstranitev gena od notranjosti do 3' dela gena. Odstranitev dela gena je opravljena na način poznan strokovnjaku s področja in je lahko opravljen z endonukleazno specifično cepitvijo, nespecifično cepitvijo ali s pomnoževanjem gena s polimerazno verižno reakcijo z uporabo oligonukleotidnih začetnikov, ki so komplementarni genu na mestih, katerih namnožen produkt kodira krajši fragment.

Izraz homologen rekombinantni gen se nanaša na gen, ki nosi zapis za krajši fragment, pripravljen z rekombinantnimi tehnikami in je vnešen v isto vrsto celic, kot izhaja izvorni gen.

Izraz heterologen rekombinantni gen se nanaša na gen, ki nosi zapis za krajši fragment, pripravljen z rekombinantnimi tehnikami in je vnešen v drugo vrsto celic, kot izhaja izvorni gen.

Izum se nanaša na krajši fragment z molsko maso večjo kot 49 kDa, prednostno v območju od 49 do 55 kDa, prednostno v območju od 49 do 52 kDa in krajši fragment ne vsebuje N- in/ali C- terminalnega dela izvorne 6-fosfofrukto-l-kinaze.

Izum se nanaša na krajši fragment encima 6-fosfofrukto-l-kinaze, za katerega je značilno, da encimska aktivnost krajšega fragmenta ni pomembno inhibirana s citronsko kislino in/ali solmi citronske kisline, da encimska aktivnost krajšega fragmenta ni pomembno inhibirana v območju nad 0 mM do 15 mM citronske kisline in/ali solmi citronske kisline. Prednostno se izum nanaša na krajši fragment, katerega encimska aktivnost ni inhibirana več kot 30 % v območju nad 0 mM do 15 mM citronske kisline in/ali solmi citronske kisline. Prav tako izum opisuje krajši fragment, označen s tem, da encimska aktivnost ni pomembno inhibirana s citronsko kislino in/ali solmi citronske kisline in je v prisotnosti citronske kisline in/ali solmi le te aktivnost fragmenta še vedno aktivirana z nekaterimi celični metaboliti kot sta ffuktoza-2,6-bifosfat in amonijevi ioni.

Izum opisuje krajši fragment za katerega je značilno, da je opcijsko posttranslacijsko spremenjen in je posttranslacijska sprememba proteazna cepitev izvornega proteina in/ali fosforilacija krajšega fragmenta in je krajši fragment opcijsko in vivo ali in vitro fosforiliran s proteinskimi kinazami kot so: proteinska kinaza C, cAMPodvisna proteinska kinaza, kalcij/ kalmodulin odvisna proteinska kinaza in/ali druge.

Izum se nanaša na krajši fragment, za katerega je značilno, da se pripravi iz izvornega encima ali gena 6-fosfofrukto-l-kinaze izoliranega iz celic mikrobnega ali živalskega izvora, ali je pripravljen sintetično ali je rekombinantnega izvora.

Izum se nanaša na krajši fragment, za katerega je značilno, da se pripravi iz izvornega encima 6-fosfofrukto-l-kinaze izoliranega iz celic mikrobnega ali živalskega izvora, oziroma je pripravljen sintetično ali je rekombinantnega izvora, prednostno je krajši fragment rekombinantnega izvora in izvira oziroma je pripravljen iz proteina iz evkariontskih celic, prednostno iz gliv, oziroma iz gliv vrste Aspergillus, oziroma iz glive Aspergillus niger. Izum se nanaša na zgoraj opisan krajši fragment, za katerega je značilno, da se pripravi iz izvornega encima z odcepitvijo N- in/ali C-terminalnega dela proteina.

Izum se nanaša na krajši fragment, za katerega je značilno, da se krajši fragment pripravi iz izvornega gena 6-fosfoffukto-l-kinaze izoliranega iz celic mikrobnega ali živalskega izvora, ali je pripravljen sintetično ali je rekombinantnega izvora, prednostno je krajši fragment rekombinantnega izvora in izvira ali je pripravljen iz izvornega gena iz evkariontskih celic, prednostno iz gliv, prednostno gliv vrste Aspergillus, prednostno glive Aspergillus niger. Izum se nanaša na zgoraj opisan krajši fragment označen s tem, da se krajši fragment pripravi iz izvornega gena z odcepitvijo 5' in/ali 3' dela izvornega gena na način, da pridobimo gen, ki nosi zapis za krajši fragment definiran zgoraj.

Izum se nanaša na uporabo zgoraj opisanega krajšega fragmenta za povečanje hitrosti sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov tako, da vključuje v postopek vnos krajšega fragmenta v celice ali vključuje v postopek vnos gena, ki nosi zapis za zgoraj omenjeni krajši fragment ali vključuje vnos RNA, ki nosi zapis za krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 19, v celice. Izum se nanaša na uporabo zgoraj opisanega krajšega fragmenta za povečanje hitrosti sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov tako, daje v celice vnešen homologen ali heterologen krajši fragment v obliki proteina ali gena ali RNA. Izume se prav tako nanaša na uporabo zgoraj opisanega krajšega fragmenta za povečanje hitrosti sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov, za katero je značilen vnos homolognega ali heterolognega krajšega fragmenta opisanega zgoraj v obliki proteina gena ali RNA v evkariontske celice mikrobnega ali živalskega izvora, prednostno v glive.

Izume se prav tako nanaša na uporabo zgoraj opisanega krajšega fragmenta za povečanje hitrosti sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov za katero je značilen vnos homolognega ali heterolognega krajšega fragmenta opisanega zgoraj v obliki proteina gena ali RNA v celice gliv vrste Aspergillus, prednostno Aspergillus niger.

Izum se nanaša na postopek za povečanje hitrosti sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov in vključuje uporabo krajšega fragmenta opisanega zgoraj v obliki proteina ali gena ali RNA in je le ta vnešen v celico s poznanimi metodami rekombinantne tehnologije. Izum se prav tako nanaša na zgoraj opisani postopek in vključuje uporabo zgoraj opisanega krajšega fragmenta v obliki proteina ali gena ali RNA in je le ta vnesen v evkarionstko celico, prednostno v glive, prednostno v glivo vrste Aspergillus s poznanimi metodami rekombinantne tehnologije.

Izume se nanaša na postopek za povečanje hitrosti sinteze citronske kisline, za katerega je značilno, da vključuje uporabo zgoraj opisanega krajšega fragmenta v obliki proteina, gena ali RNA in je le ta vnesen v evkarionstko celico, prednostno v glive, prednostno v glivo vrste Aspergillus s poznanimi metodami rekombinantne tehnologije.

Opisi materialov in metod v nadaljevanju so zgolj informativne narave in služijo pojasnjevanju izuma. V postopkih se lahko uporablja tudi druge ustrezne materiale in metode, ki so poznana strokovnjakom s področja.

1. KINETIKA

1.1. MATERIAL IN METODE

Gojenje glive Aspergillus niger

Priprava vcepka

Spore glive A. niger sev A60 (MZKI), ki so se razvile na poševnem pivinem agarju po 7 dnevni inkubaciji pri 30°C, smo suspendirali v 25 ml sterilne raztopine Tweena 80 (0,1%). Končna koncentracija spor je bila približno 10⁷ spor na ml.

Micelij smo gojili na gojišču, ki je v 1 litru vseboval: 20g glukoze, 5g NH^SO^, 5g KH2PO4, lg MgSO4.7H2O, 0,5g NaCI, 10 mg MnCh, 10 mg peptona, pH=6,0. Gojišče (lOOml) smo pocepili s 5 ml vcepka in inkubirali pri 30°C. Za izolacijo nativnega proteina smo micelij gojili 20 ur, pri pripravi fragmenta pa smo micelij pod enakimi pogoji gojili 48 ur.

Po končani fermentaciji smo micelij zbrali s filtriranjem ter ga dobro sprali z ohlajenim 50 mM fosfatnim pufrom, ki je vseboval 0,5 mM ditioeritritola in lmM EDTA. Za izolacijo nativnega fragmenta smo vedno uporabljali fosfatni pufer s pH vrednostjo 7,8, pri čiščenju fragmenta pa pufer s pH vrednostjo 7,0. Delno osušen micelij smo zamrznili v tekočem dušiku, do prahu zdrobili v Warring Blendorju in do uporabe shranili v skrinji pri -70°C.

Izolacija nativnega proteina in aktivnega fragmenta PFK1

Izolacija encima je v grobem potekala po postopku, kot je bil predhodno opisan (Smerkolj, 2000).

Priprava homogenata

Približno 50 g grobo zmletega, zamrznjenega micelija, smo dodatno dezintegrirali z 1 minutnim drobljenjem v celičnem homogenizatorju (Braun, Melsungen), ob občasnem ohlajevanju s suhim ledom. Po odtajanju smo vsebino strtih celic ekstrahirali s 5 ml ohlajenega 50mM fosfatnega pufra, primerne pH vrednosti, ob dodatku 0,5 mM ditioeritritola in 10 ul mešanice proteaznih inhibitoijev (Sigma). Homogenat smo pri 4°C 15 minut centrifugirali pri 15.000 obr./min. Koncentracija proteinov v supematantu je znašala več kot 5 mg/ml.

Obarjanje proteinov

Proteine v homogenatu smo oborili tako, da smo v raztopino ob stalnem mešanju dodajali amonijev sulfat do določene vrednosti saturacije. Pri izolaciji nativnega proteina smo uporabili frakcijo med 50 in 75% nasičenostjo z amonijevih sulfatom, pri osamitvi fragmenta pa frakcijo do 25% nasičenosti z amonijevim sulfatom. Po dodatku celotne vsebine soli, smo raztopino brez mešanja še eno uro inkubirali pri 4°C. Oborjene proteine smo zbrali s 15 minutnim centrifugiranjem pri 15.000 obr./min pri 4°C.

Razsoljevanje

Proteinski precipitat smo raztopili v 0,5-1 ml ekstrakcij skega pufra in ga razsolili na Fast desalting koloni (Pharmacia), ki smo jo eluirali s 50 mM fosfatnim pufrom primerne pH vrednosti, ob dodanem 0,5 mM ditioeritritolu.

Afinitetna kromatografija

Delno prečiščeno obliko encima smo uspeli izolirati po nanosu razsoljne raztopine proteinov na afmitetno kolono, ki je vsebovala azidno barvilo Procion MX 4GD (ICI, Colours / Fine Chemicals) vezano na nosilec Sepharose 4B (Pharmacia)(Atkinson et al.,

1981). Pri izolaciji nativnega encima je bila kolona ekvilibrirana s 50 mM fosfatnim pufrom pH 7,8, ob izolaciji fragmenta pa s 50 mM fosfatnim pufrom pH vrednosti 7,0, v obeh primerih ob dodatku 0,5 mM ditioeritritola.

Izolacija nativnega proteina

Po nanosu in spiranju s 50 mM fosfatnim pufrom pH=7,8 in ob dodatku 0,5 mM ditioeritritola, smo encim eluirali z lml 6 mM raztopine fruktoza-6-fosfata. Eluirano proteinsko frakcijo smo v hladnem preko noči dializirali proti 20 mM fosfatnemu pufru, pH 7,8, kije vseboval 0,5 mM ditioeritritola in 35% (v/v) glicerola. Preparat je na hladnem ostal stabilen nekaj tednov.

Izolacija fragmenta

Po nanosu in spiranju s 50 mM fosfatnim pufrom pH=7,0 in ob dodatku 0,5 mM ditioeritritola smo encim eluirali z lml raztopine 6 mM fruktoza-6-fosfata. Eluirani proteinski frakciji smo nemudoma dodali albumin do končne koncentracije 5 mg/ml. Encim je pri 4°C obdržal aktivnost nekaj ur.

SDS-PAGE elektroforeza

Homogenost encimskega vzorca smo določali na 10% SDS-PAGE elektroforezi (Laemmli, 1970) ob prisotnosti proteinskih standardov (Sigma) in barvanju s srebrovim nitratom, (prenesi med rezultate)

Merjenje encimske kinetike

Encimsko kinetiko smo merili spektrofotometrično po delno modificiranem postopku, kot je bil opisan predhodno (Legiša in Mattey, 1988). Reakcijska mešanica je v končnem volumnu 1 ml vsebovala 50 mM Tris-HCl pufer, pH = 7,8 pri nativnem proteinu in Bis-tris pufer, pH = 7,0 pri fragmentu. Poleg pufra je sistem za merjenje encimske kinetike vseboval še: 0,5 mM ditioeritritola, 100 mM KC1, 5 mM MgCh, 0,2 mM NADH, različne koncentracije fruktoze-6-fosfata, 20 μΐ encimskega preparata, 2,4 enote trioze-3fosfat izomeraze in glicerol-3-fosfat dehidrogenaze (Sigma), 4,5 enot aldolaze (Sigma) in 1 mM ATP.

Ker so amonijevi ioni močni aktivatorji PFK1, smo pomožne encime (aldolazo, izomerazo in glicerol-3-fosfat dehidrogenazo) predhodno preko noči dializirali v 50 mM Tris-HCl pufru, pH 7,8, ki je vseboval 0,5 mM ditiotreitola in 30% glicerola. Tako pripravljeni encimi so v hladnem ostali stabilni nekaj tednov.

Pri določevanju kinetike fragmenta, smo vse meritve izvedli ob prisotnosti albumina v pufru, in sicer v koncentraciji 5mg/ml. Albumin smo pufru dodali tik pred meritvijo.

1.2. REZULTATI

Izolacija aktivnih oblik PFK1

Aktivnost PFK1 smo uspeli določiti v dveh frakcijah oborjenih z amonijevim sulfatom, in sicer v frakciji do 25% saturacije in v frakciji med 50 in 75% saturacijo. Po razsolj evanj u in izolaciji s pomočjo afinitetne kromatografije smo iz frakcije, ki je bila oboijena s 25% saturacijo amonijevega sulfata osamili protein s približno 48-52 kDa molske mase, medtem ko je bil v frakciji oborjeni med 50 in 75% saturacijo, prisoten protein s 85kDa molske mase.

Elektroforeza

Elektroforeza nativnega proteina je pokazala liso molske mase približno 85 kDa. Elektroforeza fragmenta je pokazala eno samo liso molske mase približno 50 kDa.(slika 2)

Osnovna kinetika nativnega proteina PFK1 in kinetika ob prisotnosti efektorjev (slika 3)

Meritev kinetike pri izoliranem 85 kDa nativnem proteinu PFK1 je pokazala sigmoidno naraščanje aktivnosti ob povečevanju koncentracije substrata (fruktoze-6fosfata). Ob dodatku efektorjev kot sta AMP in fruktoza-2,6-difosfat seje močno povečala afiniteta encima do substrata in ocenjena Km dosega vrednost 0,5 mM F6P, vendar pa se maksimalna hitrost ne poveča, ob prisotnosti amonijevih ionov, pa je Km vrednost sicer nekoliko višja, vendar pa se občutno poveča tudi maksimalna hitrost delovanja. Encim najbolj učinkovito deluje ob prisotnosti amonijevih ionov in fruktoza-2,6-difosfata v fizioloških koncentracijah, ko izkazuje povečano afiniteto do substrata (Km = 0,5 mM) in podvojeno maksimalno aktivnost v primerjavi z aktivnostjo brez efektorjev.

Inhibicija nativnega proteina s citronsko kislino (slika 4)

Citronska kislina seje izkazala kot močan inhibitor nativnega proteina. Pri 5 mM citrata v sistemu je bila encimska aktivnost zmanjšana na približno polovico, medtem ko smo ob 10 mM citrata komaj še zaznali encimska aktivnost.

Inhibicija nativnega proteina s citronsko kislino ob prisotnosti efektorjev (slika 5)

Vpliv efektorjev (amonijevih ionov in fruktoza-2,6-difosfata) na aktivnost nativnega 85 kDa proteina PFK1 ob prisotnosti citronske kisline je podobna kot v primeru, ko citronska kislina kot inhibitor ni bila dodana. Gre za povečanje afinitete do substrata in povečanje maksimalne hitrosti, vendar pa efektorji ne preprečijo inhibicije s citratom. Ob 10 mM citronske kisline v sistemu, kljub prisotnosti efektorjev, namreč ni bilo mogoče zaznati aktivnosti PFK1. Testirani efektoiji le nekoliko omilijo negativen efekt citrata pri nižjih koncentracijah inhibitorja.

Osnovna kinetika 49-52 kDa fragmenta PFK1 in kinetika ob prisotnosti efektorjev (slika 6)

Pri merjenju kinetike aktivnega 49-52 kDa fragmenta smo ugotovili, da imamo opravka z izredno nestabilnim encimom, ki je ohranil svojo aktivnost izven celic le nekaj ur. Encim je ostal stabilen le ob uporabi fosfatnega pufra med procesom izolacije, izredno hitro pa je izgubljal aktivnost ob razredčevanju celičnega ekstrakta, tako da smo med procesom čiščenja morali vzdrževati čim višji nivo proteinov v vzorcu. Po izolaciji encima s pomočjo afinitetne kromatografije, smo eluentu nemudoma dodali albumin do končne koncentracije 5 mg/ml.

Tudi pri krajšem fragmentu PFK1 so meritve osnovne kinetike prikazale sigmoidno odvisnost encimske aktivnosti od naraščajoče koncentracije substrata (F6P). Tudi pri fragmentu so amonijevi ioni in fruktoza-2,6-difosfat povečali afiniteto encima do substrata (Km ⁼ 1,5 mM F6P) in podvojili maksimalno hitrost. Oba efektorja imata podoben vpliv na dvig encimske aktivnosti fragmenta PFK1 in tudi skupna uporaba obeh efektorjev bistveno ne spremeni encimske kinetike.

Aktivnost 49-52 kDa fragmenta PFK1 ob prisotnosti citronske kisline in efektorjev (slika 7)

Aktivnost prečiščenega 49-52 kDa fragmenta PFK1 je obdržala svojo vrednost ob povečevanju koncentracije citronske kisline v sistemu do 15 mM vrednosti, kar kaže na to, daje fragment rezistenten na inhibicijo s citronsko kislino. Meritve aktivnosti prečiščenega 49-52 kDa fragmenta PFK1 ob prisotnosti amonijevih ionov in fruktoze-2,6-difosfata kot efektoijev ter ob naraščajoči koncentraciji citronske kisline v sistemu pa dokazujejo, daje fragment kljub prisotnosti citronske kisline dovzeten za aktivacijo z uporabljenima efektorjema.

Z meijenjem kinetike aktivnega 49-52 kDa fragmenta PFK1 smo ugotovili, da encim ni več občutljiv na inhibicijo s citratom, njegovo aktivnost pa dodatno pospešijo nekateri drugi celični metaboliti kot sta fruktoza-2,6-bifosfat in amonijevi ioni. Omenjeni fragment je torej ohranil pozitivne lastnosti encima višjih organizmov, z odcepom dela proteinske molekule pa je izgubil negativno regulacijo.

2. UPORABA

2.1. MATERIAL IN METODE

Gojenje glive Aspergillus niger

Priprava vcepka

Spore glive A. niger sev A60 (MZKI), ki so se razvile na poševnem pivinem agarju po 7 dnevni inkubaciji pri 30°C, smo suspendirali v 25 ml sterilne raztopine Tweena 80 (0,1%). Končna koncentracija spor je bila približno 10⁷ spor na ml.

Micelij smo gojili na dva načina, in sicer gojišču, ki je v 1 litru vsebovalo: 150g saharoze, 2,5g NH₄(SO₄)₂, lg KH₂PO₄, 250g MgSO₄.7H₂O, 40 mg CuSO₄, pH=2,5. Fermentacijo smo šaržno vodili v 51 laboratorijskem mešalnem bioreaktorju s 51 gojišča, po tem, ko smo gojišče pocepili s 10 ml vcepka spor in inkubirali pri 30°C. Alternativno smo glivo A. niger sev A60 gojili v gojišču, ki je v 1 litru vsebovalo: 300g saharoze, 2,5g NH₄(SO₄)₂, lg KH₂PO₄, 250g MgSO₄.7H2O, 40 mg CuSO₄, pH=2,5. V tem primeru smo v 5 1 laboratorijskemu bioreaktorju fermentacijo začeli z 2,5 1 substrata, ki smo ga ravno tako pocepili s 10 ml vcepka in inkubirali pri 30°C. Po 32 urah rasti smo gojišču dodali 2,5 1 destilirane vode, pH=2,0. Tako obdelan micelij izloča citronsko kislino več kot dvakrat hitreje (1,6 g cit.k./l substrata/uro) kot šaržno gojeni micelij (0,7 g cit.k./l substrata/uro), ki je bil pocepljen v gojišče s 15% začetne koncentracije saharoze (Legiša in GradišnikGrapulin, 1995). Ko je bil micelij star 72ur, smo celice, ki so bile gojene po enem ali drugem postopku, s filtracijo ločili od gojišča, sprali z ohlajenim 50 mM fosfatnim pufrom, ki je vseboval 0,5 mM ditioeritritola in lmM EDTA, pH=7,8 ali pH=7,0 in ga zamrznili pod tekočim dušikom.

Izolacija nativnega proteina in aktivnega fragmenta PFK1

Izolacija PFK1 je potekala po postopku kot je opisan pod poglavjem kinetika.

2.2. REZULTATI

Iz micelija, kije bil gojen po šaržnem postopku smo lahko izolirali nativni protein z molsko masoo 85 kDa in majhno količino 49-52 kDa fragmenta. Iz micelija, ki pa je bil podvržen hipoosmotskemu šoku (razredčitev gojišča), pa smo lahko izolirali le 49-52 kDa krajši fragment PFK1 (Slika 8). Prisotnost le krajšega fragmenta PFK1 v miceliju, ki je sposoben dvakrat hitreje izločati citronsko kislino kot primarni produkt fermentacije dokazuje, da gre v tem primeru za deregulirano glikolizo, ki jo omogoča 49-52 kDa fragment PFK1, kije rezistenten na inhibicijo s citratom.

3. PRIPRAVA KRAJŠEGA FRAGMENTA 6-FOSFOFRUKTO-l-KINAZE IZ IZVORNIH GENOV

3.1. MATERIALI IN METODE

Materiali

Invitrogen	kazeinski hidrolizat, kvasni ekstrakt, restrikcij ski encimi, encimi za DNA
Kodak	modifikacije, Pfx polimerazo rentgenski film X-OMAT™-AR
Tropix	CDP-Star™
New England Biolabs	alkalna fosfataza, DNA ligaza, kinaza, restrikcij ski encimi, λ DNA
Qiagen	Plazmid Maxi™ Kit, QIAQuick Gel Extraction Kit, MiniElute

Sterilizacija gojišč, pufrskih raztopin, steklovine in plastike

Vsa gojišča, pufrske raztopine, steklovino in plastiko, ki smo jih uporabljali pri delu z bakterijami in glivami, smo predhodno sterilizirali z avtoklaviranjem pri 121 °C, 1.2 χ 10⁵ Pa, 20 minut. Temperaturno labilne snovi (antibiotike, vitamine, sladkorje, amonijeve soli, ipd.) smo raztopili v sterilni destilirani vodi in jih filtrirali skozi 0,2 pm filter (Nalgene).

Gojišča

Minimalni	6.0 g NaNO3, 1.5 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4 x 7H20, 0.5 g KC1, 1 ml
medij (MM)	Vishniacove raztopine, 2 % (m/m) glukoza, pH 6.0 za 1000 ml
Vishniacova	10 g EDTA, 4.4 g ZnSO4 x 7H2O, 1.0 g MnCl2 x 4H2O, 0.32 g CoCl2 x
raztopina	6H2O, 0.32 g CuSO4 χ 5H2O, 0.22 g (NH4)6 Mo7 O24 χ 4H2O, 1.47 g CaCl2
mehki in	x 2H2O, 1.0 g FeSO4 χ 7H2O, pH 4.0 MM, 0.95 M saharoza, 0.7 % (m/v) agar za mehki agar ali 1.5 % (m/v) agar
trdi agar (MMS) hranilni	za trdi agar MM, 2 % (m/v) glukoza, 0.5 % (m/v) kvasni ekstrakt, 0.2 % (m/v) kislega
medij (CM) LB	kazenskega hidrolizat 10 g baktotriptona, 5 g kvasnega ekstrakta, 10 g NaCl, pH 7 za 1000 ml
LBA	v sterilno gojišče LB dodamo ampicilin do končne koncentracije 100 mg/1
trdno	pred avtoklaviranjem dodamo 15 g agarja na liter gojišča
gojišče nikotinamid	10 mg/1
levcin	200 mg/1
uridin	122 mg/1

Raztopine

TE	10 mM Tris, pH=8.0, 0.1 M EDTA, pH 8.0
6 x nanašalni	0.25 % (m/v) bromfenol modro, 40 % (m/v) glukoza
pufer Pufer 1	25 mM Tris-Cl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 50 mM glukoza
Pufer 2	0.2 M NaOH, 1 % (m/v) SDS
Pufer 3	60 ml 5 M natrijevega acetata, 11.5 ml ocetne kisline, 28.5 ml vode
depurinacijska raztopina denaturacijska raztopina nevtralizacijsk a raztopina pufer SSC 25 x RN A-z a A	0.2 M HCI 0.4 M NaOH, 1 M NaCl 0.5 M Tris pH 7.2,1 M NaCl 3.75 M NaCl, 0.375 M natrijev citrat dihidrat pH 7.0 10 mg/1 raztopina v: 10 mM Tris pH 7.5, 15 mM NaCl, inkubiramo 15 min pri 100°C, počasi ohladimo in alikvote zamrznemo pri -20°C
TE z RNazo	10 mM Tris pH 7.6, 1 mM EDTA, 20 pg/ml RNaza
Ekstrakcijski pufer	1.5 ml fenola, ekvilibriranega s pufrom Tris/HCI pH 8, 1.0 ml tri- izopropil naftalena (0.02 g/ml v vodi), 1.0 ml p-amino-salicilne kisline
5x RNB	(0.12 g/ml v vodi), 0.5 ml 5 x RNB 121.1 g Tris/HCI pH 8.5, 73.04 g NaCl, 95.10 g EGTA (etilen glikol-bis
ligazni pufer	(β-aminoetil eter) Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraocetna kislina)za 1000 ml 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1 mM DTE in 1 mM ATP
pufra I pufra II	100 mM MgCl2, 5 mM pufer Tris, pH 7.4 100 mM CaCl2, 5 mM pufra Tris pH 7.4
pufra III SP6	100 mM CaCl2,5 mM Tris pH 7.4, 14 % (v/v) glicerol 0.8 % (m/v) NaCl, 10 mM natrijev fosfatni pufer, pH 6.0
KCT	1 M KCI, 25 mM CaCl2,10 mM Tris, pH 7.5
STC	1.33 M sorbitol, 50 mM CaCl2, 10 mM pufer Tris, pH 7.5
pufer PEG Natrijev	25 % PEG6000, 50 mM CaCl2, 10 mM pufer Tris, pH 7.5 0.5 M Na2HPO4 x 7 H2O, 85 % H3PO4 pH 7.2

fosfatni pufer hibridizacijski pufer pufer za spiranje pufer za PCR (Taq)

0.25 M natrijev fosfatni pufer, pH 7.2, 7 % (m/v) SDS, 1 mM EDTA

0.3 M NaCl, 0.03 M natrijev citrat, pH 7.0,1 % (m/v) SDS

500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl pH 8.3

Sevi bakterij in gliv

Pri vseh eksperimentih smo uporabljali avksotrofni sev glive Aspergillus niger A365 (pyrG')(MZKI).

Za namnožitev plazmidne DNA smo uporabili bakterijo Escherichia coli DH5a.

Plazmid pGW je plazmid sestavljen iz vektorja pUC19, ki ima vključen genpyrG A. niger. Vektorje tipa pMOJ, ki vsebujejo promotor in terminator izoliran iz glive A. niger smo uporabili za kloniranje krajših fragmentov in za transformacijo v glivo A. niger.

Osnovne metode kloniranja

Pri uporabljenih metodah smo se posluževali splošno znane literature s tega področja, razen če ni posebej navedeno drugače.

Gojenje glive Aspergillus niger

Vcepek glive A.niger smo pripravili iz spor, gojenih 7 dni na poševnem hranilnem mediju pri 30°C. Spore smo suspendirali v sterilni raztopini ST (0.8 % (m/v) NaCl, 0.05 % (m/v) Tween 20) in njihovo število določili spektrofotometrično iz umeritvene krivulje pri valovni dolžini 635 nm. Vcepek je vseboval 10⁷ spor. Micelij glive A.niger smo pridobili z gojenjem glive v 100 ml hranilnega medija v 500 ml Erlenmayerjevih steklenicah pri 30°C in mešanju 150 obr/min.

Gojenje bakterije Escherichia coli

E. coli DH5a je bila uporabljena za propagacijo plazmidne DNA. Gojili smo jo na gojišču LB pri 37°C z mešanjem pri 150 obr/min.

Izolacija genomske DNA glive A. niger

16-18 ur star micelij, ki smo ga gojili na hranilnem mediju, smo od gojišča ločili s filtracijo preko filter papirja, ga sprali z 0.9 % (m/v) raztopino NaCI in ga zmrznili v tekočem dušiku, nato pa strli v terilnici. Strtemu zmrznjenemu miceliju smo dodali 1 ml pufra za ekstrakcijo DNA, segretega na 55 °C.

Zmes smo 1 minuto mešali, dodali 0.25 ml kloroforma, ponovno premešali in pri sobni temperaturi centrifugiraii 10 minut pri 10000 obr/min. Zgornjo vodno fazo, ki je vsebovala DNA, smo ekstrahirali z 0.75 ml raztopine fenol : kloroform (1:1) in nato še z enakim volumnom čistega kloroforma. Iz vodne faze smo DNA obarjali z 0.7 kratnim volumnom izopropanola in precipitat po 15 minutnem centrifugiranju pri 10000 obr/min in sobni temperaturi ločili od supematanta. Posušeno oborino DNA smo raztopili v 500 μΐ pufra TE z RNazo in mešanico inkubirali 30-60 minut pri 37 °C. Nato smo ponovili ekstrakcijo z enakim volumnom raztopine fenol : kloroform (1:1) in nato dvakrat s čistim kloroformom. DNA smo oborili z dvakratnim volumnom absolutnega etanola in 10 minut centrifugiraii, kot je opisano zgoraj. Oborino DNA smo nato sprali še s 70 % (v/v) etanolom ter jo po sušenju na zraku raztopili v 20-50 μΐ pufra TE. Koncentracijo in čistost izolirane genomske DNA smo ugotovili z elektroforezo v agaroznem gelu s pomočjo Zdna kot standarda.

Izolacija plazmidne DNA

Plazmidno DNA smo izolirali z metodo alkalne denaturacije (Sambrook s sod., 1989). Namnožene bakterijske celice smo raztopili s pufrom 1, lizirali s pufrom 2. Nato smo s pufrom 3 oborili proteine. Te agregate smo zbrali s 5 minutnim centrifugiranjem pri 10000 obr/min in 4°C, v supernatantu pa je ostala plazmidna DNA in nizkomolekulama RNA, ki smo jo oborili z dvakratnim volumnom absolutnega etanola. Po spiranju s 70 % (v/v) etanolom smo plazmidno oborino posušili in raztopili v pufru TE z RNazo, da smo razgradili še prisotne nizkomolekulame molekule RNA.

Izolacija plazmidne DNA v večji količini

Plasmid maxi kit (QIAGEN) metodo smo uporabljali za pripravo več 10 pg plazmidne DNA po navodilih proizvajalca.

Izolacija DNA iz agaroznega gela

Za čiščenje fragmentov DNA iz agaroznega gela smo uporabili komplet QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Izolacijo smo izvajali po priloženih navodilih.

Cepitev DNA z restrikcijskimi encimi, Iigacija

Cepitve z restrikcijskimi endonukleazami smo uporabljali pri izolaciji in analizi fragmentov DNA iz rekombinantnih plazmidov. DNA smo cepili z različnimi restriktazami, v ustreznih pufrih (10 χ koncentrati ustreznih pufrov so navadno priloženi pri komercialno nabavljenih restrikcij skih endonukleazah).

Restikcijske zmesi so vsebovale 1-5 pg DNA, 10 % (v/v) 10 ^x pufra za restriktazo, 10 U restrikcij skega encima. Restrikcijsko zmes smo inkubirali najmanj 1 uro pri 37 °C (oziroma pri temp. optimumu restriktaze).

Ligacijska zmes je navadno vsebovala 100 ng vektorske DNA, nekaj 10 ng inserta, 1 U ligaze, 10 % (v/v) ligazni pufer. V večini primerov je Iigacija potekala preko noči pri 16 °C.

Priprava kompetentnih celic in transformacija bakterije Escherichia coli

DH5a

Posamezno kolonijo E. coli DH5a iz plošče LB smo inokulirali v 5 ml tekočega medija LB in jo preko noči gojili pri 37 °C. Z 200 pl te kulture smo inokulirali 200 ml medija LB in inkubirali na stresalniku pri 37 °C, dokler gostota celic ni dosegla vrednosti ODčoo med 0.15 in 0.2. Celice smo zbrali z 10 minutnim centrifugiranjem pri 4 °C in 8000 obr/min ter usedlino resuspendirali v 100 ml ledeno hladnega pufra I. Spiranje smo ponovili s 100 ml pufra II, zopet centrifugirali 10 minut pri 8000 obr/min in 4 °C, popolnoma odstranili supematant in usedlino kompetentnih celic resuspendirali v 2 ml pufra III. Kompetentne celice smo do uporabe shranili pri -70 °C.

Zmrznjene kompetentne celice smo počasi odtalili na ledu in jih pustili stati 1 uro. Kompetentnim bakterijskim celicam smo dodali 10 ng plazmida t.j. 25 μΐ ligacijske mešanice in zmes 30 minut inkubirali na ledu. Zmes smo za 3 minute izpostavili temperaturnemu šoku pri 42 °C, jo nato ohladili v ledeni kopeli in ji dodali 1 ml medija LB ter 1 uro inkubirali pri 37 °C. Nato smo bakterijske celice zbrali s centrifugiranjem pri 5000 obr/min in jih nanesli na plošče LB s primernim antibiotikom, ki je omogočil selekcijo transformiranih bakterij.

Transformacija glive Aspergillus niger

Za transformacijo smo glivo Aspergillus niger gojili v hranilnem mediju. Micelij, star 16 do 18 ur, smo zbrali s filtriranjem in ga sprali s pufrom SP6. Za pripravo protoplastov smo raztopili 50 mg mešanice litičnih encimov glive Trichochoderma harzanium (Fluka), 50 mg encima Caylase C3 (Cayla Sari) in 50 mg encima Glucanex (Novo Nordisk) v 20 ml pufra KCT, v katerem smo nato z nežnim pipetiranjem resuspendirali 1 g micelij a (mokra teža). Raztopino smo 2 uri inkubirali pri 30°C in vsake pol ure spremljali proces nastajanja protoplastov pod mikroskopom. Ko se je sprostilo približno 10⁸ protoplastov /ml, smo jih ločili od micelija s filtriranjem medija preko steklene volne in filtrat 10 minut cetrifugirali pri 3000 obr/min pri 4°C. Usedlino protoplastov smo pazljivo resuspendirali v 5 ml pufra STC. Spiranje protoplastov smo ponovili dvakrat s pufrom STC in jih, na podlagi štetja na hemocitometru, razredčili do o

končne koncentracije 10 protoplastov na ml.

Transformacijska mešanica je vsebovala 200 pl suspenzije protoplastov, 50 μΐ pufra PEG, 20 pg DNA. Po rahlem mešanju smo jo 20 minut inkubirali pri sobni temperaturi in ji nato dodali 2 ml pufra PEG. Po natančno 5 minutah inkubacije pri sobni temperaturi smo dodali 4 ml pufra STC in zmes premešali. K 1 ml te raztopine smo dodali 4 ml mehkega agarja MMS, ohlajenega na 48 °C in razlili po ploščah s trdnim agarjem MMS. Naredili smo tudi negativno kontrolo, t.j. namesto 20 pg DNA smo v transformacijsko mešanico dodali 20 pl pufra TE, pH 8. Za kontrolo preživelosti protoplastov smo pripravili tudi serijske razredčitve protoplastov in spremljali njihovo regeneracijo pred postopkom transformacije in po postopku, ki je odražal pogoje med transformacijo, le da v transformacijsko mešanico nismo dali DNA.

Čiščenje dobljenih transformant

Dobljene transformante smo čistili z dvakratnim precepljanjem na plošče z acetamidom kot edinim virom dušika in tudi na plošče z akrilamidom kot edinim virom dušika.

Biotinsko označevanje sond

Označevanje sonde z biotinom smo izvedli s setom reagentov “BioPrime™DNA Labeling System” (Life Technologies) po navodilih proizvajalca. Označeno sondo smo od nevgrajenih nukleotidov in začetnih oligonukleotidov ločili z MiniElute (QIAGEN) po navodilih proizvajalca.

Analiza DNA po Southernu

Število genov v genomski DNA posamezne transformante smo določili z analizo po Southernu. Izolirano DNA smo razrezali na manjše fragmente z restrikcij sko endonukleazo in jih ločili po velikosti z elektroforezo v 0.8 % agaroznem gelu. Po depurinaciji, denaturaciji in nevtralizaciji fragmentov DNA, smo le-te s pufrom SSC (2 χ) v vakuumu prenesli na najlonsko membrano Hybond™-N⁺ (Amersham) po navodilih proizvajalca. DNA smo vezali na najlonsko membrano s 3 minutnim obsevanjem z žarki UV valovne dolžine 312 nm.

Po prenosu fragmentov na najlonsko membrano Hybond™-N⁺ (Amersham), smo le-to sprali z 0.25 M natrijevim fosfatnim pufrom, pH 7.2. Postopki predhibridizacije, hibridizacije in spiranja so potekali pri 65 °C. Predhibridizacija je potekala 60 minut v hibridizacij skem pufru, po dodatku denaturirane, z biotinom označene sonde pa smo fragmente hibridizirali čez noč. Po končani hibridizaciji smo membrano dvakrat spirali po 5 minut ter dvakrat po 15 minut s pufrom za spiranje pri 65 °C. Spiranje smo zaključili s pufrom SSC (2 x) pri sobni temperaturi.

Detekcija biotinsko označene DNA

Za detekcijo biotinsko označenih molekul DNA smo uporabili set reagentov SouthemStar™ (Tropix) po navodilih proizvajalca. Detekcija pozitivnih signalov temelji na vezavi konjugata avidin-alkalne fosfataze na biotin in na emisiji svetlobe ob dodatku kemiluminiscentnega substrata za alkalno fosfatazo CDP-Star™ (Tropix) in na koncu z avtoradiografskim filmom X-Omat™XR (Kodak) detektirali pozitivne signale.

Elektroforeza DNA na agaroznem gelu

Pri analizi različnih vzorcev DNA smo pogosto uporabljali gele, ki smo jih pripravili s segrevanjem agaroze, navadno v 1 χ pufru TAE. Koncentracija agaroze je bila odvisna od velikosti fragmentov, ki smo jih želeli ločevati: za fragmente velikosti več 100 do več 1000 bp 0.8% (m/v) agarozni gel, za fragmente od 100-500 bp pa 1.5-2 % (m/v) agarozni gel. Ustrezno količino agaroze v prahu smo zamešali v 1 χ elektroforezni pufer, dobro raztopili s kuhanjem v mikrovalovni pečici, ohladili na 60 °C, dodali 5 μΐ EtBr (0.5 mg/ml) za 100 ml gela ter vlili v pripravljeno kadičko za elektroforezo. Ko se je gel strdil, smo nanesli vzorce DNA, katerim smo dodali 1/3 končnega volumna 3 * markeija za agarozno elektroforezo. Elektroforeza je običajno potekala v 1 χ pufru TAE, pri konstantni napetosti 100 V. Gel smo nato osvetlili z UV svetlobo in fotografirali.

Reakcija polimeraznega verižnega pomnoževanja (PCR)

PCR reakcijo smo uporabili za analizo prisotnosti določenega gena v genomu oz. mešanici DNA oziroma za namnožitev specifičnega fragmenta DNA, ki je namenjen za nadaljnje kloniranje.

Reakcijska mešanica za PCR je vsebovala naslednje komponente: od 5 do 10 ng DNA, 20 pmol oligonukleotidnih začetnikov, 0.2 mM dNTP, 2.5 mM MgCE, 10 % (v/v) pufra PCR, 1U Taq polimeraze. Za pomnoževanje s Pfx polimerazo smo uporabili pufre in pogoje pomnoževanja, ki jih priporoča proizvajalec (Invitrogen). Denaturacija je potekala pri 95 °C, pomnoževanje pri 72 °C za Taq polimerazo in pri 68 °C za Pfx polimerazo. Temperatura prileganja je odvisna od uporabljenih oligonukleotidnih začetnikov. Analizo produktov PCR smo izvedli z elektroforezo v agaroznem gelu z etidijevim bromidom.

3.2. REZULTATI

Primerjava nukleotidnega zaporedja gena pfkA pri dveh sevih glive A. niger

Popolna aminokislinska sekvenca bakterij vsebuje od okoli 310 do okoli 330 aminokislinskih preostankov, gliv od okoli 770 do okoli 995 aminokislinskih preostankov in vretenčarjev od okoli 780 do okoli 790 aminokislinskih preostankov. Popolna aminokislinska sekvenca glive A. niger vsebuje 783 aminokislinskih preostankov in je bila določena iz genomske in cDNA sekvence. Med encimi različnega izvora je na nivoju proteinov od 55 % homologije do 91 % homologije. V veliko primerih izmenjava nukleotidov med geni imenovanih osebkov nima vpliva na aminokislinsko sekvenco. Aktivno mesto encima je visoko ohranjeno z opazno proteinsko sorodnostjo med imenovanimi osebki (od 50 do 86% aminokislinskih preostankov je identičnih) in obstaja visoka stopnja homologije (55 %) tudi z bakterijsko. Mesto za vezavo citronske kisline se nahaja na položaju, ki ni visoko ohranjena med organizmi in ni potrebna za delovanje samega encima. Na podlagi proteinskega prileganja, homologije smo določili krajši fragment encima PFK1, ki je potreben za delovanje in hkrati ne vsebuje mesta za inhibicijo s citronsko kislino.

Priprava konstrukta

Pripravili smo plazmidne vektorje s skrajšanim genom pfkA glive A. niger in jim določili nukleotidno zaporedje.

Za pripravo konstrukta s krajšim fragmentom gena pfkA, ki nosi zapis za krajši fragment proteina, smo uporabili dva plazmida. pPFK-1, ki vsebuje gen pfkA glive A.niger, kloniran v pBluescript II KS+ vektor, in plazmid pGW, ki vsebuje gen pyrG prav tako glive A. niger. Na podlagi analize prileganja proteinov PFK1 smo pripravili več setov oligonukletidnih začetnikov za pomnožitev kratkega fragmenta iz izvornega pfkA gena. 5’ oligonukleotidni začetniki dolgi od 18 do 40 baznih parov so homologi s pfkA DNA od mesta 1 (start kodona) proti notranjosti in 3’ oligonukeotidni začetniki dolgi od 18 do 40 baznih parov so homologni s komplementarno verigo pfkA DNA na večih mestih v območju od 1375 do 1450 nukleotida. S primernimi seti oligonukleotidnih začetnikov smo s polimeraznim verižnim pomnoževanjem s Taq polimerazo ali Pfic polimerazo namnožili več različno dolgih krajših fragmentov pfkA gena. Za nadaljnje delo smo izbrali krajše gene pfkA, ki kodirajo za krajši fragment PFK1, ki nima mesta za inhibicijo s citronsko kislino in/ali njenimi solmi in ima molso maso 49 do 55 kDa. Namnožen krajši gen pfkA smo ločili od nečistoč na agarozni elektroforezi, ga izolirali iz agarozne elektroforeze in vnesli v bakterijski vektor pBlueScript. Po namnožitvi v bakteriji E. coli DH5alfa, smo gen vgradili v pMOJ vektor, ki dovoljuje ekspresijo krajšega fragmenta v glivah. pMOJ vektor vsebuje med drugim gene za: ampicilinsko rezistenco, pomnoževanje v bakteriji, promotorsko in terminatorsko regijo, ki omogočata ekspresijo gena krajšega fragmenta v glivi. Poleg tega končna oblika plazmidnega konstrukta lahko vsebuje tudi markerski gen potreben za selekcijo uspešne transformacije v glivah. Markerski gen je lahko vključen na isti plazmid s krajšim genom pfkF ali pa je dodan v transformacijsko mešanico ločeno.

Sestava vektorja je odvisna od organizma, v katerega bo krajši fragment vnešen. Primeren vektorski sistem za posamezne organizme oziroma vrste celic je dobro poznan strokovnjakom s področja.

Priprava seva s pomnoženim krajšim genom pfkA

Iz micelij a glive A. niger A365 (MZKI) smo pridobili suspenzijo protoplastov, ki smo jih transformirali s 20 pg plazmidne DNA, ki nosi gen za krajši fragment PFK. Na MMS plošči brez uridina so zrasle tri transformante. Vse tri transformirane seve gliv smo očistili in preverili vsebnost krajšega fragmenta z merjenjem encimske aktivnosti, na DNA nivoju pa z analizo po Southemu. Transformante smo označili s številkami 1,2 in 3. Transformanti 1 in 2, ki smo jih gojili v CM brez uridina, smo označili s številkama 4 in 5. Iz zraslega micelija smo izolirali genomsko DNA in jo razrezali z restrikcij skimi encimi, fragmente genomske DNA ločili na agaroznem gelu in nato tako ločene fragmente prenesli na najlonsko membrano. Pol najlonske membrane smo hibridizirali s sondo /?/fc4(KpnI), pol pa s sondo pyrG (Xhol). Hibridizacija je potekala pri 58 °C. Membrano smo spirali z Wash pufrom (lxSSC, 1% SDS). Na sondi, ki smo jo med pripravo označili z biotinom, smo vezali protitelesa s konjungiranim encimom, ki razgradi CD-star reagent in pri tem oddaja fotone. Ti so osvetlili fotografski film. Iz rezultatov je razvidna razlika v številu genov za pfkA in pyrG med sevom A60 in transformantami. Analiza transformante 1 je dala nak rezultat kot izhodni sev A60, zato lahko trdimo, da ni bila transformirana. Ostala dva para transformant (2 in 3 oziroma 4 in 5) pa sta sprejeli konstrukt pfkA&pyrG in ga integrirali v genomsko DNA. O točnem številu integriranih genov lahko podamo le oceno, zagotovo pa lahko potrdimo, da sta transformanti 2 in 3 oz 4 in 5 seva s pomnoženim genom pfkA.

Merjenje encimske aktivnosti PFK pri sevu s pomnoženim genom pfkA je bilo opravljeno na način opisan v poglavju kinetike. Za dodatno potrditev integracije gena pfkA v kromosom glive A. niger A365 smo izmerili encimsko aktivnost. Pri sevu 2 oziroma 4 je bila aktivnost encima PFK 5x višja. Pri sevu 3 oziroma 5 pa je bila izmerjena aktivnost v primerjavi z A60 7x višja.

LITERATURA

Arts, E. in ostali. Gen. Microbiol., 133 (1987), s. 1195-1199.

Atkinson, T. in ostali., C.R. Biochem. Soc. Trans. 9 (1981): 290-293.

Habison, A. in ostali. M. FEMS Microbiol. Lett. 5 (1979): 39-42.

Habison, A. in ostali. Biochem. J. 209 (1983): 669-676.

Hansen, T. in ostali. Arch. Microbiol. 177 (2002): 401-409.

Kemp, R. G./ Gunasekera, D. Biochem. 41 (2002): 9426-9430.

Legiša, M./ Mattey M. Enzyme Microbiol. Technol. 10 (1988): 33-36.

Legiša, M./ Benčina, M. FEMS Microbiol. Lett. 188 (1994a): 327-334.

Legiša, M./ Benčina, M. FEMS Microbiol. Lett. 121 (1994b): 129.

Legiša, M./ Gradišnik-Grapulin, M. Appl. Environ. Microbiol. 7 (1995): 2732-2737.

Legiša, M./ Gradišnik-Grapulin, M. European Patent No. 0611823 (1999).

Legiša, M./ Kidrič, J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 31 (1989): 453-457.

Laemmli. U.K. Nature 277 (1970): 680-685.

Li, Y. in ostali. Biochem. 38 (1999): 16407-16412.

Ruijter, G.J.G. in ostali. Biochim. Biophys.Acta 1334 (1997): 317-326.

Schreferl, G. in ostali. J. Bacteriol. 165, 3 (1986), s. 1019-102.

Smerkolj, S. Diplomska naloga. Ljubljana. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, (2000), 32.

Valaitis, A.P. in ostali. J. Biol. Chem. 262, 11 (1987): 5044-5048.

Voet, D./ Voet, J. G. Biochemistry. Second edition. New York. Wiley & Sons inc., 1995, 1361.

Claims (29)

1. Kraj ši fragment encima 6-fosfofrukto-1 -kinaze označen s tem, daje molska masa krajšega fragmenta večja kot 49 kDa.

2. Krajši fragment po zahtevku 1 označen s tem, daje molska masa krajšega fragmenta v območju od 49 do 55 kDa, prednostno v območju od 49 do 52 kDa.

3. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 2 označen s tem, da krajši fragment v prisotnosti citronske kisline in/ali solmi citronske kisline v območju nad 0 mM do 15 mM ne izgubi več kot 30 % encimske aktivnosti.

4. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 3 označen s tem, da encimska aktivnost krajšega fragmenta ni pomembno inhibirana z nad 0 mM do 15 mM citronske kisline in/ali solmi citronske kisline.

5. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 4 označen s tem, da encimska aktivnost krajšega fragmenta ni pomembno inhibirana s citronsko kislino in/ali solmi citronske kisline.

6. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 5 označen s tem, da encimska aktivnost ni pomembno inhibirana s citronsko kislino in/ali solmi citronske kisline in je v prisotnosti citronske kisline in/ali solmi le te aktivnost fragmenta še vedno aktivirana z nekaterimi celični metaboliti kot sta fruktoza-2,6-bifosfat in amonijevi ioni.

7. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 6 označen s tem, da krajši fragment ne vsebuje N- in/ali C- terminalnega dela izvorne 6-fosfofrukto-l-kinaze.

8. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 7 označen s tem, daje opcijsko posttranslacij sko modificiran.

9. Krajši fragment po zahtevku 8 označen s tem, da se posttranslacijska modifikacija nanaša na proteazno cepitev izvornega proteina in/ali fosforilacijo krajšega fragmenta.

10. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 8 do 9 označen s tem, daje krajši fragment opcijsko in vivo ali in vitro fosforiliran s proteinskimi kinazami kot so: proteinska kinaza C, cAMP-odvisna proteinska kinaza, kalcij/ kalmodulin odvisna proteinska kinaza in/ali druge proteinske kinaze.

11. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 10 označen s tem, da se krajši fragment pripravi iz izvornega encima ali gena 6-fosfofrukto-l-kinaze izoliranega iz celic mikrobnega ali živalskega izvora, ali je pripravljen sintetično ali je rekombinantnega izvora.

12. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 10 označen s tem, da se krajši fragment pripravi iz izvornega encima 6-fosfofrukto-l-kinaze izoliranega iz celic mikrobnega ali živalskega izvora, oziroma je pripravljen sintetično ali je rekombinantnega izvora.

13. Krajši fragment po zahtevku 12 označen s tem, daje krajši fragment po zahtevku 1 rekombinantnega izvora in izvira oziroma je pripravljen iz proteina iz evkariontskih celic, prednostno iz gliv.

14. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 12 do 13 označen s tem, daje krajši fragment po zahtevku 1 rekombinantnega izvora in izvira oziroma je pripravljen iz proteina iz gliv vrste Aspergillus, prednostno glive Aspergillus niger.

15. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 11 do 14 označen s tem, da se krajši fragment pripravi iz izvornega encima z odcepitvijo N- in/ali C-terminalnega dela proteina.

16. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 11 označen s tem, da se krajši fragment pripravi iz izvornega gena 6-fosfofrukto-l-kinaze izoliranega iz celic mikrobnega ali živalskega izvora, ali je pripravljen sintetično ali je rekombinantnega izvora.

17. Krajši fragment po zahtevku 16 označen s tem, daje krajši fragment po zahtevku 1 rekombinantnega izvora in izvira ali je pripravljen iz izvornega gena iz evkariontskih celic, prednostno iz gliv.

18. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 16 do 17 označen s tem, daje krajši fragment po zahtevku 1 rekombinantnega izvora in izvira oziroma je pripravljen iz gena gliv vrste Aspergillus, prednostno glive Aspergillus niger.

19. Krajši fragment po katerem koli zahtevku od 16 do 18 označen s tem, da se krajši fragment pripravi iz izvornega gena z odcepitvijo 5' in/ali 3' dela izvornega gena na način, da pridobimo gen, ki nosi zapis za krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 10.

20. Uporaba krajšega fragmenta po katerem koli zahtevku od 1 do 19 za povečanje hitrosti sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov označena s tem, da vključuje vnos krajšega fragmenta po katerem koli zahtevku od 1 do 19, v celico.

21. Uporaba po zahtevku 20 označena s tem, da vključuje vnos gena, ki nosi zapis za krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 19, v celico.

22. Uporaba po zahtevku 21 označena s tem, da vključuje vnos RNA, ki nosi zapis za krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 19, v celico.

23. Uporaba po katerem koli zahtevku od 20 do 22 označena s tem, da je v celico vnešen homologen ali heterologen krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 19 v obliki proteina ali gena ali RNA.

24. Uporaba po katerem koli zahtevku od 20 do 23 označena s tem, daje homologen ali heterologen krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 19 v obliki proteina ali gena ali RNA vnešen v evkariontske celice mikrobnega ali živalskega izvora.

25. Uporaba po katerem koli zahtevku od 20 do 24 označena s tem, daje homologen ali heterologen krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 19 v obliki proteina ali gena ali RNA vnešen v evkariontske celice mikrobnega izvora, prednostno glive.

26. Uporaba po katerem koli zahtevku od 20 do 25 označena s tem, daje homologen ali heterologen krajši fragment po katerem koli zahtevku od 1 do 19 v obliki proteina ali gena ali RNA vnešen v evkariontske celice gliv vrste Aspergillus, prednostno glive Aspergillus niger.

27. Postopek za povečanje hitrosti sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov označen s tem, da vključuje uporabo krajšega fragmenta, po katerem koli zahtevku od 1 do 19, v obliki proteina, gena ali RNA in je le ta vnesen v celico s poznanimi metodami rekombinantne tehnologije.

28. Postopek po zahtevku 27 označen s tem, da vključuje uporabo krajšega fragmenta, po katerem koli zahtevku od 1 do 19, v obliki proteina ali gena ali RNA in je le ta vnesen v evkarionstko celico, prednostno v celico glive, prednostno v glivo vrste Aspergillus s poznanimi metodami rekombinantne tehnologije.

29. Postopek za povečanje hitrosti sinteze citronske kisline označen s tem, da vključuje uporabo krajšega fragmenta po katerem koli zahtevku od 1 do 19 v obliki proteina ali gena ali RNA in je le ta vnesen v celico glive, prednostno v glivo vrste Aspergillus s poznanimi metodami rekombinantne tehnologije.