JPH03251172A - 新規なｌ―乳酸脱水素酵素及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なＬ−乳酸脱水素酵素及びそれをコードす
る遺伝子に関する。

更に詳細には本発明は、ストレプトコッカス属菌、特に
ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（以下、「
Ｓ、サーモフィラス」ないしｒＳ、　ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓＪということもある）由来の新規なＬ−乳酸脱
水素酵素、その製法及び該酵素をコードする遺伝子に関
するものである。

（従来の技術） Ｌ−乳酸脱水素酵素（ＥＣ１，１，１，２７）は、以下
に示す反応、 を触媒とする酵素であって、生体内では反応は左方向に
傾いており、ピルビン酸を基質とし、ＮＡＤＨ（ｒｅｄ
ｕｃｅｄ　ｎｉｃｏｔｉｎａｗｉｄｅ　ａｄｅｎｉｎｅ
　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を補酵素として、Ｌ−乳
酸を生成する。本酵素は、動物や植物の諸組織及び微生
物に広く存在しており、その中のかなりの種類のものが
単離精製され、構成アミノ酸の一次構造や立体構造の解
明も進んでいる。構造は由来の如何を問わず、約３１０
〜３３０個のアミノｍ＜分子ｊ１３５ｋｄ内外）からな
るサブユニットの四量体である。

Ｌ−乳酸脱水素酵素により生成されるＬ−乳酸は、食品
工業においては、ヨーグルトを始めとする種々の乳酸発
酵食品の呈味成分として重要である。

一方、乳酸にはＬ−乳酸の他に、光学異性体としてＤ−
乳酸が存在している。Ｄ−乳酸の過剰な摂取は健康に害
を及ぼすことが知られており、ＷＨＯ（世界保健機構）
により１日当たりの摂取量の上限が定められている。

ところが、乳酸発酵食品の製造に用いられる乳酸菌の中
には１例えばヨーグルトの生産用のＬａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ　５ｕｂｓｐ、　ｂｕ
ｌｇａｒｉｃｕｓのようにＤ−乳酸のみを産生ずる菌が
ある。そのために、このような菌を用いてヨーグルトを
製造すると、他の１．−乳酸のみを産生ずる菌（例えば
、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ　）を用いていても、ｌ−乳酸とＤ−乳酸の両者が
ヨーグルト中に蓄積されてしまう。そこで、Ｄ−乳酸の
みを産生ずる菌に、Ｉ。

乳酸脱水素酵素をコートする遺伝子を導入することによ
って、Ｌ−乳酸のみを産生ずる菌に形質転換させること
とした。こうして得られた菌を用いれば、Ｌ−乳酸のみ
を含むヨーグルトを製造することが可能となる。

そして、Ｌ−乳酸脱水素酵素のみを特異的に発現する微
生物を作呂するに当って、これに使用するＬ−乳酸脱水
素酵素の遺伝子は、Ｌ−乳酸の主たる用途が食品である
ことに鑑み、古くから食品の製造に用いられており、安
全性が確認されている菌に由来するものが好ましい。

しかるに、これまで様々な動植物や微生物由来の、数多
くのＬ−乳酸脱水素酵素が単離精製され。

その遺伝子も決定されているにも拘らず、上記の安全性
の条件を満たす菌に由来するＬ−乳酸脱水素酵素の遺伝
子は得られていないのが現状である。

（問題点を解決するための手段） そこで、本発明者らはＬ−乳酸脱水素酵素の遺伝子を、
ヨーグルトの製造に用いられてきているＳ、　ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓから取り出すことを試み、これに成功
した。乳酸菌を宿主域とする適当なプラスミドベクター
に本遺伝子を組み込み、これを乳酸菌に導入すれば、１
．−乳酸のみを産生ずる形質転換乳酸菌を得ることがで
き、Ｌ−乳酸を選択的に得ることができる。

本発明によれば、先ずＬ−ラクテートデヒドロゲナーゼ
産生能を有する供与体微生物よりその微生物のＤＮＡを
分離精製した後、例えば、超音波、制限酵素などで切断
し、得られたＤＮＡ断片と、同様にしてベクターを切断
して得られたベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼなどに
より結合させ、ｊ、−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む組換
えＤＮＡを形成する。

また、該酵素生産能を遺伝子組換えにより導入した形質
転換微生物を供与体微生物として利用することもできる
。

供与体微生物由来のＤＮＡは、供与体微生物を培養し、
得られる培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶
菌させることによって調製することができる。溶菌方法
は、例えば、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞
壁溶解酵素による処理や超音波処理などが用いられる。

また、必要によりプロテアーゼ、リボヌクレアーゼなど
の他の酵素剤やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性
剤が併用される。また凍結融解処理を施すこともある。

このようにして得られる溶菌物からＤＮＡを分離、精製
するには、常法にしたがって、例えばフェノール抽出、
除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理
、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わ
せることによって行うことができる。

ＤＮＡ　を切断する方法は、例えば、超音波処理、制限
酵素処理などにより行うことができる。切断後、必要に
応してホスファターゼやＤＮＡポリメラーゼ等の修飾酵
素が用いられる。また種々のリンカ−やアダプターを用
いることによりＤＮＡ断片末端の塩基配列を変えること
ができる。

切断されたＤＮＡ断片から、蔗糖密度勾配遠心法や電気
泳動したゲルがらの抽出等によって最適な長さの断片の
みを得る。

一方、例えばＳ、サーモフィラス等り一乳酸脱水素酵素
生産菌の培養物がらＬ−乳酸脱水素酵素を生産せしめ、
更にこれを精製しておく。この精製標品についてそのア
ミノ酸配列の少なくとも一部を決定しておき、次いでそ
れから推定されるＤＮＡ配列配列補相補的リゴヌクレオ
チドを合成し、それにアイソトープ等の標識を付してプ
ローブを作成しておく。

このようにして作成したプローブを用いるコロニーまた
はプラークハイブリダイゼーション法によって、Ｓ、サ
ーモフィラス等の全ゲノムＤＮＡの断片から目的とする
Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む断片を確認し、ＤＮＡ
を分離精製する。これを開環したプラスミド等のベクタ
ー断片に連結し、これを宿主菌に導入して形質転換体と
する。

本発明において使用するベクターとしては、宿主微生物
で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドが適し
ている。

ファージとしては１例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場
合には、λファージやＭ１３ファージなどが使用出来る
。

また、プラスミドとしては１例えば、エシェリヒア・コ
リを宿主微生物とする場合には、　ｐＢＲ３２２、ｐＵ
ｃ１８．　ｐＵｃ１９、ｐＨＣ７９やそれらの派生体な
どが使用できる。更に、例えば、エシェリヒア・コリ、
バチルス・ズブチリスなどの二種以上の宿主微生物で自
律的増殖の可能な、例えば、ｐＨＹ３００ＰＬＫ。

ＹＩｐ５、ＹＥｐ１３などシャトルベクターを利用する
ことも可能である。このようなベクターを、先き番こ述
べたＤＮＡと同様に制限酵素などで切断し、ベクター断
片を得る。

ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は、公知
のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば、
ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングの後、生体
外で適当なりＮＡリガーゼの作用により組換えＤＮＡを
作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿主微生物
に導入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用して組換え
ＤＮＡにすることもできる。

宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的増
殖が可能でその形質発現のできるものであればよい。

宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法は、公知の方
法、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合に
はカルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｅ、　Ｍ。

ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、、υ−９，１０７２゜（１９７４））など
を採用することができる。

λフアージＤＮＡであれば、イン　ビトロ　パツケイジ
フグ法（Ｈｏｒｎ、　Ｂ、＋　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋６８、２９９．　（１９７９）
）によりλフアージ粒子を形成し、このλフアージ粒子
をエシェリヒア・コリの培養菌懸濁液に添加して、目的
とする酵素生産能を保有する特殊形質導入ファージを得
ることができる。

組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物の選択方法は
、液体選択培地で培養し、培養液中の目的とする酵素活
性を測定する。液体選択培地にはベクター上のマーカー
によって、最小培地や、抗生物質添加培地が適宜用いら
れる。

得られた目的とする酵素生産菌を液体選択培地にて３７
℃で培養し、公知の方法、例えば、アルカリ抽出法（Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、
１Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　７．１５
１３．　（１９７９））によってプラスミドを得ること
ができる。

目的とする酵素遺伝子を含む組換えＤＮＡは、上記の方
法で、適宜制限酵素で切断し、他のベクターに組み込ん
だり、他の宿主に導入することができる。

本発明に係る新規り一乳酸脱水素酵素は次のようにして
調製することができる。Ｌ−乳酸脱水素酵素生産菌、あ
るいは上記の方法によってＬ−乳酸脱水素酵素生産能を
獲得した形質転換微生物を液体培養する。培地としては
、該微生物の通常の培養に用いられるものであればいず
れでもよいが、例えば、炭素源としては澱粉、液化澱粉
、グルコース。

ラクトース、グリセリン、糖蜜、廃糖蜜などがあり、窒
素源としてはスキムミルク、ミルク、各種蛋白分解物、
大豆粉、肉エキス、ペプトン、尿素、硝酸塩、アンモニ
ウム塩、酵母エキス、コーンステイープリカーなどがあ
る。その他ビオチンなどの栄養素や微量金属などが適宜
使用される。

培養後、酵素が菌体内にある場合には、培養液を遠心分
離して菌体を得、超音波や細胞壁溶解酵素等で処理し、
破砕菌体を遠心分離して除き、粗酵素液とする。また、
酵素が培地中にある場合には、培養液を遠心分離して菌
体を除き、以後の精製を行なう。

得られた粗酵素液から、塩析、透析、イオン交換樹脂、
アフイニテイクロマトグラフ処理等一般的酵素精製法に
より目的とする酵素を単離することができる。

実施例Ｉ Ａ、　Ｓ、　ｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ　Ｍ−１９２株
菌体の調製明治乳業株式会社ヘルスサイエンス研究所に
おいて保存しているＳ、　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　
Ｍ　−１９２株の種培養をスキムミルク培地２５ｍＱに
接種して３７℃で一晩培養し、この培養液を、５１（リ
ットル）のＬＣＭ培地（Ｅｆｔｈｙｍｉｏｕ　ｅｔ　ａ
ｌ、　（１９６２）Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ。

１１０：　２５８）に１％グルコース及び１％ラクトス
を添加した培地に接種した。３７℃で８時間培養後、培
養液を６，０００ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して
、Ｓ、　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ＠体１４．３ｇ（湿
重量）を得た。

Ｂ、　Ｓ、　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　Ｍ−１９２株
　体中のＬ−酸　水Ａ、で得られた菌体を、０．３阿の
水酸化カリウムを含む燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０
）　２５ｔＱに懸濁し、ＨＥＡＴ−５ＹＳＴＥＭＳ−Ｕ
ＬＴＲＡＳＯＮＩＣ社（７）ｌｊ−３７５型超音波細胞
破砕機を用いて菌体を破砕した。この菌体破砕液を、１
５，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離して上清２
６．５ｍＱを回収した。この上清中には９，３３０ユニ
ツトのし乳酸脱水素酵素が含まれており、Ｄ−乳酸脱水
素酵素活性は測定限界以下であった。ここで、Ｌ−乳酸
脱水素酵素活性の測定は、５０１の酢酸ナトリウム緩衝
液（ＰＨ５，０）に、基質の１ｍＭピルビン酸ナトリウ
ム及び酵素の０．２ｙｒＭ　ＮＡＤＨを加えたものから
なる基質溶液に試料を添加して室温（２５℃）で反応を
行い、毎分１μ１Ｉ１０１ｅのＮＡＤ”（ｏｘｉｄｉｚ
ｅｄ　ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｉｎｅｄｊ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を生成させる酵素量を１ユニツ
トと定義した。

Ｃ，Ｌ−乳酸脱水素酵素の単離精製 Ｂ、で得られた菌体破砕液上清をＯ’　Ｃａｒｒａらの
方法（０’Ｃａｒｒａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７２）Ｆ
ＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２１　：　２８１）に従って、オ
キサム酸固定化セファロースカラムを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーにかけ、２，４００ユニツトの
Ｌ−乳酸脱水素酵素を含む活性画分を得た６更にこの画
分をＭＯＮＯＱ　ＨＲ５１５（ファルマシア社）にかけ
、２５ｍＭ　Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸・水酸
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）中、０〜１−塩化ナ
トリウムのリニアグラジェントによって分画溶出した。

この中から活性画分を取って精製標品とした。精製標品
をＳＯＳポリアクリアミド電気泳動（ＬａｅＩＩｌｌＩ
ｌｌｉ　（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：　６８
０）にかけたところ、約３８，０００ダルトンの位置に
単一バンドを示し、十分に精製されたことが示された（
純度９９％以丘）。

Ｃ１で得られたＬ−乳酸説水素酵素の精製標品３０μに
の溶媒系を純水に置換した後、ＡｐｐｌｉｅｄＢｏｉｓ
ｙｓｔｅｏ＋社の４７０型Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅ
ｎｃｅｒにかけて、］、−乳酸脱水素酵素のＮ末端から
２５個のアミノ酸の配列を決定した。これを以下に示す
。

１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　
Ｈｉｓ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｉｌｅ０ Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖ
ａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ５ Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ以上のアミノ
酸配列から推定されるＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子のＤＮ
Ａの配列を以下に示す。

ＡＡ ＧＧ ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＧＡＴ ｃｃｃ ＡＡ ＧＧ ＴＴＡ ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＧＣＴ ｃｃｃ Ａ Ｇ ＧＧＴ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＧＧＴ ｃｃｃ ＡＡＡ ＧＧＧ Ａ ＴＣＴ　ＴＣＴ Ｃ Ａ Ｇ ＡＧＴ　ＡＧＴ Ｃ 以上の推定 ＤＮＡ塩基配列の中で上線を付した１４塩基部分に相補
的なオリゴヌクレオチド、３’　　ＧＴＡＴＴＴＴＴＴ
ＣＡＡＴＡ　５’ＣＣＧ をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の３８０型Ｄ
ＮＡ合成機を用いて合成し、これを５Ｔ６Ｒ１と命名し
た。更にこの５Ｔ６Ｒ１に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造）及び〔γ−３７′Ｐ）ＡＴＰを用いて５
′末端を３２ｐ標識し、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子をク
ローニングするためのプローブとした。

Ａ、と同様にして調製したＳ、　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ　Ｍ−１９２株の培養液５００ＩＩＩＱから菌体を
集菌し、得られた菌体から斎藤らの方法（Ｓａｉｔｏ　
ｅｔ　ａｌ、　（１９６３）Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　７２：　６１９）に従って、Ｓ
。

ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムＤＮＡを調製した。

約１μｇのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶで完全に消化し
、これを１％アガロースゲル電気泳動で分離した。この
アガロースゲルを、０．５Ｎ水酸化ナトリウムと１．５
Ｍ塩化ナトリウムとを含む溶液中に３０分間浸してＤＮ
Ａを変性させた。更に０．２５Ｍ水酸化ナトリウムと１
．５Ｍ塩化ナトリウムとを含む溶液を用いて、　アガロ
ースゲル中のＤＮＡをナイロンメンブレン（アマジャム
社の１ｙｂｏｎｄ−Ｎ）にプロットした。こうして調製
されたナイロンメンブレンと、Ｄ、で調製した標識プロ
ーブ５Ｔ６Ｒ１とを室温で一晩ハイブリダイゼーション
を行った。ハイブリダイゼーション終了後、０．３Ｍ塩
化ナトリウムと０．０３Ｍクエン酸ナトリウムとを含む
溶液中、３０℃で３０分間づつナイロンメンブレンを２
回洗浄して、ハイブリダイゼーションをしていない標識
プローブを除去した。

この洗浄されたナイロンメンブレンのオートラジオグラ
ムをとったところ、約３ｋｂｐの位置に標識プローブが
ハイブリダイズしており、この位置にＬ−乳酸脱水素酵
素遺伝子が含まれていることが判明した。

Ｆ、　Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニングＥ、と
同様にして調製したＳ、　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　
Ｍ−１９２株のゲノムＤＮＡ約５μｇをＥｃｏＲＶで完
全消化し。

これを１％アガロースゲル電気泳動にかけた。Ｅ。

においでＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子はアガロースゲル上
で約３　ｋｂｐの位置にあることが判明しているので、
この部分のゲルを紫外線照射下で切り出した。ＢＩＯＩ
Ｏ１社のＧＥＮＥ　ＣＬＥＡＮ　ＤＡＮ精製キットを用
いて、この切り出されたゲルからＤＮＡを回収した。

回収されたＤＮＡと、ＥｃｏＲＶで消化して開環したプ
ラスミドベクターｐＢＲ３２２とを連結して、組換えプ
ラスミドベクターを作成した。この組換えプラスミドベ
クターを塩化カルシウム法を用いてＥ。

ｃｏｌｉ　７６１株（アマージャム社）に導入した。形
質転換株はアンピシリン（５０μｇ／ＩＩＩＱ）によっ
て選択した。

アンピシリン耐性株のコロニー約１，０００個をナイロ
ンメンブレン（アマジャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ）に移
し、常法に従って標識プローブ５Ｔ６Ｒ１を用いてコロ
ニーハイブリダイゼーションを行った。オートラジオグ
ラムにより標識プローブとハイブリダイズしていた１株
をとり、菌体中のプラスミドを調べたところ、約３　ｋ
ｂＰのＥｃｏＲＶ断片が挿入されたＰＢＲ３２２を保有
していた。この組換えプラスミドをρＢＥＶＩと命名し
た（第３図）。

Ｇ、　Ｌ−酸　水　酵　　伝子の　　の確騨ＰＢＥＶ　
１を保持している１６１株、ρＢＲ３２２を保持してい
る７６１株、及びプラスミドを保持していないＴＧＩを
ＬＢ培地を培養して集菌し、Ｂ、記載の方法に従って菌
体を超音波破砕して、破砕液の上清を遠心分離によって
得た。この上清液中の酵素活性を８゜に記載されている
方法に従って酵素活性を測定した。

この結果を以下の表に示す。表中の値はユニット／ＩＩ
Ｑ培養液を示し、また、Ｎ、　Ｄ、は測定限界以下の値
であったことを示す。

表 この表に示されるように、ＰＢＥＶ　ｌを保持している
７６１株の菌体内にのみＬ−乳酸脱水素酵素活性が検出
されたことから、ρＢＥＶＩにＬ−乳酸脱水素酵素遺伝
子が含まれていることが確認された。

更に、　ｐＢＥＶｌを保持している１６１株の細胞破砕
液上清液からＣ９に従ってＬ−乳酸脱水素酵素を単離精
製し、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った
ところ、Ｓ、　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＬ−乳
酸脱水素酵素と同じ移動度を示した。

また、この単離精製されたＩ、−乳酸脱水素酵素のＮ末
端のアミノ酸配列を分析したところ、　１番目のアミノ
酸がＳ、　ｔｈｅｒｍｏρｈ　ｉ　］、ｕ　ｓ由来のＬ
−乳酸脱水素酵素と同じスレオニンであるものが約９０
％、開始コドンに対応するメチオニンであるものが約１
０％であった。そして、Ｎ末端から２〜１０番目のアミ
ノ酸配列は、Ｓ、　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＬ
−乳酸脱水素酵素と全く同一であった。

以上から、ｐＢＥＶｌに組み込まれた Ｓ、　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＬ−乳酸脱水素
酵素が、ρＶＥＶＩを保持している１６１株で発現して
いることが確認された。

Ｈ，Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列の決ｐＢＥＶ
１を制限酵素ｓｐｈ　Ｉ及びＢａ■Ｈ１ｌで消化して線
状とし、キロシーフェンス用ＤＮＡプリージョン・キッ
ト（全酒造）を用いて欠失体を１３個作成した。

この欠失体の一つをＥｃｏＲＶ及びＡａｔ　ＩＩで消化
し、逆方向の欠失体をキロシーフェンス用ＤＮＡプリー
ジョン・キットにより１３個作成した。

これらの欠失体を、　ＵＮＩＴＥＤ　ＳＴＡＴＥＳＢＩ
ＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＣｏＲＰＯＲＡＴＩＯＮ社の５Ｅ
ＱＵＥＮＣＥ　ｖｅｒ、　２．０７−ｄｅａｚａ−ｄＧ
ＴＰ　ＤＮＡシークエンスキットを用いて、それぞれ塩
基配列を決定した（第２図）。それぞれの欠失体の塩基
配列から、　　ｐＢＥＶｌに挿入されている塩基配列３
　、０７３を決定したにの配列中で、開始コドンと終結
コドンに挟まれており、かつ、Ｄ。

で推定した５′末端の塩基配列と一致する箇所を探した
ところ、この配列の１，８５１〜２，８３８番目に該当
するオープンリーディングフレームが含まれていた。即
ち、この領域がＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子
である。更に、このオープンリーディングフレームの塩
基配列から、Ｌ−乳酸脱水素酵素のアミノ酸配列が確定
した（第１図）。

このアミノ酸配列を、他の既にアミノ酸配列が知られて
いるＬ−乳酸脱水素酵素と比較してホモロジーを調べた
ところ、Ｌａｃｔｏｂａｅｉｌｌｓ　ｃａｓｅｉ　（Ｈ
ｅｎｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｅｕｒ、　
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　１３４：　５０３　）とでは
６６．０％、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏ
ｒｉｓ　（Ｃｒｏｓｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７
９）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ
　５８１：３４２）とでは６８．５％であった。

〔発明の効果〕

本発明に係るＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を使用すれば、
Ｌ−乳酸脱水素酵素を工業的に製造することができる。

この酵素は従来未知の新規酵素であり、この酵素を使用
することによりイン　ビトロでピルビン酸からＬ−乳酸
を得ることができるほか、この酵素をコードする本発明
に係る遺伝子を導入した形質転換乳酸菌を培養すること
により、Ｌ−乳酸を直接製造することもできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係るＬ−乳酸脱水素酵素のアミノ酸配
列を示した図であり、第２図は上記アミノ酸配列をコー
ドするＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列を含む塩基
配列を示した図であり、第３図は本発明に係るＬ−乳酸
脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドＰＢＥＶ　１
の構築図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図に示すアミノ酸配列からなるＬ−乳酸脱水素
   酵素。 ２、請求項１に記載のアミノ酸配列をコードするＬ−乳
   酸脱水素酵素遺伝子。 ３、第２図に示すＤＮＡ塩基配列からなるＬ−乳酸脱水
   素酵素遺伝子。 ４、ストレプトコッカス属に属する請求項１に記載され
   たＬ−乳酸脱水素酵素を生産する微生物を培養し、培養
   物から該酵素を分離採取することを特徴とする該酵素の
   製造方法。