JPH11169179A - β−ガラクトシダーゼ、その製造方法、及び該β−ガラクトシダーゼを含有する発酵乳 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 発酵乳等低pHの組成物中でも好適に使用で
き、製品の安定性等に支障をきたさない新規のβ−ガラ
クトシダーゼの提供。 【解決手段】 配列番号１もしくは配列番号２で表され
るアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の１個もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列を有するβ−ガラクトシダーゼ、その製造方法、
該β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、これを含
有する組換えプラスミド、及び該β−ガラクトシダーゼ
またはこれを産生する微生物を含有する発酵乳。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酸性領域に至適pH
を有する新規なβ−ガラクトシダーゼ、その製造方法、
及び該β−ガラクトシダーゼを含有する発酵乳等に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】β−ガラクトシダーゼ（β−galactosid
ase）は、乳糖（ラクトース）の分解反応及び分解によ
り生ずる単糖の転移反応を触媒する酵素である。また、
その中には、リソソームにおけるガングリオシド糖鎖末
端の分解に関与するものもあり、これは特に動物由来の
ものにおいて顕著である。このβ−ガラクトシダーゼは
いわゆるラクターゼとは異なる酵素であり、このような
β−ガラクトシダーゼのリソソームでの先天性欠陥がヒ
トの先天性代謝異常症であるＧ_M1ガングリオシド蓄積症
の原因となっている。

【０００３】β−ガラクトシダーゼは種々の用途に利用
されている。例えば、アスペルギルス・オリゼ（Asperg
illis oryzae）やストレプトコッカス・サーモフィルス
（Streptococcus thermoplilus）等由来のβ−ガラクト
シダーゼは、ラクターゼ活性を利用したオリゴ糖の製造
に使用されている。またその他にも乳製品へ応用するこ
とにより、乳糖不耐症（乳糖吸収不全症）のヒトにも飲
用しやすい乳製品を製造する試みもなされている。ここ
で、乳糖不耐症とは腹部の膨満感、腹痛、ひどい場合は
下痢などの症状を伴うものであり、成人の牛乳離れのひ
とつの原因と考えられているものである。

【０００４】乳糖不耐症者の飲用を促進する試みとし
て、近年では、あらかじめ乳糖を分解し、乳糖含量の低
い乳製品の製造、販売等が行われている。乳糖含量の低
い乳製品の製造方法としては、例えば特開平２−３０３
４５０号公報に開示されている方法がある。この方法は
特定濃度の還元脱脂乳をβ−ガラクトシダーゼで処理す
ることで乳糖の分解、転移反応を行い、オリゴ糖を形成
させるものである。こうして調製された牛乳は、乳糖が
オリゴ糖に置き換わっているため、乳糖不耐症のヒトで
も問題なく飲用できるのである。

【０００５】一方、発酵乳のように、細菌類が生きたま
まの状態で含有されている製品では、製品中においても
乳酸菌や酵母等の微生物由来のβ−ガラクトシダーゼが
生産されている。このため、製品保存時にも乳糖含量が
低下し、牛乳等と比較すると、乳糖不耐症改善効果があ
るといわれている。しかしながら、微生物の中でもβ−
ガラクトシダーゼ産生能を有さないものも存在するた
め、このような微生物を含有する製品では上記のような
効果は認められない。このため、β−ガラクトシダーゼ
産生能を有さない微生物を使用している発酵乳等に対し
ては、β−ガラクトシダーゼの添加、あるいは該菌株へ
のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の導入等の試みにより、
乳糖不耐症改善効果が得られるものと期待される。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、現在見
出されている細菌由来のβ−ガラクトシダーゼの至適pH
は６〜７程度の中性付近にあるため、発酵乳等の酸性食
品中では高い活性は期待できない。また、至適pHが酸性
領域に存在していても、産生する微生物の種類によって
遺伝子導入のし易さ等が異なる。このため、発酵乳製品
等の中でも活性が高く、使用されている微生物への導入
等にも好適な新規のβ−ガラクトシダーゼの発見が望ま
れている。

【０００７】従って、本発明は、発酵乳等低pHの組成物
中でも好適に使用でき、製品の安定性等に支障をきたさ
ない新規のβ−ガラクトシダーゼを提供することを目的
とする。またかかるβ−ガラクトシダーゼの製造方法、
該β−ガラクトシダーゼを用いた発酵乳を提供すること
をも目的とする。さらにかかるβ−ガラクトシダーゼを
コードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えプラスミ
ド、及び該プラスミドで形質転換された微生物を提供す
ることをも目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成すべく鋭意研究した結果、従来β−ガラクトシダー
ゼ産生能を有しないと考えられていたラクトバチルス・
カゼイ（Lactobacillus casei）が、至適pHが酸性領域
にあるβ−ガラクトシダーゼを産生することを見出し
た。またかかるβ−ガラクトシダーゼが遺伝子組換え技
術を用いて得られることを見出した。さらにかかるβ−
ガラクトシダーゼを用いて発酵乳を製造することができ
ることを見出した。

【０００９】すなわち本発明は、配列番号１もしくは配
列番号２で表されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配
列の１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは
付加されたアミノ酸配列を有するβ−ガラクトシダー
ゼ、該β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、該遺
伝子を含有する組換えプラスミド、該組換えプラスミド
で形質転換された微生物、該β−ガラクトシダーゼ産生
能を有する微生物を培養し、採取する該β−ガラクトシ
ダーゼの製造方法、及び該β−ガラクトシダーゼまたは
これを産生する微生物を含有する発酵乳を提供するもの
である。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のβ−ガラクトシダーゼは
配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列ま
たは該アミノ酸配列の１個もしくは数個のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するもの
であり、かかる欠失、置換または付加の程度は、β−ガ
ラクトシダーゼ活性を有するものであれば特に制限され
ない。

【００１１】本発明のβ−ガラクトシダーゼは、β−ガ
ラクトシド結合を特異的に切断する酵素であり、至適pH
が好ましくは酸性領域、より好ましくは約４．３５〜
５．０に存するものである。これにより発酵乳等の酸性
食品中でもβ−ガラクトシダーゼ活性を発揮することが
できる。また至適温度は３５〜４０℃であることが好ま
しく、３７℃であることが特に好ましい。本酵素のサブ
ユニットあたりの分子量は約６７〜６８キロダルトンで
ある。

【００１２】本発明のβ−ガラクトシダーゼは、該β−
ガラクトシダーゼを産生する微生物を培養し、該培養物
から採取することができる。ここで、β−ガラクトシダ
ーゼを産生する微生物としては、例えばラクトバチルス
・カゼイＡＴＣＣ３９３株、ラクトバチルス・カゼイＦ
ＥＲＭ ＢＰ−１３６６株、及び前記β−ガラクトシダ
ーゼをコードする遺伝子を含有する組換えプラスミドで
形質転換された微生物が挙げられる。

【００１３】本発明はまたかかるβ−ガラクトシダーゼ
をコードする遺伝子を提供するものであり、これは例え
ば以下の常法にしたがって採取することができる。すな
わち、β−ガラクトシダーゼを産生する菌株、例えば前
記ラクトバチルス・カゼイＡＴＣＣ３９３株またはラク
トバチルス・カゼイＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６株のＤＮ
Ａを多種類の制限酵素で切断し、得られた断片をプラス
ミドベクターに挿入して本発明の組換えプラスミドを構
築する。これを用いて形質転換体を作成し、β−ガラク
トシダーゼ活性の検出された形質転換体中から本発明の
β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を採取する。
このときかかるβ−ガラクトシダーゼ活性の検出された
形質転換体中の挿入断片を、さらに他のプラスミドベク
ターに挿入して本発明の組換えプラスミドとし、以下同
様の手段を施すことにより、β−ガラクトシダーゼをコ
ードする遺伝子を容易かつ大量に採取することができ
る。組換えプラスミドに用いるプラスミドベクターとし
ては、例えばｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＴｒｃ９
９Ａ等が挙げられる。また形質転換する微生物として
は、例えば大腸菌Ｋ−１２、ＪＭ１０８、ＭＶ１１８４
等も挙げられるが、発現用の宿主としては例えばラクト
バチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプト
コッカス属細菌、ラクトコッカス属細菌等の乳酸菌、及
びビフィドバクテリウム属細菌等が好ましい。

【００１４】あるいはβ−ガラクトシダーゼを産生する
菌株の全ＤＮＡを各種制限酵素にて分解して電気泳動
し、ｌａｃＢ遺伝子のコードされているプラスミド断片
をプローブとしてハイブリダイゼーションすることによ
りＤＮＡを調製し、その後上記と同様にしてβ−ガラク
トシダーゼをコードする遺伝子を採取することができ
る。

【００１５】かかる遺伝子の塩基配列は、上記遺伝子及
びその欠失体から常法にしたがって解析することができ
る。本発明において、上記β−ガラクトシダーゼをコー
ドする遺伝子は配列番号３または配列番号４で表される
ものであることが好ましく、このうち１個または数個の
塩基が置換、欠失または付加されていてもよい。

【００１６】上記の菌株または形質転換体の培養条件
は、該菌株の性質に従って、決定すればよい。

【００１７】上記で得られた培養物からβ−ガラクトシ
ダーゼを精製する方法としては特に制限はないが、例え
ば以下の方法により行うことができる。すなわちまず、
細胞膜をリゾチームや超音波処理等により破砕し、遠心
分離して上澄みをimmobilized APTG Column(MoBi Tec社
製) にて分画し、得られた活性画分を濃縮した。その後
濃縮画分をポリアクリルアミド電気泳動に供し、次いで
β−ガラクトシダーゼ部分を切り出して電気的抽出、さ
らに等電点電気泳動にて同様の抽出を行うことによりβ
−ガラクトシダーゼを精製することができる。また、工
業的には、細胞破砕後の溶出画分を、一般的なカラムク
ロマトグラフィー等の方法により精製することができ
る。

【００１８】こうして得られたβ−ガラクトシダーゼ
は、至適pHが酸性領域にあるため、ヨーグルトやチーズ
等の発酵乳製品に用いることができる。発酵乳製品に用
いるβ−ガラクトシダーゼは、特に精製する必要はな
く、例えば細胞破砕液をそのまま使用してもよい。さら
に上記で得られた形質転換された微生物を添加してもよ
い。β−ガラクトシダーゼの製品への添加時は、製品の
発酵前、発酵中、あるいは発酵終了後のいずれであって
もよい。

【００１９】

【実施例】次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。

【００２０】実施例１ ラクトバチルス・カゼイＡＴＣＣ３９３株からのβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の探索 （１）使用菌株 ｌａｃＢ遺伝子源として、ラクトバチルス・カゼイＡＴ
ＣＣ３９３株より抽出した全ＤＮＡを用いた。クローニ
ング及びシークエンシングの宿主として大腸菌Ｋ１２Ｊ
Ｍ１０８を用いた。これは, recA1, endA1, gyrA96, th
i, hsdR17, supE44, relA1, Δ(lac-proAB) の遺伝子型
を有し、米国New Jersey州立大学のMessing 博士より分
与された。

【００２１】（２）ＤＮＡ操作、クローニング及び形質
転換 ＤＮＡの一般的操作法は、Sambrookらのマニュアル（Sa
mbrook, J., E. F. Frltsch, and T. Manlatis. 1989.
Molecular Cloning ；a laboratory manual. 2nd ed. C
old spring Harbor Laboratory press, New York. ）に
従った。酵素はメーカーの指示に従って使用した。ベク
ターとしては、大腸菌用のｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９
及びpH４６１１を用いた。大腸菌の形質転換は、Hanaha
n（Hanahan, D. 1983. Studies on transformation of
Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 16
6：557-580）のＬｂＣｌ₂−ＣａＣｌ₂法によった。

【００２２】（３）プライマーの作製と精製 アプライドバイオシステム社（ＡＢＩ）社製ＤＮＡ syn
thesizer Model 380Bにて作製した。精製はファルマシ
アバイオテク社（Pharmacia Biotech）社製のColumns P
D-10 Sephadex G-25Mを用いてその使用法に基づいて行
った。

【００２３】（４）β−ガラクトシダーゼ遺伝子のクロ
ーニング ラクトバチルス・カゼイＡＴＣＣ３９３株の全ＤＮＡを
Ｓａｕ３Ａで部分消化したものをショ糖に密度勾配遠心
法により分画し、４〜１０kb. の画分を集めたものをＢ
ａｍＨ１消化の後脱リン酸化したベクターpH４６１１に
挿入し、大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０８に形質転換した。テト
ラサイクリン耐性かつＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドイル−β−ガラクトシド）存在化で青
色を呈するコロニーを得た。その大腸菌が有するプラス
ミドをｐＬＣ１と命名した。

【００２４】（５）塩基配列の決定 次に、このβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現し活性を
示すために必要な２．９kbのＳａｃII−ＦｓｐＩ断片の
末端を平滑化し、ｐＵＣ１１９のＳｍａＩサイトに連結
することにより組換えプラスミドｐＬＣ２００（図１−
（ａ）参照）を得た。同様にｐＵＣ１１８ベクターのＳ
ｍａＩサイトにＭ１３プライマーに順方向にＳａｃII−
ＦｓｐＩ断片を挿入した組換えプラスミドｐＬＣ３００
（図１−（ｂ）参照）と逆方向にＳａｃII−ＦｓｐＩ断
片を挿入した組換えプラスミドｐＬＣ４００（図１−
（ｃ）参照）を得た。また、得られたｐＬＣ３００とｐ
ＬＣ４００より、宝社製キロシークエンス用ディレーシ
ョンキット（Kilo-sequence用Deletion Kit）を使用し
て欠失体を多数取得した。取得した各欠失体と欠失の大
きさを表１に示した。

【００２５】

【表１】

【００２６】ｐＬＣ２００及びｐＬＣ３００，ｐＬＣ４
００より取得した欠失体について、その一本鎖ＤＮＡサ
ンプルを調製してアプライドバイオシステム社（ＡＢ
Ｉ）社製ＤＮＡ sequencer Model 373A を用いた蛍光色
素法により塩基配列を決定した。酵素反応にはアプライ
ドバイオシステム社（ＡＢＩ）社製タックダイプライマ
ーサイクルシークエンシングキット（Taq DyePrimer Cy
cle Sequencing Kit）（Universal primerの場合）、及
びタックダイデオキシターミネーターサイクルシークエ
ンシングキット（Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequ
encing Kit）（合成 primer の場合）を使用した。ＰＣ
Ｒ反応はホエイ社（HOEI SCIENCE Co.）製サーマルサイ
クラーモデル（thermal cycler Model）ＴＣ１００を使
用した。この方法により明確に塩基配列を決定できなか
った部分については、合成プライマーを用いてＲＩを用
いたサンガー（Sanger）法にて決定した。作製した合成
プライマーは表２に示した。

【００２７】

【表２】

【００２８】ＤＮＡの標識には、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ
を使用し、“Sequenase R Ver. 2.0, Step-by-step pro
tocols”（ＵＳＢ社製）に従って調製し、それを“Hydr
o-Link TM（Long Ranger）”（AT Biochem社製）ゲルを
使用して解析した。その結果、ＳａｃII−ＦｓｐＩ断片
の２８４１塩基対の塩基配列を完全に決定した。塩基配
列、アミノ酸配列の解析には遺伝情報処理ソフトウエア
ＳＤＣ−ＧＥＮＥＴＹＸ及びＳＤＣ−ＣＤ−ＲＯＭを用
いＳＷＩＳＳ−ＰＯＲＴ Ｒｅｌ．２２のプロテインシ
ークエンスデータベース（ＳＤＣソフトウエア開発株式
会社）を使用した。

【００２９】（６）結果 決定した２８４１塩基対の中にコンピューター検索によ
り一つの完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）とその上流にＦｓｐＩ側が不足しているＯＲＦが見
いだされた（図２）。前者はヒトの酸性β−ガラクトシ
ダーゼと相同性がありＯＲＦが完結していることから、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子と考えられ、この遺伝子を
ｌａｃＢ、推定生産物をＬａｃＢと命名した。ｌａｃＢ
の開始可能コドンとしては数字の小さい方から８２５
（ＧＴＧ）、８４６（ＡＴＧ）、８７６（ＡＴＧ）番目
の塩基より始まるもの等があり全て開始コドンとして使
用されている可能性がある。中でも、８４６番目のＡＴ
Ｇの１０塩基程度上流には、プリン塩基が並んでいるの
が見いだされ、遺伝子発見の翻訳段階で必要なリボソー
ムバインディングサイトと考えられた。さらにその上流
にはプロモーターと考えられる配列も見つけられた。こ
れらのことから８４６番目のＡＴＧが開始コドンとして
使用されている可能性が高いと考えられた。この場合の
分子量は６８，０００．４８と計算された。

【００３０】β−ガラクトシダーゼをコードする（上記
塩基対において８４６番目からのＡＴＧを開始コドンと
した）遺伝子の配列は配列番号３に示す通りである。ま
た推定されるアミノ酸配列は配列番号１で表されるもの
である。さらに図３〜６は、上記２８４１塩基対からな
るＳａｃII・ＦｓｐＩフラグメントの全塩基配列及びコ
ドンに対応するβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸をコド
ン直下に記載したものである。

【００３１】（７）β−ガラクトシダーゼの粗酵素液の
調製 （４）で得られたプラスミドｐＬＣ１を有する大腸菌Ｋ
１２ＪＭ１０８形質転換体を５倍濃縮し、次いでトルエ
ン処理して粗酵素液とした。かかる粗酵素液中のβ−ガ
ラクトシダーゼの至適pHは４．８であった。

【００３２】実施例２ ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９株（ＦＥＲＭ−
ＢＰ−１３６６株）からのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
の探索 （１）使用菌株 β−ガラクトシダーゼ遺伝子源としてラクトバチルス・
カゼイＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６株を用いた。本菌株は
当研究所菌株保存室より分与された。クローニングの宿
主として大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０８を用いた。両菌株は宝
酒造より入手した。

【００３３】（２）ＤＮＡ操作、クローニング及び形質
転換 ＤＮＡ操作、クローニング及び形質転換は実施例１と同
様に行った。

【００３４】（３）サザンハイブリダイゼーションによ
るβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の検索 ラクトバチルス・カゼイＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６株の
全ＤＮＡを各種制限酵素にて完全分解したものをアガロ
ースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに毛管現
象を利用して転写した。転写後のナイロンメンブレンは
サザンハイブリダイゼーションに供した。サザンハイブ
リダイゼーションの方法は常法に従った。なおプローブ
にはｌａｃＢ遺伝子のコードされているｐＬＣ３００の
２．９kb（ＳａｃＩ−ＳａｌＩ）断片を用い、アマシャ
ム（Amersham）社製のマルチプライムＤＮＡラベリング
キット（Multiprime DNA labeling Kit）を使用して³²
Ｐ標識を行った。

【００３５】（４）クローニング及び形質転換法 サザンハイブリダイゼーションによるβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の検索結果から、分解物をラクトバチルス・
カゼイＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６株の全ＤＮＡをＢａｎ
IIで完全に消化した分解物をアガロースゲル電気泳動に
供した。アガロースゲルから３．８kb付近のＤＮＡ断片
群を切り出し、ジーンクリーン（Gene Clean）を用いて
精製した。発現ベクターにはファルマシアバイオテク社
（Pharmacla Biotech）製のｐＴｒｃ９９Ａを用い、Ｓ
ａｃＩ消化した本ベクターをＣＩＰ処理した後、上記の
３．８kb付近のＢａｎII消化ＤＮＡ断片とライゲーショ
ン反応を行った。ライゲーション反応後液は、大腸菌Ｋ
１２ＪＭ１０８の形質転換に使用した。大腸菌Ｋ１２Ｊ
Ｍ１０８の形質転換は、Hanahan（Hananan, D. 1983. S
tudies on transformation of Escherichia coli with
plasmids. J. Mol.Biol. 166 ；557-580）の方法に従っ
た。形質転換体の検出には通常のＬ−ｐｌｅｔｅにＸ−
ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β
−ガラクトシド）を１００micro g／mlの濃度になるよ
うに加え、β−ガラクトシダーゼの分解により生じるコ
ロニーの青色を観察した。

【００３６】（５）β−ガラクトシダーゼ活性測定及び
タンパク質濃度測定法 β−ガラクトシダーゼ活性の測定はMillerの方法（Mill
er, J. H. Assay ofβ−galactosidase. In Experiment
s in Molecular Genetics, p352-355(1972)）に従っ
た。反応にはMclvain 緩衝液（pH４．５）を用い、ＯＮ
ＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド）の
分解活性を３４０nmで測定した。１分間に１mMのＯＮＰ
Ｇを分解できる酵素量を１unitとした。またタンパク質
量の測定はバイオラッド社製のプロテインアッセイキッ
トを使用した。

【００３７】（６）発現したβ−ガラクトシダーゼの精
製 高いβ−ガラクトシダーゼ活性を有する大腸菌Ｋ１２Ｊ
Ｍ１０８の湿菌体約２ｇを３mlの１０mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液pH６．０に懸濁し、リゾチームを加え３〜５分
間３７℃で保温した後、氷冷下で３分間、３回の超音波
破砕を行った。破砕液を６５００rpm にて１０分間遠心
分離を行い、その上清約３mlをあらかじめ１０mMリン酸
ナトリウム緩衝液pH６．０で平衡化しておいたイモビラ
イズド（Immobilized）ＡＰＴＧ column（Mo Bi Tec 社
製）に添加した。１０mMリン酸ナトリウム緩衝液pH６．
０で洗浄した後、５mlの１００mM ＮａＣｌを含む同緩
衝液及び５mlの１００mMホウ酸ナトリウム緩衝液pH１
０．０にて溶出した。溶出画分を１００mM ＨＣｌにてp
H５．０に調整した後、１０Krpmにて１０分間遠心分離
を行い沈殿を除去した。得られた上清をセントリザルト
（Centrisalt）１（ザルトリウス社製、10,000cut of
f）を用いて濃縮し、７．５％ネイティブ（Native）−
ＰＡＧＥに供した。泳動後のアクリルアミドゲルの一部
をクマシーブリリアントブルーＲ２５０染色を行い、β
−ガラクトシダーゼ蛋白質の位置を特定した後、カッタ
ーを用いてβ−ガラクトシダーゼ蛋白質部分を切り出し
た。切り出したアクリルアミドゲルとＮａｔｉｖｅ−Ｐ
ＡＧＥの泳動用緩衝液を１０倍に薄めた溶液を１０，０
００cut off の透析チューブに入れ、同緩衝液を満たし
た電気泳動層の中央に配置した。１０mV、2h. 泳動後、
透析チューブ中の緩衝液を回収し、部分精製β−ガラク
トシダーゼとした。また部分精製β−ガラクトシダーゼ
を等電点電気泳動に供し、前述の回収法と同様に等電点
電気泳動後のゲルから回収を行い、精製β−ガラクトシ
ダーゼとした。なお、等電点電気泳動はファルマシアバ
イオテク（Pharmacia Biotech）社製のアンフォライン
（Ampholine）ＰＡＧｐｌａｔｅ（pH３．５〜９．５）
を、添付のマニュアルに従って使用した。

【００３８】（７）β−ガラクトシダーゼの諸性質の検
討 精製酵素についてサブユニットの分子量及び等電点をそ
れぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動により測定し
た。また、部分精製酵素を用いてその至適pH及び基質特
異性を測定した。至適pHの測定にはpH３．５から６．９
までのMclvain緩衝液を用いた。基質特異性の検討では
合成基質ではｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシ
ド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシド、ｏ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−フコシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノ
シド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロシドについ
て、さらに天然基質としてラクトース、ラクチュロー
ス、セロビオースについて検討した。合成基質について
は反応により遊離されるｏ−ニトロフェノールまたはｐ
−ニトロフェノールを４２０nm、４００nmの吸光度を測
定することにより、酵素活性を求めた。またラクトー
ス、ラクチュロースは反応により生じるガラクトースを
ベーリンガーマンハイム社製のＦキットを用いて測定
し、酵素活性を算出した。また、セロビオースは反応に
より生じるグルコースを和光純薬工業社製のグルコース
テストＢワコーを用いて測定し、酵素活性を算出した。

【００３９】（８）塩基配列の決定及び解析 塩基配列の決定を行うために、宝酒造社製のデレーショ
ンキットを用いてｐＹＬＣ７−１の欠失体を順鎖方向に
１セット作成し、１５株のデレーションミュータントを
得た。各デレーションミュータントより調製したプラス
ミドを鋳型として、ｐＴｒｃ９９Ａの塩基配列から作成
したSence Primerを用いて塩基配列の決定を行った。塩
基配列の決定にはボクスイブラウン社製のサイクルシー
クエンシングキット（Cycle Sequencing Kit）を使用し
た。逆鎖の塩基配列の決定は、順鎖の塩基配列から推定
されるSence Primerを複数作成しｐＹＬＣ７−１を鋳型
として、順鎖と同様の方法により行った。なお決定した
塩基配列の解析はＳＤＣ−ＧＥＮＥＴＩＸ（ＳＤＣソフ
トウエア開発株式会社）を使用した。

【００４０】（９）結果 β−ガラクトシダーゼ遺伝子の検索とクローニング β−ガラクトシダーゼ活性を示す青色に呈色した検体１
２株を、それぞれシングルコロニーアイソレーションに
より分離した後、保有するプラスミドを検討した結果、
いずれも同一の約４．０kbの挿入断片を有することが明
らかとなり、その組換えプラスミドをｐＹＬＣ７−１と
命名した。

【００４１】β−ガラクトシダーゼの発現 ｐＹＬＣ７−１を有する大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０８株とプ
ラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａのみを有する大腸菌Ｋ
１２ＪＭ１０８株のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し
たところ、ｐＹＬＣ７−１を有する株においてプラスミ
ドベクターのみの株に比べ約８倍高い活性が観察された
（表３参照）。

【００４２】

【表３】

【００４３】このことからｐＹＬＣ７−１上にβ−ガラ
クトシダーゼをコードする遺伝子配列が存在し、大腸菌
内で発現していることが明らかとなった。また、タック
プロモーターの誘導物質であるＩＰＴＧを培養液中に添
加してもその活性上昇が見られなかったことから、挿入
断片中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は断片中に存在す
るプロモーターを利用していると推察された。

【００４４】β−ガラクトシダーゼの精製及び諸性質の
検討 本酵素のサブユニットあたりの分子量は約６７キロダル
トンであり、等電点（pI）は約４．３５であった。ま
た、本酵素反応の至適pHは約４．４であり、至適温度は
約３７度であった。また基質特異性の検討から（表４参
照）、本酵素はβ−ガラクトシド結合を特異的に切断す
る酵素であることが示唆された。

【００４５】

【表４】

【００４６】塩基配列の決定 クローニングされた約４．０kbの断片のうちβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子とその下流域を含む３，６３９bpの塩
基配列を決定した。コンピュータによる解析から、本配
列中に４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
を見いだした（図９参照）。そのうち最も上流に位置す
るＯＲＦはｌａｃＢと遺伝子配列で７６％、アミノ酸配
列で８６％と非常に高い相同性を示した。また、ｌａｃ
Ｂの遺伝子解析結果と同様にヒトやマウス由来の酸性β
−ガラクトシダーゼとも高い相同性を示した。これらの
ことから本ＯＲＦはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と推定
された。β−ガラクトシダーゼ遺伝子の上流にはＳＤ配
列とプロモーター配列が見いだされた。予想されるアミ
ノ酸配列から、本酵素は５９８残基のアミノ酸からなる
分子量６７，５６５．１３Ｄａ．の蛋白質であることが
推定され、精製酵素の値と非常に近い結果となった。ま
たβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の下流にはホスホトラン
スフェラーゼ系の構造遺伝子が存在することが推定され
る。

【００４７】

【発明の効果】本発明のβ−ガラクトシダーゼは、至適
pHが酸性領域にあるため、発酵乳等の酸性食品に添加し
てもβ−ガラクトシド結合切断活性が高いものである。
かかる乳糖分解反応により解糖系の基質となる糖分子数
が増加するため、解糖の速度が上昇して微生物の増殖、
代謝産物の生成が向上すると考えられる。また乳糖分解
反応により、乳糖不耐症改善効果を期待することができ
る。また本発明のβ−ガラクトシダーゼを有する微生物
に対しては、セルフクローニング等の遺伝子組換え技術
を用いて、そのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現を増強
することもできる。また本発明のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子は、ヒトやマウスの細胞内に存在し、酸性の条件
でＧ_M1ガングリオシドやケラタン硫酸末端のβ−ガラク
トシド結合の加水分解を行う酸性β−ガラクトシダーゼ
に類似の構造を持つことがわかっている。この酵素は、
Ｇ_M1ガングリオシド末端糖鎖の分解に関与し、遺伝的な
欠失や酵素活性低下によってＧ_M1ガングリオシド蓄積症
が引き起こされる。そのため、本発明のβ−ガラクトシ
ダーゼを利用すれば、Ｇ_M1ガングリオシド蓄積症の治療
等の効果も期待できる。また、本発明のβ−ガラクトシ
ダーゼは、酸性領域下でβ−ガラクトシド結合を特異的
に切断するため、糖鎖構造の改変や分析等に利用するこ
とができる。

【００４８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５９８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Lactobacillus Casei 株 名：ATCC393 配列 Met Thr Thr Phe Ser Ile Glu His Asp Phe Met Leu Asp Gly Lys Pro 5 10 15 Phe Lys Ile Leu Ser Gly Ala Ile His Tyr Phe Arg Val His Pro Asp 20 25 30 Asp Trp Tyr His Ser Leu Tyr Asn Leu Lys Ala Leu Gly Phe Asn Thr 35 40 45 Val Glu Thr Tyr Val Pro Trp Asn Leu His Glu Tyr Arg Glu Gly Glu 50 55 60 Phe Asp Phe Ser Gly Ile Leu Asp Ile Glu His Phe Leu Asp Val Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Ala Ile Val Arg Pro Ser Pro Tyr Ile Cys 85 90 95 Pro Glu Trp Glu Phe Gly Gly Phe Pro Ala Trp Leu Leu Thr Lys Ser 100 105 110 Met Arg Leu Arg Thr Asp Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ala Ile Asp Arg 115 120 125 Tyr Tyr Ala Ala Leu Met Pro His Leu Val Asn His Gln Val Thr His 130 135 140 Gly Gly Asn Val Leu Met Met Gln Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Tyr 145 150 155 160 Gly Glu Asp His Asp Tyr Leu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Met Lys Lys 165 170 175 His Gly Val Asp Val Pro Leu Phe Thr Ser Asp Gly Pro Trp Pro Ala 180 185 190 Thr Leu Asn Ala Gly Ser Met Ile Asn Asp Gly Ile Leu Ala Thr Gly 195 200 205 Asn Phe Gly Ser Ala Ala Asp Lys Asn Phe Asp Arg Leu Ala Ala Phe 210 215 220 His Gln Ala His Gly Gln Asp Trp Pro Leu Met Cys Met Glu Phe Trp 225 230 235 240 Asp Gly Trp Phe Asn Arg Trp Gly Glu Pro Ile Ile Arg Arg Asp Pro 245 250 255 Asp Glu Thr Ala Glu Asp Leu Arg Ala Val Ile Glu Arg Gly Ser Val 260 265 270 Asn Leu Tyr Met Phe His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Phe Met Asn Gly 275 280 285 Thr Ser Ala Arg Lys Asp His Asp Leu Pro Gln Val Thr Ser Tyr Asp 290 295 300 Tyr Asn Ala Pro Leu Asn Glu Gln Gly Asn Pro Thr Pro Lys Tyr Phe 305 310 315 320 Pro Ile Gln Lys Met Leu His Glu Val Leu Pro Asp Ile Gln Gln Ala 325 330 335 Glu Pro Leu Val Lys Pro Thr Leu Ala Pro Ala Glu His Pro Leu Thr 340 345 350 Ala Lys Val Ser Leu Phe Ala Val Leu Asp Gln Leu Ala Lys Pro Val 355 360 365 Ala Ala Ala Tyr Pro Gln Thr Gln Glu Phe Leu Gly Gln Tyr Thr Gly 370 375 380 Tyr Thr Leu Tyr Arg Ala Gln Pro Leu Ile Ser Gly Thr Asp Lys Gly 385 390 395 400 Thr Pro Ala Lys Leu Arg Val Ile Asp Ala Arg Asp Arg Ile Gln Ala 405 410 415 Tyr Leu Asp Gln His Trp Leu Ala Thr Gln Tyr Gln Glu Ala Ile Gly 420 425 430 Asp Asp Ile Leu Leu Pro Gln Val Glu Gly His His Gln Leu Asp Leu 435 440 445 Leu Val Glu Asn Met Ser Arg Val Asn Tyr Gly Ala Lys Ile Glu Ala 450 455 460 Ile Thr Gln Phe Lys Gly Ile Arg Thr Gly Val Met Val Asp Leu His 465 470 475 480 Phe Ile Lys Gly Tyr Gln Gln Tyr Pro Leu Asp Leu Asn Gln Ala Pro 485 490 495 Glu Leu Asp Phe Ser Lys Asp Trp Gln Pro Glu Thr Pro Ala Phe Tyr 500 505 510 Lys Tyr Thr Phe Asp Leu Thr Glu Pro His Asp Thr Tyr Leu Asp Cys 515 520 525 Arg Gly Phe Gly Lys Gly Val Met Leu Val Asn Gly Val Asn Val Gly 530 535 540 Arg Phe Trp Glu Lys Gly Pro Thr Leu Ser Leu Tyr Val Pro Ala Gly 545 550 555 560 Leu Leu His Ala Gly Gln Asn Glu Val Ile Val Phe Glu Thr Glu Gly 565 570 575 Arg Tyr Ala Glu Ser Leu Lys Met Ala Asp His Pro Ile Phe Glu Glu 580 585 590 Pro Asn Asn Glu Glu Glu 595

【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：５９８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Lactobacillus Casei 株 名：ＦＥＲＭ 配列 Met Thr Thr Phe Ser Ile Asp His Glu Phe Met Leu Asp Gly Gln Pro 5 10 15 Phe Lys Ile Leu Ser Gly Ala Ile His Tyr Phe Arg Val His Pro Ser 20 25 30 Asp Trp Tyr His Ser Leu Tyr Asn Leu Lys Ala Leu Gly Phe Asn Thr 35 40 45 Val Glu Thr Tyr Val Pro Trp Asn Leu His Glu Tyr Asn Glu Gly Asp 50 55 60 Phe Asp Phe Ser Gly Ile Leu Asp Ile Glu Arg Phe Leu Asn Thr Ala 65 70 75 80 Lys Asp Leu Gly Leu Tyr Ala Ile Aal Arg Pro Ser Pro Tyr Ile Cys 85 90 95 Ala Glu Trp Glu Phe Gly Gly Phe Pro Ala Trp Leu Leu Thr Lys Lys 100 105 110 Met Arg Leu Arg Thr Asp Asp Pro Ala Tyr Leu Gln Ala Ile Asp Arg 115 120 125 Tyr Tyr Thr Ala Leu Met Pro His Leu Val Gly His Gln Val Thr His 130 135 140 Gly Gly Asn Val Ile Met Met Gln Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Tyr 145 150 155 160 Gly Glu Asp Lys Asp Tyr Leu Ala Ala Val Ala Glu Leu Met Lys Lys 165 170 175 His Gly Val Asp Val Pro Leu Phe Thr Ser Asp Gly Pro Trp Pro Ala 180 185 190 Thr Leu Asn Ala Gly Ser Met Ala Asp Ala Gly Ile Leu Thr Thr Gly 195 200 205 Asn Phe Gly Ser Arg Ala Asp Met Asn Phe Asp Arg Leu Ala Ala Phe 210 215 220 Asn Gln Ala His Gly His Asp Trp Pro Leu Met Cys Met Glu Phe Trp 225 230 235 240 Asp Gly Trp Phe Asn Arg Trp Gly Glu Pro Ile Ile Arg Arg Asp Pro 245 250 255 Glu Glu Thr Ala Glu Asp Leu Arg Ala Val Ile Gln Arg Gly Ser Val 260 265 270 Asn Leu Tyr Met Phe His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Phe Met Asn Gly 275 280 285 Thr Ser Ala Arg Lys Asp His Asp Leu Pro Gln Val Thr Ser Tyr Asp 290 295 300 Tyr Asp Ala Pro Leu Asn Glu Gln Gly Asn Pro Thr Pro Lys Tyr Phe 305 310 315 320 Thr Ile Gln Lys Met Ile His Glu Val Leu Pro Ser Gln Ala Gln Thr 325 330 335 Thr Pro Leu Val Lys Pro Ala Met Arg Gln Ala Asp Asn Pro Leu Thr 340 345 350 Ala Lys Val Ser Leu Phe Ser Val Leu Asp Gln Leu Ala Gln Pro Val 355 360 365 Ala Ala Pro Tyr Pro Gln Thr Gln Glu Phe Leu Gly Gln Tyr Thr Gly 370 375 380 Tyr Thr Leu Tyr Arg Thr Asn Pro Leu Ile Ser Gly Thr Asp Lys Gly 385 390 395 400 Thr Pro Ala Lys Leu Arg Val Ile Asp Ala Arg Asp Arg Val Gln Ala 405 410 415 Phe Phe Asp Gly Lys Ser Leu Ala Thr Gln Tyr Gln Glu Ala Ile Gly 420 425 430 Asp Asp Ile Leu Leu Pro Glu Val Glu Gly Arg His Gln Leu Asp Leu 435 440 445 Leu Val Glu Asn Met Ser Arg Val Asn Tyr Gly Ser Lys Ile Glu Ala 450 455 460 Ile Thr Gln Phe Lys Gly Ile Arg Thr Gly Val Met Val Asp Leu His 465 470 475 480 Phe Ile Lys Asp Tyr Leu Gln Tyr Pro Leu Asp Leu Asn Lys Ala Pro 485 490 495 Gln Leu Asp Phe Thr Gly Asp Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ala Phe Tyr 500 505 510 Gln Tyr Gly Phe Asp Val Val Lys Pro Gln Asp Thr Tyr Leu Asp Cys 515 520 525 Arg Gly Phe Gly Lys Gly Val Met Leu Val Asn Gly Val Asn Ile Gly 530 535 540 Arg Phe Trp Gly Lys Gly Pro Thr Leu Ser Leu Tyr Val Pro Ala Gly 545 550 555 560 Leu Leu His Thr Gly His Asn Glu Val Ile Val Phe Glu Thr Glu Gly 565 570 575 Gln Tyr Ala Glu Ala Ile Asn Leu Val Asp His Pro Ile Phe Lys Glu 580 585 590 Leu Asn Thr Glu Glu Glu 595

【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：１７９４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：Lactobacillus Casei 株 名：ATCC393 配列 ATGACGACTT TTTCGATCGA GCATGATTTT ATGTTGGATG GCAAGCCGTT CAAGATCTTA 60 TCTGGCGCAA TTCATTACTT CCGGGTTCAT CCAGACGATT GGTATCACAG TTTGTATAAC 120 CTGAAAGCAC TGGGCTTCAA CACGGTTGAA ACGTATGTGC CATGGAACTT GCATGAGTAT 180 CGCGAAGGCG AGTTTGATTT CAGCGGCATT CTCGATATTG AACATTTTCT GGATGTGGCT 240 GAAGATCTTG GCCTGTACGC GATTGTTCGT CCGTCACCGT ATATTTGTCC CGAATGGGAA 300 TTCGGTGGTT TTCCGGCGTG GCTGTTGACC AAGTCCATGC GGTTGCGTAC CGATGATCCA 360 AATTATCTGC AAGCGATTGA TCGTTATTAT GCAGCGTTAA TGCCGCATCT GGTTAATCAT 420 CAAGTCACCC ATGGCGGCAA CGTCCTGATG ATGCAGGTGG AAAATGAGTA TGGCTCATAC 480 GGTGAAGACC ACGATTACCT AGCGGCGCTT GCCAAATTGA TGAAGAAACA CGGTGTCGAT 540 GTGCCGCTGT TCACCTCAGA CGGACCGTGG CCAGCAACGT TAAATGCCGG CAGTATGATC 600 AACGATGGTA TTCTGGCAAC CGGCAACTTT GGTTCGGCAG CCGATAAGAA CTTTGATCGG 660 TTGGCAGCAT TTCATCAGGC GCATGGTCAG GATTGGCCAC TCATGTGTAT GGAATTTTGG 720 GATGGCTGGT TTAACCGCTG GGGCGAACCG ATCATTCGCC GCGATCCTGA CGAAACGGCC 780 GAGGATCTGC GAGCGGTCAT TGAGCGCGGC AGTGTCAATC TCTACATGTT TCATGGTGGC 840 ACCAATTTCG GGTTCATGAA CGGTACCTCT GCACGTAAGG ATCACGACTT GCCTCAGGTG 900 ACCTCCTACG ATTATAACGC CCCGCTCAAT GAACAAGGCA ATCCTACCCC GAAGTATTTT 960 CCCATTCAAA AAATGCTTCA TGAAGTCTTA CCGGACATTC AGCAAGCCGA GCCGCTGGTT 1020 AAACCGACAC TGGCACCGGC TGAACATCCG CTGACGGCCA AGGTTTCGTT GTTTGCGGTG 1080 CTTGATCAAC TTGCTAAGCC GGTCGCAGCT GCTTATCCGC AAACCCAAGA GTTTTTGGGC 1140 CAGTACACGG GTTATACCTT GTATCGGGCG CAGCCGTTGA TTAGCGGCAC TGACAAAGGA 1200 ACGCCAGCTA AATTAAGGGT GATTGATGCC CGCGATCGGA TTCAAGCTTA TTTGGATCAG 1260 CACTGGTTGG CGACCCAATA TCAGGAAGCC ATAGGCGATG ATATTTTGTT GCCACAGGTT 1320 GAAGGCCATC ACCAGCTGGA TTTGCTGGTC GAAAACATGA GTCGGGTTAA CTACGGTGCC 1380 AAAATCGAGG CCATTACCCA GTTCAAAGGC ATTCGGACCG GTGTCATGGT TGACCTGCAT 1440 TTTATCAAAG GTTATCAGCA GTACCCGCTA GACTTGAATC AGGCGCCAGA ACTGGATTTT 1500 TCAAAAGATT GGCAGCCTGA AACGCCAGCG TTTTACAAAT ACACGTTTGA TCTGACAGAG 1560 CCGCATGATA CTTATCTGGA TTGTCGCGGA TTCGGTAAAG GAGTGATGCT GGTTAATGGT 1620 GTCAATGTCG GCAGGTTCTG GGAGAAAGGG CCCACGTTGT CACTGTATGT GCCAGCGGGA 1680 CTCCTGCATG CCGGACAAAA TGAGGTCATC GTGTTTGAAA CCGAAGGCCG CTATGCCGAA 1740 AGCTTGAAAA TGGCTGACCA CCCGATATTT GAAGAACCAA ATAATGAGGA GGAG 1794

【００５１】配列番号：４ 配列の長さ：１７９４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：Lactobacillus Casei 株 名：ＦＥＲＭ 配列 ATGACGACCT TTTCGATCGA TCATGAGTTT ATGTTGGACG GTCAGCCGTT CAAGATTCTG 60 TCTGGCGCG ATTCATTACTT CCGAGTCCAT CCCAGTGATT GGTATCACAG CCTTTATAAC 120 TTGAAGGCA CTGGGATTTAA CACGGTAGAA ACCTATGTCC CTTGGAATCT GCACGAGTAC 180 AACGAAGGT GACTTTGATTT CAGCGGGATT CTCGACATTG AACGCTTTCT AAACACCGCA 240 AAGGATCTT GGCTTATATGC CATCGTGCGA CCATCCCCTT ACATCTGCGC AGAATGGGAG 300 TTCGGCGGG TTTCCAGCATG GCTGTTAACG AAAAAGATGC GCTTGCGAAC CGACGATCCT 360 GCCTATCTG CAAGCGATTGA CCGATACTAC ACAGCTTTAA TGCCTCATCT TGTGGGTCAT 420 CAAGTCACG CATGGTGGCAA TGTCATCATG ATGCAAGTGG AAAATGAGTA CGGTTCATAT 480 GGCGAAGAC AAGGACTATCT TGCCGCCGTG GCCGAACTTA TGAAAAAGCA TGGCGTTGAT 540 GTCCCGCTT TTTACCTCGGA TGGTCCCTGG CCAGCAACCT TGAACGCTGG CAGCATGGCC 600 GACGCTGGT ATTTTGACTAC CGGCAATTTT GGCTCACGTG CCGACATGAA TTTCGATCGG 660 TTGGCGGCC TTCAATCAAGC TCATGGACAT GATTGGCCGT TGATGTGTAT GGAATTCTGG 720 GACGGCTGG TTCAACCGCTG GGGCGAACCG ATCATTCGCC GCGACCCAGA AGAAACTGCC 780 GAGGACTTG CGAGCGGTGAT CCAACGCGGC AGTGTCAATC TCTACATGTT CCACGGGGGA 840 ACTAATTTT GGCTTTATGAA CGGTACCTCA GCTCGCAAAG ATCATGATCT ACCGCAAGTG 900 ACTTCCTAC GATTACGATGC ACCATTGAAT GAGCAAGGCA ATCCAACGCC AAAGTACTTT 960 ACCATTCAG AAAATGATCCA CGAAGTCTTG CCATCGCAGG CCCAGACCAC ACCGCTGGTC 1020 AAGCCAGCG ATGAGGCAAGC GGACAATCCG TTGACGGCGA AAGTGTCATT ATTCTCAGTA 1080 CTTGATCAG CTAGCTCAGCC AGTAGCCGCA CCTTATCCGC AGACACAGGA GTTTCTTGGC 1140 CAATACACC GGTTATACGTT GTATCGAACA AACCCGCTGA TCAGTGGTAC CGACAAAGGC 1200 ACGCCGGCT AAGTTGCGCGT GATTGATGCC CGTGATCGGG TTCAAGCCTT CTTTGATGGC 1260 AAGTCGCTA GCAACACAGTA TCAAGAGGCC ATCGGCGATG ACATCCTGCT CCCAGAAGTT 1320 GAAGGCCGC CATCAACTAGA TCTGTTGGTC GAAAACATGA GCCGCGTCAA CTACGGCTCA 1380 AAAATCGAA GCGATTACCCA GTTTAAGGGA ATTCGCACCG GTGTCATGGT AGACCTCCAT 1440 TTCATTAAG GACTACCTGCA ATACCCACTT GACTTGAACA AGGCGCCGCA ACTTGATTTC 1500 ACCGGCGAT TGGCAAGCAGG GACACCCGCT TTTTATCAAT ATGGGTTTGA TGTGGTGAAA 1560 CAACAAGAT ACGTATCTTGA TTGTCGTGGA TTTGGTAAAG GAGTGATGCT GGTCAATGGT 1620 GTTAACATC GGCAGATTCTG GGGGAAGGGG CCAACGTTGT CACTATATGT GCCAGCCGGG 1680 TTGCTTCAC ACCGGGCACAA TGAGGTCATT GTTTTTGAAA CCGAAGGCCA ATATGCCGAG 1740 GCGATAAAC TTGGTTGACCA CCCAATATTT AAGGAACTGA ACACAGAGGA GGAA 1794

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において、ｐＵＣ１１８または１１９
のＳｍａＩサイトに、ＦｓｐＩ・ＳａｃＩＩフラグメン
トをクローニングし、組換えプラスミドｐＬＣ２００、
３００、及び４００を得る図である。

【図２】実施例１において、塩基配列を決定した２８４
１塩基対におけるＯＲＦの検索結果を示す図である。短
い線は開始コドン、長い線は終末コドンを示す。

【図３】実施例１において、２８４１塩基対からなるＳ
ａｃＩＩ・ＦｓｐＩフラグメントの全塩基対及びコドン
に対応するβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸をコドン直
下に記載した図である。推定されるプロモーターは破線
で示してある。

【図４】実施例１において、２８４１塩基対からなるＳ
ａｃＩＩ・ＦｓｐＩフラグメントの全塩基対及びコドン
に対応するβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸をコドン直
下に記載した図である。推定されるリボソームバインデ
ィングサイトは二重下線で、推定されるプロモーターは
破線で示してある。

【図５】実施例１において、２８４１塩基対からなるＳ
ａｃＩＩ・ＦｓｐＩフラグメントの全塩基対及びコドン
に対応するβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸をコドン直
下に記載した図である。

【図６】実施例１において、２８４１塩基対からなるＳ
ａｃＩＩ・ＦｓｐＩフラグメントの全塩基対及びコドン
に対応するβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸をコドン直
下に記載した図である。

【図７】実施例２において、塩基配列を決定した３６３
９塩基対におけるＯＲＦの検索結果を示す図である。短
い線は開始コドン、長い線は終末コドンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:245） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ▲高▼木 陽光 東京都港区東新橋１−１−19 株式会社ヤ クルト本社内 (72)発明者 森下 隆 東京都港区東新橋１−１−19 株式会社ヤ クルト本社内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１もしくは配列番号２で表され
   るアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の１個もしくは
   数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
   酸配列を有するβ−ガラクトシダーゼ。
2. 【請求項２】 至適pHが４．３５〜５．０である請求項
   １記載のβ−ガラクトシダーゼ。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載のβ−ガラクトシ
   ダーゼをコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 塩基配列が、配列番号３もしくは配列番
   号４で表される塩基配列、または該塩基配列の１個もし
   くは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配
   列を有するものである、請求項３記載のβ−ガラクトシ
   ダーゼをコードする遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項３または４記載のβ−ガラクトシ
   ダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えプラスミ
   ド。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換えプラスミドで形質
   転換された微生物。
7. 【請求項７】 請求項１または２記載のβ−ガラクトシ
   ダーゼ産生能を有する微生物を培養し、該培養物から採
   取することを特徴とする請求項１または２記載のβ−ガ
   ラクトシダーゼの製造方法。
8. 【請求項８】 請求項１または２記載のβ−ガラクトシ
   ダーゼまたはこれを産生する微生物を含有する発酵乳。