SE447661C - Subtilisinhaltig proteasprodukt med reducerad allergenicitet herledd ur bacillus licheniformis, forfarande for dess framstellning, tvettmedelskomposition innehallande densamma samt b. licheniformisstam nrrl b-11301, b-1 - Google Patents
Subtilisinhaltig proteasprodukt med reducerad allergenicitet herledd ur bacillus licheniformis, forfarande for dess framstellning, tvettmedelskomposition innehallande densamma samt b. licheniformisstam nrrl b-11301, b-1Info
- Publication number
- SE447661C SE447661C SE7905828A SE7905828A SE447661C SE 447661 C SE447661 C SE 447661C SE 7905828 A SE7905828 A SE 7905828A SE 7905828 A SE7905828 A SE 7905828A SE 447661 C SE447661 C SE 447661C
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- subtilisin
- protease
- concentrate
- serine protease
- component
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 title claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 title claims description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 title claims description 9
- 241000208465 Proteaceae Species 0.000 title 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 73
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 73
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 69
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 claims description 40
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 40
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 15
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 15
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 51
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L sodium sulphate Substances [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 5
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 5
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 4
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- ZBJVLWIYKOAYQH-UHFFFAOYSA-N naphthalen-2-yl 2-hydroxybenzoate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C=CC=C2)C2=C1 ZBJVLWIYKOAYQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 3
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 101000878457 Macrocallista nimbosa FMRFamide Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000005037 alkyl phenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- JYIMWRSJCRRYNK-UHFFFAOYSA-N dialuminum;disodium;oxygen(2-);silicon(4+);hydrate Chemical compound O.[O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Na+].[Na+].[Al+3].[Al+3].[Si+4] JYIMWRSJCRRYNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000011256 inorganic filler Substances 0.000 description 2
- 229910003475 inorganic filler Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 peroxy compound Chemical class 0.000 description 2
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 2
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- 229960001922 sodium perborate Drugs 0.000 description 2
- NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N sodium silicate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Si]([O-])=O NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M sodium;oxidooxy(oxo)borane Chemical compound [Na+].[O-]OB=O YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 2
- 229910002012 Aerosil® Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002016 Aerosil® 200 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 229910000503 Na-aluminosilicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 101150110390 Slc10a6 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 1
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 1
- IVXHBBLYDQMHHC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Na].[B] Chemical compound [Na].[Na].[B] IVXHBBLYDQMHHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 150000008055 alkyl aryl sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 150000004996 alkyl benzenes Chemical class 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007982 barbital buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920006184 cellulose methylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000003861 general physiology Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- HCWCAKKEBCNQJP-UHFFFAOYSA-N magnesium orthosilicate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] HCWCAKKEBCNQJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000391 magnesium silicate Substances 0.000 description 1
- 235000019792 magnesium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052919 magnesium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940105631 nembutal Drugs 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000429 sodium aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 235000012217 sodium aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 229940080237 sodium caseinate Drugs 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M sodium;5,5-diethylpyrimidin-3-ide-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCC1(CC)C([O-])=NC(=O)NC1=O RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POSZUTFLHGNLHX-KSBRXOFISA-N tris maleate Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)\C=C/C(O)=O POSZUTFLHGNLHX-KSBRXOFISA-N 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/836—Bacillus licheniformis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
15 20 25 30 35 447 661 5 5 2 betraktats såsom en inneboende olägenhet kopplad till använd- ningen av proteasprodukterna.
Hittills har ansträngningarna att minimera omfattningen av hypersensitiva reaktioner bland arbetskraft och konsumenter inriktats enbart mot åstadkommande av lågdammande partikelformiga, ex.vis granulära eller inkapslade proteasprodukter så att man reducerat risken för exponering för proteaset, både betr. arbets- kraft i anläggningar för framställningar av detergentenzym och tvättmedel och konsumenter av hushållstvättmedel. Framgången i sdessa strävanden återspeglar sig delvis i den fortsatt utsträckta hushâllsmässiga användningen av tvättmedel innehållande detergent- enzym.
Det är emellertid även känt, att framkallandet av aller- ,~ giska reaktioner kan vara mycket oförutsägbart och nyckfullt.
Det föreligger sålunda fortfarande ett behov av en kommersiell proteasberedning med allergeniska egenskaper, vilka är väsentligt nedbringade jämfört med hittills kända sådana beredningar.
Ett ändamål med föreliggande uppfinning är åstadkommande av en B. licheniformis-proteasprodukt med förminskad allergenicitet.
Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är åstad- kommande av en industriellt genomförbar process för framställning av en produkt med reducerad allergenicitet.
Uppnàendet av dessa ändamål baserar sig på vissa observa- tioner betr. beståndsdelarna i kommersiella proteasberedningar och deras egenskaper.
Nyligen publicerade undersökningar medelst kvalitativ (men högst känslig) immunoelektrofores (ex.vis enligt Grabar- Williams, vide R. Verbruggen et al, Biochim, Biophys, Acta, vol. 365 (1974), sia 108-114) anger att kommersieiic tiiigängiiga proteasprodukter, särskilt ALCALASE, är antigeniskt heterogena.
I senare studier publicerade av Verbruggen (Biochem.
J0UPn&l, V01- 151 (1975), sid 149-155) med tillämpning av tekniken med kvantitativ korsad agarosgelimmunoelektrofores visade det sig att huvudproteaskomponenten i AICAIASE bestående av en familj av subtilisinisoenzymer beledsagas av en proteinkomponent i mindre ' mängd, som skiljer sig antigeniskt från huvudproteaskomponenten.
Ett försök att ytterligare belysa sammansättningen av kommersiella proteasberedningar, vilket är tillämpbart även 1 preparativ laboratorieskala för fraktionering av sådana bered- 10 15 20 25 30 35 447 661 ningar, består i att utsätta det ur odlingsmediet utvunna proteas- koncentratet för jonbytarkromatografi. Sålunda kromatograferades ex.vis ett B.licheniformis-proteaskonoentrat (50 g) på en kolonn (5 x 55 cm) av karboximetyloellulosa (GMC, 500 g) som hölls vid 400 och bringats i jämvikt med en buffert av pH 6,5 bestående av 0,005 M tris(hydroximetyl)aminometan-(TRIS)-maleat och 0,002 M kaleiumacetat. Eluering utfördes med samma buffert under på- förande av en lineär natriumkloridgradient efter uppträdandet av den första toppen. Den optiska densiteten av fraktioner (20 ml) uppsamlade vid en flödeshastighet av 210 ml/h moníterades vid 280 nm. Kromatogrammet visas i fig. l av bilagda ritning.
Den huvudproteaskomponent, som utvanns ur poolade frak- tioner motsvarande toppen B av kromatogrammet, varvid toppen A är fronttoppen, identifíerades som subtilisin. Det antas, att biproteaskomponenten, som representeras av toppen C, är identisk med den biproteinkomponent som detekteras vid korsad immuno- elektrofores (vide supra) och som beskrivits såsom varande anti- geniskt skild från huvudkomponenten men ej på annat sätt karak- teriserad. Härefter benämnes den ovan identifierade biproteas- komponenten "komponent C". Komponent C har visat sig utgöra från ca 5 till oa 15% av Alcalasets totala proteasinnehåll.
Som ett sätt för ytterligare karakterisering utsattes subtilisinkomponenten och komponent C såsom de erhållits från poolade fraktioner motsvarande topparna B resp. C, för agaros- gelelektrofores. Elektroforesen utfördes i 0,075 M natrium- barbitalbuffert av pH 8,0 vid 1000 i 60 min. under användning av en spänningsgradient av 15 Vybm. Proven applicerades som 1% vikt/volym lösningar. elektroferogrammen anger, att under testbetingelserna subtilisin (position I) och komponent C (position II) uppvisar distinkt skilda katodiska migrationsvärden.
De i fig. 2 av bilagda ritning visade Dessutom anger elektroferogrammen, att eftersom båda pro- teaserna migrerar som bandmönster, varvid båda är sammansatta av ett huvudband åtföljt av långsammare vandrande sidoband, både subtilisinkomponenten och komponent C är multipla isoenzymsystem (Verbruggen, vide supra).
Inhibitionsstudier som anges senare i föreliggande fram- ställning har visat, att i motsats till subtilisin, komponent C 10 15 20 25 30 '35 447 661 . är ett non-serinproteas.
Föreliggande uppfinning baserar sig på upptäckten, att den allergeniska aktiviteten av subtilisinkomponenten är väsentligt lägre än den allergeniska aktiviteten av komponent C.
Enligt en sida av föreliggande uppfinning åstadkommes en proteasberedning lämplig för inblandning i tvättkompositioner, vilken innehåller ett av B. licheniformis härlett proteaskoncent- rat, och beredningen kännetecknas av att nämnda proteaskoncentrat som är stabiliserat av däri närvarande non-proteolytiska peptider härledda från odlingsmediet, är i huvudsak fritt från non-serin- proteas och uppvisar väsentligt reducerade allergeniska egenskaper jämfört med ett proteaskoncentrat som innehåller non-serinproteas.
I allmänhet är minst 99% av proteaskoncentratets proteo- lytiska aktivitet härlett från subtilisinisoenzymsystemet och innehåller minst ca 2% non-proteolytískt aktiva peptider.
Enligt en ytterligare sida av föreliggande uppfinning åstadkommas ett förfarande för framställning av ett proteaskon- centrat, som är lämpligt för införlivning i proteasberedningar avsedda för inblandning i tvättkompositioner, varvid nämnda pro- teaskoncentrat är i huvudsak fritt från non-serinproteas och upp- visar väsentligt reducerade allergeniska egenskaper jämfört med ett proteaskoncentrat som innehåller non-serinproteas, och för- farandet kännetecknas därav, att en stam av B. licheniformis muterad för att i huvudsak blockera dess förmåga att syntetisera andra proteaser än subtilisin, odlas i ett näringsmedium inne- hållande assimilerbara källor av kol, kväve och fosfor, åtföljt av utvinning av proteaskoncentratet innehållande subtilisin och av odlingsmediet härledda peptider.
Sådana utvinningsförfaranden är väl utvecklade inom tek- niken. Vanligen filtreras odlingsmediet, centrifugeras eller på annat sätt klarnas åtföljt av utfällning av proteaskoncentratet, ex.vis genom tillsats av ett vattenlösligt, oorganiskt salt, såsom natrium- eller ammoniumsulfat, eller genom tillsats av ett med vatten blandbart organiskt lösningsmedel, såsom etanol eller aceton. Fällningen kan tillvaratas på konventionellt sätt, såsom genom filtrering eller centrifugering.
Den fuktiga proteasfällningen kan torkas genom konven- En aktig torkningsprocess för användning i stor skala under kombi- tionella förfaranden, ex.vis under vakuum.- speciellt fördel- 10 15 20 30 35 447 661 nation av spraytorkning med ett efterföljande torkningssteg under flytbäddbetingelser avslöjas i brittiska patentet l 360 969.
Omvandling av det torkade enzymkoncentratet till en kommer- siell, partikelformig, làgdammande proteasberedning med förut- bestämd aktivitet kan utföras genom olika inom tekniken kända förfaranden. Ett förfarande beskrives i brittiska patentet l 338 249, vari i huvudsak sfäriska pärlor bildas av en blandning av proteaskoncentratet och ett vattendispergerbart, fast, vax- artat bindematerial, såsom en non-jonisk detergent. Här hänvisas även till brittiska patentet l 362 365, som avslöjar ett för- farande, varigenom en fuktad förblandning av enzymkoncentratet och ett fast utspädningsmedel, såsom natriumklorid, ev. i närvaro av ett bindemedel, ex.vis dextrin och/eller polyetylenglykol, extruderas och sedan sfäroidiseras, ex.vis medelst en apparat som saluföres under handelsnamnet MAUMERIZER, och slutligen torkas under flytbäddbetingelser.
Alt. kan en granulär enzymprodukt framställas genom det förfarande som beskrives i amerikanska patentet 4 106 991. En efterföljande beläggningsprocess kan ev. utföras för att ytter- ligare reducera den slutliga produktens dammningsegenskaper. Överdragning av den partikelformiga produkten utföres vanligen medelst smält vax, företrädesvis polyetylenglykol, ev. åtföljt av pulvrisering av bildad överdragen produkt med ett finfördelat färgämne, ex.vis TiO2 blandat med pulvriseringshjälpmedel.
Genom föreliggande uppfinning åstadkommes även mutant- stammar av B. lioheniformis blockerade betr. syntesen av kompo- nent C under bibehållande av förmågan att syntetisera subtilisin.
Dessutom àstadkommes genom föreliggande uppfinning en tvättkomposition innehållande en effektiv mängd av en proteas- produkt härledd av B. licheniformis som är i huvudsak fri från proteaskomponent C.
Förutom enzymet innehåller i allmänhet den kommersiella tvättmedelskompositionen enligt föreliggande uppfinning: a) Minst ett ytaktivt ämne, som kan vara anjoniskt, non- joniskt eller amfotärt, eller en vattenlöslig tvål.
Typiskt användes ett anjoniskt ytaktivt ämne (ex.vis ett lineärt alkylarylsulfonat) i blandning med ett non-joniskt ytaktivt ämne (ex.vis en alkylfenylpolyglykoleter) i mäng- l0 15 20 25 30 35 447 661 6 der av 5-30 resp. l-5 viktprocent av tvättkompositionen. b) . En eller.flera builders, företrädesvis med tillhörande komplexbildningsfunktion. Natriumtripolyfosfat, natrium- citrat, natriumsilikat och zeoliter är ex. på sådana föreningar, vanligen utgörande 10-70 viktprocent av detergentkompositionen. c) Ett blekmedel, företrädesvis en peroxiförening, såsom natriumperborat, typiskt införlivad i en mängd av upp till 50 viktprocent av kompositionen. d) Tillsatsmedel, såsom karboximetylcellulosa, optiska vit- medel och doftämnen. Om det är nödvändigt tillsättes ett pH-justeringsmedel, så att tvättmediet erhåller ett pH inom intervallet 8,0-10,5.
Den partikelformiga proteasberedningen enligt uppfinningen tillsättes i en mängd som är beräknad för att ge en proteasakti- vitet av minst 0,1 Anson-enheter (AU, vide infra), företrädesvis 0,5-2,0 AU per 100 g av tvättkompositionen. Om det är nödvändigt kan återstoden till 100% utgöras av ett oorganiskt fyllmedel, företrädesvis natriumsulfat.
Flytande detergentkompositioner kan framställas av enzym- uppslamningar, företrädesvis i vattenfria media. Sådana upp- slamningar kan typiskt bestå av en suspension av finmalet pro- teaskoncentrat i ett flytande, non-joniskt ytaktivt ämne, ex.vis Tergitol 15 S 9 eller en blandning av sådana ytaktiva ämnen.
Vanligen innehåller uppslamningen även ett eller flera oorganiska fyllmedel, såsom finmalen natriumklorid, ev. i blandning med en suspensionsstabilisator, ex.vis ángad kiselsyra (Aerosil 200).
Tergitol och Aerosil är varumärken.
Proteasuppslamningen enligt uppfinningen tillsättes i en mängd beräknad för att ge en proteasaktivitet av minst 0,1 AU, företrädesvis 0,5-2,5 AU per l00 g flytande detergentkomposition.
Tvättkompositionerna kan framställas på sedvanligt sätt, ex.vis genom sammanblandning av beståndsdelarna. Alt. beredes en förblandning, som sedan blandas med återstående ingredienser.
En renad kvalitet av subtilisin, ex.vis en som kan ut- vinnas ur poolade fraktioner motsvarande topp B av GMC jonbytar- kromatogrammet i fig. l och med en proteolytisk aktivitet av .storleksordningen 5-5 ggr den för proteaskoncentratet avses ej iïanslutning till tillämpningen av föreliggande uppfinning. 10 15 20 25 30 35 447 661 Hantering av sådant kraftfullt proteaskoncentrat skulle ound- vikligen förhöja risken för uppträdandet av lokal irritation, speciellt i andningsvägarna och andra slemhinnor, upp till en nivå som skulle vara oacceptabel för arbetare i enzymframställ- ningsanläggningen.
Dessutom är den enzymatiska instabiliteten av en sådan renad subtilisinkomponent alltför hög för att ett sådant proteas- koncentrat skall ha någon användbarhet som detergentenzym. Den väsentliga skillnaden i stabilitet som föreligger mellan renat enzym och kommersiella proteasberedningar beror uppenbarligen på närvaron i den senare av non-enzymatiskt aktiva odlingsmedie~ beståndsdelar, som stabiliserar proteaset. Sådana stabiliserande beståndsdelar är åtminstone delvis identifierbara som mindre peptider och aminosyror härrörande i huvudsak från autodigestion av proteaset under dess fermentativa framställning. Emellertid kan även ytterligare stabiliserande odlingsmediebestàndsdelar av ospecificerad karaktär vara närvarande. För lämplighetens skull användes i fortsättningen uttrycket " peptidfraktion" för sådana non-proteolytiska odlingsmediebeståndsdelar.
Peptidfraktionen elueras tillsammans med fronttoppen A när proteaskoncentratet fraktioneras på en CMC-jonbytarkolonn, såsom beskrivits i anslutning till fig. l.
Peptidfraktionsinnehållet beräknas ur formeln: _ procent totalt N - procent protein-N _ 0,14 varvid protein-N är kvävehalten av en triklorättiksyrafällning framställd under standardiserade betingelser. 1 Enligt en föredragen utföringsform av föreliggande upp- procent peptidfraktion finning är proteaskoncentratets proteolytiska aktivitet inom intervallet 2~20, företrädesvis 5-l5 Anson-enheter (AU) per g, varvid innehållet av ur odlingsmediet härledd peptidfraktion ligger inom intervallet 2-15 viktprocent.
I princip uppnås ändamålet med åstadkommande av ett för- farande för framställning av en proteasprodukt, som är i huvud- sak fri från komponent C, uppnås genom avlägsnande av endast komponent C från proteaskoncentratet, ex.vis genom fraktionerad utfällning och/eller selektiv extraktion. Bortsett ifrån det faktum, att inget förfarande av detta slag hittills utvecklats, skulle emellertid ett sådant förfarande nästan oundvikligen re- 10 15 20 25 30 35 447 661 sultera i åtföljande förlust i utbyte av subtilisin.
Dessutom_skulle de kostnader som uppstår i samband med avlägsnandet av komponent C väsentligt bidra till produktions- kostnaderna för den slutliga proteasprodukten. Separationsalter- nativet är oacceptabelt ur praktisk synpunkt.
En oundviklig stegring av prcduktionskostnaderna till o- acceptabla nivåer medför på samma sätt tillämpning av något för- farande som innebär avlägsnande av komponent C, ex.vis genom kromatografering på en CMC-jonbytarkolonn, såsom illustreras i fig. 1, enligt vilken avlägsnande av komponent C kan åstadkommas helt enkelt genom avbrytande.av elueringen kort före framträdandet av toppen C i kromatogrammet.
Ovan beskrivna hinder för framställning av ett mindre allergeniskt proteaskoncentrat har nu eliminerats i det att det förfarande redovisats, vid vilket komponent C i huvudsak elimi- neras på det mikrobiologiska stadiet genom utnyttjning av en stam av B. licheniformis som muterats för att i huvudsak blockera syntesen av komponent C under det att förmågan att syntetisera subtilisinkomponenten helt bibehålles. Odlingar av tre sådana mutantstammar av B, licheniformis har deponerats i the Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA och har tilldelats följande nummer: NRRL B-ll50l, NRRL B-ll302, NRRL B-11305 och Mutationsprocedur Mutation av B. licheniformis för blockering av dess syntes av komponent C under bibehållande av dess förmåga att syntetisera subtílisin utfördes på följande sätt. Logaritmiskt växande celler på ett medium innehållande Trypticase (2%), jästextrakt (O,5%), FeCl2, 6H2O (0,000?%), MnCl2, 4H2O (0,000l%) och MgS04, 7H2O (0,00l5%) vid pH 7,3 och hållet vid EOOC skördades efter 5 timmar och suspenderades i tris-maleatbuffert av pH 5,7.
N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanídin tillsattes till en koncentration av 100/ug/ml och suspensionen inkuberades i 50 min. på ett vattenbad vid 3000. Efter denna behandling var över- levnadsgraden O,l%. 7 g Cellerna tvättades flera gånger med bufferten och utspreds sedan på agarplattor preparerade med ovanstående odlingsmedium. 10 15 20 30 35 447 661 9, Selektion av mutanter Efter inkubering vid 5700 i 2 dygn arrangerades utskurna agarskivor, vardera uppbärande en mutantkoloni, på en glasplatta i hexagonala mönster, varefter en 1% agarosgel hälldes pà plattan.
I ett hål utskuret centralt i varje sexhörning placerades ett prov av specifikt antiserum av komponent C. Plattan inspekterades efter l dygns inkubering vid 3000. Mutantkolonier icke upp- visande utfällningslinjer utvaldes, renades genom subodling och propagerades sedan i skakkolvar.
Ytterligare karakterisering av komponent C Aminosyraanalys Den ungefärliga aminosyrasammansättningen av komponent C ges nedan. Bestämningarna är föremål för sedvanligt fel av É 10% av angivna värden. Som jämförelse anges inom parentes mot- svarande litteraturvärden för subtilisin som sådant.
Lys: 10 (9), His 8 (5), Arg; 11 (4), Asp: 22 (28), (nu: 15 (12), ThP= 33 (19), Serf 55 (52), Pr0= 13 (9), G1y= 57 (35), Ala' 17 (41), val: 16 (31), Leu 17 (16), Iieu 15 (10), Pne= 6 (4), Tyr: 21 (13), Met: 3 (5), Trp: ej best.(l), NH3: 27 (25).
Totalt antal aminosyror: 269 (275), utom Trp.
Aminosyrasammansättningen av komponent C skiljer sig som synes väsentligt från den för subtilisin, varvid den mest märkbara cys (1/2)= 2 (o), skillnaden är närvaron av de tvâ oysteinresterna (Cys l/2) i den Det föreligger vissa in- dikationer på att oysteinresterna av komponent C är sammankopp- förra jämfört med ingen i den senare. lade med en disulfidbrygga. Närvaron av en S-S-brygga i kompo- nent C, som är en medlem av gruppen av Bacillus-härledda proteaser, skulle vara högst ovanlig.
Molekylvikt Siffrorna betr. aminosyrasammansättningen antyder att molekylvikterna av komponent C och subtilisin är av samma storleks- ordning (litteraturvärdet för det senare är ca 27.300).
Inhiberingsstudier I motsats till subtilisin inhiberas komponent C ej av fos- forylerande ämnen, såsom diisopropylfosfofluoridat (DFP) eller fenylmetansulfonylfluorid (PMSF). Av dessa observationer framgår, att komponent C ej är ett serinproteas. 10 15 20 25 30 35 447 661 10 Det faktum att komponent C ej inhiberas av kelatbildare, såsom etylendiamintetraättiksyra (EDTA), anger vidare att den ej är ett metalloproteas. ' Effekt av pH på stabiliteten Komponent C uppvisar lägre stabilitet än subtilisin inom pH-intervallet 9-l0, det övervägande pH-intervallet för tvätt- lösningar. Uppenbarligen förklarar detta åtminstone delvis det faktum, att detergentenzymegenskaperna av komponent C är väsent- ligt underlägsna de för subtilisin.
Allergologiska studier Bildning av IgE-antikroppar i kaniner Lösningar (0,5 ml) av vardera av testsubstanserna subtilisln (l5,l% protein-N) och komponent C (l5,7% protein-N) jämte Al- hydrogel (Superfos, Köpenhamn, 0,5 ml och l,3% emulsion, räknat som Al205) som adjuvant injicerades subkutant på kaniner (24 djur i varje grupp). Doserna av de tvâ immunogenerna under jämförelse uttryckta i /ug protein-N var desamma. Jämförelser gjordes vid tre dosnivàer motsvarande 0,015, 0,15 resp. 1,5/ug protein-N.
Blodet avtappades från djuren den trettonde dagen efter den första immuniseringen och reimmunisering utfördes sedan följande dag. Detta schema upprepades var fjortonde dag under hela experimentperioden om 159 dagar.
Passivt kutant anafylaxtest (P05) Försöket utfördes enligt den procedur som beskrives av N.J. Zvaifler et al, Journal of Experimental Medicine, vol. 130 (1969) sid. 907. Intradermala injektioner av 0,2 ml helserum eller serumutspädningar gjordes i den nyrakade ryggen på kaniner vägande ca 2500 g. Försöken utfördes i triplikat. Efter en sensibiliseringsperiod av 72 timmar behandlades djuren intra- venöst med antigen + 50 mg Ewans Blue (Merck) upplöst i koksalt- lösning (5 ml). Behandlingsdosen motsvarade 750/Mg protein-N per djur.
Djuren avdödades efter 30-60 min. med en överdos av Nembutal och resulterande förändringar uppmättes och noterades.
Vid dosnivàn av immunogen motsvarande 0,15 /ug protein-N subkutant framträdde positiva titer för komponent 0 väsentligt tidigare och i en väsentligt större andel av djuren än mot- svarande för subtilisin.
Vid samma dosnivà var summan av titerniváerna inducerade av komponent C över 10 avtappningar väsentligt högre än den för 10 15 20 30 35 447 661 11 subtilisin (P<_0,02). Komponent C uppnådde även signifikant högre maximumtiter (P<ï0,02).
Modifierad Anson-hemoglobinmetod för bestämning av proteolytisk aktivitet Vid Anson-hemoglobinmetoden för bestämning av proteo- lytisk aktivitet digereras denaturerat hemoglobin under standard- betingelser. Det odigererade hemoglobinet utfälles med triklor- ättiksyra (TCA) och mängden TCA-löslig produkt bestämmes med Folin-Ciocalteu-fenolreagens.
En Anson-enhet (AU) är den mängd enzym, som under standard- reaktionsbetingelser nedbryter hemoglobin med en sådan ursprunglig hastighet, att per minut frigöres en mängd TCA-löslig produkt som ger samma färg med fenolreagens som en milliekvivalent tyrosin.
Standardreaktionsbetingelserna är följande: Temperatur 25°c, reaxtionstia 10 min., pa 7,5.
För ytterligare uppgifter se: M.L.Anson. Journal of General Physiology, vol. 22 (1939), sid. 79-89; O. Folin och V. Ciocalteu, The Journal of Biological Chemistry. vol, 73 (1927), sid. 627-636.
Uppfinningen kommer nu att beskrivas ytterligare i detalj i anslutning till följande exempel: Exempel l Vardera av B. licheniformis-stammarna NRRL B-11501, B-11302 och B-11503 odlades under följande betingelser: Baffelförsedda Erlenmeyer-kolvar (500 ml) förbereddes med substrat (100 ml) i vardera. Följande substratsammansättningar användes: Substrat l Substrat 2 Substrat 3 %(v1xt/voi.) %(vikt/voi.) % vikt/vol.) Potatisstärkelse 10 12,5 10 Sojabönmjöl 5 7,5 Na2HPO4.l2 H20 l 0,5 l Pluronic L-61 0,91 0,01 0,01 Tween 80 1 Barley-stärkelse 5 Natriumkaseinat 1 BAN 120 L 0,01 0,01 9,01 Pluronic L-61 är ett non-joniskt ytaktivt ämne distribu- erat av Wyandotte Corporation, Michigan, USA. 10 15 20 ZS 30 35 447 661 12 Tween 80 är polyoxietylensorbitanmonooleat distribuerat av Atlas Chemical Industries, Delaware, USA.
BAN 120 D är en kommersiell alfa-amylasprodukt erhàllen genom jäs_ning av B. subtilis och tillhandahållen av NOVO Industri A/B, Danmark.
Media upphettades från 50 till 9000 under loppet av 50 min., upphettades sedan till l2l°C under ytterligare 80 min. åt- följt av kylning.
Kolvarna inokulerades med B. licheniformis-stammen och skakades sedan på ett rotationsskakbord vid 240 varv/min. i fem dygn vid 5000. Proteasaktiviteten bestämdes sedan genom Anson- metoden. Följande resultat erhölls (AU/kg)= _ Stam Substrat l Substrat 2 Substrat 5 NRRL B-llfiol 160 219" 155 NRRL B-llzoz 158 zoo 155 NRBL B-11303 161 192 150 Prov av odlingsmedia erhållna såsom beskrivits ovan under användning av substrat 2 centrifugerades vid 15.000 g i 50 min.
Den ovanförliggande lösningen avskildes och 50"ml alikvota delar uppvärmdes till 5700. Vattenfrítt Na2S0¿ (15 g) sattes till varje portion och blandningen omrördes i 50 min. Fällningen avfiltrerades sedan och torkades under vakuum.
Bildade proteaskoncentrat hade följande karakteristika: Stam Proteolytisk akt. Protein- Peptid- AU/g halt, 75 fraktion, 75 B-11501 ll 54 8 B-11502 10 55 10 B-11505 10 51 8 _ Ett prov (5 g) av produkten erhållen från B. licheniformis NRRL B-11501 kromatograferades på en kolonn (25 X 25,5 cm) av' CMC (150 g) under betingelser analoga med de tidigare beskrivna.
Kromatogrammet erhålles genom monitering av 0D28oav fraktioner (20 ml) uppsamlade vid en flödeshastighet av 45 ml/h.
Dessutom underkastades en lösning (5% vikt/vikt) av samma koncentrat agarosgelelektrofores enligt tidigare beskrivet för- farande. Lösningar (l% vikt/volym) av subtilisin och kombonent C användes som referenser. Kromatogrammet ooh elektroferogrammen som visas i fig. 5 resp. 4 på bilagda ritning anger, att det' enda proteas som är detekterbart i proteaskoncentratet (fig. 4, 10 15 20 30 35 447 661 13 position III) är subtilisin (position II), under det att kompo- nent C (position I) är frånvarande.
Exempel 2 B. licheniformis-stam NRRL B-11501 odlades 1 1-2 dygn vid 37°c 1 en rernbaen-kolv. sedan i en jästank av rostfritt stål innehållande Efter 24 timmar vid 5400 under Denna användes på näringsagar Odlingen utvecklades nedan beskrivet luftning och sedan för ymp- jäsningssubstrat. omröring erhölls en tjock odling. ning av enzymproduktionstanken.
Ympodlingen (35 liter) överfördes till en jästank av rost- fritt stàl innehållande nedan beskrivet jäsningssubstrat. Jäs- ningsbetingelserna för både ymptanken och huvudtanken var följande: Total tankvolym: 550 liter Substratvolym: 550 liter Luftningshastighet: 500 liter/min.
Omröringz 400 varv/min. med en sexbladig turbinomrörare, 28 om diameter.
Temperatur: 5400 Substratkomposition: Potatisstärkelse 100 g/liter sojabönmjöi 50 g/liter Na2HPo4.12 H20 io g/liter EAN 120 L o,1m1/liter Piuronie L-61 1 g/liter Substratberedning: _ Substratet upphettades från 50 till 9500 under loppet av 50 min. och steriliserades sedan vid 12100 i 60 min.
Efter-en jäsningstid av 50 timmar var proteasaktiviteten 160 AU/kg, bestämt genom den modifierade Anson-metoden. Jäsnings- mediet kyiaes sedan till ca 5°c. a. Ett prov av odlingsmediet från ovan beskriven jäsning centrifugerades vid 15.000 g i 50 min. vätskan avskildes och värmdes sedan till 5700. Vattenfritt Na2S0¿ (520 g/liter) tillsattes och blandningen omrördes sedan i 50 min. och hölls fortfarande vid 5700. Fällningen avfiltrerades Den ovanförliggande därefter och torkades under vakuum.
Bildat proteaskoncentrat hade följande karakterlstika: Preteeiytisk aktivitet 8 AU/g Proteinhalt 20 % .Peptidfraktion 4 % 10 15 20 25 30 35 447 661 14 Kromatografi på CMC och agarosgelelektrofores utfört på samma sätt som beskrives i ex. 1 visade, att proteasprodukten var fri från komponent C, varvid det enda detekterbara proteaset var subtilisin. b. En andra alikvot del av ovanstående odlingsmedium centri- fugerades vid 15.000 g i_3O min. Den ovanförliggande vätskan Aceton (3 volymer) tillsattes långsamt och med Den erhållna avskildes sedan. kraftig omröring till den ovanförliggande vätskan. fällningen avfiltrerades och torkades under vakuum.
Bildat proteaskoncentrat hade följande karakteristika: Prøteoiytisk aktivitet 6 AU/g Proteinhalt 15 % Peptidfraktion 5 % Kromatografi på GMC och agarosgelelektrofores utförd på samma sätt som beskrives i ex. 1 visade, att proteasprodukten var fri från komponent C, varvid det enda detekterbara proteaset var subtilisin. ' Exemgel 2 En kommersiell partikelformig proteasprodukt framställdes på följande sätt: En förblandning bestående av enzymkoncentrat (8 AU/g; 25 viktprocent) framställt såsom beskrives i ex. 2a, polyvinyl- pyrrolidon (2%), polyetylenglykol 6000 (6%) och natriumklorid (67%) fuktades med vatten (8%), extruderades genom en skärm med 0,9 mm hål och sfäroidiserades sedan såsom beskrivas i brittiska patentet 1 362 365. Den partikelformiga produkten torkades i en fluidiserad bädd till en fukthalt av ca O,5% åtföljt av över- dragning med polyetylenglykol (4 viktprocent) och pulvriserades slutligen med en blandning (11%) av titandioxid och magnesium- silikat. 1,7 AU/g.
Exempel 4 En granulär proteasprodukt framställdes på i huvudsak samma Den slutliga enzymberedningen hade en aktivitet av sätt som beskrives i amerikanska patentet 4 106 991.
Finmalet proteaskoncentrat (9 AU/g; 25 viktprocent) fram- ställt enligt ex. 2a, titandioxid (2%), cellulosapulver (10%) CEPO.S20.(The Swedish Cellulose Powder and Wood Flour Mills, Ltd.) *-_ och finmalen natriumklorid (62%) blandades i en Lödige-blandare såsom beskrivas i ex. 1 av ovanstående US patent. 10 15 25 30 35 fungerande som bindemedel. 15 447 661 Den torra blandningen besprutades med en 4,5% vattenlösning av polyvinylpyrrolidon K 30 (l viktprocent av hela blandningen) Granulering av produkten utfördes i Lödige-blandaren àtföljt av torkning av den granulära produkten till en fukthalt understigande 5%. och överdrogs sedan med polyetylenglykol och pulvriserades enligt den procedur som beskrives i ex. 3. teasberedningen hade en aktivitet av 2 AU/g.
Exemgel 5 De enligt ex. 5 och Ä framställda partikelformiga proteas- produkterna användes för framställning av tvättpulverkompositioner med följande sammansättningar: a..
Beståndsdel NANSA S 40 S Berol WASC Tvål Natriumtripolyfosfat Natriumperborat Natriumsilikat Natrium-CMC Optiska vitmedel, doftämnen pH-justeringsmedel Proteasprøaukc (i,5-2,o AU/g) Natriumsulfat, till Bestàndsdel NANSA S 40 S Berol WASC Tvål Natriumtripolyfosfat SASIL Natriumperborat Natriumsilikat Natrium-CMC Optiska vitmedel, doftämnen pH-justeringsmedel Proteasprodukt (1,5-2,0 AU/g) Natriumsulfat, till Granulerna siktades slutligen Den sålunda erhållna pro- Mängd (viktprocent) 10 4 5 30 25 6 1 0,5 efter behov 0,8 100 Mängd (viktprocent) lO 4 5 15 15 25 .6 l 0,5 efter behov 0,8 100 UT 441 661 16 NANSA S 40 S är ett natríumalkylbensensulfonat baserat på "mjukt" fullt bionedbrytbart alkylat i pulverform (Marchon Ltd.).
Berol WASC är en non-jonisk alkylfenylpolyglykoleter (Berol AB).
SASIL är en natriumalumíniumsilikatzeolit av typ A med formeln Nal2(AlO2)l2(SíO2)l2.27 H20 (Degussa).
Claims (5)
1. Proteasberedning som är lämplig för inblandning i tvätt- kompositioner, som i sig har införlivat ett av B.1icheniformis härlett subtilisinkoncentrat, och som uppvisar väsentligt redu- cerade allergeniska egenskaper jämfört med ett subtilisinkoncen- W trat innehållande ett non-serinproteas, varvid däri införlivat subtilisinkoncentrat innehåller minst 0,5, företrädesvis 2-15 viktprocent, av ur odlingsmedíet härledda non-proteolytiska pep- tider och den proteolytiska aktivititeten för däri införlivat sub- tílisinkoncentrat ligger inom intervallet 2- 20, företrädesvis 5-15, Anson-enheter per g, k ä n_n e t e c k n a d därav, att nämnda subtílisinkoncentrat, som är stabíliserat genom däri när- varande, ur odlingsmedíet härledda non-proteolytiska peptider, är fritt från non-serinproteas och kan erhållas genom mutation av B.licheniformis med N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin och selek- tion med antiserum mot ett non-serinproteas benämnt komponent C.
2. Förfarande för framställning av en subtilisinhaltíg pro- teasberedning lämplig för inblandning i tvättkompositioner, vilken är fri från non-serinproteas och uppvisar väsentligt reducerade allergeniska egenskaper jämfört med en proteasberedning innehållan- de ett non-serinproteas, k ä n n e t e c k n a t därav, att en stam av B.licheniformis, muterad med N-metyl-N'-nitro-N-nitroso- guanidin för att blockera dess förmåga att syntetisera andra pro- teaser än subtilisin och selekterad med antiserum mot ett non- serinproteas benämnt komponent C, odlas i ett näringsmediumflinne-"_”MH hållande assimilerbara källor av kol, kväve och fosfor, åtföljt av utvinning av ett subtilisin och av odlingsmedíet härledda pep- tider innefattande proteaskoncentrat, vilket därefter på i och för sig känt sätt omvandlas till en proteasberedning.
3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t etc k n a t därav, att den muterade B.1icheniformis-stammen är utvald ur stammarna med tilldelade depositionsnummer NRRL B-11301, B-11302 och B-11303.
4. B.licheniformis-stam utvald bland deponerade stammar med tilldelade depositionsnummer NRRL B-11301, B-11302 och B-11303. 447 661 'f
5. Tvättkomposition innehållande en effektiv mängd av en proteasberedning som i sig har införlívat ett av B.licheniformis härlett suhtílrsinkoncentrat, och som uppvisar väsentligt reduce- rade allergeniska egenskaper jämfört med ett subtilísinkoncentrat innehållande ett non-serinproteas, varvid däri införlivat subtili- sinkoncentrat innehåller minst 0,5, företrädesvis 2-15 viktprocent, av ur odlingsmedíet härledda non-proteolytíska peptíder och den proteolytiska aktiviteten för däri införlívat subtilisinkoncentrat ligger inom intervallet 2-20, företrädesvis 5-15, Anson-enheter per g, varjämte nämnda subtílisinkoncentrat, som är stabiliserat genom däri närvarande, ur odlingsmedíet härledda non-proteolytiska peptider, är fritt från non-serinproteas och kan erhållas genom mutation av B.licheníformis med N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin och selektion med antiserum mot ett non-serinproteas benämnt kom- ponent C.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB7828773 | 1978-07-04 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE7905828L SE7905828L (sv) | 1980-01-05 |
SE447661B SE447661B (sv) | 1986-12-01 |
SE447661C true SE447661C (sv) | 1997-04-14 |
Family
ID=10498253
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE7905828A SE447661C (sv) | 1978-07-04 | 1979-07-03 | Subtilisinhaltig proteasprodukt med reducerad allergenicitet herledd ur bacillus licheniformis, forfarande for dess framstellning, tvettmedelskomposition innehallande densamma samt b. licheniformisstam nrrl b-11301, b-1 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4266031A (sv) |
EP (1) | EP0006638B1 (sv) |
JP (1) | JPS5913187B2 (sv) |
BE (1) | BE877435A (sv) |
BR (1) | BR7904209A (sv) |
CA (1) | CA1142105A (sv) |
CH (1) | CH642395A5 (sv) |
DE (2) | DE2966911D1 (sv) |
DK (1) | DK151269C (sv) |
ES (1) | ES482133A1 (sv) |
FR (1) | FR2430453B1 (sv) |
HU (1) | HU182981B (sv) |
IT (1) | IT1162338B (sv) |
NL (1) | NL7905172A (sv) |
SE (1) | SE447661C (sv) |
YU (1) | YU161379A (sv) |
Families Citing this family (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5264366A (en) * | 1984-05-29 | 1993-11-23 | Genencor, Inc. | Protease deficient bacillus |
JPS61250636A (ja) | 1985-04-30 | 1986-11-07 | Fuji Photo Film Co Ltd | 熱現像感光材料 |
JPH083621B2 (ja) | 1985-07-31 | 1996-01-17 | 富士写真フイルム株式会社 | 画像形成方法 |
DE3527913A1 (de) * | 1985-08-03 | 1987-02-12 | Henkel Kgaa | Alkalische protease, verfahren zur herstellung von hybridvektoren und genetisch transformierte mikroorganismen |
EG18543A (en) * | 1986-02-20 | 1993-07-30 | Albright & Wilson | Protected enzyme systems |
US4906575A (en) * | 1987-03-06 | 1990-03-06 | Chevron Research Company | Phosphate compound that is used in a microbial profile modification process |
US4947932A (en) * | 1987-03-06 | 1990-08-14 | Chevron Research Company | Phosphate compound that is used in a microbial profile modification process |
US5171682A (en) * | 1988-03-31 | 1992-12-15 | North Carolina State University | Purified Bacillus licheniformis PWD-1 keratinase |
CA2003078A1 (en) * | 1988-11-18 | 1990-05-18 | Alan Sloma | Protease deletion |
DK63490D0 (da) * | 1990-03-09 | 1990-03-09 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af ost |
US5863573A (en) * | 1990-03-09 | 1999-01-26 | Novo Nordisk A/S | Process for producing cheese |
EP0518999B1 (en) * | 1990-03-09 | 1995-08-30 | Novo Nordisk A/S | Protein hydrolysates |
DK19991D0 (da) * | 1991-02-06 | 1991-02-06 | Novo Nordisk As | Proteinpraeparationer |
DK63590D0 (da) * | 1990-03-09 | 1990-03-09 | Novo Nordisk As | Detergentkomposition |
JP3046344B2 (ja) * | 1990-10-24 | 2000-05-29 | 塩野義製薬株式会社 | 新規プロテアーゼ |
US6451586B1 (en) * | 1990-11-10 | 2002-09-17 | Roehm Gmbh & Co Kg | Enzyme preparation containing protease |
US5266473A (en) * | 1992-01-28 | 1993-11-30 | Kellogg Company | Method for decreasing the allergenicity of psyllium seed husk by enzyme treatment |
DE4329463A1 (de) * | 1993-09-01 | 1995-03-02 | Cognis Bio Umwelt | Mehrenzymgranulate |
EP0731834B1 (en) * | 1993-12-03 | 2000-05-24 | Buckman Laboratories International, Inc. | Enzyme stabilization by block-copolymers |
DE4344215A1 (de) * | 1993-12-23 | 1995-06-29 | Cognis Bio Umwelt | Silberkorrosionsschutzmittelhaltige Enzymzubereitung |
DE4422433A1 (de) * | 1994-06-28 | 1996-01-04 | Cognis Bio Umwelt | Mehrenzymgranulat |
DE19515072A1 (de) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Cognis Bio Umwelt | Cellulasehaltiges Waschmittel |
DE19615776A1 (de) | 1996-04-20 | 1997-10-23 | Henkel Kgaa | Löslichkeitsverbessertes Enzymgranulat |
DE19651446A1 (de) | 1996-12-11 | 1998-06-18 | Henkel Kgaa | Umhüllte Enzymzubereitung mit verbesserter Löslichkeit |
DE19725508A1 (de) | 1997-06-17 | 1998-12-24 | Clariant Gmbh | Wasch- und Reinigungsmittel |
CA2325568A1 (en) | 1998-03-26 | 1999-09-30 | The Procter & Gamble Company | Serine protease variants having amino acid substitutions |
US6495136B1 (en) | 1998-03-26 | 2002-12-17 | The Procter & Gamble Company | Proteases having modified amino acid sequences conjugated to addition moieties |
US6908757B1 (en) | 1998-03-26 | 2005-06-21 | The Procter & Gamble Company | Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions |
US6835550B1 (en) | 1998-04-15 | 2004-12-28 | Genencor International, Inc. | Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins |
US6838269B1 (en) | 1998-04-15 | 2005-01-04 | Genencor International, Inc. | Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
US20020182184A1 (en) * | 1999-07-09 | 2002-12-05 | Pentagonal Holdings, Inc. | Composition for the safe removal of indoor allergens |
WO2001007575A2 (en) | 1999-07-22 | 2001-02-01 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin protease variants having amino acid deletions and substitutions in defined epitope regions |
CA2376045A1 (en) | 1999-07-22 | 2001-02-01 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin protease variants having amino acid substitutions in defined epitope regions |
AU5928400A (en) | 1999-07-22 | 2001-02-13 | Procter & Gamble Company, The | Protease conjugates having sterically protected clip sites |
US6946128B1 (en) | 1999-07-22 | 2005-09-20 | The Procter & Gamble Company | Protease conjugates having sterically protected epitope regions |
US7217554B2 (en) * | 1999-08-31 | 2007-05-15 | Novozymes A/S | Proteases and variants thereof |
EP2206786A1 (en) * | 1999-08-31 | 2010-07-14 | Novozymes A/S | Novel proteases and variants thereof |
US6558939B1 (en) | 1999-08-31 | 2003-05-06 | Novozymes, A/S | Proteases and variants thereof |
US7297354B2 (en) * | 2000-04-26 | 2007-11-20 | Land O'lakes, Inc. | Protein material |
MXPA02010757A (es) * | 2000-05-04 | 2004-05-17 | Dsm Nv | Proceso en lecho fluidizado para la produccion de granulos de enzimas. |
DE50107849D1 (de) | 2000-07-28 | 2005-12-01 | Henkel Kgaa | Neues amylolytisches enzym aus bacillus sp. a 7-7 (dsm 12368) sowie wasch- und reinigungsmittel mit diesem neuen amylolytischen enzym |
DK1337648T3 (da) | 2000-11-28 | 2008-01-07 | Henkel Kgaa | Ny cyclodextrin-glucanotransferase (CGTase) fra Bacillus agaradherens (DSM 9948) samt vaske- og rengöringsmidler med denne nye cyclodextrin-glucanotransferase |
DE10142124A1 (de) | 2001-08-30 | 2003-03-27 | Henkel Kgaa | Umhüllte Wirkstoffzubereitung für den Einsatz in teilchenförmigen Wasch- und Reinigungsmitteln |
EP1438346A1 (de) | 2001-10-22 | 2004-07-21 | Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien | Baumwollaktive schmutzablösevermögende polymere auf urethan-basis |
DE10153792A1 (de) | 2001-10-31 | 2003-05-22 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten |
DE10162728A1 (de) | 2001-12-20 | 2003-07-10 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease |
DE10162727A1 (de) | 2001-12-20 | 2003-07-10 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14391) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease |
DE10163748A1 (de) | 2001-12-21 | 2003-07-17 | Henkel Kgaa | Neue Glykosylhydrolasen |
DE10163884A1 (de) | 2001-12-22 | 2003-07-10 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease |
US20040007251A1 (en) * | 2002-07-10 | 2004-01-15 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Cleaners for the control and removal of allergens |
JP2007521823A (ja) | 2004-02-13 | 2007-08-09 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ変異型 |
DE102005026544A1 (de) | 2005-06-08 | 2006-12-14 | Henkel Kgaa | Verstärkung der Reinigungsleistung von Waschmitteln durch Polymer |
DE102005026522B4 (de) | 2005-06-08 | 2007-04-05 | Henkel Kgaa | Verstärkung der Reinigungsleistung von Waschmitteln durch Polymer |
US8074973B2 (en) * | 2007-10-02 | 2011-12-13 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Method and apparatus for cooling pyrolysis effluent |
CA2747603A1 (en) | 2008-12-31 | 2010-07-08 | Novozymes A/S | Protein hydrolysate compositions |
BRPI0918708A2 (pt) | 2008-12-31 | 2015-08-25 | Solae Llc | Fração solúvel de uma composição de hidrolisado de proteína, método para aumentar a atividade de liberação de colecistoquinina de uma célula, método para promover a saciedade em um indivíduo e produto alimentício |
ES2474119T3 (es) | 2010-06-22 | 2014-07-08 | Novozymes A/S | Eliminación de pelo enzim�tica de pieles y cueros |
MX2013009772A (es) | 2011-02-23 | 2013-10-01 | Solae Llc | Composiciones de hidrosilato de proteinas que tienen actividad liberadora mejorada de colecistoquina (cck) y peptido similar a glucagon-1 (glp-1). |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE1952012C3 (de) * | 1968-10-25 | 1974-01-24 | Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd., Tokio | Biotechnisches Verfahren zur Herstellung alkalischer Protease |
GB1303633A (sv) * | 1969-04-18 | 1973-01-17 | ||
BE755886A (fr) | 1969-09-08 | 1971-03-08 | Unilever Nv | Enzyme |
GB1263765A (en) | 1969-11-18 | 1972-02-16 | Godo Shusei Kabushika Kaisha | A method for the production of protease by cultivating bacteria |
US3623956A (en) | 1970-01-21 | 1971-11-30 | Rapidase Sa Soc | Preparation of microbial alkaline protease by fermentation with bacillus subtilis, variety licheniformis |
DE2063988A1 (de) | 1970-12-28 | 1972-07-20 | Henkel & Cie GmbH, 4000 Düsseldorf | Verfahren zur Herstellung von Protease |
FR2147470A5 (sv) * | 1971-07-28 | 1973-03-09 | Anvar |
-
1979
- 1979-07-03 BR BR7904209A patent/BR7904209A/pt unknown
- 1979-07-03 SE SE7905828A patent/SE447661C/sv not_active IP Right Cessation
- 1979-07-03 JP JP54083566A patent/JPS5913187B2/ja not_active Expired
- 1979-07-03 ES ES482133A patent/ES482133A1/es not_active Expired
- 1979-07-03 FR FR7917249A patent/FR2430453B1/fr not_active Expired
- 1979-07-03 DE DE7979102237T patent/DE2966911D1/de not_active Expired
- 1979-07-03 BE BE0/196090A patent/BE877435A/fr not_active IP Right Cessation
- 1979-07-03 EP EP79102237A patent/EP0006638B1/en not_active Expired
- 1979-07-03 DK DK281579A patent/DK151269C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-07-03 CH CH620479A patent/CH642395A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-07-03 NL NL7905172A patent/NL7905172A/nl not_active Application Discontinuation
- 1979-07-03 HU HU79NO235A patent/HU182981B/hu not_active IP Right Cessation
- 1979-07-03 CA CA000331057A patent/CA1142105A/en not_active Expired
- 1979-07-03 DE DE19792926808 patent/DE2926808A1/de not_active Withdrawn
- 1979-07-03 US US06/054,555 patent/US4266031A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-07-03 YU YU01613/79A patent/YU161379A/xx unknown
- 1979-07-03 IT IT49628/79A patent/IT1162338B/it active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK151269C (da) | 1988-05-02 |
FR2430453A1 (fr) | 1980-02-01 |
IT7949628A0 (it) | 1979-07-03 |
EP0006638B1 (en) | 1984-04-18 |
DK151269B (da) | 1987-11-16 |
DE2926808A1 (de) | 1980-01-17 |
SE447661B (sv) | 1986-12-01 |
DE2966911D1 (en) | 1984-05-24 |
IT1162338B (it) | 1987-03-25 |
FR2430453B1 (fr) | 1986-04-18 |
EP0006638A2 (en) | 1980-01-09 |
ES482133A1 (es) | 1980-04-01 |
DK281579A (da) | 1980-01-05 |
BE877435A (fr) | 1980-01-03 |
CH642395A5 (de) | 1984-04-13 |
JPS5539794A (en) | 1980-03-19 |
HU182981B (en) | 1984-03-28 |
EP0006638A3 (en) | 1980-02-06 |
BR7904209A (pt) | 1980-06-17 |
JPS5913187B2 (ja) | 1984-03-28 |
NL7905172A (nl) | 1980-01-08 |
YU161379A (en) | 1984-04-30 |
CA1142105A (en) | 1983-03-01 |
SE7905828L (sv) | 1980-01-05 |
US4266031A (en) | 1981-05-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SE447661C (sv) | Subtilisinhaltig proteasprodukt med reducerad allergenicitet herledd ur bacillus licheniformis, forfarande for dess framstellning, tvettmedelskomposition innehallande densamma samt b. licheniformisstam nrrl b-11301, b-1 | |
JP2624859B2 (ja) | 酵素洗剤 | |
US5801039A (en) | Enzymes for detergents | |
EP0548228B1 (en) | Lipase variants | |
EP0701605B2 (en) | Improved enzymes and detergents containing them | |
EP0277216B1 (en) | Alkaline protease derived from bacilles production and use thereof | |
JP2003526319A (ja) | リパーゼ変異体 | |
JPS62171681A (ja) | バチルスにより産生される熱安定性アルカリ性プロテア−ゼ類 | |
JPH01502079A (ja) | 新規プロテアーゼ | |
JPH10507639A (ja) | 酵素界面活性剤組成物 | |
EP0309550B1 (en) | Novel proteolytic enzymes | |
JPH10507640A (ja) | 新規脂肪分解酵素 | |
AU688312B2 (en) | Liquid enzyme formulations | |
KR100244691B1 (ko) | 세정제 효소(Detergent Enzymes) | |
GB2024830A (en) | Protease Product of Reduced Allergenicity | |
EP0839187B1 (en) | Proteolytic enzymes derived from amycolata | |
US5948746A (en) | Proteolytic enzymes | |
JP3246603B2 (ja) | 洗 剤 | |
EP0601005B1 (en) | Detergent enzymes | |
WO1992018622A1 (en) | Novel proteases |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 7905828-5 Format of ref document f/p: F |