SE447661B - Subtilisinhaltig proteasprodukt med reducerad allergenicitet herledd ur bacillus licheniformis, forfarande for dess framstellning, tvettmedelskomposition innehallande densamma samt b. licheniformisstam nrrl b-11301, b-1 - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 447 661 5 5 2 betraktats såsom en inneboende olägenhet kopplad till använd- ningen av proteasprodukterna.

Hittills har ansträngningarna att minimera omfattningen av hypersensitiva reaktioner bland arbetskraft och konsumenter inriktats enbart mot åstadkommande av lågdammande partikelformiga, ex.vis granulära eller inkapslade proteasprodukter så att man reducerat risken för exponering för proteaset, både betr. arbets- kraft i anläggningar för framställningar av detergentenzym och tvättmedel och konsumenter av hushållstvättmedel. Framgången i sdessa strävanden återspeglar sig delvis i den fortsatt utsträckta hushâllsmässiga användningen av tvättmedel innehållande detergent- enzym.

Det är emellertid även känt, att framkallandet av aller- ,~ giska reaktioner kan vara mycket oförutsägbart och nyckfullt.

Det föreligger sålunda fortfarande ett behov av en kommersiell proteasberedning med allergeniska egenskaper, vilka är väsentligt nedbringade jämfört med hittills kända sådana beredningar.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är åstadkommande av en B. licheniformis-proteasprodukt med förminskad allergenicitet.

Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är åstad- kommande av en industriellt genomförbar process för framställning av en produkt med reducerad allergenicitet.

Uppnàendet av dessa ändamål baserar sig på vissa observa- tioner betr. beståndsdelarna i kommersiella proteasberedningar och deras egenskaper.

Nyligen publicerade undersökningar medelst kvalitativ (men högst känslig) immunoelektrofores (ex.vis enligt Grabar- Williams, vide R. Verbruggen et al, Biochim, Biophys, Acta, vol. 365 (1974), sia 108-114) anger att kommersieiic tiiigängiiga proteasprodukter, särskilt ALCALASE, är antigeniskt heterogena.

I senare studier publicerade av Verbruggen (Biochem.

J0UPn&l, V01- 151 (1975), sid 149-155) med tillämpning av tekniken med kvantitativ korsad agarosgelimmunoelektrofores visade det sig att huvudproteaskomponenten i AICAIASE bestående av en familj av subtilisinisoenzymer beledsagas av en proteinkomponent i mindre ' mängd, som skiljer sig antigeniskt från huvudproteaskomponenten.

Ett försök att ytterligare belysa sammansättningen av kommersiella proteasberedningar, vilket är tillämpbart även 1 preparativ laboratorieskala för fraktionering av sådana bered- 10 15 20 25 30 35 447 661 ningar, består i att utsätta det ur odlingsmediet utvunna proteas- koncentratet för jonbytarkromatografi. Sålunda kromatograferades ex.vis ett B.licheniformis-proteaskonoentrat (50 g) på en kolonn (5 x 55 cm) av karboximetyloellulosa (GMC, 500 g) som hölls vid 400 och bringats i jämvikt med en buffert av pH 6,5 bestående av 0,005 M tris(hydroximetyl)aminometan-(TRIS)-maleat och 0,002 M kaleiumacetat. Eluering utfördes med samma buffert under på- förande av en lineär natriumkloridgradient efter uppträdandet av den första toppen. Den optiska densiteten av fraktioner (20 ml) uppsamlade vid en flödeshastighet av 210 ml/h moníterades vid 280 nm. Kromatogrammet visas i fig. l av bilagda ritning.

Den huvudproteaskomponent, som utvanns ur poolade frak- tioner motsvarande toppen B av kromatogrammet, varvid toppen A är fronttoppen, identifíerades som subtilisin. Det antas, att biproteaskomponenten, som representeras av toppen C, är identisk med den biproteinkomponent som detekteras vid korsad immuno- elektrofores (vide supra) och som beskrivits såsom varande anti- geniskt skild från huvudkomponenten men ej på annat sätt karak- teriserad. Härefter benämnes den ovan identifierade biproteas- komponenten "komponent C". Komponent C har visat sig utgöra från ca 5 till oa 15% av Alcalasets totala proteasinnehåll.

Som ett sätt för ytterligare karakterisering utsattes subtilisinkomponenten och komponent C såsom de erhållits från poolade fraktioner motsvarande topparna B resp. C, för agaros- gelelektrofores. Elektroforesen utfördes i 0,075 M natrium- barbitalbuffert av pH 8,0 vid 1000 i 60 min. under användning av en spänningsgradient av 15 Vybm. Proven applicerades som 1% vikt/volym lösningar. elektroferogrammen anger, att under testbetingelserna subtilisin (position I) och komponent C (position II) uppvisar distinkt skilda katodiska migrationsvärden.

De i fig. 2 av bilagda ritning visade Dessutom anger elektroferogrammen, att eftersom båda pro- teaserna migrerar som bandmönster, varvid båda är sammansatta av ett huvudband åtföljt av långsammare vandrande sidoband, både subtilisinkomponenten och komponent C är multipla isoenzymsystem (Verbruggen, vide supra).

Inhibitionsstudier som anges senare i föreliggande fram- ställning har visat, att i motsats till subtilisin, komponent C 10 15 20 25 30 '35 447 661 . är ett non-serinproteas.

Föreliggande uppfinning baserar sig på upptäckten, att den allergeniska aktiviteten av subtilisinkomponenten är väsentligt lägre än den allergeniska aktiviteten av komponent C.

Enligt en sida av föreliggande uppfinning åstadkommes en proteasberedning lämplig för inblandning i tvättkompositioner, vilken innehåller ett av B. licheniformis härlett proteaskoncent- rat, och beredningen kännetecknas av att nämnda proteaskoncentrat som är stabiliserat av däri närvarande non-proteolytiska peptider härledda från odlingsmediet, är i huvudsak fritt från non-serin- proteas och uppvisar väsentligt reducerade allergeniska egenskaper jämfört med ett proteaskoncentrat som innehåller non-serinproteas.

I allmänhet är minst 99% av proteaskoncentratets proteo- lytiska aktivitet härlett från subtilisinisoenzymsystemet och innehåller minst ca 2% non-proteolytískt aktiva peptider.

Enligt en ytterligare sida av föreliggande uppfinning åstadkommas ett förfarande för framställning av ett proteaskon- centrat, som är lämpligt för införlivning i proteasberedningar avsedda för inblandning i tvättkompositioner, varvid nämnda pro- teaskoncentrat är i huvudsak fritt från non-serinproteas och upp- visar väsentligt reducerade allergeniska egenskaper jämfört med ett proteaskoncentrat som innehåller non-serinproteas, och för- farandet kännetecknas därav, att en stam av B. licheniformis muterad för att i huvudsak blockera dess förmåga att syntetisera andra proteaser än subtilisin, odlas i ett näringsmedium inne- hållande assimilerbara källor av kol, kväve och fosfor, åtföljt av utvinning av proteaskoncentratet innehållande subtilisin och av odlingsmediet härledda peptider.

Sådana utvinningsförfaranden är väl utvecklade inom tek- niken. Vanligen filtreras odlingsmediet, centrifugeras eller på annat sätt klarnas åtföljt av utfällning av proteaskoncentratet, ex.vis genom tillsats av ett vattenlösligt, oorganiskt salt, såsom natrium- eller ammoniumsulfat, eller genom tillsats av ett med vatten blandbart organiskt lösningsmedel, såsom etanol eller aceton. Fällningen kan tillvaratas på konventionellt sätt, såsom genom filtrering eller centrifugering.

Den fuktiga proteasfällningen kan torkas genom konven- En aktig torkningsprocess för användning i stor skala under kombi- tionella förfaranden, ex.vis under vakuum.- speciellt fördel- 10 15 20 30 35 447 661 nation av spraytorkning med ett efterföljande torkningssteg under flytbäddbetingelser avslöjas i brittiska patentet l 360 969.

Omvandling av det torkade enzymkoncentratet till en kommer- siell, partikelformig, làgdammande proteasberedning med förut- bestämd aktivitet kan utföras genom olika inom tekniken kända förfaranden. Ett förfarande beskrives i brittiska patentet l 338 249, vari i huvudsak sfäriska pärlor bildas av en blandning av proteaskoncentratet och ett vattendispergerbart, fast, vax- artat bindematerial, såsom en non-jonisk detergent. Här hänvisas även till brittiska patentet l 362 365, som avslöjar ett för- farande, varigenom en fuktad förblandning av enzymkoncentratet och ett fast utspädningsmedel, såsom natriumklorid, ev. i närvaro av ett bindemedel, ex.vis dextrin och/eller polyetylenglykol, extruderas och sedan sfäroidiseras, ex.vis medelst en apparat som saluföres under handelsnamnet MAUMERIZER, och slutligen torkas under flytbäddbetingelser.

Alt. kan en granulär enzymprodukt framställas genom det förfarande som beskrives i amerikanska patentet 4 106 991. En efterföljande beläggningsprocess kan ev. utföras för att ytter- ligare reducera den slutliga produktens dammningsegenskaper. Överdragning av den partikelformiga produkten utföres vanligen medelst smält vax, företrädesvis polyetylenglykol, ev. åtföljt av pulvrisering av bildad överdragen produkt med ett finfördelat färgämne, ex.vis TiO2 blandat med pulvriseringshjälpmedel.

Genom föreliggande uppfinning åstadkommes även mutant- stammar av B. lioheniformis blockerade betr. syntesen av kompo- nent C under bibehållande av förmågan att syntetisera subtilisin.

Dessutom àstadkommes genom föreliggande uppfinning en tvättkomposition innehållande en effektiv mängd av en proteas- produkt härledd av B. licheniformis som är i huvudsak fri från proteaskomponent C.

Förutom enzymet innehåller i allmänhet den kommersiella tvättmedelskompositionen enligt föreliggande uppfinning: a) Minst ett ytaktivt ämne, som kan vara anjoniskt, non- joniskt eller amfotärt, eller en vattenlöslig tvål.

Typiskt användes ett anjoniskt ytaktivt ämne (ex.vis ett lineärt alkylarylsulfonat) i blandning med ett non-joniskt ytaktivt ämne (ex.vis en alkylfenylpolyglykoleter) i mäng- l0 15 20 25 30 35 447 661 6 der av 5-30 resp. l-5 viktprocent av tvättkompositionen. b) . En eller.flera builders, företrädesvis med tillhörande komplexbildningsfunktion. Natriumtripolyfosfat, natrium- citrat, natriumsilikat och zeoliter är ex. på sådana föreningar, vanligen utgörande 10-70 viktprocent av detergentkompositionen. c) Ett blekmedel, företrädesvis en peroxiförening, såsom natriumperborat, typiskt införlivad i en mängd av upp till 50 viktprocent av kompositionen. d) Tillsatsmedel, såsom karboximetylcellulosa, optiska vit- medel och doftämnen. Om det är nödvändigt tillsättes ett pH-justeringsmedel, så att tvättmediet erhåller ett pH inom intervallet 8,0-10,5.

Den partikelformiga proteasberedningen enligt uppfinningen tillsättes i en mängd som är beräknad för att ge en proteasakti- vitet av minst 0,1 Anson-enheter (AU, vide infra), företrädesvis 0,5-2,0 AU per 100 g av tvättkompositionen. Om det är nödvändigt kan återstoden till 100% utgöras av ett oorganiskt fyllmedel, företrädesvis natriumsulfat.

Flytande detergentkompositioner kan framställas av enzym- uppslamningar, företrädesvis i vattenfria media. Sådana upp- slamningar kan typiskt bestå av en suspension av finmalet pro- teaskoncentrat i ett flytande, non-joniskt ytaktivt ämne, ex.vis Tergitol 15 S 9 eller en blandning av sådana ytaktiva ämnen.

Vanligen innehåller uppslamningen även ett eller flera oorganiska fyllmedel, såsom finmalen natriumklorid, ev. i blandning med en suspensionsstabilisator, ex.vis ángad kiselsyra (Aerosil 200).

Tergitol och Aerosil är varumärken.

Proteasuppslamningen enligt uppfinningen tillsättes i en mängd beräknad för att ge en proteasaktivitet av minst 0,1 AU, företrädesvis 0,5-2,5 AU per l00 g flytande detergentkomposition.

Tvättkompositionerna kan framställas på sedvanligt sätt, ex.vis genom sammanblandning av beståndsdelarna. Alt. beredes en förblandning, som sedan blandas med återstående ingredienser.

En renad kvalitet av subtilisin, ex.vis en som kan ut- vinnas ur poolade fraktioner motsvarande topp B av GMC jonbytar- kromatogrammet i fig. l och med en proteolytisk aktivitet av .storleksordningen 5-5 ggr den för proteaskoncentratet avses ej iïanslutning till tillämpningen av föreliggande uppfinning. 10 15 20 25 30 35 447 661 Hantering av sådant kraftfullt proteaskoncentrat skulle ound- vikligen förhöja risken för uppträdandet av lokal irritation, speciellt i andningsvägarna och andra slemhinnor, upp till en nivå som skulle vara oacceptabel för arbetare i enzymframställ- ningsanläggningen.

Dessutom är den enzymatiska instabiliteten av en sådan renad subtilisinkomponent alltför hög för att ett sådant proteas- koncentrat skall ha någon användbarhet som detergentenzym. Den väsentliga skillnaden i stabilitet som föreligger mellan renat enzym och kommersiella proteasberedningar beror uppenbarligen på närvaron i den senare av non-enzymatiskt aktiva odlingsmedie~ beståndsdelar, som stabiliserar proteaset. Sådana stabiliserande beståndsdelar är åtminstone delvis identifierbara som mindre peptider och aminosyror härrörande i huvudsak från autodigestion av proteaset under dess fermentativa framställning. Emellertid kan även ytterligare stabiliserande odlingsmediebestàndsdelar av ospecificerad karaktär vara närvarande. För lämplighetens skull användes i fortsättningen uttrycket " peptidfraktion" för sådana non-proteolytiska odlingsmediebeståndsdelar.

Peptidfraktionen elueras tillsammans med fronttoppen A när proteaskoncentratet fraktioneras på en CMC-jonbytarkolonn, såsom beskrivits i anslutning till fig. l.

Peptidfraktionsinnehållet beräknas ur formeln: _ procent totalt N - procent protein-N _ 0,14 varvid protein-N är kvävehalten av en triklorättiksyrafällning framställd under standardiserade betingelser. 1 Enligt en föredragen utföringsform av föreliggande upp- procent peptidfraktion finning är proteaskoncentratets proteolytiska aktivitet inom intervallet 2~20, företrädesvis 5-l5 Anson-enheter (AU) per g, varvid innehållet av ur odlingsmediet härledd peptidfraktion ligger inom intervallet 2-15 viktprocent.

I princip uppnås ändamålet med åstadkommande av ett för- farande för framställning av en proteasprodukt, som är i huvud- sak fri från komponent C, uppnås genom avlägsnande av endast komponent C från proteaskoncentratet, ex.vis genom fraktionerad utfällning och/eller selektiv extraktion. Bortsett ifrån det faktum, att inget förfarande av detta slag hittills utvecklats, skulle emellertid ett sådant förfarande nästan oundvikligen re- 10 15 20 25 30 35 447 661 sultera i åtföljande förlust i utbyte av subtilisin.

Dessutom_skulle de kostnader som uppstår i samband med avlägsnandet av komponent C väsentligt bidra till produktions- kostnaderna för den slutliga proteasprodukten. Separationsalter- nativet är oacceptabelt ur praktisk synpunkt.

En oundviklig stegring av prcduktionskostnaderna till o- acceptabla nivåer medför på samma sätt tillämpning av något för- farande som innebär avlägsnande av komponent C, ex.vis genom kromatografering på en CMC-jonbytarkolonn, såsom illustreras i fig. 1, enligt vilken avlägsnande av komponent C kan åstadkommas helt enkelt genom avbrytande.av elueringen kort före framträdandet av toppen C i kromatogrammet.

Ovan beskrivna hinder för framställning av ett mindre allergeniskt proteaskoncentrat har nu eliminerats i det att det förfarande redovisats, vid vilket komponent C i huvudsak elimi- neras på det mikrobiologiska stadiet genom utnyttjning av en stam av B. licheniformis som muterats för att i huvudsak blockera syntesen av komponent C under det att förmågan att syntetisera subtilisinkomponenten helt bibehålles. Odlingar av tre sådana mutantstammar av B, licheniformis har deponerats i the Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA och har tilldelats följande nummer: NRRL B-ll50l, NRRL B-ll302, NRRL B-11305 och Mutationsprocedur Mutation av B. licheniformis för blockering av dess syntes av komponent C under bibehållande av dess förmåga att syntetisera subtílisin utfördes på följande sätt. Logaritmiskt växande celler på ett medium innehållande Trypticase (2%), jästextrakt (O,5%), FeCl2, 6H2O (0,000?%), MnCl2, 4H2O (0,000l%) och MgS04, 7H2O (0,00l5%) vid pH 7,3 och hållet vid EOOC skördades efter 5 timmar och suspenderades i tris-maleatbuffert av pH 5,7.

N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanídin tillsattes till en koncentration av 100/ug/ml och suspensionen inkuberades i 50 min. på ett vattenbad vid 3000. Efter denna behandling var över- levnadsgraden O,l%. 7 g Cellerna tvättades flera gånger med bufferten och utspreds sedan på agarplattor preparerade med ovanstående odlingsmedium. 10 15 20 30 35 447 661 9, Selektion av mutanter Efter inkubering vid 5700 i 2 dygn arrangerades utskurna agarskivor, vardera uppbärande en mutantkoloni, på en glasplatta i hexagonala mönster, varefter en 1% agarosgel hälldes pà plattan.

I ett hål utskuret centralt i varje sexhörning placerades ett prov av specifikt antiserum av komponent C. Plattan inspekterades efter l dygns inkubering vid 3000. Mutantkolonier icke upp- visande utfällningslinjer utvaldes, renades genom subodling och propagerades sedan i skakkolvar.

Ytterligare karakterisering av komponent C Aminosyraanalys Den ungefärliga aminosyrasammansättningen av komponent C ges nedan. Bestämningarna är föremål för sedvanligt fel av É 10% av angivna värden. Som jämförelse anges inom parentes mot- svarande litteraturvärden för subtilisin som sådant.

Lys: 10 (9), His 8 (5), Arg; 11 (4), Asp: 22 (28), (nu: 15 (12), ThP= 33 (19), Serf 55 (52), Pr0= 13 (9), G1y= 57 (35), Ala' 17 (41), val: 16 (31), Leu 17 (16), Iieu 15 (10), Pne= 6 (4), Tyr: 21 (13), Met: 3 (5), Trp: ej best.(l), NH3: 27 (25).

Totalt antal aminosyror: 269 (275), utom Trp.

Aminosyrasammansättningen av komponent C skiljer sig som synes väsentligt från den för subtilisin, varvid den mest märkbara cys (1/2)= 2 (o), skillnaden är närvaron av de tvâ oysteinresterna (Cys l/2) i den Det föreligger vissa in- dikationer på att oysteinresterna av komponent C är sammankopp- förra jämfört med ingen i den senare. lade med en disulfidbrygga. Närvaron av en S-S-brygga i kompo- nent C, som är en medlem av gruppen av Bacillus-härledda proteaser, skulle vara högst ovanlig.

Molekylvikt Siffrorna betr. aminosyrasammansättningen antyder att molekylvikterna av komponent C och subtilisin är av samma storleks- ordning (litteraturvärdet för det senare är ca 27.300).

Inhiberingsstudier I motsats till subtilisin inhiberas komponent C ej av fos- forylerande ämnen, såsom diisopropylfosfofluoridat (DFP) eller fenylmetansulfonylfluorid (PMSF). Av dessa observationer framgår, att komponent C ej är ett serinproteas. 10 15 20 25 30 35 447 661 10 Det faktum att komponent C ej inhiberas av kelatbildare, såsom etylendiamintetraättiksyra (EDTA), anger vidare att den ej är ett metalloproteas. ' Effekt av pH på stabiliteten Komponent C uppvisar lägre stabilitet än subtilisin inom pH-intervallet 9-l0, det övervägande pH-intervallet för tvätt- lösningar. Uppenbarligen förklarar detta åtminstone delvis det faktum, att detergentenzymegenskaperna av komponent C är väsent- ligt underlägsna de för subtilisin.

Allergologiska studier Bildning av IgE-antikroppar i kaniner Lösningar (0,5 ml) av vardera av testsubstanserna subtilisln (l5,l% protein-N) och komponent C (l5,7% protein-N) jämte Al- hydrogel (Superfos, Köpenhamn, 0,5 ml och l,3% emulsion, räknat som Al205) som adjuvant injicerades subkutant på kaniner (24 djur i varje grupp). Doserna av de tvâ immunogenerna under jämförelse uttryckta i /ug protein-N var desamma. Jämförelser gjordes vid tre dosnivàer motsvarande 0,015, 0,15 resp. 1,5/ug protein-N.

Blodet avtappades från djuren den trettonde dagen efter den första immuniseringen och reimmunisering utfördes sedan följande dag. Detta schema upprepades var fjortonde dag under hela experimentperioden om 159 dagar.

Passivt kutant anafylaxtest (P05) Försöket utfördes enligt den procedur som beskrives av N.J. Zvaifler et al, Journal of Experimental Medicine, vol. 130 (1969) sid. 907. Intradermala injektioner av 0,2 ml helserum eller serumutspädningar gjordes i den nyrakade ryggen på kaniner vägande ca 2500 g. Försöken utfördes i triplikat. Efter en sensibiliseringsperiod av 72 timmar behandlades djuren intra- venöst med antigen + 50 mg Ewans Blue (Merck) upplöst i koksalt- lösning (5 ml). Behandlingsdosen motsvarade 750/Mg protein-N per djur.

Djuren avdödades efter 30-60 min. med en överdos av Nembutal och resulterande förändringar uppmättes och noterades.

Vid dosnivàn av immunogen motsvarande 0,15 /ug protein-N subkutant framträdde positiva titer för komponent 0 väsentligt tidigare och i en väsentligt större andel av djuren än mot- svarande för subtilisin.

Vid samma dosnivà var summan av titerniváerna inducerade av komponent C över 10 avtappningar väsentligt högre än den för 10 15 20 30 35 447 661 11 subtilisin (P<_0,02). Komponent C uppnådde även signifikant högre maximumtiter (P<ï0,02).

Modifierad Anson-hemoglobinmetod för bestämning av proteolytisk aktivitet Vid Anson-hemoglobinmetoden för bestämning av proteo- lytisk aktivitet digereras denaturerat hemoglobin under standard- betingelser. Det odigererade hemoglobinet utfälles med triklor- ättiksyra (TCA) och mängden TCA-löslig produkt bestämmes med Folin-Ciocalteu-fenolreagens.

En Anson-enhet (AU) är den mängd enzym, som under standard- reaktionsbetingelser nedbryter hemoglobin med en sådan ursprunglig hastighet, att per minut frigöres en mängd TCA-löslig produkt som ger samma färg med fenolreagens som en milliekvivalent tyrosin.

Standardreaktionsbetingelserna är följande: Temperatur 25°c, reaxtionstia 10 min., pa 7,5.

För ytterligare uppgifter se: M.L.Anson. Journal of General Physiology, vol. 22 (1939), sid. 79-89; O. Folin och V. Ciocalteu, The Journal of Biological Chemistry. vol, 73 (1927), sid. 627-636.

Uppfinningen kommer nu att beskrivas ytterligare i detalj i anslutning till följande exempel: Exempel l Vardera av B. licheniformis-stammarna NRRL B-11501, B-11302 och B-11503 odlades under följande betingelser: Baffelförsedda Erlenmeyer-kolvar (500 ml) förbereddes med substrat (100 ml) i vardera. Följande substratsammansättningar användes: Substrat l Substrat 2 Substrat 3 %(v1xt/voi.) %(vikt/voi.) % vikt/vol.) Potatisstärkelse 10 12,5 10 Sojabönmjöl 5 7,5 Na2HPO4.l2 H20 l 0,5 l Pluronic L-61 0,91 0,01 0,01 Tween 80 1 Barley-stärkelse 5 Natriumkaseinat 1 BAN 120 L 0,01 0,01 9,01 Pluronic L-61 är ett non-joniskt ytaktivt ämne distribu- erat av Wyandotte Corporation, Michigan, USA. 10 15 20 ZS 30 35 447 661 12 Tween 80 är polyoxietylensorbitanmonooleat distribuerat av Atlas Chemical Industries, Delaware, USA.

BAN 120 D är en kommersiell alfa-amylasprodukt erhàllen genom jäs_ning av B. subtilis och tillhandahållen av NOVO Industri A/B, Danmark.

Media upphettades från 50 till 9000 under loppet av 50 min., upphettades sedan till l2l°C under ytterligare 80 min. åt- följt av kylning.

Kolvarna inokulerades med B. licheniformis-stammen och skakades sedan på ett rotationsskakbord vid 240 varv/min. i fem dygn vid 5000. Proteasaktiviteten bestämdes sedan genom Anson- metoden. Följande resultat erhölls (AU/kg)= _ Stam Substrat l Substrat 2 Substrat 5 NRRL B-llfiol 160 219" 155 NRRL B-llzoz 158 zoo 155 NRBL B-11303 161 192 150 Prov av odlingsmedia erhållna såsom beskrivits ovan under användning av substrat 2 centrifugerades vid 15.000 g i 50 min.

Den ovanförliggande lösningen avskildes och 50"ml alikvota delar uppvärmdes till 5700. Vattenfrítt Na2S0¿ (15 g) sattes till varje portion och blandningen omrördes i 50 min. Fällningen avfiltrerades sedan och torkades under vakuum.

Bildade proteaskoncentrat hade följande karakteristika: Stam Proteolytisk akt. Protein- Peptid- AU/g halt, 75 fraktion, 75 B-11501 ll 54 8 B-11502 10 55 10 B-11505 10 51 8 _ Ett prov (5 g) av produkten erhållen från B. licheniformis NRRL B-11501 kromatograferades på en kolonn (25 X 25,5 cm) av' CMC (150 g) under betingelser analoga med de tidigare beskrivna.

Kromatogrammet erhålles genom monitering av 0D28oav fraktioner (20 ml) uppsamlade vid en flödeshastighet av 45 ml/h.

Dessutom underkastades en lösning (5% vikt/vikt) av samma koncentrat agarosgelelektrofores enligt tidigare beskrivet för- farande. Lösningar (l% vikt/volym) av subtilisin och kombonent C användes som referenser. Kromatogrammet ooh elektroferogrammen som visas i fig. 5 resp. 4 på bilagda ritning anger, att det' enda proteas som är detekterbart i proteaskoncentratet (fig. 4, 10 15 20 30 35 447 661 13 position III) är subtilisin (position II), under det att kompo- nent C (position I) är frånvarande.

Exempel 2 B. licheniformis-stam NRRL B-11501 odlades 1 1-2 dygn vid 37°c 1 en rernbaen-kolv. sedan i en jästank av rostfritt stål innehållande Efter 24 timmar vid 5400 under Denna användes på näringsagar Odlingen utvecklades nedan beskrivet luftning och sedan för ymp- jäsningssubstrat. omröring erhölls en tjock odling. ning av enzymproduktionstanken.

Ympodlingen (35 liter) överfördes till en jästank av rost- fritt stàl innehållande nedan beskrivet jäsningssubstrat. Jäs- ningsbetingelserna för både ymptanken och huvudtanken var följande: Total tankvolym: 550 liter Substratvolym: 550 liter Luftningshastighet: 500 liter/min.

Omröringz 400 varv/min. med en sexbladig turbinomrörare, 28 om diameter.

Temperatur: 5400 Substratkomposition: Potatisstärkelse 100 g/liter sojabönmjöi 50 g/liter Na2HPo4.12 H20 io g/liter EAN 120 L o,1m1/liter Piuronie L-61 1 g/liter Substratberedning: _ Substratet upphettades från 50 till 9500 under loppet av 50 min. och steriliserades sedan vid 12100 i 60 min.

Efter-en jäsningstid av 50 timmar var proteasaktiviteten 160 AU/kg, bestämt genom den modifierade Anson-metoden. Jäsnings- mediet kyiaes sedan till ca 5°c. a. Ett prov av odlingsmediet från ovan beskriven jäsning centrifugerades vid 15.000 g i 50 min. vätskan avskildes och värmdes sedan till 5700. Vattenfritt Na2S0¿ (520 g/liter) tillsattes och blandningen omrördes sedan i 50 min. och hölls fortfarande vid 5700. Fällningen avfiltrerades Den ovanförliggande därefter och torkades under vakuum.

Bildat proteaskoncentrat hade följande karakterlstika: Preteeiytisk aktivitet 8 AU/g Proteinhalt 20 % .Peptidfraktion 4 % 10 15 20 25 30 35 447 661 14 Kromatografi på CMC och agarosgelelektrofores utfört på samma sätt som beskrives i ex. 1 visade, att proteasprodukten var fri från komponent C, varvid det enda detekterbara proteaset var subtilisin. b. En andra alikvot del av ovanstående odlingsmedium centri- fugerades vid 15.000 g i_3O min. Den ovanförliggande vätskan Aceton (3 volymer) tillsattes långsamt och med Den erhållna avskildes sedan. kraftig omröring till den ovanförliggande vätskan. fällningen avfiltrerades och torkades under vakuum.

Bildat proteaskoncentrat hade följande karakteristika: Prøteoiytisk aktivitet 6 AU/g Proteinhalt 15 % Peptidfraktion 5 % Kromatografi på GMC och agarosgelelektrofores utförd på samma sätt som beskrives i ex. 1 visade, att proteasprodukten var fri från komponent C, varvid det enda detekterbara proteaset var subtilisin. ' Exemgel 2 En kommersiell partikelformig proteasprodukt framställdes på följande sätt: En förblandning bestående av enzymkoncentrat (8 AU/g; 25 viktprocent) framställt såsom beskrives i ex. 2a, polyvinyl- pyrrolidon (2%), polyetylenglykol 6000 (6%) och natriumklorid (67%) fuktades med vatten (8%), extruderades genom en skärm med 0,9 mm hål och sfäroidiserades sedan såsom beskrivas i brittiska patentet 1 362 365. Den partikelformiga produkten torkades i en fluidiserad bädd till en fukthalt av ca O,5% åtföljt av över- dragning med polyetylenglykol (4 viktprocent) och pulvriserades slutligen med en blandning (11%) av titandioxid och magnesium- silikat. 1,7 AU/g.

Exempel 4 En granulär proteasprodukt framställdes på i huvudsak samma Den slutliga enzymberedningen hade en aktivitet av sätt som beskrives i amerikanska patentet 4 106 991.

Finmalet proteaskoncentrat (9 AU/g; 25 viktprocent) fram- ställt enligt ex. 2a, titandioxid (2%), cellulosapulver (10%) CEPO.S20.(The Swedish Cellulose Powder and Wood Flour Mills, Ltd.) *-_ och finmalen natriumklorid (62%) blandades i en Lödige-blandare såsom beskrivas i ex. 1 av ovanstående US patent. 10 15 25 30 35 fungerande som bindemedel. 15 447 661 Den torra blandningen besprutades med en 4,5% vattenlösning av polyvinylpyrrolidon K 30 (l viktprocent av hela blandningen) Granulering av produkten utfördes i Lödige-blandaren àtföljt av torkning av den granulära produkten till en fukthalt understigande 5%. och överdrogs sedan med polyetylenglykol och pulvriserades enligt den procedur som beskrives i ex. 3. teasberedningen hade en aktivitet av 2 AU/g.

Exemgel 5 De enligt ex. 5 och Ä framställda partikelformiga proteas- produkterna användes för framställning av tvättpulverkompositioner med följande sammansättningar: a..

Beståndsdel NANSA S 40 S Berol WASC Tvål Natriumtripolyfosfat Natriumperborat Natriumsilikat Natrium-CMC Optiska vitmedel, doftämnen pH-justeringsmedel Proteasprøaukc (i,5-2,o AU/g) Natriumsulfat, till Bestàndsdel NANSA S 40 S Berol WASC Tvål Natriumtripolyfosfat SASIL Natriumperborat Natriumsilikat Natrium-CMC Optiska vitmedel, doftämnen pH-justeringsmedel Proteasprodukt (1,5-2,0 AU/g) Natriumsulfat, till Granulerna siktades slutligen Den sålunda erhållna pro- Mängd (viktprocent) 10 4 5 30 25 6 1 0,5 efter behov 0,8 100 Mängd (viktprocent) lO 4 5 15 15 25 .6 l 0,5 efter behov 0,8 100 UT 441 661 16 NANSA S 40 S är ett natríumalkylbensensulfonat baserat på "mjukt" fullt bionedbrytbart alkylat i pulverform (Marchon Ltd.).

Berol WASC är en non-jonisk alkylfenylpolyglykoleter (Berol AB).

SASIL är en natriumalumíniumsilikatzeolit av typ A med formeln Nal2(AlO2)l2(SíO2)l2.27 H20 (Degussa).

Claims (5)

447 661 17 PATENTKRAV

1. Proteasberedning som är lämplig för inblandning i tvätt- kompositioner, som í sig har införlivat ett av B.licheniformis hârlett subtilisinkoncentrat, och som uppvisar väsentligt redu- cerade allergeniska egenskaper jämfört med ett subtilisinkoncen- trat innehållande ett non-serinproteas, varvid däri införlivat subtilisinkoncentrat innehåller minst 0,5, företrädesvis 2-15 viktprocent, av ur odlingsmediet härledda non-proteolytiska pep- tider och den proteolytiska aktivititeten för däri införlivat sub- tilisinkoncentrat ligger inom intervallet 2- 20, företrädesvis 5-15, Anson-enheter per g, k ä n_n e t e c k n a d därav, att nämnda subtilisinkoncentrat, som är stabilíserat genom däri när- varande, ur odlingsmediet härledda non-proteolytiska peptider, är fritt från non-serinproteas och kan erhållas genom mutation av B.licheniformis med N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin och selek- tion med antiserum mot ett non-serinproteas benamnt komponent C.

2. Förfarande för framställning av en subtilisinhaltig pro- teasberedning lämplig för inblandning i tvättkompositíoner, vilken är fri från non-serinproteas och uppvisar väsentligt reducerade allergeniska egenskaper jämfört med en proteasberedning innehållan- de ett non-serinproteas, k ä n n e t e c k n a t därav, att en stam av B.1icheniformis, muterad med N-metyl-N'-nitro-N-nitroso- guanidin för att blockera dess förmåga att syntetisera andra pro- teaser än subtilisin och selekterad med antiserum mot ett non- serinproteas benämnt komponent C, odlas i ett näringsmedium inne- hållande assimilerbara källor av kol, kväve och fosfor, åtföljt av utvinning av ett subtilisin och av odlingsmediet härledda pep- tider innefattande proteaskoncentrat, vilket därefter på i och för sig känt sätt omvandlas till en proteasberedning.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att den muterade B.licheniformis-stammen är utvald ur stammarna med tilldelade depositionsnummer NRRL B-11301, B-11302 och B-11303.

4. B.licheniformis-stam utvald bland deponerade stammar med tilldelade depositionsnummer NRRL B-11301, B-11302 och B-11303. 447 661 18

5. Tvättkomposition innehållande en effektiv mängd av en proteasberedning som i sig har ínförlivat ett av B.1icheniformis hårlett subtilisinkoncentrat, och som uppvisar väsentligt reduce- rade allergeniska egenskaper jämfört med ett subtilisinkoncentrat innehållande ett non-serinproteas, varvid däri införlivat subtili- sinkoncentrat innehåller minst 0,5, företrädesvis 2-15 víktprocent, av ur odlingsmediet härledda non-proteolytiska peptider och den proteolytiska aktiviteten för däri införlivat subtilisinkoncentrat ligger inom intervallet 2-20, företrädesvis 5-15, Anson-enheter per g, varjämte nämnda subtilísinkoncentrat, som är stabilíserat genom däri närvarande, ur odlingsmediet härledda non-proteolytiska peptider, är fritt från non-serinproteas och kan erhållas gennm mutatíon av B.licheniformis med N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguánidin och selektion med antíserum mot ett non-serinproteas benämnt kem- ponent C.