DK151269B - Proteinasepraeparat med nedsat allergenicitet, fremgangsmaade til fremstilling heraf samt mikroorganismestammer til anvendelse ved fremstilling heraf - Google Patents

Description

151269

Den foreliggende opfindelse angår et proteinasepræ-parat, som er egnet som tilsætning til vaskemiddelkompositioner, en fremgangsmåde til fremstilling heraf samt en biologisk ren Bacillus licheniformis stamme til anvendelse ved 5 fremstilling heraf. Almindeligvis fremstilles kommercielle proteinasepræparater til vaskemiddelbrug ved dyrkning af udvalgte stammer af Bacillus licheniformis. Proteinasen produceres extracellulært af mikroorganismen og et protei-nasekoncentrat udvindes derefter af kulturvæsken, f.eks. ved 10 fældning med salte og/eller opløsningsmidler. Det er muligt at udføre oparbejdningsprocessen på en sådan måde, at der praktisk talt ikke bliver nogen proteinaseaktivitet tilbage i kulturvæsken. Imidlertid er fremgangsmåden ved udvindingen ikke fuldstændigt specifik med hensyn til proteinasen, hvil-15 ket bevirker, at proteinasekoncentratet normalt også vil indeholde andre konstituenter fra kulturvæsken end enzymet.

Ved tilvirkningen af et kommercielt proteinaseprodukt til vaskemidler, som f.eks. ALCALASE® (fremstillet af Novo Industri A/S, Danmark), opblandes proteinasekoncentratet der-20 efter med neutrale fyldstoffer og yderligere en række tilsætningsmidler, som tjener til at frembringe et næsten støvfrit proteinaseprodukt med forudbestemt proteolytisk aktivitet.

Den helt overvejende proteolytiske komponent i.

25 kommercielle proteinaseprodukter, der i lighed med ALCALASE er afledt af Bacillus licheniformis, er tidligere identificeret som værende subtilopeptidase A (EC 3.4.21.14), herefter benævnt subtilisin. Dette enzym, som kan udvindes af det kommercielle produkt i renset og krystalliseret tilstand, er 30 blevet nøje karakteriseret og fundet at tilhøre den samme gruppe af såkaldte serinproteinaser som trypsin og chymotryp-sin. Enzymnomenklaturen hentyder til den kendsgerning, at den mikrobielle kilde til ALCALASE oprindeligt blev klassificeret - 2 - 151269 som Bacillus subtilis. Imidlertid skulle der nu være opnået almindelig enighed om, at den mikroorganisme, der frembringer ALCALASE, er Bacillus licheniformis.

Praktisk talt alle proteiner, herunder industrielle 5 enzymer, udviser allergene egenskaber af varierende styrke i afhængighed af det enkelte protein. En mærkbar allergen effekt af de med B. licheniformis fremstillede proteinasepræ-parater iagttoges ret hurtigt efter at de var bragt på markedet, og siden da har fagfolk betragtet denne allergeni-10 citet som en uundgåelig ulempe i forbindelse med brugen af di s se prote inaseprodukter.

Hidtil har bestræbelserne for at mindske antallet af tilfælde af overfølsomhedsreaktioner blandt arbejdere og brugere udelukkende være rettet på at tilvejebringe protei-15 naseproduktet med lidet støvende egenskaber, f.eks. i form af granulater eller indkapslede partikler, med henblik på at reducere risikoen for påvirkning af proteinasen såvel for arbejdere i fabrikker, der fremstiller vaskemiddelenzymer eller pulverformede, enzymholdige vaskemidler, som forbrugere 20 af husholdningsvaskemidler. At disse bestræbelser i hvert fald delvis er lykkedes, bevidnes af den fortsatte udbredte anvendelse i den daglige husholdning af enzymholdige, pulverformede vaskemidler.

Det er imidlertid også kendt, at fremkomsten af 25 allergiske reaktioner kan være meget uforudsigelig og lunefuld. Der eksisterer derfor stadigvæk et behov for et kommercielt proteinasepræparat, hvis allergene egenskaber er i betydelig grad svækket i forhold til de tilsvarende hos hidtil kendte præparater.

151269 - 3 -

Formålet med den foreliggende opfindelse er at til- ; vejebringe et ved dyrkning af B. licheniformis fremstillet proteinaseprodukt med formindsket allergenicitet, samt at tilvejebringe en i,industriel henseende anvendelig proces til : i 5 fremstilling heraf.

Opnåelsen af dette formål er baseret på visse iagttagelser, som har relation til de kommercielle proteinasepro-diikters konstituenter og disses egenskaber.

Nyligt publicerede undersøgelser under anvendelse 10 af kvalitativ (men i høj grad følsom) immunelektrophorese (f.eks. efter Grabar-Williams metode, se R. Verbruggen et al., Biochim.Biophys., Acta, vol. 365 (1974), siderne 108 -114) viste, at de kommercielt tilgængelige proteinaseproduk-ter, herunder ALCALASE, er heterogene i antigen henseende.

15 I efterfølgende studier publiceret af Verbruggen (Biochem. Journal, vol. 151 (1975), siderne 149 - 155), hvori anvendtes den som kvantitativ agarosegel kryds-immunelektro-forese kendte teknik, viste det sig, at den proteolytiske hovedkomponent i ALCALASE, bestående af en familie af subti-20 lisin isoenzymer, ledsages af en mindre proteinkomponent, hvis antigenicitet er forskellig fra hovedkomponentens.

En metode, som også er anvendelig til præparativ fraktionering med henblik på yderligere at undersøge sammensætningen af kommercielle proteinasepræparater, er ionbytter-.25 kromatografi af det fra kulturvæsken udvundne proteinasekon-centrat. Eksempelvis kromatograferedes på denne måde et B, licheniformis proteinasekoncentrat (30 g) på en kolonne (5 x 35 cm) af carboxymethylcellulose (CMC, 500 g), som var ter-mostateret ved 4°C og ækvilibreret med en pufferopløsning 30 indstillet på pH 6.5 og bestående af 0.005 M tris(hydroxy- - 4 - 151269 methyl) aminomethan. (TRIS) maleat og 0.002 M kalciumacetat.

Til elueringen anvendtes den samme buffer, som efter fremkomsten af fronttoppen suppleredes med en lineær natrium-chlorid gradient. Den optiske tæthed af fraktioner (20 ml), 5 der opsamledes ved en strømningshastighed på 210 ml/time, måltes ved 280 nm. Kromatogrammet er vist i figur 1.

Hovedkomponenten, udvundet fra samlede fraktioner svarende til kromatogrammets top B, blev identificeret som subtilisin. Sandsynligvis er den mindre proteinasekomponent, 10 repræsenteret ved top C, identisk med den mindre proteinasekomponent, som blev fundet i kryds-immunoelektroforese (se ovenfor) og som i forbindelse hermed blev beskrevet som værende i antigen henseende forskellig fra hovedkomponenten uden i øvrigt at blive nærmere karakteriseret. I det følgende 15 vil den mindre proteinasekomponent, identificeret som ovenfor anført, blive benævnt som "C-komponenten". Det har vist sig, at C-komponenten udgør fra omkring 5 til omkring 15% af det totale proteinaseindhold af ALCALASE.

Med henblik på yderligere karakterisering blev 20 subtilisin og C-komponenten, udvundet fra samlede fraktioner svarende til henholdsvis toppene B og C, underkastet elektro-forese i agarosegel. Elektroforesen udførtes i en puffer bestående af en 0.075 M opløsning af natriumbartital med pH

8.0 ved 10°C i 60 minutter under anvendelse af en spændings-25 gradient på 15 V/cm. Til prøverne anvendtes 1% (vægt/volumen) opløsninger. Det ses af elektroforesediagrammerne, som er vist i figur 2, at subtilisin (position I) og C-komponenten (position II) under de anvendte forsøgsbetingelser udviser forskellige catodiske vandringshastigheder.

- 5 - 151269

Yderligere viser elektroforesediagrammerne, idet begge proteinaser vandrer som båndsystemer, der hver er sammensat af et hovedbånd ledsaget af langsommere vandrende sidebånd, at både subtilisin og C-komponenten udgør multiple 5 isoenzymsysterner (Verbruggen, se ovenfor).

Studier over enzyminhibering, som vil blive omtalt senere i nærværende beskrivelse, har vist, at C-komponenten i modsætning til subtilisin er en ikke-serinproteinase.

Den foreliggende opfindelse er baseret på erkendel-10 sen af, at subtilisinet har en betydelig svagere allergen effekt end C-komponenten.

Proteinasepræparatet ifølge opfindelsen, som er egnet som tilsætning til vaskemiddelkompositioner og indeholder et subtilisinholdigt proteinasekoncentrat opnået ved 15 dyrkning af en stamme af arten Bacillus licheniformis og isolering fra kulturvæsken af et proteinasekoncentrat med en proteolytisk aktivitet i området fra 2 - 20, fortrinsvis fra 5 til 15, Anson-enheder pr. gram og stabiliseret med mindst 0.5 vægtprocent, fortrinsvis fra 2-15 vægtprocent, af en 20 ikke-proteolytisk, fra kulturvæsken hidrørende peptidfraktion, er i overensstemmelse hermed ejendommeligt ved, at proteinasekoncentratet er fri for ikke-serinproteinase.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af ovennævnte proteinasepræparat indeholdende et proteinase-25 koncentrat er ejendommelig ved, at en proteinase-dannende Bacillus licheniformis stamme, som er muteret således, at dens evne til at danne ikke-serinproteinase er blokeret, dyrkes i et næringsmedium, der indeholder assimilerbare _6_ 151269 kilder til carbon, nitrogen og phosphor, hvorefter proteina-sekoncentratet udvindes og derefter på i og for sig på kendt måde omdannes til et proteinasepræparat.

Selve udvindingsmetoderne er velkendte. Efter at 5 kulturvæsken er filtreret, centrifugeret eller på anden måde er underkastet en klaringsproces, udfældes proteinasekoncen-tratet sædvanligvis, f.eks. ved tilsætning af et vandopløseligt uorganisk salt som f.eks. natrium- eller ammoniumsulfat, eller ved tilsætning af et med vand blandbart organisk opløs-10 ningsmiddel, f.eks. ethanol eller acetone. Bundfaldet kan derefter oparbejdes på sædvanlig måde, f.eks. ved filtrering eller centrifugering.

Det fugtige proteinasebundfald kan derefter tørres efter konventionelle metoder, f.eks. i vakuum. En tørrings-15 proces, som er særligt fordelagtig i stor skala, og som kombinerer spraytørring med en efterfølgende fluid-bed-tørring, er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.360.969.

Omdannelsen af det tørrede enzymkoncentrat til et kommercielt, partikelformet, lidet støvende proteinasepræpa-20 rat af forudbestemt aktivitet kan udføres efter forskellige metoder, som alle er kendt fra teknikken. En metode er beskrevet i engelsk patentskrift nr. 1.362.365, som beskriver en proces, hvorved en befugtet forblanding af enzymkoncentratet og et fortyndingsmiddel i fast form, f.eks. natrium-25 chlorid, eventuelt i nærværelse af et bindemiddel som f.eks. dextrin og/eller polyethylenglycol, extruderes og derefter omdannes til kugleformede partikler, f.eks. ved hjælp af et apparat der sælges under navnet MARUMERIZER®, efterfulgt af tørring-under fluid-bed betingelser.

- 7 - 151269

En anden mulighed er at fremstille et granuleret enzymprodukt efter en proces, som er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4.106.991. Om ønsket kan produktet underkastes en efterfølgende overtrækningsproces med henblik på yderligere 5 at reducere det endelige produkts støvende egenskaber. Overtrækning af det partikelformede produkt udføres sædvanligvis ved hjælp af en smeltet, voksagtig forbindelse, fortrinsvis ' polyethylenglycol, om ønsket efterfulgt af pudring af det resulterende overtrukne produkt under anvendelse af en fint 10 formalet pigmentfarve, f.eks. T1O2, opblandet med andre pudringsmidler.

Den foreliggende opfindelse angår som nævnt ligeledes en biologisk ren Bacillus licheniformis stamme til anvendelse ved fremstilling af det ovennævnte proteinasepræ-15 parat, som er ejendommelig ved, at den er udvalgt blandt de deponerede stammer NRRL B-11301, B-11302 og B-11303.

Det partikelformede proteinasepræparat i henhold til nærværende opfindelse kan tilsættes i en mængde, som er beregnet til at give en proteinaseaktivitet på mindst 0,1 20 Anson-enheder (AE, se nedenfor), fortrinsvis 0.5 - 2.5

Anson-enheder pr. 100 g vaskemiddelkomposition. Om nødvendigt justeres blandingens sammensætning ved tilsætning af et uorganisk fyldstof, fortrinsvis natriumsulphat.

Flydende vaskemiddelkompositioner kan fremstilles 25 ud fra opslemninger af enzymet, fortrinsvis i ikke-vandige medier. I det typiske tilfælde kan sådanne opslemninger bestå af en suspension af fint formalet proteinasekoncentrat i et flydende, non-ionisk, overfladeaktivt middel, som f.eks.

Tergitol 15 S 9, eller en blanding af sådanne midler.

30 Almindeligvis vil sådanne opsleminger også indeholde et eller - 8 - 151269 flere uorganiske fyldstoffer, som f.eks. fint formalet natriumchlorid, om ønsket i blanding med et suspensionstabiliserende middel, f.eks. "fumed silica" (AEROSIL 200®).

Vaskemiddelkompositionerne fremstilles på sædvanlig 5 måde, f.eks. ved at blande komponenterne. Alternativt kan der fremstilles en forblanding, som derefter blandes med de øvrige ingredienser.

Subtilisin i oprenset tilstand, således som det f.eks. ville kunne genvindes fra samlede fraktioner svarende 10 til top B i CMC ionbytterkromatogrammet i figur 1 og med en proteolytisk aktivitet af størrelsesordenen 3-5 gange større end proteinasekoncentratets, er uegnet i vaskemiddelkompositioner. Håndtering af et proteinasekoncentrat af en sådan aktivitet ville uundgåeligt øge risikoen for tilfælde 15 af lokal iritation, især af åndedrætsorganer og af andre slimhinder, til et for arbejdere i enzym-fremstillende virksomheder uacceptabelt niveau.

Ydermere vil et således oprenset subtilisin være i enzymatisk henseende for ustabilt til at kunne erstatte 20 proteinasekoncentratet som vaskemiddelenzym. Den betydelige forskel, der er iagttaget mellem stabiliteten af det opren-sede enzym og kommercielle proteinasepræparater, skyldes åbenbart tilstedeværelsen i sidstnævnte af ikke-enzymatisk aktive, fra kulturvæsken stammende konstituenter, som 25 stabiliserer proteinasen. sådanne stabiliserende konstituenter kan i det mindste delvis identificeres som mindre peptider og aminosyrer, hovedsageligt hidrørende fra selvnedbrydning af proteinasen i forbindelse med dens-gæringsmæssige fremstilling. Imidlertid kan andre fra kulturvæsken stammende 151269 konstituenter af uspecificeret natur også være tilstede. For nemheds skyld er udtrykket "peptid fraktion" blevet anvendt for disse ikke proteolytiske kulturvæske-konstituenter.

Peptidfraktionen elueres sammen med fronttoppen A 5 når proteinasekoncentratet fraktioneres på en CMC ionbytter-kolonne som beskrevet ovenfor i forbindelse med figur 1.

Indholdet af peptidfraktionen beregnes udfra følgende formel: procent peptidfraktion = procent total N - procent protein N, 10 0.14 idet protein N er nitrogenindholdet af et trichloreddike-syre-bundfald fremstillet under standardiserede betingelser.

Kulturer af de biologisk rene B. licheniformis stammer er deponeret hos Northern Regional Research Center, 15 Peoria, Illinois, USA og er blevet tildelt følgende deponeringsnumre: NRRL B-11301, NRRL B-11302 og NRRL B-11303. 1

Deponeringsperioden er mindst 30 år, regnet fra deponeringsdatoen, som var 1. maj 1978. Kulturerne har været offentligt tilgængelige siden 20. februar 1980.

-10- 151269

Mutationsmetode

Mutation af B. licheniformis med henblik på at blokere dens syntese af C-komponent under samtidig bibeholdelse af dens evne til at syntetisere subtilisin gennemførtes 5 på følgende måde. Bakteriecellerne dyrkedes i et medium indeholdende TRYPTICASE (2%), gærekstrakt (0.5%), FeCl2, 6H20 (0.0007%), MnCl2, 4H20 (0.0001%) og MgS04, 7H20 (0.0015%) ved pH 7.3 og en temperatur på 30°C. Logaritmisk voksende celler blev efter 5 timers udvækst høstet og derefter suspenderet i 10 TRIS-maleat buffer med pH 5.7.

N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin tilsattes til en koncentration på 100 pg/ml, hvorpå suspensionen inkuberedes i 30 minutter i et vandbad ved 30°C. Efter denne behandling var overlevelsesgraden 0.1%. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Cellerne blev vasket adskillige gange med puffer og 2 derefter spredt på agarplader, fremstillet af det ovenfor 3 nævnte vækstmedium.

4

Udvælgelse af mutanter 5

Efter inkubering ved 37°C i 2 dage udstansedes 6 agarskiver, hver med sin mutantkoloni. Skiverne blev arrange 7 ret på en glasplade i et hexagonalt mønster, hvorefter de 8 blev indstøbt i en 1% agarosegel. I et hul, udstanset i 9 centrum af hver sekskant, anbragtes en prøve af C-komponent 10 specifik antiserum. Pladen blev inspiceret efter 1 døgns 11 inkubation ved 30°C. Kolonier af mutanter, som ikke udviste præcipitationsbuer, blev udvalgt, rendyrket og derefter overpodet på rystekolber.

.η. 151269'

Supplerende karakteristik af C-komponenten Aminosyre analyse

Den omtrentlige aminosyresammensætning af C-kompo-nenten er vist nedenfor. Bestemmelsen er underkastet den 5 sædvanlige usikkerhed på ± 10 procent af de angivne værdier.

For subtilisin er tilsvarende værdier fra litteraturen til sammenligning angivet i parentes.

Lys: 10 (9); His: 9 (5); Arg: 11 (4); Asp: 22 (28); Glu: 15 (12); Thr: 33 (19); Ser 33 (32); Pro: 13 (9); Gly: 37 (35); 10 Ala: 17 (41); Val: 16 (31); Leu: 7 (16); Ileus 15 (10); Phe: 6 (4); Tyr: 21 (13); Cys (1/2): 2 (0); Met: 3 (5); Trp: ikke bestemt (1); NH3: 27 (25).

Totalt antal aminosyrer, exclusive Trp.: 269 (272).

Det ses, at aminosyresammensætningen af C-komponen-15 ten adskiller sig. signifikant fra subtilisinets, idet den mest iøjnefaldende forskel er tilstedeværelsen af to cystein-rester (Cys 1/2) i førstnævnte, sammenlignet med denne amino-syres fuldstændige fravær i subtilisin. Visse tegn tyder på, at C-komponentens cysteinrester er knyttet sammen med en 20 disulphid bro, hvilket, set på baggrund af at C-komponenten hører til gruppen af Bacillus-deriverede proteinaser, ville være højst usædvanligt.

Molekylvægt

Det fremgår af de respektive aminosyresammensæt-25 ninger, at C-komponenten og subtilisin har molekylvægte af samme størrelsesorden (idet den i litteraturen angivne værdi for sidstnævnte er omtrent 27.300).

- 12 - 151269 Hæmning af enzymaktiviteten I modsætning til subtilisin hæmmes C-komponenten ikke af phosphoryleringsmidler, som f.eks. diisopropylphos-phorofluoridat (DFP) eller phenylmethansulfonylflourid 5 (PMSF). Det fremgår haraf, at C-komponenten er en ikke-serin-proteinase.

Endvidere inhiberes C-komponenten ikke af chelat-dannende midler, som f.eks. ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), hvilket tyder på, at enzymet ikke er en metallopro-10 teinase.

Enzymstabilitetens afhængighed af pH

C-komponenten udviser en lavere stabilitet end subtilisin i pH-området fra 9 til 10, som er det fremherskende pH-interval i vaskeflotten. Antagelig er dette i hvert 15 fald en delvis forklaring på, at C-komponenten har kendeligt ringere vaskemiddelegenskaber end subtilisin.

Allergologiske undersøgelser. Dannelsen af IgE-antistoffer i kaniner

Opløsninger (0.5 ml) af hver af forbindelserne 20 subtilisin (15.1% protein N) og C-komponent (13.7 procent protein N) sammen med Alhydrogel (Superfos, København, 0.5 ml af 1.3 procent emulsion, beregnet som A^O^) som adjuvans injiceredes subkutant i kaniner (24 dyr i hver gruppe). I sammenligningsfarsøgene anvendtes samme dosis af de to 25 immunogener, udtrykt i μg protein N. Sammenligningen blev foretaget på 3 dosis-niveauer, svarende til henholdsvis 0.015, 0.15 og 1.5 μg protein N.

-13- 151269

Blodprøver blev taget på den 13. dag efter den første immunisering, hvorefter dyrene blev genimmuniseret den følgende dag. Dette skema blev gentaget hver 14. dag igennem hele forsøgsperioden, som strakte sig over 139 dage.

5 Passiv Cutan Anaphylaxi test (PCÅ)

Testen blev udført i henhold til den fremgangsmåde, der er beskrevet af N.J. Zvaifler et al., Journal of Experimental Medicine, vol. 130 (1969), side 907. Kaniner med en vægt på ca. 2500 g blev på et nybarberet område på ryggen 10 injiceret intradermalt med 0.2 ml af ufortyndet eller fortyndet serum. Testen blev udført in triplo. Efter en sensitive-ringsperiode på 72 timer blev dyrene belastet intravenøst med antigen + 50 mg Ewans Blue (Merck) opløst i saltvand (5 ml). Belastningsdosis svarende til 750 μg protein N pr. dyr.

15 Dyrene aflivedes efter 30-60 minutter med en overdosis af Nembutal, hvorefter de resulternede læsioner blev målt og noteret.

På dosisniveauet af immunogen svarende til 0.15 μg protein N subkutant fremkom de positive titere for C-kompo-20 nenten signifikant tidligere og i et forholdsmæssigt større antal af dyrene end de tilsvarende for subtilisin.

På det samme dosisniveau var summen af titerne induceret af C-komponenten over en periode omfattende i alt 10 blodprøver signifikant højere end den tilsvarende for 25 subtilisin (P 0.02). Ligeledes nåede C-komponenten signifikant højere maximale titerværdier (P 0.02).

_14_ 151269

Modificeret Anson-hæmoglobinntetode til bestemmelse af proteolytisk aktivitet I Anson-hæmoglobinmetoden til bestemmelse af proteolytisk aktivitet nedbrydes hæmoglobin under standard-5 betingelser. Det ikke nedbrudte hæmoglobin fældes med trichloreddikesyre (TCA) og mængden af TCA-opløseligt stof bestemmes ved hjælp af Folin-Ciocalteu phenolreagens.

En Anson-enhed (AE) er den mængde enzym, som under standardiserede reaktionsbetingelser nedbryder hæmoglobin med 10 en sådan begyndelseshastighed, at der pr. minut frigøres en mængde TCA-opløseligt stof, hvis farve med phenolreagenset svarer til et milliækvivalent tyrosin.

Standardreaktionsbetingelserne er følgende:

Temperatur 25°C; reaktionstid 10 minutter; pH 7,5.

15 I øvrigt henvises til: M.L. Anson; Journal of

General Physiology, vol. 22 (1939), siderne 79 - 89; O.

Folin, V. Ciocalteu, The Journal of Biological Chemistry, vol. 21 (1927), siderne 627 - 636.

Opfindelsen vil nu blive beskrevet mere detaljeret 20 under henvisning til de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Hver af B. licheniformis stammerne NRRL B-11301, B-11302 og B-11303 blev dyrket under følgende betingelser:

Erlenmeyer kolber med baffel-indstik (500 ml) blev 25 fremstillet med substrat (100 ml) i hver. Følgende substrat-sammensætning anvendtes: - 15 - 151269

Substrat 1 Substrat 2 Substrat 3 vægt/volu- vægt/volu- vægt/volu- _men %_men %_men %_

Kartoffelstivelse 10 12.5 10 5 Soj askrå 5 7.5 2

Na2HP04.12 H20 1 0.5 1

Pluronic L-61 0.01 0.01 0.01

Tween 80 1

Bygstivelse 5 10 Natriumcaseinat 1 BAN 120 L_0.01_ 0.01_0.01

Pluronic L-61 er et ikke- ionisk skumdæmpningsmiddel, som fremstilles af Wyandotte Corporation, Michigan, U.S.A.

15 Tween 80 er et polyoxyethylensorbitanmonooleat, som forhandles af Atlas Chemical Industries, Delaware, U.S.A.

BAN 120 L (NOVO INDUSTRI A/S, Danmark) er en kommerciel alpha-amylase, fremstillet ved gæring med B. subtilis.

Gæringsmedierne blev opvarmet fra 50 til 90°C i 20 løbet af 50 minutter, og derefter til 121°C i yderligere 80 minutter, efterfulgt af afkøling.

Kolberne blev inokuleret med B. licheniformis stammen og derefter monteret på et rystebord ved 240 r.p.m. i fem dage ved 30°C. Proteinaseaktiviteten blev derefter bestemt 25 efter Anson-metoden. Følgende resultater blev opnået (AE/kg): - 16 - 151269

Stamme_Substrat 1_ Substrat 2_Substrat 3 NRRL B-11301 160 219 153 NRRL B-11302 158 200 155 NRRL B-11303_161 192_ 150 5 Prøver af kulturvæskerne, fremstillet som ovenfor beskrevet med substrat 2, blev centrifugeret ved 15.000 g i 30 minutter. Supernatanten blev fraskilt og udtag på 50 ml blev opvarmet til 37°C. Vandfrit Na2S04 (15 g) sattes til hver portion, hvorefter blandingen blev omrørt i 30 minutter.

10 Bundfaldet blev derefter filtreret fra og tørret i vakuum.

De resulterende proteinasekoncentrater havde følgende sammensætning:

Stamme Proteolytisk Proteinind- Peptid fraktion aktivitet hold % % 15 _AE/g__ B-11301 11 34 8 B-11302 10 35 10 B-11303_10_31_8_

En prøve (5 g) af produktet fremstillet med B.

20 licheniformis NRRL B-11301 blev kromatograferet på en kolonne (2.5 x 23.5 cm) af CMC (130 g) under de tidligere beskrevne betingelser. Kromatogrammet fremkom ved måling af den optiske tæthed, OD2qo' fraktioner (20 ml), som blev opsamlet ved en gennemstrømningshastighed på 45 ml/t.

_17_ 151269

Endvidere blev en opløsning (3 vægt-volumen %) af samme koncentrat underkastet agarosegel elektrophorese efter den ovenfor beskrevne metode. Opløsninger (1 vægt/volumen %) af subtilisin og C-komponent blev påsat som referencer.

5 Kromatogrammet og elektropherogrammerne i henholdsvis figurerne 3 og 4 viser, at den eneste i proteinasekoncentra-tet påviselige proteinase (figur 4, position III) er subtilisin (position II), medens C-komponenten (position I) er fraværende.

10 Eksempel 2 , B. licheniformis stamme NRRL B-11301 blev dyrket på agarsubstrat i 1 - 2 dage ved 37°C i en Fernbachkolbe. Kulturen blev derefter propageret i en fermeriteringstank af rustfrit stål, indeholdende det nedenfor beskrevne substrat.

t 15 Efter 24 timer ved 34°C med beluftning og omrøring var der frembragt en tæt kultur. Denne blev derefter anvendt til podning af enzymproduktionstanken.

Podekulturen (35 1) blev overført til en gæringstank af rustfrit stål indeholdende det nedenfor beskrevne 20 gæringssubstrat. Fermenteringsbetingelserne, både for podningstanken og for hovedtanken, var følgende:

Totalt tankvolumen: 550 1

Substratvolumen: 350 1

Beluftningshastighed: 300 1/minut 25 Omrøring: 400 rpm med en seksbladet turbine-

omrører med 28 cm diamenter Temperatur: 34°C

151269 — _Lo —

Substratsammensætning:

Kartoffelmel 100 g/1

Sojaskrå 50 g/1

Na2HP04.12H20 10 g/1 5 BAN 120 L 0.1 ml/1

Pluronic L-61 1 g/1

Substratfremstilling:

Substratet opvarmedes fra 50 til 95°G i løbet af 50 minutter, og blev derefter steriliseret ved 121°C i 60 10 minutter.

Efter en gæringstid på 50 timer var proteinaseakti-viteten 160 AE/kg, bestemt efter den modificerede Anson-metode. Fermenteringsvæsken blev derefter afkølet til ca.

5°C.

15 aj_

En prøve af den ovenfor beskrevne kulturvæske blev derefter centrifugeret ved 15.000 g i 30 minutter. Superna-tanten blev skilt fra og derefter opvarmet til 37°C, Vandfrit Na2SC>4 (320 g/1) blev tilsat, og blandingen blev derefter 20 omrørt i 30 minutter, stadig ved 37°C. Bundfaldet blev derefter frafiltreret og tørret i vakuum.

Det resulterende proteinasekoncentrat havde følgende sammensætning: -19- 151269

Proteolytisk aktivitet 8 AE/g

Proteinindhold 20 %

Peptidfraktion 4 %

Kromatografi på CMC og elektroforese på agarosegel, 5 udført som beskrevet i eksempel 1, viste, at proteinase-koncentratet var frit for C-komponent, idet den eneste påviselige proteinase var subtilisin.

b.

Et andet delvolumen af ovennævnte kulturvæske blev 10 centrifugeret ved 15.000 g i 30 minutter. Supernatanten blev derefter fraskilt. Acetone (3 volumendele) tilsattes langsomt under kraftigt omrøring. Det resulterende bundfald blev derefter frafiltreret og tørret i vakuum.

Det resulterende proteinasekoncentrat havde følgen-15 de sammensætning:

Proteolytisk aktivitet 6 A/Eg

Proteinindhold 15 %

Peptidfraktion 3 %

Kromatografi på CMC og agarosegel elektroforese, 20 udført på samme måde som beskrevet i eksempel 1, viste, at proteinasekoncentratet var frit for C-komponent, og at den eneste påviselige proteinase var subtilisin.

Eksempel 3

Et kommercielt partikelformet proteinaseprodukt 25 blev fremstillet på følgende måde: - 20 - 151269

En blanding bestående af enzymkoncentrat (8 AE/g, 25 vægtprocent) fremstillet som beskrevet i eksempel 2a, polyvinylpyrrolidone (2%), polyethylenglycol 6000 (6%) og natriumchlorid 67%) blev befugtet med vand (8%), extruderet 5 gennem en sold med 0,9 mm huller og derefter sfærodiseret som beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.362.365. Det partikelformede produkt blev tørret på en fluidized bed til et vandindhold på ca. 0.5%, efterfulgt af overtrækning med poly-ethyleneglycol (4 vægtprocent) og endelig pudret med en 10 blanding (11%) af titandioxid og magnesiumsilicat. Det færdige enzympræparat havde en aktivitet på 1.7 AE/g.

Eksempel 4

Et granuleret proteinaseprodukt blev fremstillet i det væsentlige som beskrevet i U.S. patentskrift nr.

15 4.106.991.

Fint formalet proteinasekoncenrat (9 AE/g, 25 vægtprocent) , fremstillet som angivet i eksempel 2a, titandioxid (2%), cellulosepulver (10%) CEPO S20 (Svenska Tråmjols-fabrikerne, AB), og fint formalet natriumchlorid (62%) blev 20 blandet i et Lodige blandeapparat som beskrevet i eksempel 1 i ovennævnte U.S. patentskrift.

Den tørre blanding blev sprayet med en 4.5% vandig opløsning af polyvinylpyrrolidone K 30 (1% efter vægt af den totale blanding) som bindemiddel. Granulering af produktet 25 udførtes i Lodige blanderen, efterfulgt af tørring af det granulerede produkt til et vandindhold på under 3%. Til slut blev granulatet sigtet og derefter overtrukket med polyethyl-eneglycol og pudret i henhold til den fremgangsmåde, der er beskrevet i eksempel 3. Det således fremstillede proteinase-30 præparat havde en aktivitet på 2 AE/g.

Claims (4)

1. Proteinasepræparatet, som er egnet som tilsætning til vaskemiddelkompositioner og indeholder et subtilisinhol-digt proteinasekoncentrat opnået ved dyrkning af en stamme af 5 arten Bacillus licheniformis og isolering fra kulturvæsken af et proteinasekoncentrat med en proteolytisk aktivitet i området fra 2 - 2 0, fortrinsvis fra 5-15, Anson enheder pr. g og stabiliseret med mindst 0,5 vægtprocent, fortrinsvis fra 2 - 15 vægtprocent af en ikke-proteolytisk, fra kulturvæsken 10 hidhørende peptidfraktion, kendetegnet ved, at proteinasekoncentratet er fri for ikke-serinproteinase.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af et proteinasepræ-parat indeholdende et proteinasekoncentrat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en proteinase-dannende Bacil- 15 lus licheniformis stamme, som er muteret således, at dens evne til at danne ikke-serinprotease er blokeret, dyrkes i et næringsmedium, der indeholder assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og phosphor, hvorefter proteinasekoncentratet udvindes og derefter på i og for sig kendt måde omdannes 20 til et proteinasepræparat.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den muterede Bacillus licheniformis stamme er udvalgt blandt de deponerede stammer NRRL B-11301, B-11302 og B-11303. 1

4. Biologisk ren Bacillus licheniformis stamme til anvendelse ved fremstilling af proteinasepræparatet ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er udvalgt blandt de deponerede stammer NRRL B-11301, B-11302 og B-11303.