to
со
00 Изобретение относитс к биохимии и может быть использовано дл решени научно-исследовательских и прикладны задач при выделении и очистке плазми ной ДНК в упом нутой области, а такж в микробиологии, медицине, генной инженерии. Плазмидна ДНК вл етс объектом., используемым в генной инженерии в качестве векторных молекул, а также как субстрат дл многих ферментов, в том числе эндонуклеаз рестрикции, как тест-ДНК. Известен способ получени плазмид ной ДНК из бактериальных клеток., Кле ки суспендировали в буфере, разрушал лизоцимом, балластные белки отдел ли с помощью додецилсульфата натри . Дл очистки препарата использовали хлоро форм, изоамиловый спирт и фенол. Пополучаемый препарат ДНК содержит много примесей хромосомальной ДНК и РНК D Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату вл етс способ получени ковалентно-замкнутой кольцевой плазмидной ДНК, включающий еледущие стадии; суспендирование бактериальных клеток в трис-буфере содержащем глюкозу, лизоцим, инкубирова ние при О, лизис щелочным раствором додецилсульфата натри , нейтрализад ш ймеси ацетатом натри и центрифугиррвание . Плазмидную ДНК дважды переосаждают спиртом и гшкубируют с .РНКазой 2. Однако дл известного способа характерен недостаточно высокий выход целевого продукта. Целью изобретени вл етс увеличение выхода плазмидной ДНК. Постайленна цель достигаетс тем, что согласно способу получени плазмидной ДНК из микробной биомассы включающему лизис клеток, центрифу гирование, осаждение целевого про;дукта из надосадочной жидкости спиртом очистку от примесей РНК с помощью РНКазы, лизис клеток провод т щелочным раствором додецилсульфата натри при соотношении биомасса : буферньй раствор : щелочной раствор додецилсульфата натри 1:19(37-45), а очист ку от РНК осуществл ют РНКазой в присутствии 1,0-2,0 мМ ЭДТА. Способ осуществл ют следующш образом. Повышение выхода обеспечиваетс за счет сохранени суперспирапьной структуры ДНК в процессе лизиса. Понижение количества додецилсульфата натри и натра едкого, которые в среду ввод тс в определенных соотношени х , т.е. в количествах, определ ющих возможность регулировани лизиса с целью сохранени ковалентно св занной кольцевой плазмидной ДНК, а услови инкубации обеспечивают разделение ковалептно-замкнутой кольцевой . плазмидной ДНК от балластных веществ. Услови лизиса и инкубации предотвращают релаксацию ковалентно-замкнутой кольцевой плазмидной ДНК в линейную и открытую кольцевую ДНК. Предлагаемый способ обеспечивает накопление ковалентно-замкнутой кольцевой плазмидной ДНК 95-96%. Процесс очистки от РНК провод т ферментом РНКазой (0,8-0,81 мкг на 1 мг суммаррых рибонуклеиновых кислот) в присутствии 1,0-3,0 мМ ЭДТА (динатриева соль этилендиамин N - N - N - N -тётрауксусной кислоты). Введение ЭДТА подавл ет активность нуклеаз, так как нуклеазы вл ютс металлозависимыми ферментами , Э/ГГА св зывает ионы металла и ферментный центр инактивируетс . В предлагаемых услови х присутствие ЭДТА активирует каталитическую способность РНКазы, так как РНКаза не вл етс металлозависимым ферментом- Присутствие ЭДТА напротив повышает ее активность. Предлагаемый способ направлен на сохранение структ;уры плазмидной ДНК, конфигурации ее цепи, на предотвращение раскручивани цепи. Цепи удерживаютс вместе благодар образованию трех водородных св зей 1ежду гуанином (G) и цитозином (Ц) и двух водородных св зей между аденином (А) и тимином (т). Однако стабильность двойной спирали в основном определ етс взаимодействием параллельно-J(-злектронных систем оснований. Пример 1.40г биомассы Eicherichia coli НВ 101 ресуспендируют в 750 г буфера, состо щего из мМ:ЭДТА 10, глюкоза 50, трис-HCf 25, рН 8,0. Добавл ют 1,5 кг 0,8%-ного додецилсульфата натри в 0,1 н МаОН и перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь нейтрализуют добавлением 1,075 кг ЗМ ацетата натри , рН 4,8. Оставл ют при О - -4С в течение 1 ч.рсадок отдел ют центрифуги311 рованием. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, дважды переосаждают охлажденньп этанолом (6,65 кг). Полу ченньй осадок после центрифугировани ресуспендируют в 50 мл буфера, состо щего из мМ: трис-НС 10, рН 7,6, МаСв 10, ЭДТА 10, добавл ют активированную РНКазу из расчета 50 мкг на 700 млсумма-таых рибонуклеиновых кислот и инкубируют 30 мин при . Инкубат дваждь перёосаждают охлажден ным эталоном.Осадок ресуспендируют, в 20 мл буфера, состо щего из, мМ: трис--нсе 10, рН 7,6, NaCC 10, 10. Концентрацию ДНК плазмиды определ ют по формуле С А 260 -а 50, где С - концентраци плазмидной ДНК, мкг/мл;. А-.,..- оптическа . плотность при длине волны 260 нм; а - кратность разбавлени ; 50 - коэффициент, соответствующий 1 оптической единице йри .цлине волны 260 нм, мкг/мл; 1520 мкг/мл С 0,76-40:50 1,52 мг/мл. Общий выход ДНК плазмиды 30,4 мг при объеме 20 мл 0,076%. Содержание ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК 95%. Пример 2. 40 г биомас.сы Eicherichia coli НВ 101 ресуспендиРЗЖ )Т в 750 г буфера, состо щего из, мМ: ЭДТА 10, глюкоза 50,трис-НС 25, рН 8,0. Добавл ют 1,7 кг 0,8%-ного 3 .4 додецилсульфата натри в 0,1 н. NaOH и перемешивают, в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь нейтрализуют добавлением 1,2 кг ЗМ ацетата, натри ,.рН 4,8. Далее процесс провод т по примеру 1 , но в буфере дл инкубации с РНКазой концентрацию ЭДТА довод тдо 2,0 мМ. Концентрацию ДНК определ ют по Формуле С з 50 0,68-4050 1360 мкг/мл 1,36 мг/мл. Общий выход ДНК плазмиды 28 мг при объеме 20,6 мл 0,07 %. Содержание кoвaлeнтнo-зa кнyтoй кольцевой ДНК 95,5%. Приме р 3. 40 г биомассы Eicherichia coli НВ 101 ресуспендируют в 750 г буфера, состо щего из, мМ: ЭДТА 10, глюкоза 5П, трис-НСе 25, рН 8,0. Добавл ют 1,82 кг 0,8%-ного додецилсульфата натри в 0,1 н. NaOH и перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре . Смесь нейтрализуют добавлением 1,3 кг ЗМ ацетата натри , рН 4,8. . Далее процесс провод т по примеру 1, но R буфере дл инкубации с РНКазой концентрацию ЭДТА довод т до 3,0 мМ. Концентрацию ДНК плазмиды s мкг/мл определ ют по формуле С Az60-a-50 0,05-40-50 1300 мкг/мл 1,3 мг/мл. Общий выход ДНК плазмиды 27,3 мг при объеме 21,0 мл 0,068%. Содержание ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК 96%.