DE69926615T2

DE69926615T2 - Lipidabkömmlinge von pentaerythritol

Info

Publication number: DE69926615T2
Application number: DE69926615T
Authority: DE
Inventors: H. Michael NANTZ; M. Alfred ABERLE
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1999-04-02
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2019-04-03
Also published as: US6316421B1; EP1068306B1; EP1068306A1; JP2002510713A; AU3220599A; US6043390A; ATE301709T1; AU762354B2; CA2325849A1; WO1999051729A1; EP1068306A4; DE69926615D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Lipidabkömmlinge von Pentaerythrit, welche für die intrazelluläre Abgabe von Polynucleotiden nützlich sind. Diese kationischen Lipide sind bei der Herstellung von Liposomen und anderen Lipidvesikel zur Abgabe von Nucleinsäuren in Säugerzellen nützlich.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Einführung fremder Nucleinsäuren und anderer Moleküle ist ein wertvolles Verfahren zur Manipulation von Zellen und weist sowohl in der Molekularbiologie als auch in der klinischen Medizin ein großes Potential auf. Viele Verfahren sind zur Insertion endogener Nucleinsäuren in eukaryontische Zellen verwendet worden. Genetisches Material kann in Zellen eingeführt werden, um ein codiertes Protein, welches mangelhaft oder fehlerhaft ist, zu exprimieren. Die Verwendung einer derartigen Technologie lässt die Behandlung von genetischen Erkrankungen zu. Gentransfer zieht das Verteilen von Nucleinsäuren an Zielzellen und dann das Überführen der Nucleinsäure quer durch eine Membran der Zielzelle in einer Form, die auf eine therapeutische Weise wirken kann, mit sich. Von diesen vielen verwendeten Verfahren zur Erleichterung des Eintritts von DNA in eukaryontische Zellen sind kationische Liposomen unter den wirksamsten und haben umfangreiche Verwendung als DNA-Träger bei Transfektionsexperimenten gefunden. Von kationischen Lipiden selbst ist bekannt, dass sie an Polynucleotide binden und dass sie ihre intrazelluläre Abgabe in Säugerzellen erleichtern (WO 9719675). Nucleinsäure ist negativ geladen und bildet, falls sie mit einem positiv geladenen Lipid kombiniert wird, einen Komplex, der zur Formulierung und zellulären Abgabe geeignet ist. Die Verwendung von kationischen Lipidträgern zur Transfektion ist gut etabliert. Allerdings wird ihre Fähigkeit, Transfektion zu vermitteln, nicht gut verstanden.
Der genaue Weg, auf welchem Nucleinsäuren und kationische Lipide miteinander wechselwirken, und die vor und während des Transfektionsvorgangs gebildete Struktur sind nicht gut bekannt. Es wird gewöhnlich angenommen, dass die Nucleinsäuren innerhalb einer Lipid-Doppelschicht gefangen sind, was die klassische Definition eines „Liposoms" ist. Es gibt allerdings auch die Annahme, dass die Nucleinsäure nicht gefangen wird, sondern eine andere Art eines Aggregats mit dem kationischen Lipid bildet. Es ist auch berichtet worden, dass die Größe und Form des Liposom-DNA-Aggregats eine Funktion vom Verhältnis der Menge von DNA zur Menge von kationischem Lipid ist. Es ist geschlossen worden, dass DNA an die äußere Oberfläche von Liposomen bindet, welche dann in irreguläre sphärische Aggregate clustern. Die Plasmidlänge hatte keine Wirkung auf die Bindung an Liposome, und man glaubt von der Struktur des Liposom-DNA-Komplexes, dass sie sich bei Ladungsneutralität verändert, während die DNA in eine sehr kompakte Struktur organisiert wird, welche offensichtlich ganz verschieden von einem Liposom ist. Es ist geschlossen worden, dass das Liposom wahrscheinlich mindestens zwei Wege zur Einführung von DNA in Zellen verwendet: Fusion mit der Plasmamembran und Endocytose.
Die Abgabe und Expression eines transfizierten Gens stellt einen komplizierten Vorgang dar, der Schritte einschließt, welche Transfektionskomplex(Lipoplex)-Formulierung, zelluläre Internalisierung, endosomales Entweichen und nucleare Lokalisation einbeziehen. Aufnahme eines kationischen Lipids in die cytoplasmatische Membran kann durch cytoplasmatische Fusion oder Translokation nach der Aufnahme des Lipoplexes stattfinden. Aufnahme des kationischen Lipids in die cytoplasmatische Membran kann durch cytoplasmatische Fusion oder Translokation nach der Aufnahme des Lipoplexes stattfinden. Zelluläre Vorgänge können durch die Aufnahme von positiv geladenen Lipiden in die Plasmamembran inhibiert werden. Diese Aufnahme kann zu Funtionsstörung der Zelle und unter Umständen zum Zelltod führen. Daher gibt es, obwohl es Vorteile des durch kationisches Lipid erleichterten Gentransfers gibt, auch schädliche Wirkungen von Lipid-Salzen auf zelluläre Vorgänge. Die Langzeitverabreichung kationischer Lipoplexe hat gezeigt, dass sie Entzündungsreaktionen und Cytotoxizität auslösen.
Die Lipid-assoziierte Cytotoxizität ist der Inhibition der Proteinkinase C-Aktivität durch kationische Lipide nach der Internalisierung des Lipoplexes zugeschrieben worden. Dies ist vermutlich eine Folge der Aufnahme von kationischem Lipid in die Plasmamembran. Zusätzlich wird die Transfektion der Bildung von Transmembranporen zugeschrieben. Es gibt auch sich ergebende Unterbrechungen von Signalübertragungs- und Genregulationsvorgängen, welche die zelluläre Funktion beeinträchtigen. Es ist möglich, dass eine verstärkte Clearance der kationischen Lipide die Cytotoxizität vermindern könnte.
Es gibt einen Bedarf zur Entwicklung von Lipiden, welche bei der Erleichterung der intrazellulären Abgabe von genetischem Material wirksam sind, die aber die damit assoziierte Toxizität verringern werden. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses und andere Bedürfnisse.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein amphiphiles Lipid zur intrazellulären Abgabe von Polynucleotiden der Formel I,
In Formel I ist R¹ eine funktionelle Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf C₈-C₂₄-Alkyl und C₈-C₂₄-Alkenyl, wobei R¹ und R² nicht beide Stearyl (C₁₈)-Gruppen sind. Die Alkenylreste können mehr als einen Ort der Ungesättigtheit aufweisen, und die Doppelbindungen können cis oder trans sein. R² in Formel I ist eine funktionelle Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf C₈-C₂₄-Alkyl und C₈-C₂₄-Alkenyl. Die Alkenylreste können mehr als einen Ort der Ungesättigtheit aufweisen, und die Doppelbindungen können cis oder trans sein. R³ in Formel I ist eine funktionelle Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C₁-C₈-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Arylalkyl, C₁-C₈-Alkylthioalkyl, Guanidinoalkyl, Carboxyalkyl, Aminoalkyl, Carbamoyl-C₁-C₈-Alkyl und Heteroarylalkyl. R⁴ in Formel I ist eine funktionelle Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C₁-C₈-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Arylalkyl, C₁-C₈-Alkylthioalkyl, Guanidinoalkyl, Carboxyalkyl, Aminoalkyl, Carbamoyl-C₁-C₈-Alkyl und Heteroarylalkyl. Y¹ in Formel I ist eine funktionelle Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wasserstoff und C₁-C₆-Alkyl. Y² in Formel I ist eine funktionelle Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wasserstoff und C₁-C₆-Alkyl. Y³ in Formel I ist eine funktionelle Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wasserstoff und C₁-C₆-Alkyl. Y⁴ in Formel I ist eine funktionelle Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wasserstoff und C₁-C₆-Alkyl. Y⁵ in Formel I ist eine funktionelle Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wasserstoff und C₁-C₆-Alkyl. Y⁶ in Formel I ist eine funktionelle Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wasserstoff und C₁-C₆-Alkyl. X in Formel I ist ein Anion wie Halogen, einschließlich Chlorid, Iodid, Fluorid und Bromid, oder ein Oxyanion. In einer anderen Ausführungsform sind R³, Y¹ und die Atome, an welche sie gebunden sind, verbunden, um einen gegebenenfalls substituierten 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring zu bilden. In einer anderen Ausführungsform sind R⁴, Y⁶ und die Atome, an welche sie gebunden sind, verbunden, um einen gegebenenfalls substituierten 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring zu bilden.
Die kationischen Lipide der Formel I sind aus etlichen Gründen attraktiv. Diese neuen kationischen Lipide sind von Pentaerythrit abgeleitet, was ein einzigartiges „Dreh- und Angelpunkt („linchpin")"-Gerüst bereitstellt, das sich von den gegenwärtigen Diacylpropanaminiummotiven, die gewöhnlich beim Gentransfer verwendet werden, unterscheidet. Darüber hinaus sind die Lipide der Formel I weniger toxisch als bekannte kationische Lipide, zum Teil auf Grund ihrer metabolischen Aminosäurenebenprodukte. Zusätzlich ist von den Liposomen und Lipid-Komplexen, dessen Lipide die kationischen Lipide der Formel I einschließen, gezeigt worden, dass sie vergleichbare Transfektionswirkungsgrade wie die kationischen Lipide vom Stand der Technik aufweisen.
In einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung einen Lipid-Nucleinsäure-Komplex, wobei der Lipidanteil davon ein amphiphiles kationisches Lipid der Formel I enthält.
In noch einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Transfektion einer Nucleinsäure in eine Zelle. Bei diesem Verfahren wird die Zelle mit einem Lipid-Nucleinsäure-Komplex oder Liposom in Kontakt gebracht, wobei der Lipidanteil davon ein amphiphiles kationisches Lipid der Formel I enthält. Unter Verwendung von Standardtechniken können die Lipide der Formel I die in vivo- und in vitro-Transfektion mit hohem Wirkungsgrad von Nucleinsäuren in die Zellen erleichtern.
In einem weiteren noch anderen Aspekt betrifft diese Erfindung ein Arzneimittel oder eine andere Zusammensetzung zur Arzneistoffabgabe zur Verabreichung eines Nucleinsäureteilchens an eine Zelle. Diese Zusammensetzung schließt einen Lipid-Nucleinsäure-Komplex, wobei der Lipidanteil davon ein amphiphiles kationisches Lipid der Formel I enthält, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger ein.
In noch einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung neue Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, die sich aus Infektion mit einem Pathogen oder aus einer endogenen DNA-Defizienz ergeben. Diese Verfahren beziehen das Verabreichen einer Lösung eines Liposom-Nucleinsäure-Aggregats und/oder Liposom-Arzneistoff-Aggregats an einen Säuger, der an einer pathogenen Infektion oder an einer DNA-Defizienz leidet, ein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Balkendiagramm, das die Transfektionsaktivität von DMTM(Gly) : DOPE-Liposomen als eine Funktion der Molprozent DOPE zeigt. DNA-Transfektionen wurden unter Verwendung von NIH 3T3-Zellen durchgeführt. Lipoplexe wurden bei einem molaren Ladungsverhältnis von 2 : 1 (Ladung des Lipids zu DNA-Phosphatladung) formuliert. Die gezeigten Werte sind die mittlere (n = 4) und Standardabweichung der gesamten Luciferase-Licht-Einheiten (RLU), die von Zellen, welche nach Verabreichung von 1 mg DNA lysiert wurden, erhalten wurden.
2 ist ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse der Luciferasetransfektion als die mittlere (n = 4) und Standardabweichung der gesamten Luciferase-Licht-Einheiten (RLU, linke vertikale Achse) zeigt, die von NIH 3T3-Zellen, welche nach Verabreichung von 1 mg DNA lysiert wurden, erhalten wurden. Die relative Cytotoxizität, dargestellt durch die durchgehende Linie, berechnet, wie in Beispiel 3 beschrieben, ist gemäß der rechten vertikalen Achse aufgetragen. Mit Ausnahme von DOTAP wurden 1 : 1-kationisches Lipid : DOPE-Liposomen bei einem molaren Ladungsverhältnis von 2 : 1 (Ladung des Lipids zu DNA-Phosphatladung) zur Lipoplex-Bildung verwendet. DOTAP wurde ohne ein Co-Lipid verwendet.
3 ist ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse der Luciferasetransfektion als die mittlere (n = 4) und Standardabweichung der gesamten Luciferase-Licht-Einheiten (RLU, linke vertikale Achse) zeigt, die von 16HBE14_o–-Zellen, welche nach Verabreichung von 1 mg DNA lysiert wurden, erhalten wurden. Die relative Cytotoxizität, dargestellt durch die durchgehende Linie, berechnet, wie in Beispiel 3 beschrieben, ist gemäß der rechten vertikalen Achse aufgetragen. Mit Ausnahme von DOTAP wurden 1 : 1-kationisches Lipid : DOPE-Liposomen bei einem molaren Ladungsverhältnis von 2 : 1 (Ladung des Lipids zu DNA-Phosphatladung) zur Lipoplex-Bildung verwendet. DOTAP wurde ohne ein Co-Lipid verwendet.
GLOSSAR
Der Begriff „kationisches Lipid" bezeichnet jede Anzahl von Lipidarten, welche bei physiologischem pH-Wert eine positive Nettoladung tragen. Derartige Lipide schließen Dimyristoyl-bis(N,N,N-trimethylglycyl)tetraester („DMTM(Gly)"); Dioleoyl-bis(N,N,N-trimethylglycyl)tetraester („DOTM(Gly)"); N,N-Dioleyl-N,N-dimethylammoniumchlorid („DODAC"); N-(2,3-Dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid („DOTMA"); N,N-Distearyl-N,N-dimethylammoniumbromid („DDAB"); N-(2,3-Dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid („DOTAP"); 3β-(N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl)cholesterin („DC-Chol") und N-(1,2-Dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid („DMRIE") ein, sind aber nicht beschränkt darauf. Zusätzlich sind etliche Zubereitungen kationischer Lipide im Handel erhältlich, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diese schließen zum Beispiel LIPOFECTIN^®(im Handel erhältliche kationische Liposomen, umfassend DOTMA und 1,2-Dioleoyl-sn-3-phosphoethanolamin („DOPE"), von GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y., USA); LIPOFECTAMINE^® (im Handel erhältliche kationische Liposomen, umfassend N-(1-(2,3-Dioleyloxy)propyl)-N-(2-(spermincarboxamido)ethyl)-N,N-dimethylammoniumtrifluoracetat („DOSPA") und („DOPE"), von GIBCO/BRL); und TRANSFECTAM^® (im Handel erhältliche kationische Lipide, umfassend Dioctadecylamidoglycylcarboxyspermin („DOGS") in Ethanol von Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) ein.
Der Begriff „Lipid-Aggregat" benennt sowohl unilamellare als auch multilamellare Liposomen ebenso wie Mizellen und Virosomen und amorphere Aggregate kationischer Lipide oder Lipide, die mit amphipathischen Lipiden wie Phospholipiden gemischt sind.
Wie hierin verwendet, benennt der Begriff „Alkyl" verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffketten wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, sec-Butyl, iso-Butyl, tert-Butyl, Octadecyl und 2-Methylpentyl. Diese Reste sind gegebenenfalls substituiert mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen, welche üblicherweise an derartige Ketten angelagert sind, wie Hydroxyl, Brom, Fluor, Chlor, Iod, Mercapto, Cyano, Alkylthio, Heterocyclyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyl, Carbalkoyl, Alkyl, Alkenyl, Nitro, Amino, Alkoxyl, Amido und dergleichen, um Alkylreste wie Trifluormethyl, 3-Hydroxyhexyl, 2-Carboxypropyl, 2-Fluorethyl, Carboxymethyl, Cyanobutyl und dergleichen zu bilden.
Der Begriff „Alkenyl" benennt verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffketten, die ein oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen enthalten.
Der Begriff „Aryl" benennt ein Kette von Kohlenstoffatomen, welche mindestens einen aromatischen Ring mit vorzugsweise zwischen etwa 6–14 Kohlenstoffatomen bilden, wie Phenyl, Anthryl, Naphthyl, Indenyl und dergleichen, und der mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen, die üblicherweise an derartige Ketten angelagert sind, substituiert sein kann, wie Hydroxyl, Brom, Fluor, Chlor, Iod, Mercapto oder Thio, Cyano, Cyanoamido, Alkylthio, Heterocyclus, Aryl, Heteroaryl, Carboxyl, Carbalkoyl, Alkyl, Alkenyl, Nitro, Amino, Alkoxyl, Amido und dergleichen, um Arylreste wie Biphenyl, Iodbiphenyl, Methoxybiphenyl, Bromphenyl, Iodphenyl, Chlorphenyl, Hydroxyphenyl, Methoxyphenyl, Formylphenyl, Acetylphenyl, Trifluormethylthiophenyl, Trifluormethoxyphenyl, Alkylthiophenyl, Trialkylammoniumphenyl, Amidophenyl, Thiazolylphenyl, Oxazolylphenyl, Imidazolylphenyl, Imidazolylmethylphenyl und dergleichen zu bilden.
Der Begriff „Acyl" benennt den Rest -C(O)R, wobei R Alkyl oder Aryl ist, wie vorstehend definiert, wie Formyl, Acetyl, Propionyl oder Butyryl.
Der Begriff „Alkoxy" benennt -OR-, wobei R Alkyl ist.
Der Begriff „Amino" benennt eine Amin-Bindung: -NR-, wobei R Wasserstoff oder Alkyl ist.
Der Begriff „Carboxylate" gibt -C(O)O- an.
Der Begriff „Oxyanionen" gibt einen allgemeinen Begriff für funktionelle Gruppen mit einem Sauerstoffatom, welches eine negative Ladung enthält, an, wie aromatische oder aliphatische Carboxylate, Sulfonate und Sulfate.
Der Begriff „Sulfonate" gibt R-S(O)₂O- an, wobei R aromatisch oder aliphatisch sein kann.
Der Begriff „Sulfate" gibt -RO-S(O)₂O- an, wobei R aromatisch oder aliphatisch sein kann.
Der Begriff „Seitenkette" von Aminosäuren benennt den Rest R, welcher an das α-Kohlenstoffatom von natürlich vorkommenden Aminosäuren ebenso wie von synthetischen Aminosäuren und/oder Aminosäuremimetika gebunden sind. Diese Reste schließen sowohl D- als auch L-Aminosäuren ein. Dieser Rest schließt Wasserstoff (Glycin); Methyl (Alanin); Isopropyl (Valin); iso-Butyl (Leucin); sec-Butyl (Isoleucin); Hydroxymethyl (Serin); Benzyl (Phenylalanin); 3-Indolmethyl (Tryptophan); Pyrrolidin (Prolin); 4-Hydroxypyrrolidin (Hydroxyprolin); 2-Methylthioethyl (Methionin); Carboxymethyl (Aspartat); Carbamoylmethyl (Asparagin); Carboxyethyl (Glutaminsäure); Carbamoylethyl (Glutamin); Aminobutyl (Lysin); Guanidinopropyl (Arginin); Imidazolylmethyl (Histidin); 1-Hydroxyethyl (Threonin); Hydroxyphenylmethyl (Tyrosin) und Thiomethyl (Cystein) ein, ist aber nicht beschränkt darauf.
Beispiele für „synthetische Aminosäuren" schließen Norleucin, Norvalin, Alloisoleucin, Homoarginin, Thioprolin, Dehydroprolin, Hydroxyprolin, Isonipecotinsäure, Homoserin, Cyclohexylglycin, α-Amino-n-buttersäure, Cyclohexylalanin, Aminophenylbuttersäure, Phenylalanine, die an der ortho-, meta- oder para-Position der Phenyleinheit mit ein oder zwei des Folgenden substituiert sind: einem (C₁-C₄)-Alkyl, einem (C₁-C₄)-Alkoxy, Halogen- oder Nitroresten oder die mit einer Methylendioxygruppe substituiert sind; β-2- und 3-Thienylalalanin, β-2- und 3-Furanylalanin, β-2-, 3- und 4-Pyridylalanin, β-(Benzothienyl-2- und 3-yl)alanin, β-(1- und 2-Naphthyl)alanin, O-alkylierten Abkömmlingen von Serin, Threonin oder Tyrosin, S-alkyliertem Cystein, S-alkyliertem Homocystein, O-Sulfat-, O-Phosphat- und O-Carboxylatestern von Tyrosin, 3- und 5-Sulfotyrosin, 3- und 5-Carboxytyrosin, 3- und 5-Phosphotyrosin, 4-Methansulfonsäureester von Tyrosin, 4-Methanphosphonsäureester von Tyrosin, 4-Phenylessigsäure, 3,5-Diiodtyrosin, 3- und 5-Nitrotyrosin, ε-Alkyllysin und delta-Alkylornithin, ein.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
A. Verbindung und Synthese
Die vorliegende Erfindung betrifft ein amphiphiles Lipid zur intrazellulären Abgabe von Polynucleotiden der Formel I.
wobei R¹, R², R³, R⁴, Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶ und X wie vorstehend definiert sind, wobei R¹ und R² nicht beide Stearyl (C₁₈)-Gruppen sind. Die amphiphilen kationischen Lipide der Formel I können durch Behandlung von im Handel erhältlichem Pentaerythrit mit zwei Äquivalenten des passenden Acylchlorids hergestellt werden. Die Acylchloride sind im Handel erhältlich oder können unter Verwendung der gewünschten Fettsäure und Oxalylchlorid unter Umsetzungsbedingungen, die Fachleuten für chemische Synthesen wohlbekannt sind, synthetisiert werden.
Die Acylierungsumsetzung wird in einem aprotischen Lösungsmittel durchgeführt. Geeignete aprotische Lösungsmittel schließen Pyridin, Dimethylformamid und Tetrahydrofuran ein, sind aber nicht beschränkt darauf. Das Umsetzungsgemisch enthält auch einen Katalysator. Geeignete Katalysatoren schließen Ester-bildende Katalysatoren wie 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin (DMAP) ein, sind aber nicht beschränkt darauf. Das Umsetzungsgemisch wird mit Hilfe eines Eisbads auf zwischen –20 und 10°C gekühlt. Das Umsetzungsgemisch wird allmählich auf Raumtemperatur erwärmt, und die Umsetzungsbedingungen erzeugen ein Gemisch der mono-, bis-, tris- und tetraacylierten Produkte. Das Material kann dann unter Verwendung chromatographischer Techniken wie Silicagelchromatographie abgetrennt werden, um das gewünschte bisacylierte Produkt zu erbringen.
Anlagerung der Aminosäurekopfgruppe wird durch Verwendung eines N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)-Kupplungsprotokolls, welches katalytisches DMAP und Pentafluorphenol einbezieht, erreicht. Die sich ergebenden Verbindungen der Formel I können unter Verwendung von chromatographischen Techniken wie Säulenchromatographie gereinigt werden.
Der Begriff amphiphiles Lipid bezeichnet ein Lipid mit einem hydrophoben Anteil, welcher sich in eine hydrophobe Phase anordnet, und mit einen hydrophilen Anteil, welcher sich in Richtung der wässrigen Phase anordnet. Verbindungen der Formel I weisen sowohl einen hydrophoben Anteil als auch einen hydrophilen Anteil auf. Der Anteil des Moleküls mit R¹ und R² ist der hydrophobe Anteil. Der Anteil des Moleküls, welcher die quaternären Ammoniumsalze besitzt, ist die hydrophile oder polare Region.
Die Fettacylketten können ausgewählt werden, dass sie gleich oder verschieden sind. Sie können gesättigt sein oder können eine einzige oder mehrere Stelle(n) der Ungesättigtheit aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind R¹ und R² C₈-C₂₀-Alkyl. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform sind R¹ und R² unabhängig voneinander eine Myristyl-, Oleyl-, Lauryl-, Stearyl- oder eine Palmitylgruppe.
Die polare Domänengruppe kann von jeder α-Aminosäure-Einheit abgeleitet werden, wobei nur erforderlich ist, dass die α-Aminosäure ein tertiäres Stickstoffatom enthält. R³ und R⁴ sind vorzugsweise die Seitenkette einer α-Aminosäure. Der Begriff „Seitenkette" einer Aminosäure benennt den Rest R, welcher an das α-Kohlenstoffatom einer natürlich vorkommenden Aminosäure, einer synthetischen Aminosäure oder eines Aminosäuremimetikums gebunden ist. Dieser Rest schließt Wasserstoff (Glycin); Methyl (Alanin); Isopropyl (Valin); Isobutyl (Leucin); sec-Butyl (Isoleucin); Hydroxymethyl (Serin); Benzyl (Phenylalanin); 3-Indolmethyl (Tryptophan) und dergleichen ein, ist aber nicht beschränkt darauf.
In einer anderen Ausführungsform sind R³, Y¹ und die Atome, an welche sie gebunden sind, verbunden, um einen gegebenenfalls substituierten 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring zu bilden. Geeignete heterocyclische Ringe schließen Pyrrolidin, Imidazol, Imidazolylmethyl, 4-Hydroxypyrrolidin, Piperidin, Morpholin, Pyridin, Pyrazidin, Pyrazol, Pyrrol und dergleichen ein, sind aber nicht beschränkt darauf. In einer anderen Ausführungsform sind R⁴, Y⁶ und die Atome, an welche sie gebunden sind, verbunden, um einen gegebenenfalls substituierten 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring zu bilden. Geeignete heterocyclische Ringe schließen Pyrrolidin, Imidazol, Imidazolylmethyl, 4-Hydroxypyrrolidin, Piperidin, Morpholin, Pyridin, Pyrazidin, Pyrazol, Pyrrol und dergleichen ein, sind aber nicht beschränkt darauf.
Zusätzliche strukturelle Mannigfaltigkeit kann in Verbindungen der Formel I während der Quaternisierung des tertiären Stickstoffatoms eingeführt werden, um die polare Domäne des Ammoniumsalzes zu erzeugen. Geeignete Alkylierungsreagenzien schließen Alkylhalogenide ein. Alkyliodide werden bevorzugt.
Das Anion des quaternären Stickstoffatoms kann auch variiert werden. Geeignete Anionen schließen Iodid, Chlorid, Fluorid, Bromid, Oxyanionen wie Carboxylate, Sulfonate und Sulfate ein. Iodid wird bevorzugt.
Verbindungen der Formel I, welche bevorzugt sind, sind Dimyristoyl-bis(N,N,N-trimethylglycyl)tetraester-Ammoniumhalogensalz und Dioleoyl-bis(N,N,N-trimethylglycyl)tetraester-Ammoniumhalogensalz.
B. Liposomenherstellung und -zusammensetzung
In einem zweiten Aspekt betrifft diese Erfindung einen Lipid-Nucleinsäure-Komplex, umfassend eine Nucleinsäure und mindestens ein amphiphiles kationisches Lipid der Formel I. Wie vorstehend angegeben, beziehen die erfindungsgemäßen Verfahren das Komplexieren eines kationischen Lipids mit einer Nucleinsäure ein. Der Begriff „kationisches Lipid" bezeichnet jede Anzahl von Lipidarten, welche bei physiologischem pH-Wert eine positive Nettoladung tragen. Derartige Lipide schließen DODAC, DOTMA, DDAB, DOTAP, DC-Chol und DMRIE ein, sind aber nicht beschränkt darauf. Zusätzlich sind etliche Zubereitungen kationischer Lipide im Handel erhältlich, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diese schließen zum Beispiel LIPOFECTIN^® (im Handel erhältliche kationische Liposomen, umfassend DOTMA und DOPE, von GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y., USA); LIPOFECTAMINE^® (im Handel erhältliche kationische Lipsomen, umfassend DOSPA und DOPE, von GIBCO/BRL); und TRANSFECTAM^® (im Handel erhältliche kationische Lipide, umfassend DOGS in Ethanol von Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) ein.
Das kationische Lipid kann allein oder in Kombination mit einem „Helfer"-Lipid verwendet werden. Bevorzugte Helferlipide sind bei physiologischem pH-Wert nichtionisch oder ungeladen. Besonders bevorzugte nicht-ionische Lipide schließen Cholesterin und DOPE, wobei Cholesterin am meisten bevorzugt ist, ein, sind aber nicht beschränkt darauf. Das molare Verhältnis von kationischem Lipid zum Helfer kann von 2 : 1 bis etwa 1 : 2, stärker bevorzugt von etwa 1,5 : 1 bis etwa 1 : 1,5 reichen, und am meisten bevorzugt ist es etwa 1 : 1.
Zusätzlich können kationische erfindungsgemäße Lipide in Liposomen formuliert werden. Liposome werden durch wohlbekannte Techniken konstruiert, wie in Liposome Technology, Bände 1–3 (G. Gregoriadis, Hsg., CRC Press, 1993) beschrieben. Lipide werden typischerweise in Chloroform gelöst und in einem dünnen Film über die Oberfläche eines Röhrchens oder eines Kolbens durch Rotationseindampfung aufgetragen. Falls Liposome, die aus einem Gemisch aus Lipiden bestehen, gewünscht werden, werden die einzelnen Komponenten in der ursprünglichen Chloroformlösung gemischt. Nachdem das organische Lösungsmittel entfernt worden ist, wird eine Phase zugegeben, welche aus Wasser, das möglicherweise Puffer und/oder Elektrolyte enthält, besteht und das Gefäß geschüttelt, um das Lipid zu suspendieren. Gegebenenfalls wird die Suspension dann einer Ultraschallbehandlung unterzogen, entweder in einem Ultraschallbad oder mit einem Sondenbeschallungsgerät, bis die Teilchen in ihrer Größe verringert sind und die Suspension die gewünschte Klarheit hat. Für die Transfektion ist die wässrige Phase typischerweise destilliertes Wasser, und die Suspension wird beschallt, bis sie beinahe klar ist, was einige Minuten erfordert, abhängig von den Bedingungen, der Art und Qualität des Beschallungsgeräts. Gewöhnlicherweise sind die Lipidkonzentrationen 1 mg/ml der wässrigen Phase, könnten aber leicht um einen Faktor zehn höher oder niedriger sein.
Die erfindungsgemäßen Liposome umfassen ein oder mehrere der kationischen Lipide der Formel I. Erfindungsgemäße Liposome weisen gegebenenfalls ein oder mehrere andere Amphiphile auf. Die genaue Zusammensetzung der Liposomen wird von den besonderen Umständen, für welche sie verwendet werden sollen, abhängen. Für Fachleute ist es eine Routineangelegenheit, eine geeignete Zusammensetzung zu bestimmen. Die erfindungsgemäßen Liposome umfassen mindestens ein kationisches erfindungsgemäßes Lipid. In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die erfindungsgemäßen Liposome im Wesentlichen aus einer einzigen Lipidart der Formel I. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Liposome Gemische aus Verbindungen der Formel I. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Liposome ein oder mehrere Lipide der Formel I in einem Gemisch mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden oder synthetischen Lipiden, z. B. Cholesterin oder DOPE.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden vor allem unilamellare Liposome durch das Umkehrphasen-Eindampfungsverfahren von Szoka & Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4194–4198 (1978) erzeugt. Unilamellare Vesikel werden im Allgemeinen durch Ultraschallbehandlung oder Extrudieren hergestellt. Beschallung wird im Allgemeinen mit einem Bad-Beschallungsgerät wie einem Branson-Tip-Spitzenbeschallungsgerät bei einer kontrollierten Temperatur, wie sie durch den Schmelzpunkt des Lipids bestimmt wird, durchgeführt. Extrudieren kann durch Biomembran-Extruder durchgeführt werden, wie dem Lipex Biomembran Extruder. Definierte Porengröße in den Extrusionsfiltern können unilamellare liposomale Vesikel mit bestimmten Größen erzeugen. Die Liposome können auch durch Extrudieren durch ein asymmetrisches Keramikfilter wie ein Ceraflow Microfilter, das im Handel von Norton Company, Worcester MA erhältlich ist, gebildet werden.
Bei der folgenden Liposomenherstellung können die Liposome, welche während der Bildung nicht der Größe nach sortiert worden sind, durch Extrudieren der Größe nach sortiert werden, um einen gewünschten Größenbereich und eine relativ enge Verteilung der Liposomengrößen zu erreichen. Ein Größenbereich von etwa 0,2–0,4 Mikron lässt zu, dass die Liposomensuspension durch Filtersterilisation durch ein gewöhnliches Filter, typischerweise ein 0,22 Mikron-Filter, sterilisiert wird. Das Verfahren der Filtersterilisation kann auf der Grundlage eines Hochdurchsatzverfahrens durchgeführt werden, falls die Liposome auf eine Größe bis hinunter zu etwa 0,2–0,4 Mikron sortiert wurden.
Einige Techniken zur Größensortierung von Liposomen in eine gewünschte Größe sind verfügbar. Ein Verfahren zur Größensortierung wird in den US-Pat. Nr. 4,529,561 oder 4,737,323, welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind, beschrieben. Beschallung einer Liposomensuspension, entweder durch Beschallung im Bad oder durch eine Sonde, erzeugt eine schrittweise Verringerung der Größe hinunter zu kleinen unilamellaren Vesikeln, mit einer Größe von weniger als etwa 0,05 Mikron. Homogenisierung ist ein anderes Verfahren, welches auf Scherenergie beruht, um große Liposome in kleinere zu fragmentieren. In einem typischen Homogenisierungsverfahren werden multilamellare Vesikel durch einen Standard-Emulsionshomogenisator bis zur gewählten Liposomengröße rezirkularisiert, typischerweise werden zwischen etwa 0,1 und 0,5 Mikron beobachtet. Die Größe der liposomalen Vehikel kann durch quasielektrische Lichtstreuung (QELS), wie in Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10: 421–450 (1981) beschrieben, bestimmt werden. Der durchschnittliche Liposomendurchmesser kann durch Beschallung gebildeter Liposomen verringert werden. Intermittierende Beschallungszyklen können mit einer QELS-Bewertung abgewechselt werden, um effiziente Liposomensynthese zu lenken.
Extrusion des Liposoms durch eine kleinporige Polycarbonatmembran oder eine asymmetrische keramische Membran ist auch ein wirksames Verfahren zur Verringerung der Liposomengrößen auf eine relativ gut definierte Größenverteilung. Typischerweise wird die Suspension ein- oder mehrmals durch die Membran hin und hergeschickt, bis die gewünschte Verteilung der Liposomengröße erreicht ist. Die Liposomen können durch aufeinander folgende kleiner-porige Membranen extrudiert werden, um eine allmähliche Verringerung der Liposomengröße zu erreichen. Zur erfindungsgemäßen Verwendung weisen Liposomen eine Größe von etwa 0,05 Mikron bis etwa 0,5 Mikron auf. Stärker bevorzugt sind Liposomen mit einer Größe von etwa 0,05 bis 0,2 Mikron.
C. Nucleinsäure
Nucleinsäuren aller Arten können mit den erfindungsgemäßen kationischen Lipiden und Liposomen assoziiert werden und anschließend transfektiert werden. Diese schließen DNA, RNA, DNA/RNA-Hybride (wobei jedes davon einzel- oder doppelsträngig sein kann), einschließlich Oligonucleotide wie Antisense-Oligonucleotide, chimäre DNA-RNA-Polymere und Ribozyme ebenso wie modifizierte Versionen dieser Nucleinsäuren, wobei die Modifikation in der Basen-, Zucker-Einheit, der Phosphatbindung oder in jeder Kombination davon sein kann, ein.
Aus dem Vorangangenen wird Fachleuten klar sein, dass die erfindungsgemäßen Liposome für sowohl in vitro- als auch in vivo-Anwendungen nützlich sind. Die erfindungsgemäßen Liposome werden für beinahe jede in vitro-Anwendung, welche Transfektion von Nucleinsäuren in Zellen erfordert, Verwendung finden. Zum Beispiel beim Vorgang der rekombinanten Erzeugung eines Proteins.
Die Nucleinsäuren können ein essentielles Gen oder ein Fragment davon umfassen, bei welchem die Zielzelle oder -zellen auf eine gewisse Weise mangelhaft sind. Dies kann stattfinden, wo das Gen fehlt oder wo das Gen mutiert ist, was zu Unter- oder Überexpression führt. Die Nucleinsäuren können auch Antisense-Oligonucleotide umfassen. Derartige Antisense-Oligonucleotide können konstruiert werden, um die Expression eines Ziel-Gens zu inhibieren. Das Vorangegangene sind Beispiele für Nucleinsäuren, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, und sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie die Erfindung auf irgendeine Weise beschränken. Für Fachleute wird es selbstverständlich sein, dass andere Nucleinsäuren zur erfindungsgemäßen Verwendung ebenso gut geeignet sein werden.
D. Transfektionsverfahren
In noch einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Transfektion einer Nucleinsäure in eine Zelle. Das Verfahren bezieht das in Kontakt bringen einer Zelle mit einem Lipid-Nucleinsäure-Komplex oder Aggregat, umfassend eine Nucleinsäure und ein amphiphiles kationisches Lipid der Formel I, ein. Liposom-Nucleinsäure-Komplex/Aggregate können durch Zugabe einer passenden Menge von Nucleinsäure zu einer Liposomenlösung hergestellt werden. Zur Transfektion ist das Gewichtsverhältnis von kationischem Lipid zu DNA von ein wenig über 1 : 1 bis vielleicht 10 : 1. Die Menge von DNA kann beträchtlich variieren, ist aber normalerweise ein paar bis einige Zehn Mikrogramm pro Standardzüchtungsgefäß von Zellen. Die Bedingungen können breit variieren, und es ist eine Routineangelegenheit und Standarddurchführung, die Bedingungen für jede Zellart zu optimieren, wie Anbieter für im Handel erhältliche Materialien empfehlen. Optimierung bezieht das Variieren des Verhältnisses von Lipid zu DNA ebenso wie der Gesamtmenge von Aggregat ein.
Es gibt gegenwärtig einige Ungewissheit bezüglich der exakten Weise, wie Nucleinsäuren und kationische Lipide wechselwirken. Zusätzlich ist die gebildete Struktur für sowohl vor als auch während des Transfektionsvorgangs nicht definitiv bekannt. Die vorliegende Erfindung allerdings ist nicht durch die bestimmte strukturelle Art des Komplexes, der durch die erfindungsgemäßen Liposom- und Lipid-Aggregate gebildet wurde, und der zu transfizierenden Nucleinsäuren beschränkt. Der Ausdruck „Liposom-Nucleinsäure-Aggregat" bedeutet jede Assoziation eines Liposoms oder kationischen Lipids und einer Nucleinsäure, welche zur Lipofektion in der Lage ist.
Das Lipid-Nucleinsäure-Aggregat wird den Zellen in Zuchtmedium zugegeben und für einige Zehn Minuten bis einige Stunden bis vielleicht über Nacht stehen gelassen. Gewöhnlicherweise wird Serum von dem Zuchtmedium während dieser Phase der Transfektion weggelassen. Anschließend wird das Medium mit normalem, Serumenthaltendem Medium ersetzt, und die Zellen werden für Stunden bis Tage inkubiert oder möglicherweise auf unbestimmte Zeit kultiviert.
E. Spezifische Ziel-Gewebe
Spezifische zielfindende Einheiten können mit den erfindungsgemäßen Lipid:Nucleinsäure-Komplexen verwendet werden, um auf spezifische Zellen oder Gewebe abzuzielen. In einer Ausführungsform wird eine zielfindende Einheit wie ein Antikörper oder ein Antikörperfragment an ein hydrophiles Polymer angelagert und wird mit dem Lipid:Nucleinsäure-Komplex nach der Komplexbildung kombiniert. Daher stellt die Verwendung einer zielfindenden Einheit in Kombination mit einem allgemeinen Effektor-Lipid:Nucleinsäure-Komplex die Fähigkeit zur zweckmäßigen Anpassung des Komplexes zur Abgabe an spezifische Zellen und Gewebe bereit.
Beispiele für Effektoren in Lipid:Nucleinsäure-Komplexen schließen Nucleinsäuren, die Cytotoxine (z. B. Diphtherietoxin (DT), Pseudomonas Exotoxin A (PE), Pertussistoxin (PT) und die Pertussis-Adenylatecyclase (CYA)) codieren, Antisense-Nucleinsäure, Ribozyme, markierte Nucleinsäuren und Nucleinsäuren, codierend Tumor-Suppressorgene wie p53, p110Rb und p72, ein. Diese Effektoren können spezifisch auf Zellen wie Krebszellen, Immunzellen (z. B. B- und T-Zellen) und auf andere gewünschte zelluläre Ziele mit einer zielfindenden Einheit abgezielt werden. Zum Beispiel sind, wie vorstehend beschrieben, viele Krebsarten durch Überexpression von Zelloberflächen-Markern wie HER2, das in Brustkrebszellen exprimiert wird, oder IL17R, der in Gliomen exprimiert wird, gekennzeichnet. Zielfindende Einheiten wie anti-HER2- und anti-IL17R-Antikörper oder -Antikörperfragmente werden verwendet, um den Lipid:Nucleinsäure-Komplex an die Zelle der Wahl abzugeben. Das Effektormolekül wird dann an die spezifische Zellart abgegeben, was eine nützliche und spezifische therapeutische Behandlung bereitstellt.
F. Arzneistoffabgabe.
In einem weiteren noch anderen Aspekt betrifft diese Erfindung ein Arzneimittel oder eine andere Zusammensetzung zur Arzneistoffabgabe zur Verabreichung eines Nucleinsäureteilchens an eine Zelle. Diese Zusammensetzung schließt einen Lipid-Nucleinsäure-Komplex, umfassend eine Nucleinsäure und ein amphiphiles kationisches Lipid der Formel I, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger davon ein. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Arzneimittel" jede Assoziation eines Liposoms oder kationischen Lipids der Formel I und einer Nucleinsäure und oder eines Gemischs eines herkömmlichen Arzneistoffs, der in der Lage ist, in die Zellen abgegeben zu werden.
Kationische Lipid-unterstützte Arzneistoffabgabe kann auf die folgende Weise erreicht werden. Für Arzneistoffe, die in organischen Lösungsmitteln löslich sind, wie Chloroform, werden der Arzneistoff und das kationische Lipid in Lösungsmitteln, in denen beide löslich sind, gemischt, und das Lösungsmittel wird dann unter Vakuum entfernt. Der Lipid-Arzneistoff-Rückstand wird dann in einem passenden wässrigen Lösungsmittel, welches in einer bevorzugten Ausführungsform sterile physiologische Kochsalzlösung ist, dispergiert. Die Suspension kann dann gegebenenfalls bis zu mehreren Gefrier/Auftauzyklen unterzogen werden. Sie wird dann beschallt, entweder lediglich, um die Grobkörnigkeit der Dispersion zu verringern oder um die Teilchengröße auf 20–30 nm Durchmesser zu verringern, abhängig davon, ob eine große oder kleine Teilchengröße bei der gewünschten Anwendung am wirksamsten ist. Für einige Anwendungen kann es am wirksamsten sein, durch Bildung der Suspensionen durch ein Filter mit Poren des Durchmessers 100 nm oder kleiner extrudierte Liposomen zu erzeugen. Für einige Anwendungen können Einschluss von Cholesterin oder natürlichen Phospholipiden in dem verwendeten Gemisch angemessen sein, um das Lipid-Arzneistoff-Aggregat zu erzeugen.
Das Liposom-Arzneistoff-Aggregat kann dann auf jede geeignete Weise abgegeben werden. Für Arzneistoffe, welche in wässriger Lösung löslich und in organischen Lösungsmitteln unlöslich sind, wird das zu verwendende Lipidgemisch für die Lipiddispersion oder die Liposomen an der inneren Oberfläche eines Kolbens oder eines Röhrchens durch Eindampfung des Lösungsmittels aus einer Lösung des Gemischs beschichtet. Im Allgemeinen muss das Lipidgemisch, damit dieses Verfahren erfolgreich sein kann, in der Lage sein, Vesikel mit einfachen oder multiplen Lipid-Doppelschicht-Wänden zu bilden und ein wässriges Inneres einzukapseln. Die wässrige Phase, welche den gelösten Arzneistoff enthält, vorzugsweise eine physiologische Kochsalzlösung, wird dem Lipid zugegeben, geschüttelt, um eine Suspension zu erzeugen und dann gegebenenfalls bis zu einige Male gefroren und aufgetaut.
Um kleine Liposomen zu erzeugen, wird die Suspension für einen Zeitraum, der notwendig ist, die Liposomen auf die gewünschte Durchschnittsgröße zu verringern, Ultraschallwellen unterzogen. Falls große Liposomen gewünscht sind, wird die Suspension lediglich mit der Hand oder auf einem Vortex-Mixer geschüttelt, bis eine einheitliche Dispersion erhalten wird, d. h. bis visuell wahrnehmbare große Teilchen abwesend sind. Falls die Zubereitung so ist, dass der Arzneistoff nur innerhalb der Liposomen enthalten ist, dann wird der Arzneistoff in der wässrigen Phase durch Dialyse oder durch Durchlassen durch eine chromatographische Gelfiltrationssäule (z. B. Agarose), welche mit der wässrigen Phase, die alle normalen Komponenten mit Ausnahme des Arzneistoffes enthält, äquilibriert wurde, entfernt. Das verwendete Lipidgemisch kann zusätzlich zu den kationischen erfindungsgemäßen Verbindungen Cholesterin oder natürliche Lipide enthalten. Das Liposom-Arzneistoff-Aggregat kann dann auf jede geeignete Weise abgegeben werden.
G. Behandlung von Erkrankung.
In noch einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung neue Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, die sich aus Infektion mit einem Pathogen oder aus einer endogenen DNA-Defizienz ergeben. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung einer Lösung aus Liposom-Nucleinsäure-Aggregat und/oder Liposom-Arzneistoff-Aggregat an einen Säuger, der an einer pathogenen Infektion oder einer DNA-Defizienz leidet. Falls die Erkrankung das Ergebnis einer Infektion durch ein Pathogen ist, kann die Nucleinsäure ein Antisense-Oligonucleotid sein, das gegen eine DNA-Sequenz im Pathogen, welche für die Entwicklung, den Stoffwechsel oder die Reproduktion des Pathogens essentiell ist, gerichtet ist. Falls die Erkrankung eine DNA-Defizienz ist (d. h. wobei bestimmte endogene DNA fehlt oder mutiert worden ist), was zu Unter- oder Überexpression führt, kann die Nucleinsäure die normale DNA-Sequenz sein.
Von einigen Verfahren der in vivo-Lipofektion ist berichtet worden. Im Fall von ganzen Tieren kann das Lipid-Nucleinsäure-Aggregat in den Blutstrom, direkt in ein Gewebe, in das Peritoneum injiziert, in die Trachea eingeflösst oder in ein Aerosol, welches das Tier atmet, umgewandelt werden. Zhu, et al., Science 261, 209–211 (1993) beschreiben eine einzelne intravenöse Injektion von 100 Mikrogramm eines Gemisches aus DNA und DOTMA : Dioleoylphosphatidylethanolamin, das praktisch alle Geweben wirksam transfizierte. Es ist auch möglich, einen Katheter zur Implantation von Liposom-DNA-Aggregaten in eine Blutgefäßwand zu verwenden, was zu erfolgreicher Transformation einiger Zellarten, einschließlich Endothel- und vaskuläre glatte Muskelzellen führen kann. Stribling, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. LISA 89, 11277–11281 (1992), demonstrierten, dass Aerosolabgabe eines Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Expressionsplasmids, das an kationische Liposomen komplexiert war, in Mäusen in vivo mindestens 21 Tage lang hohe Mengen an Lungen-spezifischer CAT-Genexpression erzeugte. Sie beschrieben den folgenden Vorgang: Sechs Milligramm Plasmid-DNA und 12 μMol DOTMA/DOPE-Liposomen wurden mit Wasser jeweils auf 8 ml verdünnt und gemischt: gleiche Volumina wurden dann in zwei Acorn I-Zerstäuber (Marquest, Englewood, Colo.) gegeben; Tiere wurden in eine Intox-Kleintier-Expositionskammer (Albuquerque) eingebracht, und eine Luftdurchflussgeschwindigkeit von 4 l/min wurde verwendet, um das Aerosol zu erzeugen (etwa 90 min waren erforderlich, um dieses Volumen zu aerosolisieren); die Tiere wurden für 1–2 h aus der Kammer entfernt, und das Verfahren wurde wiederholt. Dieses Protokoll ist repräsentativ für das Aerosolabgabe-Verfahren.
Die folgenden Beispiele werden lediglich für Zwecke der Veranschaulichung vorgelegt, und es ist nicht beabsichtigt, die Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken, und dies sollte auch nicht so ausgelegt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese von Dimyristoyl-trimethylglycin-pentaerythrit.
a.) Synthese des Dimyristoyldiols
Zu einer Lösung aus Pentaerythritol (1,0 g, 7,3 mMol) und DMAP (ca. 10 mg) in frisch destilliertem Pyridin (75 ml) bei 0 °C wurde tropfenweise das Myristoylchlorid (14,7 mMol) gegeben. Die sich ergebende klare Lösung wurde allmählich über 4 Std. hinweg auf Raumtemperatur erwärmt und dann in einen Scheidetrichter, welcher CH₂Cl₂ (200 ml) enthält, überführt. Die organische Lösung wurde mit 10 % HCl extrahiert, die Schichten wurden abgetrennt, und die organische Phase wurde über NA₂SO₄ getrocknet. Die Lösungsmittel wurden durch Rotationseindampfung entfernt. Der Rückstand wurde unter Verwendung von Silicagel-Flash-Chromatographie gereinigt, wobei mit einem Gradienten von CH₂Cl₂ bis 19 : 1 CH₂Cl₂ : MeOH eluiert wurde, um das gewünschte Bisesterprodukt zu geben. Das Folgende ist die analytische Analyse. R_f = 0,25, 19 : 1 MeOH : CH₂Cl₂; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4,14 (s, 4H, CCH₂O-Acyl), 3,57 (s, 4H, CCH₂OH), 2,32 (t, J = 7 Hz, 2H, -OC(O)CH₂CH₂-), 1,60 (m, 2H, -OC(O)CH₂CH₂CH₂-), 1,30 (m, 44H), 0,86 (t, J = 7 Hz, 6H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 174,4, 62,4, 62,3, 44,8, 31,8, 30,0, 29,9–28,7, 24,9, 24,7, 22,6, 14,0; FTIR (KBr) 3298, 2917, 2850, 1732, 1468, 1179 cm^–1; HRMS (C₃₃H₆₄O₆) berechnet, 556,4703; gemessen, 539,4679 [(M + H)⁺-H₂O].
b.) Anlagerug und Quaternisiertung der N,N-Dimethylglycinkopfgruppe.
Zu einer Suspension aus N,N-Dimethylglycin (140 mg, 1,35 mMol) und dem vorstehenden Diester aus Teil „a" (0,45 mMol) in DMF (6,8 ml) bei Raumtemperatur, wurde Pentafluorphenol (745 mg, 4,05 mMol) gegeben. Das Gemisch wurde auf 50 °C erwärmt, um eine vollständige Auflösung aller Feststoffe zu bewirken. Bei Kühlen auf Raumtemperatur wurden Dicyclohexylcarbodiimid (300 mg, 1,45 mMol) und eine katalytische Menge von DMAP in einer Portion zugegeben und über Nacht gerührt. Die Umsetzung wurde mit Et₂O verdünnt, und der gefällte Harnstoff wurde filtriert. Das Filtrat wurde in einen Scheidetrichter überführt und aufeinander folgend mit gesättigtem NH₄Cl, Wasser und gesättigtem NaHCO₃ extrahiert. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet. Die Lösungsmittel wurden durch Rotationseindampfung entfernt, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei mit einem Gradienten von CH₂Cl₂ bis 50 : 1 CH₂Cl₂ : MeOH eluiert wurde, um die gewünschten Tetraester zu geben. Die analytische Analyse für Dimyristoyl-bis(N,N-dimethylglycyl)tetraester ist wie folgt: R_f = 0,23,9 : 1 CH₂Cl₂ : MeOH; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4,17 (s, 4H, (CH₃)₂NCH₂C(O)OCH₂-), 4,11 (s, 4H, CCH₂O-Acyl), 3,19 (s, 4H, (CH₃)₂NCH₂C(O)O-), 2,35 (s, 12H, (CH₃)₂N-), 2,30 (t, J = 7 Hz, 4H, -OC(O)CH₂CH₂-), 1,57 (m, 4H, -OC(O)CH₂CH₂CH₂-), 1,25 (s, 48H), 0,86 (t, J = 7 Hz, 6H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 174,4, 169,8, 62,4, 62,3, 56,2, 49,9, 44,9, 43,2, 34,8, 33,2, 32,1, 31,8, 29,9–28,5, 26,5, 25,5, 24,7, 22,5, 14,0; FTIR (KBr) 2922, 2853, 1746, 1467, 1284, 1148, 1064 cm^–1; HRMS (C₄₁H₇₈N₂O₈) berechnet, 726,5758; gemessen, 727,5815 (M + H)⁺.
Der vorstehende Dimyristoyl-bis(N,N-dimethylglycyl)tetraester aus Teil „b" wurde in einem Überschuss an Iodmethan gelöst, und die sich ergebende Lösung wurde 8 Std. lang bei Raumtemperatur gerührt. Iodmethan wurde unter verringertem Druck entfernt (Achtung: ein Abzug ist erforderlich), um das entsprechende rohe Bisiodidsalz zu ergeben. Reinigung wurde durch wiederholte Umkristallisation aus Acetonitril erreicht. Die analytische Analyse des quaternären Ammoniumiodidsalzes von Dimyristoyl-bis(N,N,N-trimethylglycyl)tetraester ist wie folgt: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5,73 (s, 4H, (CH₃)₃NCH₂-), 4,32 (s, 4H, (CH₃)₃NCH₂C(O)OCH₂-), 4,18 (s, 4H, CCH₂O-Acyl), 3,60 (s, 18H, (CH₃)₃N-), 2,30 (t, J = 7 Hz, 4H, -OC(O)CH₂CH₂-), 1,60 (m, 4H, -C(O)CH₂CH₂CH₂-), 1,25 (s, 48H), 0,86 (t, J = 7 Hz, 6H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 172,4, 163,3, 65,2, 63,7, 61,2, 54,9, 49,9, 48,6, 47,7, 43,2, 34,6, 31,2, 29,8–28,9, 24,8, 22,8, 14,5; FTIR (KBr) 3011, 2917, 2850, 1743, 1472, 1247, 1191, 1123, 1021 cm^–1; HRMS (C₄₃H₈₄N₂O₈I₂) berechnet, 1010,4321; gemessen, 883,5215 (M²⁺ + I^–).
Zusätzlich wurde unter Verwendung des gleichen vorstehenden Syntheseprotokolls der Dioleoyl-bis(N,N,N-trimethylglycyl)tetraester synthetisiert. Die analytischen Daten für jenen Tetraester sind wie folgt: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5,73 (s, 4H, (CH₃)₃NCH₂-), 5,34 (m, 4H), 4,33 (s, 4H, (CH₃)₃NCH₂C(O)OCH₂-), 4,18 (s, 4H, CCH₂O-Acyl), 3,60 (s, 18H, (CH₃)₃N-), 2,31 (t, J = 7 Hz, 4H, -OC(O)CH₂CH₂-), 1,60 (m, 4H, -OC(O)CH₂CH₂CH₂-), 1,27 (m, 40H), 0,86 (t, J = 7 Hz, 6H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 172,7, 164,0, 129,8, 129,4, 65,2, 63,2, 61,3, 54,6, 42,3, 33,9, 31,7, 29,7, 29,5, 29,3, 29,1, 29,0, 27,0, 24,6, 22,4, 22,4, 13,8; FTIR (KBr) 3362, 3007, 2923, 2853, 1740, 1466, 1255, 1197, 1017 cm^–1; HRMS (C₅₁H₉₆N₂O₈I₂) berechnet, 1118,5260; gemessen 991,6212 (M²⁺ + I^–).
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht die Transfektion einer Plasmid-DNA, die das Luciferasegen aus Glühwürmchen codiert.
a.) Liposomen-Formulierung.
Das kationische Lipid (1,0 mMol) und DOPE (1,0 mMol) wurden als Chloroformlösungen in ein 1,9 ml-Probenfläschchen gegeben. Das Chloroform wurde unter Verwendung eines Stromes aus trockenem Argon bei Raumtemperatur eingedampft. Die sich ergebenden dünnen Lipidfilme wurden 2–3 h lang unter Vakuum gestellt, um sicher zu gehen, dass alle Spuren des Lösungsmittels entfernt waren. Steriles Wasser (1,0 ml) wurde dann zugegeben, um die dünnen Lipidfilme zu hydratisieren, und die sich ergebende Suspension wurde bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Erwärmen in einem 60 °C-Wasserbad heftig gemischt (Vortexgerät). Die sich ergebende 1,0 mM Lipidsuspension wurde innerhalb von 2 h der Hydratisierung verwendet.
b.) Zellkultur.
NIH 3T3-Zellen wurden von ATCC (CRL 1658) erhalten und in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; GIBCO) mit 10 % fötalem Kälberserum (GIBCO) in einem befeuchteten 10 % CO₂ Inkubator bei 37 °C gezüchtet. Menschliche Bronchialepithelzellen (16HBE14_o–) wurden in Eagle's modifiziertem essentiellem Medium (MEM; GIBCO), das mit 10 % fötalem Rinderserum (GIBCO), 1 % Glutamin (GIBCO), 1 % Penicillin und Streptomycin (GIBCO) ergänzt war, kultiviert und in einem befeuchteten 5 % CO₂-Inkubator bei 37 °C gezüchtet. Beide Zelllinien wurden in sterile unbehandelte Kolben subkultiviert.
c.) Transfektionsexperimente.
Die NIH 3T3-Zellen wurden bei 50,000 Zellen pro Vertiefung auf einer Standardplatte mit 24 Vertiefungen (Corning, Corning, N.Y.) 24 h vor der Transfektion plattiert. Die Zellen waren zum Zeitpunkt der Transfektion ungefähr 80 % konfluent. Die HBE Zellen wurden bei 50,000 Zellen/Vertiefung auf eine Platte zur Gewebezucht mit 24 Vertiefungen, welche mit Fibronectin, Vitrogen (Collagen) und Rinderserumalbumin, wie zuvor beschrieben, beschichtet waren, plattiert (Gruenert, D. C., Basbaum C. B. und Widdicombe J. H. (1990) In Vitro Cell Dev Biol., 26, 411–418) und wurden als subkonfluente Einzelschichten 24 h vor der Transfektion transfiziert. Das Zuchtmedium wurde durch Ansaugen entfernt, und jede Vertiefung wurde einmal mit 0,5 ml gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit nur MEM überschichtet.
Kationische Lipid-DNA-Komplexe wurden 15–40 min vor der Transfektion hergestellt. Der pGL3-Kontrollvektor, welcher die Luciferase aus Glühwürmchen codiert (Promega, Madison, WI) wurde langsam zu einer verdünnten (DMEM oder MEM) Menge der kationischen Lipid:DOPE-Suspension in einem Polystyrolröhrchen (Falcon #2058) gegeben, und der Lipid-DNA-Komplex wurde auf ein Endvolumen von 800 ml verdünnt. Typischerweise (z. B. unter Verwendung von DOTAP) wurden 24 ml der Lipidsuspension verwendet; um 4,0 mg der Plasmid-DNA zu komplexieren, was ein molares Verhältnis von 2 : 1 von kationischem Lipid : DNA-Phosphat ergab. Unmittelbar nach der DNA-Zugabe wurde die Suspension gevortext, und man ließ sie 15 min lang bei Raumtemperatur inkubieren. Ein 200 ml-Aliquot der sich ergebenden Lipid-DNA-Suspension wurde jeder Vertiefung zugegeben (1,0 mg DNA/Vertiefung, n = 4). Die behandelten Zellen wurden dann 4 h lang bei 37 °C inkubiert. Kontrollvertiefungen wurden mit 200 ml Medium ohne Ergänzung behandelt. Zu diesem Zeitpunkt wurden 500 ml des passenden Zuchtmediums einschließlich 10 % FCS zu allen Vertiefungen gegeben und die Zellen 48 h von der Lyse und Analyse kultiviert.
d.) Luciferasetest.
Relative Luciferaseaktivität wurde unter Verwendung des Enhanced Luciferase Assay Kits und einem Moonlight 2010-Luminometer (Analytical Luminescence Laboratories, Sparks, MD) bestimmt. Konzentrierte Luciferase-Lysepuffer (233,3 ml) wurde zu jeder Vertiefung gegeben. Entfernung des Zuchtmediums war vor der Anwendung des Lysepuffers nicht notwendig. Diese Technik verstärkt die Reproduzierbarkeit durch Vermeidung der Möglichkeit des Zellverlusts während der Medienentfernung. Luciferase-Licht-Emissionen von 31,1 ml des Lysats wurden über einen Zeitraum von 10 Sekunden gemessen, und die Ergebnisse wurden als eine Funktion des angenommenen Gesamtvolumens des Lysats von 933,3 ml ausgedrückt. Die Aktivität wurde als relative Licht-Einheiten ausgedrückt, welche eine Funktion der Testbedingungen, der Luciferasekonzentration, der Sensitivität des Luminometerphotomultiplerröhrchens und des Hintergrunds ist. Ergebnisse werden in 1 zusammengefasst, als die mittlere (n = 4) und Standardabweichung aller Luciferase-Licht-Einheiten (RLU), welche von Zellen erhalten wurde, die nach der Transfektion von 1,0 mg DNA lysierten.
e.) Luciferasetransfektion.
Viele Transfektionslipide haben bei Co-Formulierungen mit DOPE eine verbesserte Aktivität gezeigt. Um zu bestimmen, ob die Pentaerythritlipide diese Aktion erfordern, wurde eine DOPE-Titration unter Verwendung von Dimyristoyllipid-DMTM(Gly) durchgeführt. Die binären Lipidgemische wurden mit pGL3-Kontrolle, Plasmid-DNA, welche das Luciferasegen aus Glühwürmchen codiert, behandelt. NIH 3T3-Transfektionsergebnisse von der Verabreichung des DMTM(Gly)-Lipoplexes werden in 1 dargestellt. Die Daten machen deutlich, dass eine äquimolare Menge von DMTM(Gly) und DOPE eine nahezu optimale Transfektionsaktivität erbringen, wobei ein höherer Prozentsatz von DOPE nur vernachlässigbare Verbesserung gibt. Die Ergebnisse für die DOTM(Gly) : DOPE Optimierung waren ähnlich.
Dieses Beispiel demonstriert, dass die Pentaerythritlipide DOTM(Gly) und DMTM(Gly) in der Lage sind, die intrazelluläre Abgabe von Plasmid-DNA zu erleichtern.
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Zellcytoxizität, die durch Beurteilung der Lactatdehyddrogenaseaktivität bestimmt wird.
a.) Cytotoxizitätsbestimmung.
Zelllebensfähigkeit wurde durch Beurteilung der Lactatdehydrogenaseaktivität posttransfizierter Zellen vor der Lyse unter Verwendung des CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) bestimmt. Die Tetrazoliumsalzlösung (Owen's Reagens; 100 ml) wurde jeder Vertiefung zugegeben, und die Platte mit 24 Vertiefungen wurde dann sanft geschüttelt, um vollständiges Vermischen zu sichern. Nach Inkubation für weitere 3–4 Std. wurde jede Vertiefung auf Formazan-Erzeugung durch Entfernung eines Aliquots des Mediums und Verdünnen mit 9 Teilen Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) analysiert. Die Verdünnung wurde in einer 1,5 ml-Methylacrylat-UV/VIS-Einwegzelle durchgeführt, und die relative Menge von Formazan wurde durch Durchführen einer Absorptionsmessung bei 490 nm unter Verwendung von PBS als die Referenz bestimmt. Der mittlere (n = 4) Absorptionswert wurde berechnet und mit dem mittleren Absorptionswert für nicht-transfizierte Zellen verglichen. Die Endergebnisse wurden als relative Cytotoxizität ausgedrückt. Relative Cytotoxizität wurde durch das Abziehen des Verhältnisses des mittleren Absorptionswerts für transfizierte Zellen zu dem mittleren Absorptionswert für unbehandelte Zellen von Eins berechnet. Ein relativer Cytotoxizitätswert von Null deutet keinen Unterschied von unbehandelten Zellen, keine messbare Cytotoxizität an. Der maximale Wert von eins deutet Zelltod für die gesamten behandelten Zellen, keine messbare Formazan-Erzeugung, was eine wesentliche Cytotoxizität angibt, an. Negative Werte können verstärkte Formazan-Erzeugung als eine Folge von Zellwachstum relativ zu unbehandelten Zellen widerspiegeln.
b.) Cytotoxizitätstest.
Um zu testen, ob (DMTM(Gly)) und (DOTM(GLY)) die Lipid-induzierte Cytotoxizität vermindern, wurde ein Test zur Zelllebensfähigkeit durchgeführt. Die relative Cytotoxizität für diese Lipide und die gängigen Transfektionslipide DOTAP und DC-Chol wurde durch Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität für mit Lipoplex behandelte Zellen bestimmt. Der vergleichende Test wurde unter Verwendung von NIH 3T3- und 16HBE14_o–-Zellen durchgeführt, und die Ergebnisse wurden in den 2 bzw. 3 aufgezeichnet. Ein Erfordernis zur Beurteilung der Cytotoxizität ist die gleichzeitige Bestimmung der relativen Transfektionsaktivität. Daher wurden die kationischen Lipide auf relative Cytotoxizität unmittelbar vor der Bestimmung der Luciferaseaktivität beurteilt.
Die 2 und 3 zeigen eine Überlagerung von Transfektionsaktivität versus relative Cytotoxizität der Lipide DMTM(GLY) und DOTM(GLY), DOTAP und DC-Cholesterol. Das Dioleoyl-Analogon DOTM(Gly) zeigte in beiden Zelllinien eine größere Transfektionsaktivität als das Dimyristoyl-Analogon. DOTM(Gly) war auch ein aktiveres Transfektionslipid im Vergleich zu DOTAP und DC-Cholesterol, wobei eine um eine Größenordnung größere Expression in beiden Zelllinien erreicht wurde. Das Dimyristoyllipid DMTM(Gly) zeigte Transfektionsaktivitäten, die gleichartig zu DOTAP und DC-Chol waren.
Der MTS-Test, ein weit verbreitet verwendetes Verfahren zur Beurteilung von mit Transfektion assoziierter Cytotoxizität, misst mitochondriale Lactatdehydrogenaseaktivität durch Tetrazoliumsalz-Bioreduktion. Die relativen MTS-Cytotoxizitätsdaten für die kationische Lipidreihe wird in den 2 und 3 veranschaulicht. Ein Ablesen von Null auf der Cytotoxizitätsskala (rechte vertikale Achse) gibt an, dass die behandelten Zellen eine relativ zu den unbehandelten Kontrollzellen vergleichbare metabolische (Dehydrogenase) Aktivität aufweisen und zeigt an, dass das kationische Lipidmittel die zelluläre Funktion nicht beeinträchtigt. Die Unterschiede in der relativen Cytotoxizität waren in den NIH 3T3-Zellen am ausgeprägtesten (2). DMTM(Gly) und DOTM(Gly) induzierten keine cytotoxische Reaktion, wohingegen von DC-Chol gemessen wurde, dass es signifikant toxischer war, wobei nahezu 50 % der behandelten Zellen beeinträchtigt waren.
Die niedrigen relativen Cytotoxizitätsreaktionen, welche für die Pentaerythritlipide in NIH 3T3- und HBE-Zelllinien bestimmt wurden (2), legen nahe, dass die Verwendung von intrinsisch aktivierten funktionellen Gruppen eine nützliche Strategie zur Verringerung der durch kationische Lipide induzierten Toxizität sein kann.
Beispiel 4
Dieses Beispiel veranschaulicht die Transfektion unter Verwendung des GFP-Reportergens.
a.) Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie.
Fluoreszenzexperimente wurden durch Transfektion des pEGFP-Cl-C-terminales Protein-Fusionsvektors (Clontech, Palo Alto, Calif.) in NIH 3T3- und 16HBE14_o–-Zellen durchgeführt. Das Transfektionsprotokoll war mit dem des Luciferase-Expressionsexperiments in Beispiel 1 identisch. Zellen wurden nach der Transfektion 48 Std. lang gezüchtet, mit 3,7 % Formaldehyd fixiert und auf einem Zeiss-ICM 405-Umkehrmikroskop mit Hochauflösungsobjektiven mit großer Gebrauchsdistanz betrachtet. Die Zellen wurden auf dem Fluorescein-Kanal und mit Phasenkontrastoptik mit einem 40 × Wasserobjektiv unter Verwendung eines T-Max 400-Films (Kodak, Rochester, N.Y.) fotografiert.
b.) Transfektion des Grünen Fluoreszierenden Proteins (GFP).
Um die Beziehungen zwischen der zellulären Aufnahme, Expression und Cytotoxizität zu untersuchen, wurde eine Transfektionsstudie unter Verwendung des GFP-Reportergens durchgeführt. Fluoreszenzmikroskopie von Zellen, welche mit GFP-codierendem Plasmid behandelt wurden, ist ein empfindliches Werkzeug zur Bestimmung des Auftretens von Transgen-Expression. In Übereinstimmung mit dem Luciferasetest waren die Lipide DOTM(GLY) und DC-Chol bei der Erleichterung des Gentransfers aktiv, wie durch die Gegenwart fluoreszierender Zellen angezeigt wurde. Das Phasenkontrastbild für DOTM(Gly) zeigte eine normale Zellmorphologie, was mit der niedrigen Cytotoxizitätsreaktion, welche durch den MTS-Test gemessen wurde, konsistent ist. Allerdings zeigte das Phasenkontrastbild für mit DC-Chol behandelte Zellen dichte Regionen großer Vakuolen, welche indikativ für durch kationische Lipide induzierte Cytotoxizität sind. Zellen, welche mit kationischen Lipidformulierungen der getesteten Reihe behandelt wurden, zeigten eine sehr ähnliche Morphologie zu Zellen, die mit ihren entsprechenden GFP-Lipoplexen transfiziert wurden. HBE-Phasenkontrastbilder stellten einige zelluläre Ablagerungen und abnormale zelluläre Morphologie für alle untersuchten kationischen Lipide dar, ein Ergebnis, welches mit dem MTS-Test zur Cytotoxizität konsistent ist. Ein Vergleich der Fluoreszenz- und Phasenkontrastbilder machte deutlich, dass die durch kationisches Lipid induzierte Cytotoxizitätsreaktion nicht auf jene Zellen, die GFP exprimierten, beschränkt war. Vakuolisierung wurde in Zellen bemerkt, welche GFP exprimierten und nicht exprimierten. Daher geht der Beginn der Cytotoxizität der Genexpression voraus. Phasenkontrastbilder von Zellen, welche mit DC-Chol behandelt wurden, stellten eine signifikant größere Vakuolisierung als Zellen dar, welche mit DOTM(Gly), DOTAP, oder DMTM(Gly) behandelt wurden.
Obwohl die Erfindung mit Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen und Beispiele davon beschrieben worden ist, ist der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht nur auf jene beschriebenen Ausführungsformen beschränkt. Wie für Fachleute selbstverständlich ist, können Modifikationen und Anpassungen an die vorstehend beschriebene Erfindung gemacht werden, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzugehen, welche durch die angehängten Ansprüche definiert und umschrieben werden.

Claims

Verbindung der Formel
wobei: R¹und R² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus C₈-C₂₄-Alkyl und C₈-C₂₄-Alkenyl; wobei R¹und R² nicht beide Stearyl (C₁₈)-Gruppen sind; R³ und R⁴ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C₁-C₈-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Arylalkyl, C₁-C₈-Alkylthioalkyl, Guanidinoalkyl, Carboxyalkyl, Aminoalkyl, Carbamoyl-C₁-C₈-Alkyl und Heteroarylalkyl; Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵ und Y⁶ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und C₁-C₆-Alkyl; X ausgewählt ist aus Chlorid, Iodid, Fluorid, Bromid und einem Oxyanion; oder alternativ dazu, R³, Y¹ und die Atome, an die sie gebunden sind, verbunden sind, um einen gegebenenfalls substituierten 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring zu bilden; und R⁴, Y⁶ und die Atome, an die sie gebunden sind, verbunden sind, um einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring zu bilden.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei: R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus C₈-C₂₀-Alkyl und C₈-C₂₀-Alkenyl; wobei R¹ und R² nicht beide Stearyl (C₁₈)-Gruppen sind; R³ und R⁴ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, Isobutyl, sec-Butyl, Hydroxymethyl, Thiomethyl, Carboxymethyl, Guanidinopropyl, Carbamoylmethyl, Carbamoylethyl, Benzyl, p-Hydroxyphenylmethyl, 1-Hydroxyethyl, 2-(Methylthio)ethyl, 3-Indolmethyl, Carboxyethyl und Aminobutyl; Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵ und Y⁶ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl; X Chlorid oder Iodid ist; oder alternativ dazu, R³, Y¹ und die Atome, an die sie gebunden sind, verbunden sind, um eine Gruppe zu bilden, ausgewählt aus einem Pyrrolidinring, einem 4-Hydroxypyrrolidinring und einem Imidazolylmethylring; und R⁴, Y⁶ und die Atome, an die sie gebunden sind, verbunden sind, um eine Gruppe zu bilden, ausgewählt aus einem Pyrrolidinring, einem 4-Hydroxypyrrolidinring und einem Imidazolylmethylring.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei: R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Myristyl, Oleyl, Lauryl und Palmityl; R³ und R⁴ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Ethyl und Isopropyl; Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵ und Y⁶ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl und Propyl; und X Iodid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei: sowohl R¹ als auch R² Myristyl sind; sowohl R³ als auch R⁴ Wasserstoff sind; Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵ und Y⁶ Methyl sind; und X Iodid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei: sowohl R¹ als auch R² Oleyl sind; sowohl R³ als auch R⁴ Wasserstoff sind; Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵ und Y⁶ alle Methyl sind; und X Iodid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei: sowohl R¹ als auch R² Myristyl sind; sowohl R³ als auch R⁴ 3-Indolmethyl sind; Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵ und Y⁶ alle Wasserstoff sind; und X Iodid ist.
Lipid-Nucleinsäure-Komplex, umfassend eine Nucleinsäure und ein amphiphiles kationisches Lipid der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert.
Verfahren zum Transfizieren einer Nucleinsäure in eine Zelle, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Zelle in einem Kulturmedium mit einem Lipid-Nucleinsäure-Komplex, umfassend die Nucleinsäure und ein amphiphiles kationisches Lipid der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, umfasst.
Arzneimittel, umfassend: (a) einen Lipid-Nucleinsäure-Komplex, umfassend eine Nucleinsäure und ein amphiphiles kationisches Lipid der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert; (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung eines Liposom-Nucleinsäure-Aggregats und/oder einer Lösung eines Liposom-Arzneistoff-Aggregats, wobei das Liposom ein amphiphiles kationisches Lipid der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Infektion mit einem Pathogen oder durch einen endogenen DNA-Mangel entstehen.