CN1479632A - 用于将核酸导入细胞的复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由阳离子聚合物和核酸组成的复合物，涉及将这种类型的复合物用于将核酸转入细胞和生物中的用途，涉及将所述复合物用作药物的用途，以及涉及可用于生产所述复合物的新型聚合物。

Description

用于将核酸导入细胞的复合物
本发明涉及由阳离子聚合物和核酸组成的复合物，涉及将所述复合物用于将核酸导入细胞的用途，并且涉及将所述复合物用作药物的用途。本发明还涉及可用于制备所述复合物的新型聚合物。
迄今为止，尚不可能在核酸(DNA和RNA)在人体内的治疗应用方面持续取得成功。造成这种现象的原因可能是必须遗传学信息的有限表达，遗传学信息的有限表达是由基因的转移不够有效，或者由于要表达的核酸的可利用性不够有效导致的。其他起着重要作用的因素包括，所使用的转运或载体系统的稳定性不够，以及生物兼容性不够。
口服或经鼻腔给药用于基因治疗或免疫的核酸的可能性是特别诱人的(Page & Cudmore，Drug Discovery Today 2001，6，92-101)。在这种情况下，必须防止核酸酶降解核酸。对于免疫接种，特别是接触粘膜的免疫接种来说，优选通过肠胃外应用进行接种，以便确保刺激MALT(与粘膜相关的淋巴组织)，这种刺激与粘膜的免疫学保护作用相关。防止该部位受到感染是非常重要的，例如，防止受到诸如HIV(人类免疫缺陷病毒)或HSV(单纯疱疹病毒)的病原体的感染。
诸如逆转录病毒或腺病毒的病毒载体，会产生诱导炎症或免疫原性过程的危险(Mc Coy等，Human Gene Therapy 1995，6，1553-1560；Yang等，Immunity 1996，1，433-442)。
作为替代方案，业已对非病毒的合成转运系统进行了研究，但是尚未表现出理想的特性。特别是基于脂类混合物的系统以及任选基于其它混入的细胞专一性配体的系统只能进行困难的或不充分的生物物理学表征，而且在储存和应用时存在着发生动态结构改变过程的危险。具体地讲，在这种情况下，不具备用作药物的服用安全性的先决条件。
因此，优选基于合成阳离子聚合物的复合物，只要其结构特征能够可再现地制备，并且被明确地表征就行(M.C.Garnett，CroiticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1999，16，147-207)。
业已披露了多种用于制备合成阳离子聚合物的方法，所述聚合物被用于制备复合物，根据所述聚合物的支化度及其微结构，这些方法产生不确定的产物。另外，用于转染的多种聚合物只能通过非常宽的分子量分布进行表征，或者只能通过平均分子量进行描述。
聚乙烯亚胺(PEI)——一种具有三维分支结构的阳离子聚合物——是一种特别适合与核酸复合和缩合的阳离子聚合物(W.T.Godbey，J.of Controlled Release 1999，60，149-160)。可以在多种体外实验系列中证实将核酸导入细胞的合适性，对此，具有Mw约2000克/摩尔范围内的低分子量(LMW-PEI，LMW：低分子量)的聚合物表现出特别高的活性(EP-A 0 905 254)。所述分支聚合物的不确定的结构被认为是它的缺陷。
相反，线性聚乙烯亚胺能够以确定的分子量制备，并且业已被用于体外和体内基因转移的多种用途(WO96/02655)。改进线性聚乙烯亚胺的转染效率的努力朝向两个方向(M.C.Garnett，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1999，16，147-207)：
1)一方面，通过引入亲水性取代基可以提高DNA/聚合物-复合物在水中的溶解度，另一方面，可以使得该复合物不能与蛋白相互作用。另外，还披露了聚乙二醇和聚乙烯亚胺的嵌段共聚物
2)通过引入细胞专一性配体，通常是亲水性碳水化合物或肽结构，可以获得定向作用。
将复合的核酸转入细胞的效率取决于多种因素，特别是取决于复合物和细胞膜之间的相互作用，细胞类型的性质，复合物的大小以及复合物各种成分之间的电荷比例。对复合物和细胞膜之间的相互作用，以及它在细胞中的摄取的了解所知甚少。
通过比较分支的未被取代的聚乙烯亚胺和被取代的聚乙烯亚胺(己基或十二烷基链取代的取代度至多50摩尔％)，可以证实疏水性取代的聚乙烯亚胺和由阴离子型磷脂组成的模拟的膜之间的相互作用增强(D.A.Tirell等，Macromolecules 1985，18，338-342)。
将疏水性官能化的聚乙烯亚胺用于与核酸配合的用途仅披露了被烷基取代的系统(WO99/43752)。对于基于聚丙烯酸的阳离子聚合物来说，还可以证实疏水性单体单元能增强转染效率(M.Kurisawa等，J.Controlled Release 2000，68，1-8)。对于具有25摩尔％硬脂酰单元的疏水化聚L-赖氨酸来说，可以证实核酸和脂蛋白与所述聚合物组成的三元复合物会导致肌肉细胞中转染效率的提高(K.-S.Kim，J.ofControlled Re1ease 1997，47，51-59)。EP-A0987029披露了聚烯丙胺，它可以选择性地具有线性和支化的烷基链或也具有芳基基团。
具有长链烷基基团的疏水化聚乙烯亚胺业已以四元完全烷基化的、并因此具有高度电荷结构的形式作为催化系统用于例如酯裂解。另外，业已将乙酰化结构用于对酶进行稳定化(US 4950596)。
本发明涉及包含具有疏水性取代基、可溶于水或可分散于水中的线性阳离子聚合物和至少一种核酸的复合物。
所述聚合物优选是聚胺，特别优选是聚乙烯亚胺。
所述疏水性取代基可以作为侧链或末端链排列于所述聚合物上。取代度(在聚合物主链上官能化的N原子的百分含量)优选为0.1-10％。
特别合适的疏水性取代基是烷基链、酰基链或类甾族化合物取代基。酰基链是特别适合的疏水性取代基。此外，合适的是可以通过将所述聚合物主链的氮官能团加成到异硫氰酸酯或加成到α，β-不饱和羰基化合物上而引入的疏水性取代基。
可优选用于复合物形成的聚合物具有以下通式：
Figure A0182025300121
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中
R1表示氢、甲基或乙基，和
R2表示具有1-23个碳原子的烷基，优选具有12-23个碳原子的烷基，特别优选具有17个碳原子的烷基，
并且，其中
R3和R4(端基)各自独立表示氢和具有1-24个碳原子的烷基，优选具有13-24个碳原子的烷基，特别优选具有18个碳原子的烷基或具有取决于引发剂的结构，其中
R5(端基)是取决于终止反应的取代基，例如羟基、NH2、NHR或NR2，其中，基团R可相应于端基R3和R4，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)为45-5250，优选为250-2250，特别优选为500-2050，而n＝a×P，0.001＜a＜0.1，优选0.01＜a＜0.05，特别优选a＝0.03。
在这里，m和n个单元不是嵌段结构，而是随机分布在该聚合物中。
另一种可优选用于所述复合物形成的聚合物具有以下通式：
Figure A0182025300131
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中，
R1表示氢、甲基或乙基，和
R2表示具有1-22个碳原子的烷基，优选具有11-22个碳原子的烷基，特别优选具有16个碳原子的烷基，
并且，其中
R3和R4(端基)各自独立表示氢或具有1-24个碳原子的酰基，优选具有13-24个碳原子的酰基，特别优选具有18个碳原子的酰基，或具有取决于引发剂的结构，
其中
R5(端基)是取决于终止反应的取代基，例如羟基、NH2、NHR或NR2，其中，R基团可相应于端基R3和R4，
并且，其中，平均聚合度P＝(m+n)为45-5250，优选为250-2250，特别优选为500-2050，而n＝a×P，0.001＜a＜0.1，优选0.01＜a＜0.05，特别优选a＝0.03。
在这里，m和n个单元不是嵌段结构，而是随机分布在该聚合物中。
所述聚合物是新的，并且是本发明的主题。
可以优选用于复合物形成的另一种聚合物具有以下通式：
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中，
R1、R2和R3表示氢或羟基，
并且，其中，
R4和R5(端基)各自独立表示氢或胆汁酸，或具有取决于引发剂的结构，其中
R6(端基)是取决于终止反应的取代基，例如羟基、NH2、NHR或NR2，其中，R基团可相应于端基R4和R5，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)为45-5250，优选为250-2250，特别优选为500-2050，而且n＝a×P，0.001＜a＜0.1，优选0.01＜a＜0.05，特别优选a＝0.03。
在这里，m和n个单元不是嵌段结构，而是随机分布在该聚合物中。
所述聚合物是新的，并且是本发明的主题。对此，还包括与所述基本甾体骨架相关的所有立体异构体。具体地讲，取代基R1、R2和R3可以α和β构型存在。5-位上的取代基同样可以α和β构型存在(根据Rmpp-Chemie-Lexikon命名，第9版，Georg Thieme Verlag，1992)。
可优选用于复合物形成的另一种聚合物具有以下通式：
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中，
R1表示OR4或NR4R5，
其中，R4和R5各自独立表示氢或具有1-24个碳原子的烷基，优选具有13-24个碳原子的烷基，特别优选具有18个碳原子的烷基，
并且，其中
R2和R3(端基)各自独立相应于聚合物主链的氮原子的取代基，或者具有取决于引发剂的结构，其中
R6(端基)是取决于终止反应的取代基，例如羟基、NH2、NHR或NR2，其中，基团R可相应于端基R2和R3，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)为45-5250，优选为250-2250，特别优选为500-2050，而且n＝a×P，0.001＜a＜0.1，优选0.01＜a＜0.05，特别优选a＝0.03。
在这里，m和n个单元不是嵌段结构，而是随机分布在该聚合物中。
所述聚合物是新的，并且是本发明的主题。
可优选用于复合物形成的另一种聚合物具有以下通式：
Figure A0182025300152
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中，
R1表示具有1-24个碳原子的烷基，优选具有13-24个碳原子的烷基，特别优选具有18个碳原子的烷基，
并且，其中
R2和R3(端基)各自独立相应于聚合物主链的氮原子的取代基，或者具有取决于引发剂的结构，
其中
R4(端基)是取决于终止反应的取代基，例如羟基、NH2、NHR或NR2，其中，基团R可相应于端基R2和R3，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)为45-5250，优选为250-2250，特别优选为500-2050，而且n＝a×P，0.001＜a＜0.1，优选0.01＜a＜0.05，特别优选a＝0.03。
在这里，m和n个单元不是嵌段结构，而是随机分布在该聚合物中。
所述聚合物是新的，并且是本发明的主题。
所述聚合物优选具有低于220000g/mol的平均分子量，特别优选2000-100000g/mol的分子量，特别优选20000-100000g/mol的分子量。
通过聚合物类似反应插入所述疏水性基团，例如，通过用卤代烷烷基化、用酰氯酰化、用活性酯酰化、通过Michael加成到α，β-不饱和羰基化合物(羧酸、羧酰胺、羧酸酯)上，或者加成到异氰酸酯上。上述反应是文献中已知的反应类型(J.March，Advanced OrganicChemistry，Wiley，New York，第4版，1992)。
制备线性聚乙烯亚胺，例如，通过2-乙基噁唑啉与阳离子引发剂的阳离子开环聚合反应制备，优选通过B.L.Rivas等的方法制备(Polymer Bull.1992，28，3-8)。通过用浓盐酸和水的混合物，优选浓盐酸和水的1∶1的混合物处理，在除去丙酸的情况下将获得的聚乙基噁唑啉定量转化成线性聚乙烯亚胺。所述反应温度优选为80-100℃，特别优选100℃。反应时间优选为12-30小时，特别优选24小时。优选通过从乙醇中多次重结晶纯化产物。
可以用上述方法制备具有2000-220000g/mol的希望分子量的线性聚乙烯亚胺。
烷基，例如C18烷基的引入通过在40-75℃，优选60℃的反应温度下，在无水乙醇中，5％浓度的相应的线性聚乙烯亚胺溶液与十八烷基氯起反应进行。加入烷基氯的量精确地取决于所需要的取代度(0.1-10％)。反应时间优选为10-24小时，特别优选17小时。
酰基，例如C18酰基的引入通过在40-60℃，优选50℃的反应温度下，在无水乙醇中，5％浓度的相应的线性聚乙烯亚胺溶液与十八烷酰氯起反应进行。加入酸氯的量精确地取决于所需要的取代度(0.1-10％)。反应时间优选为10-24小时，特别优选20小时。
还可以用N-羟基琥珀酰亚胺活化羧酸衍生物，通过活性酯方法引入酰基基团。在用胆汁酸对聚乙烯亚胺官能化时，优选使用该方法。为此，例如，在二环己基碳二亚胺的存在下，在二甲氧基乙烷溶剂中，胆汁酸衍生物鹅脱氧胆酸(3α，7α-二羟基-5β-胆酸)，以下简称为CDC的取代基，与N-羟基琥珀酰亚胺起反应。所述反应是在室温下进行的，反应时间为16小时。用这种方法制备的活性酯在无水乙醇中与5％浓度的相应的线性聚乙烯亚胺溶液起反应。加入活性酯的量精确地取决于所需要的取代度(0.1-10％)。反应温度为20-60℃，优选选50℃，反应时间优选为10-24小时，特别优选20小时。
例如，通过活性酯方法将鹅脱氧胆酸引入寡聚胺例如精胺或五亚乙基六胺已公开于文献中(S.Walker等Advanced Drug DeliveryReviews 1998，30，61-71.)。本发明的胆酸取代的聚合物具有疏水性取代基，它能够根据羟基的数量控制疏水性程度，类似于S.Walker等所披露的“阳离子表面两亲物”。
优选将高度纯化的样品用于制备本发明的复合物。为此，以0.1-1毫克/毫升，优选0.5毫克/毫升的浓度将疏水性线性聚乙烯亚胺溶解在pH7的水中，并且通过柱层析在Sephadex上纯化，然后冷冻干燥。然后将所述聚合物重新溶解在水中，或者优选溶解在生理盐水中，进行短时间的超声波处理，并且调整到pH7。为了制备复合物，所述聚乙烯亚胺溶液的浓度优选为0.1-1毫克/毫升，特别优选为0.5毫克/毫升。
可以通过标准方法鉴定阳离子聚合物，例如1H-NMR光谱法，FT-IR光谱法和ζ电位测定。
例如，用于生产复合物的核酸，可以是DNA或RNA。所述核酸可以是寡核苷酸或核酸结构。所述核酸优选包括一个或多个基因。所述核酸特别优选是质粒。
所述核酸可以包括编码一种药理活性物质或其前体的核苷酸序列和/或编码一种酶的核苷酸序列。
所述核酸可以包括编码一种病原体的抗原的核苷酸序列。病原体和与它相关的抗原包括例如：单纯疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)和糖蛋白D；人类免疫缺陷病毒(HIV)和Gag、Nef、Pol；丙型肝炎病毒和NS3；炭疽和致死因子；利什曼病毒和1mSTI1和TSA；结核杆菌和Mtb8.4。原则上讲，可以采用任何编码对它能产生免疫反应的抗原的核酸。如果必要的话，可以将编码多种抗原的不同核酸组合在一起。
所述核酸可以包括编码一种过敏原的核苷酸序列。过敏原的例子包括f2(家庭尘螨)、Betv1(桦树花粉)、Arah2(花生)、Hevb5(胶乳)。原则上讲，可以采用任何编码能在人或动物体内引起过敏反应的抗原的核酸。如果必要的话，可以将编码多种过敏原的不同核酸组合在一起。
所述核酸可以包括编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列。免疫调节蛋白的例子包括细胞因子(例如IL-4、IFNγ、IL-10、TNFα)，趋化因子(例如MCP-1、MIP1α、RANTES)，共同刺激剂(例如CD80、CD86、CD40、CD40L)或其他蛋白(例如热激蛋白)。DNA序列中的CpG基序同样具有免疫调节特性。
所述核酸可以任选包括编码抗原/过敏原和免疫调节蛋白的融合蛋白的核苷酸序列。
所述核酸优选还包括能导致专一性表达特定基因的序列，例如病毒专一性(就是说，例如，只能在病毒感染过的细胞中表达)、(定向)细胞专一性、代谢专一性、细胞周期专一性、发育专一性或非专一性。
在最简单的例子中，所述核酸包括编码所需蛋白的基因、专一性启动子序列和任选其他调控序列。为了增强和/或延长所述基因的表达，可以包含，例如，病毒启动子和/或增强子序列。例如，所述启动子和/或增强子序列在Dillon，TiBTech 1993，11，167中作过综述。其例子包括Rous肉瘤病毒和逆转录病毒的LTR序列、CMV病毒的启动子区和增强于区、AAV病毒的ITR序列和/或启动于序列p5、p19和p40、腺病毒的ITR序列和/或启动子序列、痘苗病毒的ITR序列和/或启动子序列、疱疹病毒的ITR序列和/或启动子序列、细小病毒的启动子序列和乳头瘤病毒的启动子序列(上游调控区)。
本发明的复合物还可以包括偶联细胞专一性配体的聚合物。例如，可以对所述细胞专一性配体进行设计，以便它能结合靶细胞的外膜，优选结合动物或人类靶细胞的外膜。本发明的含有配体的组合物可用于核酸的定向细胞专一性转移。所述靶细胞例如可以是内皮细胞、肌肉细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、胶质细胞、成血细胞、肿瘤细胞，例如，白血病细胞、病毒感染过的细胞、支气管上皮细胞或肝细胞，例如肝窦状细胞。能专一性结合内皮细胞的配体例如可以选自：对内皮细胞有专一性的单克隆抗体或其片段、末端带有甘露糖的糖蛋白、糖脂或多糖、细胞因子、生长因子、黏着分子、或者在特别优选的实施方案中，是来自病毒外被的糖蛋白，它对内皮细胞具有嗜性。能够专一性结合平滑肌细胞的配体例如可以选自：对肌动蛋白有专一性的单克隆抗体或其片段、细胞膜受体和生长因子，或者在特别优选的实施方案中，是来自病毒外被的糖蛋白，它对平滑肌细胞具有嗜性。能专一性结合巨噬细胞和/或淋巴细胞的配体例如可以选自：对巨噬细胞和/或淋巴细胞上的膜抗原具有专一性的单克隆抗体、对巨噬细胞和/或淋巴细胞上的膜抗原有专一性的多克隆或单克隆抗体的完整的免疫球蛋白或Fc片段、细胞因子、生长因子、末端带有甘露糖的肽、蛋白、类脂或多糖，或者在特别优选的实施方案中是来自病毒外被的糖蛋白，特别是来自C流感病毒的HEF蛋白，在所述流感病毒的872号核苷酸位置上具有突变，或者含有催化性三价(Triade)丝氨酸-71、组氨酸-368或-369和天冬氨酸-261的C流感病毒的HEF裂解产物。能专一性结合胶质细胞的配体例如选自：能专一性结合胶质细胞的膜结构的抗体和抗体片段、黏着分子、末端带甘露糖的肽、蛋白、类脂或多糖、生长因子，或者在特别优选的实施方案中，是来自病毒外被的糖蛋白，它对胶质细胞具有嗜性。能专一性结合成血细胞的配体例如可以选自：对干细胞因子的受体有专一性的抗体或抗体片段、IL-1(特别是I或II型受体)、IL-3(特别是α或β型受体)、IL-6或GM-CSF、具有这种专一性的完整的免疫球蛋白或Fc片段以及生长因子，如结合相关受体的SCF、IL-1、IL-3、IL-6或GM-CSF及其片段。能专一性结合白血病细胞的配体例如可以选自：能专一性结合白血病细胞上的膜结构的抗体、抗体片段、免疫球蛋白或Fc片段，如CD13、CD14、CD15、CD33、CAMAL、唾液酰-Le、CD5、Cd1e、CD23、M38、IL-2受体、T细胞受体、CALLA或CD19，以及生长因子或由它衍生的片段或类维生素A。能专一性结合病毒感染过的细胞的配体例如可以选自：能专一性结合在受到所述病毒感染过的细胞的细胞膜上表达的病毒抗原的抗体、抗体片段、完整的免疫球蛋白或Fc片段。能够专一性结合支气管上皮细胞、肝窦状细胞或肝细胞的配体例如可以选自：能够专一性结合靶细胞的运铁蛋白、无唾液酸糖蛋白，如非唾液酸血清类粘蛋白、拟糖蛋白或半乳糖、胰岛素、末端带有甘露糖的肽、蛋白、脂类或多糖、完整的免疫球蛋白或Fc片段，在特别优选的实施方案中，是来自病毒外被的能专一性结合所述靶细胞的糖蛋白。有关配体的更详细的例子披露于例如EP-A 0790312和EP-A 0846772中。
本发明还涉及本发明复合物的用途。例如，可以用所述复合物将核酸导入细胞或靶细胞(转染)，以便产生药物和/或基因治疗，以及预防性和治疗性免疫，并且对于过敏反应来说诱导耐受性。本发明优选涉及用本发明的复合物将非病毒或病毒核酸结构导入细胞的用途，并且涉及将这种(转染过的)细胞用于患者，以便预防或治疗疾病，其中，所述细胞可以是内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肝细胞、成纤维细胞、肌肉细胞或上皮细胞，还可将所述细胞例如局部用于皮肤或皮下、肌内注射到伤口中，注射到体腔，注射到器官中或注射到血管中。在另一种优选实施方案中，本发明涉及将本发明的复合物用于预防或治疗疾病的用途，对此，可以用常规方法施用本发明的复合物，优选口服，肠胃外或局部施用。本发明的复合物可以例如经舌、鼻腔内、经皮、皮下、静脉内、肌内、直肠给药或注射到伤口中、体腔内、身体孔口内、器官内或血管内。
有益的是可以任选将本发明的复合物与其他添加剂(佐剂、麻醉剂等)混合。
按照本发明在用于患者之前将核酸进行复合的优点在于抗DNA抗体的形成是困难的。相反，导入实验动物体内的裸露的DNA会导致易患狼疮的小鼠增加自身免疫抗体的形成，并且使分泌自身抗体的B细胞的数量增加3倍(Klinman等，DNA vaccines：safety and efficacyissues，in Gene Vaccination：Theory and Practice，ed.E.Raz，Springer)。
本发明还涉及一种用于制备转染过的细胞或靶细胞的方法，其中，将本发明的复合物与该细胞一起培养。所述转染优选是在体外进行的。本发明还涉及含有本发明的复合物的转染过的细胞或靶细胞。本发明还涉及所述转染过的细胞的用途，例如，用作药物，或用于生产药物和/或用于基因治疗。
本发明还涉及含有本发明复合物和/或用它转染过的细胞的药物。
本发明还涉及用于生产药物的方法，其中，将本发明的复合物与其他添加剂混合。
本发明还涉及将本发明的聚合物连接在细胞专一性配体上，并且涉及将复合物与病毒或非病毒核酸的结合产物用于将所述核酸导入细胞，或用于给哺乳动物施用所述复合物，以预防或治疗疾病。生产和连接细胞专一性配体的可能性业已详细披露于专利申请EP-A 0790312和DE-A 19649645中。特别将这些专利申请引入本文作为参考。
由本发明的聚合物，其任选与一种细胞专一性配体偶联，与病毒或非病毒核酸结构组成的复合物是用于基因治疗的基因转移材料。在一种优选实施方案中，将所述复合物施用于患者体外或体内、局部、体腔内、器官内、血液循环、呼吸道内、胃肠道、泌尿生殖道内、口服、鼻腔内给药、肌内或皮下给药。
本发明还涉及通过本发明的复合物将核酸结构导入其中的细胞，特别是来自酵母或哺乳动物的细胞。在一种特别优选的实施方案中，通过本发明的复合物将核酸结构导入细胞系，在转染之后，所述细胞可用于表达选定的基因。因此，所述细胞可用于提供患者使用的药物。
本发明还涉及通过本发明的复合物导入了一种核酸的哺乳动物细胞用于生产用来治疗或预防疾病的药物的用途。例如，可以从血液中获得内皮细胞，在体外用本发明的复合物处理，并且注射，例如，静脉内注射到患者体内。另一种可能性是例如对于从血液中获得的树突状细胞(抗原呈递细胞)来说，在体外用本发明的复合物处理，并且注射到患者体内，以便诱导预防性或治疗性免疫反应。在体外转染过的这类细胞还可以与本发明的复合物组合用于患者。该组合包括同时或不同时施用或注射、在相同或不同位点施用或注射所述细胞和复合物。
通过混合两种原材料将本发明的聚合物与所述核酸复合。混合比例是根据带负电荷的核酸和带正电荷的聚合物之间的需要的电荷比例确定的。通过ζ电位测定可以确定，对于疏水性官能化的线性聚乙烯亚胺(H-LPEI)来说，在pH 7的条件下的质子化程度为大约50％。DNA/聚合物电荷比例可以在1∶0.1和1∶10之间变化，优选的电荷比例为1∶2-1∶10。对于1∶5-1∶10的电荷比例来说，在100微克/毫升的DNA浓度下会出现浊度或沉淀。如果产生了沉淀的话，可以在给药之前重新悬浮或重新分散。
本发明的复合物优选是通过H-LPEI溶液添加到相应的核酸溶液中生产的。特别优选的是对该浓度进行调整，以便产生体积比为1∶1的混合物。
可以通过琼脂糖凝胶电泳检测所述组合物，以便表征所述电荷比。可以通过扫描显微分析检测选定的复合物，以便获得有关DNA缩合和复合物大小的信息。
令人惊奇的是，特别是与聚合物链连结的疏水性基团表现出特别好的结果，并且形成确定的缩合复合物，尽管在水中具有较低的溶解度。预计，具有疏水性修饰的聚合物能像表面活性剂或乳化剂那样起作用，因此，不能与核酸形成颗粒状的复合物。还可以预料的是，所述疏水性取代基决定了核酸/聚合物复合物的表面特征，并因此导致与细胞膜相互作用的增强，从而提高了转染效率。
实施例
一般说明
业已令人惊奇的发现，疏水性线性聚乙烯亚胺，以下简称为H-LPEI，在作为载体将核酸导入细胞的效率方面以及在其与线性未取代过的聚乙烯亚胺(LPEI)的生物兼容性方面特别优秀。在用小鼠进行的实验中，测试了含有H-LPEI和编码人类因子VIII(FVIII)蛋白的DNA质粒的核酸复合物，同时，在每一种情况下对照测试了分子量相同的未取代过的线性聚乙烯亚胺。只有在H-LPEI复合物的情况下才能检测到蛋白的表达。同样，用裸露的DNA进行的转染实验总是阴性的。
在FVIII基因治疗的研究中，酰化聚乙烯亚胺被证明是特别有效的，优选具有C18侧链的聚乙烯亚胺。酰化度为0.1-10％，优选1-5％，特别优选3％。平均分子量优选为20000-100000g/mol。
另外，确定具有胆汁酸取代基，优选CDC取代基的线性聚乙烯亚胺是特别有效的。酰化度为0.1-10％，优选1-5％，特别优选3％。分子量优选为20000-100000g/mol。
与此同时，在体内测试期间没有出现毒性反应。
在以下实施例中详细描述了在体内实验中FVIII蛋白表达的分析和测定，以及相关的方法。
实施例1
线性聚乙烯亚胺(LPEI)的合成：
通过2-乙基噁唑啉的阳离子开环聚合得到聚(乙基噁唑啉)(类似于B.L.Rivas，S.I.Ananias，Polymer Bul1.1992，28，3-8)，然后通过酸水解消去丙酸合成线性聚乙烯。某些前体聚合物(聚(乙基噁唑啉))还可以商购获得(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，德国)。所述前体聚合物是通过凝胶渗透层析、1H-NMR和FT-IR表征的。
通过在100℃下让24.7克的聚(乙基噁唑啉)(Mw 200000g/mol)与40毫升水和40毫升浓盐酸的混合物起反应可以进行定量水解。在24小时之后通过添加250毫升的水溶解形成的卷绕的沉淀。在冷却到20℃之后，通过添加20％的浓氢氧化钠将该产物调整到pH11，并且沉淀。通过抽吸过滤所述沉淀，并且洗涤(洗涤水pH7)，然后在五氧化二磷上在高真空条件下干燥，然后将粗品从乙醇中重结晶(产率为9.5g/88％)。通过在Sephadex G25(Pharmacia一次性PD-10脱盐柱)上进行柱层析，用Millipore水作为洗脱剂，然后冷冻干燥，由聚乙烯亚胺的饱和水溶液(pH7)获得高纯度的材料(毫克数量级)。
通过1H-NMR和FT-IR鉴定线性聚乙烯亚胺，通过这种方式可以证实所述定量水解。
实施例2
疏水性官能化的线性聚乙烯亚胺(H-LPEI)的合成，举例来说，是通过将3mo1-％C18烷基引入Mw为87000g/mol的LPEI中进行的：
为此，在60℃、氩气下，将0.5克的LPEI溶解在10毫升乙醇中，在缓慢添加0.11克(0.13毫升)十八烷基氯之后，搅拌17小时。通过在20℃下添加20毫升的水使反应产物沉淀，过滤，用水(洗涤水pH7)洗涤，在五氧化二磷上在高真空条件下干燥(产率为0.48g/96％)。通过在Sephadex G25(Pharmacia一次性PD-10脱盐柱)上柱层析，用Millipore水作洗脱剂，然后冷冻干燥，由聚乙烯亚胺的饱和水溶液(pH7)获得高纯度的材料(毫克数量级)。
通过1H-NMR和FT-IR鉴定烷基化的线性聚乙烯亚胺，通过这种方式可以证实需要的烷基化度。
实施例3
疏水性官能化的线性聚乙烯亚胺(H-LPEI)的合成，举例来说，是通过将3mo1-％C18酰基引入Mw为87000g/mol的LPEI中进行的：
为此，在50℃、氩气下，将0.5克的LPEI溶解在10毫升乙醇中，在缓慢添加0.11克(0.12毫升)十八烷酰氯之后，搅拌20小时。过滤所述反应混合物，然后在真空中定量浓缩。将残余物溶解在4毫升的热乙醇中，并且通过在20℃下添加8毫升的水使反应产物沉淀，过滤并用水(洗涤水pH7)洗涤，然后在五氧化二磷上在高真空条件下干燥(产率为0.38g/76％)。通过在Sephadex G25(Pharmacia一次性PD-10脱盐柱)上柱层析，用Millipore水作洗脱剂，然后冷冻干燥，由聚乙烯亚胺的饱和水溶液(pH7)获得高纯度的材料(毫克数量级)。
通过1H-NMR和FT-IR鉴定酰化的线性聚乙烯亚胺，通过这种方式可以证实需要的酰化度。
实施例4
疏水性官能化的线性聚乙烯亚胺(H-LPEI)的合成，举例来说，是通过将3mo1-％的鹅脱氧胆酸基团(3α，7α-二羟基-5β-胆酸)引入Mw为87000g/mol的LPEI中进行的：
为此，用N-羟基琥珀酰亚胺将鹅脱氧胆酸(Sigma-Aldrich ChemieGmbH)转化成活性酯化合物。在0-5℃下，将1克鹅脱氧胆酸和0.32克N-羟基琥珀酰亚胺溶解在5毫升二甲氧基乙烷中，与0.63克的二环己基碳二亚胺起反应。搅拌反应混合物16小时，过滤沉淀，并且真空浓缩滤液。在高真空条件下干燥活性酯(稳定的泡末)，并且通过1H-NMR鉴定。不进行进一步的纯化，在室温、氩气氛下，将179毫克的鹅脱氧胆酸活性酯添加到溶解在10毫升乙醇中的0.5克的LPEI的溶液中。然后在50℃下搅拌该反应混合物20小时。在冷却到室温之后，通过添加25毫升的水使产物沉淀。过滤残余物，用水(洗涤水，pH7)洗涤，并且在高真空条件下在五氧化二磷上干燥(产率0.41克/82％)。通过在Sephadex G25(Pharmacia一次性PD-10脱盐柱)上柱层析，用Millipore水作洗脱剂，然后冷冻干燥，由聚乙烯亚胺的饱和水溶液(pH7)获得高纯度的材料(毫克数量级)。
通过1H-NMR和FT-IR鉴定业已通过活性酯方法酰基官能化的线性聚乙烯亚胺，通过这种方法可以证实需要的酰化度。
实施例5
ζ电位测定：
进行ζ电位测定，以便确定线性聚乙烯亚胺和疏水性官能化的聚乙烯亚胺在生理学pH下的水溶液中的带电荷或质子化程度。无论平均分子量如何，并且无论聚合物类型如何，在pH7下的平均质子化程度为50％，就是说，在pH7的水溶液中，大约50％的氮原子是质子化形式的。
实施例6
多核苷酸/聚合物复合物的制备：
本实施例的目的是生产多核苷酸/聚合物复合物，例如FVIII质粒pCY2与各种多核苷酸/聚合物电荷比(1∶0.1-1∶10)和多核苷酸浓度恒定为250微克/毫升的复合物。可以根据在例5中提供的ζ电位测定计算电荷比和相应的浓度。
质粒pCY2披露于有关文献中(C.R I11，C.Q.Yang，S.M.Budlingmaier，J.N.Gonzales，D.S.Burns，R.M.Bartholomew和P.Scuderi，Blood Coagulation and Fibrinolysis 1997，8(2)，23-30)。PCY2长度为9164Bp，并且包含“甲状腺激素结合球蛋白”启动子、两个拷贝的α-1微球蛋白/Bikunin增强子和兔β球蛋白基因内含子的5’区，由它控制人B区缺失的FVIII基因的表达。所述质粒还包括氨苄青霉素抗生素抗性基因，ColE1复制起点和polyA位点。
用pH7的水和生理盐水制备浓度为0.5毫克/毫升的所有聚乙烯亚胺(LPEI，H-LPEI)的母液。对此，将25毫克LPEI或H-LPEI溶解在30毫升水或生理盐水中，加热并进行短时间的超声波处理，用0.1NHC1调整到pH7，并将最终体积调整到50毫升。通过过滤(0.2微米)对所述母液进行灭菌，并且可以在20℃下长时间保存。用所述母液制备一系列稀释液(各1毫升，表1)，并且以1∶1的体积比与浓度为500微克/毫升的多核苷酸溶液起反应，以得到具有特定电荷并且多核苷酸浓度为250微克/毫升的多核苷酸复合物(表2)。在标准实验中，通常选择体积为300微升的多核苷酸/LPEI或多核苷酸/H-LPEI溶液。具有高聚乙烯亚胺含量的复合物可能发生沉淀，其可以在各种应用之前重新悬浮或重新分散。
在室温、无菌条件下将所述聚合物溶液通过移液管转移到所述多核苷酸溶液中，然后在涡旋搅拌器中混合。在室温下培养4小时，然后在4℃下保存多核苷酸/聚合物复合物，该复合物可以稳定保存数周。可以根据需要对所述复合物溶液进行稀释，以便用于动物实验。
表1：由LPEI和H-LPEI母液制备系列稀释溶液
LPEI，H-LPEI LPEI，H-LPEI母液c＝500μg/ml   水或生理盐水溶液 总体积
c/μg/ml V/μl   V/μl  V/μl
19 38   962  1000
47 95   905  1000
95 189   811  1000
142 284   716  1000
189 378   622  1000
378 756   244  1000
表2：制备具有各种电荷比例的多核苷酸/LPEI或H-LPEI复合物(水溶液)，用于体内实验以及用于通过凝胶电泳研究的概述
多核苷酸/聚合物电荷比 LPEI/H-LPEI   水或生理盐水溶液  多核苷酸c＝500μg/ml   多核苷酸c＝1000μg/ml 复合物
 c/μg/ml  V/μl   V/μl  V/μl   V/μl   V总/μl
1∶01  19  150   0  150   0   300
1∶0.25  47  150   0  150   0   300
1∶0.5  95  150   0  150   0   300
1∶0.75  142  150   0  150   0   300
1∶1  189  150   0  150   0   300
1∶2  378  150   0  150   0   300
1∶3  500  170   55  0   75   300
实施例7
通过凝胶电泳鉴定多核苷酸/聚合物复合物
通过琼脂糖凝胶电泳研究了所述聚合物的复合物的性能以及多核苷酸/聚合物复合物的电荷状况。所述凝胶分别是用0.4克琼脂糖和40毫升Tris乙酸缓冲液(0.04M，pH8.3，含有0.01M EDTA)制备的(厚度大约为0.6厘米)。在涡旋搅拌器中混合由4微升多核苷酸/聚合物复合物(c＝250μg/ml)，9.5μl水(Millipore)和1.5μl终止混合物组成的样品，并且定量转移到凝胶加样孔中。凝胶电泳通常是用100-150mA(110V)的电流进行的。为了进行比较，还在每一个凝胶电泳中分析了DNA标记物(PeqLab，1kb Ladder)和裸露的(未复合的)多核苷酸。
在溴化乙锭水溶液中对所述凝胶进行染色之后，用254nm波长的光线照射，观察DNA带的位置。对于FVIII质粒来说可以看到两条带，相当于该质粒的超螺旋形式和环状形式，并且沿阴极方向移动。用溴化乙锭检测不到LPEI和H-LPEI。复合物中聚合物含量的增加，会导致所述质粒在加样点上的部分的、但仍然是不完全的阻滞。多核苷酸/聚合物电荷比超过1∶1的复合物不再能检测到，就是说溴化乙锭不再可能嵌入DNA。据推测，紧凑的DNA在电荷比超过1∶1时以聚合物包封的颗粒形式存在。凝胶电泳的结果与所研究的线性聚乙烯亚胺的类型(分子量，取代)无关。可以通过凝胶电泳证实计算的电荷比例(参见实施例5)。
实施例8
通过扫描显微术(AFM)鉴定多核苷酸/聚合物复合物
通过AFM(Digital Instruments)鉴定用水溶液制备的特定的多核苷酸/聚合物复合物。为此，用水将所述复合物溶液稀释到浓度为0.5-1微克/毫升，并且将1-5微升的稀释溶液通过移液管转移到硅基质上。在水蒸发(大约5分钟)后，用AFM分析样品。可以发现，当多核苷酸/聚合物比例超过1∶0.15时，会发生DNA缩合和颗粒形成，颗粒的大小在100-200nm范围内。
实施例9
用疏水性官能化的聚乙烯亚胺(H-LPEI)进行的体内转染实验：
用编码FVIII的质粒pCY2生产多核苷酸/聚合物复合物
所使用的小鼠是C57B1/6雌性小鼠，5-6周大，每只大约20克重。所述小鼠是从美国的Simonsen Labs Inc.购买的。
在所述实验中，每组使用5只小鼠，并且通过尾部静脉给每只动物注射200微升制剂，所述制剂中或者仅含有50微克质粒DNA，或者含有50微克质粒DNA+聚合物。DNA/聚合物电荷比为1∶0.5。随后的实验分别使用10只小鼠/组，以及不同电荷比的DNA：聚合物/LPEI或聚合物/H-LPEI。在注射之后24小时对所述动物进行眼眶后放血。
应用改进的FVIII活性测定分析来自所述动物的血浆样品。首先用磷酸缓冲过的食盐溶液对所述血浆进行1∶4的稀释，然后添加到用小鼠单克隆抗体C7F7包衣的96孔测定平板中。C7F7抗体对人FVIII的轻链有专一性，并且不能与小鼠FVIII起反应。在37℃下培养2小时之后，用含有0.05％ Tween 20的PBS洗涤平板2次。然后使用由Coatest试剂盒的生产商(Diapharma Inc.，瑞典)推荐的试剂和测定条件。该测定的最后一步是在405/450nm波长下读出光学密度。所有FVIII含量都是从标准曲线推测的，标准曲线是通过向稀释过的小鼠血浆中添加重组人FVIII制备的(校正如表3所示)。
以上结果在表4和5中示出。
FVIII活性测定(C7F7改进的“Coatest”)：
试剂和缓冲液：
包衣缓冲液：要么是Sigma P-3813，pH7.4，要么是0.1M碳酸氢盐缓冲液，pH9.2；
封闭缓冲液：1×Coatest缓冲液+0.8％ BSA+0.05％ Tween 20；
洗涤缓冲液：20mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.05％ Tween 20，pH7.2，使用之前过滤；
培养缓冲液：不含Tween 20的封闭缓冲液；
CoatestVIII：C/4测定试剂盒：Chromogenix AB，#82-19-18-63/2
方法：
1.用溶解在包衣缓冲液中的5微克/毫升C7F7对96孔Immulon平板进行包衣(100微升/孔)，在4℃下过夜；
2.洗涤3次；添加封闭缓冲液(100微升/孔)，在37℃下培养至少1小时；
3.洗涤3次；添加用封闭缓冲液稀释的样品(100微升/孔)，在37℃下培养l-2小时；
4.洗涤3次；添加培养缓冲液(250微升/孔)；然后添加Coatest试剂(试剂盒：50微升/孔混合的FIXa，FX+磷脂)；按照试剂盒的指导说明书进行；在37℃下培养5分钟；然后将50微升S-222底物添加到每个孔中，并且在37℃下培养5分钟，或者用较低的范围培养10分钟(步骤4可以通过具有摇床的加热块进行)；
5.用2％柠檬酸终止反应(50微升/孔)；
6.在405-450nm波长下测定O.D.。
实施例10
对照实验(表5a，b)
用裸露的FVIII质粒pCY2进行的体内对照实验都是阴性的，就是说检测不到蛋白表达。在用基于具有三种不同分子量分布(Mw22000，87000，217000克/摩尔)和例如1∶0.5的质粒/LPEI电荷比的未取代的线性聚乙烯亚胺(LPEI)质粒/聚合物复合物进行的对照实验中(静脉内注射200微升，c＝250微克/毫升，以DNA为基础)同样不能检测到任何蛋白表达。
表3：FVIII蛋白标准物的UV/可见光谱学校正(重复二次)
 标准     FVIII浓度/ng/ml   位置(MTP格式)     光密度(O.D.)     O.D.平均值
 STD01     23.00   A1A2     1.2891.149     1.289
 STD02     11.50   B1B2     1.0370.949     0.993
 STD03     5.750   C1C2     0.6870.617     0.652
 STD04     2.875   D1D2     0.4560.404     0.43
 STD05     1.438   E1E2     0.2930.261     0.277
 STD06     0.719   F1F2     0.1820.160     0.171
 STD07     0.359   G1G2     0.1210.114     0.117
 STD08     0.179   H11H12     0.1040.115     0.110
 STD09     0.000   H1H2     0.0580.060     0.059
表4a：在注射DNA/聚合物复合物之后FVIII基因表达：第一组，5只小鼠(1a-1e)，聚合物：H-LPEI，Mw 86980，C18，酰基，3mol％(*稀释倍数4)
  第1组     光学密度(O.D.)*     O.D.平均值   FVIII浓度/ng/ml    FVIII浓度/ng/ml(平均值)
  1a     0.2190.177     0.198   3.4352.464    2.950
  1b     0.0750.082     0.079   0.2210.376    0.298
  1c     0.0750.074     0.075   0.2210.198    0.210
  1d     0.0900.079     0.085   0.5510.310    0.430
  1e     0.0700.071     0.071   0.1070.130    0.119
表4b：在注射DNA/聚合物复合物之后FVIII基因表达：第二组，5只小鼠(2a-2e)，聚合物：H-LPEI，Mw 86980，CDC，3mol％(*稀释倍数4)
  第2组     光学密度(O.D.)*     O.D.平均值   FVIII浓度/ng/ml   FVIII浓度/ng/ml(平均值)
  2a     0.0660.065     0.066   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0
  2b     0.0760.078     0.077   0.2430.288   0.265
  2c     0.0670.061     0.064   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0
  2d     0.0760.070     0.073   0.2430.107   0.175
  2e     0.0870.076     0.082   0.4850.242   0.364
表5a：在注射裸露的DNA之后FVIII基因表达：第三组，5只小鼠(DNA1-DNA5)，(稀释倍数4)
  第3组     光学密度(O.D.)*     O.D.平均值   FVIII浓度/ng/ml   FVIII浓度/ng/ml(平均值)
  DNA1     0.0650.062     0.063   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0
  DNA2     0.0630.059     0.061   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0
  DNA3     0.0560.058     0.057   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0
  DNA4     0.0620.062     0.062   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0
  DNA5     0.0650.065     0.065   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0
表5b：在注射DNA/聚合物复合物之后FVIII基因表达：第四组，5只小鼠(4a-4e)，聚合物：LPEI，MW 86980克/摩尔未取代(*稀释倍数4)
  第4组     光学密度(O.D.)*     O.D.平均值   FVIII浓度/ng/ml   FVIII浓度/ng/ml(平均值)
  4a     0.0630.059     0.061   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0
  4b     0.0590.060     0.059   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0
  4c     0.0660.064     0.065   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0
  4d     0.0690.067     0.068   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0
  4e     0.0890.082     0.086   ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜   0.412
实施例11
为了检验当pH改变时多核苷酸/聚合物复合物的表现，并因此促进细胞内皮-溶酶体区室的作用，在各种缓冲液系统中，并因此在各种pH条件下进行琼脂糖凝胶电泳研究。可以看出，当pH从8.3(TAE缓冲液)改变成pH5.9(MES缓冲液)时，复合度降低，这种变化相当于部分释放。

Claims (33)

1.含有可溶于水或可分散于水中的具有疏水性取代基的线性阳离子聚合物与至少一种核酸的复合物。
2.如权利要求1的复合物，其特征在于，所述聚合物是聚胺。
3.如权利要求2的复合物，其特征在于，所述聚胺是聚乙烯亚胺。
4.如权利要求1-3中任意一项的复合物，其特征在于，所述取代基作为侧链或末端连接于所述聚合物上。
5.如权利要求1-4中任意一项的复合物，其特征在于，所述取代基是烷基链、酰基链或类甾族化合物取代基，以及可以通过将所述聚合物主链的氮官能团加成到异硫氰酸酯或加成到α，β-不饱和羰基化合物上而引入的疏水性取代基。
6.如权利要求1-5中任意一项的复合物，其特征在于所述聚合物具有以下通式：
Figure A0182025300021
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中
R1表示氢、甲基或乙基，和
R2表示具有1-23个碳原子的烷基，
并且，其中
R3和R4(端基)各自独立表示氢和具有1-24个碳原子的烷基，或具有取决于引发剂的结构，其中
R5(端基)是取决于终止反应的取代基，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)在45-5250的范围内，而n＝a×P，0.001＜a＜0.1，其中，m和n个单元是随机分布在该聚合物中。
7.如权利要求1-5中任意一项的复合物，其特征在于所述聚合物具有以下通式：
Figure A0182025300031
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中，
R1表示氢、甲基或乙基，和
R2表示具有1-22个碳原子的烷基，
并且，其中
R3和R4(端基)各自独立表示氢或具有1-24个碳原子的酰基，或具有取决于引发剂的结构，
其中
R5(端基)是取决于终止反应的取代基，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)在45-5250的范围内，而n＝a×P，0.001＜a＜0.1，其中，m和n个单元是随机分布在该聚合物中。
8.如权利要求1-5中任意一项的复合物，其特征在于所述聚合物具有以下通式：
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中，
R1、R2和R3表示氢或羟基，
并且，其中，
R4和R5(端基)各自独立表示氢或胆汁酸，或具有取决于引发剂的结构，
其中
R6(端基)是取决于终止反应的取代基，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)在45-5250的范围内，而n＝a×P，0.001＜a＜0.1，其中，m和n个单元是随机分布在该聚合物中。
9.如权利要求1-5中任意一项的复合物，其特征在于所述聚合物具有以下通式：
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中，
R1表示OR4或NR4R5，
其中，R4和R5分别表示氢或具有1-24个碳原子的烷基，
并且，其中
R2和R3(端基)各自独立相应于聚合物主链的氮原子的取代基，或者具有取决于引发剂的结构，
其中
R6(端基)是取决于终止反应的取代基，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)在45-5250的范围内，而n＝a×P，0.001＜a＜0.1，其中，m和n个单元是随机分布在该聚合物中。
10.如权利要求1-5中任意一项的复合物，其特征在于所述聚合物具有以下通式：
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中，
R1表示具有1-24个碳原子的烷基，
并且，其中
R2和R3(端基)各自独立相应于聚合物主链的氮原子的取代基，或者具有取决于引发剂的结构，
其中
R4(端基)是取决于终止反应的取代基，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)在45-5250的范围内，而n＝a×P，0.001＜a＜0.1，其中，m和n个单元是随机分布在该聚合物中。
11.如权利要求1-10中任意一项的复合物，其特征在于所述聚合物具有低于220000g/mol的平均分子量。
12.如权利要求1-11中任意一项的复合物，其特征在于所述聚合物具有2000-100000g/mol的分子量。
13.如权利要求1-12中任意一项的复合物，其特征在于所述聚合物偶联在细胞专一性配体上。
14.如权利要求1-13中任意一项的复合物，其特征在于所述核酸是质粒。
15.如权利要求1-14中任意一项的复合物，其特征在于所述核酸包括编码药理学活性物质的核苷酸序列。
16.如权利要求1-14中任意一项的复合物，其特征在于所述核酸包括编码抗原、过敏原或免疫调节蛋白的核苷酸序列。
17.如权利要求1-16中任意一项的复合物，其特征在于所述核酸/聚合物的电荷比为1∶0.1-1∶10，特别是1∶2-1∶10。
18.用于生产权利要求1-17中任意一项的复合物的方法，其特征在于将存在于水溶液中的合适量的聚合物与合适量的核酸溶液混合。
19.如权利要求18的方法，其特征在于然后将所述混合物干燥。
20.将权利要求1-16中任意一项的复合物用作药物的用途。
21.含有权利要求1-16中任意一项的复合物和其他添加剂的组合物。
22.权利要求1-16中任意一项的复合物用于将核酸导入细胞中的用途。
23.含有权利要求1-16中任意一项的复合物的细胞。
24.含有权利要求23的细胞和其他添加剂的组合物。
25.将权利要求1-16中任意一项的复合物用于生产基因治疗的药物的用途。
26.将权利要求1-16中任意一项的复合物用于生产用于接种的药物的用途。
27.将权利要求1-16中任意一项的复合物用于生产用来诱导对过敏的耐受性的药物的用途。
28.具有以下通式的聚合物：
Figure A0182025300061
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中
R1表示氢、甲基或乙基，和
R2表示具有1-22个碳原子的烷基，
并且，其中
R3和R4(端基)各自独立表示氢或具有1-24个碳原子的酰基，或具有取决于引发剂的结构，
其中
R5(端基)是取决于终止反应的取代基，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)在45-5250的范围内，而n＝a×P，0.001＜a＜0.1，其中，m和n个单元是随机分布在该聚合物中。
29.具有以下通式的聚合物：
Figure A0182025300071
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中，
R1、R2和R3表示氢或羟基，
并且，其中
R4和R5(端基)各自独立表示氢或胆汁酸，或具有取决于引发剂的结构，
其中
R6(端基)是取决于终止反应的取代基，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)在45-5250的范围内，而n＝a×P，0.001＜a＜0.1，其中，m和n个单元是随机分布在该聚合物中。
30.具有以下通式的聚合物：
Figure A0182025300072
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中，
R1表示OR4或NR4R5，
其中，
R4和R5各自独立表示氢或具有1-24个碳原子的烷基，
并且，其中，
R2和R3(端基)各自独立相应于聚合物主链的氮原子的取代基，或者具有取决于引发剂的结构，
其中，
R6(端基)是取决于终止反应的取代基，
以及，其中的平均聚合度P＝(m+n)在45-5250的范围内，而n＝a×P，0.001＜a＜0.1，其中，m和n个单元是随机分布在该聚合物中。
31.具有以下通式的聚合物：
Figure A0182025300081
其中，在每一个独立的[CH2-CH2-N]单元中，
R1表示具有1-24个碳原子的烷基，
并且，其中
R2和R3(端基)各自独立相应于聚合物主链的氮原子的取代基，或者具有取决于引发剂的结构，
其中
R4(端基)是取决于终止反应的取代基，
并且，其中的平均聚合度P＝(m+n)在45-5250的范围内，而n＝a×P，0.001＜a＜0.1，其中，m和n个单元是随机分布在该聚合物中。
32.如权利要求28-31中任意一项的聚合物，其特征在于所述聚合物具有低于220000g/mol的分子量。
33.如权利要求32的聚合物，其特征在于所述聚合物具有2000-100000g/mol的分子量。
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