CN1295338C - 靶向于成纤维细胞生长因子受体的聚乙烯亚胺转基因载体 - Google Patents
靶向于成纤维细胞生长因子受体的聚乙烯亚胺转基因载体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1295338C CN1295338C CNB2004100681767A CN200410068176A CN1295338C CN 1295338 C CN1295338 C CN 1295338C CN B2004100681767 A CNB2004100681767 A CN B2004100681767A CN 200410068176 A CN200410068176 A CN 200410068176A CN 1295338 C CN1295338 C CN 1295338C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pei
- carrier
- cell
- oligopeptides
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 title abstract description 39
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 title abstract description 4
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 22
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 16
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 147
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 86
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 39
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 13
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 13
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims description 8
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims description 8
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 claims 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 56
- 102000052178 fibroblast growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 28
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 abstract description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 abstract 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 abstract 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 61
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 11
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 8
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 8
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 7
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 7
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 7
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 7
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 239000011246 composite particle Substances 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 9-fluorenylmethyloxycarbonyl Chemical group 0.000 description 2
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- MFGOTAHWOBKNNU-XMHGGMMESA-N Isodigeranyl Chemical group CC(C)=CCC\C(C)=C\CC(C)(C=C)CCC=C(C)C MFGOTAHWOBKNNU-XMHGGMMESA-N 0.000 description 2
- MFGOTAHWOBKNNU-FQEVSTJZSA-N Isodigeranyl Natural products CC(=CCCC(=CC[C@](C)(CCC=C(C)C)C=C)C)C MFGOTAHWOBKNNU-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 2
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N sulfanyloxyethane Chemical compound CCOS FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F Chemical group Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100023593 Fibroblast growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710182386 Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000960954 Homo sapiens Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000283207 Indigofera tinctoria Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 1
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 125000004836 hexamethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 102000043959 human IL18 Human genes 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940030980 inova Drugs 0.000 description 1
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001225 nuclear magnetic resonance method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002522 swelling effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012256 transgenic experiment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供靶向于成纤维细胞生长因子受体的聚乙烯亚胺转基因载体，包括与碱性成纤维细胞生长因子受体特异结合的寡肽YC25、寡肽YC25/阳离子多聚物PEI/外源DNA的基因转移非病毒载体复合物系统。本发明提供的载体能将外源DNA有效地导入高表达FGFRs的肿瘤细胞系和肿瘤组织，达到抑制肿瘤生长的作用，但对不表达FGFRs的肿瘤细胞的转染效率很低，使得载体系统具备了肿瘤靶向性；本发明非病毒转基因载体系统可转移的外源DNA大小范围可以从几十bp到几千kb，克服了病毒载体插入外源基因的大小限制，可用于制备多基因的联合转移以治疗肿瘤的药物，同时也可作为平台技术用于制备治疗其他疾病的基因药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术，具体地说，涉及一种靶向于肿瘤细胞表面成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors，FGFRs)的非病毒转基因载体，用于将编码治疗基因的表达质粒转入富含FGFR的肿瘤细胞。本发明还涉及此非病毒转基因载体的制备和用途。
背景技术
基因治疗是指将外源基因转入细胞内部，通过恢复或增添基因表达以纠正人自身基因的结构或功能上的错乱，阻止病变的进展，杀灭病变的细胞，或抑制外源病原体遗传物质的复制，从而达到治病的目的。基因治疗包括三个重要环节，即目的基因、转基因载体和靶细胞。基因导入系统是基因治疗的核心技术。目前，应用于基因治疗的载体主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体转染效率高，是体内基因治疗的主要工具，但病毒载体包装容量有限、制备复杂、有免疫原性(体内不能反复应用)和潜在的安全危险。而非病毒载体具有安全性高、免疫原性低、易于对DNA进行操作等优点，故人们愈来愈重视人工合成的非病毒载体的研究[1]，而解决靶向性问题是非病毒中载体中最为关注的问题，理想的载体系统是能将治疗基因输送到并进入特定的靶细胞，从而能在该细胞中得到有效表达，这对于恶性肿瘤基因治疗尤为重要。以受体靶向的非病毒载体系统是最常用和有效的策略，利用细胞表面表达特异性的受体或蛋白，将特定的配体分子或片段与载体连接形成分子偶联体，使DNA能靶向性地转到表达受体的细胞。同时，针对非病毒载体的缺陷及DNA转移过程中的内吞小泡释放问题、转运入核问题，根据具体情况选择合适的载体，并对其作进一步的优化、改善以获得满意的治疗或应用效果。目前常用的非病毒载体包括裸DNA，脂质体载体及阳离子多聚物型载体等。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是最常用的阳离子多聚物非病毒载体，PEI可把质粒DNA缩合(condense)成数百纳米大小的颗粒，通过静电作用黏附到细胞表面上，被动内吞。PEI在吞噬泡内不能降解，同时可保护DNA免受溶酶体降解；另外，PEI有渗透性肿胀效应，导致吞噬泡破裂，使DNA进入胞浆，并促进DNA进入细胞核。
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)是一个结合肝素的多肽家族，至少包括了23个结构上相关的多肽，其中bFGF(basic fibroblastgrowth factor，bFGF或称FGF-2)与肿瘤关系较密切，bFGF可刺激肿瘤生长，同时是强有力的血管生成剂，在肿瘤的血管形成中具有重要作用。bFGF的放射受体分析证明FGF受体有两类[2]，一类是饱和的、高亲和力受体，有四型即FGFR1～4，与FGF具有pmol的亲和力，介导FGF的细胞反应，属于酪氨酸激酶受体超家族；另一类是低亲和力位点，主要为硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)。研究表明，许多癌细胞系高表达FGFR，如Chandler等[3]研究了60株9个不同类型的人肿瘤细胞系FGFR的表达情况，结果表明90％表达一种以上的FGFR。在静息细胞的细胞核里，几乎检测不到bFGF及其受体。不同类型细胞表面受体的配体例如糖类残基、肽、蛋白质和抗体已用于靶向非病毒载体，如转铁蛋白、甘露糖、表皮细胞生长因子、叶酸等，bFGF完整分子靶向的病毒载体和多聚赖氨酸载体已有报道[4-9]。目前在非病毒载体的构建方面，寡肽配体的应用是研究方向之一。完整bFGF分子或其寡肽偶联的PEI尚未见报道。
发明内容
本发明提供靶向于成纤维细胞生长因子受体的聚乙烯亚胺转基因载体，包括与碱性成纤维细胞生长因子受体特异结合的寡肽YC25、寡肽YC25/阳离子多聚物PEI/外源DNA的基因转移非病毒载体复合物系统，以及在制备利用该非病毒载体系统介导外源基因治疗包括宫颈癌、大肠癌、肝癌多种恶性肿瘤的药物中的应用。
本发明的第一方面提供与细胞表面碱性成纤维细胞生长因子受体特异结合的寡肽YC25，我们设计合成的bFGF配体寡肽YC25序列：YRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKC(25个氨基酸)。多肽通过固相法合成，在美国ABI公司的多肽合成仪(431A)上进行，采用Fmoc(9-芴甲氧羰基)方案，合成步骤按照ABI公司的多肽合成操作手册进行。经高效液相色谱纯化，纯度＞95％，序列鉴定通过质谱分析。多肽要与巯基化的大分子作交联，合成后寡肽末端的半胱氨酸保持巯基活性，同时避免多肽之间交联，多肽中不含有巯基还原剂(如DTT、二巯基乙醇或二巯基乙烷等)。
本发明的第二方面提供寡肽/阳离子多聚物PEI/外源DNA的基因转移非病毒载体复合物系统，其中寡肽是YC25，阳离子多聚物是多聚乙稀亚胺PEI，外源DNA是报告基因如编码增强型绿色荧光蛋白EGFP的质粒pEGFP和编码β-半乳糖苷酶(β-gal)的质粒pSVβ及pcDNA3.1β等，细胞因子基因如编码人白细胞介素18(IL-18)的质粒pcDNA3.1(-)B-IL-18，编码人α-干扰素(α-IFN)质粒pCSK-α-IFN等。该非病毒载体复合物的构建方法，合成的YC25寡肽末端含一个自由巯基的半胱氨酸(Cysteine，C)，用于与异双功能交联剂活化的PEI形成二硫键，保证每个寡肽与PEI只有一个交联位点，制备寡肽与PEI的偶联产物，再与带电荷的外源DNA混合形成载体复合物系统。
本发明的第三方面是利用寡肽YC25/阳离子多聚物PEI/外源DNA的基因转移非病毒载体复合物系统在制备治疗包括宫颈癌、大肠癌、肝癌等各种恶性肿瘤肿瘤的药物中的应用。
利用上述载体系统转染pEGFP质粒，pSVβ质粒及pcDNA3.1β质粒，pcDNA3.1(-)B-IL-18，pCSK-α-IFN到猴胚肾细胞COS-7(FGFR阳性)，人宫颈癌细胞Hela(FGFR阳性)，人前列腺癌细胞PC-3(FGFR阴性)，人肝癌细胞HepG2(FGFR阳性)等并检测其转染效率，实验证明YC25-PEI可有效地介导pEGFP质粒和pcDNA3.1(-)B-IL-18在FGFR阳性的Hela，COS-7，HepG2等细胞中表达，与自由PEI相比，转染效率明显增高；而对FGFR阴性的PC-3细胞则不能增加转染效率。建立BALB/C裸鼠的荷瘤模型，瘤体内注射携带外援DNA的载体复合物系统，观察目的基因的表达情况和肿瘤生长抑制情况。实验证明，YC25-PEI复合物系统可介导β-gal报告基因在HepG2肝癌裸鼠模型的瘤体局部有效地表达。利用YC25-PEI/pCSK-α-IFN进行基因治疗可有效抑制裸鼠皮下HepG2肿瘤的生长。
本发明非病毒载体复合物系统能在体内外实验中将外源DNA靶向性地导入表达FGFR的肿瘤细胞，在恶性肿瘤基因治疗中具有较好的应用前景，为临床肿瘤基因药物的应用提供了研究基础。
向肿瘤释放药物或转基因，FGFR是个潜在的吸引人的靶位点，大多数癌细胞以及肿瘤新生血管都高表达FGFRs。本发明利用PEI作为载体系统的骨架，同时利用FGF受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)在大多数肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，自主设计了能与肿瘤细胞表面相应受体结合的碱性细胞生长因子寡肽YC25，利用交联技术将寡肽与PEI偶联，构建了新型的非病毒基因载体系统，以增加其对肿瘤细胞及其新生血管的靶向性，旨在提供用于恶性肿瘤基因治疗药物制备的研究。利用配体多肽识别肿瘤细胞膜上过量表达的生长因子受体，经细胞的内吞作用，通过该载体系统将外源DNA选择性地导入肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。bFGF受体结合区寡肽靶向的PEI尚未见应用和报道。
本发明优点：本发明提供了一种能与肿瘤细胞膜表面成纤维细胞生长因子受体特异结合的合成多肽YC25，构建了YC25肽/阳离子多聚物/外源DNA复合体非病毒基因转移载体；本发明非病毒基因转移载体能将外源DNA有效地导入高表达FGFRs的肿瘤细胞系和肿瘤组织，达到抑制肿瘤生长的作用，但对不表达FGFRs的肿瘤细胞的转染效率很低，使得载体系统具备了肿瘤靶向性；本发明非病毒转基因载体系统可转移的外源DNA大小范围可以从几十bp到几千kb，克服了病毒载体插入外源基因的大小限制，可用于制备多基因的联合转移以治疗肿瘤的药物，同时也可作为平台技术用于制备治疗其他疾病的基因药物。
说明书附图
图1是载体复合物(YC25-PEI/pSVβ质粒DNA)形成后DNA在凝胶电泳中的阻滞情况。
图2是透射电镜观察YC25-PEI/DNA复合物物理形状和大小(N/P＝10，标尺＝1μm)。
图3是YC25-PEI/pSVβ转染COS-7细胞后X-gal原位固定染色结果。
图4是YC25-PEI/pEGFP DNA转染Hela细胞后荧光显微镜下观察阳性细胞。
图5是YC25-PEI/pEGFP DNA转染Hela和PC-3细胞后流式细胞测定阳性细胞百分比(
x±s，n＝3)。
图6是YC-25-PEI/pcDNA3.1(-)B-IL-18转染Hela和PC-3细胞后培养上清中IL-18表达水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例一
多肽与PEI通过异双功能交联剂SPDP(Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate)或SMCC(Succinimidyl trans-4-(maleimidylmethyl)cyclohexane-1-carboxylate)偶联。SPDP与PEI(pH 7～8)的氨基作用，形成吡啶二巯基修饰的PEI(PDP-PEI)；后者可与含有巯基的蛋白质反应。多肽通过半胱氨酸巯基团与PDP-PEI反应，产生二硫键连接的寡肽-PEI衍生物。SMCC与PEI形成马来酰亚胺化的PEI(maleimided PEI)，后者与含有巯基的多肽反应，寡肽与PEI通过二硫键连接。YC25寡肽与PEI不同摩尔比的偶联产物，再按照一定N/P比与带负电荷的外源DNA通过静电作用结合成YC25肽/阳离子多聚物/外源DNA载体复合物。
1.YC25的合成：
多肽通过固相法合成，经高效液相色谱纯化，纯度＞95％，序列鉴定通过质谱分析。多肽要与巯基化的大分子作交联，合成后寡肽末端的半胱氨酸保持巯基活性，同时避免多肽之间交联，多肽中不含有巯基还原剂(如DTT、二巯基乙醇或二巯基乙烷等)。多肽的功能通过与FGFR阳性细胞的结合试验以及多肽PEI偶联物/DNA复合物转染细胞实验进行筛选和验证。
2.活化PEI的制备
将2ml的5mg/ml PEI(溶媒25mM NaCl，pH 7.0)与SMCC(25mg/ml inDMF)按摩尔比分别1∶3，1∶5混合[25mg PEI(MW 25kDa)＝1μmol，0.33433mg SMCC＝1μmol]；混合时，SMCC逐滴加入PEI中，边加边搅动。室温作用30min。
去除多余的未反应的SMCC。取1.5ml上述PEI-SMCC混合物，在HiTrapDesalting SephadexTM G-25 Superfine柱过柱，按照说明书用脱气的0.1MPBS(pH 7.0)洗脱，收集2ml除去SMCC后的maleimided-PEI(回收率＞95％)(浓度为3.75mg/ml)。将maleimided-PEI应用孔径0.22μm、直径4mm聚氯乙烯(PVC)滤膜滤器(Millipore)过滤除菌。PEI活化后尽快与巯基寡肽偶联，放置不宜超过24h。留取部分样品测定PEI活化程度。巯基和硫化物定量试剂盒可以定量PEI马来酰亚胺(maleimides)化程度。在410nm检测吸光度。
SPDP可代替SMCC活化PEI，方法与上类似。
3.活化PEI与巯基寡肽的偶联
无菌操作将maleimided-PEI与巯基寡肽混合，摩尔比分别按照1∶3，1∶5混合。4℃缓慢摇动24h以上或室温作用12h。应用截流分子量10000的超滤(Superfiltration)(Millipore)通过离心，去除多余的未结合的巯基寡肽。将制备的寡肽-PEI偶联产物针式滤器过滤除菌，4℃保存。分别制备下列bFGF寡肽与PEI偶联的产物：YC25-PEI(3∶1)、YC25-PEI(5∶1)。
4.寡肽-PEI浓度的测定
通过2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)法测定氨基的浓度来测定PEI或PEI衍生物的浓度。PEI或寡肽-PEI用0.1mol/L NaHCO3(pH 8.5)倍数稀释到浓度范围20～200μg/ml。Tris、甘氨酸或其他含自由氨基的缓冲液应当避免使用。每次反应，配制新鲜的0.01％(w/v)TNBS溶液，用0.1mol/L NaHCO3(pH 8.5)作稀释液。加0.25ml 0.01％(w/v)TNBS溶液到0.5ml待检样本溶液中。混合均匀。37℃温育2h。加0.25ml 10％SDS和0.125ml 1N HCl到每个样本中。测量溶液在335nm处吸光度。一系列已知浓度的(0、50、75、100、125、150、175、200μg/ml)PEI反应溶液作为标准品，绘制标准曲线，计算待测样本浓度。
5.寡肽-PEI偶联物的鉴定
5.1TNBS法
通过TNBS法测定PEI增加的寡肽氨基评估PEI与寡肽偶联的程度，方法参照文献[10]。取PEI偶联前所用量的1％，以及偶联后寡肽-PEI产量的1％，通过TNBS法反应30min，测定各自在335nm处吸光度。偶联程度计算如下：
％Substitution＝Absorbance330nm of oligopeptide-PEI/Absorbance330nm ofPEI
5.2核磁共振法(nuclear magnesium resonance，NMR)
通过NMR鉴定寡肽PEI是否偶联成功。取一部分待测定的寡肽-PEI溶液与自由的PEI溶液真空干燥。干燥后的白色粉末溶于氧化氘(deuterium oxide，D2O)，0.22μm针式微型滤器过滤，在Varian Inova 600MHz波谱仪(Varian，Palo Alto，CA)上应用标准的质子参数测定1H-NMR波谱，峰的化学位移参照HDO(hydrogen deuderium oxide，HDO)的共振峰(4.8ppm)。
6.YC25肽/阳离子多聚物/外源DNA复合物载体的制备，凝胶电泳鉴定，透射电镜观察大小和形态。
YC25寡肽与PEI不同摩尔比的偶联产物，再按照一定N/P比与带负电荷的外源DNA通过静电作用(YC25寡肽偶联的PEI溶液与质粒DNA的溶液混合)可结合成YC25肽/阳离子多聚物/外源DNA载体复合物系统，用于体内外转染实验。取复合物30μl用琼脂糖凝胶电泳观察DNA在凝胶电泳中的阻滞情况，N/P比大于3时可将质粒DNA完全阻滞在加样孔中。寡肽偶联的PEI/DNA复合物的大小和形态通过负染透射电镜检测，在N/P＝10，PEI衍生物/DNA复合物颗粒呈类圆形，稍不规则，大小从110nm到280nm不等。
7.YC25肽/阳离子多聚物/外源DNA复合物载体系统用于肿瘤细胞的转染实验及荷瘤裸鼠的基因治疗
利用寡肽-PEI偶联物转染编码增强型绿色荧光蛋白的pEGFP质粒和编码β-半乳糖苷酶的pSVβ质粒及pcDNA3.1β质粒，到FGFR阳性的COS-7细胞，Hela细胞，HepG2等细胞并检测转染效率，转染编码IL-18和α-IFN的真核表达质粒pcDNA3.1(-)B-IL-18，pCSK-α-IFN等治疗基因，ELISA试剂盒检测上清中细胞因子表达情况。通过过量人重组bFGF竞争抑制试验以及转染FGFR阴性的前列腺癌PC-3细胞，验证寡肽-PEI的特异性靶向作用。裸鼠皮下注射肿瘤细胞成瘤后，瘤体内注射携带pcDNA3.1β质粒或pCSK-α-IFN的寡肽-PEI复合物，48h后牺牲裸鼠取瘤体，冰冻切片，进行组织X-gal染色检测β-gal表达。观察pCSK-α-IFN基因治疗的抗肿瘤作用。
实施例二 YC25肽/PEI/外源DNA复合物载体的凝胶电泳鉴定
按PEI/DNA N/P＝0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，应用HBS作为溶媒，分别配制YC25-PEI/pEGFP DNA混合液，分别取30μl进行琼脂糖凝胶电泳观察DNA阻滞情况。电泳条件：1％琼脂糖(含0.5μg/ml溴化乙锭)，1×TAE缓冲液，电压5V/cm，电泳时间30min。结果表明N/P比大于3时可将质粒DNA完全阻滞在加样孔中(参见图1)。
实施例三 透射电镜下YC25-PEI/DNA复合物颗粒的大小
PEI衍生物/DNA复合物的大小和形态通过负染透射电镜检测。按N/P＝10制备PEI/DNA复合物、YC25-PEI(5∶1)/pEGFP DNA复合物和CP9-PEI(5∶1)/pEGFP DNA复合物。2μg pSVβ质粒加入到100μl的0.9％NaCl溶液中，对应量的PEI衍生物加入其中，涡旋混合。温育30min后，取5μl的寡肽PEI/DNA复合物谨慎地滴在覆有聚乙烯醇缩甲醇支持膜的铜/铑网上。1min后，将铜/铑网放在醋酸双氧铀溶液上负染20s。过量的溶液用吸水纸小心吸除。样本在Philips TECNAI 10透射电子显微镜下观测，电压80kV。在N/P＝10，PEI衍生物/DNA复合物颗粒呈类圆形，稍不规则，大小从110nm到280nm不等。偶联寡肽的PEI与未偶联寡肽的PEI相比，转染复合物颗粒物理形态、大小无显著差异(p＜0.05)(参见图2)。
实施例四 bFGF寡肽YC25与FGFR的亲和试验
通过将bFGF寡肽YC25与HRP偶联，制备表位肽标记的HRP检测FGFR阳性的细胞，来鉴定YC25寡肽是否能结合到FGFR上。在六孔板中培养COS-7细胞[FGFR(+)]、PC-3细胞[FGFR(-)]以及Hela细胞[FGFR(+)]。待细胞丰度80％时，血清饥饿12h。然后进行YC25偶联的HRP与细胞FGFR结合试验。吸去细胞培养液，PBS洗一次。每孔加入1ml(2％甲醛+0.05％戊二醛的PBS溶液)固定液，固定15min。每孔加入3ml 0.01M PBS，洗3次。在3％H2O2水溶液中作用5min；每孔加入3ml 0.01M PBS，洗3次。每孔1ml 1％BSA，37℃温育20min，封闭蛋白结合位点。吸去多余液体，滴加系列稀释后的YC25偶联的HRP(1∶50、1∶100、1∶200及1∶300)，37℃温育1h。对照组滴加HRP作为检测物。温育后，每孔加入3ml 0.01M PBS，洗4次。加入DAB-H2O2染色5～15min，每孔加入3ml 0.01M PBS，洗3次后显微镜下观察。结果：YC25-HRP可以有效地结合到FGR阳性的细胞上：COS-7细胞，Hela细胞，HepG2细胞等。YC-25-HRP不能有效地结合到FGFR(-)PC-3细胞上。
实施例五 YC25-PEI/pSVβ转染FGFR(+)COS-7细胞
将COS-7细胞接种在24孔板，每孔5×104细胞。培养24h，待细胞60～80％融合时转染。每孔转染2μg pSVβ质粒，按PEI/DNAN/P＝10[PEI与DNA的N/P摩尔比＝[PEI(μg)×23.25]/[质粒(μg)×3.08]＝7.53×PEI(μg)/质粒(μg)](对Cos-7细胞，N/P＝10转染效果最佳)，分别应用PEI、YC25-PEI(3∶1)、YC25-PEI(5∶1)制备转染复合物。吸去细胞培养液，每孔加入1ml无血清DMEM，将转染复合物加到细胞上，水平缓慢摇动30min，然后放入细胞培养箱中培养。培养6～8h后，吸去转染液，每孔加入1ml含10％血清的DMEM继续培养36h后检测结果，分别采用原位固定X-gal染色和细胞裂解产物β-gal定量。结果：bFGF寡肽-PEI/pSVβDNA转染COS-7后原位固定X-gal染色，转染阳性细胞比例YC25-PEI(5∶1)/DNA＞YC25-PEI(3∶1)/DNA＞PEI/DNA(参见图3)。细胞裂解产物β-gal定量，在N/P＝10，偶联YC25寡肽后PEI转染效率增加(p＜0.05)。其中，YC25-PEI(5∶1)＞YC25-PEI(3∶1)＞PEI(p＜0.05)(参见图3)。
实施例六 YC25-PEI/pEGFP转染FGFR(+)Hela细胞
将人宫颈癌细胞系Hela细胞接种在6孔板，每孔5×105细胞。培养24h后，待细胞60％左右汇合时转染。每孔转染4μg编码绿色荧光蛋白的pEGFP质粒，按PEI/DNA N/P＝7.5(对Hela细胞，N/P＝7.5最优)，分别应用PEI、YC25-PEI(3∶1)、YC25-PEI(5∶1)进行转染。转染36h后，倒置荧光显微镜观察(参见图4)及流式细胞仪定量分析GFP阳性细胞比例。结果YC25寡肽-PEI/pEGFP质粒转染Hela细胞36h后，流式细胞仪分析GFP阳性细胞比例，YC25-PEI(5∶1)＞YC25-PEI(3∶1)＞PEI(p＜0.05)(参见图5)。
实施例七 YC25-PEI/pcDNA3.1β转染FGFR(-)PC-3细胞的转染效率测定
将前列腺癌细胞系PC-3细胞接种在24孔板。培养24h后，待细胞60～80％汇合时转染。每孔转染2μg编码β-半乳糖甙酶的pcDNA3.1β质粒。按PEI/DNA N/P＝7.5(对PC-3细胞，N/P＝7.5转染条件最优)，分别应用PEI、YC25-PEI(3∶1)、YC25-PEI(5∶1)进行转染。转染后36h后细胞裂解产物定量分析β-gal表达。结果：FGFR(-)的PC-3细胞，bFGF寡肽YC25-PEI/pcDNA3.1βDNA转染后经细胞裂解产物β-gal定量分析，显示偶联YC-25寡肽的PEI没有增加转染效率，反而降低了转染效率(p＜0.05)(参见图5)。
实施例八 YC25-PEI/pcDNA3.1(-)B-IL-18体外转染试验
分别接种Hela细胞、PC-3细胞于6孔板，每孔5×105细胞。培养24h后，待细胞60～80％汇合时转染。每孔转染4μg pcDNA3.1(-)B-IL-18质粒，每μg质粒稀释在50μl 0.9％NaCl溶液中。按PEI/DNA N/P＝7.5，分别加入PEI、YC25-PEI(3∶1)、YC25-PEI(5∶1)于质粒溶液中，后立即短暂涡旋30s，室温静置15～30min。吸去多孔板细胞上的培养液，每孔加入1ml无血清DMEM。将PEI/DNA混合物加到细胞上，水平摇床上缓慢摇动10～30min，然后放入CO2培养箱。培养6～10h后，吸去转染液，每孔加入1ml含15％血清的培养液。转染pcDNA3.1(-)B-IL-18的细胞培养24小时后收集上清储存于-20℃用于IL-18的测定。用人IL-18ELISA试剂盒定量细胞上清中的IL-18，发现与自由PEI相比，YC25-PEI可增强对Hela细胞的IL-18质粒的转染效率，上清中IL-18水平高于PEI转染组(p＜0.05)，而对PC-3细胞则无明显的增强效应(参见图6)。
实施例九 YC25-PEI/pCSK-α-IFN体外转染试验
将Hela细胞接种在24孔板，每孔5×104细胞。待细胞密度60％～70％左右转染编码α-干扰素的pSCK-α-IFN表达质粒，每孔2μg pSCK-α-IFN表达质粒。分别利用PEI、bFGF寡肽YC25-PEI(5∶1)转染，设PEI/DNA N/P＝7.5。细胞每孔加1ml无血清DMEM，然后将制备的转染复合物加入，培养8h后吸去旧培养液，每孔加入1ml 10％FCS的DMEM，继续培养。转染后36h，吸取细胞上清，应用人α-IFN血清样本ELISA定量检测试剂盒定量细胞上清α-IFN水平(pg/ml)。结果：对于FGFR(+)的Hela细胞，α-IFN表达水平，YC25-PEI(5∶1)组＞PEI组(p＜0.05)。
实施例十 荷瘤裸鼠体内转基因实验
将Hela细胞株接种于5周龄BALB/C裸鼠腹侧皮下，待瘤直径长至0.4cm后，随机分组，每组6只，分别为NS(生理盐水)组、单纯质粒pcDNA3.1β组、PEI/质粒DNApcDNA3.1β组、YC25-PEI(5∶1)/质粒pcDNA3.1β组。瘤体内注射相当于5μg pcDNA3.1β质粒的转染复合物100μl，PEI/DNAN/P＝7.5。第二天重复注射一次。注射后48h，牺牲裸鼠，取皮下肿瘤，用PBS漂洗2次，加入新鲜配制的固定液(2％多聚甲醛+0.25％戊二醛PBS溶液)4℃固定20min。PBS漂洗15min×3次。用OCT(Miles)包埋液包埋组织，放在冷冻切片机内冷冻。冷冻切片。将切片固定在APES包被的载玻片上，风干。在4℃4％甲醛中作用10min，使切片固定在载玻片上。将载玻片在PBS漂洗10min×2次。将载玻片在X-gal反应缓冲液中37℃染色1～24h。用PBS漂洗载玻片10min×3次。镜下观察结果，发现YC25-PEI/pcDNA3.1β组瘤体组织内β-gal可有效表达，组织蓝染，明显高于其他对照组。
将HepG2细胞株接种于裸鼠皮下，建立肿瘤模型，瘤块长至直径约0.5cm时，瘤体内注射携带pCSK-α-IFN质粒的YC25-PEI载体复合物进行基因治疗，每周二次共四次，观察肿瘤大小。与NS组，单纯质粒pCSK-α-IFN组、PEI/质粒pCSK-α-IFN组比较，YC25-PEI(5∶1)/pCSK-α-IFN组肿瘤生长明显受抑，接种后第24天时，与NS组比较，YC25-PEI(5∶1)/pCSK-α-IFN组肿瘤抑制率达51％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及的参考文献：
1.Kataoka K.Gene delivery systems：viral vs.non-viral vectors.AdvancedDrug Delivery Reviews，2001；52(151)：1
2.Moscatelli D.High and low affinity binding sites for basic fibroblast growthfactor on cultured cells：absence of a role for low affinity binding in thestimulation of plasminogen activator production by bovine capillary endothelialcells.J Cell Physiol，1987；131(1)：123
3.Chandler LA，Sosnowski BA，Greenlees L，Aukerman SL，Baird A，PierceGF.Prevalent expression of fibroblast growth factor(FGF)receptors and FGF2in human tumor cell lines.Int J Cancer.1999，81(3)：451
4.Blessing T，Kursa M，Holzhauser R，Kircheis R，Wagner E.Differentstrategies for formation of pegylated EGF-conjugated PEI/DNA complexes fortargeted gene delivery.Bioconjug Chem，2001；12(4)：529
5.Hildebrandt IJ，Iyer M，Wagner E，Gambhir SS.Optical imaging oftransferrin targeted PEI/DNA complexes in living subjects.Gene Ther，2003；10(9)：758
6.Kursa M，Walker GF，Roessler V，Ogris M，Roedl W，Kircheis R，Wagner E.Novel shielded transferrin-polyethylene glycol-polyethylenimine/DNAcomplexes for systemic tumor-targeted gene tramsfer.Bioconjug Chem，2003；14(1)：222
7.Rudolph C，Schillinger U，Plank C，Gessner A，Nicklaus P，Muller R，Rosenecker J.Nonviral gene delivery to the lung with copolymer-protected andtransferrin-modified polyethylenimine.Biochim Biophys Acta，2002；1573(1)：75
8.O′Neill MM，Kennedy CA，Barton RW，Tatake RJ.Receptor-mediated genedelivery to human peripheral blood mononuclear cells using anti-CD3 antibodycoupled to polyethylenimine.Gene Ther，200l；8(5)：362
9.Merdan T，Callahan J，Petersen H，Kunath K，Bakowsky U，Kopeckova P，Kissel T，Kopecek J.Pegylated polyethylenimine-fab′antibody fragrnentconjugates for targeted gene delivery to human ovarian carcinoma cells.Bioconjug Chem，2003；14(5)：989
10.Lemus R，Lukinskeine L，Bier ME，Wisnewski AV，Redlich CA，Karol MH.Development of immunoassays for biomonitoring of hexamethylene diisocyanateexposure.Environ Health Perspect.2001；109(11)：1103
Claims (5)
1.靶向于成纤维细胞生长因子受体的聚乙烯亚胺转基因载体，由寡肽、多聚乙烯亚胺和外源质粒DNA组成，其特征是：由碱性成纤维细胞生长因子的受体结合区寡肽YC25靶向，以多聚乙烯亚胺为骨架和外源质粒DNA组成的非病毒载体复合物系统，其中所述的寡肽YC25的氨基酸序列为YRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKC。
2.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺转基因载体，其特征是：含有的寡肽YC25可与细胞表面的成纤维细胞生长因子受体特异结合。
3.如权利要求1或2所述的聚乙烯亚胺转基因载体，其特征是：每个寡肽末端含有一个半胱氨酸，包含自由的巯基，用于被交联剂活化的聚乙烯亚胺偶联。
4.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺转基因载体，其特征是：包含的外源质粒DNA，是各种含报告基因、细胞因子基因、抗癌基因的真核重组表达质粒。
5.权利要求1-4任一项所述的聚乙烯亚胺转基因载体在制备治疗肿瘤的基因药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100681767A CN1295338C (zh) | 2004-11-10 | 2004-11-10 | 靶向于成纤维细胞生长因子受体的聚乙烯亚胺转基因载体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100681767A CN1295338C (zh) | 2004-11-10 | 2004-11-10 | 靶向于成纤维细胞生长因子受体的聚乙烯亚胺转基因载体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1614027A CN1614027A (zh) | 2005-05-11 |
| CN1295338C true CN1295338C (zh) | 2007-01-17 |
Family
ID=34765155
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004100681767A Expired - Fee Related CN1295338C (zh) | 2004-11-10 | 2004-11-10 | 靶向于成纤维细胞生长因子受体的聚乙烯亚胺转基因载体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1295338C (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100352929C (zh) * | 2005-07-22 | 2007-12-05 | 浙江大学 | 双靶向于成纤维细胞生长因子受体和整合素的转基因载体 |
| CN101721715B (zh) * | 2009-12-15 | 2012-01-11 | 武汉大学 | 肿瘤靶向性非病毒基因载体与质粒dna的复合物及其制备方法 |
| CN105802975B (zh) * | 2014-12-31 | 2020-04-14 | 浙江大学 | 靶向her2阳性肿瘤的细胞制备物及其用途 |
| CN112430330B (zh) * | 2017-07-12 | 2022-10-28 | 郑州大学 | Pda-pei修饰物、含其的抗食管癌药及其制备 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1479632A (zh) * | 2000-10-09 | 2004-03-03 | 拜尔公司 | 用于将核酸导入细胞的复合物 |
| WO2004087931A1 (en) * | 2003-04-03 | 2004-10-14 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Conjugate for gene transfer comprising oligonucleotide and hydrophilic polymer, polyelectrolyte complex micelles formed from the conjugate, and methods for preparation thereof |
-
2004
- 2004-11-10 CN CNB2004100681767A patent/CN1295338C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1479632A (zh) * | 2000-10-09 | 2004-03-03 | 拜尔公司 | 用于将核酸导入细胞的复合物 |
| WO2004087931A1 (en) * | 2003-04-03 | 2004-10-14 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Conjugate for gene transfer comprising oligonucleotide and hydrophilic polymer, polyelectrolyte complex micelles formed from the conjugate, and methods for preparation thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1614027A (zh) | 2005-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101094652B (zh) | 基因递送用生物可降解交联阳离子多嵌段共聚物及其制备方法 | |
| Suk et al. | Gene delivery to differentiated neurotypic cells with RGD and HIV Tat peptide functionalized polymeric nanoparticles | |
| CN101415444A (zh) | 生物可降解的阳离子聚合物 | |
| Morys et al. | EGFR targeting and shielding of pDNA lipopolyplexes via bivalent attachment of a sequence‐defined PEG agent | |
| CN102397554B (zh) | 一种肿瘤靶向双载药递释系统及其制备方法 | |
| CN106632682A (zh) | 融合蛋白ifn-elp及其应用 | |
| CN101302532B (zh) | 一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统及制法和应用 | |
| CN106890343A (zh) | 一种靶向型多肽纳米基因载体复合物 | |
| CN109963597A (zh) | 聚乙二醇化血管内皮抑制素类似物及其应用 | |
| CN107129522A (zh) | 一种硫辛酸修饰的固有无序蛋白纳米载体及其制备方法和应用 | |
| US20190117572A1 (en) | Microfluidic-formulated leukosome compositions and fabrication methods therefor | |
| Hatefi et al. | Perspectives in vector development for systemic cancer gene therapy | |
| CN1295338C (zh) | 靶向于成纤维细胞生长因子受体的聚乙烯亚胺转基因载体 | |
| CN107550864A (zh) | Eppt多肽‑聚乙二醇‑磷脂复合膜材料、其制备方法及主动靶向脂质体递药系统和应用 | |
| CN100352929C (zh) | 双靶向于成纤维细胞生长因子受体和整合素的转基因载体 | |
| CN109876155A (zh) | 一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统 | |
| CN112121180B (zh) | 泊洛沙姆和或泊洛沙胺与peg脂质组合的复合物纳米粒 | |
| CN106086079A (zh) | 多重靶向修饰的载基因复合物及制备方法及应用 | |
| MXPA01012802A (es) | Copolimeros para el transporte de acidos nucleicos a las celulas. | |
| CN107226844A (zh) | 增强整合素受体亲和力及靶细胞摄取能力的结构分子及其应用 | |
| CN114452266A (zh) | 一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统及其制备方法和应用 | |
| Rao et al. | Evaluation of the transfection property of a peptide ligand for the fibroblast growth factor receptor as part of PEGylated polyethylenimine polyplex | |
| CN104368009B (zh) | 一种双功能肽修饰的阿尔茨海默病靶向基因递释复合物及其制备方法 | |
| CN110101868B (zh) | 一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用 | |
| JP3938954B2 (ja) | 新規なグラフト共重合体、それを用いた薬剤、及びそれを用いて薬物を特定細胞に取り込ませる方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070117 Termination date: 20161110 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |