CN101415444A - 生物可降解的阳离子聚合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及聚合物，其包含分子量小于600道尔顿的聚乙烯亚胺、生物可降解的基团和相对疏水的基团，用于向细胞递送生物活性剂。

Description

生物可降解的阳离子聚合物
相关申请的参考
本申请要求于2006年4月6日提交的第60/789,842号美国临时申请的优先权，其整体引入本文作为参考，包括所有附图。此外，本申请与于2005年8月31日提交的第11/216,986号美国专利申请相关，其整体引入本文作为参考，包括所有附图。
发明背景
发明领域
本发明涉及向细胞递送生物活性剂的组合物和方法。特别地，本发明涉及包含聚或寡乙烯亚胺(PEI)、生物可降解的基团和相对疏水的基团的阳离子脂质聚合物，以及制备和使用这样的脂质聚合物递送诸如siRNA和反义寡核苷酸的寡核苷酸的方法。
相关领域的描述
许多技术可以用于向细胞递送诸如质粒DNA的生物活性剂，包括使用病毒转染系统和非病毒转染系统。病毒系统的转染效率通常比非病毒系统高，但是病毒系统已经出现安全性方面的问题。见Verma I.M and Somia N.，Nature 389(1997)，pp.239-242；Marhsall E.Science286(2000)，pp.2244-2245。此外，病毒载体的制备方法往往复杂而且成本高。尽管非病毒转染系统的效率通常比病毒系统低，但由于其通常被认为比病毒系统更安全且更容易制备而备受关注。
许多非病毒转染系统涉及与质粒DNA配合的阳离子聚合物的使用。已被用作基因载体的阳离子聚合物的实例包括多聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖、PAMAM树状聚体和聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯(pDMAEMA)。不幸的是，PLL的转染效率很低，并且高分子量的PLL已显示出明显的细胞毒性。在某些情况下，分子量在20,000至25,000道尔顿之间的PEI显示出较好的基因转移效率，而无需内吞体溶解剂或靶向剂。见Boussif O.，Lezoualc′h F.，Zanta M.A.，Mergny M.D.，Scherman D.，Demeneix B.，Behr J.P.，Proc Natl AcadSci USA.Aug.1，1995，92(16)7297-301。但是分子量在400至2000道尔顿的PEI对质粒DNA的递送无效。一系列聚酰胺-胺型树状聚体被作为基因递送系统进行了研究。见Eichman J.D.，Bielinska A.U.，Kukowska-Latallo J.F，Baker J.R.Jr.，Pharm.Sci.Technol.Today 2000July；3(7)：232-245。不幸的是，据报道，PEI和树状聚体都具有细胞毒性，从而限制了将PEI用作基因递送系统用于人类患者的可能。此外，具有商业上实用的基因转染效率的聚酰胺-胺型树状聚体的成本较高。
据报道，诸如质粒DNA的基因，用可降解的阳离子聚合物制备的载体以减弱的细胞毒性将基因递送至哺乳动物细胞内。见Lim Y.B.，Kim S.M.，Lee Y.，Lee W.K.，Yang T.G.，Lee M.J.，Suh H.，Park J.S.，J.Am.Chem.Soc，123(10)，2460-2461，2001。不幸的是，与非可降解聚合物相比，这些可降解的系统同样显示出较低的质粒DNA转移效率。为了提高低分子量PEI的转染效率，Gosselin等人报道可以通过使用带有低分子量PEI的含二硫键的连接体获得较高分子量的PEI。见Gosselin，Micheal A.，Guo，Menjin，and Lee，Robert J.BioconjugateChem.2001.12：232-245。用二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(DSP)和3，3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐(DTBP)制得的PEI聚合物显示出相当的基因转染效率和较低的细胞毒性。但是，含二硫键的连接体成本较高，这使得该系统的大规模制备比较困难且不受欢迎。具有含二硫键的连接体的聚合物只在还原条件下降解，这也限制了该聚合物在其它条件下的应用。
Lynn等人描述了使用二丙烯酸酯作为阳离子化合物之间的连接体分子合成生物可降解的阳离子聚合物的方法。见Lynn，David A.；Anderson，Daniel G.；Putnam，David；and Langer，Robert.J.Am.Chem.Soc.2001，123，8155-8156。但是，这些聚合物的合成需要数天来完成，而且能够用于基因递送的有效产物的量低。根据Lynn等人的方法制得一百多种阳离子聚合物，但这些聚合物中只有两种显示出有效的基因转染效率。诸如PEI的阳离子聚合物对siRNA尚未显示有效的递送。根据Lynn等人的方法制得的生物可降解的阳离子聚合物尚未用于递送siRNA或寡核苷酸。
因此，仍然需要可以安全有效地促进siRNA和寡核苷酸向细胞的递送的阳离子聚合物。
发明概述
本发明人已经发现若干能够向细胞递送寡核苷酸的聚合物组合物。在某些实施方案中，该聚合物还能够与其它部分如递送增强剂和/或诊断成像化合物配合。此外，本发明人已经发现使用该聚合物组合物向细胞递送寡核苷酸的方法。
本文公开的一实施方案包括包含选自式(I)的重复单元的聚合物：
Figure A200780012256D00081
其中PEI能够是分子量小于600道尔顿的聚乙烯亚胺重复单元。R能够选自电子对、氢、C2-C10烷基、C2-C10杂烷基、C5-C30芳基和C2-C30杂芳基，L能够选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C5-C50芳基、C2-C50杂芳基、C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C2-C50羧基烯基和C2-C50羧基杂烯基，m是能够为约1至约30的整数。
在一实施方案中，PEI能够包含选自式(IIa)或式(IIb)的至少一种重复单元：
Figure A200780012256D00082
其中x是约1至约12的整数，y是约1到约6的整数，z是约1至约13的整数。
在某些实施方案中，该聚合物能够是生物可降解的。该聚合物能够通过其降解的适当的机制包括但不限于水解、酶裂解、还原、光裂解和超声波。
在某些实施方案中，L能够选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C2-C50炔基和C2-C50杂炔基。在其它实施方案中，L能够选自C12至C18的脂肪酸、胆固醇和它们的衍生物。
在一实施方案中，该聚合物的重量平均分子量能够为约500道尔顿至约1,000,000道尔顿。在另一实施方案中，该聚合物的重量平均分子量能够为约1,000道尔顿至约200,000道尔顿。
在某些实施方案中，聚合物能够是交联的。
本文公开的另一实施方案包括聚合物，其还能够包含与该聚合物配合的寡核苷酸。适当的寡核苷酸的实例包括但不限于诸如siRNA的RNA低聚体和诸如反义寡核苷酸的DNA低聚体。
除了寡核苷酸，该聚合物还能够包含能够进入真核细胞的递送增强剂。如果需要的话，该聚合物还能够包含能够与该聚合物配合的诊断成像化合物。递送增强剂能够促进真核细胞中的以下一种或多种功能：受体识别、内化、寡核苷酸自细胞内吞体的逃逸、核定位、寡核苷酸释放和系统稳定。示例性寡核苷酸包括但不限于siRNA和反义寡核苷酸。在其它实施方案中，递送增强剂能够与聚合物偶联。
本文公开的一实施方案包括转染真核细胞的方法，其包括使细胞与聚合物接触，从而将寡核苷酸递送至细胞，其中聚合物还能够包含寡核苷酸。
本文公开的另一实施方案包括治疗哺乳动物的方法，其包括鉴定需要基因治疗的哺乳动物，并向哺乳动物给予与寡核苷酸结合的聚合物，其中所述寡核苷酸包含有效地降低或者沉默目的基因的表达的siRNA。
在某些实施方案中，聚合物还能够包含与该聚合物配合的诊断成像化合物。本文公开的一实施方案包括向哺乳动物递送诊断成像化合物的方法，其包括给予哺乳动物聚合物，其中聚合物与诊断成像化合物配合。
本文公开的一实施方案包括包含多种聚合物的聚合物库，其中聚合物的至少两种中选自R、L、PEI或m的至少一种参数是不同的。
本文公开的其它实施方案包括医学诊断系统，其包含聚合物和能够识别真核细胞特异性受体的配体。如果需要的话，聚合物能够与配体偶联。
本文公开的另一实施方案中，药物组合物能够包含敏化剂和聚合物。该敏化剂能够对可见光、紫外光辐射敏感或对两者都敏感。在一实施方案中，药物组合物能够包含敏化剂和聚合物，其中聚合物能够对寡核苷酸具有亲和力。
在一实施方案中，诊断成像组合物能够包含造影剂和聚合物。如果需要的话，诊断成像组合物还能够包含靶向剂。
本文公开的一实施方案包括包含选自式(I)的重复单元的聚合物：
其中PEI是包含至少一种式(IIb)的重复单元的聚乙烯亚胺重复单元：
Figure A200780012256D00102
其中z是约1至约13的整数。R能够选自电子对、氢、C2-C10烷基、C2-C10杂烷基、C5-C30芳基和C2-C30杂芳基。L能够选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C5-C50芳基、C2-C50杂芳基、C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C2-C50羧基烯基和C2-C50羧基杂烯基；以及m是能够为约1至约30的整数。
在一实施方案中，包含至少一种式(IIb)的重复单元的PEI的分子量能够小于600道尔顿。
在某些实施方案中，PEI还包含式IIa的重复单元：
Figure A200780012256D00111
其中x能够是约1至约12的整数，y能够是约1至约6的整数。
在一实施方案中，其中PEI还包含式(IIa)的重复单元的聚合物的分子量能够小于600道尔顿。
附图简述
图1是在用与脂质聚合物(YT-10、YT-11、YT-22、YT-23、YT-24和YT-25)配合的siRNA处理、阳离子脂质体2000(阳性对照)；处理和未经任何处理(阴性对照)之后，HT-1080-EGFP细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的照片。
图2是在用与脂质聚合物(YT-10、YT-11、YT-22、YT-23、YT-24和YT-25)配合的siRNA处理、阳离子脂质体2000(阳性对照)处理和未经任何处理(阴性对照)之后，HeLa-EGFP细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的照片。
优选实施方案的详细描述
一实施方案提供了包含聚乙烯亚胺、生物可降解的基团和相对疏水的“脂质”基团的阳离子脂质聚合物。优选的阳离子脂质聚合物包含选自式(I)的重复单元：
Figure A200780012256D00112
在式(I)中，PEI是聚乙烯亚胺，酯键是生物可降解的基团，L代表相对疏水的“脂质”基团。例如，在某些实施方案中，L选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C5-C50芳基；C2-C50杂芳基；C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C2-C50羧基烯基和C2-C50羧基杂烯基。在优选实施方案中，L选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C2-C50炔基和C2-C50杂炔基。在更优选的实施方案中，L选自C12至C18的脂肪酸、胆固醇和它们的衍生物。
式(I)中的R可以代表电子对或氢原子。本领域技术人员理解，当R代表电子对时，式(I)的重复单元是低pH下的阳离子。式(1)中的R还可以代表相对疏水的脂质基团，如C2-C10烷基、C2-C10杂烷基、C5-C30芳基或C2-C30杂芳基，在这种情况下应当理解氮原子带阳离子电荷，通常在宽pH范围内稳定。
PEI能够含有式(IIa)和/或(IIb)的至少一种重复单元，其中x是约1至约12的整数，y是约1至约6的整数，z是约1至约13的整数。
应当理解，本文所用的“式II”是指分别包含式(IIb)和(IIa)或它们的组合的PEI。
包含式(I)的重复单元的阳离子脂质聚合物可以通过使式(III)的二丙烯酸酯单体与聚乙烯亚胺(PEI)反应来制备，如下面的示意图A所示：
示意图A
Figure A200780012256D00122
在式(III)中，R和L的含义与上述包含式(I)的重复单元的阳离子脂质聚合物中R和L的含义相同。示意图A示出包含式(I)的重复单元的聚合物的制备。
示意图A中的反应可以如下进行，通过搅拌使PEI与二丙烯酸酯(III)在诸如乙醇的互溶剂中混合，优选在室温下混合数小时，然后使溶剂蒸发以回收所得聚合物。本发明不受理论约束，但是本发明人相信PEI与二丙烯酸酯(III)之间的反应涉及PEI的一个或多个胺与二丙烯酸酯的双键之间的迈克尔反应。见J.March，Advanced OrganicChemistry(高等有机化学)3rd Ed.，pp.711-712(1985)。示意图A所示的二丙烯酸酯可以通过下述实施例所示例的方式制备。
根据示意图A，通过改变PEI的分子量和结构、二丙烯酸酯(III)上R和L基团的尺寸和类型以及二丙烯酸酯(III)与PEI的比例制得各种包含式(I)的聚合物。可以使用不同二丙烯酸酯的混合物和/或不同PEI的混合物。PEI可以是多功能的，从而能够与两种或多种二丙烯酸酯反应。可以使用交联剂以制备交联阳离子脂质聚合物和/或可以调整多功能PEI与二丙烯酸酯(III)的相对比例以制备交联阳离子脂质聚合物。PEI的分子量优选小于600道尔顿。PEI与二丙烯酸酯的摩尔比优选为约1∶0.5至约1∶20。阳离子脂质聚合物的重量平均分子量可以为约500道尔顿至约1,000,000道尔顿，优选约1,000道尔顿至约200,000道尔顿。分子量可以使用PEG标准品通过尺寸排阻色谱测定，或通过琼脂糖凝胶电泳测定。在一实施方案中，通过制备多种阳离子脂质聚合物提供了聚合物库，其中至少两种聚合物中的R、L、PEI和/或m是不同的。
阳离子脂质聚合物优选可降解，更优选生物可降解，例如可通过选自水解、酶裂解、还原、光裂解或超声波的机制降解。本发明不受理论约束，但是本发明人相信式(I)的阳离子脂质聚合物在细胞内是通过酶性裂解和/或水解酯键进行降解的。
阳离子脂质聚合物可以与寡核苷酸形成配合物，从而可以用作向细胞递送寡核苷酸的载体。例如，通过向哺乳动物给予与诸如siRNA的寡核苷酸配合的该聚合物，能够将该聚合物用于治疗需要基因治疗的哺乳动物，所述siRNA有效降低或沉默目的基因的表达。包含与该聚合物配合的寡核苷酸的阳离子脂质聚合物可以通过使该阳离子脂质聚合物与寡核苷酸在互溶剂中混合形成，更优选通过下面的实施例所描述的方法。
包含与聚合物偶联的寡核苷酸的阳离子脂质聚合物还可以包含能够进入真核细胞的递送增强剂。递送增强剂可以溶解或与配合物混合，或与阳离子脂质聚合物偶联(如共价键结合或配合)。递送增强剂是促进寡核苷酸向细胞内转运的物质，通常通过促进寡核苷酸/载体配合物穿过细胞膜、减少输送过程中的降解和/或促进寡核苷酸自载体的释放来实现。诸如siRNA的寡核苷酸向细胞内的转运优选涉及寡核苷酸/载体配合物已经穿过细胞膜、内吞体膜和细胞核膜后寡核苷酸自载体的释放。例如，以siRNA为例，siRNA/载体配合物首先穿过细胞膜。当这通过细胞内吞作用完成时，siRNA/载体配合物被内化。载体与siRNA-货物(cargo)一起通过形成口袋被细胞膜包裹，口袋随后被修剪。结果得到细胞内吞体，其为包含siRNA货物与载体的大型膜结合结构。然后，siRNA-载体配合物逃逸通过内吞体膜进入细胞质，避免细胞质中的酶降解，然后穿过细胞核膜。一进入细胞核，siRNA货物便与载体分离。
通常，递送增强剂包括两类：病毒载体系统和非病毒载体系统。因为人类病毒已经进化至可以克服上述进入细胞核的屏障，病毒或病毒成分可以用于向细胞转运核酸。可以用作递送增强剂的病毒成分的实例是血凝素肽(HA-肽)。这种病毒肽通过破坏细胞内吞体促进生物分子向细胞内的转运。在内吞体的酸性pH下，这种蛋白引起生物分子和载体向细胞溶质的释放。可以用作递送增强剂的病毒成分的其它实例是本技术领域人员所熟知的。
非病毒递送增强剂通常或者基于聚合物，或者基于脂质。它们通常是起平衡核酸负电荷作用的聚阳离子。聚阳离子聚合物已经显示出很好的作为非病毒基因递送增强剂的前景，这部分归因于它们压缩极大尺寸的DNA质粒的能力和相对于病毒载体的安全性考虑。实例包括具有富含于诸如寡赖氨酸、寡精氨酸或它们的组合的碱性氨基酸的区域的肽和PEI。本发明人相信，这些聚阳离子聚合物通过压缩DNA来促进转运。诸如PEI和星射状大分子的支链聚阳离子能够调节压缩DNA和内吞体释放。见Boussif，et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.92：7297-7301。PEI能够被制备成具有可在pH 6.9时电离的末端胺和可在pH 3.9时电离的内部胺的高度分支聚合物。由于这种组织，PEI能够在导致载体膨胀的pH下发生变化，最并终从内吞体俘获中释放。
增强递送的另一种方式是阳离子脂质聚合物包含被细胞上的受体识别的配体，所述细胞已经是寡核苷酸货物递送的靶标。然后可以通过受体识别启动寡核苷酸向细胞内的递送。本文中，术语“配体”是指能够与特异性受体蛋白结合的生物分子，所述特异性受体蛋白位于靶细胞表面或其细胞核或细胞溶质中。在一实施方案中，配体可以是抗体、激素、信息素或神经递质，或能够与配体具有同样作用、与受体结合的任何生物分子。在优选实施方案中，配体是寡核苷酸。抗体是指B淋巴细胞应答抗原所产生的任何蛋白。当配体与具体的细胞受体结合时，刺激了细胞内吞作用。已用于各种细胞类型以增强寡核苷酸转运的配体的实例有半乳糖、铁传递蛋白、糖蛋白脱唾液酸血清类粘蛋白、腺病毒纤维、疟疾环子孢子蛋白、表皮生长因子、人类乳头瘤病毒衣壳、成纤维细胞生长因子和叶酸。对于叶酸受体，所结合的配体通过一种被称为胞吮的方法内化，其中受体与配体结合，周围的膜从细胞表面堵塞，然后内化物质穿过液泡膜进入细胞质。见Gottschalk，et al.(1994)Gene Ther 1：185-191。在一实施方案中，式(I)和识别真核细胞特异性受体的配体的聚合物能够被用作医学诊断系统。
本发明人相信，各种递送增强剂通过破坏内吞体发挥作用。例如，除上述HA-蛋白外，缺陷病毒颗粒也已经被用作内吞体细胞溶解剂。见Cotten，et al.(July1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.89：pages6094-6098。非病毒系统通常或者是两性的，或者基于脂质。
可以通过调节内吞体破坏、减少降解或完全绕过该过程的试剂来增强诸如siRNA的寡核苷酸向细胞的细胞质内的释放。升高内吞体pH的氯喹已被用于通过抑制溶酶体水解酶来减少内吞物质的降解。见Wagner，et al.(1990)Proc Natl Acad Sci USA vol.87：3410-3414。如以上所讨论的那样，诸如PEI和星射状大分子的支链聚阳离子也促进内吞体的释放。
内吞体的降解可以通过引入毒素亚基避免，如作为嵌合蛋白的成分的白喉毒素和绿脓杆菌外毒素，所述嵌合蛋白可以被引入阳离子脂质聚合物/生物分子配合物。见Uherek，et al.(1998)J Biol.Chem.vol.273：8835-8841。这些成分促进核酸通过内吞体膜和穿过内质网返回的穿梭。
一旦进入细胞质，寡核苷酸货物向细胞核的转运可以通过引入寡核苷酸载体上的核定位信号来增强。例如，可以使用起核定位信号(NLS)作用的特异性氨基酸序列。本发明人相信，寡核苷酸/载体配合物上的NLS与位于细胞溶质中的特异性核转运受体蛋白相互作用。一旦寡核苷酸/载体配合物被组装，配合物中的受体蛋白被认为与核孔蛋白进行多种接触，从而转运配合物通过细胞核孔。当寡核苷酸/载体配合物到达目的地后，其分裂，释放出货物和其它成分。来自SV40大T-抗原的序列Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val(SEQ ID NO.：1)可以用于向细胞核内的转运。本发明人相信，这种来自SV40大T-抗原的短序列可以提供引起相关大分子向细胞核转运的信号。
阳离子脂质聚合物还可以包含诊断成像化合物，如与聚合物配合的荧光性、放射性或不透射线的染料。该聚合物可以通过使阳离子脂质聚合物与诊断成像化合物在互溶剂中混合形成。然后能够将该聚合物(与诊断成像化合物配合)给予哺乳动物，并用众所周知的技术如PET、MRI、CT、SPECT等追踪(见Molecular Imaging of Gene Expressionand Protein Function In Vivo With PET and SPECT(在体内用PET和SPECT进行基因表达和蛋白功能的分子成像)，Vijay Sharma，PhD，Gary D.Luker，MD，and David Piwnica-Worms，MD，Ph.D.，JOURNALOF MAGNETIC RESONANCE IMAGING 16：336-351(2002))。诊断成像组合物还能够通过将式(I)的聚合物与造影剂(如1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)-Gd(III)和二乙三胺五乙酸(DTPA)-GD(III))组合制得。如果需要的话，诊断成像组合物还能够包含靶向剂。适当的靶向剂包括但不限于RGD肽和半乳糖基团。
另一实施方案提供了药物组合物，其包含敏化剂和聚合物，其中聚合物包含式(I)的重复单元和寡核苷酸，并且还可以包含能够进入真核细胞的递送增强剂和/或与该聚合物配合的诊断成像化合物。敏化剂可以是在接受光照(如可见和/或紫外光辐射)或其它刺激时发生性质改变从而促进生物分子的递送(如通过增加聚合物的降解速率)的化合物。敏化剂本身可以是接受刺激时活性发生改变的生物分子。敏化剂可以是光活化药物。合适的光活化药物包括但不限于荧光素、部花青、夹氧杂蒽及其衍生物和光敏吡咯衍生大环化合物及其衍生物。合适的光敏吡咯衍生大环化合物包括但不限于天然产生或合成的卟啉、天然产生或合成的卟吩、天然产生或合成的细菌卟吩、合成的异菌卟吩、酞菁、萘酞菁和扩展的基于吡咯的大环系统，如porphycene、sapphyrin和德卟啉(texaphyrin)。
实施例
实施例1
Figure A200780012256D00171
0℃下将乙二酰氯(13.5mL，152mmol)加至油酸1(10.7g，38mmol)的二氯甲烷(DCM，200mmol)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF，三滴)溶液中。搅拌反应混合物约1小时，然后使之升温至室温。1小时后，将溶液用甲苯稀释并蒸馏。残留物用二氯甲烷(200mL)溶解并冷却至0℃。将二乙醇胺(10.9mL，114mmol)、4-(二甲基氨基)吡啶(490mg，4mmol)和三乙胺(21mL，152mmol)加至溶液中。0℃下搅拌溶液30分钟，然后在室温下放置过夜。用二氯甲烷稀释反应混合物，并用1NHCl和NaHCO3水溶液洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)并减压浓缩。然后用硅胶柱(10∶1乙酸乙酯：甲醇)纯化粗品，制得13.5g(99.9％)化合物2，其为无色油状物。
实施例2
Figure A200780012256D00181
室温下将三乙胺(8.1g，80mmol)、DMAP(0.5g，4mmol)和2(7.1g，20mmol)用200mL二氯甲烷溶解。用氩冲洗系统，并用冰浴使溶液冷却。逐滴加入25mL的丙烯酰氯(5.4g，60mmol)二氯甲烷溶液。加完后，使反应物升温至室温并搅拌过夜。用二氯甲烷稀释反应混合物，并用水和NaHCO3水溶液洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)并减压浓缩。然后用硅胶柱(1∶3乙酸乙酯：正己烷)纯化粗品，制得7.5g(81％)化合物3(分子量463.65)，其为无色油状物。
实施例3
阳离子脂质聚合物的合成根据示意图A通过使分子量232道尔顿的五亚乙基六胺(PEHA)与化合物3发生反应进行，过程如下：称量约0.1mmol(23mg)的PEHA(Sigma-Aldrich)和约0.2mmol(93mg)的化合物3，并置于小瓶中，加入1mL乙醇并迅速溶解。室温下搅拌反应混合物3小时。然后加入5mL2M HCl乙醚溶液中和反应混合物。通过离心收集白色沉淀YT-10，用乙醚洗涤两次，室温下减压干燥。
这是通用方法，可以作为类似化合物的合成方法模型，并可以用来合成一系列可降解的阳离子脂质聚合物。除了约0.3mmol(139mg)的化合物3用于反应外，聚合物YT-11以类似的方式制备。同样，其它类型的PEI以与YT-10或YT-11类似的方式被用于合成脂质聚合物。表1列出了实例3中合成的所有脂质聚合物。YT-26聚合后变成了硬凝胶，并且没有被中和。
表1
 
脂质聚合物名称   PEI类型 PEI分子量  PEI的量 化合物3的量
YT-26 聚乙烯亚胺600(PEI600) 600 0.1mmol(60mg) 0.8mmol(371mg)
YT-10 五亚乙基六胺(PEHA) 232 0.1mmol(23mg) 0.2mmol(93mg)
YT-11 五亚乙基六胺(PEHA) 232 0.1mmol(23mg) 0.3mmol(139mg)
YT-22 四亚乙基五胺(TEPA) 189 0.1mmol(18.9mg) 0.2mmol(93mg)
YT-23 三亚乙基四胺(TETA) 146 0.1mmol(14.6mg) 0.2mmol(93mg)
YT-24 二亚乙基三胺(DETA) 103 0.1mmol(10.3mg) 0.1mmol(46mg)
YT-25 乙二胺(EDA) 60 0.1mmol(6.0mg) 0.1mmol(46mg)
实施例4
EGFP稳定细胞系：HT-1080-EGFP和HeLa-EGFP稳定细胞系分别为源于具有稳定的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达的HT-1080和HeLa细胞，通过将pEGFP-N1质粒DNA(BD Biosciences Clontech)转染至HT-1080和HeLa细胞来制备。使用pEGFP-N1质粒具有的新霉素抗性能力选择和克隆转染细胞。37℃、5％CO2条件下将细胞培养物维持于含有10％牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)中。EGFP表达能够在荧光显微镜(Olympus)下观察。HT-1080-EGFP和HeLa-EGFP细胞在蓝色激发光和绿光过滤装置下都显示出亮绿色荧光。
实施例5
siRNA递送研究：siRNA靶向的EGFP基因由Dharmacon ResearchInc.合成。siRNA靶向的EGFP和荧光素酶基因是21bp的双链RNA，它们的正义链序列是NNC GAG AAG CGC GAU CAC AUG(SEQ IDNO.：2)。
转染前24小时，将1.5×104HT-1080-EGFP和HeLa-EGFP细胞移植入96孔板的每一孔中。对于每一孔，将含有1.5μg脂质聚合物的7.5μL等份溶液加入含有15pmol siRNA的7.5μL DNA溶液中，并混合完全。室温下，将DNA和脂质聚合物混合物孵育15分钟以形成siRNA-脂质聚合物配合物。将配合物加至每一孔中，将细胞在37℃、5％CO2条件下孵育48小时。用阳离子脂质体作阳性对照。通过GFP信号分析测定siRNA递送效率。
图1是在用与脂质聚合物(YT-10、YT-11、YT-22、YT-23、YT-24和YT-25)配合的siRNA处理、阳离子脂质体2000(阳性对照)处理和未经任何处理(阴性对照)之后，HT-1080-EGFP细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的照片。
图2是在用与脂质聚合物(YT-10、YT-11、YT-22、YT-23、YT-24和YT-25)配合的siRNA处理、阳离子脂质体2000(阳性对照)处理和未经任何处理(阴性对照)之后，HeLa-EGFP细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的照片。
如图1和图2所示，强荧光表明，对沉默靶向siRNA不做任何处理时，EGFP表达未受抑制。见图1和图2的不处理部分。弱荧光表明，用脂质聚合物载体处理沉默靶向siRNA时，EGFP表达受到抑制。见图1和图2的YT-10、YT-11，YT-22、YT-23、YT-24、YT-25和阳离子脂质体2000部分。在HT-1080-EGFP细胞中，YT-10、YT-11、YT-22和YT-23显示出对EGFP表达的显著抑制作用。YT-24和YT-25也显示出有效的siRNA递送。另外，YT-11显示出递送siRNA的能力。这些结果表明与商用阳离子脂质体2000相比，该脂质聚合物是更好或相当的siRNA递送剂。
尽管本发明已经参照实施方案和实施例进行了描述，本技术领域人员应当理解，可以对上述组合物和方法作出各种删节、添加和修饰而不偏离本发明的范围，并且所有这样的修饰和改变都被视为落入本发明的范围之内。因此，本发明仅受下列权利要求的限制。
序列表
<110>田中 康进
     赵刚
     俞磊
<120>生物可降解的阳离子聚合物
<130>NDTCO.056VPC
<150>60/789,842
<151>2006-04-06
<160>2
<170>FastSEQ for windows Version 4.0
<210>1
<211>7
<212>PRT
<213>猿病毒40
<400>1
Figure A200780012256Q00211
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成制备的核糖核酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>1，2
<223>n＝A，U，C或G
<400>2
Figure A200780012256Q00212

Claims (23)

1.聚合物，其包含选自式(I)的重复单元：
Figure A200780012256C00021
其中：
PEI是分子量低于600道尔顿的聚乙烯亚胺重复单元；
R 选自电子对、氢、C2-C10烷基、C2-C10杂烷基、C5-C30芳基和C2-C30杂芳基；
L选自选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C5-C50芳基、C2-C50杂芳基、C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C2-C50羧基烯基和C2-C50羧基杂烯基；以及
m是约1至约30的整数。
2.如权利要求1所述的聚合物，其中PEI包含选自式(IIa)或式(IIb)的至少一种重复单元：
Figure A200780012256C00022
Figure A200780012256C00023
其中x是约1至约12的整数，y是约1至约6的整数，z是约1至约13的整数。
3.如权利要求1至2中任一权利要求所述的聚合物，所述聚合物是生物可降解的。
4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的聚合物，所述聚合物可以通过选自水解、酶裂解、还原、光裂解和超声波的机制降解。
5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的聚合物，其中L选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C2-C50炔基和C2-C50杂炔基。
6.如权利要求1至4中任一权利要求所述的聚合物，其中L选自C12至C18的脂肪酸、胆固醇和它们的衍生物。
7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的聚合物，其重量平均分子量为约500道尔顿至约1,000,000道尔顿。
8.如权利要求1至6中任一权利要求所述的聚合物，其重量平均分子量为约1,000道尔顿至约200,000道尔顿。
9.如权利要求1至8中任一权利要求所述的聚合物，其是交联的。
10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的聚合物，其还包含与所述聚合物配合的寡核苷酸。
11.如权利要求10所述的聚合物，其中所述寡核苷酸选自RNA低聚体和DNA低聚体。
12.如权利要求10所述的聚合物，其中所述寡核苷酸是siRNA或反义寡核苷酸。
13.如权利要求1至12中任一权利要求所述的聚合物，其还包含能够进入真核细胞的递送增强剂。
14.如权利要求1至13中任一权利要求所述的聚合物，其还包含与所述聚合物配合的诊断成像化合物。
15.如权利要求13至14中任一权利要求所述的聚合物，其中所述递送增强剂促进真核细胞中的一种或多种功能，所述功能选自受体识别、内化、所述寡核苷酸自细胞内吞体的逃逸、核定位、寡核苷酸释放或系统稳定。
16.如权利要求15所述的聚合物，其中所述寡核苷酸选自siRNA和反义寡核苷酸。
17.如权利要求13至16中任一权利要求所述的聚合物，其中所述递送增强剂与所述聚合物偶联。
18.包含选自式(I)的重复单元的聚合物：
Figure A200780012256C00041
其中：
PEI是包含至少一种式(IIb)的重复单元的聚乙烯亚胺重复单元：
Figure A200780012256C00042
其中z是约1至约13的整数；
R选自电子对、氢、C2-C10烷基、C2-C10杂烷基、C5-C30芳基和C2-C30杂芳基；
L选自选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C5-C50芳基、C2-C50杂芳基、C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C2-C50羧基烯基和C2-C50羧基杂烯基；以及
m是约1至约30的整数。
19.如权利要求18所述的聚合物，其中所述PEI的分子量小于600道尔顿。
20.如权利要求18所述的聚合物，其中所述PEI还包含式IIa的重复单元：
Figure A200780012256C00051
其中x是约1至约12的整数，y是约1至约6的整数。
21.如权利要求20所述的聚合物，其中所述PEI的分子量小于600道尔顿。
22.转染真核细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求10至17中任一权利要求所述的聚合物接触，从而将所述寡核苷酸递送至所述细胞。
23.聚合物库，其包含多种权利要求1至21中任一权利要求所述的聚合物，其中所述聚合物的至少两种中选自R、L、PEI和m的至少一种参数是不同的。
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