JP6096111B2 - 免疫刺激組成物及びワクチン組成物 - Google Patents
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Description
i)マンナンを含む組成物を得ること、
ii)サイズに基づいて工程i)の組成物を分画すること、
iii)マンナンを含む1以上の分画を選択し、1以上の分画におけるマンナンの少なくとも75%が約1000kDaより大きいこと、及び
iv)少なくとも1つのその他の化合物と工程iii)の分画を任意で混合することを含む。
i)マンナンの少なくとも75%が1000kDaより大きいマンナンを含む組成物を得ること、及び
ii)少なくとも1つの抗原又はそれをコードする核酸と工程i)の組成物を混合し又は抱合し、それによってワクチン組成物を調製することを含む。
i)マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ii)工程i)の組成物のサイズ分布とアルデヒド含量を分析すること、及び
iii)所望のサイズ及び/又はアルデヒド含量を含むのであればその組成物を選択することを含む。
i)組成物の一部を酸化すること、
ii)工程i)の酸化された生成物をANTSで標識すること、及び
iii)工程ii)の標識された生成物をSDS−PAGEによって分離することによりサイズ分布を分析することによって分析される。
i)組成物の一部を酸化すること、
ii)工程i)の酸化された生成物を3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジド(PDPH)と反応させること、
iii)工程ii)の生成物を還元剤と反応させて2−ピリジンチオンを放出させること、及び
iv)2−ピリジンチオンの放出を測定することによって分析される。
i)水和硫酸の存在下でレゾルシノール(1,3−ジヒドロキシベンゼン)と組成物を反応させ、
ii)OD430〜480nmにて吸光度を測定し、
iii)標準に対して吸光度を比較することによって
炭水化物ポリマーの糖含量を定量することにより決定することができる。
i)炭水化物ポリマーがアルデヒド基を含む、マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ii)サイズに基づいて組成物を分画すること、及び
iii)工程ii)の所望のサイズ分布を持つ炭水化物ポリマーを含む1以上の分画を選択し、それによって組成物を調製すること、を含む。
i)マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ii)サイズに基づいて組成物を分画すること、
iii)工程ii)から得られた1以上の分画を酸化すること、及び
iv)所望のサイズ分布及び/又はアルデヒド含量を持つ炭水化物ポリマーを含む1以上の分画を工程iii)から選択し、それによって組成物を調製すること、を含む。
i)1以上の分画の一部をPDPHと反応させること
ii)工程i)の生成物を還元剤と反応させて2−ピリジンチオンを放出させること、及び
iii)2−ピリジンチオンの放出を測定することによって分析される。
i)1以上の分画の一部をANTSで標識すること、及び
ii)工程i)の1以上のANTS標識した分画をSDS−PAGEで分離することによってサイズ分布を分析することにより分析することができる。
(a)選択された分画におけるマンナンの分子量は約1000kDaを超え、ANTSで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約150〜約250kDaの間であり、及び/又は炭水化物基準に基づいて約800〜約3000kDaの間であるか;
(b)選択された分画におけるマンナンの分子量は約300〜約1000kDaの間であり、ANTSで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約150〜約175kDaの間であり、及び/又は炭水化物基準に基づいて約400〜約1000kDaの間であるか;
(c)選択された分画におけるマンナンの分子量は約100〜約300kDaの間であり、ANTSで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約80〜約125kDaの間であり、及び/又は炭水化物基準に基づいて約90〜約400kDaの間であるか;
(d)選択された分画におけるマンナンの分子量は約50〜約100kDaの間であり、ANTSで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約60〜約80kDaの間であり、及び/又は炭水化物基準に基づいて約50〜約175kDaの間であるか;又は
(e)選択された分画におけるマンナンの分子量は約30〜約50kDaの間であり、ANTSで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約50〜約60kDaの間であり、及び/又は炭水化物基準に基づいて約20〜約50kDaの間である。
配列番号1:メラン/MART−1(天然)に特異的なHLA−A2エピトープペプチド
配列番号2:メラン/MART−1(類似体)に特異的なHLA−A2エピトープペプチド
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて当業者(たとえば、細胞培養、分子遺伝学、ワクチン技術、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学)によって一般に理解されるものと同じ意味を有するように解釈されるべきである。
驚くべきことに、本発明者らは高分子量マンナン(すなわち、約1000kDaを超える)がさらに小さいマンナン又はその混合物よりも高い免疫刺激活性を有することを見い出した。従って本発明の組成物はマンナンを含み、その際、組成物中のマンナンの少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも97%、さらに好ましくは少なくとも99%、一層さらに好ましくはすべてが約1000kDaより大きい。
炭水化物及び糖類の分離方法は当該技術で周知である(一般にZ. El Rassi (編者), Carbohydrate analysis by modern chromatography and electrophoresis, Journal of Chromatography, volume 66, Elsevier Science (2002)を参照のこと)。
一実施形態では、マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物、さらに好ましくはマンナンを含む組成物のサイズ分画は、クロスフロー濾過(CFF)とも呼ばれる接線流濾過(TFF)によって行われる。TFFは、生成物の流れ(供給液)が膜の表面に沿って接線方向に向かい、循環する溶液の大半が供給液タンクに戻る方法である。膜を横切る供給液の速い流れは表面を「掃く」働きをし、濃度分極(膜表面での生成物の濃縮)を低下させる。それはまた膜表面の孔を閉塞させ得る汚れの堆積を防ぐ。速い循環流量は圧力損失を発生し、その力によって膜の孔より小さい供給液や溶解分子の一部は膜フィルターを通過する。膜を通過した溶液は濾液又は通過液と呼ばれる。膜の孔より大きい分子又は粒子は供給液に保持され、効果的に濃縮される。
分画に先立って及び/又は分画後、試料のサイズ分布を決定することができる。分画に先立って実施する場合、この分析は分画のために炭水化物ポリマーの出発組成物を選択することが目的である。たとえば、出発組成物におけるポリマーの分子量種の大半が1000kDaを下回るのであれば、その組成物を捨て、炭水化物ポリマーの高分子量種のさらに高い分布を有する別のバッチを分画のために選択することができる。対照的に、回収した分画のサイズ分布の分析は分画法を確認する又は検証するように働く。このことは、これら炭水化物ポリマーをヒトで使用するための規制認可を得る場合、重要であろう。
試料のアルデヒド含量も分画前及び/又は分画後に決定し、バッチ選択及び/又は分画の検証を目的としてもよい。
一実施形態では、組成物のマンノース含量は、天然の糖類についての比色アッセイによって決定され、その際、天然の糖類は水和硫酸溶液の存在下でレゾシノールと反応する。
本明細書で使用されるとき、用語「免疫刺激組成物」は免疫応答を誘導する及び/又は高める組成物の能力を指す。
一実施形態では、組成物又はワクチンの投与によって液性免疫を生じ、その際、IgA、IgG、IgM及び任意でIgE抗体の1以上の産生が刺激される。
一実施形態では、本発明の組成物又はワクチンの投与は細胞性応答を生じ、その際、1以上の抗原提示細胞が活性化される。
(1)そのエンドサイトーシスに続く外因性経路にて処理されたワクチン抗原のMHCクラスII拘束性の提示;
(2)たとえば、抗原をコードするプラスミドDNAによるDCへの直接形質移入の後のワクチン抗原のMHCクラスI及び/又はクラスII拘束性の提示;
(3)ワクチン抗原のMHCクラスI拘束性の「交差」提示。
一実施形態では、本発明の組成物又はワクチンの投与は液性免疫及び/又は細胞性免疫のメディエータを刺激する。
用語「ワクチン組成物」はレシピエント対象にて防御免疫を引き出すのに使用することができる組成物を指す。一部の個体は強固な又は防御的な免疫応答を備えることができず、場合によってはワクチンに対する免疫応答を備えることができないので、有効であるためには、本発明のワクチンは集団の一部で免疫を引き出すことができることが言及されるべきである。この不能性は、個体の遺伝的背景が原因で生じ、又は免疫不全の状態(後天性又は先天性のいずれか)又は免疫抑制(たとえば、臓器拒絶を防ぐ又は自己免疫状態を抑えるための免疫抑制剤による治療)のために生じる。有効性は動物モデルで確立することができる。
本発明は、ワクチン組成物における少なくとも1つの抗原と組み合わせたマンナンの使用を提供する。マンナンを少なくとも1つの抗原と混合する又は抱合してワクチン接種後の防御的な免疫応答を生成することができる。
花粉;
アレルゲン、特に喘息を誘発するもの;
たとえば、インフルエンザウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、HIV−1、HIV−2、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、単純性ヘルペスウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、HTLV−1及びHTLV−2のようなウイルス;
たとえば、炭疽病、ハンセン病、結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフス、及び淋病の病因因子のような細菌;
たとえば、Babeosis bovis、プラスモジウム、レイシュマニアspp、Toxoplasma gondii及びTrypanosoma cruziのような原虫;
たとえば、Aspergillus sp.、Candida albicans、Cryptococcus neoformans及びHistoplasma capsulatumのような真菌;
たとえば、寄生蠕虫のような寄生虫、並びに
ムチン−1(MUC−1)、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異抗原、タンパク質MZ2−E、多型性上皮ムチン(PEM)、葉酸結合タンパク質LK26、切断型表皮増殖因子受容体(EGRF)、Thomsen−Friedenreich(T)抗原、テロメラーゼ、サーバイビン、メラン−A/MART−1、WT1、LMP2、ヒトパピローマウイルス(HPV)E6、E7,ヒト上皮増殖因子受容体(HER−2/neu)、メラノーマ関連抗原3(MAGE−3)、p53、NY−ESO−1、前立腺酸ホスファターゼ(PAP)、癌精巣抗原、5T4及びGM2及びGD−2ガングリオシドのような腫瘍抗原に由来する抗原が挙げられる。
抗原は、Helicobacter pylori、Chlamydia pneumoniae、Chlamydia trachomatis、Ureaplasma urealyticum、Mycoplasma pneumoniae、Staphylococcus spp.、Staphylococcus aureus、Streptococcus spp.、Streptococcus pyogenes、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus viridans、Enterococcus faecalis、Neisseria meningitidis、Neisseria gonorrhoeae、Bacillus anthracis、Salmonella spp.、Salmonella typhi、Vibrio cholera、Pasteurella pestis、Pseudomonas aeruginosa、Campylobacter spp.、Campylobacter jejuni、Clostridium spp.、Clostridium difficile、Mycobacterium spp.、Mycobacterium tuberculosis、Treponema spp.、Borrelia spp.、Borrelia burgdorferi、Leptospira spp.、Hemophilus ducreyi、Corynebacterium diphtheria、Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、Bordetella bronchiseptica、Hemophilus influenza、Escherichia coli、Shigella spp.、Erlichia spp.及びRickettsia sppを含むが、これらに限定されない細菌に由来することができる。
抗原は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、アデノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エプステインバーウイルス、リノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ルベオロウイルス、ルベラウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヘルペスウイルス(ヒト及び動物)、単純性ヘルペスウイルス、パルボウイルス(ヒト及び動物)、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ブンヤウイルス、狂犬病ウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、HIV−1、HIV−2、HTLV−1、HTLV−II、FeLV、ウシLV、FeIV、イヌジステンパーウイルス、イヌ伝染性肝炎ウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ鼻気管支炎ウイルス、TGEウイルス(ブタ)及び口蹄疫を含むが、これらに限定されないウイルスに由来することができる。
本発明の一実施形態では、対象は癌を有するか、又は癌を発症する高いリスクにある。
好まれる実施形態では、抗原はムチン又はその抗原性断片若しくは免疫原性の変異体若しくは誘導体である。多数の癌がヒトのムチンの過剰産生を伴う。ムチンは多数の上皮細胞及び腫瘍によって産生される激しくグリコシル化されたタンパク質(約100kDaを超える)である。癌細胞で見られるムチンは、一部のムチンが炭水化物コートの欠損を有し、それがタンパク質のコアを暴露したままにするという点で、正常の上皮細胞上のものと幾つかの点で異なる。MUC−1、MUC−2、MUC−3、MUC−4、MUC−5、MUC−6及びMUC−7等と命名された既知のヒトのムチンの21の形態があり、MUC−1が最も普遍的である。種々のムチンはすべて良く似た特性を有し、すなわち、それらは膜貫通型の糖タンパク質であり、すべて種々の数の反復アミノ酸配列を有し、それはセリン、スレオニン及びプロリンの高い含量を有する。異常にグリコシル化された(グリコシル化されない又はグリコシル化における欠陥のいずれか)ムチンの過剰産生は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌及び分泌組織のその他の腫瘍の特徴である。ヒトのムチンMUC−1〜MUC−21の各タンパク質コアのcDNA配列がクローニングされ、性状分析されて、特定のアミノ酸モチーフ(VNTRとして知られる)の様々な数の繰り返しの高度に反復性の中央部分を含有することが見い出されている。例証として、MUC−1は、40〜80の直列に配置されたコピー又は20アミノ酸モチーフの繰り返しを含有する高度に反復性の中央部分によって分離される独特のアミノ末端とカルボキシ末端の配列から成る。
たとえば、マクロファージ及びDCへの少なくとも1つの抗原の送達は、少なくとも1つの抗原がマンナンに抱合された場合、高めることができる。理論に限定されることを望まないが、マクロファージ及びDCは、炭水化物部分(通常、微生物由来する)を認識する細胞表面受容体を有し、抗原提示に関与する2つの過程である飲作用と同様に貪食作用に介在するので、これは最も可能性が高い。そのようなものとして本発明のマンナン/抗原抱合体はAPCターゲティングの有効なメカニズムを提供する。
一実施形態では、ワクチン組成物は抗原をコードする核酸を含む。複数の核酸がワクチンに組み込まれて多価の抗原ワクチンを提供する。一実施形態では、ワクチンはDNAワクチンである。
本発明の組成物は少なくとも1つの薬学上許容可能なキャリアを含んでもよい。用語「薬学上許容可能なキャリア」は、対象、特に哺乳類、さらに特にヒトに投与する際、アレルギー反応、毒性反応又はそのほかの有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学上許容可能なキャリアは固体であっても、液体であってもよい。薬学上許容可能なキャリアの有用な例には、本発明の活性剤の活性に影響を及ぼさない希釈剤、賦形剤、溶媒、界面活性剤、懸濁剤、緩衝剤、潤滑剤、ビヒクル、乳化剤、吸収剤、分散媒体、コーティング、安定化剤、保護コロイド、接着剤、増粘剤、チキソトロピー剤、浸透剤、金属イオン封鎖剤、等張剤及び吸収遅延剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のワクチン組成物は、単独で又は別の化合物との併用で、適当な経路によって対象に投与することができる。
一実施形態では、本発明は核酸を細胞に送達するための組成物に関するものであり、その組成物は少なくとも1つの核酸とマンナンを含み、その際、マンナンの少なくとも75%は1000kDaより大きい。少なくとも1つの核酸はポリカチオンを介してマンナンに抱合され得る。
培地及び化合物
2%HEPES、0.1mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2mMのグルタミン及び10%(v/v)のウシ胎児血清で補完することによって完全RPMI−1640培地を調製した。DCを培養するのに使用する組換えGM−CSFはBD−ファーミンゲン(米国、サンディエゴ)から購入し、PBSで再構築した。リポ多糖(LPS)(シグマL3137、オーストラリアのキャッスルヒル)は無菌蒸留水で再構築した。抗CD−11c−APCはBD−ファーミンゲン(米国、サンディエゴ)から購入した。抗CD40、抗CD80及び抗CD86抗体は自分達で調製した。マンナン、NaIO4、ANTS、エタン−1,2−ジオールはシグマから購入した。
二重蒸留水(DDW)中20mg/mlのマンナンを20mlの300kDaMWCOビバスピン濃縮器(サルトリウス)に入れ、2500rpmにて15〜20分間遠心し、1〜2mlに濃縮した(図1)。試料全体を加えるまで濃縮器を再充填した。数回の遠心が必要だった。濾液を回収し、DDWで2回洗浄したが、洗浄液は廃棄した。濃縮した分画(濃縮液)は>300kDaの分画である。次いで濾液を15mlの100kDaMWCOアミコンスピン濃縮器(ミリポア)に入れ、前に詳説したように実行した。次いで2×15mlの50kDaMWCOアミコンスピン濃縮器(ミリポア)、その後、2×15mlの30kDaMWCOアミコンスピン濃縮器(ミリポア)を用いてマンナンを順次分画した。これによって>300、100〜300、50〜100、30〜50及び<30kDaの分画を生じた。粘着性なので使用しない<30kDaの分画を除いて、濃縮液分画及び最終濾液を白色の綿毛状粉末に凍結乾燥した。試料を秤量し、回収率を記録した。
酸化マンナンにおけるアルデヒド基の数を定量する方法を図2で模式的に示す。酸化の程度がマンナンの分子量に左右されるように同一モル濃度のNaIO4を使用する。0.1Mのリン酸pH6.0緩衝液中、1.4mg/0.1mlのマンナン及びマンナン分画を0.01MのNaIO4で酸化し、暗所氷上にて1時間反応させた。10μlのエタン−1,2−ジオールで反応を止め、さらに1/2時間反応させた後、0.1Mの酢酸緩衝液pH4.8にてPD10カラムを通過させた。
アルデヒド残基の数=2−ピリジンチオンの濃度(M)/マンナンの濃度(M)=[OD343/8080]/[マンナンの濃度(mg/ml)/マンナンの分子量]
ANTSによる酸化マンナンの化学修飾を図3にて模式的に示す。0.1Mのリン酸pH6.0緩衝液中、1.4mg/0.1mlのマンナン及びマンナン分画を0.01MのNaIO4で酸化し、暗所氷上にて1時間反応させた。10μlのエタン−1,2−ジオールで反応を止め、さらに1/2時間反応させた後、0.1Mの酢酸緩衝液pH4.8にてPD10カラムを通過させた。
レゾシノールアッセイ(Monsigny et al., 1988)を用いてマンナン及びマンナン分画を定量した。マンノースを基準として用いた。OD450nm(430又は480nmがないので)での吸光度にてプレートを読み取った。
抗原のマンナンへの抱合
SDS−PAGE又は未処理ゲルにてマンナン及び分画を視覚化した。予め形成された(PAGEゲル)SDS4〜12%又は4〜20%の勾配ゲル(PAGEゲル)を1×MOPSSDS泳動緩衝液にて泳動させた。或いは、0.063Mのトリス−HCl、pH6.8で作製した5%濃縮ゲルとTBEで作製した分離ゲルから成る12%未処理ゲル(塩基性条件)を用いた。0.19Mのグリシンを加えたTBEにて電気泳動を行った(Sharma et al, 2003)。
上記のようにマンナン分画をNaIO4で酸化し、ANTSで標識した。ANTS標識したマンナンの試料をPAS染色後のSDS−PAGEによって分析した。クオンティワン(バイオラド)ソフトウエアを用いたデンシトメトリーによって乾燥ゲルを走査し、分析した。
以前記載された(Apostolopoulos et al, 2006)ようにマウスのDCを生成した。手短には、大腿骨及び脛骨の内腔から骨髄細胞を取り出した。無菌の0.73%(w/v)NH4C1で骨髄細胞を37℃にて10分間処理して赤血球を溶解させた。細胞を洗浄し、10ng/mlのGM−CSFで補完した完全培地に再浮遊させた(2×106個の細胞/3ml)。24穴プレート(1ml/ウェル)にて細胞を4日間培養した。培養培地を穏やかにピペッティングすることによって細胞を回収した。GM−CSFで培養した骨髄細胞は、混合リンパ球反応の強力な刺激細胞である多数のMHCクラスII発現DCを生じる。
成熟試験にはC57BL/6マウス由来のDCを用いた。培養プレートから樹状細胞を取り出し、10ng/mlのGM−CSFで補完した完全RPMIの150μlに1×105個のDCを再浮遊させ、48穴プレートに播いた。800、400、及び200μg/mlの最終濃度がウェルに添加されるようにマンナン及び種々のマンナン分画を加えた。LPS(1μg/ml)を陽性対照として用い、各ウェルに加え、37℃で18時間インキュベートした。細胞を回収し、イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)に結合した抗DC86、抗CD40又は抗CD80と共に抗CD11c−APCによって染色した。CD11chigh細胞をゲートで囲み、ヒストグラム解析によってFITCの強度を判定し、DCの成熟状態を判定した。
[マウス及び免疫]
HLA−A2/Kbマウスはオーストラリア、パースのアニマルリソースセンターから購入した。MFP、>1000MFP及び非抱合FPによって誘導されるエフェクター免疫応答を測定するために、0、10及び17日目に100μlの体積で尾の基部にてHLA−A2/Kbマウスを経皮的に免疫し、ELISpotアッセイを用いて10〜14日後、免疫応答を評価した。2回目及び3回目の注射後、マウスにて採血し、MUC1特異的な総Ig、IgG2a及びIgG1をELISAアッセイで検出した。
免疫したHLA−A2/Kbマウスから脾臓細胞を単離し、抗原特異的なIFN−γの分泌についてELISpotによって評価した。混合アセテートプレート(MAIPミリポア)を抗マウスIFN−γ(AN18、5μg/ml、ドイツ、マブテック)で一晩コートした。5×105個の脾臓細胞/ウェルを加え、MUC−FP(20μg/ml)の存在下で10%FCS RPMI1640培地にて18時間インキュベートした。ConA(1μg/ml)又は細胞単独をそれぞれ陽性及び陰性の対照として用いた。細胞を捨て、洗浄した後(0.05%ツイーン20/PBS)、抗マウスIFN−γ(R4−6A2、米国カリフォルニア州、マブテック)を2時間加え、その後、室温にて2時間、0.1μg/mlのエクストラアビジン−アルカリホスファターゼ(AP)(英国、シグマ)を加えた。比色APキット(米国カリフォルニア州、ヘラクレスのバイオラド)を用いて活性のスポットを検出した。AID ELISpotリーダーシステム(ドイツ、Autoimmun Diagnostika社)によってサイトカインのスポットを計数した。データは、0.5×106個の細胞当たりの平均スポット形成単位(SFU)±平均値の標準偏差(SD)として表す。
>1000kDaの酸化マンナンに結合したタンパク質抗原のヒトin vitro免疫原性試験
MART−1タンパク質は米国のバイオビジョンから購入した。GST−MUC1−VNTR(FP)は、Apostolopoulosら、1993に記載されたように調製した。Hisのタグを付けたMUC1−VNTR(pTrc)は、pTrcBベクター(インビトロゲン)(Loveland et al., 2006)にて自分達で調製した。Melan−A/MART−1[EAAGIGILTV(天然)(配列番号:1)、ELAGIGILTV(類似体)(配列番号:2)]に特異的なHLA−A2エピトープペプチドは、米国、ゲンスクリプトによって合成された。
過ヨウ素酸>1000kDa酸化マンナンへの抗原の抱合は以前記載されたように実施した。>1000kDaマンナンと抗原の比は40:1だった。
ファイコール・パックPLUS(GEヘルスケア)を用いた密度勾配遠心によってバフィコートからPBMCを分離した。フローサイトメトリーによってHLA−A2の状態を評価した。完全AB型培地(RPMI1640、10%AB型血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、HEPES、L−GLUT、NEAA、ピルビン酸ナトリウム(インビトロゲン)、2−メルカプトエタノール)にて5×106個/mlでPBMCを再浮遊し、24穴プレートにて10μg/mlのMART−1類似体ペプチド(ELAGIGILTV)(配列番号:2)及び3μg/mlのR848(インビトロゲン)によって刺激した。3日後、50U/mlのIL−2(R&Dシステムズ)、20ng/mlのIL−15及び20ng/mlのIL−7(ペプロテック)で補完した別の1mlのAB型血清を加えた。最初の刺激の7〜10日後、2μg/mlのFMP又は10μg/mlのMARTI類似体ペプチド(ELA)で感作した放射線照射自己PBMC(1:100)によって細胞を再刺激した。翌日、1mlの上清を25U/mlのIL−2を含有する新鮮なAB型培地と交換した。これを3〜4日ごとに繰り返した。
CD14マイクロビーズ(ミルテニーバイオテック)を用いた自動MACS分離によってPBMCから単球を精製した。T75フラスコにて50ng/mlのGM−CSFと20ng/mlのIL−4(R&Dシステムズ)を含有する完全FCS培地(RPMI1640+10%FCS+L−GLUT、ペニシリン/ストレプトマイシン、HEPES、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、2−メルカプトエタノール)において単球(5×105個/ml)を5〜6日間培養することによって単球由来の樹状細胞(MoDC)を生成した。
T細胞エピトープペプチドについて− 1.25μg/mlのβ2ミクログロブリンを伴った無血清培地にて無関係なペプチド(たとえば、CAP−1の10μg/ml又はペプチドなし)及び当該ペプチド(5μg/ml)で1時間感作することによってペプチド負荷したT2細胞(2×105個/ウェル)を調製した。100μlにておよそ1:5の比で(4×104個/ウェル)でT2細胞を2つ組T細胞ウェルに加え、37℃で5%CO2にて1時間インキュベートした。Golgi−Stop(T細胞/MoDC共培養200μl当たり0.1μl)を含有する50μlの培地を加え、37℃で5%CO2にて3〜4時間細胞をインキュベートした。
表面マーカーCD8及びCD4について細胞を染色し、固定し、透過処理をし、次いでCytofix/CytoPermキット(BD)と共にCD4−APC−Cy7、CD8−FITC及びIFNy−PE−Cy7(BD)を用いて細胞内IFNγの蓄積について染色した。当該ペプチド/タンパク質の存在下でのIFNγ+CD4及びCD8細胞を無関係のペプチド/タンパク質対照と比較するフローサイトメトリーによって抗原特異的なT細胞を特定した。
最初に、材料及び方法に記載したように順次膜を通過させて>300kDa、100〜300kDa、50〜100kDa、30〜50kDa、4〜30kDaのマンナン分画を単離した。その後、マンナン分画、>1000kDa、100〜300kDa、50〜100kDa及び30〜50kDaを単離した。4〜30kDaの分画はガムのような残留物だったので以後の試験には含めなかった。
huh−7細胞は、マンノース受容体を発現しているヒト肝細胞癌腫の細胞である。マンノース−BSAはマンノース受容体を結合することが知られており、これらの試験で陽性対照としてインキュベートした。マンナン全体及び種々の分画をFITCで標識し、huh−7細胞への結合をフローサイトメトリーによって観察した(図5)。
マンナンの種々の分画がBMDCを活性化するかどうか及び分画がマンナン全体よりも優れるかどうかを確認するために、様々な用量及び様々な時間で分画をDCと共にインキュベートし、成熟マーカーCD40、CD80及びCD86をフローサイトメトリーでモニターした(図6)。図6に示すように、分画は用量依存性にDCを活性化した。>300kDaの分画はマンナン全体よりも優れていた。
>300kDaのマンナン分画がマンナン全体よりも効果的にBMDCを活性化したので、さらに大きい分子量分画を分析のために単離した。一層さらに大きい分子量の分画を単離するために、マンナン全体を1000kDaのカットオフメンブレンを伴ったセントリプレップ濃縮器に通した。種々の分画の収率を表2に示す。興味深いことに、300〜1000kDa分画が大きく減少したということは、>1000kDaのマンナン分画が以前単離した>300kDaマンナン分画では優勢であることを示している。
48時間後のCD40及びDC86の上方調節をフローサイトメトリーによって観察することにより、BMDCを刺激する>1000kDa分画の種々の用量の能力を測定した(それぞれ図7A及び7B)。>1000kDa分画を>300kDa分画及びマンナン全体と比較し、>1000kDa分画はマンナン全体よりも優れ、>300kDa分画に類似することが明らかであった。
上記で見られたように、マンナンの種々の分画はBMDCを活性化し、マンノース受容体に結合することができ、>1000kDaのマンナン分画は生物学的に最も活性のある分画である。しかしながら、分画の生化学的特性を分析できることは、一連の規格を設定できるように分画の相対的な分子量を得ることができることと共に重要である。本発明者らはすでに、種々のマンナンがNaIO4で酸化された場合、異なった数のアルデヒド基を生成することを示している(表1及び2)。
方法で記載したようにマンナンの種々の分画をMUC1−FPに抱合させた。分画に比べてマンナン全体では生成されたアルデヒド基の分子量及び数が異なるので、使用するFPの量はMUC1−FPとアルデヒドのモル比として標準化した。加えて、MUC1−FPの量の範囲を抱合し、SDS−PAGEによって分析した(図15)。
上述のようにマンナン全体と>1000kDaマンナンを調製し、in vivoの免疫原性試験に用いた。
マンナンは現在シグマから調達されている。それは、製造管理及び品質管理に関する基準(GMP)の標準にあるものではなく、得られただけの情報を図18に示す。特定の基準に見合うことを保証する製造元からもたらされるかどうかは酵母マンナンにとって重要である。PDPHアッセイを用いてアルデヒドを測定し、レゾシノールアッセイを用いてマンノース含量を測定し、ANTSアッセイを用いてマンナンの種々のバッチの性状分析をすればよい。
抱合
前に記載したように>1000kDa酸化マンナンにFPを抱合した(>100MFP)(図22)。
酸化マンナン−pTrcによる反復免疫、その後のMUC1特異的T細胞の選別と増殖によってMUC1特異的なT細胞株を生成した。MUC1特異的なT細胞株にMUC1を提示する、マンナン抱合体で感作した同種DC(BC16)の能力を検討した。図23に示すように>1000MFPはMUC1特異的なT細胞株を刺激することができた。>1000MFPは10μg/ml及び20μg/mlの用量で非抱合のFPよりもT細胞の刺激において有効だった。
抱合
>1000kDa酸化マンナンにMUC1−VNTR(pTrc)を抱合した(図24)。種々の量のpTrcを>1000kDa酸化マンナンと反応させて最適な比を確認した。1:40(1/2x、レーン5)の抗原:マンナンの比での抱合体を免疫原性試験に用いた。
凍結MoDC(凍結、BC17K)によってリコールしたpTrc(MUC1)T細胞株(ドナーBC13由来)を介して、>1000kDa酸化マンナンに連結したpTrcの免疫原性を確認した(図25)。示すように、pTrcは有効には処理されず、MUC1特異的T細胞に提示されなかった。しかしながら、>1000kDa抱合体は非抱合のpTrcよりも効果的にMUC1特異的T細胞を刺激した。20μgのpTrc、>1000kDa/pTrc抱合体で感作した自己MoDCを用いて、健常ドナーBC17Kに由来するMUC1特異的T細胞株からのMUC1特異的CD8応答をリコールした(図26)。>1000kDa酸化マンナン抱合体は非抱合の抗原に比べてCD8T細胞における細胞内IFNγ分泌を効率的に刺激した。
抱合
上述のように>1000kDa酸化マンナンに組換えMART−1タンパク質も連結させた(図27)。通常型と還元型のMART−1によって2種類の抱合体を作製した。MART−1タンパク質は幾つかのシステインを有するので空気酸化し、凝集する傾向がある。抱合を円滑にするために、MART−1を先ずDTTで還元し、次いで抱合に用いた。
ペプチドによるT細胞の刺激及びリコール
実施例1に記載したようにMART−1及び>1000kDa酸化マンナン抱合体(20μg/ml)による刺激に2人のドナー(BC28及びBC29)に由来するPBMC及びMoDCを用いた。1回目の刺激後、感作したT2細胞を用いて類似体及び天然のMART−1ペプチド特異的なT細胞応答を測定した(図28)。>1000kDa酸化マンナン−MART−1で刺激したBC28ドナーのT細胞は、T2細胞によって提示された類似体又は天然のMART−1ペプチドに効率的に応答した(図28)。BC28とBC29の培養を各タンパク質と抱合体で再刺激し、自己の感作MoDCを抗原提示細胞として用いてMART−1タンパク質特異的なT細胞応答について調べた(図29)。>1000kDa酸化マンナン抱合体で刺激したBC28ドナーとBC29ドナーのT細胞にて、感作したMoDCはMART−1特異的なCD8T細胞応答をリコールすることができた。MART−1>1000kDa酸化マンナンによる刺激は非抱合のタンパク質よりも刺激において効率的だった。
インフルエンザウイルス及びマウス
卵で増殖させたH1N1(A/ニューカレドニア/20/1999)ウイルスをスクロース勾配で精製し、濃縮し、β−プロピオラクトンで不活化して、インフルエンザに関する参照及び研究にためのWHO共同研究センター(オーストラリア、北メルボルン)の副所長であるIan Barr博士に供与されたインフルエンザのゾーンプール(IZP)を創った。マウスはすべてWEHI(オーストラリア、メルボルン)によって供給されたBALB/cメスであり、最初の免疫時、8〜10週齢だった。
それぞれの所望の用量が50μlに含有されるようにH1N1ストック(2.7mg/mlから)及び>1000kDaマンナンストック(14mg/mlから)を希釈することによってH1N1/>1000kDaマンナン混合物を生成した。>1000kDaマンナンは以前記載されたように単離した。
免疫はすべて鼻内経路を介して投与した。完全に麻酔して(メトキシフルオランの吸入を介して)、直立に保持している間に、およそ5μlの液滴を各鼻孔に交互にピペットで穏やかに入れた。
記載されたように眼窩後出血によって血清を回収した。BALの回収の前に、ケタミンとキシラジルのカクテルでマウスを安楽死させた。組織を取り除いて上部気管を露出し、その中で小さく切開した。1mlのシリンジに取り付けた先端を鈍化した針の助けを借りて、1mlのPBSを穏やかに肺に送り、引き戻した。
HRP/TMBシステムを用いてELISAを行った。1μg/mlの濃度で不活化H1N1(A/ニューカレドニア/20/1999)全体でプレートをコートした。直接結合したラット抗マウスIgG−HRP(GEヘルスケア、製品番号RPN123IV)を用いて抗H1N1総IgGを検出し、ファーミンゲンのビオチン標識一次抗体(製品番号553441、553388及び556978)とGEヘルスケアのストレプトアビジン−HRP二次抗体(製品番号346480)を用いてIgG1、IgG2a及びIgAを検出した。滴定における最後の値として最終力価を測定し、相当する対照の値より上にあったが、その際、対照は各滴定時点の未処理のマウス血清(3〜5匹)の平均OD値+2SDとして算出した。
Claims (4)
- 少なくとも1つの抗原に共有結合により抱合されている、又はそれをコードする核酸にポリカチオンを介して抱合されている、酸化された出芽酵母(Saccharomyces cerevisae)マンナンを含む免疫刺激組成物であって、前記酸化マンナンの少なくとも75%が1000kDaより大きく、前記少なくとも1つの抗原又はそれをコードする核酸に抱合される前に、少なくとも150のアルデヒド基を有する、組成物。
- 対象において前記抗原又はそれをコードする核酸に対する免疫応答を誘導する及び/又は高めるための、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1または2に記載の組成物を調製する方法であって、
i)マンナンを含む組成物を得ること、
ii)サイズに基づいて工程i)の組成物を分画すること、
iii)マンナンを含む1以上の分画を選択し、1以上の分画におけるマンナンの少なくとも75%が1000kDaより大きいこと、及び
iv)少なくとも1つの抗原又はそれをコードする核酸と工程iii)のマンナンを抱合すること、を含み、前記マンナンは工程iv)の前に酸化され、前記酸化マンナンの少なくとも75%が、前記少なくとも1つの抗原又はそれをコードする核酸に抱合される前に、少なくとも150のアルデヒド基を有する、方法。 - 請求項1または2のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法であって、
i)少なくとも75%が1000kDaより大きい酸化マンナンを含む組成物を得ること、及び
ii)少なくとも1つの抗原又はそれをコードする核酸と工程i)の組成物を抱合し、それによって組成物を調製することを含み、前記酸化マンナンの少なくとも75%が、前記少なくとも1つの抗原又はそれをコードする核酸に抱合される前に、少なくとも150のアルデヒド基を有する、方法。
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