CN102985095A - 免疫刺激组合物和疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含甘露聚糖的免疫刺激组合物，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa和/或具有至少150个醛基。本发明还提供所述组合物在接种疫苗和基因治疗方法中的用途及其制备方法。

Description

免疫刺激组合物和疫苗组合物

发明领域

本发明涉及含有甘露糖特别是甘露聚糖的碳水化合物聚合物，它们的制备及在免疫刺激组合物和疫苗组合物中的用途。 

发明背景 

已经表明甘露糖(例如，甘露聚糖)、β(1,3)葡萄糖(例如，葡聚糖)、β(1,4)乙酰化甘露糖(乙酰甘露聚糖)、β(1,4)N-乙酰基-葡糖胺(壳多糖)的几种多糖(碳水化合物聚合物)以及杂多糖例如鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(果胶)刺激免疫系统。 

如吞噬作用、增殖反应、细胞因子释放以及其他的免疫系统活性增加所表明的，多糖与C型凝集素受体的结合诱导免疫刺激。由于这种免疫刺激活性，这些多糖已经被建议用于疫苗组合物。特别感兴趣的是甘露聚糖。 

甘露聚糖是由C型凝集素受体例如甘露糖受体(CD206)和DC-SIGN(CD209)识别的聚甘露糖。由于它们在抗原呈递细胞上的存在，已根据它们对含有甘露糖、岩藻糖或葡萄糖的化合物的摄取来表征这些受体。例如，甘露聚糖与甘露糖受体的结合诱导内吞作用，然后其递送入内体途径。对甘露糖基化抗原的早期研究表明，抗原上甘露糖残基的存在极大增强了树突细胞(DC)对抗原的摄取和II类主要组织相容性复合体(MHC)限制的抗原呈递。甘露聚糖与至少一种抗原的结合也增强其摄取和呈递。 

虽然知道某些多糖的免疫刺激性质已有一段时间，但是它们的使 用依然主要限于研究应用。这部分原因是控制其在临床环境使用，特别是关于人类的严格规定。因此，需要用于治疗或预防疾病的其他免疫刺激组合物和疫苗组合物及其可靠的制备方法。 

发明概述 

在努力设计用于制备具有治疗用途的可再现特性的、包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物的方法时，本发明人惊讶地发现，一个具有确定大小和/或醛含量的甘露聚糖亚群与其他亚群和起始群体相比具有增强的性能。 

因此，在第一个方面，本发明提供了一种包含甘露聚糖的免疫刺激组合物，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa。 

在一个实施方案中，所述甘露聚糖是氧化的并因此包含醛基。这在甘露聚糖与至少一种抗原或其编码核酸结合时特别有用。 

在一个实施方案中，甘露聚糖在用氨基萘-1,3,6-三磺酸(ANTS)标记之后的大小分布基于蛋白标准物是约150Da至约250Da和/或基于碳水化合物标准物是约800kDa至约3000kDa。 

在另一个方面，本发明提供了一种包含氧化甘露聚糖的免疫刺激组合物，其中所述甘露聚糖的至少75%具有至少150个醛基。 

在另一个方面，本发明提供了一种包含氧化甘露聚糖的免疫刺激组合物，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa并且具有至少150个醛基。 

此外，提供了一种疫苗组合物，其包含甘露聚糖和至少一种抗原或其编码核酸，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa。 

在一个实施方案中，甘露聚糖是氧化的。 

在一个进一步的实施方案中，所述氧化甘露聚糖与所述至少一种 抗原共价结合。 

在一个替代实施方案中，所述氧化甘露聚糖通过聚阳离子与所述至少一种核酸结合。 

在一个实施方案中，所述氧化甘露聚糖的至少75%在与所述至少一种抗原或其编码核酸结合之前具有至少150个醛基。 

在一个实施方案中，甘露聚糖在与抗原或其编码核酸结合之前和用氨基萘-1,3,6-三磺酸(ANTS)标记之后的大小分布基于蛋白标准物是约150Da至约250Da和/或基于碳水化合物标准物是约800kDa至约3000kDa。 

甘露聚糖可以来自任何来源，例如真菌，更优选酵母。 

抗原可以来自任何来源，如病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原、真菌抗原、肿瘤抗原、自体抗原或变应原。例如，抗原可以是完整生物体、蛋白或抗原肽。 

在一个实施方案中，本发明的组合物被配制用于粘膜、局部、皮内、肌内、皮下或静脉内施用。 

在一个实施方案中，本发明的组合物还包含至少一种可接受的载体。 

在另一个方面，本发明提供了一种用于诱导和/或增强受试者免疫反应的方法，该方法包括给所述受试者施用本发明的组合物。 

在一个实施方案中，该方法包括施用至少一种抗原或其编码核酸。 

在一个实施方案中，甘露聚糖和至少一种抗原或核酸被依次或同时施用。在一个优选的实施方案中，它们在同一组合物中施用。 

在一个实施方案中，甘露聚糖和至少一种抗原或其编码核酸作为根据本发明的疫苗组合物施用。 

在一个实施方案中，当抗原来自感染因子或是其突变体/或衍生物时，该方法使受试者对病原体(感染因子)免疫。在另一个实施方案中，当抗原来自癌细胞或是其突变体/衍生物时，该方法用于癌症治疗。 

在一个实施方案中，组合物通过粘膜、局部、皮内、肌内、皮下或静脉内施用。 

还提供了本发明组合物制备用于诱导和/或增强受试者免疫反应的药物的用途。 

另外，提供了本发明组合物用于诱导和/或增强受试者免疫反应的用途。 

本发明组合物还可用于体外或离体的初次免疫方法。因此，在进一步的方面，本发明提供了一种在体外或离体激活巨噬细胞、DC和/或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，该方法包括使所述细胞与本发明组合物接触。初次免疫的细胞可以被施用给需要的受试者。 

按大小和或醛含量选择的本发明的甘露聚糖群体还可用于将至少一种核酸递送至细胞。因此，在进一步的方面，本发明提供了用于将至少一种核酸递送至细胞的组合物，所述组合物包含至少一种核酸和甘露聚糖，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa。 

在一个实施方案中，甘露聚糖是氧化的。 

在一个进一步的实施方案中，所述氧化甘露聚糖通过聚阳离子与所述至少一种核酸结合。 

在一个进一步的实施方案中，所述氧化甘露聚糖的至少75%在与 所述至少一种核酸结合之前具有至少150个醛基。 

在另一个方面，本发明提供了用于将至少一种核酸递送至细胞的方法，该方法包括使所述细胞与上述方面的组合物接触。 

在一个实施方案中，细胞在体外或离体。在一个替代实施方案中，细胞在体内。 

在一个实施方案中，所述核酸为基因治疗或基因疫苗接种而被递送至所述细胞。 

还提供了组合物用于制备基因治疗或基因疫苗接种的药物的用途。 

另外，提供了组合物用于基因治疗或基因疫苗接种的用途。 

在另一个方面，本发明提供了一种用于制备本发明的组合物的方法，该方法包括 

i)获得包含甘露聚糖的组合物， 

ii)基于大小对来自步骤i)的组合物进行分级， 

iii)选择一个或多个包含甘露聚糖的级分，其中所述一个或多个级分中的甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa，以及 

iv)任选地使来自步骤iii)的级分与至少一种其他化合物混合。 

在一个实施方案中，该方法还包括在步骤iv)之前氧化所述甘露聚糖的步骤。在一个进一步的实施方案中，所述氧化甘露聚糖的至少75%具有至少150个醛基。 

在一个实施方案中，所述至少一种其他化合物是抗原或其编码核酸。 

在另一个方面，本发明提供了一种用于制备本发明的疫苗组合物的方法，该方法包括 

i)获得包含甘露聚糖的组合物，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa；以及 

ii)使来自步骤i)的组合物与至少一种抗原或其编码核酸混合或结合，从而制备所述疫苗组合物。 

在一个实施方案中，该方法还包括在步骤ii)之前氧化所述甘露聚糖。在一个进一步的实施方案中，所述氧化甘露聚糖的至少75%具有至少150个醛基。 

为了协助产生本发明的组合物和更一般地包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物，优选的是，包含甘露糖的碳水化合物聚合物(例如甘露聚糖)的起始群体在各批次之间是一致的和/或足够高度地代表较大分子量种类的碳水化合物聚合物。 

因此，在另一个方面中，本发明提供了选择包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物的方法，该方法包括 

i)获得包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物， 

ii)分析来自步骤i)的组合物的大小分布和/或醛含量，以及 

iii)如果所述组合物包括期望的大小分布和/或醛含量，则选择该组合物。 

在一个实施方案中，大小分布通过以下分析 

i)氧化所述组合物的一部分， 

ii)用ANTS标记来自步骤i)的氧化产物，以及 

iii)通过SDS-PAGE拆分来自步骤ii)的ANTS标记产物来分析所 述大小分布。 

在一个实施方案中，醛含量通过以下分析 

i)氧化所述组合物的一部分， 

ii)使来自步骤i)的氧化产物与3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼(PDPH)反应， 

iii)使来自步骤ii)的产物与还原剂反应以释放2-吡啶硫酮，以及 

iv)测量2-吡啶硫酮的释放。 

在一个实施方案中，还原剂是二硫苏糖醇(DTT)。 

在一个实施方案中，2-吡啶硫酮的释放通过分光光度法以OD343nm的吸光度来测量。 

在一个实施方案中，组合物用高碘酸钠氧化。 

在一个实施方案中，该方法还包括测定来自步骤i)的组合物的纯度。例如，纯度可以通过按以下方式定量碳水化合物聚合物的糖含量来测定 

i)使所述组合物与间苯二酚(1,3-二羟基苯)在水合硫酸的存在下反应， 

ii)测量OD430-480nm处的吸光度，以及 

iii)使所述吸光度与标准物相比较。 

药品良好生产规范是获得监管部门批准的一个重要要求。然而，许多(如果不是全部)包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物的来源导致高度异质的群体，使它们难以清楚且一贯地定义。对于获自天然来源例如酵母的聚合物尤其如此。本发明人不仅鉴定了包含具 有增强性能的甘露聚糖的新组合物，本发明还提供了用于产生这种组合物和更一般地包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物的方法，所述组合物具有确定的性能，使它们更顺应监管审批程序。 

因此，在另一个方面，本发明提供了一种制备包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物的方法，该方法包括 

i)获得包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物，其中所述碳水化合物聚合物包含醛基， 

ii)基于大小对所述组合物进行分级，以及 

iii)选择一个或多个来自步骤ii)的包含具有期望的大小分布的碳水化合物聚合物的级分，从而制备所述组合物。 

或者，该方法包括 

i)获得包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物， 

ii)基于大小对所述组合物进行分级， 

iii)氧化从步骤ii)获得的一个或多个级分，以及 

iv)选择一个或多个来自步骤iii)的包含具有期望的大小分布和/或醛含量的碳水化合物聚合物的级分，从而制备所述组合物。 

在替代方法的一个实施方案中，所述一个或多个级分用高碘酸钠氧化。 

在替代方法的一个实施方案中，在步骤ii)之前，所述组合物使用本发明方法来选择。 

任一方法的步骤ii)可以使用任何合适的方法进行，例如但不限于切向流过滤、尺寸排阻色谱法和/或超滤。 

在另一个实施方案中，任一方法还包括在选择之前分析一个或多个级分的醛含量。在一个实施方案中，醛含量通过以下分析 

i)使所述一个或多个级分的一部分与PDPH反应， 

ii)使来自步骤i)的产物与还原剂反应以释放2-吡啶硫酮，以及 

iii)测量2-吡啶硫酮的释放。 

在一个实施方案中，还原剂是DTT。 

在一个实施方案中，2-吡啶硫酮的释放通过分光光度法以OD343nm的吸光度测量。 

在一个进一步的实施方案中，任一方法还包括分析选定的一个或多个级分的大小分布。例如，该大小分布可以通过以下分析 

i)用ANTS标记所述一个或多个级分的一部分，以及 

ii)通过SDS-PAGE拆分来自步骤(i)的一个或多个ANTS标记的级分来分析所述大小分布。 

在一个实施方案中，含有甘露糖的碳水化合物聚合物是甘露聚糖，并且 

a)所述选定级分中的甘露聚糖的分子量大于约1000kDa，并且用ANTS标记后的大小分布基于蛋白标准物是约150kDa至约250Da和/或基于碳水化合物标准物是约800kDa至约3000kDa， 

b)所述选定级分中的甘露聚糖的分子量为约300kDa至约1000kDa，并且用ANTS标记后的大小分布基于蛋白标准物是约150kDa至约175Da和/或基于碳水化合物标准物是约400kDa至约1000kDa， 

c)所述选定级分中的甘露聚糖的分子量为约100kDa至约 300kDa，并且用ANTS标记后的大小分布基于蛋白标准物是约80kDa至约125Da和/或基于碳水化合物标准物是约90kDa至约400kDa， 

d)所述选定级分中的甘露聚糖的分子量为约50kDa至约100kDa，并且用ANTS标记后的大小分布基于蛋白标准物是约60kDa至约80Da和/或基于碳水化合物标准物是约50kDa至约175kDa，或 

e)所述选定级分中的甘露聚糖的分子量为约30kDa至约50kDa，并且用ANTS标记后的大小分布基于蛋白标准物是约50kDa至约60Da和/或基于碳水化合物标准物是约20kDa至约50kDa。 

除非另外明确指明，本文任何实施方案加以必要改变而应用于任何其他实施方案。 

本发明的范围不限于本文所描述的具体实施方案，具体实施方案仅为示例说明的目的。如本文描述的，各种功能等同产品、组合物和方法显然在本发明的范围之内。 

贯穿本说明书，词语“包含”或变形例如“包括”或“含有”将被理解为暗示包含所述元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组。 

本发明在下文中借助以下非限制性实施例并参照附图来描述。 

附图简述 

图1：使用Centriprep浓缩器的分级过程。 

图2：图解描述氧化甘露聚糖中醛残基的定量方法的示意图。 

图3：图解描述用ANTS对氧化甘露聚糖改性。 

图4：图解描述蛋白与氧化甘露聚糖的结合。 

图5：甘露聚糖用异硫氰酸荧光素(FITC)标记并通过流式细胞术测量在各种浓度下与Huh7人肝癌细胞的结合。 

图6：用全甘露聚糖和甘露聚糖级分成熟BMDC。在6(图6A)、24(图6B)和48(图6C)小时的时间点通过流式细胞术测量共刺激分子CD40、CD80和CD86的上调。以各个剂量分析样本。 

图7：用全甘露聚糖、＞1000kDa甘露聚糖级分和>300kDa甘露聚糖级分成熟BMDC。通过流式细胞术测量共刺激分子CD40(图7A)和CD86(图7B)的上调。以各个剂量在48小时的时间点分析样本。 

图8：间苯二酚测定的吸光度与浓度曲线，显示了甘露聚糖级分的不同甘露糖含量。 

图9：ANTS标记的甘露聚糖级分在天然PAGE凝胶上的分析。 

图10：ANTS标记的甘露聚糖级分在SDS-PAGE凝胶上的分析。 

图11：ANTS标记的甘露聚糖级分的扫描SDS-PAGE凝胶，带注释的Rf。 

图12：通过Quantity one软件产生的标准曲线。 

图13：基于蛋白标准物的相对分子量。 

图14：基于碳水化合物标准物的相对分子量。 

图15：全甘露聚糖和与MUC1-FP结合的甘露聚糖级分在SDS-PAGE凝胶上的分析。星号表示加入了与全甘露聚糖-MUC1-FP结合物相同比例的MUC1-FP:甘露聚糖的结合物。 

图16：在第0、10、17天用10μg MUC1-FP、MFP或＞1000MFP免疫的小鼠的脾细胞中的MUC1特异性IFN-γ反应。 

图17：在第0、10、17天用10μg MUC1-FP、MFP或＞1000MFP 免疫的小鼠中的总抗MUC1血清IgG、IgG1和IgG2a。 

图18：供应商的甘露聚糖规格。 

图19A：使用间苯二酚测定分析各批次甘露聚糖。 

图19B：使用间苯二酚测定获得的甘露糖的标准曲线。 

图20：通过在高碘酸氧化后定量醛残基来比较来自Sigma的各批次甘露聚糖。 

图21：与ANTS反应的各批次甘露聚糖的荧光-浓度曲线。 

图22：FP与>1000kDa氧化甘露聚糖的结合。分子量标准物、FP和>1000MFP在SDS-PAGE凝胶(4-20%)上电泳并用考马斯蓝染色。 

图23：召回MUC1特异性T细胞反应。同种异体DC(BC16)用10μg/ml和20μg/ml的>1000MFP或FP脉冲并用于召回CD8(A)和CD4(B)在MUC1-特异性T细胞系中的细胞内IFNγ反应。 

图24：pTrc(MUC1-VNTR)与>1000kDa氧化甘露聚糖的结合。分子量标准物、pTrc和>1000kDa的pTrc在SDS-PAGE凝胶(4-20%)上电泳并用考马斯蓝染色。 

图25：召回MUC1特异性T细胞反应。同种异体DC(BC17A)用20μg/ml和40μg/ml的>1000kDa pTrc或pTrc脉冲并用于召回来自供体BC13的pTrc(MUC1)-特异性T细胞系中的CD8细胞内IFNγ反应。 

图26：召回MUC1特异性T细胞反应。自体DC用20μg/ml的>1000kDa氧化甘露聚糖-pTrc或pTrc脉冲并用于召回来自供体BC17K的MFP-特异性T细胞系中的CD8细胞内IFNγ反应。 

图27：MART-1与>1000kDa氧化甘露聚糖结合。分子量标准物、MART-1、>1000甘露聚糖-MART-1在SDS-PAGE凝胶(4-20%)上电泳并用考马斯蓝染色。 

图28：引发MART-1特异性反应(1刺激)。如实施例1中描述的，来自供体BC28的PBMC用MART-1蛋白或MART-1>1000kDa氧化甘露聚糖结合物初次免疫。显示了通过MART-1类似物和类似肽脉冲的T2细胞召回MART-1特异性CD8细胞内IFNγ反应。 

图29：引发MART-1特异性反应(2刺激)。如实施例1中描述的，来自供体BC28和BC29的PBMC用MART-1蛋白或MART-1>1000kDa氧化甘露聚糖结合物初次免疫。显示了通过MART-1蛋白和>1000kDa氧化甘露聚糖结合物召回MART-1特异性CD8细胞内IFNγ反应。 

图30：对H1N1和H1N1+>1000kDa甘露聚糖的混合物的H1N1-特异性抗体反应。在第0和14天用单独或与>1000kDa甘露聚糖混合的1μg H1N1鼻内免疫小鼠。在最后一次免疫之后十天，收获血清样本和肺洗涤样本并通过ELISA测定测试抗H1N1IgG1、IgG2a和IgA活性。 

序列表信息

SEQ ID NO：1：对Melan/MART-1特异性的HLA-A2表位肽(天然) 

SEQ ID NO：2：对Melan/MART-1特异性的HLA-A2表位肽(类似物) 

发明详述 

一般技术和定义

除非另有明确定义，本文使用的所有技术和科学术语须被视为具有与本领域(例如，细胞培养、分子遗传学、疫苗技术、免疫学、免疫组织化学、蛋白化学和生物化学)普通技术人员通常理解的相同含义。 

除非另有说明，本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员公知的标准程序。这种技术在以下来源的文献中全面描述和解释：例如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)，Maniatis等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1982)，J.Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编者),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,第1和2卷,IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编者),DNA Cloning:A Practical Approach,第1-4卷,IRL Press(1995和1996)，F.M.Ausubel等(编者),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括至今的所有更新)，E.Harlow和D.Lane(编者),Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory(1988)，以及J.E.Coligan等(编者),Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(1991，包括至今的所有更新)。 

如本文所用，“约”或“大约”通常是指在给定值或范围的20%之内，更优选在10%之内，并且甚至更优选在5%之内。 

术语“和/或”，例如“X和/或Y”，应理解为是指“X和Y”或“X或Y”并且须被视为提供对两种含义或任一含义的明确支持。 

“受试者”可以在用本发明组合物施用时免疫反应被诱导和/或增强的任何生物体。在一个优选的实施方案中，受试者动物，更优选为哺乳动物或鸟。在一个特别优选的实施方案中，受试者是人。其他优选的实施方案包括伴侣/家养动物，例如猫和狗；家畜动物，例如马、 牛、绵羊、猪和山羊、家禽或野生动物。 

甘露聚糖和其他含有甘露糖的碳水化合物聚合物

令人惊讶的是，本发明人发现，高分子量甘露聚糖(即，大于约1000kDa)具有比较小甘露聚糖或其混合物更高的免疫刺激活性。因此，本发明组合物包含甘露聚糖，其中组合物中甘露聚糖的至少75%、更优选至少80%、更优选至少90%、更优选为至少95%、更优选至少97%、更优选至少99%和甚至更优选全部大于约1000kDa。 

令人惊讶的是，本发明人还发现，具有至少150个醛基的氧化甘露聚糖具有比含有少于150个醛基的氧化甘露聚糖或其混合物更高的刺激活性。因此，本发明组合物包含甘露聚糖，其中组合物中甘露聚糖的至少75%、更优选至少80%、更优选至少90%、更优选为至少95%、更优选至少97%、更优选至少99%、和甚至更优选全部各自具有至少150个醛基。 

如本文所用的“甘露聚糖”指仅由甘露糖形成的直链或支链多糖，而不指改性多糖，例如，乙酰化的甘露糖(乙酰甘露聚糖)或具有甘露糖主链但非甘露糖侧基的取代甘露聚糖(例如由甘露糖主链与半乳糖侧基组成的半乳甘露聚糖)。 

适用于本发明组合物的甘露聚糖存在于例如真菌，更优选为酵母。在来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(面包酵母)的支链甘露聚糖中，甘露聚糖由α-(1→6)连接的吡喃甘露糖基主链结构组成，在O-2原子上被α-D-吡喃甘露糖基、α-D-吡喃甘露糖基-α-(1→2)-α-D-吡喃甘露糖基和α-D-吡喃甘露糖基α-(1→3)-α-D-吡喃甘露糖基-(1→2)-α-D-吡喃甘露糖基的侧链取代。此外，酿酒酵母甘露聚糖也可以被磷酸化(Barreto-Bergter and Gorin,1983;Vinogradov等,1998)。 

甘露聚糖优选分离自真菌、更优选酵母的细胞壁。在一个实施方案中，甘露聚糖可以分离自遗传修饰的酵母，该遗传修饰的酵母已经 被工程化为优先表达高分子量甘露聚糖，优选大于1000kDa的甘露聚糖。 

可通过氧化从例如酵母获得的甘露聚糖来产生包含醛基的甘露聚糖。将醛引入碳水化合物聚合物的最常用方法是通过高碘酸盐介导(NaIO₄)的邻二醇的氧化(参见图2的图解)。对于其他氧化方法，一般参见M.L.Wo lfrom(编者)，Periodate oxidation of carbohydrates,Advances in Carbohydrate Chemistry,第11卷,第1-40页(1956)。 

在一个优选的实施方案中，使用NaIO₄氧化甘露聚糖以产生多醛，其然后与至少一种抗原或其编码核酸结合。 

在一个实施方案中，高分子量的甘露聚糖(即，大于约1000kDa)通过来自例如酵母例如酿酒酵母的全甘露聚糖提取物的大小分级获得。在该实例中，全甘露聚糖可以通过本领域已知的方法从酿酒酵母获得，所述方法包括培养细胞或喷雾干燥细胞的热水提取以及溶剂提取方法。来源于酿酒酵母的甘露聚糖可以获自供应商，例如Sigma(St.Louis,MO)，并且在一个实施方案中，随后分级以得到高分子量甘露聚糖组合物。 

在一个实施方案中，高分子量甘露聚糖组合物基本上不含核糖、核酸、核糖核酸、蛋白和/或其他碳水化合物。 

本发明的方法涉及制备本发明的组合物和更一般地包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物。 

如本文所用，“含有甘露糖的碳水化合物聚合物”是任何多亚基化合物，所述化合物包含甘露糖亚基(即，甘露糖单体单元)或其变体，或者由甘露糖亚基(即，甘露糖单体单元)或其变体组成。实例包括但不限于甘露聚糖、半乳甘露聚糖和乙酰甘露聚糖。在一个实施方案中，碳水化合物聚合物包含醛基。在一个优选的实施方案中，氧化碳水化合物聚合物以产生聚醛。 

含有甘露糖的碳水化合物聚合物的制备

碳水化合物和糖的分离方法是本领域中公知的(一般参见Z.ElRassi(编者),Carbohydrate analysis by modern chromatography and electrophoresis,Journal of Chromatography,第66卷,Elsevier Science(2002))。 

大小分级 

在一个实施方案中，通过还称为交叉流过滤(CFF)的切向流过滤(TFF)进行包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物、更优选包含甘露聚糖的组合物的大小分级。TFF是使产品流(进料)沿膜表面切线定向的过程，大部分溶液循环回到进料罐。进料溶液横过膜的快速流动起“扫”表面的作用，降低浓差极化(膜表面的产品浓度)。它还防止污垢积聚，污垢可以堵塞膜表面的孔。快速横流产生压力降，这迫使一些进料溶液和小于膜孔的溶解分子穿过膜滤器。穿过膜的溶液被称为滤液或渗透液。大于膜孔的分子或颗粒保留在进料溶液中并有效浓缩。 

膜过滤可以归类为“微滤”或“超滤”过程。孔径通常在0.1微米和1微米之间的微滤膜一般用于澄清、灭菌和除去微粒或用于细胞收集。具有小得多的0.001和0.1微米之间孔径的超滤膜用于使溶解分子(蛋白、肽、核酸、碳水化合物和其他生物分子)浓缩和脱盐、交换缓冲液、分级和水纯化。超滤膜通常根据分子量截留(MWCO)而非孔径来分类。 

在另一个实施方案中，通过尺寸排阻色谱进行包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物的大小分级。 

尺寸排阻色谱的基本原理是本领域技术人员公知的并在“Gel filtration:Principles and Methods,GE Healthcare”中解释。用于分级特定范围的适合柱可以被容易地选择并有效用于拆分上述级分，例如 Sephacryl S-100HR、Sephacryl S-200HR、Sephacryl S-300HR、Sephacryl S-400HR和Sephacryl S-500HR或其等效物。以类似的方式，可以使用琼脂糖介质或其等效物，例如琼脂糖6B、4B、2B。在一个实施方案中，使用Sephacryl S-400HR分级包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物。 

在又一个实施方案中，通过超滤进行包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物的大小分级。 

可以使用具有适当分子质量截留的分子膜进行样本的超滤。用于实现分级的特定膜和程序是本领域技术人员普遍可获得的。 

本领域技术人员也将理解，包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物的大小分级也可以通过密度梯度离心进行。 

在优选的实施方案中，样本在分级之前被至少部分纯化以除去污染物，例如核糖、核酸(包括DNA和RNA)、蛋白和/或不包含甘露糖的碳水化合物。可以与其他色谱技术组合实现纯化，所述色谱技术包括亲和色谱、离子交换色谱和疏水性相互作用色谱。如下所述，可以通过测量其甘露糖含量来测定组合物纯度。 

去除非碳水化合物组分一种方法是使用消化酶切割非碳水化合物组分，然后通过大小分级除去切割的产物。包括链霉蛋白酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶和蛋白酶的消化酶是本领域众所周知的，并在各种教科书中描述，教科书的一个实例是Maniatis等(1982)，同上。适用于消化蛋白的蛋白酶包括内肽酶和外肽酶、链霉蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶)、巯基蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)和需要钙的蛋白酶(例如嗜热菌蛋白酶)。 

或者，非碳水化合物组分可通过亲和色谱法除去，例如，通过使用DNA或RNA结合基质(Maniatis等，1982，同上)。另一个选择是通过使用多糖结合基质(例如凝集素)使碳水化合物聚合物与污染组 分纯化分离。 

根据本发明方法，可以测定选定级分中的包含甘露糖的碳水化合物聚合物的大小分布、醛和/或甘露糖含量。该验证可能在获得用于人类的监管批准方面是重要的。 

大小分布 

可以测定样本在分级之前和/或之后的大小分布。当在分级之前进行时，这种分析有助于用于分级的碳水化合物聚合物的起始组合物的选择。例如，如果起始组合物中聚合物的大部分分子量种类低于1000kDa，则可以弃掉该组合物并选择高分子量种类的碳水化合物聚合物分布较高的另一批进行分级。相反，分析回收级分的大小分布的作用是证实或验证分级方法。这在获得这些碳水化合物聚合物用于人类的监管批准时将是重要的。 

通过使氧化样本与ANTS反应(参见图3的图解)，并通过SDS-PAGE拆分ANTS标记样本，可以测定组合物的碳水化合物聚合物的大小分布。拆分的ANTS标记样本与蛋白和/或碳水化合物标准物的对比将允许测定所述样本的大小分布。 

如本文所用的“蛋白和/或碳水化合物标准物”指各种分子量的已知蛋白或碳水化合物的组合物，在SDS-PAGE中用作分子量标准物。该组合物被设计为产生尖锐的良好分离的条带，用作估计同一凝胶相邻泳道中电泳的样本的分子量的标志。标准物可被预先染色(以允许在电泳过程中容易观察分子量范围)或未染色。用于电泳应用的许多标准物是可获得的，并且可购自例如Invitrogen或Bio-rad。通常，标准物以即用形式提供，不需要还原、预混或添加负载染料。这些标准物的批号间是一致的，并且基于适当凝胶而严格控制质量，以确保一致的条带迁移和强度。 

醛含量 

还可以在分级之前和/或后进行测定样本的醛含量，以帮助批次的选择和/或级分验证。 

在一个实施方案中，在用NaIO₄氧化之后，通过定量样本中的醛残基数目来测定样本的醛含量。例如，如果甘露聚糖各自包含约90-200个醛残基，则可以选择包含这种甘露聚糖的组合物用于分级。 

该方法包括首先氧化样本，例如，通过在黑暗的冰上使1.4mg样本在100μl的0.1M磷酸盐缓冲液pH6.0中与0.01M NaIO₄反应1小时。然后将反应用10μl乙二醇猝灭，并在加载至PD1O柱之前允许反应另外1/2小时，PD1O柱用0.1M醋酸盐缓冲液pH4.8预平衡以除去过量的NaIO₄。 

随后可以通过分光光度法测量醛基数目，通过测量用PDPH处理时吡啶-2-硫酮的释放。 

如本领域技术人员所理解的，可以使用几种其他方法定量醛。例如，肟、酰肼、氨基脲和碳酰肼容易与醛反应并且可以连接至报道分子(例如，荧光化合物)以定量碳水化合物聚合物中的醛基。可以使用的荧光化合物的选择细节在www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook/Reagents-for-Modifying-Groups-Other-Than-Thiols-or-Amine s/Hydrazines-Hydroxylamines-and-Aromatic-Amines-for-Modifying-Ald ehydes-and-Ketones.html。实例包括荧光素-5-氨基硫脲、Alexa Fluor488、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647和Texas Red。 

此外，2,4-二硝基苯肼与醛反应生成红色的腙，这也可以用于通过分光光度法定量碳水化合物聚合物中的醛基数目(Apostolopoulos等，2000年)。 

甘露糖含量 

在一个实施方案中，通过对中性糖的比色测定来测定组合物中的甘露糖含量，其中中性糖与间苯二酚在水合硫酸溶液存在下反应。 

例如，向含有在200μl体积中具有5nmol至100nmol中性糖的样本(溶解在0.01M乙酸中)的测定管添加200μl6mg/ml间苯二酚和1ml75%硫酸。然后，涡旋该溶液，并在温度被调节的水浴中90℃下加热30分钟，并随后在黑暗冷水浴中放置30分钟。然后，在430或480nm测定混合物的光密度。可以通过使用上述体积的一半进行相同测定，具有相似结果。 

或者，可以微量滴定板形式进行该测定。在该实施方案中，20μl6mg/ml间苯二酚和100μl 75%硫酸和50μl原始物(pristine)被添加到96孔微量滴定板的U形孔，该孔含有在20μl体积中具有1nmol至100nmol中性糖的样本(溶解在0.01M乙酸中)。然后用涡旋设备振动板来混合溶液并在孵育箱中90℃下加热30分钟，并随后在黑暗中室温保持30分钟。然后使用微量滴定板读数器在430或480nm处测定混合物的光密度。为了定量目的，一式两份、更优选一式三份、更优选一式四份地测定空白、中性糖标准物和样本。 

甘露糖含量也可以通过以下来测定：酶或酸水解碳水化合物聚合物，然后通过HPLC、质谱、毛细管电泳或薄层色谱来分析(Wang等,2007;Anumula,1994;R.Townsend,Chromatography in Biotechnology,C.Horvath和L.S.Ettre(编者),American Chemical Society,Washington,D.C.(1993)pp.86-101)。 

免疫刺激组合物和疫苗组合物

如本文所用，术语“免疫刺激组合物”指组合物诱导和/或增强免疫反应的能力。 

术语“免疫反应”具有其在本领域中的普通含义，并且包括体液免疫和细胞免疫。免疫反应可以表现以下的一种或多种：抗抗原抗体的 发展，抗原特异性T细胞的扩增，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的增加；抗肿瘤或抗肿瘤抗原延迟型超敏(DTH)反应的发展，病原体的清除，病原体和/或肿瘤生长和/或扩散的抑制，肿瘤缩小，转移的减少或消除，复发时间增加，无病原体或肿瘤的存活时间增加，和存活时间增加。免疫反应可以由以下的一种或多种介导：B细胞激活，T细胞激活，自然杀伤细胞激活，抗原呈递细胞(例如，B细胞、DC、单核细胞和/或巨噬细胞)的激活，细胞因子生成，趋化因子生成，特定细胞表面标志物的表达，特别是共刺激分子的表达。免疫反应的特征可以是体液、细胞、Th1或Th2反应或其组合。 

体液反应 

在一个实施方案中，施用组合物或疫苗导致体液反应，其中刺激IgA、IgG、IgM和任选地IgE抗体生成的一种或多种。 

免疫球蛋白可以包括每一类抗体中的亚类的一种或多种，例如IgG2a和IgG1。 

在一个实施方案中，刺激IgG1和/或IgA生成。 

在某些情况下，IgE生成的刺激可能是有益的，例如，使对蠕虫感染免疫。 

在其他情况下，总IgE生成的减少或者IgE水平相对于其他抗体类别的减少可能是有益的，例如防止或减少I型超敏反应或特应性，例如枯草热、哮喘发作或食物和其他过敏症。IgE与其受体的结合和随后与变应原的交联负责触发免疫反应的潜在病症，例如哮喘(包括特应性哮喘)、过敏性鼻炎和特应性皮炎，这些是流行病程度的健康问题。因此，在一个实施方案中，免疫反应使得IgE生成减少。 

在另一实施方案中，相对于IgA、IgG、IgM或它们的子类的一种或多种，IgE滴度降低。在用组合物免疫时，IgE生成可能是不变的，而其他抗体的一种或多种的生成增加。 

在一个实施方案中，相对于IgE，免疫选择性刺激IgA、IgG和IgM的一种或多种的生成。 

在一个实施方案中，刺激IgA生成，并且在一个或多个粘膜区和/或血清中的IgA滴度增加。 

在一个实施方案中，免疫后IgA生成与IgG、IgM和IgE的生成相比更多。 

在另一实施方案中，免疫导致IgA生成相对于IgG1和/或IgG2a生成的增加更多。 

在又一个实施方案中，刺激IgG生成，并在一个或多个全身区域和/或血清中的IgG滴度增加。 

在一个实施方案中，免疫后IgG生成与IgA、IgM和IgE的生成相比更多。 

在另一个实施方案中，免疫导致IgG生成相对于IgA的增加更多。 

在一个实施方案中，免疫导致IgG2a生成相对于IgG1的增加更多。 

细胞免疫反应 

在一个实施方案中，施用本发明组合物或疫苗导致细胞反应，其中一种或多种抗原呈递细胞被激活。 

在一个实施方案中，巨噬细胞和/或DC被激活。 

DC的激活可以导致共刺激分子(包括例如CD40、CD80和86)升高的表面表达和/或促炎细胞因子(例如IL-12和/或IL-4)的增加和/或I类和/或II类MHC分子的增加。 

在一个进一步的实施方案中，免疫导致CD8和/或CD4T细胞反 应。 

在一个进一步的实施方案中，免疫导致细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的产生。 

在一个实施方案中，DC激活幼稚T细胞。认为树突细胞在针对疫苗抗原启动免疫系统中发挥至少三种不同的作用： 

1)内吞后以外源途径加工的疫苗抗原的II类MHC限制的呈递， 

2)在用例如编码抗原的质粒DNA直接转染DC后抗原的I类和/或II类MHC限制的呈递， 

3)疫苗抗原的I类MHC限制的“交叉”呈递。 

Th1/Th2 

在一个实施方案中，本发明的组合物或疫苗的施用刺激体液和/或细胞免疫的介质。 

在一个实施方案中，本发明的组合物或疫苗的施用导致细胞介导的Th1型反应。 

在另一个实施方案中，本发明的组合物或疫苗的施用导致抗体介导的Th2型反应。 

在一个实施方案中，本发明的组合物或疫苗的施用导致Th1诱导细胞因子(例如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IFN-γ)的生成。通常，这些细胞因子促进细胞介导的免疫。 

在另一个实施方案中，本发明的组合物或疫苗的施用导致Th2诱导细胞因子(例如IL-4、IL-5和IL-10)的生成。通常，这些细胞因子促进体液免疫。 

在一个实施方案中，巨噬细胞的激活导致IL-12和/或IL-18的生 成。这反过来又可以通过NK细胞激活IFN-γδ生成，诱导分化为Th1介导的免疫反应，其支持细胞介导的免疫和/或补体固定抗体的生成。 

疫苗 

术语“疫苗组合物”指可以用来在接受者中引发保护性免疫的组合物。应注意有效性，本发明疫苗可以在一部分群体中引发免疫性，因为一些个体可能未能达到强大或保护性免疫反应或者在某些情况下对疫苗的任何免疫反应。这种失效可能源于个体的遗传背景，或者因为免疫缺陷病症(后天的或先天的)或免疫抑制(例如，免疫抑制性药物治疗以防止器官排斥或抑制自身免疫性病症)。可以在动物模型中确立效力。 

疫苗可以是“单价”(也称为一价)或“多价”(也被称为多价)。单价疫苗包含单一抗原。多价或多价疫苗包含两种或更多种抗原，其可以例如使针对相同病原体的两种或更多种菌株或针对两种或更多种病原体的免疫。 

可以使用组合物或疫苗针对例如病原体或肿瘤来免疫、耐受、治疗或保护受试者。 

术语“免疫”在本文用来指在受试者中产生保护性免疫反应，为受试者提供针对特定病原体或疾病的抗性。 

术语“耐受”在本文用来指在受试者中诱导免疫耐受性。使受试者耐受是在受试者中诱导对特异性免疫反应的避免或抑制。免疫耐受可用于预防或改善例如移植排斥、自身免疫性或变态反应。 

“治疗”在本文用来指部分或全部地破坏受试者中病原体感染的细胞或肿瘤细胞，优选对非感染细胞具有最小的破坏作用。本发明组合物的治疗性施用可以治疗病原体感染的接受者或患有癌症的接受者。在一个替代的实施方案中，抗原呈递细胞，例如巨噬细胞和DC，在体外或离体与本发明组合物接触，然后施用给受试者。如本领域技 术人员知道的，在体外进行的程序不是在活生物体中而是在受控环境中进行。这种体外程序可以针对来源于生物体的组织或细胞进行，并且通常被称为离体程序。 

术语“保护”在本文用来指防止病原体感染或肿瘤生长的开始(即，防止癌症发生)或延缓肿瘤生长的发生。本发明组合物的预防性施用可以保护接受者免受所述感染或肿瘤生长。 

抗原 

本发明提供与至少一种抗原组合的甘露聚糖在疫苗组合物中的用途。甘露聚糖可以与至少一种抗原混合或结合以在接种疫苗后产生保护性免疫反应。 

“至少一种抗原”是指一个或多个抗原类型或抗原决定簇。另外，本领域技术人员将理解，多于一种抗原分子可以与甘露聚糖聚合物结合(即，结合物可以包括与甘露聚糖聚合物结合的多于单个抗原，并且可以包括一个或多个抗原类型或抗原决定簇)。 

该疫苗可以施用给患有疾病或者易患疾病或处于疾病风险的受试者。在该实施方案中，疫苗施用可以防止或改善病原体感染的效应。 

如本文所用，“抗原”指具有诱导特异性免疫反应的能力的物质。抗原可以是在其生命周期的任何阶段的完整生物体、灭活的完整生物体、从完整生物体分离的片段或组分、生物体裂解物或肿瘤裂解物、通过本领域已知方法遗传上或合成上工程化的特异性抗原。此外，选定的抗原可以源自成熟的完整生物体或孢子体(卵囊)的任一种或两者。 

用于本发明组合物和方法的抗原还可以由完整细胞或其亚细胞级分组成。这种细胞或其亚细胞级分可以源自例如肿瘤或感染组织。 

优选的抗原包括例如来自以下的抗原： 

花粉； 

变应原，特别是诱发哮喘的那些； 

病毒，例如流感病毒、猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒、HIV-1、HIV-2、狂犬病病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒、口蹄疫病毒、乳头状瘤病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HTLV-1和HTLV-2； 

细菌，例如炭疽、麻风病、结核病、白喉、莱姆病、梅毒、伤寒和淋病的病原体； 

原生动物，例如牛焦虫(Babeosis bovis)、疟原虫(Plasmodium)、利什曼原虫(Leishmania spp.)、弓形虫(Toxoplasma gondii)和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)； 

真菌，例如曲霉菌(Aspergillus sp.)、白色念珠菌(Candida albicans)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)； 

寄生虫，例如蠕虫；和 

肿瘤抗原，例如粘蛋白-1(MUC-1)、癌胚抗原、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、蛋白MZ2-E、多形上皮粘蛋白(PEM)、叶酸结合蛋白LK26、截短的表皮生长因子受体(EGRF)、Thomsen-Friedenreich(T)抗原、端粒酶、存活蛋白、Melan-A/MART-1、WT1、LMP2、人乳头状瘤病毒(HPV)E6E7、人表皮生长因子受体(HER-2/neu)、独特型、黑色素瘤相关抗原3(MAGE-3)、p53、NY-ESO-1、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、癌睾丸抗原、5T4、以及GM-2和GD-2神经节苷脂。 

该抗原可以是蛋白、肽、多糖或寡糖(单独或与蛋白载体结合)或其混合物。蛋白和肽可以是提取物或裂解物的一部分，从天然来源纯 化的，通过固相合成合成的，或者可以通过重组遗传学获得。多糖和寡糖可以从天然来源分离，或者可以使用酶程序和/或有机合成方法来合成。 

抗原可以形成融合蛋白的一部分，以促进融合蛋白在重组宿主细胞中的表达和产物纯化。融合蛋白的非抗原部分一般代表融合多肽的N-末端区域，羧基末端序列包含抗原序列。融合蛋白可以选自谷胱甘肽-S-转移酶、β-半乳糖苷酶或任何其他蛋白或其部分，特别是那些能够实现亲和纯化的特性的那些，亲和纯化利用蛋白的结合或其他亲和特性来纯化得到的融合蛋白。蛋白也可以与载体蛋白的C-末端或N-末端融合。融合蛋白的性质将取决于在其中产生融合蛋白的载体系统。细菌表达载体的一个例子是pGEX，pGEX在感兴趣基因亚克隆入该载体中时产生由谷胱甘肽-S-转移酶与感兴趣蛋白组成的融合蛋白。产生具有感兴趣蛋白的融合蛋白的其他载体系统的例子描述于Sambrook等，1989，同上。 

或者，任选地偶联至蛋白载体的合成肽或多肽可用于本发明。合成肽或多肽可以按照标准方法生成。 

有用的肽或多肽可以包括已知当完整多肽被施用给动物时引发抗体和/或抗原特异性CTL反应的多肽的表位携带部分。这种多肽部分的表位是多肽的免疫原性或抗原性表位。 

“免疫原性表位”被定义为当完整蛋白是免疫原时引发抗体和/或抗原特异性CTL反应的蛋白部分。另一方面，蛋白分子中抗体或MHC分子可以结合的区域被定义“抗原性表位”。蛋白的免疫原性表位的数目一般小于抗原性表位的数目。 

关于携带抗原性表位的肽或多肽的选择，该领域公知的是，模拟蛋白序列的一部分的相对短的合成肽通常引发与部分模拟的蛋白反应的抗血清(参见，例如，Sutcliffe等，1983)。能够引发蛋白反应性血清的肽经常以蛋白的一级序列表示，可以由一组简单的化学规则表 征，并且既不局限于完整蛋白的免疫显性区域(即，免疫原性表位)也不限于氨基或羧基末端。 

本发明的携带抗原性表位的肽和多肽优选包括在特定多肽的氨基酸序列中含有的至少7个、更优选至少9个和最优选约15至30个氨基酸的序列。 

由CTL上的T细胞受体识别的表位可能不同于抗体发现的那些。通常，CTL识别结合至I类MHC分子并暴露在细胞表面上的肽(源自细胞质中隔室中酶促降解的蛋白)。这些CTL识别的肽根据MHC等位基因特异性序列基序选择性结合I类MHC分子。这些肽可以通过表达克隆来鉴定(参见van der Bruggen，等，1991)并利用各种I类和II类结合肽算法来预测(Pietersz等，2006年)。 

或者，CTL识别的肽可以通过源自用于免疫的蛋白抗原的肽在体外或离体刺激对细胞毒性T淋巴细胞的诱导来鉴定。本发明的携带特定CTL识别表位的肽和多肽优选是至少6个氨基酸且更优选是约7至20个氨基酸的序列。 

携带表位的肽和多肽可通过任何常规方法产生。 

细菌抗原 

抗原可以源自细菌，包括但不限于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、链球菌(Streptococcus spp.)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、沙门氏菌 (Salmonella spp.)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、鼠疫巴德氏菌(Pasteurella pestis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、弯曲杆菌(Campylobacter spp.)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、梭状芽孢杆菌(Clostridium spp.)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、分枝杆菌(Mycobacterium spp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、梅毒螺旋体菌(Treponema spp.)、疏螺旋体(Borrelia spp.)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、钩端螺旋体(Leptospira spp.)、杜克雷嗜血杆菌(Hemophilus ducreyi)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、副百日咳杆菌(Bordetella parapertussis)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、流感嗜血杆菌(hemophilus influenza)、大肠杆菌(Escherichia coli)、志贺氏菌(Shigella spp.)、埃利希氏体(Erlichia spp.)和立克次氏体属(Rickettsia spp.)。 

细菌的抗原可以是天然的、重组的或合成的。这样的细菌抗原包括但不限于来自细菌的与细胞表面上呈递的碳水化合物决定簇结合的选择蛋白或凝集素，和细菌的蛋白受体，所述蛋白例如纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白。 

病毒抗原 

抗原可以源自病毒，包括但不限于流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒、麻疹病毒、风疹病毒、水痘带状疱疹病毒、疱疹病毒(人类和动物)、单纯疱疹病毒、细小病毒(人类和动物)、巨细胞病毒、肝炎病毒、人类乳头状瘤病毒、甲病毒、黄热病病毒、布尼亚病毒、狂犬病病毒、沙粒病毒、丝状病毒、HIV1、HIV2、HTLV-1、HTLV-II、FeLV、牛LV、FeIV、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、猫杯状病毒、猫鼻气管炎病毒、TGE病毒(猪)和口蹄疫病毒。 

病毒抗原可以是天然、重组的或合成的。这样的病毒抗原包括但 不限于负责附着到细胞表面受体以启动感染过程的病毒蛋白，例如(i)逆转录病毒(HIV、HTLV、FeLV和其他)和疱疹病毒的包膜糖蛋白，和(ii)流感病毒的神经醇胺酶。 

肿瘤抗原 

在本发明的一个实施方案中，受试者患有癌症或者处于发展癌症的增加的风险。 

“癌症”是指各种恶性肿瘤，特征是有能力侵入周围组织和/或转移到新部位的细胞增殖。癌症可以是例如乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌或肺癌。在一个优选的实施方案中，癌症是乳腺癌。 

癌症的许多“风险因素”是众所周知的，例如家族癌症史、个人癌症史、以前增生性疾病(例如非典型增生)的活组织检查检测。特定的遗传风险因素也是已知的，乳腺癌的实例包括BRCA1、BRCA2、ATM、CHEK-2和p53突变。还可以考虑生活方式相关的风险因素。乳腺癌的生活方式相关风险因素包括直到30岁以后的推迟生育和长期使用激素替代疗法。熟练的医疗从业者可以评价这些和其他风险因素，以确定受试者是否将受益于本发明疫苗组合物的预防性使用。 

本发明癌症疫苗可以包括一种或多种肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原可以是天然的，重组的或合成的。这样的肿瘤相关抗原包括但不限于MUC-1及其肽片段、蛋白MZ2-E、多形上皮粘蛋白、叶酸结合蛋白LK26、MAGE-1或MAGE-3及其肽片段、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其肽片段、癌胚抗原(CEA)及其肽片段、甲胎蛋白(AFP)及其肽片段、胰腺癌胚胎抗原及其肽片段、CA125、15-3、19-9、549、195及其肽片段、前列腺特异性抗原(PSA)及其肽片段、前列腺特异性膜抗原(PSMA)及其肽片段、鳞状细胞癌抗原(SCCA)及其肽片段、卵巢癌抗原(OCA)及其肽片段、胰腺癌相关抗原(PaA)及其肽片段、Her1/neu及其肽片段、gp-100及其肽片段、突变K-ras蛋白及其肽片段、突变p53及其肽片段、非突变p53及其肽片段、截短的表皮生长 因子受体(EGFR)、嵌合蛋白p210BCR-ABL、端粒酶及其肽片段、存活蛋白及其肽片段、Melan-A/MART-1蛋白及其肽片段、WT1蛋白及肽片段、LMP2蛋白及肽片段、HPV E6E7蛋白及肽片段、HER-2/neu蛋白及肽片段、独特型蛋白及肽片段、NY-ESO-1蛋白及肽片段、PAP蛋白及肽片段、癌症睾丸蛋白及肽片段和5T4蛋白及肽片段。Cheever等，2009描述了其他示例性的肿瘤抗原。 

粘蛋白 

在一个优选的实施方案中，抗原是粘蛋白或其抗原性片段或免疫原性突变体/衍生物。许多癌症伴随人类粘蛋白的过量生成。粘蛋白是高度糖基化的蛋白(大于约100kDa)，其由许多上皮细胞和肿瘤产生。癌细胞上发现的粘蛋白在某些方面不同于正常上皮细胞上的粘蛋白，因为一些粘蛋白在其碳水化合物包衣方面存在缺陷，使蛋白核心暴露。有21种形式的已知人类粘蛋白，命名为MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5、MUC-6和MUC-7等。MUC-1是最普遍存在的。各种粘蛋白都具有非常相似的性质，即，它们是跨膜糖蛋白，都具有可变数目的重复氨基酸序列，该重复氨基酸序列具有高含量的丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸。异常糖基化的粘蛋白(非糖基化或糖基化缺陷)的过量生成是乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、结肠肿瘤、肺肿瘤、前列腺癌肿瘤和其他分泌组织肿瘤的特征。人类粘蛋白MUC-1至MUC-21各自的蛋白核心的的cDNA序列已被克隆和表征，并且已经被发现包括不同数目的特定氨基酸基序重复序列的高度重复中央部分(被称为VNTR)。作为例子，MUC-1由独特的氨基末端序列和羧基末端序列组成，氨基末端序列和羧基末端序列被含有40至80个串联排列的20个氨基酸基序的拷贝或重复序列的高度重复中央部分分开。 

在一个实施方案中，肿瘤相关抗原是人类粘蛋白MUC-1至MUC-21中的任何一个或多个，如上所述，全部包括富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸的重复氨基酸序列的高度重复中央部分。具体地，本发 明疫苗可以包括人类粘蛋白多肽(包含具有正常等位基因变化的可变数目的重复序列)，或者可以包括人类粘蛋白重复序列的一个或多个，优选2至80、更优选2至20和甚至更优选2至10个人类粘蛋白的重复亚基。人类粘蛋白及其亚基优选是非糖基化或异常糖基化的，以激发对癌细胞上存在的粘蛋白的免疫反应，所述癌细胞的碳水化合物包衣存在使蛋白核心暴露的缺陷。人类粘蛋白MUC-1的使用是特别优选的，但要清楚理解，本发明延伸到任何抗原的使用，尤其是人类粘蛋白MUC-1至MUC-21的使用。 

MUC-1抗原可以如以下描述：例如，WO95/108145、US6,054,438、US6,222,020、WO98/50527、WO01/18035、WO00/63363、 WO95/03825、WO00/06723和WO04/016643。还考虑WO2008/011672中公开的MUC-1T细胞表位衍生肽或肽类似物的使用。 

甘露聚糖抗原结合物 

当至少一种抗原与甘露聚糖结合时，可以增加所述至少一种抗原向例如巨噬细胞和DC的递送。虽然不希望被理论所限制，但这最可能是因为巨噬细胞和DC具有识别碳水化合物部分(通常来自微生物)并介导抗原呈递中涉及的两个过程吞噬作用及胞饮作用的细胞表面受体。因此，本发明甘露聚糖-抗原结合物提供了用于APC靶向的有效机制。 

在一个优选的实施方案中，甘露聚糖的多糖链在与至少一种抗原结合之前用例如NaIO₄氧化(参见图4的图解)。在一个实施方案中，至少一种抗原以WO95/18145中描述的类似方式与氧化甘露聚糖结合。也可以使用还原甘露聚糖，并且可以通过向氧化甘露聚糖-抗原结合物添加硼氢化钠或氰基硼氢化钠来制备含有还原甘露聚糖的组合物。 

在一个替代实施方案中，可以首先用溴化氰激活甘露聚糖的多糖链，然后使激活的多糖链与二胺反应，随后与至少一种抗原结合以形 成结合物，然后该结合物可以任选地被氧化。 

甘露聚糖和至少一种抗原可以用双功能剂衍生化以交联甘露聚糖和至少一种抗原。常用的交联剂包括1,1-双(重氮基乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮基水杨酸的酯)、同双官能亚氨酸酯(包括二琥珀酰亚胺酯，例如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-丙酸酯))和双官能马来酰亚胺(例如双-N-马来酰亚氨基-1,8-辛烷)。衍生剂(例如甲基-3-[(对-叠氮基-苯基)二硫代]丙亚胺酸酯)产生可光激活的中间体，其能够在光的存在下形成交联。氧化甘露聚糖可与抗原的肼衍生物反应产生结合物。或者，甘露聚糖可首先与试剂(例如羰基二咪唑)反应，然后与抗原反应，并被氧化产生结合物。 

至少一种抗原与甘露聚糖的偶联涉及碳水化合物上的官能团与抗原上的官能团反应。碳水化合物聚合物充满羟基。这些基团可以根据标准的化学程序被激活。例如，羟基基团可以与卤化氢(例如碘化氢、溴化氢和氯化氢)反应，得到官能化的卤代多糖。羟基可以用三卤化磷、活泼金属(例如乙醇钠，异丙醇铝和叔丁醇钾)激活或酯化(用诸如甲苯磺酰氯或乙酸等基团)，以形成官能团，然后该官能团可以与多肽上的官能团反应形成一个或多个键。 

编码抗原的核酸 

在一个实施方案中，疫苗组合物包括编码抗原的核酸。多种核酸可以被加入疫苗以产生多价抗原疫苗。在一个实施方案中，疫苗是DNA疫苗。 

至少一种核酸可以被连接至甘露聚糖，例如通过聚阳离子，例如聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺或PAMAM树状聚合物。在一个实施方案中，氧化甘露聚糖-聚阳离子的正电荷与带负电荷的DNA相互作用并形成可用于转染的polyplex(Tang等，2008；Tang等，2007；Tang等，2009)。 

DNA接种通常涉及将编码抗原的DNA直接在体内引入例如受试者的肌肉或皮肤，以便由受试者的细胞表达抗原。一旦DNA编码的抗原被转染细胞加工并呈递，可以激发细胞和/或体液免疫反应。DNA疫苗描述于US5,939,400、US6,110,898、WO95/20660和WO93/19183。 

到目前为止，大多数的DNA疫苗在哺乳动物系统中依赖源自巨细胞病毒(CMV)的病毒启动子。这些具有在许多哺乳动物物种中的肌肉和皮肤接种中具有良好效率。已知影响通过DNA免疫引起的免疫反应的因素DNA递送方法，例如，胃肠外途径可以产生低的基因转移率并产生相当大的基因表达变化。使用基因枪高速接种的质粒增强了小鼠的免疫反应，这大概是因为更大的DNA转染效率和更有效的通过DC的抗原呈递。还可以通过本领域已知的其他方法将含有本发明的基于核酸的疫苗的载体引入期望的宿主，所述方法例如转染、电穿孔、显微注射法、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体转染法(溶酶体融合)或DNA载体转运。下文更详细描述了DNA疫苗的施用机制。 

其他组分 

本发明的组合物可包括至少一种药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指当施用给受试者、特别是哺乳动物和更特别是人时不产生变应性、毒性或其他不利反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体可以是固体或液体。药学上可接受的载体的有用实例包括但不限于不影响本发明活性剂活性的稀释剂、赋形剂、溶剂、表面活性剂、助悬剂、缓冲剂、润滑剂、媒介物、乳化剂、吸收剂、分散介质、包衣、稳定剂、保护性胶体、粘合剂、增稠剂、触变剂、穿透剂、螯合剂、等渗剂和吸收延迟剂。 

载体可以是常规使用的那些的任何一种，并且只受化学物理考虑因素(例如溶解度和缺乏与活性剂的反应性)和施用途径的限制。适合 本发明的载体包括常规使用的那些，例如水、盐水、葡萄糖水溶液、乳糖、林格氏溶液、缓冲溶液、透明质酸、二醇、淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇和类似物。也可使用脂质体作为载体。 

可以进一步提高本发明组合物的免疫原性或效力的化合物也可以被包含在其中或与其共同施用。例如，组合物可包括一种或多种油(例如，弗氏完全和不完全的)、皂苷、改性皂苷、脂质体、矿物盐(例如、AlK(SO₄)₂、AlNa(SO₄)₂、AlNH₄(SO₄)、二氧化硅、明矾、Al(OH)₃、Ca₃(PO₄)₂、高岭土和碳)、多核苷酸(例如聚IC和聚AU酸)和某些天然物质(例如脂质A、来自结核分枝杆菌的蜡D以及短小棒状杆菌、百日咳杆菌和布鲁氏菌属成员中存在的物质)、牛血清白蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素、麻仁、钥孔血蓝蛋白、绿脓杆菌毒素A、霍乱类毒素、霍乱毒素、百日咳毒素、病毒蛋白和真核细胞蛋白，例如干扰素、白细胞介素或肿瘤坏死因子。这样的蛋白可以根据本领域技术人员已知的方法从天然来源或重组来源获得。其他已知的免疫原性大分子包括多糖、tRNA、不可代谢的合成聚合物例如聚乙烯基胺、聚甲基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、4',4-二氨基二苯基-甲烷-3,3'-二羧酸和4-硝基-2-氨基苯甲酸的混合缩聚物(具有相对高的分子量)或糖脂、脂质或碳水化合物。 

施用

本发明的组合物或疫苗可以通过适当的途径单独或者与另一化合物组合施用给受试者。 

在一个实施方案中，化合物是抗原或其编码核酸。在一个实施方案中，甘露聚糖和至少一种抗原或其编码核酸在不同的组合物中依次或同时施用。在一个优选的实施方案中，它们在相同的组合物中施用。 

甘露聚糖可与至少一种抗原或其编码核酸混合施用，或者，甘露 聚糖可以与至少一种抗原或其编码核酸结合。 

多种施用途径是可能的，包括但不限于口服、饮食、局部、肠胃外(例如静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、血管内或皮下注射)和吸入(例如支气管内、鼻内或口腔吸入、鼻内滴)施用途径。 

在一个实施方案中，组合物或疫苗被施用至粘膜部位。粘膜部位的实例包括但不限于：呼吸道，例如鼻区域(例如，鼻)、气管、支气管和肺；口腔或口腔组织，包括口服(例如，口和牙龈)和口咽腔；咽喉，包括扁桃体；眼睛的结膜；胃肠道(如食道、胃、十二指肠、小肠和大肠、结肠和直肠)；生殖道/组织(包括但不限于膀胱、输尿管、尿道及相关组织、阴茎、外阴/阴道和宫颈-阴道组织、以及子宫和输卵管)。 

待施用的组合物或疫苗的制剂将根据所选的施用途径而不同(例如，溶液、乳剂、胶囊)。 

可以在生理上可接受的载体中制备组合物或疫苗。对于溶液或乳液，合适的载体包括水溶液或醇/水溶液、乳液或悬液，包括生理盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或固定油。静脉内载体包括各种添加剂、防腐剂或流体、营养素或电解质补充剂和类似物(一般参见Remington's Pharmaceutical Sciences,1985)。对于吸入，可溶性组合物或疫苗可以被加载到合适的施用分配器(例如雾化器、喷雾器或加压气溶胶分配器)。 

通过并入逆转录病毒、腺病毒或其他合适的载体中，或各种其他基于蛋白或脂质的基因递送复合物，以及通过使用促进“裸”多核苷酸递送的技术(例如电穿孔或“基因枪”递送)，可以将编码抗原的核酸直接递送至细胞。或者，可以将核酸引入能够表达供递送的蛋白的宿主细胞中。然后，这些转染或转化的细胞可以有效表达治疗有效量的抗原的量被植入(单独或在隔离装置)、注射或以其他方式引入。 

在一个替代的实施方案中，抗原呈递细胞，例如巨噬细胞和/或DC可以在体外或离体与组合物接触以实现抗原加载，然后被施用给受试者。在一个实施方案中，抗原呈递细胞源自受试者或自体供体并且离体加载抗原。例如，可以从受试者或自体供体取血并通过密度梯度离心富集外周血单核细胞(PBMC)，然后通过与塑料表面的附着而富集单核细胞。然后用细胞因子混合物培养附着细胞，以诱导分化成例如未成熟DC，得到的未成熟DC可以与疫苗抗原和甘露聚糖接触，或者用编码所述抗原的核酸转染。然后，得到的成熟/激活的树突细胞制剂(即，具有上调的共刺激分子CD40、CD80和CD86)的等分试样(例如，冷冻保存的等分试样)可以根据方案确定的时间表通过例如皮内注射施用给受试者。 

组合物或疫苗的施用可以是单次或多次事件，或者可以是初次-加强方案的一部分，这些的组合或这些的每个与其他常规施用/接种方法的组合。例如，初次-加强方案可以包括：通过例如肌内、皮内、血管内、皮下或静脉内施用的初次免疫，和通过例如鼻内、肌内、皮内、血管内、皮下或静脉内施用的加强免疫。初次组合物和加强组合物之一或两者可以包括抗原或其编码核酸以及甘露聚糖。初次免疫组合物和加强组合物之一可以不含甘露聚糖。 

本发明组合物或疫苗对于特定应用有效的施用量和频率将根据本领域已知的因素而变化，所述因素包括但不限于甘露聚糖和/或至少一种抗原或其编码核酸的物理性质和化学性质、载体性质、预期给药方案、受试者免疫系统的状态(例如，抑制、损害、刺激)、施用组合物或疫苗的方法、和施用组合物或疫苗的物种。因此，一般性地设定对所有可能应用有效的甘露聚糖和/或至少一种抗原或其编码核酸的量是不切实际的。量和频率可以由主治医生或兽医来确定。 

施用有效量的组合物。“有效量”是在施用条件下足以实现期望的免疫刺激效果的量。 

作为实例，可以给受试者施用约100ng/kg至约50mg/kg甘露聚糖，优选约10μg/kg至约10mg/kg。甚至更优选地，特别对于人类，预期的剂量为约1mg/kg至约10mK/kg甘露聚糖。 

作为实例，可以给受试者施用约1μg/kg至约10,000μg/kg抗原，优选约5μg/kg到约5000μg/kg、更优选约8μg/kg至约1000μg/kg和最优选约400μg/kg到约600μg/kg。甚至更优选地，特别对于人类，预期的剂量为约100μg/kg至约200μg/kg抗原。 

本发明的组合物和疫苗还可以与其他免疫反应调节剂联合施用给受试者，所述其他免疫反应调节剂例如细胞因子、II类HLA蛋白结合辅助分子、CD40激动剂、检查点受体拮抗剂(例如CTLA-4、PD-1、Stat3)、B7共刺激分子、FLt3激动剂和CD40L激动剂。 

II类HLA蛋白结合辅助分子的存在有效刺激辅助(CD4+)T细胞。II类HLA蛋白结合辅助分子可以是本领域技术人员公知的那些的任何一种，包括例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素或更小的T细胞辅助表位(例如PADRE肽)及其组合。 

可以进一步提高本发明组合物和/或药学上可接受的载体的免疫原性或效力的化合物也可以被包含在其中或与其共同施用。 

本发明组合物还可以与其他免疫治疗策略组合使用，例如在受试者患有癌症并且疫苗是癌症疫苗时与化疗组合使用。 

递送核酸至细胞

在一个实施方案中，本发明涉及用于将核酸递送至细胞的组合物，该组合物包括至少一种核酸和甘露聚糖，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa。所述至少一种核酸可以通过聚阳离子与甘露聚糖结合。 

在一个实施方案中，核酸编码抗原。 

在另一个实施方案中，核酸编码基因。 

短语“将核酸引入细胞”指通过重组方法引入核酸序列。 

术语“核酸”与所有形式的DNA、RNA和多核苷酸同义，即，单链和双链DNA、cDNA、mRNA、siRNA等。 

将核酸递送给受试者的方法包括直接递送核酸和递送经核酸转染或转化的细胞。细胞或核酸可以直接递送至期望的器官或肿瘤，例如，通过注射、导管插入术或内窥镜术。它们也可以通过静脉内、支气管内、肿瘤内、鞘内、肌内、眼内、局部、皮下、经皮或口服递送。 

核酸递送媒介物的实例有脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、金属颗粒、以及细菌、病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和本领域常用的其他重组媒介物，其已经被描述用于在多种真核和原核宿主中表达并且可用于基因治疗、基因接种(例如DNA接种)以及简单的蛋白表达。 

如本文使用的，“载体”指用于将异源核酸引入细胞以使之表达或复制的离散元件。例如，载体可以是人工染色体、质粒、粘粒、噬菌体或病毒，并且能够稳定地整合入宿主细胞基因组，或者它可以作为独立的遗传元件(例如附加体、质粒)存在。载体可以作为单一多聚核苷酸或作为两个或多个独立的多核苷酸存在。当存在于宿主细胞中时，载体可以是单拷贝载体或多拷贝载体。本发明使用的优选载体是表达载体，其中一个或多个功能基因可以适当方向插入载体并邻近表达控制元件以指导一种或多种蛋白在宿主细胞中的表达。 

术语“控制元件”指可操作连接的核苷酸编码序列在特定宿主细胞中表达所必需的核酸序列。例如，适于在原核细胞中表达的控制序列包括复制起点、启动子、核糖体结合位点和转录终止位点。例如，适于在真核生物中表达的控制序列包括复制起点、启动子、核糖体结 合位点、聚腺苷酸化信号和增强子。 

“启动子”指导核酸的转录。如本文所用，“启动子”包括转录起始位点附近的必要的核酸序列，例如，在聚合酶II型启动子的情况下是TATA元件。 

启动子还任选地包括远端“增强剂或阻遏子元件”，其位置可以与转录起始位点相隔多达数千个碱基对。启动子可以是同源的或异源的。“组成型”启动子是在处于大多数环境和发育条件下的选定生物体中有活性的启动子。“诱导型”启动子在选定生物体中处于环境或发育调控下的启动子。 

载体可以是病毒或非病毒载体，包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和质粒载体。病毒的示例性类型包括HSV(单纯疱疹病毒)、腺病毒、AAV(腺相关病毒)、HIV(人类免疫缺陷病毒)、BIV(牛免疫缺陷病毒)和MLV(鼠白血病病毒)。核酸能够以提供足够有效地的递送水平的任何期望形式施用，包括在病毒粒子中、在脂质体中、在纳米粒子中以及与聚合物复合。如本文使用的，基因递送、基因转移等术语指将核酸引入宿主细胞(有时称为“转基因”)，而不论引入所使用的方法如何。这样的方法包括多种公知技术，例如载体介导的基因转移(例如，通过病毒感染/转染，或各种其他基于蛋白或基于脂质的基因递送复合物)以及有利于递送“裸”多核苷酸的技术(例如电穿孔、“基因枪”递送和用于引入核酸的各种其他技术)。所引入的多核苷酸可以稳定或瞬时维持在宿主细胞中。稳定维持通常要求引入的多核苷酸含有与宿主细胞相容的复制原点或整合入宿主细胞的复制子例如染色体外复制子(例如质粒)或者核或线粒体染色体。如本领域已知和本文描述的，已知许多载体能够介导基因转移到哺乳动物细胞。 

实施例

实施例1：材料和方法

培养基和化学品 

通过补充2%HEPES、0.1mM的2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺和10%(V/V)胎牛血清来制备完全RPMI-1640培养基。用于培养DC的重组GM-CSF购自BD-Pharmingen(San Diego，USA)并在PBS中重构。脂多糖(LPS)(L3137,Sigma,Castle Hill Australia)在无菌蒸馏水中重构。抗-CD11c-APC购自BD Pharmingen(San Diego,CA)。抗CD40、CD80和CD86抗体是内部制备的。甘露聚糖、NaIO₄、ANTS、乙烷-1,2-二醇购自Sigma。 

在这些研究中所用的甘露聚糖来自面包酵母(酿酒酵母)。甘露聚糖是非常异质性的，并入了范围从50至>1,000kDa的各种分子量的富含甘露糖的多糖。 

分级方法 

将20mg/ml甘露聚糖(Sigma)的双蒸水(DDW)溶液添加至20ml300kDa MWCO Vivaspin浓缩器(Sartorius)，以2500rpm离心15-20分钟，并浓缩至1-2ml(图1)。浓缩器被重新填充，直到加入全部样本。需要几次旋转。收集滤液并进行2×DDW洗涤，但弃掉。浓缩的级分(保留物)是>300kDa的级分。然后将滤液加至15ml100kDa MWCOAmicon旋转浓缩器(Millipore)并如前详述地操作。然后使用2×15ml50kDa MWCO Amicon旋转浓缩器(Millipore)、随后2×15ml30kDaMWCO Amicon旋转浓缩器(Millipore)依次分级甘露聚糖。这得到了>300、100-300、50-100、30-50和<30kDa的级分。保留物级分和最终滤液被冷冻干燥至白色松散粉末，除了<30kDa级分是粘的并因此不使用。样本称重并记录回收率。 

在后来的分级电泳中，使用2×20ml1000kDa MWCO Vivaspin浓缩器(Sartorius)作为第一分级步骤，随后顺序是如上所述的其他浓缩器。这得到>1000、300-1000、100-300、50-100、30-50和<30kDa 的级分。 

如前，将保留物级分和最后滤液冷冻干燥至白色松散粉末，并不使用<30kDa的级分。样本称重并记录回收率。在一些电泳中，300-1000kDa级分中没有粉末，因此在那些电泳中该特定级分没有被用于分析。 

使用PDPH定量方法定量甘露聚糖中的醛残基 

图2图解显示了氧化甘露聚糖中醛基数目的定量方法。使用相同摩尔浓度的NaIO₄，使得氧化程度取决于甘露聚糖的分子量。0.1M磷酸盐pH6.0缓冲液中的甘露聚糖和甘露聚糖级分1.4mg/0.1ml用0.01M NaIO₄氧化，并允许在黑暗中在冰上反应1小时。用10μl乙烷-1,2-二醇猝灭反应，并在穿过含有0.1M醋酸盐缓冲液pH4.8的PD10柱之前允许反应另外1/2小时。 

2ml氧化甘露聚糖中的1ml以0.7mg/ml与0.1mg PDPH反应，在室温旋转过夜，然后穿过含有DDW的PD10。通过与0.01M DTT反应15分钟并读取OD343nm处的吸光度，可以测定醛基数目。这释放指示醛基的2-吡啶(图2)。 

醛残基数目 

=2-吡啶硫酮的浓度(M)/甘露聚糖的浓度(M) 

=[OD343/8080]/[甘露聚糖的浓度(mg/ml)/甘露聚糖的分子量]。 

用于各种级分的平均分子量是：全甘露聚糖=500kDa，>1,000=1000kDa，>300=650kDa，100-300=200kDa，50-100=75kDa，30-50=40kDa。 

用ANTS化学修饰甘露聚糖并定量 

图3图解显示了用ANTS化学修饰氧化甘露聚糖。0.1M磷酸盐 pH6.0缓冲液中的甘露聚糖和甘露聚糖级分1.4mg/0.1ml用0.01MNaIO₄氧化，并允许在黑暗中在冰上反应1小时。用乙烷-1,2-二醇猝灭反应，并在穿过含有0.1M醋酸盐缓冲液pH4.8的PD10柱之前允许反应另外1/2小时。 

1ml的0.7mg/ml的氧化甘露聚糖，>300kDa、100-300kDa、50-100kDa和30-50kDa级分在3/17乙酸/DDW中分别与0.288、0.184、0.598、1.59和2.99mg ANTS(×400过量)反应。添加氰基硼氢化钠(50μl，1M；Sigma)，并在穿过含有DDW的PD10之前使反应在室温下旋转过夜。根据ANTS标准物读取ANTS结合物在激发405nm发射520nm处的荧光。 

用于定量甘露糖残基的间苯二酚测定 

使用间苯二酚测定来定量甘露聚糖和甘露聚糖级分(Monsigny等,1988)。甘露糖被用作标准物。读取板在OD450nm处的吸光度(由于没有430或480nm)。 

抗原与甘露聚糖的结合 

图4图解显示了蛋白与氧化甘露聚糖的结合。通过分别添加100μl、77μl、250μl、600μl和1.25ml的0.1M NaIO₄来氧化在0.1M磷酸盐pH6.0中14mg/ml(除了30-50级分为14mg/0.5ml以外)的甘露聚糖和>1000kDa、300-1000kDa(或在较早电泳中>300)、100-300kDa、50-100kDa、30-50kDa的级分并补足至1.6ml的终体积。 

将混合物在黑暗中在冰上放置1小时，用乙烷-1,2-二醇猝灭，并如前所述反应另外1/2小时。在用0.05M碳酸氢盐pH9.0预平衡的PD10柱(GE Biosciences)上分离结合物，以除去未反应的材料和副产物。这涉及使1.6ml样本、随后0.9ml缓冲液穿过该柱并弃掉。收集接下来的2ml并使1ml氧化甘露聚糖或级分分别与计算量的0.35、0.3、0.495、0.735和0.59mg FP和OVA反应。结合物在室温下孵育过夜，并在 4-12%或4-20%SDS-PAGE凝胶上分离以证实成功结合。斑点和缺乏明显蛋白条带，指示良好结合。 

对于体内研究中使用的最终>1000MFP结合物，使0.7mgFP(5.45mg/ml，128μ1)与2ml氧化甘露聚糖反应。类似地，对于>1000ManRSVg结合物，使0.25mg RSVg(0.37mg/ml，367μl)与2ml氧化甘露聚糖反应。 

>1000MFP中甘露聚糖的摩尔浓度是MFP中甘露聚糖摩尔浓度的一半，因此，在体内免疫原性研究中使用10μg FP。 

天然和变性凝胶电泳 

甘露聚糖和级分在SDS-PAGE或天然原生凝胶上显现。预制(PAGE凝胶)SDS4-12%或4-20%梯度凝胶(PAGE凝胶)在1×MOPSSDS电泳缓冲液中电泳。或者，使用12%天然凝胶(碱性条件)，由在0.063M Tris-HCl pH6.8中制成的5%堆积凝胶和在TBE中制成的拆分凝胶组成。在TBE加0.19M甘氨酸中进行电泳(Sharma等，2003年)。 

使用考马斯染料和PAS染料来分别针对蛋白和糖染色凝胶。 

通过密度测定法测定甘露聚糖的分子量 

如上，甘露聚糖级分用NaIO₄氧化并用ANTS标记。ANTS标记的甘露聚糖样本在PAS染色之后通过SDS-PAGE分析。扫描干燥的凝胶并使用Quantity One(Bio-Rad)软件通过密度测定法分析。 

骨髓来源的树突细胞的生成 

如以前所述生成鼠DC(Apostolopoulos等，2006)。简言之，从股骨和胫骨的内腔提取骨髓细胞。然后在37℃下用无菌的0.73%(w/v)NH₄Cl处理骨髓细胞10分钟以裂解红细胞。洗涤细胞并 重悬于补充了10ng/ml GM-CSF的完全培养基(2×10⁶细胞/3ml)。这些细胞在24孔板中(1ml/孔)培养4天。通过轻轻吸取培养基而收获细胞。GM-CSF培养的骨髓细胞产生大量表达II类MHC的DC，其是有效混合的淋巴细胞反应(MLR)刺激细胞。 

体外树突细胞成熟研究 

在成熟研究中使用C57BL/6小鼠来源的DC。从培养板取出树突细胞，并将1×10⁵DC重悬于补充了10ng/ml GM-CSF的150μl完全RPMI并接种入48孔板。添加甘露聚糖和各种甘露聚糖级分，使得向孔中添加最终浓度为800、400和200μg/ml。LPS(1μg/ml)被用作阳性对照，并且也被加入到各孔中并在37℃下孵育18小时。收获细胞并用抗-CD11c-APC连同与异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗CD86、抗CD40或抗CD80一起染色。CD11c^高细胞被门控并通过直方图分析测定FITC的强度以确定DC成熟状态。 

体内小鼠免疫原性研究 

小鼠和免疫 

HLA-A2/K^b小鼠购自Animal Resources Centre,Perth,Australia。为测定由MFP、>1000MFP和未结合FP诱导的效应子免疫反应，在第0、10和17天用100μl体积在尾根部皮内免疫HLA-A2/K^b小鼠，并在10-14天后使用ELISpot测定来评估免疫反应。在第2次和第3次注射后对小鼠取血，并通过ELISA测定检测MUC1特异性总Ig、IgG2a和IgG1。 

在体内的抗原特异性T细胞反应 

从免疫HLA-A2/K^b小鼠分离脾细胞并通过ELISpot评估抗原特异性的IFN-γ分泌。混合醋酸板(MAIP Millipore)用抗小鼠IFN-γ(AN18，5μg/ml，Mabtech，Germany)包被过夜。添加5×10⁵脾细胞/孔并在10%FCS RPMI1640培养基中在MUC-FP(20μg/ml)存在 下孵育18小时。ConA(1μg/ml)或单独的细胞分别用作阳性对照和阴性对照。弃掉细胞并在洗涤(0.05%吐温20/PBS)之后，添加抗小鼠IFN-γ抗体-生物素(R4-6A2，Mabtech，CA，USA)，持续2小时，然后添加0.1μg/ml的extravidin-碱性磷酸酶(AP)(Sigma，UK)，在室温下持续2小时。使用比色AP试剂盒(Biorad，Hercules，CA，USA)检测活性斑点。使用AID ELISpot读数系统(Autoimmun Diagnostika GmbH，Germany)计数细胞因子斑点。数据以平均斑点形成单位(SFU)/0.5×10⁶细胞+/-平均值的标准偏差(SD)来提供。 

与＞1000kDa的氧化甘露聚糖连接的蛋白抗原的人类体外免疫原性研究 

蛋白/肽抗原 

MART-1蛋白购自Biovision，USA。如Apostolopoulos等，1993中的描述来制备GST-MUC1-VNTR(FP)。内部制备pTrcB载体(Invitrogen)中的His标记的MUC1-VNTR(pTrc)(Loveland等，2006)。通过Genscript，USA合成对Melan-A/MART-1[EAAGIGILTV(天然)(SEQ ID NO:1)、ELAGIGILTV(类似物)(SEQ ID NO:2)]特异性的HLA-A2表位肽。 

GST-MUC1-VNTR(FP)、MUC1-VNTR(pTrc)和MART-1与＞1000kDa氧化甘露聚糖的结合。 

如前所述进行抗原与高碘酸盐>1000kDa氧化甘露聚糖的结合。>1000kDa甘露聚糖与抗原的比例为40:1。 

肽特异性CD8T细胞的生成。 

使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)通过密度梯度离心从血沉棕黄层分离PBMC。通过流式细胞术评估HLA-A2状态。在24孔板中，将PBMC以5×10⁶/ml重悬于完全AB培养基(RPMI1640、10%AB血清、青霉素/链霉素、HEPES、L-GLUT、NEAA、丙酮酸钠(Invitrogen)、 2-巯基乙醇)并用10μg/ml MART-1类似肽(ELAGIGILTV)(SEQ ID NO:2)和3μg/ml R848(InvivoGen)刺激。三天后，添加另外1ml补充了50U/ml IL-2(R＆D Systems)、20ng/ml IL-15和20ng/ml IL-7(Petrotech)的完全AB培养基。初次免疫后7-10天，用2μg/ml FMP或10μg/ml MART1类似肽(ELA)脉冲的照射的自体PBMC(1:100)再刺激细胞。次日，将1ml上清液更换为含有25U/ml IL-2的新鲜完全AB培养基。这在每3-4天重复。 

通过FACS分选产生MART-1特异性T细胞克隆。在与用肽脉冲的照射的(6000cGy)T2细胞孵育4小时之后，使用FACS Aria分选对ELAGIGILTV肽(SEQ ID NO:2)特异性的IFNγ分泌细胞。使用根据生产商方案进行的IFNγ分泌和检测测定(Miltenyi Biotech)来鉴定IFNγ分泌细胞。 

引发蛋白抗原特异性T细胞反应。 

使用CD14微球(Miltenyi Biotech)通过AutoMAC S分离从PBMC纯化单核细胞。通过在在T75烧瓶中含有50ng/ml GM-CSF和20ng/ml IL-4(R＆D Systems)的完全FCS培养基(RPMI1640+10%FCS+L-GLUT、青霉素/链霉素、HEPES、非必需氨基酸、丙酮酸钠、2-巯基乙醇)中培养单核细胞(5×10⁵/ml)5-6天，产生单核细胞衍生的树突细胞(MoDC)。 

向24孔板添加在完全AB培养基中2×10⁵/ml的MoDC(对于1:20的MoDC:T细胞)(每个测试条件1ml)，随后添加蛋白或>1000kDa氧化甘露聚糖结合物(10-20μg/ml)。4小时后，向孔添加1ml完全AB培养基中的4×10⁶清除CD14的PBMC。3天之后，添加25U/ml的IL-2、10ng/ml的IL-7和10ng/ml的IL-15。7-10天后，用l×10⁵加载了抗原的MoDC再刺激T细胞。再刺激后24小时，向培养物补充25U/ml的IL-2并在3-4天后再次补充。通常在1或2次再刺激之后分析T细胞培养物。 

抗原特异性T细胞反应的分析 

对于T细胞表位肽-通过用无关的肽(例如，CAP-110μg/ml或无肽)和一种感兴趣的肽(5μg/ml)在含有1.25μg/mlβ2-微球蛋白的无血清培养基中脉冲1小时，制备肽加载的T2细胞(2×10⁵/孔)。以约1:5比例(4×10⁴/孔)以100μl添加T2细胞，以复制T细胞孔并在37℃、5%CO₂下孵育1小时。添加含有Golgi-Stop(0.1μl每200μl T细胞/MoDC共培养物)的50μl培养基，并在37℃、5%CO₂下孵育细胞另外3-4小时。 

对于蛋白抗原和结合物-向含有75-100μl完全培养基中2×10⁴MoDC/孔(自体或A2匹配的)的v底96孔板簇集板添加抗原或>1000kDa甘露聚糖结合物(20μg/ml)并孵育2小时。向每个孔添加75-100μl完全培养基中的2×10⁵个刺激的T细胞，并在37℃、5%CO₂下孵育细胞15-16小时。添加含有Golgi-Stop(0.1μl每200μl T细胞/MoDC共培养物)的50μl培养基，并在37℃、5%CO₂下孵育细胞另外4-5小时。 

细胞内干扰素-γ(IFNγ)反应的分析 

针对表面标志物CD8和CD4来染色细胞，固定并透化，然后用Cytofix/CytoPerm试剂盒(BD)使用CD4APC-Cy7、CD8FITC和IFNγPE-Cy7(BD)对细胞内IFNγ的累积染色。通过流式细胞术鉴定抗原特异性T细胞，比较感兴趣的肽/蛋白与无关肽/蛋白对照存在下的IFNγ+CD4和CD8T细胞。 

实施例2：甘露聚糖的分级

最初，甘露聚糖依次穿过在材料和方法中描述的膜，以分离>300kDa、100-300kDa、50-100kDa、30-50kDa、4-30kDa的甘露聚糖级分。随后，分离>1,000kDa、100-300kDa、50-100kDa和30-50kDa的甘露聚糖级分。4-30kDa的级分类似胶，所以没有包括在随后的研究中。 

通过300kDa、100kDa、50kDa、30kDa的膜依次分级已知浓度的已知体积的甘露聚糖来进行分离(图1)。来自每个膜的流动和洗液穿过下一个膜。所有分离在水中进行并且在结束时冻干所有样本并记录白色粉末的重量(表1)。 

表1：显示各种级分回收和氧化甘露聚糖上醛残基的分级电泳的代表性样本 

如方法中所述的，分析各种级分与0.01M NaIO₄反应之后产生的醛残基。如表1所示，全甘露聚糖、>300kDa、100-300kDa、50-100kDa和30-50kDa级分分别产生73、82、35、19和9个醛残基(例如，电泳7)。 

实施例3：各种甘露聚糖级分与甘露糖受体的结合

Huh-7细胞是表达甘露糖受体的人类肝细胞癌细胞。已知甘露糖-BSA结合甘露糖受体，并作为阳性对照包括在这些研究中。全甘露聚糖和各种级分用FITC标记并通过流式细胞术观察与Huh-7细胞的结合(图5)。 

全甘露聚糖和所有级分以剂量依赖方式结合Huh-7细胞。因此，无论大小，所有甘露聚糖级分结合甘露糖受体或其他甘露糖结合凝集素。 

实施例4：甘露聚糖和各种甘露聚糖级分对BMDC的激活

为了确认是否甘露聚糖的各种级分激活BMDC以及是否任何级 分优于全甘露聚糖，将各级分以不同剂量与DC孵育不同时间，并通过流式细胞术监测成熟标志物CD40、CD80和CD86(图6)。如图6所示，所有级分以剂量和时间依赖性方式激活DC。>300kDa的级分优于全甘露聚糖。 

实施例5：分离>1000kDa的甘露聚糖级分

因为>300kDa的甘露聚糖级分比全甘露聚糖更有效地激活BMDC，分离较高分子量级分来分析。为了分离甚至更高分子量级分，使全甘露聚糖穿过具有1,000kDa截留膜的Centriprep浓缩器。各种级分的收率示于表2。有趣的是，300-1,000kDa级分大大减少，指示>1,000kDa的甘露聚糖相对于之前分离的>300kDa甘露聚糖级分占主导地位。 

实施例6：>1000kDa的甘露聚糖级分与全甘露聚糖和>300kDa的甘露聚糖级分的活性比较

通过流式细胞术观察48小时后CD40和CD86的上调(分别是图7A和7B)，测量各种剂量的>1000kDa级分刺激BMDC的能力。将>1000kDa级分与>300kDa级分和全甘露聚糖相比较，明显的是，>1000kDa级分优于全甘露聚糖并类似于>300kDa级分。 

实施例7：甘露聚糖级分的分子量的分析

如上所见，甘露聚糖的各个级分可以激活BMDC、结合甘露糖受体，并且>1000kDa的甘露聚糖级分是最具生物活性的级分。然而，重要的是能够分析各级分的生化性质，以及获得各级分的相对分子量，使得可以设定一系列规格。本发明人已经表明，各种甘露聚糖在用NaIO₄氧化时产生不同数目的醛基(表1和表2)。 

测量甘露聚糖的甘露糖含量的间苯二酚测定也可以用作鉴定甘露聚糖不同级分的手段(图8)。 

甘露聚糖是不带电荷的碳水化合物并且是高度亲水性的，并因此在用于蛋白分析的SDS-PAGE凝胶上不迁移。经常地，碳水化合物被化学修饰而加入电荷和疏水性以供分析。为加入这些性质，使氧化甘露聚糖与ANTS反应。在天然PAGE凝胶上分析用ANTS标记的甘露聚糖级分(图9)，没有根据其相对分子量而拆分这些甘露聚糖。 

然而，当通过SDS-PAGE分析ANTS标记的级分时，它们以类似于分级分子量(细胞膜截留)的模式迁移(图10)。SDS-PAGE凝胶被扫描并用于密度测定分析(图11)。还使用了正规的蛋白标准物。这使被分配到不同于定义蛋白的条带的分子量范围能够分散(宽条带)。分析来自几个分级电泳的甘露聚糖以验证分析。从已知分子量(蛋白或甘露聚糖级分)和相对前沿(Rf)产生标准曲线。Rf被定义为迁移的总距离除以由特定条带迁移的距离(图12)。基于标准曲线，计算各种甘露聚糖组分的相对分子量(图13和14)。 

实施例8：MUC1-FP与甘露聚糖的结合

如方法中所描述的，甘露聚糖的各种级分与MUC1-FP结合。因为全甘露聚糖与各级分相比较的分子量和产生的醛基数目不同，FP使用量被标准化为MUC1-FP与醛的摩尔比。此外，一定范围量的MUC1-FP被结合并通过SDS-PAGE分析(图15)。 

实施例9：>1000MFP和ΜFΡ在小鼠体内的活性

如上所述制备全甘露聚糖和>1000kDa甘露聚糖，并用于体内免疫原性研究。 

为确认连接到全甘露聚糖的MUC1的免疫原性，>1000kDa的甘露聚糖、结合物或MUC1-FP以10μg的剂量在第0、10、17和14天皮内注射入小鼠。使小鼠安乐死以通过ELISpot分析来分析细胞反应(图16)。在来自免疫小鼠的脾细胞中测量对各种剂量的MUC1-FP的抗原特异性IFN-γ反应。如图16所示，MUC1-FP、MFP和>1000MFP免疫小鼠之间的细胞反应没有显著不同。测试来自免疫小鼠的血清的抗-MUC1特异性总IgG、IgG1和IgG2a抗体(图17)。有趣的是，用>1000MFP免疫的小鼠与其他组相比具有～10倍更高滴度的抗MUC1特异性IgG2a。2次免疫之后，证明了小鼠血清中类似的IgG2a倾向(数据未示出)。 

实施例10：甘露聚糖的表征和可能的质量控制测定

甘露聚糖目前来源是Sigma。它不具有良好生产规范(GMP)标准，并且给出的仅有信息示于图18。对于酵母甘露聚糖重要的是它是否来自生产商，以确保它满足特定的标准。PDPH测定可用于测量醛，间苯二酚检测可用于测量甘露糖含量，并且ANTS测定可用来表征各批次的甘露聚糖。 

使用间苯二酚测定来分析来自Sigma的五个批次甘露聚糖。如图19A所示，所有批次显示相同的吸光度与浓度曲线，指示甘露聚糖中相同的甘露糖含量。图19B显示在间苯二酚测定中使用甘露糖的标准曲线。类似地，所有5个批次在用NaIO₄氧化后分析醛残基(图20)。 

从三个独立的测量可以看到，醛残基的数目在90-155个残基之间变化。因此，如果生成的醛残基为125±20%，则可以设定甘露聚糖的规格为合格。以类似的方式，可以用ANTS替代PDPH与氧化甘 露聚糖反应来测量荧光(图21)。有趣的是，该测定中所有批次的变化也是～±20%。 

实施例11：GST-MUC1-VNTR(FP)：

结合 

如前所述使FP与>1000kDa的氧化甘露聚糖(>1000MFP)结合(图22)。 

与＞1000kDa氧化甘露聚糖连接的FP的免疫原性 

通过用氧化甘露聚糖-pTrc反复刺激、随后分选MUC1-特异性T细胞并扩增，产生了MUC1-特异性T细胞系。考察了用甘露聚糖结合物脉冲的同种异体DC(BC16)向MUC1-特异性T细胞系呈递MUC1的能力。如图23所示，>1000MFP能够刺激MUC1-特异性T细胞系。在刺激T细胞方面，在10μg/ml和20μg/ml剂量下，>1000MFP比未结合的FP更有效。 

实施例12：MUC1-VNTR(pTrc)：

结合 

使MUC1-VNTR(pTrc)与>1000kDa的氧化甘露聚糖结合(图24)。使不同量的pTrc与>1000kDa的氧化甘露聚糖反应以确定最佳比例。抗原:甘露聚糖比例为1:40的结合物(1/2x，泳道5)用于免疫原性研究。 

与＞1000kDa的氧化甘露聚糖结合的MUC1-VNTR的免疫原性 

通过用冷冻MoDC(冷冻，BC17K)召回的pTrc(MUC1)T细胞系(来自供体BC13)确认与>1000kDa的氧化甘露聚糖连接的pTrc的体外免疫原性(图25)。如所示的，pTrc未被有效加工并呈递给给MUC1特异性T细胞。然而，>1000kDa的结合物比未结合的pTrc更有效地刺激了MUC1特异性T细胞。用20μg/ml pTrc、>1000kDa pTrc结合 物脉冲的自体MoDC用于召回源自健康供体BC17K的MUC1-特异性T细胞系的MUC1特异性CD8反应(图26)。与未结合的抗原相比，>1000kDa的氧化甘露聚糖结合物有效刺激了CD8T细胞中的细胞内IFNγ分泌。 

实施例13：MART-1

结合 

如上所述使重组MART-1蛋白也连接至>1000kDa的氧化甘露聚糖(图27)。用正常和还原的MART-1蛋白制成了两种类型的结合物。MART-1蛋白具有几个几个半胱氨酸并因此易于空气氧化和聚集。为了便于结合，MART-1首先用DTT还原，然后用于结合。 

MART-1>1000kDa氧化甘露聚糖结合物的免疫原性 

用肽初次免疫和召回T细胞 

如实施例1中描述的，用MART-1和>1000kDa氧化甘露聚糖结合物(20μg/ml)初次免疫来自2个供体(BC28和BC29)的PBMC和MoDC。1次刺激后，使用脉冲的T2细胞测量类似和天然MART-1肽特异性T细胞反应(图28)。用>1000kDa氧化甘露聚糖-MART-1初次免疫的BC28供体T细胞有效地响应T2细胞呈递的类似或天然MART-1肽(图28)。用各自的蛋白和结合物再次刺激BC28和BC29培养物，并使用自体脉冲MoDC作为抗原呈递细胞来测试MART-1蛋白特异性T细胞反应(图29)。脉冲的MoDC能够召回用>1000kDa氧化甘露聚糖结合物初次免疫的BC28和BC29供体T细胞中的MART-1特异性CD8T细胞反应。在初次免疫方面，用MART-1>1000kDa氧化甘露聚糖初次免疫比未结合的蛋白更有效。 

实施例14：使用灭活流感病毒(H1Ν1)和>1000kDa甘露聚糖的混合物的体内免疫原性研究。

流感病毒和小鼠 

通过蔗糖梯度纯化卵生H1N1(A/New Caledonia/20/1999)病毒，浓缩并用β-丙内酯灭活，以产生流感区带池制品(IZP)，其由WHO流感参考和研究合作中心(WHO Collaborating Centrefor Reference and Research on Influenza)(North Melbourne,Australia)的副主任Ian Barr博士惠赠。所有小鼠是WEHI(Melbourne,Australia)提供的雌性BALB/c，并且在首次免疫时是8-10周龄。 

H1N1/＞1000kDa甘露聚糖混合物的产生 

通过在无菌PBS中稀释H1N1储液(从2.7mg/ml)和>1000kDa甘露聚糖储液(从14mg/ml)，使得各自期望的剂量包含于50μl中，产生了H1N1/>1000kDa甘露聚糖混合物。如前所述分离>1000kDa甘露聚糖。 

免疫 

所有免疫通过鼻内途径施用。在完全麻醉(通过吸入甲氧基氟烷(methoxyfluorane))并保持直立的同时，将大约5μl滴剂轻轻地交替移入每个鼻孔。 

血清和BAL(支气管肺泡灌洗液/肺洗液）收集 

如所述的，通过眼眶后取血来收集血清。在收集BAL之前，用氯胺酮和xylazil的混合物使小鼠安乐死。取出组织以暴露上部气管，并在其中做成一个小切口。在与1ml注射器连接的平头针辅助下，使1ml PBS缓缓流入肺，然后回抽出来。 

抗体滴度的ELISA测定 

使用HRP/TMB系统进行ELISA。用浓度为1μg/ml的灭活的全H1N1(A/New Caledonia/20/1999)涂覆板。使用直接结合的大鼠抗小鼠 IgG-HRP(GE healthcare，产品号RPN1231V)检测总抗H1N1IgG，并使用来自Pharmingen(产品号553441、553388和556978)的生物素标记的第一抗体和来自GE healthcare(产品号346480)的第二链霉亲和素-HRP来检测IgG1、IgG2a和IgA。终点滴度被测量为滴定中维持高于相应对照值的最后一个值，其中对照被计算为每个滴定点的天然小鼠血清(3-5只小鼠)的平均OD值+2SD。 

在第0、14天，用H1N1(1μg)或与>1000kDa甘露聚糖混合的H1N1(100μg)鼻内免疫4只BALB/c小鼠的组。最后一次免疫后10-14天，分析小鼠血清和肺分泌物中的H1N1特异性IgG1、IgG2a和IgA抗体。如在图30中看到的，>1000kDa的甘露聚糖增强了血清IgG1反应。更重要地，>1000kDa的甘露聚糖有效增强血清和肺H1N1-特异性IgA。 

本领域技术人员将理解，在不背离概括描述的本发明的精神和范围的条件下，可以对以具体实施方案显示的本发明进行许多变化和/或调整。因此，在所有方面都认为本实施方案是示例说明而非限制性的。 

本文讨论和/或引用的所有出版物以其整体并入本文。 

本说明书中包括对文件、行为、材料、设备、制品等的任何讨论仅仅是出于提供本发明背景的目的。这不应被视为承认：由于在本申请每项权利要求优先权日之前存在，这些事物的任何或全部构成现有技术基础的一部分或者是本发明相关领域的公知常识。 

本申请要求2010年5月10日提交的US61/333,086、2010年5月10日提交的AU2010901997和2010年9月9日提交的AU2010904060的优先权，其全部内容通过引用并入本文。 

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Claims (66)

1.一种包含甘露聚糖的免疫刺激组合物，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述甘露聚糖是氧化的。

3.一种包含氧化甘露聚糖的免疫刺激组合物，其中所述甘露聚糖的至少75%具有至少150个醛基。

4.一种包含氧化甘露聚糖的免疫刺激组合物，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa并且具有至少150个醛基。

5.一种疫苗组合物，其包含甘露聚糖和至少一种抗原或其编码核酸，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa。

6.权利要求5所述的组合物，其中所述甘露聚糖是氧化的。

7.权利要求6所述的组合物，其中所述氧化甘露聚糖与所述至少一种抗原共价结合。

8.权利要求6所述的组合物，其中所述氧化甘露聚糖通过聚阳离子与所述至少一种核酸结合。

9.权利要求7或权利要求8所述的组合物，其中所述氧化甘露聚糖的至少75%在与所述至少一种抗原或其编码核酸结合之前具有至少150个醛基。

10.权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述甘露聚糖来自酵母。

11.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述甘露聚糖的至少90%大于约1000kDa。

12.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述甘露聚糖的至少95%大于约1000kDa。

13.权利要求4或权利要求9所述的组合物，其中所述氧化甘露聚糖的至少90%具有至少150个醛基。

14.权利要求4或权利要求9所述的组合物，其中所述氧化甘露聚糖的至少95%具有至少150个醛基。

15.权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述甘露聚糖在用氨基萘-1,3,6-三磺酸(ANTS)标记之后的大小分布基于蛋白质标准物是约150Da至约250Da和/或基于碳水化合物标准物是约800kDa至约3000kDa。

16.权利要求5至15中任一项所述的组合物，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原、真菌抗原或肿瘤抗原、自体抗原或变应原。

17.权利要求1至16中任一项所述的组合物，其被配制用于粘膜、局部、皮内、肌内、皮下或静脉内施用。

18.权利要求1至17中任一项所述的组合物，其还包含至少一种可接受的载体。

19.一种用于诱导和/或增强受试者免疫反应的方法，所述方法包括给所述受试者施用权利要求1至18中任一项所述的组合物。

20.权利要求19所述的方法，其中所述方法包括施用所述至少一种抗原或其编码核酸。

21.权利要求20所述的方法，其中所述甘露聚糖和所述至少一种抗原或其编码核酸依次或同时施用。

22.权利要求20所述的方法，其中所述甘露聚糖和所述至少一种抗原或其编码核酸作为根据权利要求5至18中任一项所述的疫苗组合物施用。

23.权利要求19至22中任一项所述的方法，所述方法使所述受试者对病原体免疫。

24.权利要求19至22中任一项所述的方法，用于癌症治疗。

25.权利要求19至24中任一项所述的方法，其中所述组合物通过粘膜、局部、皮内、肌内、皮下或静脉内施用。

26.权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述受试者是鸟或哺乳动物。

27.权利要求26所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

28.权利要求1至18中任一项所述的组合物制备用于诱导和/或增强受试者免疫反应的药物的用途。

29.权利要求1至18中任一项所述的组合物用于诱导和/或增强受试者免疫反应的用途。

30.一种在体外或离体激活巨噬细胞、树突细胞和/或CTL的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1至18中任一项所述的组合物接触。

31.一种用于将至少一种核酸递送至细胞的组合物，所述组合物包含至少一种核酸和甘露聚糖，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa。

32.权利要求31所述的组合物，其中所述甘露聚糖是氧化的。

33.权利要求32所述的组合物，其中所述氧化甘露聚糖通过聚阳离子与所述至少一种核酸结合。

34.权利要求33所述的组合物，其中所述氧化甘露聚糖的至少75%在与所述至少一种核酸结合之前具有至少150个醛基。

35.一种用于将至少一种核酸递送至细胞的方法，该方法包括使所述细胞与权利要求31至34中任一项所述的组合物接触。

36.权利要求35所述的方法，其中所述细胞在体外、离体或体内。

37.权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述至少一种核酸为基因治疗或基因疫苗接种而被递送至所述细胞。

38.权利要求31至34中任一项所述的组合物制备用于基因治疗或基因疫苗接种的药物的用途。

39.权利要求31至34中任一项所述的组合物用于基因治疗或基因疫苗接种的用途。

40.一种制备权利要求1至18或31至34中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括

i)获得包含甘露聚糖的组合物，

ii)基于大小对来自步骤i)的组合物进行分级，

iii)选择一个或多个包含甘露聚糖的级分，其中所述一个或多个级分中的甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa，以及

iv)任选地使来自步骤iii)的甘露聚糖与至少一种其他化合物混合或结合。

41.权利要求40所述的方法，其中所述至少一种其他化合物是抗原或其编码核酸。

42.权利要求40或权利要求41所述的方法，还包括在步骤iv)之前氧化所述甘露聚糖的步骤。

43.权利要求42所述的方法，其中所述氧化甘露聚糖的至少75%具有至少150个醛基。

44.一种制备权利要求5至18中任一项所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括

i)获得包含甘露聚糖的组合物，其中所述甘露聚糖的至少75%大于约1000kDa；以及

ii)使来自步骤i)的组合物与至少一种抗原或其编码核酸混合或结合，从而制备所述疫苗组合物。

45.权利要求44所述的方法，还包括在步骤ii)之前氧化所述甘露聚糖。

46.权利要求45所述的方法，其中所述氧化甘露聚糖的至少75%具有至少150个醛基。

47.一种选择包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物的方法，所述方法包括

i)获得包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物，

ii)分析来自步骤i)的组合物的大小分布和/或醛含量，以及

iii)如果所述组合物包括期望的大小分布和/或醛含量，则选择所述组合物。

48.权利要求47所述的方法，其中所述大小分布通过以下分析

i)氧化所述组合物的一部分，

ii)用氨基萘-1,3,6-三磺酸(ANTS)标记来自步骤i)的氧化产物，以及

iii)通过SDS-PAGE拆分来自步骤ii)的ANTS标记产物来分析所述大小分布。

49.权利要求47或权利要求48所述的方法，其中所述醛含量通过以下分析

i)氧化所述组合物的一部分，

ii)使来自步骤i)的氧化产物与3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼(PDPH)反应，

iii)使来自步骤ii)的产物与还原剂反应以释放2-吡啶硫酮，以及

iv)测量2-吡啶硫酮的释放。

50.权利要求49所述的方法，其中所述还原剂是二硫苏糖醇(DTT)。

51.权利要求49或权利要求50所述的方法，其中所述2-吡啶硫酮的释放通过分光光度法以OD343nm的吸光度来测量。

52.权利要求48至51中任一项所述的方法，其中所述组合物用高碘酸钠氧化。

53.权利要求47至52中任一项所述的方法，还包括测定来自步骤i)的组合物的纯度。

54.权利要求53所述的方法，其中所述纯度通过按以下方式定量所述碳水化合物聚合物的糖含量来测定

i)使所述组合物的一部分与间苯二酚(1,3-二羟基苯)在水合硫酸的存在下反应，

ii)测量OD430-480nm处的吸光度，以及

iii)使所述吸光度与标准物相比较。

55.一种制备包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物的方法，所述方法包括

i)获得包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物，其中所述碳水化合物聚合物包含醛基，

ii)基于大小对所述组合物进行分级，以及

iii)选择来自步骤ii)的一个或多个包含具有期望的大小分布和/或醛含量的碳水化合物聚合物的级分，从而制备所述组合物。

56.一种制备包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物的方法，所述方法包括

i)获得包含含有甘露糖的碳水化合物聚合物的组合物，

ii)基于大小对所述组合物进行分级，

iii)氧化从步骤ii)获得的一个或多个级分，以及

iv)选择来自步骤iii)的一个或多个包含具有期望的大小分布和/或醛含量的碳水化合物聚合物的级分，从而制备所述组合物。

57.权利要求56所述的方法，其中在步骤ii)之前，所述组合物使用权利要求47至54中任一项所述的方法来选择。

58.权利要求55至57中任一项所述的方法，其中步骤ii)通过切向流过滤、尺寸排阻色谱法和/或超滤来进行。

59.权利要求56至58中任一项所述的方法，其中所述一个或多个级分用高碘酸钠氧化。

60.权利要求55至59中任一项所述的方法，还包括在选择之前分析一个或多个级分的醛含量。

61.权利要求60所述的方法，其中所述醛含量通过以下分析

i)使所述一个或多个级分的一部分与3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼(PDPH)反应，

ii)使来自步骤i)的产物与还原剂反应以释放2-吡啶硫酮，以及

iii)测量2-吡啶硫酮的释放。

62.权利要求61所述的方法，其中所述还原剂是二硫苏糖醇(DTT)。

63.权利要求61或权利要求62所述的方法，其中所述2-吡啶硫酮的释放通过分光光度法以OD343nm的吸光度测量。

64.权利要求55至63中任一项所述的方法，还包括分析一个或多个选定级分的大小分布。

65.权利要求64所述的方法，其中所述大小分布通过以下分析

i)用氨基萘-1,3,6-三磺酸(ANTS)标记所述一个或多个选定级分的一部分，以及

ii)通过SDS-PAGE拆分来自步骤i)的一个或多个ANTS标记的级分来分析所述大小分布。

66.权利要求65所述的方法，其中所述含有甘露糖的碳水化合物聚合物是甘露聚糖，并且

a)所述选定级分中的甘露聚糖的分子量大于约1000kDa，并且用ANTS标记后的大小分布基于蛋白标准物是约150kDa至约250Da和/或基于碳水化合物标准物是约800kDa至约3000kDa，

b)所述选定级分中的甘露聚糖的分子量为约300kDa至约1000kDa，并且用ANTS标记后的大小分布基于蛋白标准物是约150kDa至约175Da和/或基于碳水化合物标准物是约400kDa至约1000kDa，

c)所述选定级分中的甘露聚糖的分子量为约100kDa至约300kDa，并且用ANTS标记后的大小分布基于蛋白标准物是约80kDa至约125Da和/或基于碳水化合物标准物是约90kDa至约400kDa，

d)所述选定级分中的甘露聚糖的分子量为约50kDa至约100kDa，并且用ANTS标记后的大小分布基于蛋白标准物是约60kDa至约80Da和/或基于碳水化合物标准物是约50kDa至约175kDa，或

e)所述选定级分中的甘露聚糖的分子量为约30kDa至约50kDa，并且用ANTS标记后的大小分布基于蛋白标准物是约50kDa至约60Da和/或基于碳水化合物标准物是约20kDa至约50kDa。

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