CN105492022A - 用于接种疫苗的免疫原性络合物及其获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醛的免疫原性复合物，包含该免疫原性复合物的组合物，以及其作为免疫应答刺激剂和疫苗用于治疗感染性疾病、肿瘤和过敏的用途。同样地，本发明涉及基于通过使用二醛而使得抗原和甘露聚糖同时聚合和缀合来获得所述的免疫原性复合物的方法。

Description

用于接种疫苗的免疫原性络合物及其获得方法

本发明涉及包含聚合抗原、甘露聚糖和二醛的免疫原性复合物，包含该免疫原性复合物的组合物，以及其作为免疫应答刺激物和疫苗的用途。同样地，本发明涉及使用二醛，基于抗原和甘露聚糖同时进行聚合和缀合而获得所述的免疫原性复合物的方法。因此，本发明属于免疫学和疫苗生产领域的范围内，以及治疗和预防过敏反应的领域范围内。

背景技术

树突状细胞(DC)是专门高效地刺激T细胞的抗原呈递细胞，并且鉴于此，它们基本用于诱导特异性免疫应答。未成熟的DC策略性地分布于组织和器官中，其中它们作为哨兵，在它们的微环境中不断地取得抗原样品。作为对不同刺激(包括抗原本身、微生物有机体的产物以及组织危险物信号)的应答，DC开始成熟过程，这使得DC在周围携带由它们本身所负载的抗原迁移至次级淋巴器官的T区。在此，显示HLA-II和共刺激分子表达增多的成熟DC与T细胞相互作用，将抗原性的肽(经DC加工后)呈递给T细胞，并刺激T细胞开始特异性的应答。

未成熟的DC通过受体介导的内吞作用、微胞钦作用和吞噬作用捕获抗原。有多种不同的受体与内吞摄入有关，其中发现了甘露糖受体(MR)(CD206和CD209)。它们通过碳水化合物识别结构域而识别末端甘露糖残基、海藻糖和/或N-乙酰氨基葡萄糖。天然配体包括细菌来源的产物(糖蛋白和糖脂)，以及具有高的甘露糖含量的哺乳动物糖蛋白。MR在巨噬细胞和未成熟的DC中表达，与甘露糖基化的抗原的内吞作用有关，用于其加工和T细胞呈递。

在IgE抗体介导的过敏状况中，免疫治疗是以给予治疗疫苗为基础的，这些疫苗抗原与过敏患者所敏感的那些为相同的变应原。变应原为得自于花粉、尘螨、上皮细胞等的蛋白质，它们是患者所呼吸(环境吸入器)的空气中所携带的超级结构。广泛接受的是，这些疫苗的临床功效与所传递的变应原的剂量有关，这样WHO和得自于科学社会的共同指导原则建议应该使用足够的变应原浓度来制备疫苗。这种要求意味着患者对疫苗剂量的过敏反应涉及不利作用的风险，而根据规定所述的作用应该受到限制。避免这种风险的方式在于基于改性的变应原(类变应原)来制备疫苗，其中所述的变应原显示出针对IgE抗原的较低的反应能力(较低的变应原性)。

基于使用甲醛和/或戊二醛来处理变应原的化学修饰在疫苗制造商中最广泛地使用。醛基(R-CHO)与存在于变应原氨基酸中的氨基(R-NH2)(例如赖氨酸)的反应是此类修饰的基础。与甲醛(其为单醛)相反，戊二醛为具有2个R-CHO基的二醛，其中所述的R-CHO基能够与不同分子中存在的赖氨酸R-NH2反应。这导致变应原聚合，以及与特异性IgE抗体(通过甲醛形成的类变应原是基于蛋白质的结构修饰，而不是基于它们的聚合)的反应性受损。由于IgE抗体失去了与它们的抗原决定簇(变应原结合位点)反应的可及度，并减少了IgE致敏的肥大细胞(其被IgE所活化)的数量，所以认为这种聚合确定了类变应原较低的变应原性。聚合的变应原的变应原性损失可以意味着免疫原性损失，这可以降低这些制备物的临床功效。已经表明聚合会降低DC中MR与变应原甘露糖残基的接近，以及这对于聚合的变应原的免疫原性损失而言是决定性的。这由以下事实所支持：就变应原摄入而言，甘露糖残基为DC所用的主要配体之一，并且这些细胞在将变应原呈递给应答T细胞中起重要的作用。

用于将糖与蛋白质缀合的方法主要基于通过氧化过程来活化糖，从而通过cis-乙二醇基的转化而生成反应性醛基(R-CHO)。在使用例如高碘酸盐处理后在氧化的糖中生成的R-CHO可以与赖氨酸的ε-氨基反应，从而形成Schiff碱。由于它们的碳水化合物残基用于缀合并避免了与其生物学活性有关的蛋白质部分，所以这种方法学非常适用于缀合糖蛋白(例如酶、抗体)。

尽管使用高碘酸盐的糖氧化也已经报告为对蛋白质(包括变应原(Weinbergeretal.2013.JControlRelease,165:101-109))进行甘露糖基化的方式(Masarovaetal.2002.Int.J.Polymer.Anal.Charact.,7:106–116)，但是将聚合的抗原进行甘露糖基化的使用具有2个主要的缺点：

a)糖的氧化使得相邻的碳原子之间的键产生了断裂，其中所述的碳原子包含羟基(OH)并且为反应性醛生成的基础。所述的断裂影响了甘露糖的结构(Shibuya,N.,etal.1988.J.Biol.Chem.,263:728-734)，从而改变了其结合识别甘露糖的凝集素的能力(Masarovaetal.2001,Chem.Pap.55:130-135)，及其DC活化能力(Shengetal,2006.Immunology,118:372–383)。尽管甘露糖结构整体性的损失可以通过降低氧化程度而减小至最低(Masarovaetal.2001,Chem.Pap.55:130—135)，但是在轻度条件下的缀合效率服从于待甘露糖基化的蛋白质的本性(Weinbergeretal.2013,J.ControlRelease,165:101-109)。为了保护天然形式的甘露糖，已经试图在高温下通过糖基化来实施蛋白质的甘露糖基化，但是在氧气缺乏下，结果为阴性(Kanskaetal.2008.Biotechnol.Appl.Biochem.49:57–64)。

b)在氧化后活化的甘露糖生成了反应性醛，其必须与待甘露糖基化的蛋白质的游离氨基反应。但是，蛋白质与戊二醛的聚合使得这些氨基急剧减少，因为它们已经用于它们与戊二醛本身的反应中。在这些条件下，经活化用于将蛋白质(之前使用戊二醛处理过)甘露糖基化的甘露糖的效率可能极低，这是因为当缺乏甘露糖可以结合的氨基时，其为戊二醛的聚合能力(Silvaetal.2004.FoodTechnol.Biotechnol.42:51–56)。这种不便性不仅影响聚合的变应原的甘露糖基化，而且影响与戊二醛(最终认为其可以被甘露糖基化)聚合的任何蛋白质的甘露糖基化。

Patterson等人1977(JAllergyClinicalImmunology59:314-319)描述了变应原与戊二醛的聚合(禾本科花粉)。由于聚合的变应原显示IgE抗体致敏的肥大细胞的活化能力降低，所以聚合的变应原是低变应原的。

Subiza等人2008(ClinicalandExperimentalAllergy,39:987-994)描述了用于过敏中免疫治疗的戊二醛(也称为类变应原)修饰的变应原(禾本科花粉、Trisetumpaniceum和喜马拉雅鸭茅(喜马拉雅鸭茅))的用途。研究者报告使用通过与戊二醛聚合而得到的禾本科类变应原的接种疫苗是有效的。

Heydenreich等人2012(Immunology,136:208-217)描述了在由梯牧草(梯牧草)和垂枝桦(Betulaverrucosa)物种的完整花粉得到的变应原提取物与它们相应的戊二醛或甲醛修饰的类变应原之间，免疫原性和变应原性的差异比较研究。报告，使用戊二醛进行修饰比使用甲醛进行修饰会使得类变应原的变应原性和免疫原性降低更多，并且DC不会高效地捕获这种类型的修饰的变应原。

Weinberger等人2013(JournalofControlRelease,165:101-109)描述了变应原蛋白质(卵清蛋白和木瓜蛋白酶)与甘露糖的缀合，其中通过使用高碘酸盐进行轻度氧化而活化糖。根据待甘露糖基化的蛋白质而得到不同的效率程度。报告，甘露糖基化的缀合物在体内被DC所捕获，并且在小鼠中产生免疫应答，因此它们可以用于免疫治疗。

因此，在本领域的水平下，需要提供基于聚合的且甘露糖基化的抗原而获得疫苗的方法，该方法为目前本领域水平下所使用的那些方法的备选方法，并且其允许抗原聚合以及以高效的方式与甘露糖缀合，而不会使糖损失它们的结构完整性并且不会使聚合性质(较低的变应原性)受到影响，因此基于聚合的且甘露糖基化的蛋白质的疫苗通过改善它们被DC的摄入而增加其免疫原性。

发明概述

本发明的发明人发现向天然蛋白质抗原与甘露聚糖的混合物中加入二醛允许抗原聚合，同时使抗原与甘露聚糖缀合，这可以获得免疫原性复合物或疫苗，该免疫原性复合物或疫苗在个体中能够刺激或降低免疫应答的，而不会引发对该复合物的过敏反应，并且能够被树突状细胞(DC)所识别并捕获。

基于上述发现，已经研发了本发明的一系列的方面，在下文中将详细描述这些方面。

本发明的免疫复合物

如之前所提及，向蛋白质(抗原)和甘露聚糖的混合物中加入二醛(特别是戊二醛)允许抗原聚合，同时抗原与甘露聚糖缀合，这可以获得免疫原性复合物或疫苗。

因此，在本发明的一个方面中，涉及免疫原性复合物，下文称为“本发明的免疫原性复合物”，其包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醛。

在本发明中，“免疫原性复合物”可理解为一个或两个单元的结合，其中所述的单元通过化学键(化学缀合)和通过物理诱捕(物理缀合)而保持彼此缀合，所述的多个单元为聚合的抗原、甘露聚糖和二醛。

“聚合的抗原”是指抗原单体彼此键合而形成的聚合物，其中所述的抗原单体可以不同或相同。因此，在具体的实施方案中，聚合物的抗原包含彼此相同或不同的至少2个抗原。“抗原”是指在受试对象(人类或动物)的有机体中在体液和细胞水平下能够诱导免疫应答的，或者在与免疫细胞接触时能够诱导细胞免疫应答(免疫细胞扩增、活化和/或成熟、产生细胞因子或抗体)的任何物质。具体而言，抗原为可以为变应原的蛋白质，由感染试剂衍生的蛋白质，肿瘤细胞，所述的蛋白质的肽或片段，由所述的蛋白质得到的重组蛋白质，或者甚至能够诱导指定的应答的合成肽。在具体的实施方案中，所述的抗原为变应原。

“变应原”是指在个体中能够引起过敏的物质，换言之，是指被个体的免疫系统识别为外来的，导致免疫应答(主要是产生E型免疫球蛋白(IgE))的物质。变应原的实例包括但不限于花粉变应原提取物，由节肢动物得到的变应原提取物，由食物或食物产品得到的变应原提取物，在昆虫的唾液、爪或刺上存在的成分(在受试对象中会诱导敏感反应)等。因此，可以使用花粉蛋白质提取物，例如禾本科花粉(多年生黑麦草(Loliumperenne),草地早熟禾(Poapratense),梯牧草(Phleumpratense),狗牙根(Cynodondactylon),高羊茅草地早熟禾(Festucapratensis),喜马拉雅鸭茅(Dactylisglomerata),黑麦(Secalecereale),大麦(Hordeumvulgare),燕麦(Avenasativa),Triticumsativa)，其他草花粉(例如艾草(Artemisiavulgaris),藜(Chenopodiumalbum),长叶车前(Plantagolanceolata),蒲公英茴香(Taraxacumvulgare),Parietariajudaica,刺沙蓬(Salsolakali),异株荨麻(Urticadioica))，或者树花粉(例如橄榄(Oleaeuropaea),悬铃木属,Cuppresusspp)等。此外，还可以使用由节肢动物得到的蛋白质提取物，例如尘螨(例如欧洲室尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus),美洲尘螨(Dermatophagoidesfarinae),Acarosiro,Blomiatropicalis,梅氏嗜霉螨(Euroglyphusmaynei),家甜食螨(Glyciphagusdomesticus),害嗜鳞螨(Lepidoglyphusdestructor),腐食酸螨(Tyrophagusputrescentiae))等。其他变应原提取物可以得自真菌孢子(烟草赤星病菌(Alternariaalternata),蜡叶芽枝霉(Cladosporiumherbarum),特异青霉(Peniciliumnotatum))和动物上皮细胞(狗上皮细胞、猫上皮细胞、马上皮细胞、羽毛混合物)，以及得自食物成分等。如本领域专业人员所理解的那样，皮肤和皮肤上的附属物(例如头发)包含在术语“上皮细胞”内。实际上，任何变应原都可以用于免疫原性复合物中，然而，在具体的实施方案中，变应原选自花粉、充满、上皮细胞、真菌孢子和它们的组合。

在另一个具体的实施方案中，得自物种梯牧草,喜马拉雅鸭茅,狗牙根,多年生黑麦草,三毛草属,橄榄,Cuppresusspp.,豚草属,桦木属,悬铃木属,欧榛(Corylusavellana)或欧洲桤木(Alnusglutinosa)。

在另一个具体的实施方案中，虫螨术语物种欧洲室尘螨,美洲尘螨或Blomiatropicalis。

在另一个具体的实施方案中，上皮细胞属于物种Felisdomesticus或家犬(Canisfamiliaris)。

在另一个具体的实施方案中，真菌孢子属于物种烟草赤星病菌或细链格孢(Alternariatenuis)。

在本发明中，“甘露聚糖”是指碳水化合物聚合物，其由甘露糖和以下类型的糖苷键组成：α-1,6-糖苷,α-1,2-糖苷,α-1,3-糖苷或β-1,3-糖苷。甘露糖是指由6个碳原子形成的单一的糖或单糖，并且其功能化学基团在碳1或异头碳中为醛。甘露聚糖可以包含得自甘露糖蛋白的肽残基(其与甘露糖蛋白天然结合)。任何甘露聚糖都可以用于本发明的内容中。甘露聚糖的实例包括但不限于聚甘露糖,半乳甘露聚糖,葡萄甘露聚糖,乙酰化甘露聚糖和芦荟多糖(aloeride)。

甘露聚糖可以理解为甘露糖通过α-D-(1→6)键结合而形成的线性结构，其具有主要通过α-D-(1→2)键(而且还通过α-D-(1→3)键)形成的不同单元的常见的短的支链。

“半乳甘露聚糖”可以理解为甘露糖链彼此通过β(1→4)键结合而形成的化合物，在多数情况下，其具有半乳糖单元通过α(1→6)键与甘露糖结合而形成的支链。根据提取半乳甘露聚糖的植物，半乳甘露聚糖具有不同的支化程度。

“葡萄甘露聚糖”应该理解为以下化合物，其化学结构通过β(1→4)键连接的比例分别为8:5的D-甘露糖和D-葡萄糖。例如葡萄甘露聚糖在植物魔芋(Amorphophalluskonjac)的块茎中发现。

“乙酰化甘露聚糖”应该理解为β(1-4)-甘露聚糖型的O-乙酰化复合多糖的混合物。例如乙酰化甘露聚糖在植物(Aloevera)中发现。

“芦荟多糖”可以理解为由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖构成的具有高分子量的多糖。例如芦荟多糖在植物真芦荟中发现。

甘露聚糖(聚甘露糖,半乳甘露聚糖,葡萄甘露聚糖等)可以得自天然来源，例如得自真菌、酵母菌和植物，或者使用本领域的专业人员普遍已知的技术通过化学合成而获得。在具体的实施方案中，作为本发明的免疫原性复合物的一部分的甘露聚糖得自酵母菌、植物或真菌。在另一个具体的实施方案中，酵母菌选自酵母属、毕赤酵母属和假丝酵母属。

酵母属的实例。酵母菌包括但不限于S.bayanus,布拉迪酵母(S.boulardii),S.bulderi,S.cariocanus,S.cariocus,酿酒酵母(S.cerevisiae),S.chevalieri,S.dairenensis,S.ellipsoideus,S.eubayanus,S.exiguus,S.florentinus,S.kluyveri,S.martiniae,S.monacensis,S.norbensis,奇异酵母(S.paradoxus),巴斯德酵母(S.pastorianus),S.spencerorum,S.turicensis,S.unisporus,S.uvarum和S.zonatus。在更具体的实施方案中，酵母菌为酿酒酵母。

毕赤酵母属的实例。酵母菌包括但不限于巴斯德毕赤酵母(P.pastoris),P.anomola,P.heedii,P.guilliermondii,P.kluyveri,P.membranifaciens,P.norvegensis,P.ohmeri,巴斯德毕赤酵母和P.subpelliculosa。

假丝酵母属的实例。酵母菌包括但不限于白色念珠菌(C.albicans),C.ascalaphidarum,C.amphixiae,南极假丝酵母(C.Antarctica),C.C.C.atmosphaerica,C.blattae,C.carpophila,C.cerambycidarum,C.chauliodes,C.corydali,C.dosseyi,C.dubliniensis,C.ergatensis,C.fructus,光滑念珠菌(C.glabrata),C.fermentati,C.guilliermondii,C.haemulonii,C.insectamens,C.insectorum,C.intermédia,C.jeffresii,乳酒念珠菌(C.kefyr),C.krusei,葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae),C.lyxosophila,C.maltosa,C.marina,C.membranifaciens,C.milleri,C.oleophila,C.oregonensis,C.parapsilosis,橡树假丝酵母(C.quercitrusa),C.rugosa,C.sake,C.shehatea,C.temnochilae,C.tenuis,C.tropicalis,C.tsuchiyae,C.sinolaborantium,C.sojae,C.subhashii,C.viswanathii,C.utilis。

可以提取甘露聚糖的植物的实例包括但不限于豆科(例如角豆树Ceratoniasiliqua,瓜尔豆胶Cyanaposistetragonolobus等)，块茎(例如魔芋等)，由得到的植物种子，其中甘露聚糖用作能量储备和绿藻类(例如伞藻属,松藻属,海棍藻属等)和红藻类(脐形紫菜(Porphyraumbilicalis))的植物细胞壁。

可以提取甘露聚糖的真菌的实例包括但不限于拟青霉属和多孔蓖科真菌灵芝(GanodermaIucidum)(reishi)。

如本领域的技术人员所理解的那样，如果甘露聚糖由真菌或酵母菌获得，则其为真菌和酵母菌细胞壁的一部分，因此其可以包含有机体合成细胞壁所使用的蛋白质的残基。由此，甘露聚糖的结构中可以包含由存在的氨基酸残基得到的氨基。因此，在另一个更具体的实施方案中，所述的氨基得自赖氨酸的氨基酸。

在本发明中，“二醛”可以理解为是指包含2个醛基的化合物。二醛的实例包括但不限于戊二醛,乙二醛,丙二醛,丁二醛和己二醛。在优选的实施方案中，二醛为戊二醛。

如上所述，本发明的免疫原性复合物包含聚合物的抗原、甘露聚糖和二醛。因此，本发明的免疫原性复合物的成分的结合可以通过化学缀合、物理缀合或同时以2种方式缀合来生成。

在本发明中，“化学缀合”可以理解为本发明的免疫原性复合物的成分通过化学键的方式而结合。如上述说明，由于甘露聚糖的结构中存在氨基酸，例如赖氨酸，所以甘露聚糖可以包含氨基。不希望被理论所束缚，认为免疫原性复合物的成分之间的结合可以通过甘露聚糖中存在的氨基与反应中存在的二醛之间的键而生成。因此，在具体的实施方案中，聚合的抗原通过二醛与甘露聚糖结合。在水性介质中的二醛以一定比例以聚合形式存在，因此，多种种类具有2个或多个醛官能团，该醛官能团与甘露聚糖中和抗原蛋白质中存在的氨基反应，从而在反应混合物中存在的多种成分中形成共价交联。醛与氨基之间的一级反应使得所谓的Schiff碱形成，根据pH的条件，该Schiff碱可以是可逆的。但是，在醛基属于二醛或多醛化合物(例如戊二醛)并且其聚合形式存在于水性溶液中的情况下，发生了丁间醇醛型的缩合和脱水的其他反应，这生成了多官能聚合本性的α-β不饱和羰基系统。此外，已经显示Schiff碱还可以与反应介质中存在的醛形成羟醛缩合。另一方面，由羟醛缩合衍生得到的羰基和α-β不饱和亚胺可以通过氨基发生缀合物加成反应，从而形成新的稳定的共价键。与原始二醛的多官能本性及其在反应介质中存在的聚合形式一起描述的化学反应性是甘露聚糖与抗原之间化学共价且稳定交联从而形成最终的聚合化学缀合物的基础。

在本发明中，“物理缀合”可以理解为本发明的免疫原性复合物的成分通过物理诱捕而结合。不希望被理论所束缚，认为当抗原聚合时，甘露聚糖处在被诱捕于聚合物织物(刚性且其结构是高水平支化的是有利的)中。因此，在具体的实施方案中，变应原通过聚合物的物理诱捕而与甘露聚糖结合。

一旦形成免疫原性复合物，则所述的成分的比例可以根据介质中存在的甘露聚糖的浓度而改变。因此，在具体的实施方案中，抗原:甘露聚糖的比例范围为1:10至1:0.1，优选为1:4至1:0.15，更优选为1:3至1:0.3，更优选为1:4至1:0.5。在具体的实施方案中，抗原:甘露聚糖的比例为1:0.3或1:0.5。

本发明的方法

本发明的发明人发现将二醛加入至抗原和甘露聚糖的混合物中允许抗原聚合，同时抗原与甘露聚糖缀合，这可以获得以下免疫原性复合物或疫苗，其在个体中能够刺激和/或诱导免疫应答，而不会引发对该复合物的过敏反应，并且其可以被树突状细胞(DC)识别并捕获。

因此，在另一个方面中，本发明涉及获得本发明的免疫原性复合物的方法，下文称为“本发明的方法”，其包括：(i)制备包含抗原和甘露聚糖的溶解液，以及(ii)将二醛加入至所述的溶解液中。

在第一步骤[步骤(i)]中，本发明的方法由制备包含抗原和甘露聚糖的溶解液组成。

术语抗原如之前所定义。在具体的实施方案中，抗原为变应原。变应原的实例包括但不限于花粉变应原提取物，由节肢动物得到的变应原提取物，由食物或食物产品得到的变应原提取物，在昆虫的唾液、爪或刺上存在的成分(在受试对象中会诱导敏感反应)等。在具体的实施方案中，变应原选自花粉，优选为梯牧草,喜马拉雅鸭茅,狗牙根,多年生黑麦草,三毛草属,橄榄,Cuppresusspp.,豚草属,桦木属,悬铃木属,欧榛或欧洲桤木；虫螨，优选为属于物种欧洲室尘螨,美洲尘螨或Blomiatropicalis的虫螨；上皮细胞，优选为属于物种Felisdomesticus或家犬的上皮细胞；真菌孢子，优选为属于物种烟草赤星病菌或细链格孢的真菌孢子；以及它们的组合。

如本领域的技术人员所理解的那样，步骤(i)的溶解液可以包含多于一种的抗原，其可以是彼此不同的或相同的。因此，在具体的实施方案中，溶解液包含至少2种抗原，其可以是彼此相同的或不同的。

用于获得抗原和变应原提取物的技术和方法学是本领域技术人员普通已知的，但是这些抗原和变应原提取物可以是市售可得的，或者以重组蛋白质的形式发现。在这种情况下，抗原或变应原提取物是冻干的，其必须例如使用磷酸盐缓冲剂来重新构成，这样其可以用于本发明的方法中。

另一方面，步骤(i)的溶解液还具有甘露聚糖。术语甘露聚糖如之前所定义，并且可以用于本发明的方面中。甘露聚糖的实例包括但不限于聚甘露糖,半乳甘露聚糖和葡萄甘露聚糖。在本发明的方法的具体的实施方案中，用于本发明的方法中的甘露聚糖得自酵母菌、植物或真菌。在另一个更具体的实施方案中，酵母菌选自酵母属，具体为酿酒酵母、毕赤酵母属和假丝酵母属。可以获得甘露聚糖的酵母菌、真菌和植物的实例在本公开之前的部分中进行了描述。此外，如上文所述，在甘露聚糖的结构中可以包含由甘露糖蛋白中存在的氨基酸残基得到的氨基。因此，在另一个甚至更具体的实施方案中，甘露聚糖包含氨基，在另一个更具体的实施方案中，所述的氨基得自赖氨酸的氨基酸。

加入至溶解液中的甘露聚糖的量可以根据预期在本发明的免疫原性复合物中获得的抗原:甘露聚糖比例而改变。因此，在具体的实施方案中，抗原:甘露聚糖的比例范围为1:10至1:0.1，优选为1:4至1:0.15，更优选为1:3至1:0.3，更优选为1:4至1:0.5。在具体的实施方案中，抗原:甘露聚糖的比例为1:0.3或1:0.5。

一旦制备抗原和甘露聚糖的溶解液，便将二醛作为聚合试剂加入[本发明的方法的步骤(ii)]。将二醛逐渐加入至溶解液中，直至达到足以取得抗原聚合以及甘露聚糖与抗原缀合的浓度。使用二醛制备聚合物的技术和方法学是本领域现有技术所公知的，并且是本领域的专业人员的惯例(Silvaetal.2004.ChemicalModificationson蛋白质sUsingGlutaraldehyde.FoodTechnol.Biotechnol.42:51–56)。

在将二醛加入至抗原和甘露聚糖分散液中之后，使混合物处于合适的条件下，并且在4℃下在搅拌下发生聚合反应的足够时间为例如大约15小时。

在具体的实施方案中，二醛选自戊二醛,乙二醛,丙二醛,丁二醛和己二醛。优选地，二醛为戊二醛。

在发生聚合反应所需的时间结束时，通过将混合物中加入能够中和(中和试剂)游离醛基的试剂来终止反应，其中所述的试剂例如为包含氨基的试剂(例如氨基酸、ε-氨基-n-己酸等)或者与醛反应的其他反应试剂(例如焦亚硫酸钠、铵等)，但排除氧化试剂(例如过氧化氢、过氧化钠等)，因为它们作用于甘露糖。在本发明的方法的具体的实施方案中，所述的方法具有额外的步骤(iii)，其包括加入中和试剂，例如氨基酸、特别是甘氨酸，来终止聚合反应。加入至反应混合物中以终止聚合的甘氨酸的量可以根据反应条件而改变，而且计算必须加入以终止聚合的甘氨酸的量是本领域的专业人员的惯例。通常，甘氨酸相对于醛的加入量而言必须是过量的，例如二醛:甘氨酸的比例为1:50。

在终止聚合反应后，可以分离免疫原性复合物，这是本领域的技术人员的惯例。因此，在具体的实施方案中，本发明的方法包括分离免疫原性复合物的步骤(iv)。实际上，分离蛋白质复合物的任何方法都可以用于本发明的内容中。所述的方法的实例包括但不限于低压或高压液相色谱柱，基于结合甘露糖的凝集素(例如ConcanavalinA)的亲和色谱，沉淀技术(例如硫酸铵)，密度梯度分离和差示离心。例如包含本发明的免疫原性复合物(已经形成)的混合物可以被透析，从而消除盐和可能的未聚合的残基，此后例如通过切向超滤(具有孔径为100KDa的膜)对聚合的混合物进行过滤。

本发明的免疫原性复合物的用途

本发明的免疫原性复合物具有某些技术特征，这些特征使得其在个体中能够刺激和/或诱导免疫应答，并且在变应原的情况下对所述的复合物具有低的过敏反应。这种性质得以使用本发明的免疫原性复合物来精制药物组合物，当将该药物组合物给予受试对象时，其能够刺激和/或诱导所述的受试对象的免疫应答，并且使得其在治疗例如过敏、感染疾病或瘤形成中合适地用作疫苗。

因此，在一个方面中，本发明涉及本发明的免疫原性复合物在药物组合物的精制中的用途。

因此，在另一个方面中，本发明涉及药物组合物，下文中称为“本发明的药物组合物”，其包含本发明的免疫原性复合物以及药物可接受的载体。药物可接受的载体的实例是本领域现有技术已知的，并且包括磷酸盐缓冲的生理盐水溶液，水，乳液(例如油/水)，不同类型的润湿剂，无菌溶解液等。可以通过本领域现有技术已知的常规过程来配制包含所述的载体的组合物。用于说明本发明的免疫原性复合物的所有具体的实施方案都可以用于本发明的方面中。此外，本发明的药物组合物还可以具有药物可接受的赋形剂，稀释剂，佐剂(例如氢氧化铝、磷酸钙、单磷酰脂质A、壳聚糖等)，和/或稳定剂(例如甘油)。如本领域的专业人员应该理解的那样，本发明的免疫原性复合物以治疗有效量存在于本发明的组合物中，换言之，所述的量为足以在受试对象中发挥刺激和/或诱导免疫应答的作用的量。

术语药物组合物包含在人类或动物护理(兽用组合物)中使用的组合物。

在具体的实施方案中，本发明的药物组合物还包含额外的物质。实际上，潜在地用于对症治疗疾病或过敏的任何物质都可以作为额外的活性物质而引入。所述的额外的活性物质的示意性而非限定性的实例包括抗组织胺药s,甾类激素s,色甘酸二钠,氟替卡松,卢帕他定,依巴斯汀,氯雷他定,地氯雷他定,组氨受体的其他拮抗剂,白细胞三烯等，以及它们的混合物。

本发明的药物组合物可以通过任何合适的途径(例如口服、舌下、口周、鼻内、肠胃外、经皮、局部给予途径等)给予，对于这些途径，可以使用所选给予途径的配制物所需的药物可接受的赋形剂和载体。给予和制备药品的不同药物方式是本领域的技术人员公知的。在示意性而非限定性的方式中，本发明的药物组合物可以为大颗粒、纳米颗粒或脂质体形式的配制物的一部分，并且其可以以固体药物给予形式、液体药物给予形式或包含分散系统的药物给予形式给予。更具体而言，本发明的药物组合物可以为注射溶液形式，适用于舌下传递的药物形式，粉末，小丸，小珠，片剂，胶囊，糖浆，乳液，栓剂，滴眼液，雾化，气雾剂，乳膏，凝胶等。根据医生和临床因素来测定本发明的组合物的剂量方案。如医药领域所公知的那样，剂量取决于多种因素，包括患者的身体特征(年龄，高度，性别)，所采用的传递过程，疾病的严重性，所采用的具体的化合物以及个体的药代动力学性质。

在具体的实施方案中，所述的药物组合物用于刺激和/或诱导免疫应答。在另一个具体的实施方案中，所述的药物组合物用作疫苗。在另一个具体的实施方案中，所述的药物组合物用于治疗受试对象中的过敏、感染性疾病和瘤形成。

在本发明中，“过敏”可以理解为颗粒或物质(所谓的“变应原”)的超敏性，其中所述的颗粒或物质如果被吸入、消化或触摸，则会在受试对象中产生特征性的临床现象并引入免疫应答，主要是IgE应答。术语“变应原”已经在本公开的上文中进行了描述。

在本发明中，“感染性疾病”是指符合微生物有机体(例如细菌、真菌、病毒、原生动物等)或朊病毒引起的感染的临床表现。感染性疾病的实例包括但不限于布鲁氏菌病(布鲁菌属),炭疽(炭疽杆菌(Bacillusanthracis)),霍乱(霍乱弧菌(Vibriocholerae)),白喉(白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)),丹毒(链球菌属),Q热(贝纳特氏立克次体(Coxiellaburneti)),伤寒(伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphi),副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)),Legionnaires病(嗜肺性军团病杆菌(Legionellapneumophila)),肺炎(肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae),金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus),克雷白氏杆菌(Klebsiellapneumoniae),支原体属,衣原体属),肺结核(结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis))和破伤风(破伤风杆菌(Clostridiumtetani))。病毒感染性疾病的实例包括但不限于登革热(黄病毒),黄热病(黄病毒),埃博拉出血热(线状病毒),流感(流感病毒),甲型肝炎(肠道病毒(VHA)),乙型肝炎(正肝去氧核糖核酸病毒(VHB)),丙型肝炎(丙型肝炎病毒(VHC)),疱疹(疱疹病毒),单核细胞增多症(EB病毒),腮腺炎(巴拉米哥病毒),猪瘟(鼠疫病毒),脊髓灰质炎(肠道病毒),感冒(鼻病毒,冠状病毒,Ecovirus,柯萨基病毒),狂犬病(棒状病毒),风疹(风疹病毒),麻疹(麻疹病毒),水痘(水痘-带状疱疹)和天花(正痘病毒)。真菌感染的实例包括但不限于曲霉病,念珠菌病,广色霉菌病,隐球菌病,脚癣,孢子丝菌病,组织胞浆菌病,环状疱疹,耳癣,花斑癣,角膜真菌病和接合菌病。原生动物引起的疾病的实例包括但不限于利什曼病,疟疾,隐孢子虫病,弓形体病,阿米巴病,贾第鞭毛虫病和Chagas病。朊病毒引起的感染性疾病的实例包括但不限于Creutzfeldt-Jakob病,牛脑海绵状病(“疯牛病”),痒病(或颤抖病),致死性家族失眠病(FFI)和苦鲁病。

在本发明中，“瘤形成”可以理解为通过改变细胞增殖并多次改变细胞分化而引起的疾病，其由团块或肿瘤的形成组成，在恶性的情况下，称为癌症。良性瘤形成的实例包括但不限于纤维瘤(纤维结缔组织),粘液瘤(疏松结缔组织),脂肪瘤(脂肪组织),软骨瘤(软骨组织),骨瘤(骨组织),血管瘤(血管),淋巴管瘤(淋巴管),脑膜瘤(脑膜),血管球瘤(支持神经组织),平滑肌瘤(平滑肌组织),横纹肌瘤(横纹肌组织),乳突淋瘤(形成乳头的上皮组织),腺瘤(腺组织)和畸胎瘤(全能细胞)。恶性肿瘤的实例包括但不限于肉瘤(例如纤维肉瘤,粘液肉瘤,脂肪肉瘤,软骨肉瘤,骨肉瘤,血管皮内细胞瘤,淋巴管肉瘤,滑膜肉瘤,平滑肌肉瘤,横纹肌肉瘤等),癌(例如表皮或鳞状细胞癌,基底细胞癌,腺癌,囊腺癌,绒毛膜癌,阴茎癌,肺癌,乳癌,结肠癌等),神经胶质瘤,淋巴瘤,白血病,黑素瘤,肝细胞瘤,精原细胞瘤,脊索瘤和间皮瘤。另一方面，癌症的实例包括但不限于肺癌,乳癌,结肠直肠癌,胰腺癌,卵巢癌,白血病,前列腺癌,肝癌和膀胱癌。

在本发明中，个体或受试对象是指动物物种的成员，优选为哺乳动物，并且包括但不限于宠物、灵长动物和人类，在本发明的内容中，所述的个体优选为任何种族或年龄的雄性或雌性人类。

“疫苗”是指一旦处于有机体中，便引起特定的淋巴细胞活化和抗原产生并由此产生针对外源物质或致病微生物有机体的防御应答的抗原制备物。这种应答可以生成免疫记忆，产生针对相应的病原体攻击的短暂或长期的免疫力。

因此，本发明允许针对受试对象进行疫苗定制，换言之，可以根据受试对象的需要来选择抗原，从而产生本发明的免疫原性复合物，其可以用作疫苗。待治疗/预防的疾病取决于用于制备本发明的免疫原性复合物而选择的抗原。因此，任何过敏、感染性或抗肿瘤疾病都可以使用本发明的免疫原性复合物来治疗。例如在了解受试对象对其过敏的变应原之后，可以根据本发明来制备包含所选的变应原(多种)的免疫原性复合物，并且可以将其给予受试对象，从而产生免疫应答，由此治疗过敏。

因此，在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的免疫原性复合物的疫苗。

本发明的治疗方法

在另一个方面中，本发明涉及用于预防和/或治疗受试对象中由变应原引起的感染性疾病、肿瘤或过敏反应的方法，其中所述的方法包括将本发明的免疫原性复合物或本发明的药物组合物给予所述的受试对象。

在整个说明书和权利要求书中，术语“包含”及其变体不排除其他技术特征、添加剂、成分或步骤。对于本领域的专业人员而言，本发明的其他目的、优点和特征可以部分由说明书、部分由本发明的实践推导得到。提供以下实施例和附图是为了说明的目的，其无意于限定本发明。

附图简述

图1.其示出甘露聚糖与高碘酸盐的氧化反应的图示。方案显示在由酵母菌衍生得到的甘露聚糖中的2种类型的糖苷键α(1-2)和α(1-6)。使用高碘酸盐的氧化会破坏2种情况下的吡喃糖环。

图2.其示出使用高碘酸盐预处理的和未使用高碘酸盐处理的甘露聚糖的一维光谱的图示。

图3.其显示4辐图，代表了在多种聚合的变应原(黑柱)中的游离氨基占天然未聚合形式的变应原值(白柱)的百分率。所示的数据为至少4种不同批次的平均值。

图4.其为显示在使用事先氧化的甘露聚糖处理牛血清白蛋白(BSA)之后在变性条件下的电泳(PAGE)结果的图像。泳道对应于缀合物的混合物粗品(缀合的BSA)以及在AMICONYM100中过滤的2种样品(BSA小于100kDa，和BSA大于100kDa)。

图5.其为显示通过气相色谱由梯牧草(Phleumpratense)的天然提取物或梯牧草的聚合物得到的氨基酸的分析图。在聚合的样品中观察到游离赖氨酸显著减少。

图6.其为显示由酿酒酵母得到的甘露聚糖原液样品的氨基酸的分析图。

图7.其为显示使用甘露聚糖以不同的比例(蛋白质:碳水化合物)聚合的样品的一维光谱的图。未使用甘露聚糖聚合的样品用作对照。

图8.其为显示使用甘露聚糖以不同的比例(蛋白质:碳水化合物)聚合的样品的二维光谱(DOSY)“扩散序谱Y(扩散序谱Y)”的图。未使用甘露聚糖聚合的样品用作对照。

图9.其为显示通过梯牧草的气相色谱而分析的不同样品单糖百分率的图示。

图10.其为显示一维光谱的图，其比较了梯牧草天然提取物(未聚合的)、聚合的(未使用甘露聚糖)以及以一定比例(1:0.5)共同聚合的样品。

图11.其为显示由梯牧草、未聚合的以及使用和未使用甘露聚糖聚合的样品得到的二维光谱(DOSY)“扩散序谱Y”的图。

图12.其为显示二维光谱HSQC(H-C)的图，其中比较了梯牧草的不同样品。非单体区的放大区域。

图13.其为显示由使用甘露聚糖以不同的比例(蛋白质:碳水化合物)聚合的(D.farinae)的虫螨提取物样品得到的二维光谱(DOSY)“扩散序谱Y”的图。未使用甘露聚糖聚合的样品用作对照。

图14.其为显示叠加一维光谱的图，其中所述的光谱得自D.farinae的天然提取物、聚合的(未使用甘露聚糖)和以一定比例(1:0.3)共同聚合的样品。

图15.其为显示通过D.farinae的气相色谱所分析的不同样品单糖百分率的图示。

图16.其为显示由D.farinae、未聚合的以及使用或未使用甘露聚糖聚合的样品得到的二维光谱(DOSY)“扩散序谱Y”的图。

图17.其为a)天然提取物，b)聚合的和c)只用甘露聚糖聚合(1:0.3)的D.farinae样品的电子显微图像。

图18.其为显示在不同时间下梯牧草的一维质子光谱的一组图。

图19.图19A为图，其显示对梯牧草的天然提取物进行IgE结合抑制的ELISA检验的结果，其中所述的梯牧草具有天然的变应原(未聚合的)，聚合的非甘露糖基化的变应原和使用戊二醛进行甘露糖基化的变应原。图19B为相当于SDS(SDS-PAGE)存在下的聚丙烯酰氨凝胶电泳和免疫检测(免疫印迹)的图像，其中所述的电泳和免疫检测使用了由过敏患者得到的血清、梯牧草的提取物(与PAGE分离的蛋白质具有IgE反应性)。Pm＝分子量模型；1＝天然变应原；2＝聚合的未甘露糖基化的变应原；3＝使用戊二醛进行甘露糖基化的变应原。

图20.图20A为图，其显示对欧洲室尘螨和D.farinae的天然提取物进行IgE结合抑制的ELISA检验的结果，其中所述的天然提取物分别具有天然变应原(未聚合的)、聚合的未甘露糖基化的变应原和使用戊二醛进行甘露糖基化的变应原。图20B为相当于SDS(SDS-PAGE)存在下的聚丙烯酰氨凝胶电泳和免疫检测(免疫印迹)的图像，其中所述的电泳和免疫检测使用了由过敏患者得到的血清、欧洲室尘螨和D.farinae的提取物(与PAGE分离的蛋白质具有IgE反应性)。Pm＝分子量模型；1＝天然变应原；2＝聚合的未甘露糖基化的变应原；3＝使用戊二醛进行甘露糖基化的变应原。

图21.其为一组图，其显示出在对梯牧草或D.farinae过敏的患者中体外嗜碱细胞活性检验的结果，其中所述的对梯牧草或D.farinae为未聚合的提取物(天然)、聚合的(Pol)或与甘露聚糖聚合的(Pol甘露聚糖)，并具有相同的蛋白质浓度。使用试剂盒，通过流式细胞仪来分析嗜碱细胞的活性。

图22.其为显示在对梯牧草过敏的患者中对体内应答(刺痛检验)的测试的结果，其中所述的梯牧草为未聚合的提取物(天然)、聚合的(Pol)或与甘露聚糖聚合的(Pol甘露聚糖)，并具有相同的蛋白质浓度。

图23.其为显示在对D.farinae过敏的患者中对体内应答(刺痛检验)的测试结果的值的箱线图，其中所述的D.farinae为未聚合的提取物(天然)、聚合的(Pol)或与甘露聚糖聚合的(Pol甘露聚糖)，并具有相同的蛋白质浓度。

图24.图24A为显示使用得自聚合物的(Pol)梯牧草(Pol)、或者聚合的且甘露糖基化的(Pol甘露聚糖)梯牧草得到的变应原，在对由人类单核细胞衍生的树突状细胞(DC)摄入的测试中所获得的结果的图示。利用与这种禾本科提取物有关的颜料的自发荧光，通过流式细胞仪进行测试。图24B为显示使用得自未聚合物的(天然)梯牧草、聚合的(聚合物)或者使用甘露聚糖聚合的(Pol甘露聚糖)(使用Alexa488在半胱氨酸处进行标记)得到的变应原，在对由人类单核细胞衍生的树突状细胞(DC)摄入中所获得的结果的图示。在2个温育时间(1和5min)下进行测试，并通过流式细胞仪进行分析。顶部显示双阳性细胞(右上方象限)，其中捕获了Alexa488的DC(HLADR+)被浓缩。下侧显示根据与DC温育的制备物的DC的平均荧光强度。图24C为代表微管区域的共聚焦显微镜样品，以便理解在温育30min后在不同的荧光素化制备物(Alexa488)中被DC摄入的差异。与不同复合物有关的荧光可以在附图中以细胞内小白点的形式可见(为了更好地识别被捕获的荧光染料，上方面板为阳性，下方面板为阴性，以黑点表示)。

图25.其为一组图，其显示在24小时中，使用天然(N)梯牧草的提取物、聚合的(P)梯牧草(P)和使用甘露聚糖聚合的梯牧草(PM)来刺激的树突状细胞(DC)上清液中细胞因子的产生。

图26.其为显示在使用由未聚合的(天然)梯牧草,聚合的且未甘露糖基化的(Pol)梯牧草，或者聚合的甘露糖基化的(Pol-Man)梯牧草得到的变应原所刺激的树突状细胞中成熟标志物的表达。

图27.其为显示在使用由未聚合的(天然)D.farinae,聚合的且未甘露糖基化的(Pol)，或者聚合的且甘露糖基化的(Pol-Man)而得到的变应原所刺激的树突状细胞中成熟标志物的表达。

图28.其为显示在使用由梯牧草得到的聚合的(Pol)或者聚合的且甘露糖基化的(PolMan)变应原进行体外免疫测定后，对产生特异性IFNγ,IL-10和IL-4的细胞的诱导的图。通过ELISPOT测定产生细胞的量。

图29.其为显示在使用由D.farinae得到的聚合的(Pol)或者聚合的且甘露糖基化的(PolMan)变应原进行体外免疫测定后，对产生特异性IFNγ,IL-10和IL-4的细胞的诱导的图。通过ELISPOT测定产生细胞的量。

图30.其为用于Balb/c小鼠的免疫方案。

图31.其为在淋巴细胞增殖测试中随后进行的方案。

图32.其为显示在使用由梯牧草得到的5μg变应原而免疫的小鼠中增殖应答的图，其中所述的变应原为聚合的但为甘露糖基化的(聚合物)，或者聚合的且甘露糖基化的(聚合物甘露聚糖)。使用CSFE进行增殖测定。

图33.其为显示在使用由D.farinae得到的20μg变应原而免疫的小鼠中增殖应答的图，其中所述的变应原为聚合的但为甘露糖基化的(聚合物)，或者聚合的且甘露糖基化的(聚合物甘露聚糖)。使用CSFE进行增殖测定。

图34.其为一组图(图34A和34B)，其显示在使用由梯牧草得到的聚合物来免疫的小鼠的脾细胞所产生的细胞因子，其作为对由梯牧草的天然(未聚合的)变应原的应答。柱表示由相同的组得到的小鼠的平均值。灰色的柱：未甘露糖基化的聚合物；黑色的柱：甘露糖基化的聚合物。

图35.其为一组图(图35A和35B)，其显示在使用由D.farinae得到的聚合物来免疫的小鼠的脾细胞所产生的细胞因子，其作为对由D.farinae的天然(未聚合的)变应原的应答。柱表示由相同的组得到的小鼠的平均值。灰色的柱：未甘露糖基化的聚合物；黑色的柱：甘露糖基化的聚合物。

图36.其为一组图(图36A和36B)，其显示针对由梯牧草得到的天然(未聚合的)形式的变应原的、特异性抗体的水平，其是在使用变应原来免疫小鼠而得到的血清中检测的，其中所述的变应原为聚合的但未甘露糖基化的(聚合物)，或者聚合的且甘露糖基化的(聚合物甘露聚糖)。下方的图表示在使用IgG2a和IgE的各类免疫原诱导的特异性抗原的水平之间的比例。

图37.其为一组图(图37A和37B)，其显示针对由D.farinae得到的天然(未聚合的)形式的变应原的、特异性抗体的水平，其是在使用变应原来免疫小鼠而得到的血清中检测的，其中所述的变应原为聚合的但未甘露糖基化的(聚合物)，或者聚合的且甘露糖基化的(聚合物甘露聚糖)。下方的图表示在使用IgG2a和IgE的各类免疫原诱导的特异性抗原的水平之间的比例。

实施例

实施例1：通过使用变应原(聚合物的或未聚合的)与氧化的甘露聚糖缀合而生产疫苗

1-甘露聚糖的氧化

事先，使用100KDa截留膜，通过超滤将由酿酒酵母得到的甘露聚糖分级。收集低分子量的过滤级份，并经历高碘酸盐的氧化。图1示出了高碘酸盐对甘露糖整体性和醛基生成的理论作用。在图2中，凭经验证明在甘露聚糖氧化后这些基团的生成。

2-变应原的聚合

使用戊二醛使得自不同来源(梯牧草、橄榄、欧洲室尘螨和欧洲桤木)的变应原聚合。图3示出了聚合的变应原中的氨基比天然的未聚合形式的变应原的值减少。根据欧洲药典(2.2.56部分，氨基酸分析)，通过与茚三酮反应来测定氨基的存在。

3-使用BSA(牛血清白蛋白)氧化的甘露聚糖的缀合

所得的结果显示BSA与氧化的甘露聚糖之间的缀合，这可以通过聚丙烯酰氨凝胶电泳来证明[图4,(缀合的BSA)]。相同的图示出了缀合的BSA级份(通过超滤而保留最大100kDa的级份)显示成BSA单体的方式。这意味着在变性环境下，很高百分率的可以形成的缀合物返回至初始状况，这说明与预氧化的甘露聚糖的缀合反应不会生成具有足够稳定性的产物。可以通过化学方法(称为还原胺化作用)来稳定这些缀合物，其中所述的方法涉及使用氰基硼氢化钠使缀合反应中形成的Schiff碱发生化学还原，从而得到相应的更稳定的仲胺。但是，该反应意味着在初始底物上的新的化学转化，其中所述的底物生成了在任何起始试剂(甘露聚糖和蛋白质)中均不存在的并且因此必需要定义和表征的官能团和化学实体(仲胺)。

4-使用由事先用戊二醛聚合的梯牧草变应原得到的蛋白质提取物，使氧化的甘露聚糖发生甘露聚糖缀合

尽管由于聚合物中游离的氨基显著减少而取得成功的缀合是不明显的(图3)，但是根据用于白蛋白所述的方案来检验过氧化的甘露聚糖与由梯牧草得到的变应原聚合物的缀合(Masárová,J.andMislovicová,D.2002.Int.J.Polymer.Anal.Charact.,7:106-116)。如预期的那样，在与戊二醛聚合后，游离赖氨酸的量相当于天然未聚合的提取物的总氨基酸％减少4.5折(图5)。

氧化的甘露聚糖与由聚合的梯牧草的提取物(分子大小大于100KDa的材料)缀合。此外，再次通过100KDa膜将反应产物分级。在该步骤中，收集大于100Kda的保留的级份，其中发现已经缀合的初始的聚合的提取物和甘露聚糖。

使用蒽酮，通过比色分析来分析由保留的样品得到的全部碳水化合物的含量，并且与未使用甘露聚糖处理的聚合的提取物的初始含量相比，未观察到样品中碳水化合物的量显著增加。另一方面，核磁共振研究(一维和二维研究)未显示2种化合物之间具有共价结合，也未显示分子水平下的结构差异，表明使用这种缀合方案，在2种成分之间未得到分子相互作用，因此，在2种产物之间未得到结合或缀合。不希望被理论所束缚，这可能是由于游离氨基(主要由赖氨酸提供)减少，以及游离残基的赖氨酸(由于蛋白质材料为聚合物)的可及性低，由此形成的具有较低挠性的刚性结构。这种可能性得到以下事实的支持：使用事先用戊二醛聚合的其他变应原得到了相同的阴性结果，以及由此游离氨基减少，如图3所示。

5-结论

这些结果表明在梯牧草的聚合的样品(以及其他聚合的变应原)与氧化的甘露聚糖之间缺乏缀合。该事实，以及甘露糖在氧化后发生转化的缺点(图1)(Shibuya,N.,etal.1988.JournalofBiologicalChemistry,263:728-734)和所形成的缀合物缺乏稳定性(即使使用富集赖氨酸的蛋白质，例如BSA，图4)可以废除这种方法学用于生产聚合的变应原疫苗。

实施例2

使用戊二醛，通过用甘露糖聚合的变应原的缀合来精制疫苗

材料和方法

用于蛋白质提取物聚合和缀合的方法由以下步骤组成：

1.所述的过程起始于由梯牧草得到的冻干的提取物，其在所需体积的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中重新构成，从而达到2mg/mL的最终蛋白质浓度。此后，使用磷酸钾或磷酸钠缓冲液将pH调节至7.2，其需要降低或升高提取物的pH，并且考虑调节pH所用的缓冲液的体积来计算蛋白质的浓度。

Ex.：起始蛋白质的定量：由P.pratense得到的300mg蛋白质

PBS需要量：150mL

将pH调节至7.2的需要量：1mL缓冲液

样品的最终浓度：1.986mg/mL

2.提取物的聚合和缀合反应：

在搅拌条件下在提取物上滴加聚合试剂，在本实施例中为戊二醛，直至达到最终浓度为0.025M。此外，在此时，还以比例1:0.5(蛋白质质量:甘露聚糖质量)加入用于样品缀合的甘露聚糖。在15小时中，在4℃下在搅拌下保持反应。

Ex.：戊二醛的初始浓度：2.5M.

加入到提取物中的体积：1.5mL

甘露聚糖(蛋白质:碳水化合物的比例为1:0.5)：90mg

3.终止反应：

将提取物温暖至室温(25℃)，并加入甘氨酸粉末以终止聚合反应。甘氨酸必需是过量的，例如与戊二醛的比例为1:50。将甘氨酸溶解于样品中，并在搅拌下在4℃下保持2小时。

Ex.：甘氨酸的初始浓度(分子量：75.07)：1.25M

戊二醛浓度：0.025M

提取物的体积：152.5mL(初始151mL+1.5mL戊二醛)

待加入的甘氨酸的定量：14.31g

4.随后，将提取物针对7个体积的蒸馏水进行透析，以便除去盐和可能未聚合的残基。使用交流过滤系统(Pellicon,MerckMillipore)，其具有100kDa多孔膜。

Ex.：提取物的体积：152.5mL

水的体积：1.525mL

5.最后，与甘露聚糖聚合的并缀合的提取物过滤通过0.22μm，等分，并冷冻于-60℃并冻干用于保存。

结果

使用所述的方法的结果是，得到了在免疫学方面比原始变应原改善的甘露糖基化的聚合物。使用戊二醛进行处理允许结合2种结构(变应原和甘露聚糖)，从而同时发生聚合和缀合，这可以通过以下实施例中所示的结果来证明(实施例3)。

所述的甘露糖基化的聚合物具有结构和免疫学性质，这些性质优于天然的或者聚合的和非甘露糖基化的变应原的性质，分别如实施例4和实施例5-10中所示。

因此，建立一种方法，用于在单一的步骤中，使用戊二醛，用甘露聚糖聚合的抗原的缀合，其中甘露糖结构的整体性得到保持。为了达到此目的，另一方面利用了以下事实：由自然来源得到的(例如由酿酒酵母)甘露聚糖具有原始甘露糖蛋白的肽残基，在该肽残基上，在包含赖氨酸的酵母菌中合成甘露聚糖(图6)，从而得到化学缀合。另一方面，在具有蛋白质聚合物的溶液中，甘露聚糖的聚合、支化和刚性结构得到良好地利用，其中甘露聚糖被通过戊二醛聚合的蛋白质所诱捕，得到物理缀合。在两种情况的任意一种中，在互不排斥的情况下，使用戊二醛处理天然形式的(未聚合的)蛋白质与甘露聚糖的混合物允许结合2种结构，这会同时产生缀合和聚合。

实施例3

通过与戊二醛发生反应，关于变应原(禾本科和虫螨)与甘露聚糖的聚合和缀合的证据

材料和方法

将在实施例2中获得的2mg等分的冻干样品溶解于0.5mL重水中，并在500MHzBrukerAdvance光谱仪或装配有冷冻探针的600MHzBrukerAdvance中通过核磁共振(NRM)来分析。根据制造商(BrukerBiospinCorporation(Billerica,Massachusetts,USA))标准化且实施的方案，在光谱采集和处理软件TOPSPIN中，由不同的样品获得一维质子共振光谱、二维质子碳13RNA异核核糖核酸(hetronuclear)相关光谱(HSQC；Zwahlenetal.,1997.J.Am.Chem.Soc.119:6711-6721)和通过平移扩散排序的二维光谱(DOSY,Wuetal.1995.J.Magn.Reson.A.115:260-264)。

使用用于分子总碳水化合物的蒽酮方法(Shields,R.andW.Burnett.1960.AnalyticalChemistry32:885-886)以及用于分析蛋白质的Bradford方法(Bradford,M.M.1976.AnalyticalBiochemistry72:248-254)，通过比色技术来分析样品的碳水化合物和蛋白质含量。

通过对以糖醇乙酸酯形式释放的单糖进行总酸水解和气相色谱分析(M.F.Chaplin&J.F.Kennedyeditors,CarbohydrateAnalysis:apracticalapproach.(1986)OxfordIRLPRESS)，对由样品的碳水化合物部分得到的不同的单糖速率进行分析。

通过样品的总酸水解对样品的蛋白质部分中的不同的氨基酸进行分析，并在BiochromAminoacidAnlyzer仪器中通过对所释放的氨基酸实施液相色谱来进行分析。

结果

3.1-梯牧草与不同比例的甘露聚糖的共同聚合的研究，从而建立能够使用甘露聚糖聚合的提取物发生充分缀合的更合适的比例。

使用不具有甘露聚糖的聚合物样品，通过核磁共振(NMR)，对在该方法中获得的具有不同蛋白质:甘露聚糖比例的样品的结构进行分析。自身聚合的蛋白质提取物具有属于样品本身的寡糖残基(12-20％)，这可以通过气相色谱来证明(单糖分析)。通过增加介质中的糖的量，光谱中多糖的信号也增强，如所预期的那样(图7)。进行平移扩散研究，该研究根据扩散系数对化合物进行排序，并相应地取决于分子大小(通过NMR的二维光谱；二维光谱(DOSY)“扩散序谱Y”)。在本研究中，可以观察到在使用甘露聚糖聚合的样品中，颗粒比未聚合的样品更大，这表明在所有情况下蛋白质提取物与甘露聚糖之间的结合(图8)。具体而言，在比例为1:4的情况下，观察到更大量的寡糖部分，这可能是由于反应介质中过量的碳水化合物的原因。

另一方面，对蛋白质和糖的量进行定量，从而尝试并建立(大致而言)已经发生聚合过程的样品的蛋白质:糖的比例，并将其与原始比例比较(表1)。

表1：在聚合前和聚合后蛋白质:甘露聚糖的比例的比较

在聚合的样品中比例为1:4的情况下，正常的是在所得过程后得到较低比例的糖的量，这是由于在反应介质中发现大幅的初始过量，此后在洗涤步骤中除去未反应的部分。在剩余的样品中，发现多糖的比例比初始比例升高，这是由于提取物本身具有共价键合的多糖残基。

一旦获得所有的数据，便选择比例(1:0.5)，因为其证明了碳水化合物被引入至样品中并最少地使用了甘露聚糖。

3.2-在蛋白质-碳水化合物的比例下对梯牧草的共同聚合分析

3.2.1通过气相色谱的碳水化合物分析

由冻干材料的溶解开始，通过酸水解(糖醇分析)使用气相色谱来定量碳水化合物相对于全部样品的百分率(以干重计)(Fukuda,M.&Kobata,A.1993.Glycobiology.APracticalApproach.ThepracticalApproachSeries.OxfordUniversityPressInc.,NewYork.)。

分析3种样品(图9)：

-梯牧草天然提取物

-聚合的梯牧草

-使用甘露聚糖聚合的梯牧草(1:0.5)

所得的结果显示相对于聚合的样品(不具有甘露聚糖)和天然提取物而言，在经历共同聚合的样品中甘露聚糖显著升高。

3.2.2NMR(核磁共振)研究

通过NMR的结构研究显示聚合的样品中的信号变宽，表明大小增加，这得到了由平移扩散DOSY(扩散序谱Y)得到的二维光谱的证实(图10和11)。在该二维试验中，可以观察到在未聚合的蛋白质提取物的情况下，具有不同尺寸的材料，因此其为极其混杂的样品，当其聚合时，增加其平均分子大小。另一方面，当提取物在甘露聚糖存在下聚合时，还获得比所述的聚合物(由于多糖为高分子量)具有甚至更低的扩散系数(表明了更大的大小)的材料，说明多糖与蛋白质提取物之间的结合或相互作用，这是因为光谱的2个部分(碳水化合物区和蛋白质区)具有相同的扩散系数，说明2种成分的相互作用。这些核磁共振试验证实了在甘露聚糖存在下，在使用戊二醛使蛋白质提取物聚合后，缀合的蛋白质:甘露聚糖。

另一方面，根据碳13与质子之间的(13C-1H)RNA异核核糖核酸(HSQC,“HeteronuclearSingleQuantumCoeherence”)，通过NMR进行另一个二维研究。这些研究显示，在原子水平下，氢与碳之间形成键，并且这些键的每一个都相当于牢固的关系信号(concretecorrelationsignal)(峰)(由光谱得到)和位置(坐标:横坐标，¹H的化学位移；纵坐标：¹³C的化学位移)(其根据化合物的类型而不同)。该组信号(H-C键)得到二维图案，其对每种化合物而言是特异性的并且是排他的，类似于“指纹”的方式(Claridge,T.D.W.1999.High-resolutionNMRtechniquesinOrganicChemistry.TetrahedronOrganicChemistrySeries.Elsevier)。

进行3个HSQC试验来区分各种类型的样品的特征图案：

-游离的甘露聚糖

-由梯牧草得到的聚合物

-在甘露聚糖存在下由梯牧草得到的聚合物(1:0.5)

在甘露聚糖存在下聚合的样品呈现出甘露聚糖的特征信号，以及样品本身的固有碳水化合物的特征信号，表明蛋白质提取物与多糖之间的相互作用(图12)。

3.3-在不同甘露聚糖比例下，D.farinae的共同聚合过程的研究。

由使用梯牧草获得的结果开始，在蛋白质:碳水化合物的比例为(1:0.5)下进行初步试验，然而，所得的结果对于各种情况下的梯牧草提取物而言是不令人满意的，这是因为观察到未与蛋白质材料结合的过量的甘露聚糖残基(图13，通过黑色圆圈限定的信号)。在介质中，在较低的碳水化合物比例(1:0.3和1:0.15)下实施新的聚合。所选的比例为(1:0.3)，因为观察到在样品中引入了主要与蛋白质结合的形式(图13，盒b)的而非游离形式(图13，盒c，黑色圆圈)的甘露聚糖，并且甘露聚糖的这种引入高于所述的比例(1:0.15)，而且对于1:0.3的比例而言，在相当于蛋白质部分的光谱区中，观察到最大的干扰(图13)。

3.3.1在蛋白质:碳水化合物的比例为(1:0.3)下，D.farinae的共同聚合的分析。

图14显示在甘露聚糖以1:0.3的比例存在下由聚合的D.farinae提取物得到的样品相对于在甘露聚糖缺乏下聚合的相应以及未聚合的提取物样品的、一维质子光谱的定量比较。所述的光谱表明在使用甘露聚糖聚合的样品中甘露聚糖的特异性信号，以及在蛋白质特异性光谱区中通过聚合引起的光谱图案改变。

3.3.1.1通过气相色谱对碳水化合物的分析

由冻干材料的溶解开始，通过气相色谱对碳水化合物相对于全部样品的百分率(以干重计)进行定量(Fukuda,M.&Kobata,A.1993.Glycobiology.OxfordUniversityPressInc.,NewYork)。

分析3种样品(图15)：

-D.farinae天然提取物

-聚合的D.farinae

-使用甘露聚糖聚合的D.farinae(1:0.3)

D.farinae的提取物和聚合物包含样品本身固有的寡糖残基(在存在更多的葡萄糖、甘露糖和半乳糖下通过气相色谱测定为大约17-20％)。与甘露聚糖共同聚合的产物的结果显示相对于未使用甘露聚糖聚合的样品和天然提取物而言，甘露糖显著增多。

3.3.1.2NMR(核磁共振)研究

通过NMR来分析在(1:0.3)(蛋白质:甘露聚糖)的比例下同时聚合和缀合所获得的样品。这些结果显示在聚合的样品中，信号变宽，表明分子的大小增加，这可以在二维光谱DSY中证实(图16)。与梯牧草的情况类似，使用甘露聚糖聚合的样品是均匀的，并且大小比未使用甘露聚糖聚合的样品更大，表明多糖与D.farinae的蛋白质提取物之间的结合，由此证明2种成分之间的缀合。

3.3.1.3透射电子显微镜

由D.farinae的不同样品的透射电子显微镜得到的图像允许我们观察在天然的和聚合的提取物之间，结构水平的差异。在所述的聚合提供了更高密度的颗粒并且与甘露聚糖的缀合还会在形态学和结构水平上产生变化的情况下(在所述的聚合物中清楚可见)，进一步证明了多糖与蛋白质提取物之间的结合(图17)。

实施例4

通过与戊二醛的反应而产生的聚合和甘露糖基化生成了比未甘露糖基化的聚合物更稳定的聚合物

在水性介质中经过长期储存，比较梯牧草3种样品的稳定性，其中一种是在甘露聚糖存在下聚合的(蛋白质/甘露聚糖的比例为1:0.5)，另一种为在甘露聚糖缺乏下聚合的，以及未聚合的变应原本身。将与实施例3中分析的那些相等的样品等分物溶解于重水中，并通过NMR分析，接着储存在4℃下。未由NMR管中取出样品，也未进行操作。在储存后的4个月，根据相同的采集参数来重复NMR试验，从而检查在这些溶解条件(4℃下的重水)下样品的稳定性。结果以初始时和4个月后光谱的差异呈现(通过光谱仪自身的TOPSPIN软件进行光谱的差减)，显示聚合的样品比天然提取物更稳定(信号损失40％)，并且与甘露聚糖缀合甚至更增强了稳定性，这是因为仅4％的样品信号损失，表明样品降解/沉淀的指数较低(图18)。

实施例5

关于变应原性的损失，使用戊二醛进行甘露糖基化的聚合物与非甘露糖基化的聚合物相当

5.1-使用特异性IgE抗体的反应性测试

材料和方法

通过抑制ELISA技术来实施IgE反应性测试。以1μg天然提取物/孔(稀释于0.05M碳/重碳酸盐缓冲液,pH＝9.6中)平板接种96孔板(Microlon,highbindingcapacity,Greinerbio-one,Germany)。将平板在4℃下放置过夜。第二天，使用PBS-t缓冲液(磷酸盐缓冲液，具有0.25％Tween-20)洗涤平板，并在各种情况下将它们加入至由过敏患者(对禾本科或虫螨过敏)得到的相应的血清池中，并加入抑制剂(天然提取物、聚合的提取物和甘露糖基化的聚合的提取物)(通过1/2系列稀释，由100μg/mL稀释至0.01μg/mL)。将具有混合物的平板过夜温育，第二条，在使用PBS-t洗涤后，将它们与过氧化物酶缀合的抗人IgE单克隆抗体(SouthernBiotech,USA)(以1:2000稀释)温育。使用OPD系统(SigmaAldrich,USA)将平板显色30分钟。使用盐酸(1/10在水中稀释)终止反应，并在492nm下读取平板。

此外，还通过电泳和免疫检测来分析天然提取物、聚合的以及聚合的且甘露糖基化的IgE的反应性。在变性条件下，在聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行提取物的蛋白质的分离。实施免疫测试，从而将电泳分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜(BioRad,Germany)上。使用具有5％BSA(牛血清白蛋白)的PBS-t来封闭膜，并与得自过敏患者的血清温育。此后，将它们与过氧化物酶缀合的抗人IgE单克隆抗体(SouthernBiotech,USA)(以1:2000稀释)温育。使用ECL化学发光系统用于显色(GE-Healthcare,USA)。

结果

5.1.1将IgE与梯牧草的聚合物(使用戊二醛进行甘露糖基化)的反应性损失与非甘露糖基化的聚合物的反应性比较。

图19A显示抑制ELISA，其中可以理解的是P.pratense的聚合的变应原(甘露糖基化的或未甘露糖基化的)显示IgE的反应性比天然变应原降低。图19B显示在凝胶电泳和免疫检测(使用由过敏患者得到的血清来实施的)中对应于P.pratense的变应原蛋白质的条带，而在对应于聚合的变应原以及聚合的且甘露糖基化的变应原的泳道中，未观察到条带(PAGE-SDS)和IgE结合(免疫检测)。

5.1.2将IgE与欧洲室尘螨和D.farinae的聚合物(使用戊二醛进行甘露糖基化)的反应性损失与非甘露糖基化的聚合物的反应性比较

图20A显示抑制ELISA，其中可以理解的是欧洲室尘螨和D.farinae的聚合的变应原(与甘露聚糖缀合的或缀合的)具有相似的IgE反应性，其低于在天然变应原中所观察到的反应性。图20B显示在凝胶电泳和免疫检测(使用由过敏患者得到的血清来实施的)中对应于虫螨物种的变应原蛋白质的条带，而在对应于聚合的变应原以及聚合的且甘露糖基化的变应原的泳道中，未观察到条带(PAGE-SDS)和IgE结合(免疫检测)。

5.2-体外人类嗜碱细胞活化的检验

对梯牧草与D.farinae的不同制备物活化患者嗜碱细胞的能力进行评估，其中所述的患者对那些变应原过敏。

材料和方法

使用市售的试剂盒(ORPEGENPharma,Heidelberg,Germany)对嗜碱细胞的活化进行评估，其中所述的试剂盒允许通过流式细胞仪测量外周血中嗜碱细胞活化的百分率。过程：

1-将外周静脉血提取至具有肝素钠的管中。

2-将所述的血液与刺激缓冲液(包含IL-3)温育。

3-使用由P.pratense和D.farinae得到的变应原(天然的，聚合物以及聚合物-甘露聚糖)进行刺激。此外，还包括阴性对照(仅具有洗涤缓冲液)和阳性对照(趋化肽N-甲酰基-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(fMLP))。

4-使用荧光染料缀合的单克隆抗体(抗CD203c和抗CD63.FITC)来标记细胞。双阳性细胞(CD203c/CD63)反应了活化的嗜碱细胞。

5-使用低渗缓冲液使红细胞裂解。

6-在FC500血细胞计数仪(BeckmanCoulter)中进行分析。用于测定活化的嗜碱细胞的特异性标记：CD203c+和CD63+。

结果

在与各种未聚合的变应原(天然的)温育后，活化的嗜碱细胞(CD203c+CD63+)的百分率如所预计的那样，高于并类似于使用测试的阳性对照所获得的百分率。另一方面，当进行与梯牧草和D.farinae的聚合的变应原的温育时，活化程度降低。聚合物活化嗜碱细胞的能力的这种损失反映了它们变应原性的损失，并其如图21中所示，所述的损失与未甘露糖基化的和甘露糖基化的聚合物相当。所有这些表明甘露糖基化的聚合物保持它们对2种变应原的变应原性降低至与常规聚合的变应原(未甘露糖基化的)所显示的相同的程度。

5.3-在过敏患者中的皮肤检验(刺痛检验)

对梯牧草和D.farinae的不同制备物在患者中产生阳性皮肤检验的能力进行评估，其中所述的患者对那些变应原过敏。

材料和方法

刺痛检验

刺痛检验由以下组成：将P.pratense和D.farinae的一滴各种变应原(天然的，聚合物或者聚合物-甘露聚糖)(2个重复)分别置于对P.pratense和D.farinae过敏的患者的前臂皮肤上。将这些变应原(按照之前所述来制备)在50％缓冲的甘油盐水溶液中调节至相同的蛋白质浓度。使用1mm刺血针穿过液滴来刺痛皮肤而向真皮中引入变应原。变应原通过其特异性的IgE与肥大细胞致敏的患者反映，所述的肥大细胞在活化后释放组胺。释放的组胺增加了毛细管渗透性，从而产生了液体溢出物，这导致在刺痛后20分钟出现皮肤丘疹。

丘疹的大小(mm²)被认为是制备物的变应原性指数，该指数越高，所产生的丘疹的表面越大。

统计学

对于描述性统计而言，使用各置信界限为95％的平均值、标准偏差、相应的第一四分位数和第三四分位数的中值、变异系数和值的范围(最大值和最小值)。

对于比较性统计而言，在使用虫螨(D.farinae)的皮肤检验而得到的数据中使用方差分析(ANOVA)和Bonferroni校正(用于成对的值之间的比较)，这是因为这些符合正态分布。在使用梯牧草的皮肤检验而得到的数据的情况下，使用非参数检验，这是因为这些数据不符合正态分布。使用Friedman检验来比较3种制备物，并使用Wilcoxon检验进行成对比较。

对于图示而言，使用箱线图，其表示各个25％和75％四分位数的中值。

结果

5.3.1在使用梯牧草的聚合物(使用戊二醛进行甘露糖基化)的刺痛检验中，变应原性的损失高于未甘露糖基化的聚合物的变应原性损失。

研究12名患者，5名男性，7名女性，在临床上均为对禾本科花粉过敏。平均年龄为41岁，年龄范围为11至78岁。由梯牧草的天然提取物(未修饰的)诱导的丘疹的面积大小的中值为28.4mm²，25和75％四分位数的值分别为23.0和43.1mm²。对应于聚合的提取物的值为8.0mm²，四分位数的中值分别为8.0和19.7。对于聚合的且甘露糖基化的提取物而言，中值为0.0，并且四分位数分别为0.0和5.4(表3)。

使用3种类型的制备物所得到的丘疹大小的差异极为显著(Friedman检验，P<0.0001)，在制备物对之间(天然的-聚合物，天然的-甘露糖基化的聚合物以及聚合物-甘露糖基化的聚合物)也极为显著(Wilcoxon检验,P<0.0001)。在体内显示变应原性较低的制备物为甘露糖基化的聚合物。

表2和3显示使用各制备物所获得的各丘疹面积的个体值，以及这些值的描述性统计和患者的流行病学数据(年龄和性别)。

表2：患者的流行病学数据(年龄和性别)、以及通过各制备物诱导的各丘疹的面积值

表3：图2中所示的数据的描述性统计

图22通过箱线图显示使用各种梯牧草的制备物所获得的丘疹的面积值。如可以观察到的那样，使用甘露糖基化的聚合物进行的皮肤检验实际上是阴性的，其相对于未甘露糖基化的聚合物有所降低，而未甘露糖基化的聚合物相应地比天然抗原(未聚合的)更低。所有这些表明梯牧草的甘露糖基化的聚合物的变应原性降低至与常规聚合物(未甘露糖基化的)相同或更高的程度。

5.3.2在使用D.farinae的聚合物(使用戊二醛进行甘露糖基化)进行的刺痛检验中，反应性损失与为甘露糖基化的聚合物相当。

研究22名患者，14名男性，8名女性，在临床上均为对美洲尘螨过敏。平均年龄为32岁，年龄范围为12至82岁。由美洲尘螨的天然提取物(未修饰的)诱导的丘疹的面积大小的中值为64.2mm²，25和75％四分位数的值分别为54.2和72.3mm²。对应于聚合的提取物的值为32.5mm²，四分位数的中值分别为1.0和45.7。对于聚合的且甘露糖基化的提取物而言，中值为24.1，并且四分位数分别为16.3和33.8。

使用3种类型的制备物所得到的丘疹大小的差异极为显著(ANOVA检验，P<0.0001)，在制备物对之间(天然的-聚合物，天然的-甘露糖基化的聚合物)也极为显著(Bonferroni校正,P<0.0001)。2种制备物显示在体内，变应原性比未聚合的变应原性极为重要地降低。

表4和5显示使用各制备物所获得的各丘疹面积的个体值，以及这些值的描述性统计和患者的流行病学数据(年龄和性别)。

表4：患者的流行病学数据(年龄和性别)、以及通过各制备物诱导的各丘疹的面积值

表5：表4中所示的数据的描述性统计

图23通过箱线图显示使用各种D.farinae的制备物所获得的丘疹的面积值。如可以观察到的那样，使用甘露糖基化的聚合物进行的皮肤检验与使用未甘露糖基化的聚合物的皮肤检验类似，同时比天然抗原(未聚合的)那些低更多。所有这些表明D.farinae的甘露糖基化的聚合物的变应原性降低至与常规聚合物(未甘露糖基化的)相同的程度。

实施例6

使用戊二醛进行甘露糖基化的聚合物比未甘露糖基化的聚合物更好地被树突状细胞捕获

材料和方法

由健康供者的外周血单核细胞诱导树突状细胞(DC)，并使用GM-CSF和IL-4培养5天。由此获得的的DC(未成熟)暴露于按照之前所述而制备的梯牧草聚合物(具有或不具有缀合的甘露聚糖)中，从而评估这些细胞的摄入。通过流式细胞仪，利用由梯牧草得到的提取物的自发荧光(由于其染料)，在DC与制备物之间接触2小时后，进行摄入测试。评估2个参数：a)被DC捕获的变应原的定量(摄入速率)；b)显示内化能力的细胞的百分率。此外，使用事先用荧光染料(AlexaM488)通过半胱氨酸而标记的梯牧草的变应原来进行摄入测定。通过流式细胞仪和共聚焦显微镜来分析结果。

结果

如图24A中可以观察的那样，根据MFI(平均荧光指数，其反映了摄入速率)被DC捕获的梯牧草自发荧光的甘露糖基化聚合物的量是常规聚合物(未甘露糖基化的)所捕获的量的7倍以上。在同一图的左上方，呈现了具有捕获2种制备物(梯牧草的聚合物，甘露糖基化的和未甘露糖基化的)的能力的细胞的量。如可以观察到的那样，显示较强荧光的阳性细胞的百分率对应于与甘露糖基化的聚合物温育的那些。这些结果可以使用荧光染料(AlexaM488)通过半胱氨酸进行标记来证明。如图24B中可以观察到的那样，将当所述的细胞与具有甘露聚糖的聚合物温育时，双阳性细胞(识别为HLA-DR和Alexa488)的量更高，这意味着这种制备物的摄入更高。在同一图的下方，呈现了平均荧光值。如可以观察到的那样，在与甘露糖基化的聚合物温育的DC中，荧光强度也更高。图24C显示共聚焦荧光显微镜的图像，其中可以看见，与未甘露糖基化的聚合物或天然变应原温育的DC相比，与具有甘露聚糖的聚合物温育(30min)的DC的摄入更高。这些试验的结论为甘露糖基化的聚合物被更大量的DC所捕获，并且这些DC也以更大的量捕获这些聚合物。

实施例7

与未甘露糖基化的聚合物相比，使用戊二醛进行甘露糖基化的聚合物诱导人类树突状细胞更多地产生IL-10和IL-6。

7.1树突状细胞产生细胞因子的测试

材料和方法

使用IL-4和GM-CSF使由健康供者得到的经分离的外周血单核细胞分化成树突状细胞(DC)。将这些DC(未成熟的)与50μg/mL聚合的且甘露糖基化的(PM)以及未甘露糖基化的(P)变应原(梯牧草)温育。在使用不同的制备物进行刺激后的24小时，在这些细胞的培养物上清液中测定细胞因子的浓度。用于定量细胞因子的技术为流式细胞仪Multiplex。

结果

图25显示3个独立试验的平均值。

如可以观察到的那样，与梯牧草的甘露糖基化的聚合物温育的树突状细胞(DC)比聚合的未甘露糖基化的变应原或天然的变应原(未聚合的)产生更多量的IL-6和IL-10。相反，3种制备物诱导了相似的IL-8的产生。这些结果表明人类骨髓DC对甘露糖基化的聚合物产生差异性地应答。使用甘露糖基化的聚合物观察到IL-10增加的事实是免疫调控性强阳性的(这是使用这种类型的制备物所寻求的)。

实施例8

关于诱导人类树突状细胞成熟的能力，将使用戊二醛进行甘露糖基化的聚合物与未甘露糖基化的聚合物比较

8.1-树突状细胞的成熟测试

材料和方法

由健康供者的外周血(白细胞层)单核细胞诱导树突状细胞(DC)，并使用GM-CSF和IL-4培养5天。由此获得的的DC(未成熟)暴露于不同的变应原制备物(天然的、聚合物以及聚合物-甘露聚糖)中，从而评估在对这些变应原的应答在DC的成熟情况。在培养48小时后，通过流式细胞仪来分析成熟测试，从而评估与DC成熟有关的分子的表达(HLA-II(DR),CD80,CD83和CD86)。

细胞标记过程：每次标记使用5x10⁵个细胞。将细胞再次悬浮于PBS中，并加入1μg直接抗体(1:100)(与荧光染料缀合的)或间接抗体(未缀合的)。在4℃下在黑暗中将它们温育20分子，随后用PBS洗涤。在间接抗体的情况下，加入与所关注的荧光染料缀合的1μg(以1:100稀释)小鼠抗IgG二级抗体。在使用PBS将它们洗涤2次后，将细胞再次悬浮于300-400μL体积的PBS中，并最终通过流式细胞仪(FC500BeckmanCoultek)进行分析。

结果

8.1.1通过梯牧草变应原(根据它们的聚合和/或甘露糖基化)由人类衍生的树突状细胞(DC)的成熟。

如图26中可以观察到的那样，在骨髓未成熟的DC与聚合的变应原温育后，所述的变应原会诱导骨髓未成熟的DC成熟。根据图中所反映的标志物在DC表面的表达来评估成熟的程度。相对于未聚合的变应原，在与聚合的变应原温育的DC中，与成熟有关的所有标志物均增多，根据聚合物为甘露糖基化的或未甘露糖基化的，所述的标志物不具有显著的差异。

这些结果表明，由DC成熟的观点来看，梯牧草的甘露糖基化的聚合物表现与常规聚合物(未聚合的)相似，因此显示成熟指数高于常规的变应原(未聚合的)。

8.1.2通过D.farinae变应原(根据它们的聚合和/或甘露糖基化)由人类单核细胞衍生的树突状细胞的成熟。

如图27中可以观察到的那样，在骨髓未成熟的DC与聚合的变应原温育后，所述的变应原会诱导骨髓未成熟的DC成熟。根据图中所反映的标志物在DC表面的表达来评估成熟的程度。相对于未聚合的变应原，在与聚合的变应原温育的DC中，与成熟有关的所有标志物均增多，根据聚合物为甘露糖基化的或未甘露糖基化的，所述的标志物不具有显著的差异。这些结果表明，由DC成熟的观点来看，D.farinae的甘露糖基化的聚合物表现与常规聚合物(未聚合的)相似，因此显示成熟指数高于常规的变应原(未聚合的)。

实施例9

与未甘露糖基化的聚合物相比，在体外免疫测试中，使用戊二醛进行甘露糖基化的聚合物改善了产生IFNγ和IL-10的T细胞的诱导。

材料和方法

使用外周血人类细胞进行体外免疫测试

免疫方案

在使用自体成熟的DC(负载由相应的变应原提取物)进行3轮刺激后，由健康个体的PBMC获得变应原特异性效应器T细胞。简言之，将iDC(10⁶/mL)与具有相应提取物(100μg/mL)的完全DMEM培养基温育8小时，然后通过与肽聚糖(1μl/mL)温育而成熟。将事先洗涤的成熟的树突状细胞(mDC)与相应的提取物在完全DMEM培养基中再次温育6小时(在1mL中，10⁶个细胞)，此后立即进行辐射(3000rad)。然后，将经过辐射并负载变应原的mDC分布于48孔平板(10⁶/mL)中，并在IL-7(1μl/mL)存在下与PBMC(10⁷个细胞/mL)一起共培养。在第一次刺激后的5天，向培养物中补充IL-2(10U/mL)。使用负载变应原提取物的DC重复3次相同PBMC的刺激和扩增过程。通过ELISPOT测试来测量细胞产生的变应原特异性IFNγ,IL-10和IL-4。

结果

9.1.1使用戊二醛进行甘露糖基化的梯牧草聚合物会改善未甘露糖基化的聚合物的IFN-γ和IL-10应答，而不增加IL-4应答。

如图28中可以看见，与在常规的聚合物(未甘露糖基化的)中免疫的那些培养物相比，在使用聚合物的且甘露糖基化的变应原免疫的培养物中，在特异性应答中，增加了产生IFN-γ和IL-10的细胞的数量。这种增加与产生IL-4的细胞的更多的数量不一致，表明对TH2表现型不具有极化作用。使用甘露糖基化的聚合物所观察到的IFN-γ和IL-10增加而IL-4不增加的事实是免疫调控性强阳性的(这是使用这种类型的制备物所寻求的)。

9.1.2使用戊二醛进行甘露糖基化的D.farinae变应原会改善未甘露糖基化的聚合物的IFN-γ和IL-10应答，而不增加IL-4的应答。

如图29中可以看见，与在常规的聚合物(未甘露糖基化的)中免疫的那些培养物相比，在使用聚合物的且甘露糖基化的变应原免疫的培养物中，在特异性应答中，增加了产生IFN-γ和IL-10的细胞的数量。这种增加与产生IL-4的细胞的更多的数量不一致，表明对TH2表现型不具有极化作用。使用甘露糖基化的聚合物所观察到的IFN-γ和IL-10增加而IL-4不增加的事实是免疫调控性强阳性的(这是使用这种类型的制备物所寻求的)。

实施例10

与未甘露糖基化的聚合物相比，使用戊二醛进行甘露糖基化的聚合物会改善体内的免疫应答

在小鼠中的体内免疫测定

材料和方法

使用梯牧草和D.farinae变应原(具有甘露糖基化的和未甘露糖基化的聚合物)实施免疫，从而评估它们在体内的免疫能力。使用图30中所示的方案在Balb/c小鼠中进行免疫。

在脾中通过使用CFSE标记实施响应于变应原(天然形式)的特异性淋巴增殖测试，来评估对免疫的应答。使用植物凝血素(PHA)作为阳性对照。在培养的第6天和第7天来测定增殖。此外，在刺激48小时后，使用Multiplex流式细胞仪技术在培养物上清液中进行细胞因子的定量(图31)。使用植物凝血素(PHA)作为阳性对照。此外，通过ELISA来评估特异性IgE水平(P.pratense或D.farinae)，以及IgG1(作为TH2应答标志物)和IgG2a(TH1应答标志物)的水平。

结果

10.1与使用未甘露糖基化的聚合物相比，使用梯牧草的甘露糖基化的聚合物进行免疫会对抗原刺激产生更高的增殖应答。

如图32中可以观察到的那样，与由小鼠(使用常规的聚合的变应原(未聚合的)来免疫)的脾所取得的细胞相比，当应答的细胞取自使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免疫的小鼠的脾时，反映了对抗原产生应答的T细胞数量的增殖百分率显著较高。这表明与未甘露糖基化的聚合物相比，聚合的且甘露糖基化的梯牧草变应原的免疫原性性质显著较高。

10.2与使用未甘露糖基化的聚合物相比，使用D.farinae的甘露糖基化的聚合物进行免疫会对抗原刺激产生更高的增殖应答。

如图33中可以观察到的那样，与由小鼠(使用常规的聚合的变应原(未聚合的)来免疫)的脾所取得的细胞相比，当应答的细胞取自使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免疫的小鼠的脾时，反映了对抗原产生应答的T细胞数量的增殖百分率显著较高。这表明与未甘露糖基化的聚合物相比，聚合的且甘露糖基化的D.farinae变应原的免疫原性性质显著较高。

10.3相对于未甘露糖基化的聚合物而言，使用甘露糖基化的梯牧草聚合物所免疫的小鼠的脾会改变细胞因子的模式。

图34(图34A和34B)表示在脾细胞(使用P.pratense变应原刺激的)的培养物上清液中所获得的不同细胞因子的产生，其中所述的脾细胞得自使用甘露糖基化的和未甘露糖基化的聚合的变应原所免疫的小鼠。如可以观察到的那样，根据脾细胞的来源，所产生的细胞因子的模式很多都不同。由淋巴细胞产生的变化以定量的方式示于表6中。

10.4与使用未甘露糖基化的聚合物相比，使用Phleum的甘露糖基化的聚合物所免疫的小鼠的淋巴细胞会增加IL-10的产生。

表6.在使用Phleum聚合物所免疫的小鼠中，由其淋巴细胞在体外相对产生的细胞因子

**与使用未甘露糖基化的聚合物所免疫的小鼠中获得的值相比，相对增加100倍以上。

如表6中可以观察到的那样，相对于图34(图34A和34B)中所示的淋巴来源的细胞因子的产生而言，可以获得的最大的改变对应于IL-10，其在聚合的且甘露糖基化的变应原所刺激的小鼠中比使用未甘露糖基化的聚合物所免疫的小鼠中所获得的生产高出300倍以上。IL-10的这种增加是免疫调控性强阳性的(这是使用这种类型的制备物所寻求的)。

10.5相对于未甘露糖基化的聚合物而言，由使用甘露糖基化的D.farinae的聚合物所免疫的小鼠而得到的脾细胞会改变细胞因子的模式。

图35(图35A和35B)表示在脾细胞(使用D.farinae变应原刺激的)的培养物上清液中所获得的不同细胞因子的产生，其中所述的脾细胞得自使用甘露糖基化的和未甘露糖基化的聚合的变应原所免疫的小鼠。如可以观察到的那样，根据脾细胞的来源，所产生的细胞因子的模式很多都不同。由淋巴细胞产生的变化以定量的方式示于表7中。

10.6与使用未甘露糖基化的聚合物所产生的因子相比，由使用D.farinae的甘露糖基化聚合物所免疫的小鼠而得到的脾细胞会增加IL-10,IFNγ和IL-2(作为对抗原刺激的应答)

表7.在使用D.farinae聚合物所免疫的小鼠中，由其淋巴细胞在体外相对产生的细胞因子

**与使用聚合物(不具有甘露聚糖)所免疫的小鼠中获得的值相比，相对增加100倍以上。

如表7中可以观察到的那样，相对于图35(图35A和35B)中所示的淋巴来源的细胞因子的产生而言，可以获得的最大的改变对应于IL-2,IL-10和IFN-γ，其在未甘露糖基化的聚合物所免疫的小鼠中所获得的生产相比，使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免疫的小鼠中增加300,145和125倍以上。这种增加(特别是IL-10和IFN-γ)是免疫调控性强阳性的(这是使用这种类型的制备物所寻求的)。

10.7与未甘露糖基化的聚合物相比，使用高剂量的聚合物的且甘露糖基化的梯牧草聚合物所免疫的小鼠中，特异性抗体的应答有利于IgG/IgE比例。

如图36(图36A和36B)中可以观察到的那样，与常规的聚合的变应原(未甘露糖基化的)相比，在使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免疫的小鼠而得到的血清中，响应于梯牧草变应原的特异性IgG抗体较高。相反，特异性IgE抗体应答低于常规的聚合物。如图中可以看见的那样，当使用聚合的且甘露糖基化的梯牧草变应原进行免疫时，IgG2a/IgE的比例较高。比例的这种增加是免疫调控性强阳性的(这是使用这种类型的制备物所寻求的)，因为其表明了所得应答的抗过敏极性。

10.8与未甘露糖基化的聚合物相比，使用高剂量的甘露糖基化的D.farinae聚合物所免疫的小鼠中，特异性抗体的应答有利于IgG/IgE比例。

如图37(图37A和37B)中可以观察到的那样，与常规的聚合的变应原(未甘露糖基化的)相比，在使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免疫的小鼠而得到的血清中，响应于D.farinae变应原的特异性IgG抗体较高。相反，特异性IgE抗体应答低于常规的聚合物。如图中可以看见的那样，当使用聚合的且甘露糖基化的D.farinae变应原进行免疫时，IgG2a/IgE的比例较高。比例的这种增加是免疫调控性强阳性的(这是使用这种类型的制备物所寻求的)，因为其表明了所得应答的抗过敏极性。

Claims (48)

1.一种包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醛的免疫原性复合物。

2.根据权利要求1所述的免疫原性复合物，其中所述的甘露聚糖得自植物、真菌或酵母菌。

3.根据权利要求2所述的免疫原性复合物，其中所述的酵母菌选自酵母属、毕赤酵母属和假丝酵母属。

4.根据权利要求3所述的免疫原性复合物，其中所述的酵母属物种为酿酒酵母。

5.根据权利要求1至4的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的甘露聚糖包含氨基。

6.根据权利要求5所述的免疫原性复合物，其中所述的氨基存在于赖氨酸氨基酸中。

7.根据权利要求1至6的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的聚合的抗原包含至少2个抗原，它们是彼此相同的或不同的。

8.根据权利要求1至7的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的二醛选自戊二醛,乙二醛,丙二醛,丁二醛和己二醛。

9.根据权利要求8所述的免疫原性复合物，其中所述的二醛为戊二醛。

10.根据权利要求1至9的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的聚合的抗原通过所述的戊二醛与所述的甘露聚糖结合。

11.根据权利要求1至9的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的抗原通过所述的聚合的抗原通过物理诱捕而与所述的甘露聚糖结合。

12.根据权利要求1至11的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的抗原为变应原。

13.根据权利要求12所述的免疫原性复合物，其中所述的变应原选自花粉、虫螨、上皮细胞、真菌孢子和它们的组合。

14.根据权利要求13所述的免疫原性复合物，其中所述的花粉选自物种梯牧草、喜马拉雅鸭茅、狗牙根、多年生黑麦草、三毛草属、橄榄、Cuppresusspp.、豚草属、桦木属、悬铃木属、欧榛或欧洲桤木。

15.根据权利要求13或14所述的免疫原性复合物，其中所述的虫螨属于物种欧洲室尘螨、美洲尘螨或Blomiatropicalis。

16.根据权利要求13至15的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的上皮细胞属于物种Felisdomesticus或家犬。

17.根据权利要求13至16的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的真菌孢子属于物种烟草赤星病菌或细链格孢。

18.根据权利要求1至17的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的抗原：甘露聚糖的比例范围为1:10至1:0.1，优选为1:0.3或1:0.5。

19.根据权利要求1至18的任意一项所述的免疫原性复合物，其包括(i)制备包含抗原和甘露聚糖的溶解物；以及(ii)将所述的二醛加入至所述的溶解物中。

20.权利要求19所述的方法，其包括步骤(iii)：包括加入中和试剂，优选为甘氨酸，从而终止所述的聚合反应。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其还包括步骤(iv)：分离所述的免疫原性复合物。

22.根据权利要求19至21的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的甘露聚糖得自植物、真菌或酵母菌。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的酵母菌选自酵母属、毕赤酵母属和假丝酵母属。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述的酵母属物种为酿酒酵母。

25.根据权利要求19至24的任意一项所述的方法，其中所述的甘露聚糖包含氨基。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述的氨基存在于赖氨酸氨基酸中。

27.根据权利要求19至26的任意一项所述的方法，其中所述的聚合的抗原包含至少2个抗原，它们是彼此相同的或不同的。

28.根据权利要求19至27的任意一项所述的方法，其中所述的二醛选自戊二醛,乙二醛,丙二醛,丁二醛和己二醛。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述的二醛为戊二醛。

30.根据权利要求19至29的任意一项所述的方法，其中所述的抗原为变应原。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述的变应原选自花粉、虫螨、上皮细胞、真菌孢子和它们的组合。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述的花粉选自物种梯牧草、喜马拉雅鸭茅、狗牙根、多年生黑麦草、三毛草属、橄榄、Cuppresusspp.、豚草属、桦木属、悬铃木属、欧榛或欧洲桤木。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述的虫螨属于物种欧洲室尘螨、美洲尘螨或Blomiatropicalis。

34.根据权利要求31至33的任意一项所述的方法，其中所述的上皮细胞属于物种Felisdomesticus或家犬。

35.根据权利要求31至34的任意一项所述的方法，其中所述的真菌孢子属于物种烟草赤星病菌或细链格孢。

36.根据权利要求19至35的任意一项所述的方法，其中所述的抗原：甘露聚糖的比例范围为1:10至1:0.1，优选为1:0.3或1:0.5。

37.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至18的任意一项所述的免疫原性复合物以及药物可接受的载体。

38.根据权利要求37所述的药物组合物，其还包含佐剂。

39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述的佐剂选自氢氧化铝、磷酸钙、酪氨酸、单磷酰脂质A和壳聚糖。

40.根据权利要求37至39的任意一项所述的药物组合物，其还包含额外的活性物质。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述的额外的活性物质包括抗组胺试剂、甾类激素、组胺受体的拮抗剂、白细胞三烯或它们的混合物。

42.根据权利要求37至41的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物配制成大颗粒、纳米颗粒或脂质体。

43.根据权利要求37至42的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物为固体药物给予形式、液体药物给予形式或包含分散系统的药物传递形式。

44.根据权利要求37至43的任意一项所述的组合物，其中所述的药物组合物为使用肠胃外、鼻内、口周、舌下、口服、经皮或局部给予的药物形式。

45.根据权利要求1至18的任意一项所述的免疫原性复合物用于制备药物组合物的用途。

46.根据权利要求45所述的用途，用于在受试对象中刺激和/或诱导所述的免疫应答。

47.根据权利要求45的用途，所述的用途为作为疫苗。

48.根据权利要求45至47的任意一项所述的用于治疗受试对象的感染性疾病、肿瘤或过敏的用途。