CN103221034A - 来自肿瘤组织的纳米囊泡及使用该纳米囊泡的癌症疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种癌症疫苗，特别是，一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有来自肿瘤组织的纳米囊泡，以及一种使用来自肿瘤组织等的纳米囊泡治疗癌症的方法。根据本发明，来自肿瘤组织的纳米囊泡抗原产率很高，并具有类似于细胞外囊泡的特性，其能进行各种改性，从而预期对于开发癌症疫苗是十分有用的。

Description

来自肿瘤组织的纳米囊泡及使用该纳米囊泡的癌症疫苗
技术领域
本发明涉及一种癌症疫苗。更具体地，本发明涉及一种治疗癌症的药物组合物，其包括来自肿瘤组织的纳米囊泡，本发明还涉及一种使用来自肿瘤组织的纳米囊泡治疗癌症的方法。
背景技术
癌症是各种疾病的广泛组合，由于结构和功能单元细胞的改性诱导的异常分化或增殖，其全部涉及无死亡的失控的细胞生长。在癌症中，细胞侵入附近的身体部位，且还可能通过淋巴系统或血流扩散至更远的身体部位，并最终转移到其他器官，诸如肺和肝。存在100多种不同的折磨人类的已知癌症。其中代表性的是肺癌、结肠直肠癌、胃癌和肝癌。一般来说，患癌症的风险通常随着年龄增加，且因为人类平均寿命的增加，全世界内癌症的发病有上升趋势。然而，还未发现癌症的有效治愈方法，因此，迫切需要新型癌症治疗方法。通常通过手术、化学疗法和放射疗法治疗癌症。然而，这些治疗可能引起严重的副作用，包括继发性癌症的发生、癌症转移、免疫抑制和异常细胞代谢。考虑到常规癌症治疗方法的问题，利用患者的免疫系统是一种将密切关注作为研发癌症疗法的潜在战略的想法。研发癌症疫苗是最可取的医疗方法之一。
旨在引起癌症的有效免疫应答，癌症疫苗激活患者的免疫机制以提高对癌症的抵抗力。接种癌症疫苗是有利的，其产生的副作用小并有助于患者的免疫系统对抗术后仍然存在的癌症及其自身转移的、隐藏的癌症。考虑到事实，即大多数癌症是由自体细胞改性引起的，成功研发癌症疫苗是很重要的，以选择合适的诱导患者免疫系统识别癌症为攻击目标的癌抗原。用作癌抗原，已知作为抗原的肽或蛋白质可以从癌细胞分离，或癌细胞自身可在放射治疗后使用。这些癌抗原可与佐剂组合使用或负载于树突状细胞以增强免疫反应。如果肽或蛋白质抗原是已知的，其很容易制备，但其可能导致免疫耐受，因为一个患者与另一个患者合适的抗原不同。癌症是极其异源的，且很难定义癌症特异性抗原。此外，患者的癌症病因和免疫控制机制是彼此不同的。因此，标准化治疗不能保证癌症治疗的成功。如果癌症患者的肿瘤组织由手术获得，其可用作特异于该患者的各种癌抗原的来源。然而，使用癌细胞本身可引起副作用，包括肿瘤发生和自身免疫应答的风险。因此，需要高实用性和安全性的来自肿瘤的癌症疫苗。
纳米大小的囊泡可用作癌症疫苗中的抗原。纳米大小的囊泡抗原可由抗原呈递细胞诸如树突状细胞容易地识别并捕获，并容易通过淋巴系统循环，因此其高度易于诱发免疫应答。有代表性的纳米大小的囊泡为几乎从所有细胞类型自发脱落的细胞外囊泡（例如，外切体、微泡等）。细胞外囊泡的大小范围为几十纳米至几百纳米，且包括双层脂质膜和生物活性物质，诸如蛋白质、脂类和遗传物质，完成各种生理/病理功能。特别是，如果细胞外囊泡直接来源于癌细胞的质膜，其反应癌细胞的抗原含量。此外，来自癌细胞的细胞外囊泡由于其高表面积-体积含有高局部浓度的癌抗原，且相比较于受体形式的抗原其更易于诱发免疫。此外，细胞外囊泡可用作无细胞的疫苗，且因此与难获得临床许可的常规肿瘤细胞疫苗相比，预期会引起显著减少的副作用。
然而，由于以下原因，细胞外囊泡在实际临床应用中是不利的。必须构建直接从患者分离的癌症细胞的细胞系以获得其细胞外囊泡。很难大量获得细胞外囊泡，因为它们以痕量释放。细胞外囊泡的复杂的分离和纯化需要高费用及很多时间。因此，需要研发替代来自肿瘤的细胞外囊泡的纳米囊泡抗原。
发明内容
技术问题
本发明旨在研发用于增强抗癌免疫力并破坏免疫耐受的纳米大小囊泡形式的癌抗原。从癌细胞自发脱落的细胞外囊泡可用作癌症疫苗，由于其为纳米大小的且包含与癌细胞相同的各种抗原蛋白，但是其很难大量分离及制备。因此本发明的目的是提供一种治疗癌症的药物组合物，其包括来自肿瘤组织的纳米囊泡，所述纳米囊泡保持常规细胞外囊泡的优势并可高产量制备，一种使用所述囊泡治疗癌症的方法，及一种制备所述来自肿瘤组织的纳米囊泡的方法。
然而，本发明所完成的目的不限于前述及上述的方面，且本发明的其他目的、特征及优势将通过以下详述更清楚地理解。
技术方案
根据一方面，本发明提供了一种包含来自肿瘤组织的纳米囊泡的药物组合物。根据本发明的一个实施方式，肿瘤组织可以是源自患者的癌组织。在另一个实施方式中，肿瘤组织被转化以表达一种热休克蛋白。根据进一步的实施方式，该药物组合物还可包含免疫佐剂，且佐剂可以是聚肌胞（polyI:C）。在还另一实施方式中，纳米囊泡包含除了来自肿瘤组织质膜的组分，且所述组分可以是环糊精或聚乙二醇。根据本发明的还一实施方式，纳米囊泡可具有化学改性的膜，且所述纳米囊泡可由巯基或胺基化学改性。
根据另一方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，其包括向所需受试者施用包含来自肿瘤组织的纳米囊泡的药物组合物。在这方面，所述肿瘤组织、组合物和纳米囊泡如上文所定义。
根据另一方面，本发明提供了一种癌症疫苗，其包含作为抗原的来自肿瘤组织的纳米囊泡。
根据还另一方面，本发明提供了一种制备来自肿瘤组织的纳米囊泡的方法。在一实施方式中，所述方法包括：从肿瘤组织中分离细胞；通过以下方法由细胞悬浮液构建纳米囊泡，所述方法选自由挤压、超声波处理、细胞裂解、均质化、冻融、电穿孔、机械降解和化学处理组成的组；从悬浮液中分离构建的纳米囊泡；以及在存在佐剂的条件下，培养纳米囊泡的悬浮液。
在另一个实施方式中，所述方法包括：从肿瘤组织中分离细胞；添加佐剂至细胞悬浮液以将佐剂负载于细胞中；通过以下方法由细胞悬浮液构建纳米囊泡，所述方法选自由挤压、超声波处理、细胞裂解、均质化、冻融、电穿孔、机械降解和化学处理组成的组。
在另一个实施方式中，所述方法还包括从细胞悬浮液分离负载佐剂的纳米囊泡。
根据进一步的实施方式，可使用以下方法完成分离，所述方法选自由密度梯度离心、超速离心、过滤、渗析及自由流电泳组成的组。
有益效果
由于其有效的抗癌活性，尽管有报道在癌症疫苗研发中使用自发脱落的细胞外囊泡，但细胞外囊泡的临床应用赋予显著限制性，因为其需要体外培养患者的细胞并难以分离及制备，此外制备该囊泡时产生低产率。相反地，根据本发明的来自肿瘤组织的纳米囊泡可以高产率制备同时保持与自发脱落的细胞外囊泡相似的特性。此外，来自肿瘤组织的纳米囊泡可被不同地改性并可在癌症疫苗研发中用作癌抗原。
附图说明
图1是使用超声波处理制备的来自黑色素瘤的纳米囊泡的透射电子显微镜照片。
图2是使用超声波处理制备的来自黑色素瘤的纳米囊泡的粒度图，通过基于动态光散射的粒度分析仪测得。
图3示出了抗原膜蛋白酪氨酸酶和核蛋白组蛋白的蛋白质印迹，其在使用超声波处理制备的纳米囊泡中分别变得富集和稀疏。
图4是使用超声波处理制备的来自结肠直肠癌细胞的纳米囊泡的透射电子显微镜照片。
图5是使用挤压制备的来自黑色素瘤的纳米囊泡的透射电子显微镜照片。
图6是示出来自骨髓的树突状细胞识别和内吞DiI-标记的纳米囊泡的流动细胞图。
图7是树突状细胞中细胞因子水平图，其示出了细胞因子IL-12p70的水平依赖来自黑色素瘤的纳米囊泡的剂量增加。
图8是随时间绘制的用来自黑色素瘤的纳米囊泡和/或佐剂处理或未处理的小鼠肿瘤体积的图示，说明了来自黑色素瘤的纳米囊泡与佐剂结合作为癌症疫苗的功效。
图9示出了小鼠黑色素瘤细胞转移后，从用来自黑色素瘤的纳米囊泡和/或佐剂免疫或未免疫的小鼠中切除的肺部图片。
图10是小鼠肺中转移菌落的数量图。
图11示出了用来自黑色素瘤的纳米囊泡和/或佐剂处理或未处理后，用H&E染色的肺部图片。
图12是细胞因子水平图，其示出细胞因子IL-12p70的水平随着来自结肠直肠癌的纳米囊泡的剂量增加而增加，通过酶联免疫吸附法（ELISA）分析。
图13是随时间绘制的用来自结肠直肠癌的纳米囊泡和/或佐剂处理或未处理的小鼠中的肿瘤体积的图示，说明了来自结肠直肠癌的纳米囊泡与佐剂结合作为癌症疫苗的功效。
图14是负载佐剂聚肌胞（polyI:C）的来自黑色素瘤的纳米囊泡的透射电子显微镜照片。
图15随时间绘制的用来自黑色素瘤的纳米囊泡和/或佐剂处理或未处理的小鼠肿瘤体积的图示，说明了来自黑色素瘤的纳米囊泡与佐剂结合作为癌症疫苗的功效。
图16示出了热休克蛋白的蛋白质印迹，显示富集热休克蛋白的纳米囊泡可来自于热应力下培养后的黑色素瘤。
具体实施方式
根据本发明，密集与深入研究癌症疫苗导致发现来自肿瘤组织的纳米囊泡在不诱导免疫耐受的情况下产生抗癌免疫活性，且其可以高产率大规模地分离和制备。
从癌细胞自发脱落的细胞外囊泡也用作癌症疫苗，因为其反映存在于癌细胞中的相同的抗原含量，但其难以大规模地分离及制备。
最终在本发明中，本发明人已着手研究癌症疫苗并发现来自肿瘤的纳米囊泡可以不需要体外培养也能够大规模地生产，且当所述囊泡改性可有效地使癌症患者免疫，从而激发免疫反应杀死癌细胞。
详细地，本发明人集中研发来自肿瘤的纳米囊泡，其可以高产率地制备同时保持常规细胞外囊泡的优势，并进行了各种实验，其中癌细胞在抗原膜蛋白富集，并通过超声波处理或挤压制备大小为100至200纳米的纳米囊泡。观察到通过这种方法获得的纳米囊泡具有与自发脱落的细胞外囊泡相似的形态、大小和密度。此外，通过负载佐剂或富集热休克蛋白改性纳米囊泡时，发现所述纳米囊泡的抗癌活性增强。
根据一方面，本发明涉及治疗癌症的药物组合物，其包含来自肿瘤组织的纳米囊泡。而且，根据另一方面，本发明涉及包含来自肿瘤组织的纳米囊泡的癌症疫苗。在本发明中，肿瘤组织包括自体癌组织，但不限于此。
根据本发明的一个实施方式，肿瘤组织可以是黑色素瘤或结肠直肠癌细胞。此外，用于本发明的纳米囊泡可以来自其他癌细胞。
本发明中制备的纳米囊泡的大小范围为50至250纳米，并包含膜脂质和抗原膜蛋白。
可使用蛋白质印迹或其他分析技术分析并鉴定纳米囊泡中的蛋白质。
作为抗原，纳米囊泡的蛋白质可包括酪氨酸酶，但不限于此。
用于刺激抗原引发的免疫应答，还可将佐剂负载于纳米囊泡。本发明中使用的佐剂的实例是toll样受体3配体、聚肌胞（polyI:C），但不限于此，且可使用其他toll样受体配体。
在本发明中，佐剂可以与纳米囊泡结合以提供负载佐剂的纳米囊泡，然而其并不限制本发明。各种刺激免疫应答和抗癌作用的材料可共轭于纳米囊泡。
如果纳米囊泡从热应力作用后的肿瘤细胞获得，其可富集热休克蛋白90。
本发明的纳米囊泡可包含除了来自肿瘤组织的膜组分的非膜组分。非膜组分的实例包括环糊精和聚乙二醇，但不限于此。此外，还可以用巯基或胺基使纳米囊泡的膜组分化学改性。
本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的实例包括，但不限于，生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油及肉豆蔻酸异丙酯。
根据另一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用含有来自肿瘤组织的纳米囊泡的组合物。如本文中所使用的术语“受试者”意指需要治疗疾病的对象，且更具体地是指人类和非人类的哺乳动物，诸如灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马、牛等。本领域的技术人员将理解“药学上有效量”可由多种因素决定，包括患者年龄、体重、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率及疾病严重程度。
根据本发明组合物的有效剂量取决于多种因素，包括患者健康状况和体重、疾病严重程度、药物制剂、给药途径和给药时间。一般情况下，本发明的组合物可以单剂量施用，且优选地每日以多剂量施用，每日剂量范围为0.001至100mg/kg，优选地0.01至30mg/kg。本发明的药物组合物可通过多种途径施用于哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、家畜、人类等。对施用方法不赋予限制。例如，可口服给药、直肠给药或静脉内、肌内、皮下、硬膜内或脑室内注射。
根据还另一方面，本发明涉及制备来自肿瘤组织的纳米囊泡的方法。在这方面的一实施方式中，通过负载佐剂或富集热休克蛋白使纳米囊泡改性从而引发更强的免疫应答。
可通过超声波处理或挤压由癌组织质膜制备在本发明的癌症疫苗中用作免疫原的纳米囊泡。以下，将详细描述来自肿瘤组织的纳米囊泡的制备。
根据本发明的一个实施方式，制备来自肿瘤组织的纳米囊泡的方法，其包括(a)从肿瘤组织中分离细胞；(b)通过以下方法由细胞悬浮液构建纳米囊泡，所述方法选自由挤压、超声波处理、细胞裂解、均质化、冻融、电穿孔、机械降解和化学处理组成的组；(c)从悬浮液中分离构建的纳米囊泡；以及(d)在存在佐剂的条件下，培养纳米囊泡的悬浮液。
根据本发明的另一个实施方式，制备来自肿瘤组织的纳米囊泡的方法，其包括(a)从肿瘤组织中分离细胞；(b)向细胞的悬浮液中添加佐剂，从而使所述佐剂负载于细胞中；以及(c)通过以下方法由细胞悬浮液构建纳米囊泡，所述方法选自由挤压、超声波处理、细胞裂解、均质化、冻融、电穿孔、机械降解和化学处理组成的组。
在本发明的另一个实施方式中，该方法可以进一步包括从细胞悬浮液中分离负载佐剂的纳米囊泡。在这种情况下，所述分离可以使用选自由密度梯度离心、超速离心、过滤、透析和自由流动电泳组成的方法来完成。
通过以下实施例，将更好的理解本发明，所述实施例用于说明作用，但不构成对本发明的限制。
实施例
实施例1：使用超声波处理由黑色素瘤细胞制备的纳米囊泡及其表征
将黑色素瘤细胞系（B16BL6）皮下注射到小鼠（C57/BL6，雌性）体内，培养2至3周以使肿瘤尺寸达到1.0至1.5cm，然后手术切除获得肿瘤组织。研磨黑色素瘤组织并使其通过45μm的过滤器以使组织均化，接着在4℃下，在低渗溶液中培养30分钟。然后，用100冲量的均化器均化滤液，并调节匀浆使其终盐浓度为150mM，从而形成囊泡。以500x g离心10分钟，去除核蛋白和以微球形式存在的完整细胞，上清液在水浴超生发生器中超声处理30分钟，以形成纳米级的恒定尺寸的囊泡。随后，通过以10,000x g离心20分钟去除细胞碎片和线粒体。收集上清后，将其体积调整为10ml，置于在超速离心管中包含0.1ml的2.0M蔗糖作为底层和0.35ml的0.8M蔗糖作为上层的蔗糖垫中，并以100,000x g超速离心2小时。分离浸没有囊泡的蔗糖层，与4.8ml的30%Optiprep混合，并用3.0ml的20%Optiprep和2.5ml的5%Optiprep按顺序覆盖，之后以200,000x g超速离心2小时。最后，纳米囊泡层形成于5%和20%的Optiprep之间。图1是实施例1中制备的来自黑色素瘤的纳米囊泡的透射电子显微镜照片。从图1的透射电子显微镜照片中可以看出，纳米囊泡由脂质双层构成，具有球形形状。图2是通过基于动态光散射的粒度分析仪测量的纳米囊泡的粒度图。如图2的数据可以理解，纳米囊泡的平均尺寸为101.6±24.8nm。
图3示出了膜蛋白酪氨酸酶和核蛋白组蛋白的蛋白质印迹结果，每种以10μg的由纳米囊泡和癌细胞（WC）制备的蛋白质存在。与衍生纳米囊泡的黑色素瘤细胞相比，观察到纳米囊泡含有高浓度的膜抗原蛋白酪氨酸酶，但是核蛋白组蛋白浓度较低。
实施例2：使用超声波处理由结肠直肠癌细胞制备的纳米囊泡及其表征
将结肠直肠癌细胞系（Colon26）皮下注射到小鼠（BALB/C，雌性，雌性）体内，培养2至3周以使肿瘤尺寸达到1.0至1.5cm，然后手术切除获得肿瘤组织。重复实施例1中相同的程序。也就是，研磨结肠直肠癌组织并过滤以均化，接着在4℃下，在低渗溶液中培养30分钟。然后，用100冲量的均化器均化滤液，并调节匀浆使其终盐浓度为150mM，从而形成囊泡。以500x g离心10分钟，去除核蛋白和以微球形式存在的完整细胞，上清液在水浴超生发生器中超声处理30分钟，以形成纳米级的恒定尺寸的囊泡。随后，通过以10,000x g离心20分钟去除细胞碎片和线粒体。收集上清后，将其体积调整为10ml，置于在超速离心管中包含0.1ml的2.0M蔗糖作为底层和0.35ml的0.8M蔗糖作为上层的蔗糖垫中，并以100,000x g超速离心2小时。分离浸没有囊泡的蔗糖层，接着按顺序，分离，与4.8ml的30%Optiprep混合，并用3.0ml的20%Optiprep和2.5ml的5%Optiprep覆盖，之后以200,000x g超速离心2小时。最后，纳米囊泡层形成于5%和20%的Optiprep之间。图4是按照该方法制备的来自结肠直肠癌细胞的纳米囊泡的透射电子显微镜照片。
实施例3：使用挤压法制备的来自黑色素瘤细胞的纳米微泡及其表征
将黑色素瘤细胞系（B16BL6）皮下注射到小鼠（C57/BL6，雌性）体内，培养2至3周以使肿瘤尺寸达到1.0至1.5cm，然后手术切除获得肿瘤组织。研磨黑色素瘤组织并使其通过45μm的过滤器以使组织均化，接着在4℃下，在低渗溶液中培养30分钟。然后，用100冲量的均化器均化滤液，并调节匀浆使其终盐浓度为150mM，从而形成囊泡。以500x g离心10分钟，去除核蛋白和以微球形式存在的完整细胞，并使上清液通过1μm孔径的膜过滤器三次，然后通过0.4μm孔径的膜过滤器三次。收集上清后，将其体积调整为10ml，置于在超速离心管中包含0.1ml的2.0M蔗糖作为底层和0.35ml的0.8M蔗糖作为上层的蔗糖垫中，并以100,000x g超速离心2小时。分离浸没有囊泡的蔗糖层，按照以下顺序，分离，与4.8ml的30%Optiprep混合，并用3.0ml的20%Optiprep和2.5ml的5%Optiprep覆盖，之后以200,000x g超速离心2小时。最后，纳米囊泡层形成于5%和20%的Optiprep之间。图5是按照该方法制备的来自黑色素瘤的纳米囊泡的透射电子显微镜照片。
实施例4：来自黑色素瘤的纳米囊泡诱导树突状细胞的免疫应答
从小鼠（C57/BL6，雌性）的股骨和胫骨中收集骨髓细胞。红细胞溶解后，骨髓细胞在补充有营养素和20ng/ml GM-CSF的10%FBS/RPMI中分化成树突状细胞一周。单独地，在实施例1中制备的纳米囊泡用DiI（一种亲脂性红色荧光染料）标记。将树突状细胞与纳米囊泡一起培养，并使用FACS检查内吞作用。
图6示出了纳米囊泡被树突状细胞内吞的流动细胞图，其中括号内的数字表示MFI（平均荧光强度）值。将分化的树突状细胞以1x105细胞/孔播种于24孔板中，并用0、0.1、1.0、2.0或10.0μg/ml的纳米囊泡处理24小时。收集细胞培养物并以500x g在4℃下离心10分钟，上清液再以3000x g离心20分钟。使用ELISA（酶联免疫吸附法）定量分析获得的上清液中的细胞因子。
图7是示出细胞因子水平的图示，其示出了IL-12p70（一种诱导T辅助细胞1型应答的细胞因子），该细胞因子的水平依赖于纳米囊泡剂量的方式增加。这些数据表明实际上来自黑色素瘤的纳米囊泡像抗原呈递细胞，例如树突状细胞一样而发挥作用，从而引发抗癌效果。
实施例5：来自黑色素瘤的纳米囊泡对抗肿瘤生长的抑制活性分析
每只小鼠（C57/BL6，雌性）皮下注射5x105的黑色素瘤细胞(B16BL6)，培育一周，从而形成可测量的肿瘤块。然后，以与实施例1中相同的方式制备来自黑色素瘤的纳米囊泡，以单独的10μg的剂量或与50μg的佐剂聚肌胞（polyI:C）组合，每隔一周，腹膜内注射三次。一周内测量肿瘤块尺寸两次或三次。肿瘤块体积根据公式v=l x s2/2计算，其中v表示体积，l表示肿瘤块最长轴的长度，s是垂直于最长轴的轴长。
图8是随时间绘制的用纳米囊泡和/或佐剂处理或未处理的小鼠肿瘤体积的图示，说明了来自黑色素瘤的纳米囊泡与佐剂结合作为癌症疫苗的功效。如图8所示，纳米囊泡与佐剂的结合作为疫苗的使用降低了肿瘤的生长。同样，本发明的负载佐剂的纳米囊泡被证明能够有效的抑制肿瘤的生长，如通过式T/C比率（=[(处理组的肿瘤体积中位数)/(对照组的肿瘤体积中位数)x100]进行分析，对于负载佐剂的纳米囊泡来说，计算后的值为34%，而临界值为42%。特别地，与癌细胞（WC）本身相比，纳米囊泡能够高度抑制肿瘤生长。因此，来自肿瘤的纳米囊泡可以被认为是有效的癌症疫苗。
实施例6：来自黑色素瘤的纳米囊泡对抗癌症转移的抑制活性分析
每只小鼠（C57/BL6，雌性）静脉注射1x105的黑色素瘤细胞（B16BL6）以在肺部形成肿瘤。4天后，将与实施例1中相同方法制备的来自黑色素瘤的纳米囊泡腹膜内单独注射或与50μg的佐剂聚肌胞（polyI:C）组合注射，每隔4天注射3次到小鼠体内。在第14天，使小鼠安乐死，并切除肺部。
图9示出了小鼠黑色素瘤细胞转移后，从用来自黑色素瘤的纳米囊泡和/或佐剂免疫或未免疫的小鼠中切除的肺部图片。可以看出，纳米囊泡与佐剂结合作为癌症疫苗有效地激发了黑色素瘤细胞向肺部转移的免疫力。在这些图片中，黑色素瘤肿瘤块以黑斑表示。
计算转移的菌落，结果如图10中所示。由图10可以看出，用纳米囊泡和佐剂结合处理后肺部中检测到的转移的菌落数目显著下降。
剖开切除的肺部，并用H&E（苏木精-伊红）染色，以使细胞核染成蓝色，细胞质染成红色。图11示出了用来自黑色素瘤的纳米囊泡和/或佐剂处理或未处理后，用H&E染色的肺部图片。可以看出，仅仅用纳米囊泡和佐剂的结合处理降低了黑色素瘤的转移（由箭头示出），这表明来自肿瘤的纳米囊泡能够被用作癌症疫苗，引发显著的对抗癌症转移的免疫力。
实施例7：来自结肠直肠癌细胞的纳米囊泡诱导树突状细胞的免疫应答
从小鼠（BALB/C，雌性）的股骨和胫骨中收集骨髓细胞。红细胞溶解后，骨髓细胞在补充有营养素和20ng/ml GM-CSF的10%FBS/RPMI中分化成树突状细胞一周。将分化的树突状细胞以1x105细胞/孔播种于24孔板中，并用10.0μg/ml的在实施例2中制备的来自结肠直肠癌的纳米囊泡处理24小时。收集细胞培养物并以500x g在4°C下离心10分钟，上清液再以3000x g离心20分钟。使用ELISA（酶联免疫吸附法）定量分析获得的上清液中的细胞因子。
图12是细胞因子水平的图示，其示出了IL-12p70（一种诱导T辅助细胞1型应答的细胞因子），该细胞因子的水平依赖于纳米囊泡剂量增加。这些数据表明实际上来自结肠直肠癌的纳米囊泡像抗原呈递细胞，例如树突状细胞一样而发挥作用，从而引发抗癌效果。
实施例8：来自结肠直肠癌的纳米囊泡对抗肿瘤生长的抑制活性分析
每只小鼠（BALB/C，雌性）皮下注射5x105的结肠直肠癌细胞(Colon26)，培育一周，从而形成可测量的肿瘤块。然后，以与实施例2中相同的方式制备来自结肠直肠癌的纳米囊泡，以单独的10μg的剂量或与50μg的佐剂聚肌胞（polyI:C）组合，每隔一周，腹膜内注射三次。一周内测量肿瘤块尺寸两次或三次。肿瘤块体积根据公式v=l x s2/2计算，其中v表示体积，l表示肿瘤块最长轴的长度，s是垂直于最长轴的轴长。
图13是随时间绘制的用纳米囊泡和/或佐剂处理或未处理的小鼠中的肿瘤体积的图示，其示出了来自结肠直肠癌的纳米囊泡与佐剂结合作为癌症疫苗的功效。如图13所示，纳米囊泡与佐剂的结合作为疫苗显著降低了肿瘤的生长。同样，根据本发明的纳米囊泡和佐剂的结合被证明能够有效的抑制肿瘤的生长，如通过T/C比率所分析的，对于负载佐剂的纳米囊泡来说，计算后的值为27%。因此，如果来自癌细胞，那么无论来自什么类型癌症的纳米囊泡都可以被用作癌抗原以激发对癌症的免疫力。
实施例9：负载佐剂的纳米囊泡的制备
研磨从小鼠体内获得的肿瘤组织并使其通过45μm的过滤器以使组织均化，接着在4℃下，在低渗溶液中培养30分钟，并用1mg/ml的佐剂聚肌胞（polyI:C）处理额外的10分钟。然后，用100冲量的均化器均化滤液，并调节匀浆使其终盐浓度为150mM，从而形成囊泡。以500x g离心10分钟，去除核蛋白和以微球形式存在的完整细胞，并使上清液通过1μm孔径的膜过滤器三次，然后通过0.4μm孔径的膜过滤器三次。收集滤液后，将其体积调整为10ml，置于在超速离心管中包含0.1ml的2.0M蔗糖作为底层和0.35ml的0.8M蔗糖作为上层的蔗糖垫中，并以100,000x g超速离心2小时。分离浸没有囊泡的蔗糖层，按照下列顺序，分离，与4.8ml的30%Optiprep混合，并用3.0ml的20%Optiprep和2.5ml的5%Optiprep覆盖，之后以200,000x g超速离心2小时。最后，纳米囊泡层形成于5%和20%的Optiprep之间。
图14是根据该方法制备的来自黑色素瘤的纳米囊泡的透射电子显微镜图，其示出了dsRNA聚肌胞（polyI:C）与纳米囊泡的共轭。
实施例10：负载佐剂的纳米囊泡对抗肿瘤生长的抑制活性分析
每只小鼠（C57/BL6，雌性）皮下注射5x105的黑色素瘤细胞（B16BL6），培育一周，从而形成可测量的肿瘤块。然后，用于实施例9相同的方式制备10μg的负载聚肌胞（polyI:C）的，来自黑色素瘤的纳米囊泡，每隔一周向小鼠腹膜内注射三次。一周内测量肿瘤块尺寸两次或三次。肿瘤块体积根据公式v=l x s2/2计算，其中v表示体积，l表示肿瘤块最长轴的长度，s是垂直于最长轴的轴长。
如图15所示，与结合施用10μg的纳米囊泡和50μg的佐剂（[NV+聚肌胞]）相比，当使用10μg的负载佐剂的纳米囊泡([NV（聚肌胞])时，获得了更高的抗癌活性。负载佐剂的纳米囊泡也证明具有有效的抗癌活性，因为计算其T/C比率为33%。这些数据表明，当负载于纳米微泡时，佐剂没有扩散，而是增加了局部作用浓度，特别地证明了由聚肌胞激活的toll样受体3存在于免疫细胞的核内体中，并能够通过纳米囊泡递送。
实施例11：富集热休克蛋白的纳米囊泡的制备
来自小鼠的肿瘤组织在42℃的热应力下，在10%FBS/MEM中培养1.5小时。然后，研磨肿瘤组织并使其通过45μm的过滤器以使组织均化，接着在4℃下，在低渗溶液中培养30分钟。然后，用100冲量的均化器均化滤液，并调节匀浆使其终盐浓度为150mM，从而形成囊泡。以500x g离心10分钟，去除核蛋白和以微球形式存在的完整细胞，上清液在水浴超生发生器中超声处理30分钟，以形成纳米级的恒定尺寸的囊泡。随后，通过以10,000x g离心20分钟去除细胞碎片和线粒体。收集上清后，将其体积调整为10ml，置于在超速离心管中包含0.1ml的2.0M蔗糖作为底层和0.35ml的0.8M蔗糖作为上层的蔗糖垫中，并以100,000x g超速离心2小时。分离浸没有囊泡的蔗糖层，按照下列顺序，分离，与4.8ml的30%Optiprep混合，并用3.0ml的20%Optiprep和2.5ml的5%Optiprep覆盖，之后以200,000x g超速离心2小时。最后，纳米囊泡层形成于5%和20%的Optiprep之间。
图16示出了在42℃的热应力下培养后，来自黑色素瘤的纳米囊泡的热休克蛋白90(HSP90)的蛋白质印迹结果。如图16所示，42℃的热应力提高了热休克蛋白90(HSP90)的表达水平。特别地，与癌细胞本身相比，在纳米囊泡中，热休克蛋白是1.8倍富集的。当应用到癌症患者时，富集热休克蛋白的纳米囊泡预期能够激发更强大的抗癌活性，因为热休克蛋白产生免疫原性作用而激发与热休克蛋白相关的肿瘤发生的免疫力。
鉴于上述具体的描述，可以对本发明做出这些以及其他改变。大体上，所附权利要求书中使用的术语不应该限制本发明为本说明书中公开的具体实施例，除非上述描述明确地定义了这些术语。因此，本发明实际的范围涵盖了公开的实施例以及所有根据权利要求实现或实施的等价形式。
工业实用性
综上所述，根据本发明的来自肿瘤组织的纳米囊泡能够以高产量制备，并且保持与自发脱落的细胞外囊泡相同的特性。此外，来自肿瘤组织的纳米囊泡能够进行多种改性，从而能够作为癌抗原对于开发癌症疫苗是十分有用的。

Claims (19)

1.一种治疗癌症的药物组合物，其包含来自肿瘤组织的纳米囊泡。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肿瘤组织被转化为表达热休克蛋白。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，进一步包含免疫佐剂。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述免疫佐剂是聚肌胞。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述纳米囊泡包含除了来自肿瘤组织质膜的组分。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述组分是环糊精或聚乙二醇。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述纳米囊泡具有化学改性的膜。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述纳米囊泡用巯基或胺基进行化学改性。
9.一种治疗癌症的方法，其包括向所需受试者施用包括来自肿瘤组织的纳米囊泡的药物组合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肿瘤组织被转化为表达热休克蛋白。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述药物组合物还包含免疫佐剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述免疫佐剂是聚肌胞。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述纳米囊泡包含除了来自肿瘤组织质膜的组分。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述组分是环糊精或聚乙二醇。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述纳米囊泡具有化学改性的膜。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述纳米囊泡用巯基或胺基进行化学改性。
17.一种制备来自肿瘤组织的纳米囊泡的方法，其包括：
(a) 从肿瘤组织中分离细胞；
(b) 通过以下方法由细胞悬浮液构建纳米囊泡，所述方法选自由挤压、超声波处理、细胞裂解、均质化、冻融、电穿孔、机械降解和化学处理组成的组；
(c) 从悬浮液中分离构建的纳米囊泡；以及
(d) 在存在佐剂的条件下，培养纳米囊泡的悬浮液。
18.一种制备来自肿瘤组织的纳米囊泡的方法，其包括：
(a) 从肿瘤组织中分离细胞；
(b) 向细胞悬浮液中添加佐剂，从而使所述佐剂负载于细胞中；以及
(c) 通过以下方法由细胞悬浮液构建纳米囊泡，所述方法选自由挤压、超声波处理、细胞裂解、均质化、冻融、电穿孔、机械降解和化学处理组成的组。
19.一种癌症疫苗，包含作为抗原的来自肿瘤组织的纳米囊泡。
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