KR100796220B1 - 미립자 전달 시스템 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 바람직하게는 면역활성제를 포함할 수 있는 1종 이상의 생물활성제를 포함하는 미립자를 투여하기 위한 조성물 및 투여 방법을 제공한다. 이러한 점에서, 본 발명은, 예를 들어 호흡관, 위장관 또는 비뇨생식관을 이용하여 생물활성제를 국소 및 전신 투여하는 방법을 제공한다. 미립자들은 건조 분말의 형태이거나, 또는 비수성 현탁 매질과 배합되어 안정화된 분산물을 형성할 수 있다. 바람직한 구체예에서 본 발명의 조성물은 점막 표면으로의 제제의 표적 전달을 위해 정량식 흡입기, 건조 분말 흡입기, 분무기 또는 연무기와 같은 흡입 장치와 함께 사용될 수 있다.

Description

미립자 전달 시스템 및 사용 방법{PARTICULATE DELIVERY SYSTEMS AND METHODS OF USE}

본 발명은 일반적으로, 선택된 구체예에서 면역활성제를 포함할 수 있는 1종이상의 생물활성제를 포함하는 미립자를 투여하기 위한 조성물 및 투여 방법에 관한 것이다. 이러한 점에서, 본 발명은 예를 들어 호흡관, 위장관 또는 비뇨생식관을 이용한 생물활성제의 국소 전달 및 전신 전달 방법을 제공한다. 특히 바람직한 구체예에서, 점막 표면으로의 표적 전달을 위해 본 발명의 조성물을 정량식 흡입기, 건조 분말 흡입기, 분무기(atomizer) 또는 연무기(nebulizer)와 같은 흡입 장치와 함께 사용할 수 있다.

척추동물은 체내에서 발달하는 종양 세포와 같은 비정상 세포는 물론, 환경으로부터의 병원균에 대한 방어로서 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 지니고 있다. 이 면역 반응은 호중구 및 단핵구/대식세포계의 세포에 의해 매개되는 선천적 면역, 즉 수동 면역의 형태, 또는 특정 항원 서열을 인식하는 임파구에 의해 매개되는 후천적 면역, 즉 능동 면역의 형태일 수 있다. 상기 능동 면역 반응 그 자체는 다시 두가지로 세분될 수 있는데, 체순환계에 노출된 항원들을 중화시켜서 전문 식세포에 의해 이들이 업데이크되도록 조력하는 특이적 항체의 생산을 수반하는 체액 반응과, 체내의 감염된 또는 비정상적 세포의 인식에 필요한 세포 반응이 그것이다.

두 경우의 반응 모두에서, 특이적 반응은 항원의 세포내 프로세싱에 의해 촉발된다. 항원이 세포질 경로를 통해 프로세싱될 경우, 이로 인해 생긴 펩티드는 이펙터(effector) T 세포로의 적절한 제시를 촉진하는 발생 초기의(nascent) MHC 클래스 I 분자에 결합한다. MHC 클래스 I 제시는 세포독성 T 임파구에 의해 쉽게 인식된다. 대조적으로, 엔도사이토시스 경로를 통한 세포내 프로세싱에 의하면 체액 반응의 자극과 관련된 T 헬퍼(helper) 반응에 유리한 MHC 클래스 II 분자 상의 제시가 이루어진다. 백신화의 목적은 이 두 반응 모두를 유발시키고 기억 T 세포를 생성시켜서 면역계가 병원균의 감염에 반응하도록 준비시키는 것이다. 이러한 반응은 소위 "애쥬번트"라 불리는 자극 보조 분자의 발현을 촉진하는 시그널의 동시 투여에 의해 촉진된다. 체액 반응 및 세포 면역 반응이 모두 관여하면 광범위한 면역이 이루어지므로, 이것은 세포내 병원균을 제거하기 위한 바람직한 목표가 된다. 자극 보조 분자가 적절하게 발현되지 않으면 T 세포의 무반응 상태를 야기시킬 수 있다.

이러한 점에서, 면역 반응의 조절은 두가지 경로, 즉 외부 병원체 또는 이것의 항원에 대한 면역 반응의 유발, 또는 만성적 염증을 유도하는 자가 에피토프에 대해 유발된 부적절한 반응의 억제 중 하나를 취할 수 있다. 자가 에피토프에 대한 이러한 만성적 반응은 당뇨병(일반적으로 유형 I), 다발성 경화증, 류머티즘성 관절염 또는 홍반성 낭창과 같은 다양한 자가면역 질환과 관련이 있다. 어느 경우에나, 활성 물질은 종종 전형적인 약제에 일반적으로 사용되는 작은 화학 물질보다 비교적 복잡한 펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA를 기초로 한 물질이나 다른 거대분자 구조의 형태를 취할 수 있다. 이러한 복잡한 생물활성제는 경구 투여시 일반적으로 낮은 생체이용률을 나타내기 때문에, 전통적으로 침입성 비경구 주사에 의해 투여해 왔다. 그러나, 최근에 비교적 큰 생체분자를 흡입과 같은 방법으로 점막 경로를 통해 전달할 수 있다는 것이 제안되었다. 이러한 물질을 흡입을 통해 체순환계로 전달하는 방식은, 호흡계 점막을 통한 투여가 위장관의 소화 효소를 피할 수 있다는 점에서 특히 매력적이다. 게다가, 이것은 체순환계와의 교환에 유용한 넓은 표면적으로 인하여, 펩티드 및 단백질의 생체이용률을 증가시킬 수 있는 가능성을 제공한다. 경구적 생체이용을 위한 분자량 컷오프는 일반적으로 500 달톤의 범위로 간주되는 반면, 이보다 더 큰 분자량의 펩티드 호르몬 또는 유사체(예, 1.8 kD 데스모프레신, 5.8 kD 인슐린, 9.5 kD 부갑상선 호르몬)가 코 또는 폐 점막을 통해 손상되지 않은 상태로 체순환계로 흡수되는 것으로 확인되었다.

점막 표면 자체로의 표적 전달은 단백질, 펩티드, 바이러스 및 DNA 제형을 분해되지 않게 효과적으로 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 이것이 MALT(mucosa-associated lymphoid tissue: 점막 관련 임파계 조직) 임파계 내의 국소 면역 반응을 유도하는 경우에 유리하게 작용할 수 있다. 점막 백신화는 병원균의 침입구가 일반적으로 외부 환경과 접한 신체의 점막 표면 중 하나에 존재하는 병원균을 공격하기 위해 고안되는 백신의 경우에 특히 유용하다. MALT 임파계는 점막의 프로프리아층 내에 위치한다. 외래 항원이 국소 수지상 세포에 제시되면, B 세포 전구체가 국소적으로 증폭 및 성숙되며, 이것은 일반적으로 항원의 전신 전달에 의해 유도되는 IgG 항체는 물론, IgA 및 IgM 항체를 생산한다. IgA 및 IgM 항체는 트랜스사이토시스라는 과정에 의해 전문화된 수송 수용체를 통해 점막 표면을 통과해서 루멘으로 분비된다. 거기서, 이들은 점막 표면에 있는 침입 병원균에 대한 최전선 방어를 하게 된다. 최근의 증거에 따르면, 생성된 면역 복합체는 병원성 항원에 결합할 뿐만 아니라, 본래 자연적으로 트랜스사이토시스 경로를 통해 일어나는 바이러스의 전달을 막을 수 있다고 한다. 점막 면역화는 병원균 유래의 항원에 대한 이러한 최전선 면역 반응을 준비시킴으로써, 생물체가 처음에 침입 병원균을 차단하는 효율을 크게 증가시켜야 한다.

종래에, 이러한 업테이크 메카니즘을 이용하여 펩티드 또는 단백질을 효과적으로 전달하기 위한 몇몇 시도가 이루어졌다. 예를 들면, 미국 특허 제5,756,104호는 비내(鼻內) 백신 제제용으로 리포좀 제제를 이용하는 것을 기술하고 있다. 이러한 제제는 리포좀과 그 안에 분산된 유리 항원성 물질을 갖는 수성 담체를 포함한다. 이 조성물이 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌지만, 이것은 극도로 불안정하여 시간이 경과함에 따라 분해되기 쉬운 것으로 나타났다. 실용적인 면에서 이것은 심각한 장애가 된다.

이러한 한계를 극복하고 전달 효율을 더욱 증가시키기 위한 시도를 통해 비교적 큰 생체분자의 투여를 위한 건조 분말제를 개발하게 되었다. 불행히도, 종래의 분말 제제(즉, 미분화된 것)는 종종 장기간에 걸친 정확하고 재현가능한 투약을 제공하지 못한다. 부분적으로, 이것은 미세 입자간의 소수성 또는 정전기적 상호작용으로 인해 분말이 응집되는 경향이 있기 때문이다. 이러한 응집력은, 응집을 막기 위해 더 큰 담체 입자(즉, 락토스)를 사용함으로써 부분적으로 극복할 수 있다. 그러나, 이러한 더 큰 입자 및 관련 약물은 종종 표적 세포에 도달하지 못해서 불균일한 약물 전달 프로필이 초래된다. 또한, 담체 분자를 포함하는 미정제 혼합물은 혼입된 생체분자를, 설령 보호한다고 해도, 거의 보호하지 못한다. 따라서, 전술한 수성 조성물처럼, 이러한 제제는 시간이 경과함에 따라 분해되기 쉽고 활성을 잃기 쉽다.

보다 최근에는, 종래의 선행 기술 분말 및 수성 제제가 안고 있는 한계점을 극복하기 위해 개선된 제형화 방법이 착수되었다. 이러한 점에서, 본 명세서에 참고 인용된 미국 특허 출원 제09/218,209호 및 제09/219,736호는 초미립자 형태로 생물활성제를 포함하는 제제를 제조하는 방법 및 공정을 기술하고 있다. 이렇게 제조된 분말은 바람직하게는 공동의(hollow) 다공성 형태를 보이며, 건조 분말 흡입기(DPI), 또는 비수성 액체(즉, 히드로플루오로알칸 또는 플루오로카본)에 현탁된 경우에는 정량식 흡입기(MDI) 및 연무기와 같은 흡입 장치에 사용하기에 적합하다. 뿐만 아니라, 제형화 과정 중에 자극이 적은 조건을 이용하므로 생물학적 활성을 보유할 수 있게 하여, 이 제제를 단백질 및 펩티드뿐만 아니라 바이러스와 같은 보다 복잡한 거대분자 구조와 함께 사용하기에 특히 적합하게 한다. 또한, 이렇게 제조된 분말은 잔류 함수량이 매우 낮아서, 추진제와 같은 단쇄 플루오로카본 및 플루오로케미칼 또는 퍼플루오로옥틸 브로마이드(PFOB)와 같은 장쇄 플루오로케미칼 중에서의 제형화를 통해 더 유지할 수 있기 때문에, 이러한 제제는 불안정한 생물활성제의 안정한 보관 수단을 제공한다.

초미립자의 바람직한 공동의 다공성 형태는 강화된 안정성뿐만 아니라, 특히 흡입 치료에 적합한 공기역학적 특성을 제공한다. 또한, 미립자 특성은 매우 안정한 분산물의 형성을 가능하게 하여, 이것이 HFA-134a와 같은 히드로플루오로알칸 추진제뿐 아니라 PFOB와 같은 기타 플루오로카본 액체 비이클과 특히 화합성이 되게 한다. 따라서, 건조 형태로 사용되든지 또는 비수성 분산물로서 사용되든지 간에, 이 초미립자는 우수한 투여량 재현성, 탁월한 플룸(plume) 특성(추진제 또는 건조 분말 스프레이의 균일성 척도) 및 호흡할 수 있는 분획(장치 또는 인후에 퇴적되는 것 말고)으로서 전달되는 높은 투여량 전달율을 제공한다. 이러한 특성들은 본 발명의 초미립자가 폐 깊숙히 전달되는 한 상당한 이론적인 장점을 제공하다는 것을 시사한다. 단백질 및 펩티드와 같은 큰 거대분자는 폐포 수준에서 업테이크되는 것이 최적이기 때문에, 이러한 깊은 퇴적은 체순환계로의 전달이 필요한 경우 바람직하다.

이러한 초미립자 제제의 사용은 종래의 선행 기술의 전달 방법에 비해 상당히 개선된 것이지만, 여전히 생리적 반응을 강화시킬 수 있는 생물활성제, 면역조절제 또는 면역활성제의 표적 전달을 제공할 필요가 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 강화된 면역 반응을 유발시키는 조성물, 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 백신 및 면역조절제를 비롯한 면역활성제를 이것을 필요로 하는 환자의 점막 표면에 효과적으로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 활성을 유지하기 위해 냉장 또는 냉동시킬 필요가 없는 백신 또는 기타 생물활성 제형을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 흡입 치료를 통해 수동 면역 및 능동 면역을 확립하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 필요로 하는 환자에게 면역을 부여하거나 환자의 면역계를 하향 조절하는 데 사용할 수 있는 안정한 면역활성제 제제를 제공하는 것이다.

발명의 요약

상술한 목적들 및 기타 목적들이 본 발명의 명세서와 청구의 범위에 의해 제공된다. 이 목적을 위해, 본 발명의 방법 및 관련 조성물은, 광범위한 측면에서, 생물활성제를 분말 또는 미립자의 형태로 선택된 표적 부위에 전달하는 개선된 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 놀랍게도 본 발명의 방법 및 조성물은 투여 후 바람직하게는 면역활성제를 포함하는 혼입된 생물활성제의 활성을 강화 또는 증가시키는 데 이용될 수 있음을 알게 되었다. 이러한 점에서, 본 발명의 백신은 유사한 선행 기술의 백신 제제에 의해 유도되는 것보다 훨씬 더 강화된 면역 반응을 유도할 수 있는 "애쥬번트 효과"를 나타내는 것으로 생각된다. 예기치 않은 이러한 효능의 향상뿐만 아니라, 비교적 자극이 적은 제형화 기법을 미립자 형태 및 조성물과 병용하여 임의의 혼입 제제의 활성을 보호 및 강화시킬 수 있다. 이것은 냉장 또는 냉동할 필요 없이도 생물학적 활성을 보유하는, 비교적 효능있는 제제의 형성을 가능하게 한다. 게다가, 선행 기술의 약물의 전달용 분말 또는 분산물과는 달리, 본 발명은 바람직하게 입자간의 인력을 감소시켜서 유동성과 분산성을 향상시키는 신규 기법을 이용한다. 이러한 분말을 비수성 현탁 매질(예, 액체 플루오로케미칼)에 혼입시킬 경우, 상술한 동일한 특성으로 인해 응집(flocculation), 침강 또는 크림화를 감소시키고, 나아가서는 제제의 분해율을 감소시킬 수 있다. 마지막으로, 본 발명의 미립자 또는 분산물을 점막 표면과 같은 선택된 표적 부위에 투여하는 것은 생물활성을 더욱 최적화 또는 강화시키는 작용을 할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 분산물 또는 분말을 정량식 흡입기, 건조 분말 흡입기, 분무기, 에어로졸기, 비측용 펌프, 스프레이병, 연무기 또는 액체 투여량 점적주입(liquid dose instillation; LDI) 기법과 함께 이용하여 생물활성제를 효과적으로 전달하는 데 사용할 수 있다.

본 발명의 미립자 제형화 기법의 특히 이로운 특징은 광범위한 생물활성 구조체가 이들의 소수성 또는 친수성에 관계없이 안정화된 분산물 또는 분말에 혼입될 수 있다는 것이다. 바람직한 구체예에서, 생물활성 분말을 비교적 자극이 적은 분무 건조법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 양립 가능한 미립자 제형화 기법 덕분에, 펩티드, 단백질 또는 유전 물질과 같은 더 크고 더 불안정한 생체분자를 역효과나 지나친 활성의 손실 없이 본 발명의 조성물에 쉽게 혼입할 수 있다. 상기 제형화 기법 및 이로써 제조된 미립자는 또한 종래의 투여 기법 및 시스템을 이용하여 비교적 고용량(약 10 mg)의 생물활성제를 혼입 및 전달할 수 있다. 따라서, 건조 분말 또는 안정화된 분산물 중 어느 형태로 투여되든지 간에, 이 신규한 미립자 제조 기법 및 본 발명의 제제에 의해 제공될 수 있는 강화된 반응은 점막과 같은 표적 부위에 생물활성제를 효과적으로 전달하게 한다.

본 발명과 관련하여 사용되는 "생물활성제"란 호르몬, 사이토카인 또는 케모카인과 같은 활성 펩티드나 단백질, 또는 면역활성제를 말한다. 즉, 본 발명의 조성물과 방법은 거의 모든 생물활성제와 양립할 수 있으며, 이들은 외래 항원 또는 병원균에 대한 면역 반응을 유발시키거나, 능동 면역 반응을 하향 조절하는 것과 같이 면역 반응을 조절하기 위해 디자인된 면역활성제를 전달 또는 투여하는 데 놀라울 정도로 효과적이라는 것을 발견하였다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 "면역활성제", 또는 "면역학적으로 활성이 있는 물질"이란 피검체의 생리적 반응 또는 면역 반응을 유도하거나 기존의 반응을 조절하는 데 사용될 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 이러한 면역활성제 또는 생물학적 제제는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물; DNA, RNA 및 안티센스 작제물을 비롯한 유전 물질뿐만 아니라 바이러스, 파지 및 박테리아를 비롯한 미생물을 포함할 수 있다.

뿐만 아니라, 보조인자, 증강제 또는 침투 강화제로 작용할 수 있는 분자를 본 발명의 미립자 내에 쉽게 공동 제형화할 수 있다. 당업자들은 업테이크, 제시 또는 생체이용률을 향상시키는 작용을 하는 임의 화합물이 본 발명의 교시에 따라 증강제 또는 침투 강화제로서 작용할 수 있음을 알 것이다. 예를 들면, 세포의 막 투과성을 변경 또는 증가시킬 수 있는 화합물은 증강제 또는 침투 강화제로서 작용할 수 있다. 증강제 또는 침투 강화제의 예로는 킬레이트제(예, EDTA, 시트르산), 세제 또는 계면활성제(예, 9-라우릴 에테르), 지방산(예, 올레산) 및 담즙염(예, 나트륨 글리코콜레이트)을 들 수 있다. 특히 바람직한 침투 강화제는 탄소수 약 10개 미만의 사슬 길이를 갖는 비교적 단쇄의 인지질을 포함한다. 생물활성제의 경우와 마찬가지로, 또 아래에서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, 선택된 증강제 또는 침투 강화제를 다양한 농도로 미립자 내로 혼입시키거나 결합시킬 수 있다.

당업자라면, 본 발명의 미립자, 초미립자 또는 천공된 미세구조체가 원하는 물리적 특성 또는 형태를 제공하는 임의의 생체적합성 물질로 제조될 수 있다는 것을 알 것이다. 이러한 점에서, 천공된 미세구조체는 바람직하게는, 표면 상호작용을 최소화하고 전단력을 감소시킴으로써 인력을 완화시키는 작용을 하는 세공, 공극, 흠 또는 기타 간극을 포함한다. 이러한 형태는 응집을 줄이고 분산성을 향상시키는 작용을 한다. 그러나, 이러한 제한을 조건으로, 임의의 생체적합성 물질 또는 구성(configuration)을 사용하여 미세구조체 매트릭스를 형성할 수 있음을 알 것이다. 선택된 물질에 대해서는, 미세구조체가 바람직한 구체예로서 침투 강화제로서 작용하는 1종 이상의 계면활성제를 혼입하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 이 계면활성제는 의약용으로 승인된 인지질 또는 기타 계면활성제나 양성친화제를 포함한다. 유사하게, 미세구조체는 1종 이상의 생물활성제나 생물학적 제제를 혼입하는 것이 바람직하다. 구성에 있어서는, 본 발명의 선택된 구체예는 비록 공극을 포함하거나 천공된 기타 구조체도 고려될 수 있지만, 큰 내부 공극을 한정하는 비교적 얇은 다공성 벽을 갖는 분무 건조된 공동의 미소구체를 포함한다.

공동 및/또는 다공성의 천공된 미세구조체를 이용하면 선행 기술의 분말화된 제제 및 분산물을 지배하는 반데르발스 힘과 같은 분자들의 인력을 상당히 줄일 수 있다는 놀라운 발견을 하였다. 이러한 점에서, 분제 조성물은 일반적으로 흡입 치료를 위한 바람직한 특성을 제공하면서 제제의 유동성에 기여하는 비교적 낮은 용적 밀도를 갖는다. 더욱 구체적으로, 비교적 저밀도의 천공된(또는 다공성) 미세구조체 또는 초미립자를 이용하면 입자들간의 인력이 상당히 감소됨으로써 생성된 분말의 유동성을 얻는 데 필요한 전단력을 감소시킨다. 또한, 비교적 저밀도의 천공된 미세구조체가 흡입 치료에 사용될 경우 우수한 공기역학적 수행 능력을 제공한다. 분산물에서는 이러한 분말의 물리적 특성이 안정한 제제를 형성하도록 한다. 또한, 본 발명의 교시에 따라 분산물 성분을 선택함으로써 입자간 인력을 더 감소시켜서 안정성이 강화된 조성물 또는 제제를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예는 천공된 미세구조체 또는 다공성 미립자를 포함하지만, 비교적 비다공성 또는 실질형(solid) 미립자 또한 본 발명의 교시에 부합하는 분제 또는 분산물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 즉, 분말 또는 비교적 비다공성 또는 실질형 미립자의 현탁물을 포함하는 분산물 역시 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주된다. 이러한 점에서, 이러한 비교적 비다공성 미립자는 미분화된 입자, 분말 입자 또는 나노결정체를 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 "미립자(particulate)"란 천공된 미세구조체 및 비교적 비다공성 입자를 비롯하여 임의의 다공도 및/또는 밀도를 갖는 입자들을 포함하는 것으로 광범위하게 해석 및 간주된다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 분말은 적절한 비수성 분산 매질 내에 분산시켜 선택된 생물활성제를 포함하는 안정화된 분산물을 제공할 수 있다. 이러한 분산물은 정량식 흡입기, 분무기, 비측용 펌프, 스프레이병 및 연무기에 특히 유용하다. 본 발명의 다른 구체예는 직접 점적주입 기법을 이용하여 폐 또는 비강에 직접적으로 투여할 수 있는 안정화된 분산물을 포함한다. 어떤 경우에는, 특히 바람직한 현탁 매질은 실온에서 액체인 플루오로케미칼(즉, 퍼플루오로카본 또는 플루오로카본) 또는 플루오르화 추진제(즉, 히드로플루오로알칸 또는 클로로플루오로카본)를 포함한다. 이들의 이로운 습윤성 때문에, 일부 플루오로케미칼은 입자 분산물을 폐 또는 다른 점막 표면에 더 깊이 전달하여, 전신 전달을 향상시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 이러한 현탁 매질은 무수성인 경향이 있어서, 혼입된 생물활성제의 가수분해를 지연시킨다. 마지막으로, 플루오로케미칼은 일반적으로 정균 작용을 하기 때문에 화합성 제제 내에서의 미생물의 성장 및 그와 관련된 단백질 분해 가능성을 감소시킨다.

본 발명의 분말 또는 안정화된 분산물의 전달에 대한 본 발명의 또다른 측면은 1종 이상의 생물활성제 또는 생물학적 제제를 환자에게 투여하는 흡입 시스템에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 적합한 흡입 장치의 예로는 분무기, 비측용 펌프, 스프레이어 또는 스프레이병, 건조 분말 흡입기, 정량식 흡입기 또는 연무기를 들 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이러한 흡입 장치는 생물활성제를 원하는 생리적 부위(예, 점막 표면)에 에어로졸 형태로 전달한다. 본 발명의 목적을 위해, "에어로졸화된"이란 용어는 문맥상 달리 제한되지 않는다면, 미세한 고체 입자 또는 액체 입자의 기체상 현탁물을 의미하는 것으로 간주된다. 즉, 에어로졸 또는 에어로졸화된 약제는, 예를 들면 건조 분말 흡입기, 정량식 흡입기, 분무기, 스프레이병 또는 연무기에 의해 생성될 수 있다. 물론, 아래에서 더 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 또한 직접적으로(예, 통상적인 주사 또는 무침 주사를 통해), 또는 액체 투여량 점적주입과 같은 기법을 이용하여 전달될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 점막 표면과 접촉하여(예, 흡입을 통해) 점막 면역과 전신 면역 둘 다를 유도한다.

본 발명의 분말 또는 안정화된 분산물은 생물활성제를 점막 표면에 투여하는 데 특히 적합하지만, 이것은 화합물을 신체의 임의 부위에 국소 또는 전신 투여하는 데에도 사용할 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 바람직한 구체예에서 이 제형을 위장관, 호흡관, 국소, 근육내, 비경구, 피내, 경피, 복강, 비내, 질, 직장, 귀, 협측, 경구 또는 눈을 비롯하여 다수의 상이한 경로를 이용하여 투여할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 점에서, 당업자들은 선택된 투여 경로가 대개 생물활성제의 선택 및 피검체가 원하는 반응에 따라 결정된다는 것을 알 것이다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 후술하는 본 발명의 바람직한 대표적 구체예의 상세한 설명을 참조하면 당업자들에게는 쉽게 이해될 것이다.

바람직한 구체예의 상세한 설명

A. 서론

본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있지만, 여기에서는 본 발명의 원리를 예시하는 특정 구체예를 개시한다. 본 발명은 예시된 특정 구체예에만 한정되는 것은 아니다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 생물활성제의 전달에 유리하게 이용될 수 있는 분말 또는 초미립자의 제조 방법, 이를 포함하는 시스템 및 조성물을 제공한다. 바람직하게 생물활성제는 활성 펩티드나 단백질 또는 면역활성제를 포함한다. 본 발명에 있어서, 면역활성제는 면역 반응을 유도할 수 있거나, 기존의 반응을 조절하는 데 사용될 수 있는 백신, 면역글로불린 또는 자가항원과 같은 임의의 분자를 포함할 수 있다. 당업자라면, 본 발명의 분말이 건조 상태(예, DPI, 즉 기체 추진 분말 주입기를 통해) 또는 안정화된 분산물의 형태(예, 분무기, 스프레이병, MDI, LDI, 무침 주사기, 주사기, 비측용 펌프 또는 연무기를 통해)로 생물활성제를 전달하는 데 유리하게 이용될 수 있음을 알 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 분말 또는 초미립자는 천공된 미세구조체를 포함하는데, 이는 본 발명에서 개시된 바와 같이, 공극, 세공, 흠, 공동, 공간, 간극, 틈, 천공 또는 구멍을 나타내거나, 한정하거나 포함하는 구조적 매트릭스를 포함한다. 이러한 천공된 미세구조체 분말은 흡입 치료에 특히 유용하게 하는 공기역학적 특성을 지니고, 추진제 또는 비수성 전달 비이클 중의 안정화된 분산물을 형성하도록 하는 형태를 나타낸다. 더욱 일반적으로, 본 발명의 생물활성 분말을 형성하는 동안 이용되는 비교적 자극이 적은 조건 및 적합한 전달 방법과 관련된 장점들은 비교적 부서지기 쉬운 생물학적 제제를 효율적으로 투여할 수 있게 한다.

어느 특정 이론에 의해 지지되기를 원하지는 않지만, 본 발명의 조성물을 제조, 보관 및 투여하는 데 이용되는 비교적 자극이 적은 방법은 일반적으로 불안정한 제제 내에서 생물학적 활성을 효과적으로 보유할 수 있게 한다. 이러한 점에서, 바람직한 제형은 활성 유지를 위해 냉장을 요하지 않는다. 게다가, 본 발명의 분말에 사용하기에 적절한 화합물의 선택 및 선택된 생리적 부위(예, 점막 표면)로의 전달은 혼입된 제제(들)의 업테이크를 촉진시키는 것은 물론, 이것의 활성을 강화시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물 및/또는 전달 기법은 선택된 제제를 투여한 후 면역 반응 또는 생체활성을 강화시킬 수 있는 예기치 않은 "애쥬번트 효과"를 유발하는 것으로 보인다. 더 구체적으로, 하기 실시예에서 설명하는 바와 같이, 본 발명은 프로인트 완전 애쥬번트 중 항원 투여를 통해 얻을 수 있는 것(즉, 통상적인 약학 제형보다 몇배 더 높은 정도)과 유사한 면역 반응을 유도하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 능동 국소 또는 전신 면역화를 유도하거나, 수동 면역화, 면역 조절, 호르몬 조절 또는 유전자 치료를 하기 위한 활성 펩티드, 단백질, 유전 물질 또는 병원성 입자(생존한 것이건 불활화이건)의 효과적인 전달을 제공한다.

B. 생물활성제

광범위한 측면에서, 이러한 분말을 혼입한 분산물을 비롯하여 본 발명의 분말화된 또는 초미립자 조성물은 바람직하게는 1종 이상의 생물활성제를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, "생물활성제"란 용어는 임의의 활성 펩티드나 단백질, 또는 임의의 면역활성제를 포함하는 것으로 간주된다. 면역활성제에 대해서는, 본 발명의 특히 바람직한 구체예는 면역 반응을 조절할 수 있도록 고안된 면역활성제를 포함한다. 본 발명의 교시에 따르면, 피검체의 면역 반응의 조절은 잠재적인 병원균의 감염 또는 외래 항원에 대한 반응을 유도하는 것, 기존의 면역 반응을 촉진하는 것, 국소 또는 전신 수동 면역을 유도하는 것, 또는 자가면역 반응이나 알러지 반응을 억제하는 것을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, "생물활성제" 또는 "면역활성제"란 용어는 피검체에서 원하는 생리적 또는 면역 반응을 제공하는 임의의 분자나 유기체, 또는 이들의 유사체, 동족체 또는 유도체를 포함하는 것으로 광범위하게 해석된다. "생물활성제"란 용어는 문맥상 달리 제한되지 않는다면 "면역활성제" 및 이것의 등가물을 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 생물활성제의 예로는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질 또는 키메라 단백질, 면역글로불린; DNA, RNA, 재조합 작제물 및 안티센스 작제물을 비롯한 유전 물질; 바이러스, 파지, 박테리아 탄수화물 및 박테리아를 비롯한 미생물뿐만 아니라 증강제, 보조인자 또는 침투 강화제로서 작용할 수 있는 더 작은 분자가 있다. 본 발명에 따른 생물활성 조성물은 유전자 치료에 이용할 수 있는 백신, 면역조절제, 이펙터 또는 레플리콘으로 사용할 수 있다.

본 발명의 분말 또는 초미립자 조성물은 오직 1종 이상의 생물활성제(즉, 100% w/w까지)를 포함할 수 있는 것으로 이해해야 할 것이다. 그러나, 선택된 구체예에서, 천공된 미세구조체는 활성에 따라 훨씬 적은 생물활성제를 혼입할 수 있다. 따라서, 고활성 물질을 위해서는, 미립자, 초미립자 또는 천공된 미세구조체는 약 0.1% w/w 이상의 농도로 포함하는 것이 바람직하지만, 0.001 중량% 만큼의 적은 양으로 혼입할 수도 있다. 본 발명의 다른 구체예는 생물활성제 또는 생물학적 제제를 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 40% w/w 이상으로 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 분말은 생물활성제를 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 또는 90% w/w 이상 포함할 수 있다. 본 발명의 분말 또는 천공된 미세구조체에 혼입된 생물활성제의 정확한 양은 실제 사용되는 제제의 선택, 요구량, 투여 방법 및 형태에 좌우된다. 당업자들은 본 발명의 교시와 더불어 잘 알려진 약학적 기법을 이용하여 이러한 결정을 할 수 있음을 알 것이다.

약학 제제에 대해서는, 면역 반응을 비롯하여 생리적 반응을 유도할 목적으로 본 발명의 분말 또는 천공된 미세구조체 내로 제형화할 수 있는 임의의 생물활성제를 분명 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주한다. 본 발명의 교시에 따르면, 선택된 생물활성제(들)를, 원하는 효능을 제공하고 선택된 제조 기법과 양립 가능한 임의 형태의 분말 또는 천공된 미세구조체에 결합시키거나 그 안에 혼입시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "결합시키다(associate)" 또는 "결합시키는(associating)"이란 용어는 미립자, 초미립자, 구조적 매트릭스 또는 천공된 미세구조체가 생물활성제를 포함하거나, 혼입하거나, 흡착하거나, 흡수하거나, 생물활성제에 의해 코팅 또는 형성될 수 있다는 것을 의미한다. 적절하다면 이 제제는 염의 형태(즉, 알칼리 금속이나 아민염, 또는 산 부가염으로서) 또는 에스테르 또는 용매화물(수화물)로서 사용될 수 있다. 이러한 점에서, 생물활성제의 형태는 화합물의 활성 및/또는 안정성의 최적화 및/또는 현탁 매질에서의 제제의 용해도 최소화 및/또는 입자의 응집을 최소화시키도록 선택될 수 있다.

적어도 어느 정도까지는, 본 발명에 의해 제공되는 장점들은 본 발명의 분말 및 분산물에 의해 제공되는 독특한 제형화법, 저장 방법 및 전달 방법의 측면에 있다. 이러한 점에서, 그리고 아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 분말 또는 천공된 미세구조체를 형성할 수 있는 조건은 비교적 자극이 적다. 즉, 활성 화합물 또는 활성제를 극한 물리적 또는 화학적 조건에 적용하지 않고 본 발명에 따라 생물활성제를 포함하는 미립자를 제조할 수 있다. 이것은 쉽게 분해 또는 불활성화될 수 있는 단백질, 유전 물질 또는 약독화 바이러스와 같은 비교적 큰 거대분자에 있어서 매우 중요하다. 뿐만 아니라, 본 발명의 선택된 구체예는 비수성 현탁 매질을 포함하는 비교적 안정한 분산물을 형성함으로써 혼입된 제제의 생물학적 활성을 유지하는 역할도 한다. 현탁 매질(바람직하게는 액체 플루오로케미칼 또는 플루오로케미칼 추진제) 중의 이러한 활성 분말의 분산물은 정균 작용을 하고 무수성인 경향이 있어서, 혼입된 제제의 가수분해 또는 단백질 분해를 억제한다. 이러한 조성물은 오랜 저장 기간에 걸쳐 비교적 높은 활성 수준을 유지하는 것으로 확인되었다. 마지막으로, 놀랍게도, 본 발명의 분말 조성물 및 이것의 전달 기법 둘 다를 결합된 생물활성제의 활성을 증강 또는 강화시키는 데 적용할 수 있다는 것을 알게 되었다. 이러한 점들을 모두 합하여, 본 발명의 이러한 장점들은 고활성제를 선택된 생리적 부위에 효율적으로 전달하여 그 효능을 제공한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 조성물, 방법 및 시스템은 펩티드, 폴리펩티드, 박테리아성 탄수화물, 바이러스 및 유전 물질과 같은 생물활성제의 전달에 유용하다. 이러한 점에서, 본 발명은 능동 면역화를 위한 백신의 접종(예, 점막 및 전신 백신화), 수동 면역화를 위한 면역글로불린, 자가면역 질환의 치료를 위한 면역조절제, 활성 펩티드나 단백질, 및 유전자 치료나 백신화를 위한 이펙터와 발현 벡터에 특히 유용하다. 아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 선택된 제제를 포함하는 분말은 다양한 상이한 수단을 통해 제조할 수 있다. 분말 또는 초미립자는 천공된 미세구조체의 형태이고, 혼입된 생물활성제의 안정성 및/또는 효능을 강화시키기 위해 추가 성분을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 선택적으로, 이 분말은 현탁 매질 중에서 제형화되어 안정화된 분산물을 제공할 수 있다.

특히 바람직한 종류의 생물활성제에 대해 바로 아래에서 상세히 설명할 것이다.

B(i). 항원 및 백신(능동 면역화용)

본 발명의 교시에 따르면, 특히 바람직한 생물활성제는 백신을 포함한다. 본 명세서와 첨부 실시예를 통해 설명하는 것처럼, 적합한 백신은 불활성화 균 또는 사균(예, 바이러스), 생 약독화 미생물, 파지; 단백질, 펩티드 또는 탄수화물(예, 박테리아성 탄수화물)과 같은 소단위체 백신; 레플리콘, 바이러스 벡터 및 플라스미드를 비롯한 유전 물질; 및 융합 단백질 또는 키메라 항체와 같은 재조합 분자를 포함할 수 있다. 어떤 형태의 제제 또는 생물학적 제제를 선택하는가에 관계없이, 이렇게 얻은 분말화된 조성물을 피검체를 1종 이상의 표적 항원에 대해 면역화시키는 데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명과 관련된 애쥬번트 효과 또는 강화된 면역은 특히 효과적인 면역화를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 "표적 항원"이란, 그에 대해 면역 반응을 유도하고자 하는 항원, 일반적으로 단백질 또는 펩티드를 말한다. 이러한 항원은 바이러스, 박테리아, 원생동물, 진균류, 효모 또는 기생생물 항원과 같은 병원균에 포함될 수 있거나, 암세포와 같은 세포에 포함될 수 있다. 종양 항원 및 바이러스 항원은 특히 바람직한 표적 항원이다. 유전자 백신의 경우에는, 투여된 유전 물질에 의해 자가 세포가 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포에 의해 1종 이상의 표적 항원이 발현될 것이다. 반대로, 키메라 단백질 또는 융합 단백질이나, 사균 또는 약독화된 미생물을 비롯하여 단백질 또는 펩티드계 백신의 경우, 표적 항원(들)은 면역계에 직접적으로 제시된다. 어느 경우든지, 본 발명의 분말 또는 분산물을 이용한 표적 항원의 제시는 원하는 면역 반응을 일으킬 것이다. 흥미롭게도, 생 바이러스 또는 생 바이러스 및 사 바이러스의 조합물을 본 발명의 교시에 따라 백신으로 사용했을 때, 피검체에서 특히 활발한 면역 반응이 유발된다는 것을 알게 되었다.

당업자라면, 일반적으로, 효과적인 항바이러스 면역 반응은 세포 매개 반응( 일반적으로 Th1/CTL 세포 반응이 관련됨) 및 B 세포 매개 체액 반응 둘 다를 포함한다는 것을 알 것이다. 정제 단백질 또는 사균은 일반적으로 CTL 반응없이 B, Th2 반응을 유도하는 반면, 생 백신 및 소단위체 또는 사 백신의 특정 제형은 CTL 반응이 관련된 B, Th1 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 백신 조성물은 투여 후 B, Th1 및 CTL 반응을 비롯한 광범위한 면역 반응을 유도할 것이다. 그러나, 백신 접종시 생 바이러스에 의한 감염은 받아들이기 어려운 부작용을 초래할 수 있다. 그러므로, 성공적인 백신화 전략의 목표는 심한 역효과를 일으키지 않고, 세포 및 체액 면역 반응 둘 다를 관여시키는 것이다. 후술하는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 투여 후 이 두가지 유형의 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다.

이러한 점에서, 적합한 백신은 표적 항원에 대해 B 세포 반응, T 세포 반응 또는 이들의 복합 반응을 유도하는 임의의 분자, 유기체 또는 화합물을 포함할 수 있다. 이와 같이, 숙주 면역계에 실제로 제시되는(직접적 또는 숙주 세포를 형질전환시킨 후든지 간에) 물질은 자연 발생적 표적 항원의 유사체, 동족체 또는 유도체이거나 표적 항원을 포함하는 분자일 수 있다. 뿐만 아니라, 면역화는 사실상 제시되는 표적 항원의 유형 및 전달 형태에 따라 국소적 또는 전신적일 수 있다. 예를 들면, 특히 바람직한 구체예에서, 면역원성 반응은 사실상 대개 점막(예, 점막 관련 임파계 조직[MALT] 임파계) 내에서 일어난다. 전술한 바와 같이, 외래 항원이 국소 수지상 세포에 제시되면, T 세포 및 B 세포가 국소 증식 및 성숙되어서 일반적으로 항원의 전신 전달에 의해 유도된 IgG 항체 외에도, IgA 및 IgM 항체를 생성한다. 이러한 국소 면역화, 특히 비도 및 비동에서의 면역화는 인플루엔자 바이러스 및 호흡기 합포체 바이러스와 같은 공기중 병원균에 의한 감염을 방지하는 데 특히 효과적인 것으로 확인되었다.

더욱 일반적으로, 본 발명의 백신 조성물은 다수의 병원균 유래의 1종 이상의 표적 항원을 포함할 수 있다. 예를 들면, 표적 항원은 인플루엔자 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 허피스 바이러스(HSV-I 및 HSV-II 포함), 백시니아 바이러스, 간염 바이러스(간염 A형, B형, C형 또는 D형을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아님), 바리셀라 바이러스, 로타바이러스, 파필로마 바이러스, 홍역 바이러스, 엡슈타인 바르 바이러스, 콕스새키 바이러스, 폴리오 바이러스, 엔테로바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스(HIV-1 또는 HIV-2를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아님), 호흡기 합포체 바이러스, 루벨라 바이러스, 스트렙토코커스 박테리아(예, 스트렙토코커스 뉴모니아; Streptococcus pneumoniae), 스태필로코커스 박테리아(예, 스태필로코커스 오리어스; Staphyloococcus aureus), 헤모필러스 박테리아(예, 헤모필러스 언플루엔자; Hemophilus unfluenzae), 리스테리아 박테리아(예, 리스테리아 모노사이토게네스; Listeria monocytogenes), 클랩실라(Klebsiella) 박테리아, 그램-음성 바실러스 박테리아, 에쉐리키아 박테리아(예, 에쉐리키아 콜라이; Escherichia coli), 살모넬라 박테리아(예, 살모넬라 티피무리엄; Salmonella typhimurium), 비브리오 박테리아(예, 비브리오 콜레라; Vibrio cholerae), 여시니아 박테리아(예, 여시니아 페스티스; Yersinia pestis 또는 여시니아 엔테로콜리티커스; Yersinia enterocoliticus), 엔테로코커스(Enterococcus) 박테리아, 네이세리아 박테리아(예, 네이세리아 메닝기티디스; Neisseria meningitidis), 코리네박테리움 박테리아(예, 코리네박테리움 티프테리아; Corynebacterium diphtheriae), 클로스트리듐 박테리움(예, 클로스트리듐 테타니; Clostridium tetani), 마이코플라즈마(예, 마이코플라즈마 튜버쿨로시스; Mycoplasma tuberculosis), 캔디다(Candida) 효모, 아스퍼길러스(Aspergillus) 진균류, 무커(Mucor) 진균류, 톡소플라즈마, 아메바, 말라리아 기생충, 트리파노소형 기생충, 레이시마니알 기생충, 장내 기생충 등을 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 표적 항원의 비제한적인 구체예로는 헤마글루티닌, 핵단백질, M 단백질, F 단백질, HBS 단백질, HIV의 gp 120 단백질, HIV의 nef 단백질 및 리스테리오라이신을 들 수 있다.

어떤 유형의 항원이 표적 항원으로 선택되든지 간에, 항원은 하나 이상의 적절한 에피토프를 포함할 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "적절한 에피토프"란 면역계에 접근 가능한 표적 항원 내에 포함된 에피토프를 말한다. 예를 들면, 적절한 에피토프는 미생물이 세포를 침투한 후 프로세싱되거나, 미생물 또는 미생물 단백질의 표면에서 항체에 의해 인식될 수 있다. 바람직하게, 에피토프에 대해 유도된 면역 반응은 유리한 효과를 부여한다; 예를 들면, 표적 항원이 바이러스 단백질인 경우, 표적 항원의 적절한 에피토프에 대한 면역 반응은 적어도 부분적으로 바이러스의 감염성 또는 병원성을 중화시킨다. 당업자들은 적절한 에피토프가 B 세포 또는 T 세포 에피토프일 수 있음을 알 것이다.

본 명세서에서 사용되는 "B 세포 에피토프"란 용어는 더 큰 단백질 내에 포함된 펩티드 서열을 비롯하여, B 세포에 의한 항체 생산을 유도할 수 있는 펩티드를 말한다.

예를 들면, 인간 면역결핍증 바이러스("HIV) 타입 1의 막 단백질의 과가변역 3 루프("V3 루프")가 B 세포 에피토프로 알려져 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 공지된 B 세포 에피토프의 비제한적인 다른 예로는 면역우성 B 세포 에피토프인 것으로 확인된 인플루엔자 HA 1 헤마글루티닌의 B 위치와 같은 인플루엔자 바이러스 종과 관련된 에피토프(Li 등, 1992, J. Virol. 66:399-404), 홍역 바이러스의 F 단백질의 에피토프(잔기 404-414, Parlidos 등, 1992, Eur. J. Immunol. 22:2675-2680); 간염 바이러스 프리-S1 영역의 에피토프(잔기 132-145, Leclerc, 1991, J. Immunol. 147:3545-3552) 및 아구창 질환 VP1 단백질의 에피토프(잔기 141-160, Clarke 등, 1987, Nature 330:381-384)를 들 수 있다. 사용할 수 있는 또다른 B 세포 에피토프는 공지되어 있거나, 또는 Caton 등의 문헌[1982, Cell 31:417-427]에 기술된 것과 같은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 펩티드는 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "T 세포 에피토프"란 용어는 더 큰 단백질 내의 펩티드 서열을 비롯하여, MHC 자가 항원과 결합되어 T 세포에 의해 인식되면 기능적으로 T 세포를 활성화시키는 펩티드를 말한다. 이러한 점에서, 본 발명은 MHC 클래스 II 자가 항원과 관련해서, 헬퍼 T 세포에 의해 인식됨으로써 Th 세포를 통한 B 세포 항체의 생성을 촉진하는 Th 에피토프를 제공한다.

비제한적인 예로는, PR8 종의 인플루엔자 A 헤마글루티닌(HA) 단백질은 아미노산 잔기 110-120 위치에서 Th 에피토프를 포함한다. 공지된 T 세포 에피토프의 다른 예로는 파상풍 톡소이드의 2종의 난교잡 에피토프(Ho 등, 1990, Eur J. Immunol. 20:477-483); 사이토크롬 c의 에피토프(잔기 88-103); 마이코박테리아 열충격 단백질의 에피토프(잔기 350-369, Vordermir 등, Eur. J. Immunol. 24:2061-2067); 달걀 흰자 리소자임의 에피토프(잔기 48-61, Neilsonet 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:7380-7383); 스트렙토코커스 A M 단백질의 에피토프(잔기 308-319, Rossiter 등, 1994, Eur. J. Immunol. 24:1244-1247) 및 스태필로코커스 뉴클라아제 단백질의 에피토프(잔기 81-100, de Magistris, 1992, Dell 68:1-20)를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 또다른 Th 에피토프는 공지되어 있거나, 또는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 통해 쉽게 확인할 수 있다.

적절한 에피토프의 또다른 예로는 CTL 에피토프를 들 수 있는데, 이것은 MHC 클래스 I 자가 항원과 관련해서 세포독성 T 세포에 의해 인식됨으로써 표적 항원을 포함하는 세포의 CTL 매개 세포 용해를 촉진시킨다. 이러한 에피토프의 비제한적인 예로는 아미노산 잔기 147-161과 365-379 각각에 해당하는 인플루엔자 바이러스 핵 단백질(Taylor 등, 1989 Immunogenetics 26:267; Townsend 등, 1983, Nature 348:674), LSMV 펩티드(아미노산 잔기 33-41; Zinkernagal 등, 1974, Nature 248:701-702) 및 아미노산 잔기 257-264에 해당하는 난알부민 펩티드(Cerbone 등, 1983, J. Exp. Med. 163:603-612)를 들 수 있다.

유전자 백신의 경우, 투여된 유전 물질에 의해 자가 세포가 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포는 1종 이상의 표적 항원을 발현하게 된다. 그 후, 발현된 항원(들)은 피검체에서 원하는 면역 반응을 일으킨다. 당업자들은 유전 물질이 나형(naked) 분자의 형태(예, DNA 또는 RNA) 또는 바이러스 벡터의 형태로 분말과 결합될 수 있다는 것을 알 것이다. 어느 경우든지, 본 발명에 적합한 핵산은 바람직하게 1종 이상의 적절한 에피토프를 암호화할 것이고, 적절한 에피토프의 발현 및/또는 안정성 및/또는 면역원성을 조절하는 엘리먼트를 선택적으로 더 포함할 수 있다.

예를 들면, 유전자 작제물 내에서 암호화된 에피토프의 발현을 조절하는 엘리먼트로는 프로모터/인핸서 엘리먼트, 전사 개시 부위, 폴리아데닐화 부위, 전자 종결 부위, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 코돈, 번역 종지 코돈, 시그널 펩티드 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 구체적인 예로는 사이토메갈로바이러스(CMV 또는 SV40 바이러스("SV40"); Montgomery 등, 1993, DNA and Cell Biology 12: 777-783)의 초기 이른 유전자의 프로모터 및 인트론 A 서열을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 선택적으로, 동일한 오픈 리딩 프레임 내에서 1종 이상의 에피토프가 발현될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 유전자 백신 및 이것의 제조 방법의 예는 국제 출원 공개 공보 WO 94/21797(머크 & 컴퍼니 및 비칼 인코포레이티드), 국제 출원 공개 공보 WO 97/21687(Mt. 시나이), 미국 특허 제5,589,466호 및 제5,580,859호, 국제 출원 공개 공보 WO 90/11092호(비칼 인코포레이티드)에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 모두 본 명세서에 참고 인용한다.

적절한 에피토프의 강화된 안정성 및/또는 면역원성을 제공하기 위해, 더 큰 펩티드 또는 단백질과 관련해서 에피토프를 제시하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 적절한 에피토프는 키메라 항체 가변 영역에서 또는 융합 단백질의 일부로서 발현될 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 1종 이상의 적절한 에피토프를 포함하는 전장 단백질(예, 바이러스 코트 단백질)을 투여하는 것이 이로울 수 있다. 선택적으로, 면역원성 펩티드 또는 단백질의 조합물 또는 칵테일을 포함하는 분말 또는 천공된 미세구조체를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 점에서, 적절한 에피토프는 같거나 다른 병원균으로부터 유래할 수 있다는 것을 알 것이다. 후자의 경우, 기회주의적 병원균을 근본적인 질병 유발 물질과 함께 표적화할 수 있다. 본 발명의 조성물은 광범위한 표적 범위뿐만 아니라, 다양한 에피토프 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 B 세포 에피토프의 혼합물, T 세포 에피토프의 혼합물 또는 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프의 조합물을 포함하는 핵산 또는 펩티드나 단백질을 포함할 수 있다.

더욱 구체적으로, 1종 이상의 적절한 에피토프를 포함하거나 발현하는 조성물의 투여는 예기치 않은 시너지 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 조합 백신은 특정 병원균(들)에 대해 원하는 면역을 부여하는 데 있어서 1개의 적절한 에피토프를 암호화하는 단일 핵산종을 포함하는 조성물보다 훨씬 더 효과적인 것으로 입증되었음을 알 것이다. 당업자들은 또한 이러한 시너지 효과에 의하면 단일 에피토프 백신보다 적은 양을 더 낮은 빈도로 투여해서 효과적인 면역 예방 또는 면역 치료 반응을 유도할 수 있다는 것을 알 것이다. 뿐만 아니라, 이러한 다중 에피토프 백신 조성물을 이용하면 유도된 다부위 면역이 종 내의 자연적 표현형 변이 또는 특정 병원균에 의한 표적 항원의 급속한 돌연변이에 대해 더욱 저항성을 나타낼 것이므로, 더욱 포괄적인 방어를 제공할 수 있다. 물론, 효과적인 면역은 단일 B 또는 T 세포 에피토프를 암호화하는 백신에 의해서도 이루어질 수 있으며, 이러한 조성물은 분명히 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다.

본 발명은 항원 그 자체는 외에도, 입자 외피 자체의 부형제 성분을 조작하여 제형화된 항원의 면역원성을 강화 또는 변형시키는 것을 가능하게 한다. 예를 들면, 만노스 수용체에 의해 항원의 업테이크가 촉진되어 라이소솜 구획으로의 표적화가 향상될 경우, 수지상 세포에 의한 효율적 항원 포획이 용이해진다는 것이 확인되었다(Salusto 등, J. Expt. Med. 182:389-400, 1995). 따라서, 저비율의 만노스 또는 세포 상의 수용체에 결합하는 다른 다당류를 미립자 내로 혼합시키면 면역원성을 강화시킬 수 있음을 예상할 수 있을 것이다. 또한, 아래에서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, APC 반응을 촉진하는 보조인자 또는 사이토카인을 이용하면 필요에 따라 면역 반응을 강화 또는 억제시킬 수 있다. 본 발명은 국소 수지상 세포 또는 기타 APC로 향하는 점막 또는 다른 표적 전달 부위(예, 경피) 내에서 국소 면역 반응의 촉진을 증대시키는 보조인자를 항원과 함께 공동 제형화할 수 있게 한다. 본 발명에 의해 제공되는 이러한 조합 제형은 국소 환경 내에서 APC를 활성화시키고 항원의 업테이크 및 제시를 강화시킴으로써 결과적인 면역 반응의 효율을 증가시킬 수 있다.

더욱 일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은 피검체를 면역화 또는 백신화시키는 데 사용될 경우 강화된 면역 반응을 제공한다. 본 발명의 미립자에 의해 제공되는 "애쥬번트(adjuvant) 효과"는 애쥬번트(즉, 명반 또는 프로인트 완전 애쥬번트)와 함께 투여되는 항원에 의해 유도되는 반응과 유사한 면역 반응을 유도하는 데 사용할 수 있다. 당업자들은, 본 발명과는 달리, 이러한 전통적인 애쥬번트가 일반적으로 바람직하지 않은 부작용을 수반할 수 있으며, 많은 경우에 인간에게 사용할 수 없음을 알 것이다. 반대로, 본 발명은 잠재적 독성 애쥬번트를 투여하지 않고, 강화된 면역 반응(즉, 공지 기술의 이용을 통해 제시된 유사한 항원에 의해 유발된 것보다 더욱 강화된 면역 반응)을 제공할 수 있다. 특정 이론에 의해 지지되기를 원하지는 않지만, 관찰된 면역 강화는, 적어도 부분적으로, 미립자의 구성 또는 형태, 항원 방출 프로필 및 미립자 내에서의 항원 응집의 가능성의 결과라고 여겨진다. 어떤 경우에는, 이러한 효과는 더욱 소량의 항원 및/또는 더욱 낮은 빈도의 접종으로 임상적으로 유용한 면역 반응을 유발시킬 수 있게 한다.

본 발명의 조성물 및 방법에 의해 제공되는 면역 반응은 이러한 애쥬번트 효과에 의해 종래의 접종 기법에 의한 면역 반응에 비해 강화된 것이다. 특히, 본 발명의 조성물에 의해 유도된 면역 반응은 수성 담체 중에 가용화 또는 현탁된 동일한 항원의 정맥 투여 또는 복강 투여에 의해 유발된 면역 반응보다 일반적으로 더 크다. 물론, 유도된 면역 반응의 크기는 하기 실시예에 기술된 적합한 방법을 포함하여 당업자에게 공지된 다양한 기법들 중 임의의 하나(예컨대, 항체 역가를 위한 CTL 레벨)를 이용하여 측정할 수 있다. 이러한 비교를 이용하면, 본 발명의 제제는 전술한 선행 기술 방법을 이용한 동일한 항원의 투여에 의해 유발된 반응보다 바람직하게는 25%, 50%, 75% 또는 100% 더 큰 면역 반응을 일으킨다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 수성 담체 중의 항원을 이용하여 얻은 기본선 반응보다 2배, 3배, 4배 또는 5배 이상 강화된 반응을 일으킨다. 더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 제제 및 방법은 기본선 반응보다 6배, 7배, 8배, 9배 또는 심지어 10배 이상 강화된 면역 반응을 일으킬 것이다. 더욱 바람직한 다른 구체예는 기본선보다 20배, 30배, 40배, 50배 또는 심지어 자승배 이상 강화된 반응을 유도할 수 있다. 당업자들은 본 발명의 미립자의 이러한 신규하고 이전에는 예기치 못했던 특성들이 피검체에서 원하는 면역 반응을 유도하는 데 매우 효과적으로 작용한다는 것을 알 것이다.

전술한 애쥬번트 효과뿐만 아니라, 본 발명의 교시에 따르면 다른 메카니즘 또한 면역 반응의 강화에 기여할 수 있다. 예를 들면, 놀랍게도, 생 바이러스 및 사 바이러스의 조합물은 사 바이러스가 단독으로 유발하는 것보다 훨씬 더 강한 반응을 유도할 수 있다는 것을 알게 되었다. 더욱 구체적으로, 바람직한 구체예에서, 미립자 제조시에, 어느 정도 죽거나 불활성화된 생약독화 바이러스를 이용하여 분말을 제형화할 수 있다. 하기 실시예를 통해 입증되는 것처럼, 이러한 생 바이러스와 사 바이러스의 혼합물은 놀라울 정도로 강한 즉, 강화된 면역 반응을 유도하는 것으로 나타난다. 뿐만 아니라, 본 발명의 교시에 따르면, 특정 바이러스 또는 바이러스 혼합물은 자연 발생적인 불활성화 또는 약독화 바이러스를 포함할 수 있거나, 또는 하나 이상의 외래 항원을 발현하도록 조작될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 생 바이러스를 제형화하는 대안의 방법은 입자 매트릭스 내에 바이러스 수용체를 제형화하여, 조작 후(즉, 분무 건조 후) 특정 바이러스가 입자에 결합되게 하는 것을 포함한다. 현재, 다양한 세포 바이러스 수용체가 잘 정의되어 있으며, 예를 들면 레트로바이러스 수용체로서 작용할 수 있는 프로락틴 수용체, CCR5, HIV의 세포 수용체, 폴리오 바이러스 수용체, HSV1에 결합하는 IgG Fc 영역 및 인플루엔자 바이러스에 결합하는 수용체가 있다.

당업자들은 또한 선택된 항원 또는 항원의 형태(바이러스, 펩티드, 유전 물질 등)에 관계없이, 피검체의 효과적인 면역화는 1회 이상의 접종을 포함할 수 있다는 것을 알 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "면역화시키다" 또는 "면역화" 또는 이와 관련된 용어는 표적 항원 또는 에피토프에 대한 실질적인 면역 반응(항체 또는 이펙터 CTL과 같은 세포 면역으로 이루어짐)을 유도할 수 있는 능력을 부여하는 것을 말한다. 이들 용어는 완전한 보호성 면역의 유발을 요하지는 않지만, 기본값보다 훨씬 더 큰 보호 면역 반응을 요한다. 예를 들면, 본 발명의 방법을 적용한 후, 포유류의 표적 항원에 대한 세포 및/또는 체액 면역 반응이 강화된다면, 이 포유류는 표적 항원에 대해 면역화되었다고 간주할 수 있다. B 세포 및 T 세포 반응 둘 다의 강화를 입증하는 분석법은 잘 알려져 있으며, 당업자들은 이를 쉽게 수행할 수 있다. 바람직하게, 면역화는 표적 항원을 발현하는 병원균에 의해 유발 또는 야기되는 질병에 대한 저항력을 상당히 증가시킨다.

유사하게, 본 명세서에서 사용되는 "접종"이란 용어는, 본 발명에 따르면, 적절한 에피토프를 포함하거나 적절한 에피토프를 생성 또는 발현할 수 있는 1종 이상의 백신을 포함하는 조성물을 투여 또는 도입하는 것을 말한다. 효과적인 면역 반응은 1회 접종에 의해 유도될 수 있지만, 피검체의 효과적인 면역화는 다회 접종, 또는 한차례 이상의 추가 접종을 포함할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 원하는 면역 예방 효과를 얻기 위해서, 1회, 2회, 3회, 4회 또는 5회의 접종을 포함할 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이 투여된 백신은 바람직하게는 점막 표면에 접촉 및/또는 흡수된다. 특히 바람직한 구체예에서, 점막 표면은 구강 또는 비도나 폐기도의 점막 표면이다. 당업자들은 또한 본 발명의 백신 조성물(즉, 분말 또는 분산물)을 신생아(0∼6개월), 유아(6개월∼2세), 어린이(2세∼13세) 또는 어른(13세 이상)에게 접종하는 데 사용할 수 있다는 것을 알 것이다.

B(ii). 면역글로불린(수동 면역 치료)

본 발명의 방법 및 조성물은 국소 및 전신 능동 면역을 유도하기 위한 효과적인 수단을 제공하지만, 이들은 또한 국소 또는 전신 수동 면역을 유도하는 데에도 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 분말 및 초미립자는 면역글로불린 또는 이들의 단편이나 부분을 투여하여, 감염 또는 질병에 대한 빠른 예방 또는 치료를 수행하는 데 사용될 수 있다. 투여된 면역글로불린은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있으며, 표적 병원균 상의 하나 이상의 항원을 인식할 것이다. 바람직하게, 인식된 항원(들)은 하나 이상의 비교적 보존된 에피토프를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 투여된 조성물은 중화용 항체, 치료용 항체 또는 예방용 항체 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 투여된 조성물은 1종 이상의 모노클로날 항체 또는 면역반응성 단편들을 포함한다.

투여 후, 활성 면역글로불린(들)은 전달 부위에서 작용할 수도 있고, 또는 체순환계로 흡수될 수도 있다. 투여 부위에 보유된 항체는 처리된 부위(즉, 점막 표면)와 접촉하는 임의의 표적 감염성 물질(예, 공기중 바이러스)에 재빨리 결합하여, 후속 감염을 예방하거나 미생물을 제거할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 바람직한 구체예에 의해 제공되는 비교적 높은 레벨의 순환 항체는 혈류로부터 표적 병원균을 재빨리 제거하여 감염과 관련된 증상을 예방 또는 적어도 개선시킬 것이다. 물론, 피검체의 일생동안 지속될 수 있는 능동 면역과는 달리, 수동 면역은 전달된 면역글로불린 양이 순환계에 잔류하는 동안만 지속되는 비교적 일시적인 현상임을 알 것이다.

전술한 바와 같이, 표적 병원균 상의 항원(들)을 인식하는 임의의 면역글로불린 또는 이들의 면역반응성 단편을 이용하여 피검체에 원하는 면역을 부여할 수 있다. 특정 병원균 및/또는 항원 및/또는 에피토프에 대하여 모노클로날 및 폴리클로날 항체 둘 다를 제공할 수 있는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 실제 투여되는 항체의 형태에 대해서는, 천연 항체 및 조작된 항체 모두 본 발명의 교시에 따라 적합하며, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 비롯한 상이한 클래스의 항체들도 적합하다. 유사하게, F(ab')₂, Fab 또는 Fv를 비롯한 면역글로불린의 임의의 면역반응성 단편 또는 도메인을 원하는 보호 면역을 제공하는 데 사용할 수 있다. 조작된 항체에 대해서는, 인간화된 작제물(즉, 키메라 항체)이 특히 바람직하다. 이러한 면역글로불린은 일반적으로 쥐 항체의 항원 결합 상보성 결정역(CDR)을 포함하지만, 이 분자의 나머지 부분은 이종으로 인식되지 않는 인간 항체 서열을 포함한다. 예를 들면, Jones 등의 문헌[Nature, 321:522-525(1986)]을 참조할 수 있으며, 이문헌은 본 명세서에서 참고 인용한다. 인간 폴리클로날 IgG는 일반적으로 피검체에 의해 외래 물질로 인식되지 않기 때문에, 이러한 항체를 저빈도로 투여한다면 바람직하지 않은 부작용을 일으키지 않으며, 체내에서 빨리 제거되지 않는 경향이 있다.

수동 면역은 쉽게 전염되는 병원균, 특히 공기 또는 수중의 병원균에 의한 감염 기회를 방지 또는 감소시키는 데 특히 효과적이다. 이와 같이, 적절한 면역글로불린을 포함하는 본 발명의 분말 및 분산물은 인플루엔자 또는 호흡기 합포체 바이러스와 같은 호흡기 바이러스 및 병원균에 대해 특히 효과적이다. 예를 들면, 액체 플루오로카본 매질 내의 면역글로불린이 장입된 천공된 미세구조체를 포함하는 안정화된 분산물을 분무기 또는 스프레이병을 통해 비도에 투여할 수 있다. 필요에 따라 쉽게 투여할 수 있는 이 조성물은 감기 바이러스(오르소믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 리노바이러스)와 같은 표적 병원균에 대한 국소 및 전신 수동 면역을 제공할 것이다. 유사하게, 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)와 같은 수중 병원균에 대한 보호를 위해 쉽게 투여할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 수동 면역은 광견병 바이러스, 간염(A, B, C) 바이러스, HIV 및 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetanii)를 비롯하여 다양한 유기체(이에 국한되는 것은 아니다)에 적어도 약간의 보호 능력을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 당업자라면, 본 발명의 조성물에 의해 수동 면역을 유발시킬 수 있는 기타 감염성 물질을 쉽게 확인할 수 있다.

B(iii). 종양 항원

또다른 구체예에서, 표적 항원은 종양 항원일 수 있다. 당업자들은 종양 항원이 흔히 종양이 유래한 조직 유형에 한정되거나, 악성 변이 과정 동안 돌연변이되는 세포 단백질 유래의 펩티드 단편이라는 것을 알 것이다. 다른 종양 항원은 흔히 종양 세포에 의해 비정상적으로 발현되고/되거나, 전사 에러, 종양 세포 특유의 돌연변이에 기인하는 RNA 프로세싱으로 인해 발생하는 "신규한(neo)" 항원이다. 또는, 정상 단백질의 번역후 변경(예, 글리코실화)에 있어서의 변화가 그때까지는 면역계에 의해 정상적으로는 인식되지 않는 숨겨진(잠복) 에피토프의 노출을 도울 수 있다(예, 뮤신, MUC1의 경우가 이러하다). 종양 항원과 결합된 B 세포 에피토프는 종양 세포의 표면에서 발현되며, 특이적 항체에 의해 인식된다. 대조적으로, T 세포 에피토프는 두가지 유형이 있는데, 종양 관련 항원 유래의 MHC 클래스 I-제한 펩티드인 CTL 에피토프와 종양 항원 유래의 MHC 클래스 II-제한 펩티드인 Th 에피토프가 그것이다. Th 에피토프는 주로 항원 제시 세포(APC)에 의해 CD4⁺ T 세포에 제시되는 반면, CTL 에피토프는 종양 세포는 물론, APC에 의해 제시되어 종양 특이적 CD8⁺ T 세포에 의해 인식된다. 종양 항원의 예로는 배아암종 항원("CEA"), 흑색종 관련 항원, 알파 태아 단백질, 파필로마 바이러스 항원, 엡슈타인 바르 항원, MUC 1, p53 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 몇몇 다른 종양 항원이 자가 세포독성 T 임파구에 의해 인식된다고 보고되었으며, 이에 대해서는 본 명세서에서 참고 인용하는 Boon, T. 등의 문헌[J. Exp. Med., 183:725-729, 1996], Disis, M.L. 등의 문헌[Curr. Opin. Immunol. 8:637-642, 1996], Robbins, P.F. 등의 문헌[Curr. Opin. Immunol. 8:628-636, 1996], Salgaller 등의 문헌[J. Surg. Oncol. 68:122-138, 1998]에 기재되어 있다.

B(iv). 면역 조절

자가면역 질환은 자가반응성 T 및 B 세포뿐 아니라 조절 또는 이펙터 역할을 할 수 있는 다른 면역 세포 아형에 의해 매개된다. 기관 특이적 자가 에피토프를 인식하는 T 세포가 제I형 당뇨병, 다발성 경화증(MS) 또는 류마티즘성 관절염(RA)과 같은 자가면역 질환의 발병의 주요 요인인 것으로 생각된다. 체내의 특정 부위에 제시된 항원을 인식하는 CD4+, 및 특정 경우에는, CD8+ T 세포는 조직을 침투하여 다양한 유형의 세포 파괴를 유발하고 염증을 지속시킨다. IL-2, IFN-, TNF- 및 LT-를 생성하는 CD4+ Th1 세포는 병원성인 것으로 간주되는 반면, IL-4, IL-10, IL-5, IL-13 및 IL-9를 생성하는 CD4+ Th2 세포는 자가면역에 대해 비병원성인 것으로 간주되고, 특정 환경에서는 질환을 억제할 수 있다. 또한, 점막의 항원에 노출에 의해 TGF- 및 IL-10을 분비하도록 유도된 Th3 세포는 점막 유도 내성의 중요한 매개체인 것으로 생각된다.

자가면역 질환을 예방 또는 억제하기 위한 전략으로서, 자가반응성 T 세포는 우수한 치료상 표적이 된다. 자가면역 질환을 유도하는 병원성 자가반응성 T 세포를 불활성화시키는 몇가지 방법(일반적으로 "내성"이라 하고, 반드시 "결실"에 국한되는 것은 아니다)이 있는데, (1) 다량의 항원에 장기간 노출시켜서 병원성 세포를 직접적으로 무력화(turn-off, 또는 anergize)하는 것; (2) 비전문 APC와 관련된 항원 또는 특정 조절 인자에 노출시켜서 병원성 T 세포의 기능을 무력화 또는 전환시키는 것; 및 (3) Th2/Th3 표현형의 항원 특이적 Th 억제자 세포를 병소 부위로 이동하게 하여 병원성 T 세포의 기능을 억제하도록 유도하는 것이 그것이다.

본 발명에 따르면 흡입 치료를 이용하여 내성을 유도할 수 있다는 놀라운 사실을 발견하였다. 호흡관은 면역 내성 유도의 표적 부위로서 두배의 장점을 지닌다. 첫째로, 호흡관은 복잡한 항원의 국소 및 전신 전달을 가능하게 하는 비침입적 경로이며, 둘째로, 점막 면역이 투여된 항원에 대한 Th2/Th3 억제자 세포를 포함할 가능성이 있기 때문이다. 이러한 항원은 자가 항원 전체(재조합 또는 정제된 것), 항원 단편들(당해 기술 분야에 공지된 분자생물학 또는 생화학적 기법을 통해 얻은 것) 또는 에피토프에 한정된 펩티드일 수 있다. 다른 구체예에서, 이들은 바이러스 성분, 파지, 키메라 항체, 융합 단백질, 레플리콘, 박테리아로서 혼입될 수 있거나, 또는 핵산을 기초로 한 벡터 또는 바이러스 벡터를 통해 전달될 수 있다. 이들은 면역글로불린과 같은 분자 자체, 또는 체세포 상의 수용체에 대한 천연 또는 합성 리간드 내로 혼입시킬 수 있다. 이들은 분리된 각각의 성분으로서 또는 혼합물로서 투여될 수 있다. 제I형 당뇨병에 대한 비제한적인 예로는 GAD65(글루탐산 데카르복실라제 65-Baekkeskov 등, Nature 1990, 347:151), 인슐린(Palmer 등, Science 1983, 222:1337), ICA512/IA-2(랑게르한스섬 세포 항원 512; Rabin 등, J. Immunol. 1994, 152:3183)와 같은 펩티드 및 항원이 있다. MS의 경우에는, MBP(마이엘린 염기성 단백질, Steinman 등, 1995, Mol. Med. Today, 1:79; Warren 등, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11061), PLP. 트랜스알돌라제, 2',3' 시클릭 뉴클레오티드 3' 포스포디에스테라제(CNP), MOG 및 MAG(Steinman L., 1995, Nature, 375:739)와 같은 단백질 및 펩티드가 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 자가면역 질환뿐만 아니라, 알러지원에 의해 유발된 면역 반응을 하향 조절하는 데에도 사용될 수 있다.

B(v). 활성 펩티드 및 단백질

특정 펩티드 및 단백질은 외래 항원 또는 자가 항원에 대한 면역 반응을 조절, 상향 조절 또는 하향 조절하는 능력을 지닌다고 알려져 있다. 이러한 펩티드 또는 단백질은 내생 수용체와 결합하거나, 내생 엘리먼트의 리간드-수용체 결합을 방해함으로써 특정 프로세스를 활성화 또는 억제할 수 있다. 이러한 단백질 또는 펩티드의 예로는 자가면역 억제를 유도하는 면역 조절 기능을 갖는 사이토카인이 있으며, 인터페론-, IL-4, IL-10, IL-13, IL-9의 천연형, 또는 다른 분자에 부착되거나, 혼입되거나 또는 복합체를 이룬 단편 형태가 그 예이다. 미생물 또는 종양 세포에 대한 면역을 증가시키는 면역활성화제로 작용할 수 있는 다른 사이토카인에는 IL-12, IL-2, 인터페론-, 인터페론-, TNF-, TNF-, 림포톡신 및 GM-CSF가 있다. 예를 들면, GC-MSF, IFN-α, IL-2, IL-12 또는 TNF-α의 동시 투여는 면역 반응 및 항원 제시 능력을 강화시킨다는 것이 증명되었다. 그러나, 많은 경우 이러한 항원의 전신 전달은 바람직하지 않은 부작용을 야기시키기 때문에 이러한 다기능 인자의 표적 전달 연구에 집중하게 되었다. 본 발명에 의하면 이롭게도 특정 항원(들)과 국소 수지상 세포나 다른 APC 제시로 향하는 점막 또는 다른 표적 전달 부위(예, 경피 또는 피내) 내에서의 국소 면역 반응 자극을 증강시킬 수 있게는 보조인자의 공동 제형을 얻을 수 있다. 본 발명의 이러한 조합 제형은 국소 환경 내에서의 APC의 활성화를 촉진하고 항원의 업테이크 및 제시를 강화시킴으로써, 결과적으로 면역 반응의 효율을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 활성 단백질 또는 펩티드는 임파구의 모집을 증가, 조절 또는 억제할 수 있는 천연형 또는 단편, 작제물이나 다른 분자들과의 복합체 형태의 케모카인을 포함한다. 예를 들면, 에오탁신-1, 에오탁신-2, TARC, MIP-3b, SLC는 Th2 세포, MIG, IP-10, MIP-1, MIP-1의 모집을 매개하는 것으로 생각되며, RANTES는 Th1 세포의 모집을 매개하는 것으로 생각된다(Sallusto 등, 1998, J. Exp. Med., 187:875; Ward 등, 1998, Immunity, 9:1). 유사하게, 천연형 또는 단편들, 재조합 작제물이나 다른 분자들과의 복합체 형태의 사이토카인 또는 케모카인 수용체는 특정 임파구의 모집 또는 활성화를 억제할 수 있다. 진행중인 Th1 반응을 억제하는 것으로 보이는 사이토카인 및 케모카인 수용체의 예로는 IL-12 수용체, IFN- 수용체, IL-2 수용체, TNF- 수용체, CXCR3 또는 CCR5를 들 수 있다. 진행중인 Th2 반응을 억제시킬 수 있는 사이토카인 및 케모카인 수용체의 예로는 IL-4 수용체, IL-13 수용체, IL-9 수용체, IL-10 수용체, CCR3, CCR4 또는 CCR7이 있다. 물론, 이에 적합한 화합물은 사이토카인, 케모카인 또는 이들의 수용체에만 국한되는 것은 아니고, 인테그린 및 귀소(homing) 수용체와 같은 다른 리간드 또는 수용체(천연형, 단편, 작제물 또는 다른 분자와의 복합체 형태)를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이러한 모든 종류의 화합물을 제형화하여 호흡관을 통해 국소 또는 전신 투여함으로써, 면역 반응을 강화, 억제 또는 조절할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 천공된 미세구조체는, 필요에 따라 2종 이상의 활성 성분의 조합물을 포함할 수 있다는 것을 알 것이다. 이 물질은 단일 종류의 천공된 미세구조체 내의 조합물로서, 또는 다른 종류의 천공된 미세구조체 내에 개별적으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 2종 이상의 활성제 또는 생물활성제를 단일 공급 원료 제제에 혼입시켜 분무 건조시켜서 다수의 생물활성제를 포함하는 단일 종류의 미세구조체를 제공할 수 있다. 반대로, 각각의 물질을 별개의 원료에 첨가하여 별도로 분무 건조시켜서 상이한 조성을 갖는 여러 종류의 미세구조체를 제공할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 이러한 각각의 종류의 미세구조체를 현탁 매질 또는 건조 분말 분배 구획에 원하는 비율로 첨가한 다음, 에어로졸 전달 시스템에 배치할 수 있다.

전술한 것을 기초로 하여, 당업자들은 다양한 생물활성제를 본 발명의 분말에 혼입할 수 있음을 알 것이다. 따라서, 상기한 바람직한 생물활성제는 단지 예에 불과하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 당업자들은 또한 해당 제제에 대한 생물활성제의 적정량 및 투여 시기는 기존의 정보에 따라 과도한 실험없이 결정할 수 있다는 것을 알 것이다.

C. 분말 조성물

전술한 바와 같이, 본 발명은 다양한 생물활성제를 효과적으로 전달하는 데 이용될 수 있다. 미립자는 생물활성제만으로 제조할 수 있지만, 이것들은 1종 이상의 추가 물질을 포함하는 것이 바람직하고, 특정 구체예에서는, 흡수 강화제, 증강제, 부형제 또는 구조적 성분을 포함할 수 있다. 더욱 일반적으로, 미립자(즉, 구조적 매트릭스)는 임의의 혼입된 활성제와 화합성인 물리적 및 화학적 특성을 지닌 임의 물질로 제조되거나 또는 이를 포함할 수 있다. 다양한 물질을 분말을 형성하는 데 이용할 수 있지만, 특히 바람직한 약학적 구체예에서, 미립자는 인지질과 또는 플루오르화 계면활성제 등의 계면활성제와 결합되거나 이를 포함할 수 있다. 반드시 요구되는 것은 아니지만, 적합한 계면활성제의 혼입은 분말의 유동성을 향상시키고, 에어로졸 효율을 증가시키고, 분산 안정성을 향상시키고, 현탁액의 제조를 용이하게 할 수 있다. 뿐만 아니라, 선택된 계면활성제는 또한 흡수 강화제로서 작용하여 선택된 물질의 업테이크를 증가시켜서 생물활성을 향상시킨다. 물론, 본 발명의 분말을 단지 전통적인 비계면활성 부형제와 1종 이상의 혼입된 생물활성제를 이용하여 제조할 수도 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 분말은 선택적으로 1종 이상의 계면활성제를 포함하거나 이와 결합시킬 수 있다. 본 발명의 교시에 따르면, 이들 화합물은 임의의 혼입된 생물활성제를 안정화시켜서 비수성 매질에 현탁된 미립자를 안정화시키는 것을 돕거나 표적 부위에서의 이 물질의 업테이크를 증가시키는 작용을 할 수 있다. 본 발명의 미립자와 결합된 그러한 계면활성제뿐만 아니라, 미립자를 현탁 매질 액상 중에서 제형화하는 경우에는 선택적으로 혼화성 계면활성제를 병용할 수 있다. 당업자들은 계면활성제의 사용이 본 발명을 실시하는 데 필수적이지는 않지만 분산 안정성, 분말 유동성을 더욱 증가시키고, 제형화 과정을 단순화시키거나 전달 효율을 증가시킬 수 있음을 알 것이다. 물론, 액상 중에 1종 이상의 계면활성제를 사용하는 것 및 천공된 미세구조체에 결합된 1종 이상의 계면활성제를 사용하는 것을 비롯하여 계면활성제 조합물은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다. "∼와 결합되거나 또는 ∼를 포함하는"이란, 미립자 또는 천공된 미세구조체가 계면활성제를 혼입하거나, 흡수하거나, 흡착하거나, 이것에 의해 코팅되거나, 또는 이것으로 제조될 수 있음을 의미한다.

광범위한 의미에서, 본 발명에 사용하기에 적절한 계면활성제는 천공된 미세구조체의 형성을 돕거나, 또는 강화된 현탁 안정성, 향상된 분말 분산성 또는 감소된 입자 응집을 제공하는 임의의 화합물 또는 조성물을 포함한다. 계면활성제는 단일 화합물 또는 공동 계면활성제에서와 같이 화합물의 임의 조합물을 포함할 수 있다. 포화 및 불포화 지질, 비이온성 세제, 비이온성 블록 공중합체, 이온성 계면활성제 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 비플루오르화 계면활성제가 특히 바람직하다. 안정화된 분산물을 포함하는 구체예에서는, 이러한 비플루오르화 계면활성제는 현탁 매질에서 비교적 불용성인 것이 바람직할 것이다. 전술한 계면활성제 외에도, 적절한 플루오르화 계면활성제는 본 발명의 교시에 따라 양립 가능하고, 원하는 제제를 만드는 데 사용할 수 있다.

천연원 및 합성원 유래의 인지질을 비롯한 지질은 본 발명에 사용하기에 특히 적합하며, 다양한 농도로 미립자 또는 구조적 매트릭스를 형성하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 적합한 지질은 약 40℃ 이상에서 겔에서 액체 결정상으로 전이되는 것들을 포함한다. 혼입된 지질은 비교적 장쇄(즉, C₁₆∼C₂₂) 포화 지질인 것이 바람직하며, 바람직하게는 인지질을 포함한다. 본 발명의 안정화된 제제에 유용한 인지질의 예로는 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디아라키도일포스파티딜콜린, 디베헤노일포스파티딜콜린, 단쇄 포스파티딜콜린, 장쇄 포화 포스파티딜에탄올아민, 장쇄 포화 포스파티딜세린, 장쇄 포화 포스파티딜글리세롤, 장쇄 포화 포스파티딜이노지톨, 당지질, 갱글리오사이드 GM1, 스핑고마이엘린, 포스파티드산, 카디올리핀; 폴리에틸렌 글리콜, 키틴, 히알루론산 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 중합체 쇄를 보유하는 지질; 설폰화된 단당류, 이당류, 및 다당류를 보유하는 지질; 팔미트산, 스테아르산 및 올레산과 같은 지방산; 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트가 있다.

적합한 비이온성 세제로는 솔비탄 트리올리에이트(스판(등록상표명) 85), 솔비탄 세스퀴올리에이트, 솔비탄 모노올리에이트, 솔비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노라우레이트 및 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올리에이트, 올레일 폴리옥시에틸렌(2) 에테르, 스테아릴 폴리옥시에틸렌(2) 에테르, 라우릴 폴리옥시에틸렌(4) 에테르, 글리세롤 에스테르 및 수크로스 에스테르를 비롯한 솔비탄 에스테르를 들 수 있다. 적합한 기타 비이온성 세제는 본 명세서에서 참고 인용하는 문헌[McCutcheon's Emulsifiers and Detergents: 맥퍼블리싱 컴퍼니, 글렌 록, 뉴 저지]을 통해 쉽게 확인할 수 있다. 바람직한 블록 공중합체는 폴록사머 188(플루로닉(등록상표명) F-68), 폴록사머 407(플루로닉(등록상표명) F-127) 및 폴록사머 338을 비롯하여 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시플로필렌의 디블록 및 트리블록 공중합체를 포함한다. 나트륨 설포숙시네이트와 같은 이온성 계면활성제와 지방산 비누도 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 미세구조체는 올레산 또는 이것의 알칼리염을 포함할 수 있다. 이들의 우수한 생체적합성으로 인하여, 인지질 및 인지질과 폴록사머의 조합물은 본 발명의 약학적 구체예에 사용하기에 특히 적합하다.

RNA 또는 DNA를 전달하는 데 있어서, 전술한 계면활성제 외에도, 양이온성 계면활성제 또는 지질을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 적합한 양이온성 지질의 예는 DOTMA, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드; DOTAP, 1,2-디올레일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판; 및 DOTB, 1,2-디올레일-3-(4'-트리메틸암모니오)부타노일-sn-글리세롤을 포함한다. 폴리리신 및 폴리아르기닌과 같은 다가 양이온 아미노산 역시 고려된다.

전술한 계면활성제 외에도, 광범위한 계면활성제를 선택적으로 본 발명과 함께 사용할 수 있다는 것 또한 알 것이다. 또, 본 발명의 최적 계면활성제 또는 이들의 조합물은 과도한 실험을 필요로 하지 않는 경험적 연구를 통해 쉽게 결정할 수 있다. 마지막으로, 아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 미립자 또는 구조적 매트릭스를 포함하는 계면활성제는 천공된 미세구조체를 형성하는 과정 중에 사용되는 수중유형 에멀젼 전구체(즉, 분무 건조 공급 원액)의 형성에도 유용하게 사용될 수 있다.

선행 기술의 제형과는 달리, 비교적 고농도의 계면활성제 또는 생체적합성 벽 형성 물질(예, 인지질)의 혼입은 본 발명의 분말 분산성을 향상시키고, 현탁액 안정성을 증가시키고, 분말 응집을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 즉, 중량 대 중량을 기준으로, 미립자 또는 천공된 미세구조체의 구조적 매트릭스는 비교적 고농도의 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 점에서, 미립자는 바람직하게 약 1%, 5%, 10%, 15%, 18% 또는 20% w/w 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 초미립자 또는 미세구조체는 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% w/w 이상 계면활성제를 포함한다. 또다른 구체예는 계면활성제(들)가 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% w/w 이상 존재하는 미립자를 포함한다. 특정 구체예에서, 분말은 실질적으로 인지질과 같은 계면활성제를 100% w/w 포함한다. 당업자들은 이러한 경우 미립자 또는 구조적 매트릭스의 나머지 부분(이용 가능한 부분)은 생물활성제, 부형제 또는 기타 첨가제를 포함할 것임을 알 것이다.

후술하는 바와 같이, 계면활성제는 임의의 유형의 미립자 내에 혼입시킬 수 있다. 즉, 전술한 계면활성제 농도는 천공된 미세구조체에 이용되는 것이 바람직하지만, 이것은 비교적 비다공성 또는 실질적으로 실질형(solid) 미립자를 포함하는 분말 또는 안정화된 분산물을 제공하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 선택된 구체예는 고농도의 계면활성제에 결합된 천공된 미세구조체를 포함하지만, 동일한 계면활성제 농도의 비교적 저다공성 미립자를 이용하여 적합한 분말을 제조할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 미립자들은 약 5% w/w 이상의 비교적 고농도로 계면활성제를 포함한다. 이러한 점에서, 이러한 구체예는 특별히 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다.

본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 미립자는 선택적으로 합성 또는 천연 중합체 또는 이들의 조합물을 포함한다. 이러한 측면에서 유용한 중합체는 폴리락티드, 폴리락티드-코-글리콜리드, 사이클로덱스트린, 폴리아크릴레이트, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 폴리안하이드라이드, 폴리락탐, 폴리비닐 피롤리돈, 단당류, 이당류 또는 다당류(덱스트란, 전분, 키틴, 키토산 등), 히알루론산, 단백질(알부민, 콜라겐, 젤라틴 등)을 포함한다. 초미립자 제제에 유용하다고 인정되는 중합체 수지의 예로는 스티렌-부타디엔, 스티렌-이소프렌, 스티렌-아크릴로니트릴, 에틸렌-비닐 아세테이트, 에틸렌-아크릴레이트, 에틸렌-아크릴산, 에틸렌-메틸아크릴레이트, 에틸렌-에틸 아크릴레이트, 비닐-메틸 메타크릴레이트, 아크릴산-메틸 메타크릴레이트 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트가 있다. 당업자라면, 적절한 중합체를 선택함으로써 미립자의 전달 효율 및/또는 분산물의 안정성을 활성제 또는 생물활성제의 유효성을 최적화하도록 조절할 수 있음을 알 것이다.

전술한 중합체 물질 및 계면활성제 외에도, 미립자에 다양한 부형제를 혼입시키거나 첨가하여 구조체, 바람직한 구체예에서는 천공된 미세구조체(즉, 라텍스 입자와 같은 미소구체)를 제공할 수 있다. 이러한 점에서, 선택적 용매 추출과 같은 제조후 기법을 이용하여 경질화 성분을 제거할 수 있음을 알 것이다. 적합한 부형제의 비제한적 예로는 단당류, 이당류 및 다당류를 비롯한 탄수화물을 들 수 있다. 예를 들면, 덱스트로스(무수 및 모노하이드레이트), 갈락토오스, 만니톨, D-만노스, 솔비톨, 소르보스 등과 같은 단당류; 락토스, 말토스, 수크로스, 트레할로스 등과 같은 이당류; 라피노스 등과 같은 삼당류; 및 전분(히드록시에틸전분), 사이클로덱스트린 및 말토덱스트린과 같은 기타 탄수화물이 있다. 아미노산 역시 적합한 부형제이며, 글리신이 바람직하다. 탄수화물과 아미노산의 혼합물 역시 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주한다. 무기염(예, 염화나트륨, 염화칼슘 등), 유기염(예, 나트륨 시트레이트, 나트륨 아스코르베이트, 마그네슘 글루코네이트, 나트륨 글루코네이트, 트로메타민 히드로클로라이드 등) 및 완충액을 함유하는 것도 고려된다. 염 및 유기 고체, 예컨대 탄산암모늄, 아세트산암모늄, 염화암모늄 또는 캠포를 함유하는 것도 고려된다.

전술한 화합물들과 함께, 미소구체 제형에 다른 부형제를 첨가하여 입자의 경도, 제조 수율, 전달 효율 및 퇴적률, 저장 수명 및 환자의 수용성을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 선택적 부형제는 착색제, 미각 차단제, 완충액, 흡습제, 항산화제 및 화학적 안정제를 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 전술한 바와 같이, 미립자는 관련 생물활성제의 업테이크를 증강, 유도 또는 조절할 수 있는 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 미립자는 표적 부위에 있는 세포와 관련된 분자에 미립자를 우선적으로 유도하거나, 또는 이에 결합하게 하는 항체, 보조인자, 수용체, 리간드 및 기질과 같은 표적화 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 미립자는 점막 세포 수용체를 표적으로 하는 항체 및 면역활성 화합물을 포함하도록 형성될 수 있다. 이러한 표적화 분자는 표적 점막 부위에서 생물활성 미립자의 농도를 증가시켜서 임의의 국소 면역 반응을 더욱 강화시킬 것이다. 점막 또는 다른 표적 세포의 표면에서 우선적으로 발현되는 수용체에 대한 리간드 역시 원하는 부위에서의 미립자의 결합을 증가시키는 데 사용할 수 있다는 것을 알 것이다.

또다른 바람직한 구체예는 접촉 지점에서의 체류 시간을 연장시키거나 점막을 통한 침투력을 강화시키는 전하를 띤 물질을 포함하거나 이것으로 코팅될 수 있는 천공된 미세구조체를 포함한다. 예를 들면, 양이온 전하는 형성된 초미립자와 음전하의 생물활성제, 예컨대 유전 물질을 결합시키는 데 사용할 수 있는 반면, 음이온 전하는 점막 접착을 촉진한다고 알려져 있다. 이러한 전하는 폴리아크릴산, 폴리리신, 폴리락트산 및 키토산과 같은 다중 음이온 또는 다중 양이온 물질의 결합 또는 혼입을 통해 부여할 수 있다.

D. 분말 형태

당업자라면, 원하는 안정성 및 전달 특성을 제공하는 한 다양한 조성, 구성,형태의 분말 또는 미립자를 본 발명에 따라 사용할 수 있다는 것을 알 것이다. 이러한 점에서, 몇몇 용도(예, 공기총 또는 무침 주사기를 통한 안정화된 분산물의 피내 투여)에서는 비교적 조밀한 고체 미립자 또는 분말을 사용하는 것이 유리하며, 다른 구체예(예, DPI 투여)에서는 비교적 다공성인 공기역학적으로 가벼운 천공된 미세구조체가 바람직할 수 있다. 따라서, 아래에서는 본 발명을 바람직한 구체예의 관점에서 기술하지만, 임의의 특정 입자 조성, 구성 또는 형태에만 국한되는 것이 아니라는 점이 강조되어야 한다. 오히려, 미립자 특성(전하, 밀도, 조성 등)의 선택은 대개 투여 형태, 표적 전달 부위 및 생물활성제의 선택을 기초로 한다.

미분화 및 분쇄된 미립자를 비롯한 다양한 미립자 형태를 본 발명의 교시에 따라 사용할 수 있지만, 본 발명은 건조 입자간의 응집력을 감소시키는 독특한 방법 및 조성물을 제공함으로써, 미립자의 응집을 최소화하여 전달 효율을 향상시킬 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 선택된 제제는 효율적으로 에어로졸화되고, 균일하게 전달되어 폐 또는 비도에 깊이 침투할 수 있는 유동성이 큰 건조 분말을 제공한다. 뿐만 아니라, 선택된 분말 구성 및 형태를 비수성 현탁 매질과 조합할 경우 비교적 안정한 분산물을 제공한다는 것을 알게 되었다. 어느 경우든지, 투여 후 놀라울 정도로 인후 퇴적을 감소시키도록 본 발명의 미립자를 제형화할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 특히 바람직한 구체예는 구조적 매트릭스를 포함하는 다공성 또는 천공된 미세구조체의 형태로 분말 또는 미립자을 혼입시킨다. 본 명세서에서 사용되는 "구조적 매트릭스" 또는 "미세구조체 매트릭스"란 원하는 특성을 제공하는 다수의 공극, 틈, 공동, 흠, 세공, 구멍, 균열 등을 한정하는 천공된 미세구조체를 형성하는 임의의 고체 물질을 의미하는 것과 동일한 것으로 간주된다는 것을 알 것이다. 선택된 구체예에서, 구조적 매트릭스에 의해 한정되는 천공된 미세구조체는 1종 이상의 계면활성제를 혼입시킨 분무 건조된 다공성 미소구체를 포함한다. 분산 안정성 또는 전달 효율을 더욱 증가시키기 위해 매트릭스 성분을 변화시킴으로써 구조적 매트릭스의 밀도를 조정할 수 있다는 것 또한 알 것이다.

미립자 또는 천공된 미세구조체의 절대 형상(shape)[형태(morphology)와는 반대되는 의미]은 일반적으로 중요하지 않으며, 원하는 특성을 제공하는 전반적인 구성은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다. 따라서, 바람직한 구체예는 미소구체에 가까운 형상을 포함할 수 있다. 그러나, 붕괴, 변형 또는 파열된 미립자 역시 적합하다. 이러한 점에서, 본 발명의 특히 바람직한 구체예는 또한 분무 건조된 공동의 다공성 미소구체를 포함한다는 것을 알 것이다. 어떤 경우에는 본 발명의 천공된 미세구조체의 분말은 비제한적으로 현탁액 안정성의 증가, 향상된 분산성, 우수한 샘플링 특성, 담체 입자의 제거 및 강화된 공기역학을 비롯하여 여러가지 장점들을 제공한다.

분산성, 분산 안정성을 최대화하고, 투여 후 분포를 최적화하기 위해서는 미립자 또는 천공된 미세구조체의 평균 기하학적 입자 크기가 약 0.5∼50 ㎛인 것이 바람직하고 1∼30 ㎛인 것이 더욱 바람직하다. 밸브 또는 작은 구멍이 이용될 경우, 큰 입자(즉, 50 ㎛를 초과하는 것)는 응집되거나 현탁액으로부터 분리되는 경향이 있어서 장치를 막히게 할 가능성이 있기 때문에 큰 입자를 사용하는 것은 바람직하지 않을 수 있음을 알 것이다. 특히 바람직한 구체예에서는 천공된 미세구조체의 평균 기하학적 입자 크기(또는 직경)가 20 ㎛ 미만 또는 10 ㎛ 미만이다. 평균 기하학적 직경이 약 7 ㎛ 또는 5 ㎛ 미만인 것이 더욱 바람직하고, 약 4 ㎛ 또는 2.5 ㎛ 미만인 것이 더욱 더 바람직하다. 다른 바람직한 구체예는 천공된 미세구조체의 평균 기하학적 직경이 약 1∼5 ㎛ 사이인 제제를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서는 천공된 미세구조체가 직경이 약 1∼10 ㎛ 또는 1∼5 ㎛이고, 외피 두께가 약 0.1 ㎛∼약 0.5 ㎛인 건조된 공동의 다공성 미소구체 외피를 포함한다. 분산물 및 구조적 매트릭스 성분의 미립자 농도를 선택된 입자 크기의 전달 특성을 최적화하도록 조정할 수 있다는 것이 본 발명의 특별한 장점이다.

본 명세서를 통해 기술한 바와 같이, 미세구조체의 다공성은 분산성(예, DPI내) 또는 분산 안정성(예, MDI, 제트 총 또는 연무기 사용시)을 성립하는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 점에서, 천공된 미세구조체의 평균 다공도는 최신 영상화 기법과 결부된 전자 현미경을 통해 측정할 수 있다. 더욱 구체적으로, 천공된 미세구조체의 대표적 시료의 전자 현미경 사진을 입수하여 디지탈 방식으로 분석하여 제제의 다공성을 정량할 수 있다. 이러한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 과도한 실험을 거치지 않고 수행할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해서는, 미립자 또는 천공된 미세구조체의 평균 다공도(즉, 내부 및/또는 중심 공극에 노출되는 입자 표면적의 백분율)는 약 0.5%∼약 80% 범위일 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서는, 평균 다공도는 약 2%∼약 40%의 범위이다. 선택된 제조 파라미터를 기준으로 하여, 평균 다공도는 미세구조체 표면적의 약 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% 이상일 수 있다. 다른 구체예에서 미세구조체의 평균 다공도는 약 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상일 수 있다. 세공 그 자체에 대해서는, 일반적으로 평균 세공 크기가 5 nm∼약 40 nm이고, 약 20 nm∼약 200 nm의 범위인 것이 더욱 바람직하다. 특히 바람직한 구체예에서는 평균 구멍 크기가 약 50 nm∼약 100 nm의 범위이다. 아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 세공 크기 및 다공도는 혼입된 성분 및 제조 파라미터의 신중한 선택에 의해 긴밀하게 조절될 수 있다는 것이 본 발명의 중요한 장점이다.

이러한 점에서, 미립자 또는 천공된 미세구조체의 입자 형태 및/또는 공동의 디자인 역시 본 발명의 건조 분말 제형의 분산성 또는 응집성에 중요한 역할을 한다. 즉, 미세 분말의 고유의 응집 특성은 일반적으로 건조 입자간에 존재하는 반데르발스 힘, 정전기적 인력 및 액체 가교력을 감소시킴으로써 극복할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 교시에 따르면, 습도 및 전하의 조절뿐 아니라, 입자 형태 및 밀도를 조작하여 향상된 분말 분산성을 제공할 수 있다. 이를 위해, 본 발명의 바람직한 구체예는 입자간의 표면 접촉 면적을 감소시켜서 입자간 힘을 최소화시키는 세공, 공극, 공동, 흠 또는 기타 간극을 지닌 천공된 미세구조체를 포함한다. 또한, 본 발명의 교시에 따른 인지질 및 플루오르화 발포제와 같은 계면활성제를 이용하여 수분 함량뿐 아니라, 전하 및 정전기력을 완화시킴으로써 분말의 유동성을 향상시킬 수 있다.

가장 미세한 분말(예, ＜ 5 ㎛)은 분말의 전달, 에어로졸화 및/또는 포장을 시도할 때 문제가 될 수 있는 불량한 분산성을 나타낸다. 이러한 점에서, 입자의 상호작용을 조절하는 주요 힘은 일반적으로 원거리 및 근거리 힘으로 분류될 수 있다. 원거리 힘은 중력 및 정전기력을 포함하며, 여기서 상호작용은 이격 거리의 제곱 또는 입자의 직경에 따라 달라진다. 건조 분말에 작용하는 중요한 근거리 힘은 반데르발스 상호작용, 수소 결합 및 액체 가교력을 포함한다. 후자의 두가지 근거리 힘은 입자간의 접촉이 이미 존재하는 경우 발생한다는 점에서 다른 힘과 다르다. 본 발명에 기술된 대로 천공된 미세구조체를 이용하면 이러한 인력을 상당히 완화 또는 감소시킬 수 있다는 것이 본 발명의 주요한 장점이다.

당업자라면, 반데르발스(VDW) 인력이 근거리에서 발생하고, 적어도 부분적으로, 상호작용하는 입자간의 표면 접촉에 의존한다는 것을 알 것이다. 두개의 입자가 서로 가까워질 때, VDW 힘은 접촉 면적이 증가함에 따라 증가한다. 두개의 건조 입자에 대한, VDW 상호작용력의 크기, F⁰ _vdw는 하기 식을 이용하여 계산할 수 있다.

상기 식 중, ħ는 플랑크 상수, ω는 각진동수, d₀는 응착력이 최대일 때의 거리, r₁ 및 r₂는 상호작용하는 두 입자간의 반경이다. 따라서, 건조 분말에 대한 VDW 힘의 크기와 강도를 최소화하는 한가지 방법은 입자간 접촉 면적을 감소시키는 것임을 알 것이다. d₀의 크기가 이러한 접촉 면적을 반영하는 것임에 주목하는 것이 중요하다. 입자가 완전한 구일 경우, 두개의 대립체간의 접촉 면적이 최소가 된다. 또한, 입자가 매우 다공성인 경우, 접촉 면적은 더욱 감소한다. 따라서, 본 발명의 천공된 미세구조체는 입자간 접촉 및 이에 상응하는 VWD 인력을 감소시키는 역할을 한다. 이러한 VDW 힘의 감소는 기하학적 입자 직경의 증가보다는 대체로 본 발명 분말의 독특한 입자 형태에 의한 것임을 인식하는 것이 중요하다. 이러한 점에서, 본 발명의 특히 바람직한 구체예는 비교적 적은 VWD 인력을 나타내는 평균 또는 작은 미립자(예, 평균 기하학적 직경 ＜ 10 ㎛)를 지닌 분말을 제공한다는 것을 알 것이다.

또한, 전술한 바와 같이, 분말에 영향을 미치는 정전기력은 두 입자 모두 또는 어느 하나가 전기적으로 전하를 띨 경우 발생한다. 이러한 현상은 전하의 유사성 또는 비유사성에 따라 입자간의 인력 또는 척력을 일으킬 것이다. 가장 간단한 경우, 쿨롱의 법칙을 이용하여 전기적 전하를 설명할 수 있다. 입자간의 정전기력을 조절 또는 감소시키는 한가지 방법은 두 입자 모두 또는 어느 하나가 부전도성 표면을 갖는 것이다. 따라서, 천공된 미세구조체 분말이 비교적 부전도성인 부형제, 계면활성제 또는 활성제를 포함한다면, 입자 내에 발생된 임의의 전하는 표면 전체에 불균일하게 분포될 것이다. 결과적으로, 증가된 전하의 보유는 물질의 저항력에 의해 지배되기 때문에, 부전도성 성분을 포함하는 분말의 전하 반감기는 비교적 단축된다. 저항성 또는 부전도성 성분은 효과적인 전자 공여체 또는 수용체로서 작용할 수 없는 물질이다.

본 명세서에 참고 인용하는 Derjaguin 등의 문헌[Muller, V.M., Yushchenko, V.S. 및 Derjaguin, B.V., J. Colloid Interface Sci. 1980, 77, 115-119]은 전자를 수용 또는 공여할 수 있는 능력에 따라 나열한 분자기의 목록을 제공한다. 이러한 점에서, 대표적 기들을 다음과 같이 정렬시킬 수 있다.

공여체 : -NH₂ ＞ -OH ＞ -OR ＞ -COOR ＞ -CH₃ ＞ -C₆H₅ ＞

-할로겐 ＞ -COOH ＞ -CO ＞ -CN 수용체 :

본 발명은 비교적 비전도성의 물질을 이용하여 본 발명의 분말 내의 정전기적 효과를 감소시킨다. 상기 정렬을 이용하면, 바람직한 비전도성 물질은 할로겐화된 및/또는 수소화된 성분을 포함한다. 인지질 및 플루오르화 발포제(분무 건조된 분말 내에 어느 정도 보유될 수 있다)와 같은 물질은 이들이 입자 하전에 저항성을 제공할 수 있으므로 바람직하다. 입자 내의 잔류 발포제(예, 플루오로케미칼)의 보유는, 비교적 적은 레벨로 존재한다 하더라도, 일반적으로 분무 건조 및 집진장치 분리 중에 제공되는 것처럼, 미립자 또는 천공된 미세구조체의 하전의 감소를 도울 수 있다. 일반적인 정전기 이론 및 본 발명의 교시를 근거로 하면, 당업자들은 과도한 실험을 거치지 않고 본 발명의 분말의 정전기력을 감소시키는 첨가 물질을 확인할 수 있을 것이다. 이러한 점에서, 고도로 하전된 물질은 역 전하를 띠는 화합물로의 단순한 pH 조정 또는 킬레이트화를 통해 정전기적으로 변형 및 조절할 수 있다(예, 양이온성 지질에 핵산을 결합시킴). 또한, 필요한 경우, 에스테르화 및 하전 기법을 이용하여 정전기력을 조작하고 최소화시킬 수도 있다.

전술한 놀라운 장점들 외에도, 본 발명은 또한 수소 및 액체 결합을 완화 또는 감소시킨다. 당업자들에게 공지된 바와 같이, 수소 결합 및 액체 가교 결합은 분말에 의해 흡수된 수분으로부터 발생할 수 있다. 일반적으로, 더 높은 습도는 친수성 표면에 대한 더 높은 입자간 힘을 유발한다. 이것은 락토스와 같은 비교적 친수성 화합물을 사용하는 경향이 있는 선행 기술의 흡입 치료용 약학 제형에 있어서 심각한 문제점이다. 그러나, 본 발명의 교시에 따르면, 흡착된 물로 인해 생긴 응집력은 접촉 표면의 소수성을 증가시킴으로써 조절 또는 감소시킬 수 있다. 입자 소수성의 증가는 부형제의 선택 및/또는 유동화 층을 이용하는 것과 같은 제조후 분무 건조 코팅 기법의 이용을 통해 달성할 수 있다는 것을 당업자들은 알 것이다. 따라서, 바람직한 부형제는 인지질, 지방산 비누 및 콜레스테롤과 같은 소수성 계면활성제를 포함한다. 본 발명의 교시에 따르면, 당업자들은 과도한 실험을 거치지 않고 유사한 바람직한 특성을 나타내는 물질을 확인할 수 있을 것이다.

건조 분말로서 사용되든지 비수성 현탁 매질과 배합하여 사용되든지 간에, 미립자 또는 천공된 미세구조체는 "건조" 상태로 제공하는 것이 바람직할 것이다. 이렇게 하면 미립자는 상온에서 보관하는 동안 분말이 화학적 및 물리적으로 안정하게 유지되고 쉽게 분산될 수 있는 수분 함량을 포함하게 된다. 이와 같이, 미립자의 수분 함량은 일반적으로 6 중량% 이하, 바람직하게는 3 중량% 이하이다. 어떤 경우에는 수분 함량이 1 중량%만큼 낮다. 물론, 수분 함량은, 적어도 부분적으로, 제형에 의해 결정되고 이용하는 공정 조건, 예를 들면 입구 온도, 공급물 농도, 펌프 속도 및 발포제 유형, 농도 및 후건조에 의해 조절된다.

당업자에게 공지된 바와 같이, 정지 각도(angle of repose) 또는 전단 지수와 같은 방법을 건조 분말의 유동성을 측정하는 데 사용할 수 있다. 정지 각도는 분말 원추를 평평한 면 위에 부을 때 형성되는 각으로 정의한다. 정지 각도가 45 °∼ 20°인 분말이 바람직하며 적합한 분말 유동을 나타낸다. 더욱 구체적으로, 정지 각도가 33°∼ 20°사이인 분말은 비교적 낮은 전단력으로 유동하며, 흡입 치료(예, DPI)용 약학 제제에 특히 유용하다. 정지 각도보다 측정 시간이 더 걸리지만, 전단 지수는 더 신뢰할만하고 측정이 용이하다. 당업자들은 본 명세서에서 참고 인용하는 Amidon 및 Houghton이 기술한 실험 절차(G.E. Amidon 및 M.E. Houghton, Pharm. Manuf., 2, 20 1985)가 본 발명의 전단 지수를 측정하는 데 사용할 수 있다는 것을 알 것이다. 역시, 본 명세서에서 참고 인용하는 S. Kocova 및 N. Pilpel의 문헌[J. Pharm. Pharmacol. 8, 33-55, 1973]에 기술된 바와 같이, 항복 응력, 내부 마찰 유효각, 장력 및 비응집력과 같은 분말 파라미터로부터 전단 지수를 어림할 수 있다. 본 발명에서는, 전단 지수가 약 0.98 미만인 분말이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 조성물, 방법 및 시스템에 사용되는 분말은 전단 지수가 약 1.1 미만이다. 특히 바람직한 구체예에서는, 전단 지수가 약 1.3 미만, 또는 약 1.5 미만이다. 물론, 원하는 부위에 활성제 또는 생물활성제를 효과적으로 퇴적시킨다면, 다른 전단 지수를 갖는 분말을 사용할 수 있다.

또한, 분말의 유동성이 용적 밀도 측정치와 밀접한 관련이 있다는 것을 알 것이다. 이러한 점에서, 통상적인 선행 기술의 견해(C. F. Harwood, J. Pharm, Sci., 60, 161-163, 1971)는 용적 밀도의 증가는 물질의 전단 지수에 의해 예상되는 것처럼 향상된 유동성과 관련이 있다고 본다. 이와는 반대로, 놀랍게도, 본 발명의 천공된 미세구조체에서는 비교적 낮은 용적 밀도를 갖는 분말이 우수한 유동 성을 나타낸다는 것을 알게 되었다. 즉, 본 발명의 공동의 다공성 분말은 실질적으로 세공이 없는 분말에 비해 우수한 유동성을 나타내었다. 이러한 목적을 위해, 특히 바람직한 유동성을 나타내는 용적 밀도가 0.5 g/cm³ 미만인 분말을 제공하는 것이 가능하다는 것을 알게 되었다. 더욱 놀랍게도, 용적 밀도가 0.3 g/cm³ 미만, 약 0.1 g/cm³ 미만 또는 0.05 g/cm³ 미만인 우수한 유동성을 나타내는 천공된 미세구조체 분말을 제공하는 것이 가능하다는 것을 알게 되었다. 우수한 유동성을 갖는 저 용적 밀도 분말을 제조하는 능력 역시 본 발명의 신규하고 놀라운 특징임을 강조한다.

본 발명의 분말을 DPI와 함께 사용할 경우 이러한 저 용적 밀도가 특히 유익하다. 구체적으로, 아주 낮은 용적 밀도를 갖는 분말 제형을 제공함으로써, 본 발명은 건조 분말 흡입 장치에 사용하는 데 상업적으로 적합한 최소한의 충전 중량으로 감소시킨다. 즉, DPI용으로 고안된 대부분의 단위 용량 용기는 고정된 부피 또는 중량 측정 기법을 이용하여 충전한다. 다수의 선행 기술 제형과는 대조적으로, 본 발명은 생물활성제 및 첨가물 또는 증량제가 전체 흡입 입자를 구성하는 분말을 제공한다. 매우 낮은 용적 밀도를 갖는 입자를 제공함으로써, 단위 용량 용기로 충전될 수 있는 최소 분말 질량이 감소되며, 이는 담체 입자의 필요성을 제거한다. 즉, 본 발명의 비교적 낮은 용적 밀도를 갖는 분말은 담체 입자를 이용하지 않고 비교적 소량의 약학적 화합물을 재현적으로 투여할 수 있게 한다. 뿐만 아니라, 담체 입자를 사용하지 않는 것은 인후 퇴적을 감소시켜서, 선행 기술 제형의 큰 락토스 입자가 입자의 크기로 인해 인후 및 상부 기도와 충돌하기 때문에 생기는 "구역질" 증상을 완화시키는 작용을 한다.

천공된 미세구조체 분말에 의해 제공되는 인력(예, 반데르발스 힘, 정전기력, 수소 결합 및 액체 가교력 등)의 감소 및 우수한 유동성은 특히 흡입 치료(예, DPI, MDI, 연무기와 같은 흡입 장치를 이용한)용 제제에 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 유동성과 함께, 천공된 또는 다공성 및/또는 공동 구조의 미세구조체는 또한 방출시 분말의 결과적인 에어로졸 특성에도 중요한 역할을 한다. 이러한 현상은 MDI 또는 연무기의 경우에서와 같이 현탁액으로서 에어로졸화된 미립자 또는 천공된 미세구조체, 또는 DPI의 경우에서와 같이 건조 형태의 천공된 미세구조체의 전달에서 사실로 나타난다. 이러한 점에서, 미립자의 천공된 구조 및 비교적 높은 표면적은 미립자가 흡입시 기체 흐름을 타고 비슷한 크기의 비천공된 입자보다 더 멀리 더 쉽게 전달될 수 있게 한다.

더욱 구체적으로는, 이들의 고 다공도 때문에, 입자의 밀도가 1.0 g/cm³ 보다 훨씬 낮고, 일반적으로 0.5 g/cm³ 미만, 더욱 일반적으로는 0.1 g/cm³ 및 0.01 g/cm³ 만큼 낮다. 기하학적 입자 크기와는 달리, 천공된 미세구조체의 공기역학적 입자 크기인 d _aer 는 실질적으로 입자 밀도, ρ: d _aer = d _aer ρ(여기서, d _aer 는 기하학적 직경이다)에 의존한다. 입자 밀도가 0.1 g/cm³인 경우 d _aer 는 대개 d _geo 보다 3배 적을 것이며, 이는 폐의 말초 영역으로의 입자 퇴적을 증가시키고 그에 따라 인후의 퇴적을 감소시킬 것이다. 이러한 점에서, 천공된 미세구조체의 평균 공기역학적 직경은 약 5 ㎛ 미만이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 3 ㎛ 미만, 그리고 특히 바람직한 구체예에서는 약 2 ㎛ 미만이다. 이러한 입자의 분포는 DPI, MDI 또는 연무기 중 어느 것을 통해 투여하든지 간에, 더 많은 생물활성제를 폐에 깊이 퇴적시킬 것이다.

하기 실시예에서 기술되는 바와 같이, 본 발명의 에어로졸 제형의 입자 크기분포는 예를 들면 캐스캐이드 충격과 같은 통상적인 기법에 의해 또는 타임 오브 플라이트(time of flight) 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. 또, 흡입 장치로부터 방출된 양의 측정은 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 약전 방법(Pharmacopeial Previews, 22(1996) 3065)에 따라 수행하였다. 이러한 기법 및 관련 기법을 통해 폐에 효과적으로 퇴적될 것 같은 미립자에 해당하는 에어로졸의 "미립자 분율(fine particle fraction)"을 계산할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "미립자 분율"이란 작동 1회당 DPI, MDI 또는 연무기의 마우스피스로부터 8단 앤더슨 캐스캐이드 충격기의 2∼7 플레이트로 전달되는 활성 약제의 총량의 백분율을 말한다. 이러한 측정치를 기준으로 하면, 본 발명의 제형은 바람직하게 천공된 미세구조체(w/w)의 약 20 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 약 25∼90 중량%, 더욱 더 바람직하게는 약 30∼80 중량%의 미립자 분율을 나타낼 것이다. 선택된 구체예에서 본 발명은 약 30 중량%, 40 중량%, 50 중량%, 60 중량%, 70 중량%, 80 중량% 또는 90 중량% 이상의 미립자 분율을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 선행 기술 제제와 비교했을 때, 본 발명의 제형은 충격기 유입구 및 플레이트 0 및 1에서의 비교적 낮은 퇴적률을 나타낸다. 이러한 부품 위로의 퇴적은 인간 인후에서의 퇴적과 관련이 있다. 더욱 구체적으로, 시판되는 대부분의 MDI 및 DPI는 총량의 약 40∼70%(w/w)를 인후에 퇴적시키는 반면, 본 발명의 제형은 일반적으로 약 20%(w/w) 미만으로 퇴적시킨다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 약 40 중량%, 35 중량%, 30 중량%, 25 중량%, 20 중량%, 15 중량% 또는 10 중량% 미만의 인후 퇴적이 일어나도록 조정하였다. 당업자들은 본 발명에 의해 제공되는 인후 퇴적의 상당한 감소가 인후 염증과 같은 관련 국소 부작용의 감소로 이어진다는 것을 알 것이다.

본 발명에 의해 제공되는 이로운 퇴적 프로필에 대해서, MDI 추진제는 일반적으로 현탁된 입자를 인후 후부를 향해 고속으로 장치 밖으로 방출시킨다는 것이 잘 알려져 있다. 선행 기술 제형은 일반적으로 큰 입자 및/또는 응집체를 많은 비율로 포함하기 때문에, 방출된 양의 2/3 이상이 인후와 충돌할 수 있다. 또한, 종래의 분말 제제의 바람직하지 않은 전달 프로필은 DPI 장치 내에서 발생하는 것과 같은 저속 입자의 조건 하에도 나타난다. 일반적으로 이러한 문제는 응집되기 쉬운 고체의 조밀한 입자를 에어로졸화시킬 때 일어난다. 그러나, 전술한 바와 같이, 본 발명의 안정화된 분산물의 신규하고 예기치 않은 특성은 놀랍게도 DPI, MDI, 분무기 또는 연무기와 같은 흡입 장치를 통해 투여한 후 놀라울 정도로 인후 퇴적을 감소시킨다.

특정 이론에 의해 지지되기를 원하는 것은 아니지만, 본 발명에 의해 제공되는 인후 퇴적의 감소는 입자 응집의 감소 및 혼입된 미세구조체의 공동 및/또는 다공성 형태에 의한 것으로 보인다. 즉, 분산된 미세구조체의 공동성 및 다공성은 공동/다공성 휘플공이 야구공 보다 더 빨리 감속되는 것처럼, 추진제 흐름(또는 DPI의 경우 기체 흐름) 내에서의 입자의 속도를 감소시킨다. 따라서, 비교적 천천히 이동하는 입자들은 인후 후부에 충돌 및 부착되기보다, 환자에 의해 흡입되기 쉽다. 뿐만 아니라, 고도로 다공성인 입자의 성질은 천공된 미세구조체 내의 추진제가 인후에 충돌하기 전에 재빨리 떨어져서 입자의 밀도를 감소시킨다. 따라서, 상당히 더 높은 비율로 투여된 생물활성제는 효과적으로 흡수될 수 있는 폐 기도에 퇴적된다.

E. 분말 형성

전술한 바와 같이, 다양한 성분들이 본 발명의 미립자에 결합 또는 혼입될 수 있다. 유사하게, 여러가지 기법을 통해 원하는 형태(예, 천공된 또는 공동/다공성 구성), 분산성 및 밀도를 갖는 미립자를 제공할 수 있다. 기타 방법들 중에서, 분무 건조, 진공 건조, 용매 추출, 유화, 동결 건조 및 이들의 병용법을 통해 본 발명에 적합한 미립자를 제조할 수 있다. 이러한 기법들 중 다수의 기본 개념은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 교시에 따르면 과도한 실험을 거치지 않고 이를 적용하여 원하는 입자 구성 및/또는 밀도를 갖는 입자를 제조할 수 있다는 것을 알 것이다.

몇가지 절차가 본 발명에 대체로 적용 가능하지만, 특히 바람직한 구체예는 일반적으로 분무 건조에 의해 형성된 미립자 또는 천공된 미세구조체를 포함한다. 잘 알려진 바와 같이, 분무 건조는 액체 공급액을 건조된 미립자 형태로 전환시키는 일단계 공정이다. 약학 분야에서는, 흡입을 비롯한 다양한 투여 경로용의 분말화된 물질을 제공하기 위해 분무 건조가 사용되어 왔다는 것을 알 것이다. 예를 들면, 문헌[M. Sacchetti 및 M.M. Van Oort in: Inhalation Aerosols: Physical and Biological Basis for Theraphy, A.J. Hickey, ed. Marcel Dekkar, New York, 1996]을 참조할 수 있으며, 이는 본 명세서에 참고 인용한다.

일반적으로, 분무 건조는 고도로 분산된 액체와 충분한 부피의 고온 공기를 접촉시켜 증발시키는 단계와 액체 소적을 건조시키는 단계로 이루어진다. 분무 건조시킬 제제 또는 공급액(또는 공급 원액)은 선택된 분무 건조 장치를 이용하여 분무화할 수 있는 임의의 용액, 조제의(coarse) 현탁액, 슬러리, 콜로이드성 분산액 또는 페이스트가 될 수 있다. 바람직한 구체예에서는, 공급 원액은 에멀젼, 역 에멀젼, 마이크로에멀젼, 다중 에멀젼, 미립자 분산액 또는 슬러리와 같은 콜로이드 시스템을 포함한다. 일반적으로 공급액을 여과된 따뜻한 기류로 분무하여 용매를 증발시키고 건조된 생성물은 수집기로 수송한다. 그 후 사용한 공기는 용매와 함께 배출시킨다. 당업자들은 원하는 생성물을 제조하기 위해 몇몇 다른 유형의 장치를 이용할 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들면, 부치 리미티드 또는 니로 코포레이션이 제조 시판하는 분무 건조기를 이용하면 원하는 크기, 형태 및 밀도를 갖는 입자를 효과적으로 제조할 수 있다.

이러한 분무 건조기, 특히 분무기는 특수한 용도, 즉 2중 노즐 기법을 이용한 2종 용액의 동시 분무를 위해 변형 또는 주문 제작할 수 있음을 알 것이다. 더욱 구체적으로는 유중수형 에멀젼을 제1 노즐로부터 분무할 수 있고, 만니톨과 같은 점착방지제 함유 용액을 제2 노즐로부터 동시 분무할 수 있다. 다른 경우에는, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 펌프를 이용하여 주문 제작된 노즐를 통해 공급 용액을 주입하는 것이 바람직할 수 있다. 원하는 형태 및/또는 조성물을 포함하는 미세구조체를 제조할 수 있다면, 장치의 선택은 그다지 중요하지 않다는 것을, 본 발명의 교시에 따르면 당업자들은 쉽게 알 것이다.

이렇게 얻은 분무 건조된 분말은 일반적으로 구에 가까운 형태이고 크기가 거의 일정하며 대개 중공성이지만, 혼입된 약제 및 분무 건조 조건에 따라 형태가 어느 정도 불규칙적일 수 있다. 어떤 경우에는, 제조시 팽창제(또는 발포제)를 사용하면, 미립자 또는 천공된 미세구조체의 분산 안정성 및 분산성이 향상되는 것으로 나타난다. 특히 바람직한 구체예는 분산상 또는 연속상으로서 팽창제를 함유하는 에멀젼을 포함할 수 있다. 팽창제는 계면활성제 용액을 이용하여 분산시키는 것이 바람직한데, 예를 들면 약 5000∼15,000 psi의 압력에서 시판되는 마이크로유동화기를 사용하는 것이다. 이러한 공정은 일반적으로 수성 연속상 내에 분산된 물과 비혼화성인 발포제의 마이크론 이하의 소적을 포함하는, 바람직하게 혼입된 계면활성제에 의해 안정화된 에멀젼을 형성시킨다. 이러한 기법 및 기타 기법을 이용한 이러한 에멀젼의 제조 방법은 통상적인 것으로, 당업자에게 잘 알려져 있다. 발포제로는 분무 건조 과정 중에 증발하여, 선택된 구체예에서는 비교적 공동 다공성의 공기역학적으로 경질인 미소구체를 남게 하는 플루오르화 화합물(예, 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로옥틸 브로마이드, 퍼플루오로데칼린, 퍼플루오로부틸 에탄)이 바람직하다. 아래에서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, 다른 적합한 액체 발포제로는 비플루오르화 오일, 클로로포름, 프레온, 에틸 아세테이트, 알콜 및 탄화수소가 있다. 질소 및 이산화탄소 기체 또한 적합한 발포제로 간주된다.

전술한 화합물 외에도, 감압 하에 제조후 단계에서의 승화에 의해 제거될 수 있는 무기 및 유기 물질 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다. 이러한 승화성 화합물은 분무 건조 공급액 내에서 미분화된 결정으로 용해되거나 분산될 수 있으며, 탄산암모늄 및 캠포가 그 예이다. 본 발명에 적합한 다른 화합물은 공급액에 분산될 수 있고 동일계에서 제조될 수 있는 경질화 고체 구조체를 포함한다. 그 후, 이 구조체를 초기의 입자를 생성시킨 후, 제조후 용매 추출 단계를 통해 추출한다. 예를 들면, 라텍스 입자를 분산시킨 다음, 다른 벽 형성 화합물과 함께 건조시켜서 적합한 용매로 추출시킬 수 있다.

전술한 바와 같이 발포제를 이용하여 미립자를 제조하는 것이 바람직하지만, 일부 경우에는 발포제를 첨가하지 않고 약제의 수성 분산물 및/또는 부형제 및 계면활성제(들)를 직접 분무 건조시킨다는 것을 알 것이다. 이러한 경우에는, 제형을 공동의 비교적 다공성인 미립자를 형성할 수 있는 공정 조건(예, 고온)에 적용할 수 있다. 또한, 약제는 이러한 기법에 사용하기에 특히 적합하게 하는 특수한 물리화학적 특성(예, 고결정도, 증가된 융점, 표면 활성 등)을 지닐 수 있다.

발포제를 사용할 경우, 결과적인 미립자의 다공도 및 분산도는, 적어도 부분적으로, 발포제의 성질, 공급 원액 내 농도(예, 에멀젼으로서) 및 분무 건조 조건에 의존하는 것으로 보인다. 다공성 및 현탁액에서의 분산성에 대해서는, 놀랍게도, 이전까지 발포제로 고려하지 않았던 화합물을 사용하여 특히 바람직한 특성을 갖는 천공된 미세구조체를 제조할 수 있다는 것을 알게 되었다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 이러한 신규하고 예기치 않은 측면을 통해, 비교적 비점이 높은(즉, 약 40℃ 이상) 플루오르화 화합물을 사용하여 특히 다공성인 미립자를 제조할 수 있다는 것을 알게 되었다. 이러한 천공된 미세구조체는 흡입 치료에 특히 적합하다. 이러한 점에서, 비점이 약 40℃, 50℃, 60 ℃, 70℃, 80℃, 90℃ 또는 95℃ 이상인 플루오르화화 또는 부분적 플루오르화 발포제를 사용하는 것이 가능하다. 비점이 물보다 높은, 즉 100℃ 이상인 발포제(예, 퍼플루브론, 퍼플루오로데칼린)를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 0.3 ㎛ 미만의 평균 가중 입자 직경을 갖는 안정한 에멀젼 분산물의 제조를 용이하게 하는, 비교적 물에 대한 용해도가 낮은( < 10^-6 M) 발포제를 사용하는 것이 바람직하다.

전술한 바와 같이, 이러한 발포제는 분무 건조 전에 유화된 공급 원액에 혼입시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 목적을 위해서, 이러한 공급 원액은 또한 1종 이상의 생물활성제, 1종 이상의 계면활성제 또는 1종 이상의 부형제를 포함하는 것이 바람직하다. 물론, 상기 성분들의 조합물 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 비점이 높은( ＞100℃) 플루오르화 충전제가 본 발명의 바람직한 양태를 이루지만, 유사한 비점(＞100℃)을 갖는 비플루오르화 발포제 역시 적합한 미립자를 제공하는 데 사용될 수 있음을 알 것이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 비플루오르화 발포제의 예는 하기 화학식을 포함한다:

R¹-X-R² 또는 R¹-X

상기 식 중, R¹ 또는 R²는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 방향족, 시클릭 또는 이들의 조합물이며, X는 탄소, 황, 질소, 할로겐, 인, 산소 및 이들의 조합물을 포함하는 임의의 기이다.

본 발명을 임의의 방식으로 제한하는 것은 아니지만, 분무 건조 중에 수성 공급물 성분이 증발함에 따라 입자 표면에 얇은 껍질이 남게 된다고 가정할 때, 분무 건조의 초기에 형성된 얻은 입자 벽 또는 껍질은 수백개의 에멀젼 소적(약 200∼300 nm)으로서 임의의 고비점 발포제를 포획하는 것으로 생각된다. 건조 과정이 진행됨에 따라 미립자의 내부 압력은 증가하게 되며, 이로써 혼입된 발포제의 적어도 일부를 증발시켜서 비교적 얇은 껍질을 통과하게 한다. 이러한 배기 또는 탈기는 분명 미세구조체 내에 세공 또는 다른 흠을 형성시킨다. 동시에 남아있는 미립자 성분(약간의 발포제를 포함할 수 있음)은 입자가 경화됨에 따라 내부에서 표면으로 이동하게 된다. 이러한 이동은 증가된 내부 점도에 의해 야기된 질량 전달에 대한 저항력 증가의 결과로서 건조 과정 중에 분명히 천천히 일어난다. 일단 이동이 끝나면, 입자는 경화되어서, 공극, 세공, 결함, 공동, 공간, 간극, 틈, 천공 또는 소공을 남기게 된다. 세공 또는 결함의 수와 이들의 크기 및 형성되는 막 두께는 대개 제형 및/ 또는 선택된 발포제의 성질(예, 비점), 에멀젼 내 발포제의 농도, 총 고형분 농도 및 분무 건조 조건에 의존한다. 전술한 바와 같이, 이러한 천공된 입자 형태는, 적어도 부분적으로, 분말 분산성, 현탁액 안정성 및 공기역학적특성을 향상시키는 것으로 생각된다.

놀랍게도, 이렇게 비교적 비점이 높은 발포제의 상당량이 분무 건조된 생성물에 보유될 수 있음을 알게 되었다. 즉, 전술한 분무 건조된 미립자는 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 40%(w/w)의 잔류 발포제를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 이러한 잔류 발포제에 의해 야기되는 증가된 입자 밀도에 의해 더 높은 수율을 달성할 수 있다. 잔류 플루오르화 발포제는 미립자의 표면 특성을 변화시켜서 공정 과정 동안 입자의 응집을 감소시키고 나아가서 분산 안정성을 증가시킨다는 것을 당업자들은 알 것이다. 분말 내의 잔류 플루오르화 발포제는 또한 장벽을 형성하거나 제조 과정 중에 발생하는 인력(예, 정전기력)을 완화시킴으로써 입자간의 응집력을 감소시킬 수 있다. 이러한 응집력의 감소는 본 발명의 미세구조체를 건조 분말 흡입기와 함께 사용할 경우 특히 이익이 될 수 있다.

또한, 잔류 발포제의 양은 공정 조건(예를 들면, 출구 온도), 발포제 농도 또는 비점에 의해 조절될 수 있다. 출구 온도가 비점 이상이면, 발포제는 입자로부터 방출되어 제조 수율은 감소된다. 바람직한 출구 온도는 일반적으로 발포제의 비점보다 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃ 또는 100℃ 낮게 조절될 것이다. 출구 온도와 비점간의 온도차가 50∼150℃의 범위인 것이 더욱 바람직하다. 당업자라면, 선택된 활성제 및/또는 부형제에 적합한 공정 조건(예, 출구 온도)의 범위를 먼저 확인함으로써 입자 다공도, 제조 수율, 정전기력 및 분산성을 최적화할 수 있다는 것을 알 것이다. 그 후, 온도차가 20℃ 이상 150℃ 이하가 되도록 하는 최대 출구 온도를 이용하여 바람직한 발포제를 선택할 수 있다. 어떤 경우에는, 온도차가 이 범위를 벗어날 수 있는데, 예를 들면, 초임계 조건 하에 또는 동결 건조 기법을 이용하여 미립자를 제조할 경우가 그러하다. 당업자들은 또한 과도한 실험을 거치지 않고 본 발명의 실시예에서 기술된 기법과 유사한 기법을 이용하여 바람직한 발포제 농도를 결정할 수 있다는 것을 알 것이다.

특정 구체예에서는 잔류 발포제가 유용하게 사용될 수도 있지만, 건조 분무된 생성물로부터 발포제를 실질적으로 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 점에서, 잔류 발포제는 제조후 증발 단계를 통해 진공 오븐 내에서 쉽게 제거될 수 있다. 뿐만 아니라, 이러한 제조후 기법은 미립자 내의 천공을 제공하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 진공 하에 형성된 미립자로부터 제거될 수 있는 생물활성제 및 부형제를 분무 건조시킴으로써 세공을 만들 수 있다.

어느 경우든지, 공급 원액의 일반적인 발포제 농도는 2%∼5% v/v 사이이고, 약 10%∼45% v/v 사이인 것이 더욱 바람직하다. 다른 구체예에서는 발포제의 농도가 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% v/v 이상인 것이 바람직하다. 그러나 다른 공급 원액 에멀젼은 선택된 화합물을 35%, 40%, 45% 또는 50% v/v로 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 공급액에 사용되는 발포제의 농도를 확인하는 또다른 방법은 그것을 전구체 또는 공급 에멀젼 내에 발포제의 농도 대 안정화 계면활성제(예, 포스파티딜콜린, 즉 PC)의 농도 비로서 제공하는 것이다. 플루오로카본 발포제(예, 퍼플루오로옥틸 브로마이드)의 경우를 예로 들어 설명하면, 이 비를 PFC/PC 비라고 한다. 더욱 일반적으로, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위에서, 다른 적합한 발포제 및/또는 계면활성제로 예시 화합물을 대체할 수 있다는 것을 알 것이다. 어떤 경우든지, 전형적인 PFC/PC 비는 약 1∼약 60이며, 약 10∼약 50인 것이 더욱 바람직하다. 바람직한 구체예에서는 이 비는 일반적으로 약 5, 10, 20, 25, 30, 40 또는 50 이상이다. 더 높은 PFC/PC 비를 사용하면 공동성과 다공성이 더 큰 구조체를 만들 수 있다는 것을 알 것이다. 더욱 구체적으로, 약 4.8을 초과하는 PFC/PC 비를 이용하는 방법들은 본 발명의 건조 분말 제형 및 분산물에 특히 적합한 구조체를 제공할 수 있다.

비교적 비점이 높은 발포제가 본 발명의 바람직한 한 양태를 구성하지만, 다른 발포제 또는 팽창제 또한 본 발명에 적합한 미세구조체를 제공하는 데 사용할 수 있다는 것을 알 것이다. 이와 같이, 발포제는 원하는 미세구조체를 제조하기 위해 공급액 내에 혼입시킬 수 있는 임의의 휘발성 물질을 포함할 수 있다. 이 발포제는 초기 건조 과정 또는 진공 건조 또는 용매 추출과 같은 제조후 단계 중에 제거될 수 있다. 적절한 발포제는 다음을 포함한다:

1. 용액을 포화시키는 데 사용되는 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 알콜과 같은 수용액과 혼화성인 비점이 낮은(100℃ 이하) 용해된 물질.

2. 고압에서 사용되는 CO₂나 N₂와 같은 기체, 또는 프레온, CFC, HFA, PFC, HFC, HFB, 플루오로알칸 및 탄화수소와 같은 액체.

3. 일반적으로 하기 화학식으로 표시되는 본 발명에 사용하기에 적합한 비혼화성의 비점이 낮은(100℃ 이하) 액체의 에멀젼:

R¹-X-R² 또는 R¹-X

상기 식 중, R¹ 또는 R²는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 방향족, 시클릭 또는 이들의 조합물이고, X는 탄소, 황, 질소, 할로겐, 인, 산소 및 이들의 조합물을 포함하는 임의의 기이다.

4. 제조후 단계에서 감압 하에 승화를 통해 제거할 수 있는 암모늄염, 캠포 등과 같은 용해 또는 분산된 염 또는 유기 물질.

5. 제조후 용매 추출 단계를 이용하여 초기의 입자 생성 후에 추출할 수 있는 분산된 고체.

비점이 낮은 팽창제는 일반적으로 계면활성제 용액의 약 1%∼40% v/v의 양으로 공급 원액에 첨가한다. 약 15% v/v의 팽창제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 분무 건조된 분말을 산출한다는 것을 알게 되었다.

최종적으로 선택되는 발포제의 유형에 관계없이, 본 발명에 적합한 미립자는 뷔히 미니 분무 건조기(모델 B-191, 스위스)와 같은 시판되는 장치를 이용하여 제조할 수 있다. 당업자들이 이해하는 바와 같이, 분무 건조기의 입구 온도 및 출구 온도는 원하는 입자 크기를 제공하고, 혼입된 생물활성제의 활성을 유지하도록 조절될 수 있다. 이러한 점에서, 입구 및 출구 온도는 제형 성분의 용융 특성 및 공급 원액의 조성에 따라 조절할 수 있다. 따라서, 공급물의 조성 및 원하는 미립자 특성에 따라 입구 온도는 60℃∼170℃ 사이, 출구 온도는 약 40℃∼120℃ 사이일 수 있다. 입구 온도가 90℃∼120℃, 출구 온도가 60℃∼90℃인 것이 더욱 바람직할 것이다. 분무 건조 장치에 이용되는 유속은 일반적으로 약 3 ㎖/분∼약 15 ㎖/분이다. 분무기 기류 속도는 25 ℓ/분∼약 50 ℓ/분 사이로 다양하다. 시판되는 분무 건조기는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 특정 분산물에 적합한 세팅 조건은 첨부되는 예를 참조하여 표준 실험 테스트를 통해 쉽게 결정할 수 있다.

초미립자는 플루오르화 발포제를 이용하여 에멀젼의 형태로 형성하는 것이 바람직하지만, 비플루오로화 오일을 사용하여 미세구조체를 손상시키지 않고 생물활성제의 장입량을 증가시킬 수 있다는 것을 알 것이다. 이러한 경우에, 비플루오르화 오일의 선택은 활성제 또는 생물활성제의 용해도, 물에 대한 용해도, 비점 및 인화점을 기초로 한다. 생물활성제를 오일에 용해시킨 다음, 공급액에 유화시킨다. 바람직하게 오일은 선택된 제제에 대한 실질적인 가용성, 물에 대한 낮은 용해도(< 10^-3 M), 물보다 높은 비점 및 건조 출구 온도보다 높은 인화점을 지닐 것이다. 가용성을 증가시키기 위해서 비플루오르화 오일에 계면활성제 및 용매 보조제를 첨가하는 것 또한 본 발명의 범위에 속하는 것이다.

특히 바람직한 구체예에서, 비플루오르화 오일을 수성 조성물에서 제한된 용해도를 갖는 생물활성제를 용해시키는 데 사용할 수 있다. 비플루오르화 오일을 사용하는 것은 소수성 펩티드 및 단백질의 장입 용량을 증가시키는 데 특히 유용하다. 이러한 화합물을 용해시키는 오일 또는 오일 혼합물은 굴절률이 1.36∼1.41의 범위인 것(예, 에틸 부티레이트, 부틸 카보네이트, 디부틸 에테르)이 바람직하다. 뿐만 아니라, 온도와 압력 같은 공정 조건을 선택된 제제의 가용성을 높이도록 조절할 수 있다. 제제의 장입 용량을 최대화하기 위해 적절한 오일 또는 오일 혼합물 및 공정 조건을 선택하는 것은 본 발명의 교시에 따르면 당업자들이 인식하는 범위의 것이고, 과도한 실험을 거치지 않고 수행할 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예는 인지질과 같은 계면활성제 및 1종 이상의 생물활성제를 포함하는 분무 건조된 제제를 포함한다. 다른 구체예는 임의의 선택된 계면활성제 외에도, 탄수화물(즉, 글루코스, 락토스 또는 전분)과 같은 친수성 부위를 포함하는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 점에서, 다양한 전분 및 전분 유도체가 본 발명에 사용하기에 특히 적합하다. 다른 선택적인 성분으로는 통상의 점도 변형제, 인산염 완충액 또는 기타 통상적인 생체적합성 완충액과 같은 완충액, 또는 산이나 염기와 같은 pH 조정제, 및 삼투압제(등장성, 고삼투압 또는 저삼투압을 제공하는 것)를 포함할 수 있다. 적절한 염의 예로는 인산나트륨(1염기 및 2염기 모두), 염화나트륨, 인산칼슘, 염화칼슘 및 기타 생리학적 허용 염을 포함한다.

어느 성분이 선택되든지 간에, 미립자 제조의 첫 단계는 일반적으로 공급 원액 제조를 포함한다. 선택된 약물을 물에 용해시켜서 농축액을 만드는 것이 바람직하다. 또한, 특히 불수용성 제제의 경우, 약물은 에멀젼 내에 직접 분산시킬 수 있다. 대안으로, 약물을 고체 미립자 분산물 형태로 혼입시킬 수 있다. 사용되는 활성제 또는 생물활성제의 농도는 최종 분말에 요구되는 제제의 양 및 이용되는 전달 장치의 성능(예, MDI 또는 DPI의 경우 미세 입자 투여량)에 의존한다. 필요한 경우, 폴록사머 188 또는 스판 80과 같은 보조 계면활성제를 이러한 첨가 용액에 분산시킬 수 있다. 추가적으로, 당 및 전분과 같은 부형제를 첨가할 수도 있다.

선택된 구체예에서는 그 후, 별도의 용기에서 수중유형 에멀젼을 형성시킨다. 사용되는 오일은 장쇄 포화 인지질과 같은 계면활성제를 이용하여 유화시킨 플루오로카본(예, 퍼플루오로옥틸 브로마이드, 퍼플루오로데칼린)이 바람직하다. 예를 들면, 적합한 고전단 기계 혼합기(예, 울트라-투락스 모델 T-25 혼합기)를 이용하여 8000 rpm으로 2∼5분 동안 1 g의 인지질을 150 g의 고온 증류수(예, 60℃) 내에 균질화시킬 수 있다. 혼합하는 동안 일반적으로 5∼25 g의 플루오로카본을 분산된 계면활성제 용액에 적가한다. 그 후 형성된 물 에멀젼 중의 퍼플루오로카본을 고압 균질화기를 이용하여 가공하여 입자 크기를 감소시킨다. 예를 들면, 이 에멀젼을 50∼80℃를 유지하면서 12,000∼18,000 psi로 5회에 거쳐 통과시켜서 가공할 수 있다.

그 후, 생물활성제 용액 및 퍼플루오로카본 에멀젼을 모아서 분무 건조기에 공급할 수 있다. 에멀젼이 수성 연속상을 포함하는 것이 바람직하기 때문에, 일반적으로 두가지 제제는 혼화성이다. 본 발명의 목적을 위해서는 생물활성제를 별도로 용해시키지만, 다른 구체예에서는, 활성제 또는 생물활성제를 에멀젼에 직접적으로 용해(또는 분산화)시킬 수 있다. 이러한 경우에는, 활성제 에멀젼 또는 생물활성제 에멀젼은 별도의 약제를 병용하지 않고 간단히 분무 건조시킨다.

어떤 경우든지, 원하는 입자 크기 및 결과적인 건조 미세구조체의 제조 수율로 제조하기 위해 제조자의 지시에 따라 입구 온도 및 출구 온도, 공급 속도, 분무화 압력, 건조 공기의 유속 및 노즐 형태와 같은 공정 조건을 조절할 수 있다. 조절 예는 다음과 같다: 공기 유입구 온도: 60℃∼170℃; 공기 유출구 온도: 40℃∼120℃; 공급 속도: 3 ㎖∼약 15 ㎖/분; 및 흡출 공기 흐름: 300 ℓ/ml, 분무화 기류 속도: 25∼50 ℓ/분. 적절한 장치 및 공정 조건의 선택은 본 발명의 교시에 따르면 당업자들이 인식하는 범위의 것이며, 과도한 실험을 거치지 않고 수행할 수 있다. 어떤 경우든지, 이러한 방법 및 이와 실질적으로 동일한 방법을 이용하면 폐로의 에어로졸 퇴적에 적절한 입자 직경을 갖는 공동 다공성의 공기역학적으로 가벼운 미소구체를 제조할 수 있다. 공동 및 다공성인 미세구조체는 거의 벌집 또는 거품의 형상을 하고 있다. 특히 바람직한 구체예에서는, 천공된 미세구조체가 공동, 다공성의 건조된 미소구체를 포함한다.

분무 건조법과 함께 동결 건조를 통해 본 발명에 유용한 천공된 미세구조체를 형성할 수 있다. 당업자라면, 동결 건조는 물이 동결된 조성물로부터 승화되는 동결 건조되는 과정이라는 것을 알 것이다. 동결 건조 과정과 관련된 특별한 장점은 수용액에서 비교적 불안정한 생물학적 제제 및 기타 약제를 온도를 증가시키지 않고 건조시켜서(이로써 불리한 열의 영향을 제거한다), 안정성 문제가 거의 없는 건조 상태로 보관이 가능하다는 것이다. 본 발명에 있어서, 이러한 기법은 펩티드, 단백질, 유전 물질 및 기타 천연 및 합성 거대분자를 생리학적 활성을 손상시키지 않고 미립자 또는 천공된 미세구조체로 혼입시키는 데 특히 적합하다. 동결 건조된 미립자를 제공하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 교시에 따르면 과도한 실험을 거치지 않고 적합한 미세구조체를 제조할 수 있다. 미세 거품과 같은 구조를 포함하는 동결 건조된 케익을 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 미분화시켜서 평균 직경이 5 ㎛ 또는 10 ㎛ 이하인 입자를 제조할 수 있다. 따라서, 동결 건조 과정이 원하는 특성을 지닌 미세구조체를 제조하는 데 사용될 수 있는 한, 이것은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다.

전술한 기법 외에도, 본 발명의 미립자 및 천공된 미세구조체는 또한 벽 형성 물질을 포함하는 공급액(에멀젼이든 수용액이든)을 감압 하에 가열된 오일(예, 퍼플루브론 또는 기타 비점이 높은 FC) 저장용기에 재빨리 첨가하는 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 공급액의 수분 및 휘발성 용매는 빨리 끓어 증발한다. 이러한 공정은 튀밥 또는 팝콘과 유사하게 벽 형성 물질로부터 천공된 구조를 제조하는 데 사용될 수 있다. 벽 형성 물질은 가열된 오일 중에 불용성인 것이 바람직하다. 그 후 이렇게 얻은 입자를 여과 기법을 이용하여 가열된 오일로부터 분리한 다음, 진공 하에 건조시킬 수 있다.

추가적으로, 본 발명의 미립자 또는 천공된 미세구조체는 2중 에멀젼 방법을 이용하여 형성할 수도 있다. 2중 에멀젼 방법에서는, 약제를 먼저 초음파 분해 또는 균질화를 통해 유기 용매(예, 메틸렌 클로라이드)에 용해된 중합체 내로 분산시킨다. 그 후, 폴리비닐알콜과 같은 유화제를 포함하는 연속 수성상 내에서 다중 에멀젼을 형성시킴으로써 이러한 1차 에멀젼을 안정화시킨다. 그 후, 통상적 기법 및 장치를 이용한 증발 또는 추출을 통해 유기 용매를 제거한다. 그 후, 이렇게 얻은 미립자를 사용 전에 세정, 여과, 건조시키거나, 이들을 본 발명에 따른 적절한 현탁매질과 혼합한다.

F. 투여

최종적으로 선택되는 미립자 제조 방법이 무엇이든지 간에, 형성된 분말은 분말 형태 또는 비수성 현탁 매질을 포함하는 분산물로서 효과적으로 사용될 수 있게 하는 많은 이로운 특성을 지닌다. 특히 바람직한 구체예에서, 생물활성 조성물은, 이것이 건조 분말이든 분산물이든지 간에, 흡입 치료를 통해 호흡관(즉, 폐 및/또는 비도)의 점막 표면에 투여된다. 이러한 투여는 MDI, DPI, 연무기, 비측용 펌프, 분무기, 스프레이병을 이용하거나, 소적의 형태로 직접 점적주입함으로써 수행될 수 있다. 그러나, 흡입 치료가 본 발명에 가장 적합하지만, 다른 형태의 투여 방법 및/또는 투여 경로 또한 유용하다는 것을 알 것이다.

이러한 점에서, 본 발명의 분말 및 안정화된 분산물은 체내의 임의 부위에 국소적 또는 전신적으로 화합물을 투여하는 데 사용될 수도 있다. 따라서, 바람직한 구체예에서는, 이 제제를 국소, 근육내, 경피, 피내, 복강, 비측, 폐, 협측, 질, 직장, 귀, 경구 또는 눈을 비롯한 많은 다른 경로를 통해 전달할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직한 표적 부위는, 예를 들면 위장관, 비뇨생식관 또는 호흡관일 수 있다. 더욱 일반적으로는, 본 발명의 안정화된 분산물을 국소적으로 또는 체내 강에 투여함으로써 제제를 전달하는 데 사용할 수 있다. 바람직한 구체예에서 체내 강은 복강, 공동, 직강, 요도, 위, 비강, 질, 이도, 구강, 볼(buccal pouch) 및 늑막으로 이루어진 군에서 선택된다. 당업자들은 선택된 투여 경로가 대개 생물활성제의 선택 및 피검체에서의 원하는 반응에 의해 결정되다는 것을 알 것이다.

본 발명의 분말 또는 안정화된 분산물의 전달에 관한 본 발명의 또다른 측면은 1종 이상의 생물활성제 또는 생물학적 제제를 환자에게 투여하는 시스템에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 적합한 흡입 장치의 예로는 분무기, 비측용 펌프, 스프레이어어 또는 스프레이병, 건조 분말 흡입기, 정량식 흡입기 또는 연무기를 들 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이러한 흡입 시스템은 에어로졸의 형태로 생물활성제를 원하는 생리학적 부위(예, 점막 표면)에 전달할 것이다. 본 발명의 목적을 위해서, "에어로졸화된"이란, 문맥상의 제한에 의한 다른 지시 사항이 없는 한, 미세 고체 또는 액체 입자의 기체상 현탁액을 의미하는 것으로 간주한다. 즉, 에어로졸 또는 에어로졸화된 약제는 건조 분말 흡입기, 정량식 흡입기, 분무기, 스프레이병 또는 연무기 등에 의해 생성될 수 있다. 물론, 아래에서 상세히 기술하는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 또한 직접적으로 (예, 통상적인 주사 또는 무침 주사) 또는 액체 투여량 점적주입과 같은 기법을 이용하여 전달할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 분말 또는 분산물을 포함하는 무침 주사기(예, 가압 가스총)에 관한 것이다.

F(i). 건조 분말 흡입기

흡입 치료에 대해서는, 당업자들은 본 발명의 분말, 특히 천공된 미세구조체를 포함하는 분말이 DPI에 특히 유용하다는 것을 알 것이다. 통상적인 DPI, 또는 건조 분말 흡입기는 분말화된 제형 및 소정량의 약제가 단독으로 또는 락토스 담체 입자와 혼합된 상태로 흡입을 위한 건조 분말의 미세한 분무제 또는 에어로졸로서 전달되는 장치를 포함한다. 유용한 DPI 약제는 일반적으로 크기가 0.5∼20 ㎛인 별개의 입자로 쉽게 분산되도록 제형화된다. 이 분말은 흡입을 통해 또는 가압 공기와 같은 약간의 외부 전달력을 통해 전달된다. DPI 제형은 일반적으로 단일 용량 단위로 포장되거나, 약제를 장치에 수동 전달하는 복수 투여량을 측정할 수 있는 저장용기 시스템을 이용한다.

DPI는 일반적으로 이용되는 투여량 전달 시스템을 기준으로 분류된다. 이러한 점에서, DPI의 주요한 두가지 유형은 단위 용량 전달 장치 및 대량 저장용기 전달 시스템을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "저장용기"란 포괄적인 의미로 사용될 것이며, 문맥상의 제한에 의한 다른 지시 사항이 없는 한 두 형태를 모두 포함하는 것으로 간주한다. 어떤 경우든지, 단위 용량 전달 시스템은 단일 단위로서 장치에 전달되는 분말 제형의 투여량을 요구한다. 이러한 장치를 이용할 경우, 제형은 수분 침투를 방지하기 위해 호일로 포장하거나 블리스터 스트립에 넣을 수 있는 투약용 웰에 미리 채워진다. 다른 단위 용량 포장은 경질 젤라틴 캡슐을 포함한다. DPI용으로 고안된 대부분의 단위 용량 용기는 고정된 부피 기법을 이용하여 충전한다. 결과적으로, 단위 포장 내로 정량해 넣을 수 있는 최소량에 대한 물리적인 제한(여기서는 밀도)이 존재하며, 이것은 분말 유동성 및 용적 밀도에 의해 지배된다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 분말은 선행 기술의 담체 제제가 안고 있는 많은 문제점들을 제거한다. 즉, 본 발명에 개시된 것과 같은 입자 크기, 공기역학적 특성, 형태 및 밀도, 습도 및 전하를 조절함으로써 DPI 성능을 향상시킬 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명은 약제 및 첨가제 또는 증량제가 바람직하게 천공된 미세구조체와 결합되거나 또는 이를 포함하는 조성물을 제공한다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 바람직한 조성물은 일반적으로 용적 밀도가 0.1 g/cm³ 미만 및 종종 0.05 g/cm³ 미만인 분말을 산출한다. 용적 밀도가 종래의 DPI 제형보다 낮은 분말을 제공하여야 훨씬 적은 양의 선택된 생물활성제를 단위 용량 용기에 채우거나 DPI계 저장용기를 통해 정량할 수 있다. 소량을 효과적으로 정량할 수 있는 능력은 호르몬과 같은 비교적 강력한 생물활성제의 경우에 중요하다. 뿐만 아니라, 담체 입자에 결합시키지 않고 입자를 효과적으로 전달할 수 있는 능력은 제품 제형화, 충전 과정을 단순화하고, 원치 않는 부작용을 감소시킨다.

본 발명의 분말은 비교적 다량의 생물활성제를 1회 작동으로 투여할 경우 특히 효과적이다. 선행 기술의 제형과는 달리, 분말화된 제형은 효과적인 충전 및 전달을 위해 증량제의 사용을 필요로 하지 않기 때문에, 중량 기준으로 더 많은 양의 생물활성제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 1회 작동으로 약 10 mg의 생물활성제를 전달하는 데 사용될 수 있다는 것이 중요하다. 이러한 장점들은 다른 화합성 제제만큼 강력하지 않을 수 있는 수동 면역화를 위한 면역조절제 또는 항체 등을 전달할 경우에 특히 중요하게 작용할 수 있다. 물론, 본 설명이 특별히 DPI의 사용에 관한 것이지만, 이러한 동일한 장점은 분산물 제형 및 MDI, 비측용 펌프 및 무침 주사기와 같은 다른 투여 형태에도 동일하게 적용될 수 있다.

전술한 장점을 외에도, 본 발명의 바람직한 구체예는 특히 DPI에 사용하기에 효과적이게 하는 바람직한 공기역학적 특성을 나타낸다. 더욱 구체적으로, 미립자의 천공된 구조 및 비교적 넓은 표면적은 미립자를 유사한 크기의 상대적으로 비천공된 입자보다 흡입시 기체의 흐름을 타고 더 쉽게 더 멀리 전달될 수 있게 한다. 이러한 고다공도 및 저밀도로 인하여, DPI를 이용한 천공된 미세구조체의 투여는 비도 내의 점막 표면 및 폐의 말초 영역과 같은 표적 부위에의 입자의 퇴적을 증가시키고, 그에 따라 인후 내 퇴적이 줄어든다. 이러한 입자 분포를 이용하면 전신 투여에 바람직한 투여된 제제의 깊은 폐 퇴적을 증가시킨다. 뿐만 아니라, 선행 기술의 DPI 제제보다 현저히 개선된 본 발명의 저밀도, 고다공성 분말은 바람직하게 담체 입자의 필요성을 제거한다.

F(ii). 안정화된 분산물

본 발명의 분말은 건조 분말 구성으로 사용하는 것과 함께, 안정화된 분산물을 제공하기 위해 본 발명의 분말을 현탁 매질에 혼입시켜 사용할 수도 있다. 바람직하게는 안정화된 분산물은 비수성 현탁 매질을 포함한다. 이 중에서도 특히, 안정화된 분산물은 MDI, 분무기 또는 스프레이병, 비측용 펌프, 무침 주사기, 연무기 또는 액체 투여량 점적주입(LDI 기법)을 이용하여 환자의 폐 기도에 생물활성제를 효과적으로 전달한다.

당업자라면, 본 발명의 분산물 또는 현탁액의 강화된 안정성은 현탁된 입자들간의 반데르발스 힘을 완화시키고, 현탁 매질과 입자들간의 밀도차를 감소시킴으로써 얻어진다는 것을 알 것이다. 본 발명의 교시에 따르면, 현탁액 안정성의 증가는 천공된 미세구조체를 조작하여 적합한 현탁 매질에 분산시킴으로써 얻을 수 있다. 전술한 바와 같이, 천공된 미세구조체는 유동 현탁 매질이 미립자의 경계를 자유롭게 투과하거나 관류할 수 있게 하는 세공, 공극, 공동, 흠 또는 기타 간극을 포함한다. 특히 바람직한 구체예는 공동이며 다공성인, 거의 벌집 또는 거품과 같은 형상의 천공된 미세구조체를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 천공된 미세구조체는 공동의 다공성 분무 건조 미소구체를 포함한다. 물론, 다른 구체예에서도 강화된 안정성은 비교적 비다공성인 고체 미립자를 포함하는 것을 비롯하여 미립자 성분(예, 계면활성제)의 선택을 통해 부여할 수 있다.

천공된 미세구조체를 현탁 매질(예, 히드로플루오로알칸 추진제 또는 액체 플루오로카본)에 첨가하면, 현탁 매질은 입자를 침투하여, 연속상과 분산상이 구별되지 않는 "균일 분산액"을 형성한다. 한정된 또는 "가상의(virtual)" 입자(즉, 초미립자 매트릭스에 의해 둘러싸인 부피를 포함)는 이들이 현탁된 매질의 거의 대부분을 차지하기 때문에, 입자 응집(침전) 추진력은 감소된다. 또, 한정된 입자와 연속상간의 밀도차는 미세구조체에 매질을 채움으로써 감소되어, 입자 크림화 또는 침강을 효과적으로 감소시킨다. 이와 같이, 본 발명의 미립자 및 안정화된 분산물은 특히 다수의 에어로졸화 기법, 예를 들면 MDI, 스프레이병을 이용한 분무화, 비측용 펌프, 에어로졸화 등에 적합하다. 뿐만 아니라, 안정화된 분산물은 비제한적으로 액체 투여량 점적주입, 무침 주사, 통상적인 주사 및 국소 도포를 비롯한 다른 투여 경로에도 적합하다.

선행 기술의 조성물과는 달리, 본 발명의 바람직한 현탁액은 입자간의 척력을 증가시키지 않고, 오히려 입자간의 인력을 감소시키도록 고안된다. 이러한 점에서, 비수성 매질의 기본적인 응집 추진력은 반데르발스 힘이라는 것을 알 것이다. 전술한 바와 같이, VDW 힘은 양자 역학 유래의 힘으로, 파동 쌍극자(즉, 유도된 쌍극자-유도된 쌍극자 상호작용)간의 인력으로 볼 수 있다. 분산력은 매우 근거리에 작용하며, 원자간의 거리의 육제곱의 크기이다. 두개의 거시적 물체가 서로 접근할 경우, 원자간의 분산 인력의 합은 증가한다. 결과적인 힘은 상당히 원거리에 작용하며, 상호작용하는 물체의 기하학적 구조에 의존한다.

더욱 구체적으로, 두개의 구 입자의 경우, VDW 힘의 크기, 즉 V_A의 크기는 하기 식에 의해 어림잡을 수 있다.

상기 식 중, A_eff는 입자와 매질의 성질을 나타내는 유효 하마커 상수이고, H₀는 입자간의 거리이며, R₁ 및 R₂는 구 입자 1 및 2의 반경이다. 유효 하마커 상수는 분산된 입자와 현탁 매질의 극성 차이에 비례한다:

상기 식 중, A_SM 및 A_PART는 각각 현탁 매질과 입자에 대한 하마커 상수이다. 현탁된 입자와 분산 매질의 성질이 유사해지면, A_SM 및 A_PART의 크기는 비슷해지고, A_eff 및 V_A는 더 작아진다. 즉, 현탁 매질과 관련된 하마커 상수와 분산 입자와 관련된 하마커 상수간의 차이를 감소시킴으로써, 유효 하마커 상수(및 이에 상응하는 반데르발스 인력)가 감소될 수 있다.

하마커 상수의 차이를 최소화하는 한가지 방법은 전술한 바와 같이 연속상 및 분산상이 실질적으로 구별되지 않는 "균일 분산액"을 만드는 것이다. 유효 하마커 상수를 감소시키기 위한 입자의 형태를 찾는 것 외에도, 구조적 매트릭스(천공된 미세구조체를 한정하는)의 성분을 바람직하게 선택하여 하마커 상수가 선택된 현탁 매질의 하마커 상수와 비교적 가깝게 한다. 이러한 점에서, 분산액 성분의 화합성을 결정하고 제제의 안정성 지수를 높이기 위해 현탁 매질과 미립자 성분의 하마커 상수의 실제 값을 이용할 수 있다. 대안으로, 측정 가능한 하마커 상수와 일치하지만 더욱 식별이 용이한 특징적인 물리적 값을 이용하여 비교적 양립가능한 미립자 또는 천공된 미세구조체 성분과 현탁 매질을 선택할 수 있다.

이러한 점에서, 많은 화합물의 굴절률값은 상응하는 하마커 상수와 비례하는 경향이 있음을 알게 되었다. 따라서, 측정이 용이한 굴절률값을 이용하여 현탁 매질과 입자 부형제의 조합물이 비교적 낮은 유효 하마커 상수 및 관련 안정성을 갖는 분산액을 제공할 것인가에 대한 매우 우수한 지표를 제공할 수 있다. 화합물의 굴절률은 광범위하게 이용되거나 쉽게 도출되기 때문에, 이러한 값을 이용하면 과도한 실험 없이 본 발명에 따른 안정화된 분산물을 형성할 수 있다. 단지 설명을 위한 목적으로, 본 발명의 분산물에 적합한 몇가지 화합물의 굴절률을 하기 표 1에 기재한다.

화합물	굴절률
HFA-134a	1.172
HFA-227	1.223
CFC-12	1.287
CFC-114	1.288
PFOB	1.305
만니톨	1.333
에탄올	1.361
n-옥탄	1.397
DMPC	1.43
플루로닉 F-68	1.43
수크로스	1.538
히드록시에틸전분	1.54
염화나트륨	1.544

상기 언급한 적합한 분산물 성분과 일관되게, 당업자들은 굴절률차가 약 0.5 미만인 성분으로 이루어진 분산물의 형성이 바람직하다는 것을 알 것이다. 즉, 현탁 매질의 굴절률이 입자 또는 천공된 미세구조체와 관련된 굴절률의 약 0.5 내에 속하는 것이 바람직할 것이다. 현탁 매질 및 입자의 굴절률은 직접 측정하거나 각각의 개별 상의 주요 성분의 굴절률을 이용하여 추정할 수 있다. 미립자 또는 천공된 미세구조체의 경우, 주성분은 중량 백분율을 기준으로 결정할 수 있다. 현탁 매질의 경우, 주성분은 일반적으로 부피 백분율 기준으로 도출된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 굴절률 차이값이 약 0.45, 약 0.4, 약 0.35 또는 약 0.3 미만인 것이 바람직하다. 더 낮은 굴절률 차이값이 더 큰 분산 안정성을 의미한다면, 특히 바람직한 구체예는 약 0.28, 약 0.25, 약 0.2, 약 0.15 또는 약 0.1의 지수 차이값을 포함한다. 당업자들은 본 발명에 따라 과도한 실험 없이 특히 적합한 부형제가 어느 것인지 결정할 수 있다. 바람직한 부형제의 최종 선택은 생체적합성, 조절 상태, 제조의 용이성, 비용을 비롯한 다른 요인들에 의해서도 영향을 받는다.

전술한 바와 같이, 천공된 및/또는 공동의 미세구조체를 이용하여 입자와 연속상간의 밀도차를 최소화하여, 현탁 매질의 대부분이 입자 부피로 이루어지게 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "입자 부피"란 혼입된 공동/다공성 입자(이들이 고체, 즉 입자 경계에 의해 한정되는 부피일 경우)에 의해 대체되는 현탁 매질의 부피를 말한다. 전술한 바와 같이, 이를 설명하면, 이러한 유체 충전 미립자 부피는 "가상 입자"로 볼 수 있다. 바람직하게, 생물활성제/부형제 외피 또는 매트릭스의 평균 부피(즉, 천공된 미세구조체에 의해 실질적으로 대체되는 매질의 부피)는 평균 입자 부피의 약 80% 미만(또는 가상 입자의 80% 미만)을 구성한다. 초미립자 매트릭스의 부피는 평균 입자 부피의 약 50%, 40%, 30% 또는 20% 미만을 구성하는 것이 더욱 바람직하다. 외피/기질의 평균 부피가 평균 입자 부피의 약 10%, 5%, 3% 또는 1% 미만을 구성하는 것이 더욱 더 바람직하다. 당업자라면, 이러한 매트릭스 또는 외피의 부피는 이것이 포함된 현탁 매질에 의해 대부분 결정되는 가상 입자 밀도에 일반적으로 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 알 것이다.

이러한 미세구조체의 사용은 반데르발스 인력을 실질적으로 제거함으로써 가상 입자의 겉보기 밀도가 현탁 매질의 밀도에 근접하게 한다. 뿐만 아니라, 전술한 바와 같이, 초미립자 매트릭스의 성분은, 가능한 한 다른 것들도 많이 고려하여, 현탁 매질의 밀도에 근접되도록 선택하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 가상 입자와 현탁 매질은 약 0.6 g/cm³ 미만의 밀도 차이값을 가질 것이다. 즉, 가상 입자의 평균 밀도(매트릭스 경계에 의해 한정됨)는 현탁 매질의 약 0.6 g/cm³ 내에 속할 것이다. 더욱 바람직하게, 가상 입자의 평균 밀도는 선택된 현탁 매질의 0.5, 0.4, 0.3 또는 0.2 g/cm³ 내에 속하는 것이다. 더욱 더 바람직한 구체예는 밀도차가 약 0.1, 0.05, 0.01 또는 0.005 g/cm³ 미만인 것이다.

전술한 장점들 외에도, 본 발명의 미립자를 사용하면 현탁액 내에 더 많은 부피의 입자 분획을 포함하는 분산물을 형성할 수 있다. 조밀 패킹에 가까운 부피 분율의 선행 기술 분산물 제형에서는 일반적으로 분산 점탄성이 급격히 증가하게 된다. 이러한 유형의 유동성은 MDI 또는 연무기에 사용하기에 적절하지 않다. 당업자라면, 입자의 부피 분율이 입자의 겉보기 부피(즉, 입자 부피) 대 시스템의 전체 부피의 비로 정의될 수 있다는 것을 알 것이다. 각 시스템은 최대 부피 분율 또는 패킹 분율을 갖는다. 예를 들면, 단순한 입방체 내에서의 입자는 0.52의 최고 패킹 분율에 달하는 반면, 면 중심 입방/육방정계에 가까운 패킹된 형태 내 입자는 약 0.74의 최고 패킹 분율에 달한다. 구가 아닌 입자 또는 다분산 시스템의 경우, 도출된 값이 다르다. 따라서, 최대 패킹 분율은 흔히 주어진 시스템의 실험적 파라미터로 간주된다.

여기서, 놀랍게도 본 발명의 바람직한 미립자는 조밀 패킹에 가까운 높은 부피 분율에서도 바람직하지 않은 점탄성을 나타내지 않는다는 것을 알게 되었다. 이와는 대조적으로, 고체 미립자를 포함하는 유사한 현탁액과 비교할 경우, 이들은 유동이 자유롭고, 거의 또는 전혀 항복 응력이 없는 저점도의 현탁액으로서 존재한다. 본 발명의 현탁액의 저점도는, 적어도 상당 부분, 유체가 충전된 공동의 다공성 입자간의 비교적 약한 반데르발스 힘에 기인하는 것으로 생각된다. 이와 같이, 선택된 구체예에서는 본 발명의 분산물의 부피 분율이 약 0.3 이상이다. 다른 구체예는 조밀 패킹 상태에 가까운 높은 값인, 0.3∼약 0.5 또는 0.5∼약 0.8의 패킹 값을 가질 수 있다. 뿐만 아니라, 부피 분율이 조밀 패킹에 가까워지면 입자 침강이 자연적으로 감소하는 경향이 있기 때문에, 상대적으로 농축된 분산물의 형성은 제형의 안정성을 더 증가시킬 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물이 비교적 농축된 현탁액을 형성하는 데 사용될 수 있지만, 안정화 인자는 훨씬 더 낮은 패킹 부피에서도 동등하게 작용하며, 이러한 분산물은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다. 이러한 점에서, 저 부피 분율을 포함하는 분산물은 종래 기법을 이용하여 안정화시키기가 매우 어렵다. 반대로, 본 발명의 생물활성제를 포함하는 미립자가 혼입된 분산물은 저 부피 분율에서도 특히 안정하다. 따라서, 본 발명은 안정화된 분산물, 특히 호흡기 분산물이 0.3 미만의 부피 분율로 형성되고 이용될 수 있게 한다. 몇몇 바람직한 구체예에서, 부피 분율이 약 0.0001∼0.3이고, 더욱 바람직하게는 0.001∼0.01이다. 또다른 바람직한 구체예는 부피 분율이 약 0.01∼약 0.1인 안정화된 분산물을 포함한다.

본 발명의 천공된 미세구조체는 또한 미분화된 생물활성제의 희석 현탁액을 안정화하는 데에도 사용될 수 있다. 이러한 구체예에서, 천공된 미세구조체는 현탁액 내 입자의 부피 분율을 증가시키기 위해 첨가되어서, 크림화 또는 침강에 대한 현탁액 안정성을 증가시킨다. 또한, 이러한 구체예에서, 혼입된 미세구조체는 미분화된 약물 입자의 조밀 접근(응집)을 막는 역할도 한다. 이러한 구체예에서 천공된 미세구조체가 생물활성제를 반드시 포함하는 것은 아니라는 것을 알 것이다. 오히려, 이것은 계면활성제를 비롯한 다양한 부형제만으로 제조될 수 있다.

당업자라면, 본 발명의 안정화된 현탁액 또는 분산물을 특정 현탁 매질 중에서의 미세구조체의 분산을 통해 제조한 다음, 용기 또는 저장용기에 위치시킬 수 있다는 것을 알 것이다. 이러한 점에서, 충분한 양의 성분들을 단순히 조합하여 원하는 최종 분산물 농도로 제조함으로써 본 발명의 안정화된 제제를 제조할 수 있다. 미세구조체는 물리적 에너지 없이 쉽게 분산되지만, 분산을 돕기 위해서 물리적 에너지(예, 초음파 분해의 도움)를 적용하는 것도 고려될 수 있다. 대안으로, 이 성분들을 단순히 현탁 또는 다른 형태의 교반에 의해 혼합할 수 있다. 이러한 과정은 현탁액 안정성에 미치는 습기의 역효과를 피하기 위해 무수 조건 하에 수행하는 것이 바람직하다. 일단 분산물이 형성되면, 이 분산물은 응집 및 침강에 대해 저항력이 증가한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 분산물은 안정화시키는 것이 바람직하다. 광범위한 의미에서, "안정화된 분산물"이란 생물활성제의 효과적인 전달을 위해 요구되는 정도로 응집, 응결 또는 크림화에 대해 저항성을 나타내는 분산물을 말한다. 뿐만 아니라, 개시된 분산물 및 분말이 실온에서 안정하여 활성을 유지하기 위해 냉장 또는 냉동시킬 필요가 없다는 것이 본 발명의 중요한 장점이다. 저장 수명을 연장시키는 것 외에도, 이러한 현저한 온도 안정성은 운송 및 투여 과정을 상당히 단순화시킨다.

당업자라면, 특정 분산액의 안정성을 측정하는 데 사용될 수 있는 몇가지 방법들이 있다는 것을 이해하겠지만, 본 발명의 목적에 바람직한 방법은 동적 광침강법을 이용하여 크림화 또는 침강 시간을 측정하는 것을 포함한다. 바람직한 방법은 현탁된 입자들을 원심 분리력에 적용시켜서 시간의 함수로서 현탁액의 흡광도를 측정하는 것을 포함한다. 흡광도의 급격한 감소로 그 현탁액의 안정성이 불량함을 확인한다. 당업자라면, 과도한 실험을 수행하지 않고 상기 절차를 특정 현탁액에 대해 적용할 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 위해서, 크림화 시간은 현탁된 약물 미립자가 현탁 매질 부피의 1/2로 크림화되는 데 걸리는 시간으로 정의한다. 유사하게, 침강 시간은 미립자가 액체 매질 부피의 1/2로 침강하는 데 걸리는 시간으로 정의될 수 있다. 전술한 광침강 기법 외에도, 제제의 크림화 시간을 측정하는 비교적 단순한 방법은 밀폐된 유리병 내의 미립자 현탁액을 제공하는 것이다. 이 병을 교반 또는 진탕시켜서 비교적 균질의 분산물을 만든 다음, 방치해 두었다가 적절한 기구를 이용하거나 또는 육안으로 관찰한다. 그 후, 현탁된 미립자가 현탁 매질 부피의 1/2로 크림화되는 데 걸리는 시간(즉, 현탁 매질의 최고 절반까지 상승하는 데 걸리는 시간) 또는 부피의 1/2 로 침강하는 데 걸리는 시간(즉, 매질의 하위 1/2로 침전되는 데 걸리는 시간)을 기록한다. 크림화 시간이 1분 이상인 현탁 제형이 바람직하며 적절한 안정성을 나타낸다. 크림화되는 데 걸리는 시간이 1분, 2분, 5분, 10분, 15분, 20분 또는 30분 이상인 안정화된 분산물이 더욱 바람직하다. 특히 바람직한 구체예에서, 안정화된 분산물의 크림화 시간은 약 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간 또는 3시간이다. 실질적으로 침강 시간이 동일한 것이 적합한 분산물이라는 표시가 된다.

또한, 다른 성분들도 본 발명의 안전화된 분산물 내에 포함될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들면, 최대 수명을 지니고 투여가 용이한 안정화된 분산물로 미세하게 조절하기 위해 삼투압제, 안정화제, 킬레이트제, 완충액, 점도 조절제, 염 및 당을 첨가할 수 있다. 이러한 성분들은 현탁 매질에 직접 첨가하거나, 천공된 미세구조체와 결합하거나 또는 여기에 혼입시킬 수 있다. 멸균성, 등장성 및 생체적합성 등을 고려하여 통상적인 첨가제를 본 발명의 조성물에 첨가할 수 있다. 당업자라면 이러한 물질의 사용법을 이해할 것이고, 이러한 물질의 구체적인 양, 비 및 유형을 과도한 실험없이 실험적으로 결정할 수 있다.

F(iii). 정량식 흡입기

전술한 바와 같이, 안정화된 분산물은 정량식 흡입기 사용과 같이 에어로졸화를 통해 환자의 비도 또는 폐 기도로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 안정화된 제제의 사용은 전술한 표적 부위에 우수한 투여량 재현성 및 향상된 퇴적을 제공한다. MDI는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 과도한 실험 없이 청구된 분산물을 투여하는 데 사용할 수 있다. 호흡 활성화 MDI뿐 아니라, 안정화된 분산물 및 본 발명과 함께 사용하기에 적합하게 개발되었고, 개발될 수 있는 다른 유형의 개선점을 포함하는 것도 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주한다.

MDI 캐니스터(canister)는 일반적으로 사용되는 추진제의 증기압을 견딜 수 있는 용기 또는 저장용기를 포함하는데, 예를 들면 플라스틱 또는 플라스틱 코팅 유리병, 또는 바람직하게는 선택적으로 양극 처리, 래커칠 및/또는 플라스틱 코팅될 수 있는 알루미늄캔과 같은 금속캔으로서, 여기서 용기는 계량 밸브로 폐쇄되어 있다. 계량 밸브는 작동 1회당 계량된 양의 제형을 전달하도록 고안된다. 이 밸브는 밸브를 통해서 추진제가 새는 것을 막기 위해 개스켓을 포함한다. 개스켓은 적절한 탄력을 지닌 물질, 예를 들면 저밀도 폴리에틸렌, 클로로부틸, 흑백 부타디엔-아크릴로니트릴 고무, 부틸 고무 및 네오프렌을 포함할 수 있다. 적절한 밸브는 에어로졸 산업분야에 잘 알려져 있는 제조업자에 의해 시판되는데, 예를 들면 발로이스, 프랑스(예, DF10, DF30, DF31/50 ACT, DF60), 백스팍 plc, LTK(예, BK300, BK356) 및 3M-네오테크닉 리미티드, LIK(예, 스프레이미서)가 있다.

각각의 충전된 캐니스터를, 사용하기 전에 적합한 채널링 장치 또는 작동기에 편리하게 장착하여 환자의 폐 또는 구강 또는 비강으로 약제를 투여하기 위한 정량식 흡입기를 형성한다. 적합한 채널링 장치는, 예를 들면 밸브 작동기 및 원통형 통로 또는 원추형의 통로를 포함하는데, 이 통로를 통해서 충전된 캐니스터로부터 약제가 계량 밸브(예, 마우스피스 작동기)를 통해 환자의 코 또는 입으로 전달될 수 있다. 정량식 흡입기는 1회 작동당 일정한 단위 투여량의 약제를 투여하도록 고안되는데, 예를 들면 1회 작동당 생물활성제 10∼5000 ㎍이다. 일반적으로, 단일 충전 캐니스터는 수십 또는 수백의 투약량을 제공한다.

추진제로서 작용하는 적절한 증기압을 지닌 임의의 생체적합성 현탁 매질을 MDI에 사용할 수 있다는 것이 본 발명의 장점이다. 특히 바람직한 현탁 매질은 정량식 흡입기에 사용하기에 적합한 것이다. 즉, 계량 밸브의 활성화와 이에 관련하여 압력이 방출되면 이들은 에어로졸을 형성할 수 있다. 일반적으로, 선택된 현탁 매질은 생체적합성(즉, 비교적 비독성)이고 생물활성제를 포함하는 현탁된 천공된 미세구조체와 비반응성이어야 한다. 현탁 매질은 천공된 미세구조체 내에 혼입된 임의의 성분의 실질적인 용매로서 작용하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명의 선택된 구체예는 플루오로카본(다른 할로겐으로 치환된 것을 포함함), 히드로플루오로알칸, 퍼플루오로카본, 탄화수소, 알콜, 에테르 또는 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택된다. 현탁 매질은 특수성을 부여하기 위해 선택된 다양한 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 MDI 현탁 매질 내에 사용하기에 특히 적합한 추진제는 실온의 압력 하에 액화될 수 있는 추진제 기체로서, 흡입 또는 국소 사용시 안전하고 독소가 없고 부작용이 없는 것이다. 이러한 점에서, 적합한 추진제는 정량식 흡입기가 작동하면 효과적으로 에어로졸을 형성할 수 있는 충분한 증기압을 갖는 탄화수소, 플루오로카본, 수소 함유 플루오로카본 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일반적으로 히드로플루오로알칸, 즉 HFA라고 불리는 추진제가 특히 바람직하다. 적합한 추진제의 예로는 단쇄 탄화수소, CH₂ClF, CCl₂F₂CHClF, CF₃CHClF, CHF₂CClF₂, CHClFCHF₂, CF₃CH₂Cl 및 CClF₂CH₃와 같은 C_1-4 수소 함유 클로로플루오로카본; CHF₂CHF₂, CF₃CH₂F, CHF₂CH₃ 및 CF₃CHFCF₃와 같은 C_1-4 수소 함유 플루오로카본(예, HFA); 및 CF₃CF₃ 및 CF₃CF₂CF₃와 같은 퍼플루오로카본을 포함한다. 단독 퍼플루오로카본 또는 수소 함유 플루오로카본을 추진제로 사용하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 추진제로는 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(CF₃CH₂F)(HFA-134a) 및 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로-n-프로판(CF₃CHFCF₃)(HFA-227), 퍼플루오로에탄, 모노클로로디플루오로메탄, 1,1-디플루오로에탄 및 이들의 조합물이 있다. 이 제형은 성층권 오존을 고갈시키는 성분을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 특히, 이 제형은 CCl₃F, CCl₂F₂ 및 CF₃CCl₃과 같은 클로로플루오로카본이 실질적으로 없는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예는 환경 친화적인 현탁 매질을 포함하지만, 전통적인 클로로플루오로카본 및 치환된 플루오르화 화합물 역시 본 발명의 교시에 따라 현탁 매질로서 사용할 수 있다. 이러한 점에서, FC-11(CCl₃F), FC-11B1(CBrCl₂F), FC-11B2(CBr₂ClF), FC12B2(CF₂Br₂), FC21(CHCl₂F), FC21B1(CHBrClF), FC-21B2(CHBr₂F), FC-31B1(CH₂BrF), FC113A(CCl₃CF₃), FC-122(CClF₂CHCl₂), FC-123(CF₃CHCl₂), FC-132(CHClFCHClF), FC-133(CHClFCHF₂), FC-141(CH₂ClCHClF), FC-141B(CCl₂FCH₃), FC-142(CHF₂CH₂Cl), FC-151(CH₂FCH₂Cl), FC-152(CH₂FCH₂F), FC-1112(CClF=CClF), FC-1121(CHCl=CFCl) 및 FC-1131(CHCl=CHF)는 모두 환경 문제를 일으킬 수 있지만 본 발명에 교시에 따른 적합한 물질이다. 이와 같이, 이 화합물들 각각을 단독으로 또는 다른 화합물(즉, 휘발성이 적은 플루오로카본)과 병용하여 사용하여 본 발명에 따른 안정화된 호흡기 분산물을 형성할 수 있다.

F(iv). 연무기

전술한 구체예에 따르면, 본 발명의 안정화된 분산물은 또한 에어로졸화된 약제를 제조하여 이를 필요로 하는 환자의 폐 기도를 통해 투여하기 위해 연무기와 함께 사용될 수 있다. 연무기는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 과도한 실험을 거치지 않고 청구된 분산물을 투여하는 데 쉽게 이용할 수 있다. 호흡 활성화 연무기 및 개발되었거나 개발될 수 있는 다른 유형의 개선점을 포함하는 연무기 역시 안정화된 분산물 및 본 발명에 적합하고 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주한다.

연무기는 에어로졸을 형성함으로써, 즉 대량 액체를 호흡 가능한 기체 내에 현탁된 소적으로 전환시킴으로써 작동한다. 여기서, 투여된(바람직하게는 폐 기도로) 에어로졸화된 약제는 생물활성제를 포함하는 천공된 미세구조체와 관련된 현탁 매질의 소적을 포함한다. 이러한 구체예에서, 본 발명의 안정화된 분산물은 일반적으로 연무기에 작동 가능하게 연결된 액체 저장용기 내에 배치된다. 제공되는 제제의 구체적 부피, 저장용기를 채우는 수단 등은 대개 개개의 연무기의 선택에 좌우되며, 이는 당업자의 인지 범위 내에 속한다. 물론, 본 발명은 1회 투약 연무기 및 반복 투약 연무기에 모두 적합하다.

본 발명은 바람직하게 플루오르화 화합물(즉, 플루오로케미칼, 플루오로카본 또는 퍼플루오로카본)을 포함하는 현탁 매질과의 안정화된 분산물을 제공함으로써 상술한 문제 및 기타 문제를 극복한다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예는 실온에서 액체인 플루오로케미칼을 포함한다. 전술한 바와 같이, 연속상으로서든 현탁 매질로서든지 간에 이러한 화합물을 사용하면 선행 기술의 액체 흡입 제제보다 많은 장점을 얻게 된다. 이러한 점에서, 많은 플루오로케미칼은 폐에서의 안전성 및 생체적합성이 입증되어 있다. 또한, 수용액과는 대조적으로, 폐 투여 후의 기체 교환에 부정적인 영향을 주지 않는다. 대조적으로, 이것은 실제적으로 기체 교환을 향상시킬 수 있으며, 독특한 습윤성 때문에 폐에 더 깊이 에어로졸화된 입자 흐름을 전달함으로써 원하는 약학적 화합물의 전신 전달을 향상시킨다. 또한, 비교적 비반응성인 플루오로케미칼의 성질은 혼입된 생물활성제의 분해(단백질 분해 또는 가수분해에 의함)를 지연시키는 작용을 한다.

어떤 경우든지, 연무기에 의한 에어로졸화는 일반적으로 증가된 소적 표면적을 제공하기 위해, 어떤 경우에는, 분무화 또는 에어로졸화된 약제의 운송을 위해 에너지의 공급을 필요로 한다. 에어로졸화의 일반적인 형태 중 하나는 유체 스트림을 노즐로부터 분사시켜서 소적이 형성되도록 하는 것이다. 연무화된 투여에 대해서는, 폐 내로 깊숙히 전달될 수 있을 정도로 충분히 작은 소적을 제공하기 위해서 일반적으로 추가 에너지를 제공한다. 따라서, 고속 기류 또는 압전기 결정에 의해 제공되는 것과 같은 추가적인 에너지가 요구된다. 흔히 사용되는 연무기의 두가지 유형은 제트 연무기와 초음파 연무기이며, 분무 과정 중 유체에 추가 에너지를 적용하는 전술한 방법에 의존한다.

체순환계를 향한 에어로졸화에 의한 생물활성제의 폐 전달에 대해서는 최근 연구가, 정량 용액이라고도 불리는 휴대용 초음파 연무기를 이용하는 것에 집중되었다. 이러한 장치는 일반적으로 단일 거환 연무기로 알려져 있으며, 1회 또는 2회의 호흡으로 폐 깊숙히 전달되기에 효과적인 입자 크기로 수용액 내의 단일 거환 약제를 에어로졸화시킨다. 이 장치들은 3개의 광범위한 종류로 나뉜다. 첫번째 종류는 Mutterlein 등의 문헌[J. Aerosol Med. 1988; 1:231]에 기술된 것과 같은 순수한 압전기적 단일 거환 연무기를 포함한다. 또다른 종류로는, 미국 특허 제3,812,854호에 기술된 것과 같은 마이크로채널 압출성형 단일 거환 연무기를 통해 원하는 에어로졸을 생성할 수 있다. 마지막으로, 세번째 종류는 환형 가압 단일 거환 연무기를 개시하는 Robertson 등의 특허(WO 92/11050)에 예시된 장치를 포함한다. 상기 참조 문헌 각각은 모두 본 명세서에서 참고 인용한다. 대부분의 장치는 수동으로 조작되지만, 호흡으로 작동되는 장치도 일부 존재한다. 호흡 작동 장치는 장치가 환자가, 회로를 통해 흡입하는 것을 감지할 경우 에어로졸을 방출함으로써 작동한다. 호흡 작동 연무기는 또한 환자를 위한 호흡 기체를 포함하는 기류로 에어로졸을 방출하기 위해 환기장치 회로 상의 라인 내에 위치될 수 있다.

사용되는 연무기의 유형에 관계없이, 생체적합성의 비수성 화합물을 현탁 매질로서 사용할 수 있다는 것이 본 발명의 장점이다. 바람직하게, 에너지를 적용하면 이것들은 에어로졸을 형성할 수 있다. 일반적으로, 선택된 현탁 매질은 생체적합성(즉, 비교적 비독성)이고, 생물활성제를 포함하는 현탁된 천공된 미세구조체와 비반응성이어야 한다. 바람직한 구체예는 플루오로케미칼, 플루오로카본(다른 할로겐으로 치환된 것 포함), 퍼플루오로카본, 플루오로카본/탄화수소 디블록, 탄화수소, 알콜, 에테르 또는 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 현탁 매질을 포함한다. 이러한 현탁 매질 특수성을 부여하기 위해 선택된 다양한 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다는 것을 알 것이다.

본 발명의 교시에 다르면, 현탁 매질은 탄화수소, 플루오로카본 또는 탄화수소/플루오로카본 디블록을 비롯한 다수의 상이한 화합물 중 1종 이상을 포함한다. 일반적으로 고려되는 탄화수소 또는 고도로 플루오르화되거나 퍼플루오르화된 화합물은 직쇄, 분지쇄 또는 환형의 포화되거나 불포화된 화합물일 수 있다. 이러한 플루오로케미칼 및 탄화수소의 통상적인 구조적 유도체 또한 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다. 이러한 완전 또는 부분적 플루오르화 화합물의 화합물을 포함하는 선택된 구체예는 하나 이상의 헤테로 원자 및/또는 브롬이나 염소 원자를 포함할 수 있다. 바람직하게, 이러한 플루오로케미칼은 2∼16개의 탄소 원자를 포함하며, 선형, 시클릭 또는 폴리시클릭 퍼플루오로알칸, 비스(퍼플루오로알킬)알켄, 퍼플루오로에테르, 퍼플루오로아민, 퍼플루오로알킬 브로마이드 및 퍼플루오로알킬 클로라이드, 예컨대 디클로로옥탄을 포함하는데, 이에 국한되는 것은 아니다. 현탁 매질에 사용하기에 특히 바람직한 플루오르화 화합물은 퍼플루오로옥틸 브로마이드 C₈F₁₇Br(PFOB 또는 퍼플루브론), 디클로로플루오로옥탄 C₈F₁₆Cl₂ 및 히드로플루오로알칸 퍼플루오로옥틸 에탄 C₈F₁₇C₂H₅(PFOE)를 포함할 수 있다. 다른 구체예에 대해서는, 현탁 매질로서 퍼플루오로헥산 또는 퍼플루오로펜탄을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

더욱 일반적으로, 본 발명에 사용될 수 있는 플루오로케미칼은 일반적으로 할로겐화 플루오로케미칼(즉, C_nF_2n+1X, XC_nF_2nX, 여기서 n=2-10, X=Br, Cl, I) 및 특히 1-브로모-F-부탄 n-C₄F₉Br, 1-브로모-F-헥산(n-C₆F₁₃Br), 1-브로모-F-헵탄(n-C₇F₁₅Br), 1,4-디브로모-F-부탄 및 1,6-디브로모-F-헥산을 포함한다. 기타 유용한 브롬화된 플루오로케미칼은 미국 특허 제3,975,512호에 개시되어 있으며, 본 명세서에서 참고 인용한다. 퍼플루오로옥틸 클로라이드(n-C₈F₁₇Cl), 1,8-디클로로-F-옥탄(n-ClC₈F₁₆Cl), 1,6-디클로로-F-헥산(n-ClC₆F₁₂Cl) 및 1,4-디클로로-F-부탄(n-ClC₄F₈Cl)과 같은 클로라이드 치환기를 갖는 플루오로케미칼 또한 바람직하다.

플루오로카본, 플루오로카본-탄화수소 화합물, 및 에스테르, 티오에테르 및 아민과 같은 다른 결합기를 포함하는 할로겐화된 플루오로케미칼 또한 본 발명의 현탁 매질로서 사용하기에 적합하다. 예를 들면, 화학식 C_nF_2n+1OC_mF_2m+1 또는 C_nF_2n+1CH=CHC_mF_2m+1(예, C₄F₉CH=CHC₄F₉(F-44E), i-C₃F₉CH=CHC₆F₁₃(F-i36E) 및 C₆F₁₃CH=CHC₆F₁₃(F-66E))(식 중, n 및 m은 같거나 다르고, n 및 m은 약 2∼약 12의 정수임)을 갖는 화합물이 본 발명의 교시에 따라 적합하다. 유용한 플루오로케미칼-탄화수소 디블록 및 트리블록 화합물은 화학식이 C_nF_2n+1-C_mH_2m+1 및 C_nF_2n+1C_mH_2m+1(식 중, n은 2∼12이고, m은 2∼16) 또는 C_pH_2p+1-C_nF_2n-C_mH_2m+1(식 중, p는 1∼12이고, m는 1∼12이며, n은 1∼12임)인 화합물을 포함한다. 이러한 유형의 바람직한 화합물은 C₈F₁₇C₂H₅, C₆F₁₃C₁₀H₂₁, C₈F₁₇C₈H₁₇, C₆F₁₃CH=CHC₆H₁₃ 및 C₈F₁₇CH=CHC₁₀H₂₁을 포함한다. C_nF_2n+1O-C_mF_2mOC_pH_2p+1(식 중, n, m 및 p는 1∼12임)는 물론, 치환 에테르 또는 폴리에테르(즉, XC_nF_2nOC_mF_2mX, XCFOC_nF_2nOCF₂X[식 중, n 및 m은 1∼4이고, X는 Br, Cl 또는 I임]) 및 플루오로케미칼-탄화수소 에테르 디블록 또는 트리블록(즉, C_nF_2n+1-O-C_mH_2m+1[식 중, n은 2∼10이고, m은 2∼16임) 또는 C_pH_2p+1-O-C_nF_2n-O-C_mH_2m+1(식 중, p는 2∼12이고, m은 1∼12이고, n은 2∼12임) 또한 사용될 수 있다. 또한, 용도에 따라, 퍼플루오로알킬화 에테르 또는 폴리에테르도 청구된 분산액에 적합할 수 있다.

C₁₀F₁₈(F-데칼린 또는 퍼플루오로데칼린), 퍼플루오로퍼히드로페난트렌, 퍼플루오로테트라메틸사이클로헥산(AP-144) 및 퍼플루오로 n-부틸데칼린과 같은 폴리시클릭 및 시클릭 플루오로케미칼 역시 본 발명의 범위에 속한다. 그 밖의 유용한 플루오로케미칼은 F-트리프로필아민("FTPA") 및 F-트리부틸아민("FTBA"), F-4-메틸옥타히드로퀴놀리진("FMOQ"), F-N-메틸-데카히드로이소퀴놀린("FMIQ"), F-N-메틸데카히드로퀴놀린("FHQ), F-N-사이클로헥실피롤리딘("FCHP") 및 F-2-부틸테트라히드로푸란("FC-75" 또는 "FC-77")과 같은 퍼플루오르화 아민을 포함한다. 플루오르화 화합물로 유용한 또다른 화합물로는 퍼플루오로페난트렌, 퍼플루오로메틸데칼린, 퍼플루오로디메틸에틸사이클로헥산, 퍼플루오로디메틸데칼린, 퍼플루오로디에틸데칼린, 퍼플루오로메틸아다만탄, 퍼플루오로디메틸아다만탄을 들 수 있다. 퍼플루오로옥틸 하이드라이드와 같은 비플루오르 치환기를 갖는 다른 플루오로케미칼 및 탄소 원자수가 상이한 유사 화합물 역시 유용하다. 당업자들은 다른 다양하게 변형된 플루오로케미칼이 본 명세서에서 사용되는 플루오로케미칼의 광범위한 정의에 속하고 본 발명에 사용하기에 적합하는 것을 알 것이다. 이와 같이, 전술한 화합물 각각은 단독으로, 또는 다른 화합물과 함께 사용되어 본 발명의 안정화된 분산물을 형성할 수 있다.

현탁 매질로서 유용할 수 있는 또다른 부류의 플루오로카본 또는 플루오르화 화합물의 비제한적 예로는 플루오로헵탄, 플루오로사이클로헵탄, 플루오로메틸사이클로헵탄, 플루오로헥산, 플루오로사이클로헥산, 플루오로펜탄, 플루오로사이클로펜탄, 플루오로메틸사이클로펜탄, 플루오로디메틸사이클로펜탄, 플루오로메틸사이클로부탄, 플루오로디메틸사이클로부탄, 플루오로트리메틸사이클로부탄, 플루오로부탄, 플루오로사이클로부탄, 플루오로프로판, 플루오로에테르, 플루오로폴리에테르 및 플루오로트리에틸아민을 들 수 있다. 이러한 화합물들은 일반적으로 환경 친화적이며, 생물학적으로 비반응성이다.

에너지를 적용하면 에어로졸을 형성할 수 있는 임의의 액체를 연무기와 함께 사용할 수 있지만, 선택된 현탁 매질은 약 5 대기압 미만의 증기압을 갖는 것이 바람직하고, 약 2 대기압 미만이 더욱 바람직할 것이다. 다른 언급이 없다면, 본 발명에서 언급하는 모든 증기압은 약 25℃에서 측정된다. 다른 구체예에서, 바람직한 현탁 매질 화합물의 증기압은 약 5 토르∼약 760 토르, 더욱 바람직한 화합물의 증기압은 약 8 토르∼약 600 토르이지만, 더욱 더 바람직한 화합물의 증기압은 약 10∼약 350 토르이다. 이러한 현탁 매질은 압축 공기 연무기, 초음파 연무기 또는 기계적 분무기와 함께 사용하여 효과적인 환기 치료를 제공할 수 있다. 또한, 더욱 휘발성이 강한 화합물을 더 낮은 증기압의 성분들과 혼합하여 분산된 생물활성제의 안정성을 더욱 향상시키고 생체이용률을 더욱 강화시킬 수 있는 특정 물리적 특성을 갖는 현탁 매질을 제공할 수 있다.

연무기에 관한 본 발명의 다른 구체예는 주변 조건(즉, 1 기압) 하에 선택된 온도에서 비등하는 현탁 매질을 포함한다. 예를 들면, 바람직한 구체예는 0℃ 이상, 5℃ 이상, 10℃ 이상, 15℃ 이상 또는 20℃ 이상에서 비등하는 현탁 매질을 포함한다. 다른 구체예에서, 이 현탁 매질 화합물은 25℃ 이상 또는 30℃ 이상에서 비등할 수 있다. 또다른 구체예에서, 선택된 현탁 매질은 인간 체온(즉, 37℃) 이상, 45℃, 55℃ , 65℃, 75℃, 85℃ 이상 또는 100℃ 이상에서 비등할 수 있다.

F(v). 직접 투여

본 발명의 안정화된 분산물을 MDI 및 연무기와 함께 사용하여 다양한 투여 경로를 이용하여 다양한 표적 부위로 생물활성제를 투여할 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들면, 본 발명의 조성물을 액체 투여량 점적주입(LDI) 기법과 병용하여 폐에 직접 전달할 수 있다. 대안으로, 안정화된 분산물은 비측용 펌프, 스프레이병 또는 분무기를 이용하여 비도 내의 점막 표면에 효과적으로 전달할 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 분산물을 통상적인 주사를 이용하거나 또는 압축 기체를 이용한 무침 주사기를 통해 표적 부위(예, 근육내 또는 피내)에 투여할 수 있다. 후자의 경우는 무침 접종의 경우 특히 바람직하다. 또다른 구체예는 눈이나 귀 또는 더욱 바람직하게는 점막 표면, 예를 들면 비뇨생식관이나 위장관 내 점막 표면과 같은 표적 부위로 분산물을 국소 전달하는 것에 관한 것이다. 이러한 기법은 혼입된 생물활성제의 침투를 강화시키기 위해 이온이동법을 추가로 이용할 수 있다. 어떤 경우든지, 안정화된 분산물은 혼입된 제제의 활성을 보존하면서 우수한 투여량 재현성을 제공한다.

당업자들은 전술한 전달 기법에 적합한 현탁 매질이 연무기와 함께 사용하는 상기 언급한 현탁 매질과 유사하다는 것을 알 것이다. 즉, 안정화된 분산물은 플루오로케미칼, 플루오로카본(다른 할로겐으로 치환된 것을 포함), 퍼플루오로카본, 플루오로카본/탄화수소 디블록, 탄화수소, 알콜, 에테르 또는 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 현탁 매질을 포함하는 것이 바람직하다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 목적을 위해서 이러한 전달 기법에 적합한 현탁 매질은 연무기에 사용한다고 전술한 것과 동일하다. 특히 바람직한 구체예에서, 선택된 현탁 매질은 주변 조건 하에 액체인 플루오로케미칼을 포함한다.

액체 투여량 점적주입은 안정화된 분산물을 폐에 직접 투여하는 것을 포함한다. 이러한 점에서, 생물활성 화합물을 폐로 직접 투여하는 것은 폐 환부의 나쁜 혈관 순환이 약물의 정맥 전달 유효성을 감소시키는 질환의 치료에 특히 효과적이다. LDI에 대해서는, 안정화된 분산물을 부분적 액체 환기 또는 총 액체 환기와 함께 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 투여 전, 중 또는 후에 생리학적으로 허용가능한 기체(예, 산화질소 또는 산소)의 치료적 유효량을 약학적 미세분산물 내로 주입하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

LDI에 대해서는, 본 발명의 분산물을 폐 전달 도관을 이용하여 폐로 투여할 수 있다. 당업자들은 본 명세서에서 사용되는 "폐 전달 도관"이 폐 내로 액체를 점적주입 또는 투여하기 위한 임의의 장치나 기구 또는 이들의 부품을 포함하는 것으로 광범위하게 간주될 수 있음을 알 것이다. 이러한 점에서, 폐 전달 도관 또는 전달 도관은 본 발명의 분산물을 이것을 필요로 하는 환자의 폐 기도 부위의 적어도 일부분에 투여 또는 점적주입할 수 있는 임의의 구경, 루멘, 카테터, 튜브, 도관, 주사기, 작동기, 마우스피스, 기관내관 또는 기관지경을 의미하는 것으로 간주된다. 전달 도관은 액체 환기장치 또는 기체 환기장치이거나 관련된 것일 수 있음을 알 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 전달 도관은 기관내경 또는 기관지경을 포함한다.

안정화된 분산물은 환자의 폐의 기능적 잔류능을 기초로 투여할 수 있지만, 선택된 구체예는 훨씬 더 적은 부피(예, 밀리리터 또는 그 이하)의 폐 투여를 포함함을 알 것이다. 예를 들면, 치료할 질환에 따라, 투여 부피는 1, 3, 5 10, 20, 50, 100, 200 또는 500 밀리리터일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 액체 부피는 0.25 또는 0.5 퍼센트 FRC 미만이다. 특히 바람직한 구체예에서는, 액체 부피가 0.1 퍼센트 FRC 이하이다. 비교적 소량의 안정화된 분산물을 투여하면, 현탁 매질(특히 플루오로케미칼)의 습윤성 및 분산성이 폐에서의 생물활성제의 균일한 분포를 촉진할 수 있음을 알 것이다. 그러나, 다른 구체예에서, 0.5, 0.75 또는 0.9 퍼센트 FRC 이상의 부피의 현탁액을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 물론, 적어도 몇몇 플루오로케미칼이 지닌 특수한 습윤성 및 분산성이 비도와 같은 다른 점막 표면에 투여하기에 특히 적합하게 한다.

당업자들은 본 발명의 분말 및 안정화된 분산물이 멸균된, 미리 포장된 형태 또는 키트 형태로 의사 또는 기타 건강 관리 전문가에서 편리하게 공급될 수 있다는 것을 알 것이다. 더욱 구체적으로, 이 제형은 안정한 분말 또는 환자에게 즉석해서 투여할 수 있는 예비 성형 분산물로서 제공될 수 있다. 반대로, 이것들은 즉석해서 혼합할 수 있는 분리된 형태로서 제공될 수 있다. 즉석해서 사용할 수 있는 형태로 제공될 경우, 분말 또는 분산물은 단일 사용 용기 또는 저장용기뿐 아니라 반복 사용 용기 또는 저장용기에 포장할 수 있다. 어느 경우든지, 용기 또는 저장용기는 선택된 흡입 또는 투여 장치와 함께 사용할 수 있으며, 본 발명에 기술된 대로 사용될 수 있다. 개별 성분으로서 제공될 경우(예, 분말화된 미소구체 및 순수 현탁 매질로서), 사용하기 전 어느 때라도 지시하는 대로 용기 내 내용물을 간단히 배합함으로써 안정화된 제제를 제조할 수 있다. 또, 이러한 키트는 다수의 즉석 혼합 단위 또는 미리 포장된 투약 단위를 포함하기 때문에 사용자가 필요에 따라 투여할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 미세구조체 내에 제형화한 후 기능성 HA 펩티드(인풀루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 잔기 110∼120)의 농도를 그래프로 나타낸 것이다.

도 2는 미세구조체 내에 제형화한 항원이 T-세포를 활성화시키기 위한 세포내 프로세싱을 필요로 하지 않는다는 것을 나타낸다.

도 3은 비도 내로 투여되는 미립자 및 정맥 주사를 이용하여 전달된 HA 펩티드의 혈장 농도를 그래프로 나타내어 비교한다.

도 4는 선택된 대조군과 함께, 본 발명에 따른 미립자 내에 제형화한 인간 IgG의 검량선을 나타낸다.

도 5A 및 도 5B는 IgG 제형화 초미립자 및 HA 펩티드 제형화 초미립자 각각의 방출 역학을 그래프로 나타낸 것이다.

도 6A 및 도 6B는 제형화한 미립자를 이용한 기관내 및 비도 투여 후의 혈장내 IgG의 지속성을 나타낸다.

도 7A 및 도 7B는 본 발명에 따라 제형화한 초미립자로서 기관내에 투여된 IgG의 전신 및 국소 항체 반응을 각각 나타낸 것이다.

도 8은 IgG 초미립자를 마우스의 기관내에 투여한 후 T 세포 반응의 지표인 사이토카인의 농도를 그래프로 나타낸 것이다.

도 9는 기관내에 투여된 IgG 초미립자에 대한 쥐 항체 반응을 나타낸다.

도 10A 및 도 10B는 IgG 초미립자를 복강내에 투여한 후 각각 7일 및 14일 이 지난 후의 마우스의 항체 역가를 나타낸다.

도 11A, 도 11B 및 도 11C는 각각 초미립자로 제형화한 바이러스, 바이러스 대조군에 대한 T 세포 반응과 제형화 및 비제형화 바이러스의 감염성 역가를 나타낸다.

도 12는 초미립자 제형 생 인플루엔자 바이러스 및 미립자 제형 사 인플루엔자 바이러스를 비내에 투여한지 7일 및 14일 후 이에 대한 쥐 항체 반응을 나타낸다.

도 13A, 도 13B 및 도 13C는 각각 대조군 항원과 함께 바이러스 초미립자 또는 생 바이러스 또는 사 바이러스를 비내 접종한 후 T 세포의 반응의 지표인 인자들의 쥐 체내 농도를 나타낸다.

도 14A 및 도 14B는 각각 생 바이러스 및 사 바이러스를 포함하는 초미립자를 비내에 접종한 마우스의 바이러스 쉐딩 및 체중 변화량을 나타낸다.

도 15는 송아지 감마 글로불린을 포함하는 제형화된 미소구체의 정량식 흡입기로부터의 효율적인 전달을 보여주는 시험관내 앤더슨 캐스캐이드 충격기 실험 결과이다.

하기 실시예를 참조하면 전술한 설명이 더욱 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 단지 본 발명의 바람직한 실시 방법의 대표예일 뿐이며, 어떤 방식으로든지 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해 또는 해석되어서는 안된다.

I. 분무 건조에 의한 HA 펩티드 공동 다공성 입자의 제조

하기 조건 하에 B-191 미니 스프레이-드라이어(비히, 플라빌, 스위스)를 이용한 분무 건조 기법에 의해 공동 다공성 HA 110-120 펩티드(인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 아미노산 잔기 110-120)를 제조하였다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 51℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 ℓ/시간. 공급물은 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 제제 A 및 B를 혼합하여 제조하였다. 입자의 수집을 돕기 위해서 집진장치의 출구에 150망 스테인레스 강철 스크린을 배치하였다.

제제 A: 탈이온수 5 g에 HA 110-120 펩티드(카이론 코포레이션, 에머리빌, CA) 18 mg 및 히드록시에틸 전분(아지노모토, 일본) 1 mg을 용해시켰다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 수중 플루오로카본 에멀젼을 다음과 같이 제조하였다. 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여 8000 rpm으로 2∼5분 동안(온도 = 60∼70℃) 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루트비히스하펜, 독일) 0.3 g을 고온 탈이온수(온도 = 50∼60℃) 33 g 중에 균질화시켰다. 혼합하는 동안 퍼플루브론(퍼플루오로옥틸 브로마이드: 아토켐, 파리, 프랑스) 8 g을 적가하였다. 여기에 플루오로카본을 첨가한 후, 이 에멀젼을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그 후, 형성된 조제 에멀젼을 18,000 psi의 고압 균질화기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 B의 1/8을 분리하여 제제 A에 첨가하였다. 이렇게 얻은 HA 펩티드/퍼플루브론 에멀젼 공급 용액을 전술한 조건 하에 분무 건조기에 공급하였다. 분말을 집진장치에 모으고, 퍼플루브론을 이용하여 거름 스크린을 세정하여 수집용 병에 모았다. 이어서, 퍼플루브론 중의 HA 현탁액을 -60℃에서 냉동 및 동결 건조시켰다. 자유 유동성 백색 분말을 얻었다.

II. HA 펩티드를 함유하는 공동 다공성 입자의 시험관내 활성

풀모스피어(HA-Pul) 내의 HA 펩티드와 순수 HA 펩티드의 항원 제시 세포를 활성화시키는 기능을 비교하였다. 실시예 I의 HA 펩티드 풀모스피어(PulmoSphere)를 5 mg/ml 농도의 멸균 PBS(제형 중량/부피)와 항온처리하였다. 형성된 HA-Pul-PBS 용액의 연속 희석액을 완전 RPMI-10% FCS 중의 M12 항원 제시 세포(1 x 10⁴/웰) 및 HA 특이적 TcH(2 x 10⁴/웰)를 포함하는 마이크로웰에 첨가하였다. TcH 세포주는 IL-2 프로모터에 의해 조절되는 리포터 유전자(IL-2/-gal)를 보유한다.

37℃에서 12시간 동안 항온처리한 후에, 마이크로웰 플레이트를 윈심분리하고, 4℃에서 5분 동안 세포를 파라포름알데히드-글루타르알데히드로 고정시킨 다음 PBS로 세정하고, X-gal 기질을 첨가하여 밤새 두었다. 활성화된 TcH 수/500 세포/웰을 광학 현미경을 이용하여 측정하였다. 세포 총수를 청색 세포의 비로 곱하여 활성화된 TcH 총수/웰을 계산하였다. 도 1에 도시된 결과는 제형 내의 활성 펩티드의 존재를 증명한다. 표준 활성화 곡선(HA 염수)과의 비교는 활성 펩티드의 농도가 약 5%(wt/wt)임을 보여주었고, 이는 역상 HPLC 측정치와 일치하였다.

III. HA 펩티드 풀모스피어 작용 메카니즘

T 세포 에피토프 HA 110-120(HA-Pul)을 함유하는 풀모스피어 미립자의 내부화 및 프로세싱 요건을 관찰하였다. 퍼플루브론에 현탁된 HA-Pul(500 nM/웰 HA 110-120 펩티드)을 공기중에서 건조시키고, 완전 RPMI-10% FCS 중의 특이적 TcH 세포의 존재 하에 비고정 또는 파라포름알데히드로 고정된 M12 항원 제시 세포(APC)와 항온처리하여, 유사한 농도의 PBS에 현탁된 HA-Pul 및 순수 HA 펩티드와 비교하였다. 세포내 프로세싱을 요하지 않는 수크로스 정제 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스(15 g/ml)를 양성 대조군으로 사용하였다. 음성 대조군은 NP 147-155 펩티드 제형, 비제형화 NP 펩티드 및 무관한 바이러스를 포함하였다. 실시예 II에 기재된 세포수와 배양 조건에 따라 수행한 다음, 세포를 고정시켜서 X-gal 기질에 노출시켰다. 이 결과를 활성화된 TcH의 백분율로 나타내었다.

도 2는 고정 및 비고정된 APC가 순수 HA 펩티드 및 HA-Pul을 제시할 수 있음을 보여준다. 대조적으로, 생 APC만이 바이러스 내용물로부터의 HA 펩티드를 제시할 수 있었다. 게다가, B/Lee 바이러스는 물론, 제형화 또는 순수 NP 펩티드는 특이적 TcH를 활성화시키지 않았다. 이 결과는 HA-Pul의 내부화 및 프로세싱이 TcH 활성화의 필수조건이 아님을 암시한다. 오히려, HA-펩티드는 풀모스피어로부터 쉽게 방출되어서 M12 APC 상의 MHC 클래스 II 분자(I-E^d)에 결합하여 TCR을 끌어들여 TcH를 활성화시킨다. 이 프로세싱 단계는 PBS 또는 퍼플루브론 중에서 전달된 HA-Pul은 물론 순수 HA 펩티드의 경우에도 관찰되었다. 뿐만 아니라, 이 결과는 풀모스피어 내로 제형화하고 퍼플루브론 중에서 안정화된 HA 110-120 펩티드가 이것의 면역원성을 보유한다는 것을 입증한다.

IV. 분무 건조에 의한 형광 표지된 공동 다공성 HA 펩티드 입자의 제조

하기 조건 하에 B-191 미니 스프레이-드라이어(뷔히, 플라빌, 스위스)를 이용한 분무 건조 기법에 의해 공동 다공성 HA-플루오로세인 110-120 펩티드/텍사스 레드 DHPE 입자를 제조하였다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 51℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 ℓ/시간. 공급물은 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 용액 A 및 B를 혼합하여 제조하였다. 입자의 수집을 돕기 위해서 집진장치의 출구에 150망 스테인레스 강철 스크린을 배치하였다.

제제 A: 탈이온수 5 g에 HA-플루오로세인 110-120 펩티드(카이론 코포레이션, 에머리빌, CA) 20 mg 및 히드록시에틸 전분(아지노모토, 일본) 1 mg을 용해시켰다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 수중 플루오로카본 에멀젼을 다음과 같이 제조하였다. 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루트비히스하펜, 독일) 0.3 g, 형광 염료 0.3 mg, 텍사스 레드 DHPE(몰리큘러 프로브즈, 유진, OR, 3 mg)를 먼저 클로로포름에 용해시켰다. 그 후, 부치 로토뱁(Buchi RotoVap)을 이용하여 클로로포름을 제거하였다. 이어서, E100-3/텍사스 레드 DHPE 박막을 33 ㎖의 고온 탈이온수(60∼70℃) 내에 분산시켰다. 그 후, 계면활성제를 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여 10,000 rpm으로 약 2분 동안(온도 = 50∼60℃) 수성층내에서 더 가공하였다. 혼합하는 동안 퍼플루브론(아토켐, 파리, 프랑스) 8 g을 적가하였다. 여기에 플루오로카본을 첨가한 후, 이 에멀젼을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그 후, 형성된 조제 에멀젼을 18,000 psi의 고압 균질화기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 B의 1/8을 분리하여 제제 A에 첨가하였다. 이렇게 얻은 HA 플루오로세인 펩티드/텍사스 레드 DHPE/퍼플루브론 에멀젼 공급 용액을 전술한 조건 하에 분무 건조기에 공급하였다. 분말을 집진장치에 수집하고, 퍼플루브론을 이용하여 거름 스크린을 세정하여 수집용 병에 모았다. 이어서, 퍼플루브론 중의 HA 현탁액을 -60℃에서 냉동 및 동결 건조시켰다. 자유 유동성 형광 암갈색 분말을 얻었다.

V. 형광 표지된 HA 풀모스피어의 생체이용률

실시예 IV에서와 같이 제조한 플루오로세인-HA 펩티드(20% wt/wt) 풀모스피어(f-HA-Pul)를 포함하는 제형을 퍼플루브론에 현탁시켰다. 메토페인으로 마취시킨 마우스의 비내에 70 g의 펩티드 투여량에 상응하는 70 ℓ부피의 퍼플루브론 내 f-HA-Pul을 접종하였다. 헤파린 처리된 튜브에 안구 채혈을 통해 혈액 시료를 모아서, 혈장을 분리하고 형광측정기를 이용하여 펩티드 농도를 측정하였다. 대조군에는, 70 ℓ의 멸균 염수 중의 70 g의 f-HA 펩티드를 정맥 투여하였다(모든 군에 대해서 n=4).

도 3은 시간에 따른 f-HA 펩티드의 혈청 농도를 나타낸다. 비내로 전달된 f-HA 펩티드의 절대 생체이용률은 약 5%였으며, T_max는 20분 후였다. 이러한 두가지 투여 경로의 약물동력학 프로필은 서로 달랐으며, 정맥 투여시에는 연속적인 대수 감소, 비내 투여시에는 일시적 증가에 이은 지수 감소를 나타내었다. f-HA는 뇨로 배출 제거되었으며(데이타는 기재하지 않음), 모두 제거되는 데 6시간이 걸렸다.
이 실시예는 Pul 내에 제형화된 T 세포 에피토프(분자량이 약 1.4 kDa)의 비내 투여가 전신 전달에 적합하다는 것을 보여준다.

VI. 분무 건조에 의한 인간 IgG 공동 다공성 입자의 제조

하기 조건 하에 B-191 미니 스프레이-드라이어(뷔히, 플라빌, 스위스)를 이용한 분무 건조 기법에 의해 공동 다공성 인간 IgG 입자를 제조하였다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 61℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 ℓ/시간. 공급물은 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 용액 A 및 B를 혼합하여 제조하였다.

제제 A: 일반 염수(박스터, 시카고, IL) 2 g에 인간 IgG(시그마 케미칼스, 세인트 루이스, MO) 55 mg 및 히드록시에틸 전분(아지노모토, 일본) 3.2 mg을 용해시켰다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 수중 플루오로카본 에멀젼을 다음과 같이 제조하였다. 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여 8000 rpm으로 2∼5분 동안(온도 = 60∼70℃) 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루트비히스하펜, 독일) 0.415 g을 고온 탈이온수(온도 = 50∼60℃) 40.3 g 중에 균질화시켰다. 혼합하는 동안 퍼플루브론(아토켐, 파리, 프랑스) 5.2 g을 적가하였다. 플루오로카본을 첨가한 후, 이 에멀젼을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그 후, 형성된 조제 에멀젼을 18,000 psi의 고압 균질화기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 B의 1/8을 분리하여 제제 A에 첨가하였다. 이렇게 얻은 IgG/퍼플루브론 에멀젼 공급 용액을 전술한 조건 하에 분무 건조기에 공급하였다. 분말을 집진장치에 모으고, 퍼플루브론을 이용하여 거름 스크린을 세정하여 수집용 병에 모았다. 이어서, 퍼블루론 중의 IgG 현탁액을 -60℃에서 냉동 및 동결 건조시켰다. 자유 유동성 백색 분말을 얻었다. 타임-오브-플라이트 분석법(에어로자이저, 암허스트 프로세스 인스트러먼츠, 암허스트, MA)을 통해 측정하였을때, 공동 다공성 IgG 입자의 부피-가중 평균 공기역학적 직경은 2.373 ±1.88 ㎛였다.

VII. 폴리클로날 인간 IgG 풀모스피어의 시험관내 활성

캡쳐 hlgG ELISA를 이용하여 실시예 VI의 폴리클로날 인간 IgG 풀모스피어(hlgG-Pul) 제형의 특성을 관찰하였다. 퍼플루브론 중의 5 mg/ml의 hlgG-Pul 현탁액을 제조하여 피펫으로 웰에 옮기고 공기중에서 건조시켰다. 건조된 hlgG-Pul에 PBS를 첨가하고 밤새도록 항온처리하였다. 수화된 hlgG-Pul 용액을 희석시켜서 코팅 완충액(1:1000으로 희석, 시그마 이뮤노케미칼) 중의 마우스 항-인간 k 쇄 모노클로날 항체로 코팅된 ELISA 플레이트로 옮긴 다음, 15% 염소 혈청을 함유하는 PBS로 실온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 이 웰을 세정하고, 염소 항-인간 IgG 알칼라인 포스파타제 접합체(15% 염소 혈청, 0.05% Tween을 함유하는 PBS로 1:1000 희석)를 첨가한 다음, pNPP 기질을 첨가하여 발색 반응시켰다. 자동 플레이트 기록기를 이용하여 405 nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 염수 중의 hlgG(표준) 및 공(blank) 풀모스피어와 혼합한 hlgG를 대조군으로 이용하여, 지질이 분석에 미치는 영향을 배제하였다. 공 풀모스피어는 인지질과 전분만으로 이루어졌다.

도 4는 hlgG-Pul, hlgG 및 hlgG + 공 풀모스피어에 대한 검량선을 나타낸다. hlgG-Pul 제형은 약 20 중량%의 hlgG를 포함하는 것으로 측정되었다. 또한, hlgG-Pul은 k 경쇄 및 중쇄 에피토프의 발현을 유지하였다.

VIII. 풀모스피어 제형으로부터의 HA 110-120 펩티드 및 인간 IgG의 용해 역학

0.2 ㎛ 직경의 필터를 장착하고 평평한 바닥의 24웰 세포 배양 플레이트를 갖춘 용해 챔버를 이용하여 풀모스피어로부터의 항원 및 hlgG 방출 역학을 측정하였다. 실시예 I 및 실시예 IV로부터 얻은 풀모스피어 분말 약 3 mg을 용해 챔버의 하부 구획에 위치시키고, 동시에 멸균 PBS(1.3 ㎖/웰)에 노출시켰다. 호흡 패턴을 모의하기 위해 이 플레이트를 37℃에서 수평 교반기(30 RPM) 위에 배치하였다. 상부 구획으로부터 25 ㎕의 시료를 모아서, hlgG의 경우에는 캡쳐 ELISA(도 5A), 플루오로세인 표지 HA 펩티드 제형(f-HA)의 경우에는 생물학적 정량(도 5B)을 통해 분석하였다. f-HA에 대한 결과는 형광측정기를 통해 별도로 확인하였다(데이타는 기재하지 않음). hlgG 및 HA 펩티드 풀모스피어 제형의 용해 역학을 이들 각각의 수성 대조군과 비교하였다.

도 5A 및 5B에 도시된 결과는 백분율 방출로 나타내었다. HA 펩티드 제형의 경우에는 급속 확산 제어 방출이 관찰되었으며, 수성 대조군과 차이를 보이지 않았다. 완전 분해는 2시간 내에 일어났다. 대조적으로, hlgG 제형에서는 보다 저속의 부식 제어 역학이 관찰되었다. 완전 용해에는 6시간 이상 소요되었으며, 수성 IgG 대조군은 1시간이 소요되었다. 본 발명의 결과는 풀모스피어로부터의 용해 역학이 적어도 부분적으로는 제형화된 화합물의 분자량(각각 1.4 kDa 및 150 kDa)에 의존한다는 것을 입증한다. 또한, 친수성 또는 소수성의 차이도 이와 유사한 효과를 나타낼 수 있음을 알 것이다.

IX. hlgG 풀모스피어의 생체이용률

실시예 VI로부터의 인간 IgG 풀모스피어(hlgG-Pul)를 케타민/자일라진으로 마취시킨 마우스의 기관내(20 ℓ의 퍼플루브론 중의 20 g의 hlgG)로, 또는 메토페인으로 마취시킨 마우스의 비측 경로(70 ㎕의 퍼플루브론 중의 70 g의 hlgG)를 통해 투여하였다. 멸균 PBS 중의 동일 부피의 hlgG를 대조군에 정맥 투여하였다. 다양한 시간 간격으로 마우스로부터 채혈하여, 모든 군(n=3)에서 캡쳐 ELISA를 통해 hlgG의 혈청 농도를 측정하였다. 정맥 투여군과 비교했을 때의 혈청 농도-시간 곡선(AUC) 하의 면적으로부터 절대 생체이용률을 결정하였다. AUC 값은 사다리꼴 규칙을 이용하여 계산하였다.

혈장 hlgG 농도 곡선은 도 6A(기관내) 및 6B(비내)에 도시되어 있다. hlgG-Pul의 생체이용률은 기관내 전달의 경우 27%, 비내 투여의 경우 1.5%였다. 두 경우 모두에서, T_max는 약 2일 후에 나타났다. 웨스턴 블로팅을 수행하여 호흡관을 통해 전달된 후의 순환 hlgG의 분자량이 순수 hlgG의 분자량과 차이가 없다는 것을 확인하였다. hlgG는 14일 이상 순환계에 존속하는 것으로 관찰되었다.

X. 기관 경로를 통해 전달된 hlgG 풀모스피어에 대한 항체 반응

퍼플루브론에 현탁된 실시예 IV로부터의 hlgG-풀모스피어(hlgG-Pul)를 기관내 투여(hlgG 20 g 투여)를 통해 처리한 마우스의 혈액 및 기관지 폐포 세정액(BAL)의 체액 반응을 관찰하였다. 또한, 하기 대조군으로 마우스를 처리하였다: 염수 중의 20 ㎍ hlgG의 기관내 투여, 염수 중의 100 ㎍ hlgG의 정맥 투여 및 기관내 투여, 프로인트 완전 애쥬번트(CFA) 중의 100 ㎍의 피하 투여, 그리고 염수의 기관내 투여. 각 군은 3중으로 처리하였다. 혈액 및 BAL은 면역화 2주 후에 채취하였다.

hlgG 또는 0.1% BSA로 코팅된 ELISA 플레이트를 이용하여 항-hlgG 마우스 IgG의 역가를 측정하였다. 웰을 PBS-15% 염소 혈청으로 블로킹하고 다양한 희석율의 혈청 또는 BAL을 이용하여 2시간 동안 항온처리하였다. 세척 후, 염소 항-마우스 IgG 알칼라인 포스파타제 접합체, 이어서 pNPP 기질을 첨가하여 발색 반응시켰다. 자동 플레이트 기록기를 이용하여 550 nm에서 흡광도(OD)를 분석하였으며, 이 결과를 혈청 IgG의 경우에는 종점 희석 역가로서(도 7A), BAL IgG의 경우에는 평균 OD로서(도 7B) 나타내었다.

염수 중의 hlgG를 투여한 투여량/경로 대조군과 비교하였을 때, 이 결과는 기관내 경로를 통해 hlgG-Pul을 처리한 마우스에서 증가된 전신 및 국소 체액 반응을 보여준다. 뿐만 아니라, 기관내 또는 정맥 경로를 통해 염수 중의 hlgG 고투여량을 투여한 마우스와 비교했을 때에도 이 반응은 증강되었다. 혈청 항체의 역가는 CFA 중의 hlgG로 피하 접종한 마우스에서 관찰한 것과 유사하였다. 흥미롭게도, 체액 반응은 전신 생체이용률과는 서로 연관성이 없었으며(데이타는 기재하지 않음), 이는 국소 면역이 관여한다는 것을 암시한다.

XI. 기관 경로를 통해 전달된 hlgG 풀모스피어에 대한 T 세포의 반응

퍼플루브론에 현탁된 실시예 VI로부터의 hlgG-풀모스피어(hlgG-Pul)로 기관 경로를 통해 면역화시킨 마우스의 비장에서 유도된 T 세포 면역 레벨을 관찰하였다. 비장을 단일 세포 현탁액이 되게 분리하여, 저장성 완충액으로 처리하여 적혈구를 제거하였다. 비장 세포가 4 x 10⁶ 세포/ml이 되도록 완전 RPMI-10% FCS에 재현탁시킨 다음, 6 g/ml의 hlgG 존재 하에 24웰의 평평한 바닥 플레이트(1 ㎖/웰)에서 항온처리하였다. 72시간 동안 항온처리한 후, 상청액을 모아서 ELISA(바이오소스 인터내셔널, 카마릴로-CA로) IL-2, IFN- 및 IL-4의 농도를 측정하였다.

이 결과(도 8)를 각 군의 마우스 개체들의 사이토카인 농도의 평균값으로서 나타내었고, hlgG 염수 대조군과 비교했을 때 hlgG-Pul로 면역화된 마우스에서 3종 사이토카인 모두의 생산이 촉진되었다. hlgG-Pul 처리군의 비장 T 세포에 의한 사이토카인 생산은 염수 중의 hlgG를 정맥 투여한 경우 관찰되는 것과 유사하였다. 이 결과는 폐에서 초회 항원 자극을 받은 기억 T 세포가 전신으로 이동한다는 것을 강하게 시사한다.

XII. 비측 경로를 통해 전달된 hlgG 풀모스피어에 대한 항체 반응

퍼플루브론에 현탁 또는 염수에 용해시킨 실시예 VI로부터의 풀모스피어(hlgG-Pul) 제형으로서 비내 점적주입(20 g)을 통해 hlgG를 투여한 마우스의 체액 반응을 관찰하였다. 면역화 후, 다양한 시간대에 혈청을 모아서, 실시예 X에서 기술한 ELISA 절차를 이용하여 hlgG 특이적 마우스 IgG의 역가를 측정하였다. 이 결과(도 9)는 평균 종점 역가로서 나타냈으며(n=3), 염수 대조군과 비교했을 때, hlgG-Pul을 처리한 마우스에서 개시 속도가 더 빠르고, 그 정도가 크며, 개체간 면역 반응 재현율이 더 낮다는 것을 보여주었다.

XIII. 복강 경로를 통해 전달된 hlgG 풀모스피어에 대한 항체 반응

퍼플루브론에 현탁시킨 실시예 VI으로부터의 hlgG-풀모스피어(hlgG-Pul)를 복강(i.p.) 경로를 통해 처리한(hlgG 100 g 투여) 마우스의 체액 반응을 관찰하였다. 또한, 마우스를 하기 대조 용액 중의 100 ㎍ hlgG로 복강내 처리하였다: 염수, 복층 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 리포좀 염수 용액(+ ml lip), 단층 DPPC 리포좀 염수 용액(+ ul lip) 및 공 풀모스피어 염수 용액(+ 공 Pul). 또한 hlgG가 없는 공 풀모스피어 용액을 추가 대조군으로 테스트하였다. ml lip(〉10 ㎛) 및 ul lip(90 nm)의 입자 중간 직경을 레이저광 분산 기법을 이용하여 측정하였다. 각 군은 3중으로 실시하였다. 7일 및 14일 경과 후, 혈청에서의 IgG 체액 면역 반응을 실시예 X에 기술된 것과 동일한 ELISA 기법을 이용하여 측정하였다.

이 결과를 종점 역가의 평균으로 나타내었으며, hlgG-Pul을 접종한 마우스의 항체 역가가 일관되게 증가한다는 것을 보여주었다. 더욱 구체적으로, 도 10A 및 도 10B는 각각 7일 및 14일 후의 종점 역가를 나타낸다. 공 Pul에 첨가된 hlgG는 염수 중의 hlgG와 유사하게 역가를 유도하였다. 뿐만 아니라, hlgG에 DPPC 리포좀 제제 중 하나를 첨가한 것은 hlgG-Pul에 의해 관찰된 증가된 면역을 회복시키지 않았다. 따라서, 이러한 결과는 (1) 강화된 면역 hlgG-Pul은 경로 의존적 현상이 아니고(실시예 X 및 XII 참조); (2) hlgG-Pul 제형은 hlgG의 강화된 면역원성을 위한 필수조건이며; (3) DPPC 또는 기타 Pul 성분은 독립적인 애쥬번트 효과를 지니지 않는다는 것을 입증한다. 또한, 이러한 결과는 hlgG-Pul에 의해 면역을 강화시키는 데 있어서 다른 요인들 뿐만 아니라 전달 경로가 중요하다는 것을 보여준다.

XIV. 분무 건조에 의한 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 공동 다공성 입자의 제조

8개의 구조 단백질 복합체 및 8개의 음전하 RNA 단편들을 포함하는 비교적 복잡한 막을 지닌 바이러스를 포함하는 공동 다공성 인플루엔자 바이러스(A/WSN/32 H1N1)를 하기 조건 하에 B-191 미니 스프레이-드라이어(뷔히, 플라빌, 스위스)를 이용한 분무 건조 기법에 의해 성공적으로 미립자 내로 혼입시켰다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 61℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 ℓ/시간. 공급물은 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 제제 A 및 B를 혼합하여 제조하였다. 제형화 전, 바이러스는 살아 있었고, 수크로스 구배 원심분리를 통해 정제하였다.

제제 A: 히드록시에틸 전분(아지노모토, 일본) 1 mg을 계량하여 염수 중에 0.6 mg의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 튜브에 옮겼다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 수중 플루오로카본 에멀젼을 다음과 같이 제조하였다. 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루트비히스하펜, 독일) 0.111 g을 20 g의 고온 탈이온수(온도 = 50∼60℃)에 옮겨서 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여 8000 rpm에서 2∼5분 동안 균질화시켰다. 혼합하는 동안 4.4 g의 퍼플루브론(아토켐, 파리, 프랑스)를 적가하였다. 여기에, 플루오로카본을 첨가한 후, 이 에멀젼을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그 후, 형성된 조제 에멀젼을 18,000 psi의 고압 균질화기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 B의 1/8을 분리하여 제제 A에 첨가하였다. 이렇게 얻은 인플루엔자 바이러스/퍼플루브론 에멀젼 공급 용액을 전술한 조건 하에 분무 건조기에 공급하였다. 분말을 집진장치에 모으고, 퍼플루브론을 이용하여 거름 스크린을 세정하여 수집용 병에 모았다. 이어서, 퍼블루론중의 인플루엔자 바이러스 현탁액을 -60℃에서 냉동 및 동결 건조시켰다. 자유 유동성 백색 분말을 얻었다.

XV. 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어의 시험관내 활성

하기 기법을 이용하여 생 바이러스 항원의 분무 건조된 입자로의 혼입을 관찰하였다: 실시예 XIV로부터의 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어(WSN-Pul)를 멸균 PBS에서 5 mg/ml이 되도록 40℃에서 6시간 동안 용해시켰다. 그 후, 수화된 WSN-Pul을 다양한 농도로 희석시켜서 96웰 플레이트에서 비고정 또는 파라포름알데히드 고정된 M12 항원 제시 세포(APC)와 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항원을 첨가한 후, APC를 세척하고 TcH와 4시간 동안 항온처리하였다. 포름알데히드-글루타르알데히드로 고정시킨 세포를 X-gal 기질과 함께 항온처리한 다음, 양성 세포 수를 측정하였다.

이 결과를 활성화된 TcH의 백분율로 나타내었다(도 11A). 다양한 농도의 수크로스 정제 생 WSN 바이러스를 대조군으로 이용하였다(도 11B). WSN-Pul 제형은 약 5 중량%의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 것으로 측정되었다. 비고정된 APC만이 바이러스를 활성화시켰으며, 이는 항원이 분해되지 않았다는 것을 나타낸다. 감염성 바이러스의 역가를 MDCK(Madine Darby kindney carcinoma cells; 매딘 다비 신장 암세포) 분석을 통해 측정하였고(도 11C), 이는 총 바이러스의 약 1%가 여전히 허용성 세포를 감염시키고 그 안에서 복제할 수 있다는 것을 보여주었다. 이러한 결과들은 모두 비교적 큰 인플루엔자 바이러스 항원이 풀모스피어 분말 내에 성공적으로 혼입된다는 것을 입증한다.

XVI. 비측 경로를 통해 전달된 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어에 대한 항체 반응

5 g의 바이러스 및 2 x 10³ TCID₅₀의 생 바이러스(생 바이러스 양에 대응하는 총 항원의 1%)를 함유하는 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어(WSN-Pul) 제형을 BALB/c 마우스의 비내에 접종한 후, WSN 바이러스에 대한 바이러스 특이적 IgG 항체 반응의 유도를 측정하였다. 대조군의 마우스는 2 x 10³ TCID₅₀ 생 바이러스(총 바이러스의 0.05 g에 해당) 또는 자외선 사멸 WSN 바이러스(5 g)로 면역화시켰다. hlgG를 처리한 마우스로부터의 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다. 하기 ELISA 기법을 이용하여 혈청 내의 항체 반응을 측정하였다: 코팅 완충액 중 수크로스 정제 WSN 바이러스로 웰을 코팅하고, 비포유류 단백질(세라블록)으로 블로킹시킨 다음, 혈청 시료의 연속 희석액과 함께 항온처리하였다. 이 시료를 세척하고, 비오틴 접합된 래트 항 마우스 mAb, 스트랩타비딘-알칼라인 포스파타제 및 pNPP 기질을 첨가하여 발색 반응시켰다. 이 결과를 종점 역가의 역수의 기하학적 평균으로서 나타내었다. 접종군당 마우스의 수는 3이었다.

도 12에 도시된 결과는 7일 및 14일 후에 WSN-Pul 또는 염수 중 생 WSN 바이러스(WSN/lo)로 면역화된 마우스에서의 고역가 IgG 항체 유도를 보여준다. 이와는 대조적으로, 염수 중 사 바이러스로 면역화된 마우스에서는 소량의 특이적 IgG 역가만이 검출되었다.

XVII. 비측 경로를 통해 전달된 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어에 대한 T 세포의 반응

T 세포의 반응을 바이러스 및 실시예 XVI에서 기술한 대로 면역화시킨 마우스의 임파구의 에피토프-특이적 사이토카인의 생산 측면에서 관찰하였다. 5 g의 바이러스 및 2 x 10³ TCID₅₀의 생 바이러스(생 바이러스 양에 상응하는 총 항원의 1%)를 함유하는 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어(WSN-Pul) 제형을 BALB/c 마우스의 비내에 접종한 후, T 세포 반응의 유도를 측정하였다. 대조군의 마우스는 2 x 10³ TCID₅₀ 생 바이러스(총 바이러스의 0.05 g에 해당) 또는 자외선 사멸 WSN 바이러스(5 g)로 면역화시켰다. 시험에 사용된 항원은 수크로스 정제 WSN 바이러스, HA 110-120 펩티드 및 NP 147-155 펩티드였다. 미처리 염수군을 대조군으로 포함시켰다.

면역화 10일 후, 피콜 구배 원심분리를 통해 혈액으로부터 말초 혈액 단핵구 (PBMC)를 분리하였다. 다양한 수의 반응자 세포를 니트로셀룰로스/항-IFN 또는 항-IL-4(파밍엔) ELISPOT 플레이트(밀리포어)에서 3 x 10⁵ 세포/웰이 되게 하여 완전 RPMI-10% FCS 중에서 항온처리하였다. 자극자 세포(미토마이신 처리된 비장 세포, 5 x 10⁵/웰), 항원 및 인간 rIL-2(20 U/ml)를 첨가하고, 이 플레이트를 48시간 동안 공동 항온처리하였다. 그 후, 이 세포를 PBS-0.05% Tween으로 세척하고, 항-사이토카인 항체(파밍엔)와 밤새도록 항온처리한 다음, HRP-스트렙타비딘 접합체, 이어서 불용성 기질(벡터 래보라토리즈)를 첨가하여 발색 반응시켰다. 반응을 물로 중단시키고, 웰을 공기 중에서 건조시킨 다음, 입체 현미경을 이용하여 스폿을 계측하였다.

백그라운드 시그널을 뺀 후, 이 결과를 IFN- 또는 IL-4/10⁶ PBMC을 생산하는 특이적 세포의 빈도로서 나타내었다. 백그라운드는 재현적으로 6/10⁶ 이하였다. 각군의 마우스로부터 PBMC를 모았다. 도 13A, 13B 및 13C에 표시된 결과는 WSN-Pul 및 WSN 바이러스에 의한 백신화가 일반적으로 IFN- 및 IL-4를 생산하는 HA-특이적 T 세포, NP-특이적 T 세포 및 WSN 특이적 T 세포를 유도한다는 것을 보여준다. 이와는 대조적으로, 사 바이러스에 의한 면역화는 주로 IL-4 생산 T 세포를 유도하였다. 또한, 사 바이러스에 의한 면역화는 NP 147-155 펩티드에 특이적인 IL-4 생산 Tc2 세포의 강화된 부분집단을 유도하였다. 이러한 데이타는 생 대조 바이러스 및제형화 바이러스(즉, 생 바이러스 및 사 바이러스 포함)에 의해 유도된 T 세포 반응이 일반적인 종래의 백신에 해당하는 사 바이러스 대조군에 의해 유도된 반응보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다.

XVIII. 비측 경로를 통해 전달된 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어로 면역화한 마우스의 감염 시도에 대한 보호

실시예 XVII에 기술된 대로 면역화한 마우스를 비측 경로를 통해 1.2 x 10⁶ 인플루엔자 바이러스로 면역화한지 3주 후에 감염원에 노출시켰다. 감염원에 노출시킨지 4일 후, 바이러스 쉐딩 및 체중 변화에 대한 방어 능력을 측정하였다. 이 결과는 도 14A 및 14B에 도시되어 있다.
MDCK 분석을 통해 생 바이러스를 적정함으로써 비내 세정액 중의 바이러스 역가를 결정하였다. 이 결과는 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어(WSN-Pul) 또는 대조 생 WSN 바이러스로 미리 면역화시킨 마우스에서는 감염성 바이러스가 존재하지 않음을 보여 주었다(도 14A). 자외선 사멸 WSN 바이러스로 면역화한 마우스 또는 비면역화 마우스는 코 세정액에서 유의적인 인플루엔자 바이러스 역가를 나타내었다. 뿐만 아니라, WSN-Pul 또는 WSN 바이러스(소량의 생 바이러스)로 면역화한 마우스는 감염원에 노출된 후에도 체중을 유지하였다(도 14B). 반면에 비면역화 마우스 및 자외선 사멸 WSN 바이러스로 면역화한 마우스는 심한 체중 감소를 나타내다가 죽었다(7일경에 각 군의 2/3가 사망). 이러한 결과는 WSN-Pul이 점막 전달되면 효과적인 백신화 효력을 발휘할 수 있다는 것을 입증한다.

XIX. 분무 건조에 의한 TA7 레트로바이러스의 공동 다공성 입자의 제조

하기 조건 하에 B-191 미니 스프레이-드라이어(뷔히, 플라빌, 스위스)를 이용한 분무 건조 기법에 의해 공동 다공성 TA7 레트로바이러스 입자를 제조하였다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 61℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 ℓ/시간. 공급물을 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 용액 A 및 B를 혼합하여 제조하였다.

제제 A: 탈이온수 2 g에 1 mg의 TA7 레트로바이러스를 용해시켰다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 수중 플루오로카본 에멀젼을 다음과 같이 제조하였다. 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여, 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루트비히스하펜, 독일) 0.3 g을 16.5 g의 고온 탈이온수(온도 = 50∼60℃)에 8,000 rpm으로 약 2∼5분 동안(온도 = 60∼70℃) 균질화시켰다. 혼합하는 동안 8.0 g의 퍼플루브론(아토켐, 파리, 프랑스)를 적가하였다. 여기에 플루오로카본을 첨가한 후, 이 에멀젼을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그 후, 형성된 조제 에멀젼을 18,000 psi의 고압 균질화기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 B의 1/8을 분리하여 제제 A에 첨가하였다. 형성된 TA7 레트로바이러스/퍼플루브론 에멀젼 공급 용액을 전술한 조건 하에 분무 건조기에 공급하였다. 분말을 집진장치에 수집하고, 퍼플루브론을 이용하여 거름 스크린을 세정하여 수집용 병에 모았다. 이어서, 퍼블루론 중의 TA7 레트로바이러스 현탁액을 -60℃에서 냉동 및 동결 건조시켰다. 자유 유동성 백색 분말을 얻었다.

XX. TA7 레트로바이러스 분무 건조된 입자의 시험관내 활성

실시예 XIX에서 제조한 분무 건조된 입자로 TA7 레트로바이러스를 혼입한 후, 이것의 활성을 관찰하였다. 분무 건조된 TA7 레트로바이러스 입자를 염수에 용해시킨 다음, 1시간 동안 Hela 세포에 적용하였다. 마지막 접종 후 24시간이 지나면, β-gal을 이용하여 세포가 형질전환 발현을 하는지를 분석하였다. 순수 입자와 분무 건조된 TA7 레트로바이러스 I 입자간에는 차이점이 관찰되지 않았다. 이 결과는 비교적 크고 복잡한 TA7 레트로바이러스가 활성의 손실없이 분무 건조된 입자에 효과적으로 혼입될 수 있다는 것을 입증한다.

XXI. 분무 건조에 의한 소 감마 글로불린의 공동 다공성 입자의 제조

하기 조건 하에 B-191 미니 스프레이-드라이어(뷔히, 플라빌, 스위스)를 이용한 분무 건조 기법에 의해 공동 다공성 소 감마 글로불린(BGG) 입자를 제조하였다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 61℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 ℓ/시간. 공급물은 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 용액 A 및 B를 혼합하여 제조하였다.

제제 A: 0.2% 염수 용액 21 g에 0.6 g의 BGG(캘바이오켐 샌 디에고, CA), 0.42 g의 락토스(시그마 케미칼스, 세인트 루이스, MO) 및 25 mg의 플루로닉 F-68(NF 등급)(바스프, 파시파니, NY)를 용해시켰다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 수중 플루오로카본 에멀젼을 다음과 같이 제조하였다. 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루트비히스하펜, 독일) 1.02 g을 30 g의 고온 탈이온수(온도 = 50∼60℃)에 8,000 rpm으로 약 2∼5분 동안(온도 = 60∼70℃) 균질화시켰다. 혼합하는 동안 35 g의 F-데칼린(에어 프러덕츠, 알렌타운, PA)을 적가하였다. 여기에 플루오로카본을 첨가한 후, 이 에멀젼을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그 후, 형성된 조제 에멀젼을 18,000 psi의 고압 균질화기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 A와 제제 B를 합하여 전술한 조건 하의 분무 건조기에 공급하였다. 자유 유동성 백색 분말을 집진장치 분리기에 모았다. 타임-오브-플라이트 분석법(에어로자이저, 암허스트 프로세스 인스트러먼츠, 암허스트, MA)을 통해 측정하였을 때, 공동 다공성 입자의 부피-가중 평균 공기역학적 직경은 1.27 ±1.42 ㎛였다.

XXII. 소 감마 글로불린 MDI 제형의 앤더슨 캐스캐이드 충격기 결과

실시예 XXI에 따라 제조한 BGG 공동 다공성 입자로 제형화한 정량식 흡입기(MDI)의 흡입 특성을 앤더슨 캐스캐이드 충격기를 이용하여 평가하였다. 공동 다공성 BGG 입자 83 mg을 계량하여 10 ㎖ 알루미늄 캔에 넣고, 질소 흐름하의 진공 오븐에서 40℃로 3∼4시간 동안 건조시켰다. 이 캔을 DF31/50act 50 I 밸브(밸로이스 오브 아메리카, 그리니치, CT)를 이용하여 주름잡아 밀봉하고, 9.64 g의 HFA-134a(듀폰, 윌밍톤, DE) 추진제로 채워서 캔 기둥에 과압을 가했다.

장치를 작동시키자, 61%의 미립자 분율 및 68 ㎍의 미립자 투여량이 관찰되었다(도 15). 이 실시예는 BGG와 같은 비교적 큰 생물활성제가 제형화될 수 있고, MDI로부터 효과적으로 전달될 수 있다는 것을 보여준다.

당업자들은 또한 본 발명의 정신 또는 정수를 벗어나지 않는 한 본 발명이 다른 특정 형태로 실시될 수 있다는 것을 알 것이다. 본 발명의 전술한 설명은 단지 본 발명의 대표적 구체예만을 개시한 것이고, 본 발명의 범위 내에서 다른 변형도 고려될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에서 상세히 기술한 특정 구체예에 국한되는 것은 아니다. 오히려, 첨부된 청구의 범위가 본 발명의 범위 및 내용을 나타내는 것으로 보아야 한다.

Claims (53)

1. 면역활성제와 결합된 다수의 천공된 미세구조체를 포함하는 피검체의 면역계 조절용 약학 조성물로서,

   상기 천공된 미세구조체는 (a) 공극, 세공, 흠, 공동, 공간, 간극, 틈, 천공 또는 구멍; (b) 0.5∼5 ㎛의 평균 공기역학적 직경; 및 (c) 포화 및 불포화 지질, 비이온성 세제, 비이온성 블록 공중합체, 이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 생체적합성 플루오르화 계면활성제 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 생체적합성 계면활성제를 5% 내지 100% w/w(중량/중량)으로 포함하고,

   상기 조성물에 의해 초래되는 면역 반응이 수성 담체 중에 용해 또는 현탁된 동일한 항원의 정맥내 또는 복막내 투여에 의해 유발되는 면역 반응보다 큰 것인 약학 조성물.
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3. 제1항에 있어서, 천공된 미세구조체가 킬레이트제, 계면활성제, 지방산, 담즙염 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 침투 강화 부형제를 포함하는 것인 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서, 생체적합성 계면활성제가 인지질, 폴록사머 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
5. 제1항에 있어서, 천공된 미세구조체가 25% 내지 100% w/w의 생체적합성 계면활성제를 포함하는 것인 약학 조성물.
6. 제4항에 있어서, 인지질이 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디베헤노일포스파티딜콜린, 디아라키도일포스파티딜콜린 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
7. 제1항에 있어서, 천공된 미세구조체가 비수성 현탁 매질 중에 분산되는 것인 약학 조성물.
8. 제7항에 있어서, 비수성 현탁 매질이 히드로플루오로알칸, 플루오로카본, 퍼플루오로카본, 플루오로카본/탄화수소 디블록, 탄화수소, 알콜, 에테르 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 포함하는 것인 약학 조성물.
9. 제7항에 있어서, 비수성 현탁 매질이 액체 불화 화합물 및 히드로플루오로알칸 추진제로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 포함하는 것인 약학 조성물.
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11. 제1항에 있어서, 천공된 미세구조체의 평균 기하학적 직경이 0.5∼5 ㎛인 것인 약학 조성물.
12. 제1항에 있어서, 천공된 미세구조체의 평균 기하학적 직경이 1∼30 ㎛인 것인 약학 조성물.
13. 제1항에 있어서, 면역활성제가 백신을 포함하는 것인 약학 조성물.
14. 제1항에 있어서, 피검체의 면역계 조절이 외래 항원 또는 병원성 입자에 대해 면역 반응을 유도하는 것, 국소 또는 전신 수동 면역을 유도하는 것, 면역 반응을 자극하는 것, 또는 면역 반응을 하향 조절하는 것을 포함하는 것인 약학 조성물.
15. 제1항에 있어서, 조성물이 국소, 근육내, 경피, 피내, 복강내, 비측, 폐, 질, 직장, 귀, 구강 또는 접안 투여를 이용하여 전달되는 것인 약학 조성물.
16. 면역활성제와 결합된 다수의 천공된 미세구조체를 포함하는 피검체에서 강화된 면역 반응을 유도하기 위한 백신으로서,

    상기 천공된 미세구조체는 (a) 공극, 세공, 흠, 공동, 공간, 간극, 틈, 천공 또는 구멍; (b) 0.5∼5 ㎛의 평균 공기역학적 직경; 및 (c) 포화 및 불포화 지질, 비이온성 세제, 비이온성 블록 공중합체, 이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 생체적합성 플루오르화 계면활성제 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 생체적합성 계면활성제를 5% 내지 100% w/w으로 포함하고,

    상기 백신은 피검체의 기도에 투여될 수 있도록 제제화되며,

    상기 강화된 면역 반응은 상기 미세구조체가 실질적으로 존재하지 않을 경우 수성 담체를 통해 전달되는 비교가능한 면역활성제에 의해 초래되는 면역 반응에 비하여 강화된 것인 백신.
17. 제16항에 있어서, 생체적합성 계면활성제가 인지질, 폴록사머 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 백신.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 인지질이 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디베헤노일포스파티딜콜린, 디아라키도일포스파티딜콜린 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 백신.
19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 면역활성제가 소단위체 백신 펩티드, 소단위체 백신 단백질, 소단위체 백신 탄수화물, 기타 면역활성 유전 및 재조합 물질, 불활성화된 미생물, 생 약독화 미생물, 파지, 레플리콘, 바이러스 벡터, 플라스미드 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 백신.
20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 백신이 건조 분말 흡입기를 사용하여 투여되는 것인 백신.
21. 제16항 또는 제17항에 있어서, 천공된 미세구조체가 비수성 현탁 매질 중에 분산되는 것인 백신.
22. 제21항에 있어서, 비수성 현탁 매질이 액체 불화 화합물 및 히드로플루오로알칸 추진제로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 포함하는 것인 백신.
23. 제21항에 있어서, 백신이 정량식 흡입기, 연무기(nebulizer), 분무기(atomizer), 비측용 펌프 또는 스프레이병을 이용하여 투여되는 것인 백신.
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25. 제16항 또는 제17항에 있어서, 천공된 미세구조체의 평균 기하학적 직경이 0.5∼5 ㎛인 것인 백신.
26. 제16항 또는 제17항에 있어서, 유도된 면역 반응이 점막 면역, 전신 면역, 또는 점막 면역과 전신 면역 둘 다를 포함하는 것인 백신.
27. 제16항에 있어서, 천공된 미세구조체가 면역원성 변형 부형제를 더 포함하는 것인 백신.
28. 제27항에 있어서, 면역원성 변형 부형제가 만난, 세포-결합 다당류, 보조인자, 사이토카인 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 백신.
29. 삭제
30. 제16항에 있어서, 면역 반응이 천공된 미세구조체가 실질적으로 존재하지 않을 경우 수성 담체를 통해 전달되는 비교가능한 면역활성제에 의해 초래되는 면역 반응에 비하여 25% 이상 강화된 것인 백신.
31. 삭제
32. 제16항에 있어서, 천공된 미세구조체가 공동의(hollow) 다공성 미세구조체를 포함하는 것인 백신.
33. 제1항에 있어서, 천공된 미세구조체가 공동의 다공성 미세구조체를 포함하는 것인 약학 조성물.
34. 삭제
35. 제3항에 있어서, 침투 강화 부형제가 2 내지 10개의 탄소쇄 길이를 가지는 단쇄 인지질인 것인 약학 조성물.
36. 제16항에 있어서, 천공된 미세구조체의 평균 기하학적 직경이 1∼30 ㎛인 것인 백신.
37. 제1항에 있어서, 피검체의 면역계 조절이 점막 면역을 포함하는 것인 약학 조성물.
38. 제13항에 있어서, 면역활성제가 소단위체 백신 펩티드, 소단위체 백신 단백질, 소단위체 백신 탄수화물, 기타 면역활성 유전 및 재조합 물질, 불활성화된 미생물, 생 약독화 미생물, 파지, 레플리콘, 바이러스 벡터, 플라스미드 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
39. 제1항에 있어서, 면역활성제가 면역활성 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 유전 물질 및 미생물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
40. 백신과 결합된 다수의 천공된 미세구조체를 포함하는 면역 반응 조절을 요하는 피검체의 면역 반응 조절용 조성물로서, 상기 천공된 미세구조체는 (i) 공극, 세공, 흠, 공동, 공간, 간극, 틈, 천공 또는 구멍; 및 (ii) 0.5∼5 ㎛의 평균 공기역학적 직경을 가지며; 상기 천공된 미세구조체는 포화 및 불포화 지질, 비이온성 세제, 비이온성 블록 공중합체, 이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 생체적합성 플루오르화 계면활성제 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 생체적합성 계면활성제를 5% 내지 100% w/w으로 포함하고,

    상기 면역 반응은 상기 미세구조체가 실질적으로 존재하지 않을 경우 수성 담체를 통해 전달되는 비교가능한 면역활성제에 의해 초래되는 면역 반응에 비하여 강화된 것인 조성물.
41. 제40항에 있어서, 생체적합성 계면활성제가 인지질, 폴록사머 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
42. 제40항에 있어서, 백신이 불활성화된 미생물, 생 약독화 미생물, 파지, 소단위체 백신 단백질, 소단위체 백신 펩티드, 소단위체 백신 탄수화물, 레플리콘, 바이러스 벡터, 플라스미드, 기타 면역활성 유전 및 재조합 물질 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
43. 제40항에 있어서, 약제가 기도로 전달되거나 기도를 통해 전달될 수 있도록 제제화되는 것인 조성물.
44. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 천공된 미세구조체가 면역원성 변형 부형제를 더 포함하는 것인 조성물.
45. 제44항에 있어서, 면역원성 변형 부형제가 만난, 세포-결합 다당류, 보조인자, 사이토카인 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
46. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 천공된 미세구조체가 공동의 다공성 미소구체를 포함하는 것인 조성물.
47. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 소단위체 백신 펩티드, 소단위체 백신 단백질, 소단위체 백신 탄수화물, 기타 면역활성 유전 및 재조합 물질, 불활성화된 미생물, 생 약독화 미생물, 파지, 레플리콘, 바이러스 벡터, 플라스미드 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
48. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 천공된 미세구조체가 비수성 현탁 매질에 분산되는 것인 조성물.
49. 제1항에 있어서, 면역조절제가 외부 항원, 자가-항원, 항원 에피토프 펩티드, 면역글로불린, 자가면역 관련-리간드, 사이토카인 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
50. 제16항에 있어서, 면역조절제가 외부 항원, 자가-항원, 항원 에피토프 펩티드, 면역글로불린, 자가면역 관련-리간드, 사이토카인 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 백신.
51. 제1항에 있어서, 약제가 기도로 전달되거나 기도를 통해 전달될 수 있도록 제제화되는 것인 약학 조성물.
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