KR20010053299A - 미립자 전달 장치 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 1종 이상의 생물 활성제, 바람직한 양태에서 면역 활성제를 포함하는 미립자 조성물과 투여 방법에 관한 것이다. 이러한 점에서, 본 발명은 호흡관, 위장관 또는 비뇨생식기 등을 이용하여 생물 활성제를 국소 및 전신 투여하는 방법을 제공한다. 미립자들은 건조 분말의 형태이거나, 비수성 현탁 매체와 결합되어 안정화된 분산물을 형성할 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 점막 표면으로의 제제의 표적 전달을 위해 측량 흡입기, 건조 분말 흡입기, 분무기 또는 연무기와 같은 흡입 장치와 함께 사용될 수 있다.

Description

미립자 전달 장치 및 사용 방법{PARTICULATE DELIVERY SYSTEMS AND METHODS OF USE}

척추동물은 체내에서 진행되는 종양 세포와 같은 비정상 세포는 물론, 환경으로부터의 병원균에 대한 방어로서 면역 반응을 일으킬 수 있는 능력을 지니고 있다. 이 면역 반응은 호중구 및 단핵구 세포/대식 세포계의 세포에 의해 매개되는 선천적 면역, 즉 수동 면역의 형태, 또는 특이적 항원 서열을 인식하는 임파구 세포에 의해 매개되는 후천적 면역, 즉 능동 면역의 형태일 수 있다. 상기 능동 면역 반응 그 자체는 다시 두가지로 분류될 수 있는데, 전신 순환에 노출된 항원들을 중화시켜서 전문 식세포에 의해 이들이 업데이크되도록 조력하는 특이적 항체의 생산을 수반하는 체액 반응과, 체내의 감염된 또는 비정상적인 세포의 인식에 필요한 세포 반응이 그것이다.

두 경우의 반응 모두에서, 특이적 반응은 항원의 세포내 작용에 의해 일어난다. 항원이 세포질 경로를 통해 작용할 경우, 이로 인해 생긴 펩티드는 초기의 MHC 클래스 I 분자에 결합하여 이펙터(effector) T 세포로의 적절한 제시를 용이하게 한다. MHC 클래스 I 제시는 세포 독성 T 임파구 세포에 의해 쉽게 인식된다. 대조적으로, 식작용 경로를 통해 세포내 작용된 항원은 체액 반응의 촉진을 수반하는 T 헬퍼(helper) 반응에 유리한 MHC 클래스 II 분자의 생성을 제시한다. 백신화의 목적은 이두 반응 모두를 유발시키고 기억 T 세포을 생성시켜서 면역계가 병원균의 감염에 반응하게 하는 것이다. 이러한 반응은 소위 "보조제"라 불리는 자극 보조 분자의 발현을 촉진하는 시그날의 동시 투여를 통해 촉진된다. 체액 반응 및 세포 면역 반응이 모두 관여하면 광범위한 면역이 이루어지므로, 이것은 세포내 병원균을 제거하기 위한 바람직한 목표가 된다. 자극 보조 분자가 적절하게 발현되지 않으면 T 세포의 무반응 상태를 야기시킬 수 있다.

이러한 점에서, 면역 반응의 조절은 두가지 경로, 즉 외부 병원체 또는 이것의 항원에 대한 면역 반응의 유발, 또는 만성적 염증을 일으키는 자가 에피토프에 대해 유발된 부적절한 반응의 억제 중 하나를 취할 수 있다. 자가 에피토프에 대한 이러한 만성적 반응은 당뇨병(일반적으로 유형 I), 다발성 경화증, 류머티즘성 관절염 또는 홍반성 낭창과 같은 다양한 자가 면역 질환과 관련되어 있다. 어느 경우에나, 활성제는 종종 전형적인 약학제에 일반적으로 사용되는 작은 화학 물질보다 비교적 복잡한 펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA를 기초로 한 물질이나 다른 거대 분자 구조의 형태를 취할 수 있다. 이러한 복잡한 생물 활성제는 경구 투여시 일반적으로 낮은 생체 이용률을 나타내기 때문에, 전통적으로 침투성 비경구 주입에 의해 투여되어왔다. 그러나, 최근에 비교적 큰 생체 분자를 흡입과 같은 방법으로 점막 경로를 통해 전달할 수 있다는 것이 제안되었다. 흡입을 통한 이러한 물질의 전신 순환으로 전달하는 경우, 호흡계 점막을 통한 투여는 위장관의 소화 효소를 피할 수 있다는 점에서 특히 매력적이다. 게다가, 이것은 전신 순환과 교환이 가능한 넓은 표면적 때문에, 펩티드 및 단백질의 생체 이용률을 증가시킬 수 있는 가능성을 제공한다. 경구적인 생체 이용을 위해서는 일반적으로 분자량이 일반적으로 500 달톤의 범위로 제한되는 반면, 이보다 더 큰 분자량의 펩티드 호르몬 또는 유사체(예, 1.8 kD 데스모프레신, 5.8 kD 인슐린, 9.5 kD 부갑상선 호르몬)는 코 또는 폐의 점막을 통해 손상되지 않은 상태로 전신 순환으로 흡수되는 것으로 추정되고 있다.

점막 표면 자체로의 표적 전달은 단백질, 펩티드, 바이러스 및 DNA 조성물을 분해되지 않게 효과적으로 전달할 수 있을 뿐만아니라, 이것이 MALT(mucosa-associated lymphoid tissue: 점막 관련 임파구 조직) 임파구계내의 국소 면역 반응을 일으키는 경우에 유리하다. 점막 백신화는 침입구가 일반적으로 외부 환경과 접한 신체의 점막 표면 중 하나에 존재하는 병원균을 공격하기 위해 고안되는 백신의 경우에 특히 주목을 끈다. MALT 임파구계는 점막의 프로프리아층내에 위치한다. 외부 항원이 국소 수상 세포에 제시되면, B 세포 전구체가 국소적으로 증폭 및 성숙되어, 일반적으로 항원의 전신 전달에 의해 유도되는 IgG 항체는 물론, IgA 및 IgM 항체를 생성시킨다. IgA 및 IgM 항체는 트랜스시토시스라는 과정에 의해 전문화된 운송 수용체를 통해 점막 표면을 통과해서 루멘으로 분비된다. 거기서, 이들은 점막 표면에 침입한 병원균에 대한 최전선 방어를 하게 된다. 최근의 증거에 따르면, 생성된 면역 복합체는 병원균 항원에 결합할 뿐만아니라, 본래 자연적으로 트랜스시토시스 경로를 통해 일어나는 바이러스의 전달을 막을 수 있다고 한다. 점막 면역화는 병원균 유래의 항원에 대한 이러한 최전선 면역 반응을 일으킴으로써, 생물체가 먼저 침입 병원균을 차단하는 효율을 상당히 증가시켜야 한다.

종래에, 이러한 업테이크 기작을 개발하여 펩티드 또는 단백질을 효과적으로 전달하기 위한 몇몇 시도가 이루어졌다. 예를 들면, 미국 특허 제5,756,104호는 비내(鼻內) 백신 제제용으로 리포좀 조성물을 이용하는 것을 기술하고 있다. 이러한 조성물은 리포좀과 그안에 분산된 유리 항원 물질을 갖는 수성 담체를 포함한다. 이 조성물이 면역 반응을 일으키는 것으로 밝혀졌지만, 이것은 극도로 불안정하여 시간이 경과함에 따라 분해되기 쉬운 것으로 나타난다. 실용적인 면에서 이것은 심각한 장애가 된다.

이러한 한계를 극복하고 전달 효율을 더욱 증가시키기 위한 시도를 통해 비교적 큰 생체 분자의 투여를 위한 건조 분말제를 개발하게 되었다. 불행히도, 종래의 분말 제제(즉, 미분화된 것)는 종종 장기간에 걸친 정확하고 재현가능한 투약을 제공하지 못한다. 부분적으로, 이것은 미세한 입자간의 소수성 또는 정전기적 상호 작용 때문에 분말이 뭉치는 경향이 있기 때문이다. 이러한 응집은 응집을 막기 위해 더 큰 담체 입자(즉, 유당)를 사용하면 부분적으로 극복할 수는 있다. 그러나, 이러한 더 큰 입자 및 관련 약제는 종종 표적 세포에 도달하지 못해서 약제의 전달이 고르지 않게 된다. 또한, 담체 분자를 포함하는 미정제 혼합물은 혼합된 생체 분자를, 설령 한다고 해도, 거의 보호하지 못한다. 따라서, 전술한 수성 조성물 처럼, 이러한 제제는 시간이 경과함에 따라 분해되기 쉽고 활성을 잃기 쉽다.

보다 최근에는, 종래의 선행 기술 분말 및 수성 제제와 관련된 한계를 극복하기 위해 개선된 조제 방법이 착수되었다. 이러한 점에서, 본 명세서에 참고 인용된 미국 특허 출원 제09/218,209호 및 제09/219,736호는 극미립자 형태의 생물 활성제를 포함하는 제제를 생산하는 방법 및 공정을 기술하고 있다. 이렇게 생산된 분말은 공동의(hollow) 다공성 형태인 것이 바람직하고, 건조 분말 흡입기(DPI) 또는 비수성 액체(즉, 히드로플루오로알칸 또는 불화탄소)에 현탁된 경우에는 측량 흡입기(MDI) 및 연무기와 같은 흡입 장치를 사용하기에 적합하다. 뿐만아니라, 조제 과정 동안에 자극이 적은 조건을 이용하므로 생물학적 활성을 보유할 수 있게 하여, 이 제제를 바이러스와 같은 보다 복잡한 거대 분자 구조는 물론, 단백질 및 펩티드와 함께 사용하기에 특히 적합하게 한다. 또한, 이렇게 생산된 분말은 잔류 함수량이 매우 낮아서, 추진제와 같은 단쇄 불화탄소 및 불화 화합물 또는 퍼플루오로옥틸 브로마이드(PFDB)와 같은 더 긴 쇄 불화 화합물내에 조제를 통해 추가로 포함될 수 있기 때문에, 이러한 조성물은 불안정한 생물 활성제를 안정하게 보관할 수 있게 한다.

극미립자의 바람직한 공동의 다공성 형태는 강화된 안정성 뿐만아니라, 특히 흡입 치료에 적합한 공기 역학적적 특성을 제공한다. 또한, 미립자 특성은 매우 안정한 분산물의 형성을 가능하게 하여, 이것이 PFDB와 같은 기타 불화탄소 액체 매체는 물론 HFA-134a와 같은 히드로플루오로알칸 추진제와 특히 화합성이 되게 한다.따라서, 건조 형태로 또는 비수성 분산물로서 사용되든지 간에, 이 극미립자는 우수한 투약 재현성, 탁월한 플룸(plume) 특성(추진제 또는 건조 분말 분사의 균일성 척도) 및 호흡할 수 있는 분획(장치 또는 인후에 침전되는 것과 대조적으로)으로서 높은 퍼센트의 투약 전달율을 제공한다. 이러한 특성들은 본 발명의 미립자가 폐 깊숙히 전달되는 한 중요한 이론적인 이점을 제공하다는 것을 시사한다. 단백질 및 펩티드와 같은 큰 거대 분자는 폐포 수준에서 업테이크되는 것이 최적이기 때문에, 이러한 깊은 침적은 전신 순환으로의 전달이 필요한 경우 바람직하다.

이러한 극미립자 제제의 사용은 통상적인 선행 기술의 전달 방법을 상당히 개량한 것이지만, 여전히 생리적 반응을 강화시킬 수 있는 생물 활성제, 면역 조절제 또는 면역 활성제를 제공할 필요가 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 강화된 면역 반응을 유발시키는 조성물, 장치 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 백신 및 면역 조절제를 포함하는 면역 활성제를 이것을 필요로 하는 환자의 점막 표면에 효과적으로 전달하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 활성을 유지하기 위해 냉장 또는 냉동시킬 필요가 없는 백신 또는 기타 생물 활성 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 흡입 치료를 통해 수동 면역 및 능동 면역을 유발시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 필요로 하는 환자에게 면역을 부여하거나 면역계를 하향 조절하는데 사용할 수 있는 면역 활성제의 안정한 제제를 제공하는 것이다.

발명의 요약

상술한 목적들 및 기타 목적들이 본 발명의 명세서와 청구 범위에 의해 제공된다. 이 목적을 위해, 본 발명의 방법 및 관련 조성물은 광범위한 측면에서 생물 활성제를 분말 또는 미립자의 형태로 선택된 표적 위치에 전달하는 것을 향상시킨다. 더욱 구체적으로, 놀랍게도 본 발명의 방법 및 조성물을 투여함으로써 바람직하게는 면역 활성제를 포함하는 혼합된 생물 활성제의 활성을 강화 또는 증가시킬 수 있다는 것을 알게 되었다. 이러한 점에서, 본 발명의 백신은 유사한 선행 기술의 백신 조성물에 의해 야기되는 것 보다 훨씬 더 강화된 면역 반응을 일으킬 수 있는 "보조제 효과"를 나타내는 것 같다. 예기치 않은 이러한 효능의 향상 뿐만아니라, 비교적 자극이 적은 조제 기술을 임의의 혼합된 제제의 활성을 보호 및 강화시키기 위한 미립자 형태 및 조성물과 결합시킬 수 있다. 이것은 냉장 또는 냉동할 필요 없이도 생물학적 활성을 보유하는, 비교적 효능있는 제제의 형성을 가능하게 한다. 게다가, 선행 기술의 약제의 전달용 분말 또는 분산물과는 달리, 본 발명은 바람직하게 입자간의 인력을 감소시켜서 유동성과 분산성을 향상시키는 신규한 기술을 이용한다. 이러한 분말을 비수성 현탁액(예, 액체 불화 화합물)에 혼합할 경우, 상술한 동일한 특성으로 인해 응집, 침전 또는 크림화를 감소시키고, 나아가서는 제제의 분해율을 감소시킬 수 있다. 마지막으로, 본 발명의 미립자 또는 분산물을 점막 표면과 같은 선택된 표적 위치에 투여하여 생활성을 더욱 최적화 또는 강화시킬 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 분산물 또는 분말을 측량 흡입기, 건조 분말 흡입기, 분무기, 연무질기, 비측용 펌프, 분사병, 연무기 또는 액체 투약 점적 (liquid dose instillation; LDI) 기술과 함께 생물 활성제를 효과적으로 전달하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 미립자 조제 기술의 특히 이로운 특징은 광범위한 생물 활성 구조물이 이들의 소수성 또는 친수성에 관계없이 안정화된 분산물 또는 분말에 혼합될 수 있다는 것이다. 바람직한 양태에서, 생물 활성 분말을 비교적 자극이 적은 분사 건조 방법을 이용하여 생산할 수 있을 것이다. 이러한 양립 가능한 미립자 조제 기술 덕분에, 펩티드, 단백질 또는 유전 물질과 같은 더 크고 더 불안정한 생체 분자를 역효과나 지나친 활성의 손실 없이 본 발명의 조성물에 쉽게 혼합할 수 있다. 이러한 동일한 조제 기술 및 이로써 생산된 미립자는 또한 종래의 투여 기술 및 방식을 이용하여 비교적 높은 투약량(약 10 mg)의 생물 활성제를 혼합 및 전달 가능하게 한다. 따라서, 건조 분말 또는 안정화된 분산물 중 어느 형태로 투여되든지 간에, 이 신규한 미립자 제조 기술 및 본 발명의 제제에 의해 일어날 수 있는 강화된 반응은 점막과 같은 표적 위치에 생물 활성제를 효과적으로 전달하게 한다.

본 발명과 관련하여 사용되는 "생물 활성제"란 호르몬, 시토킨 또는 케모킨과 같은 활성 펩티드나 단백질, 또는 면역 활성제를 말한다. 즉, 본 발명의 조성물과 방법은 거의 모든 생물 활성제와 양립할 수 있으며, 이들은 외부 항원 또는 병원균에 대한 면역 반응을 유발시키거나, 능동 면역 반응을 하향 조절하는 것과 같이 면역 반응을 조절하도록 고안된 면역 활성제를 전달 또는 투여하는데 놀라울 정도로 효과적이라는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 "면역 활성제", 또는 "면역학적으로 활성이 있는 물질"이란 피검체의 생리적 반응 또는 면역 반응을 일으키거나 기존의 반응을 조절하는데 사용될 수 있는 임의의 분자를 포함할 것이다. 이러한 면역 활성제 또는 생물 제제는 바이러스, 파지 및 박테리아를 포함하는 미생물 뿐만아니라, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물; DNA, RNA 및 안티센스 구성물을 포함하는 유전 물질을 포함할 수 있다.

뿐만아니라, 보인자, 증강제 또는 침투 강화제로 작용할 수 있는 분자를 본 발명의 미립자내에 쉽게 공동 조제할 수 있다. 당업자들은 업테이크, 제시 또는 생체 이용률을 향상시키는 작용을 하는 화합물이 본 발명의 교시에 따라 증강제 또는 침투 강화제로서 작용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 세포의 막 투과성을 변경 또는 증가시킬 수 있는 화합물은 증강제 또는 침투 강화제로서 작용 할 수 있다. 증강제 또는 침투 강화제의 예로는 킬레이트제(예, EDTA, 시트르산), 세정제 또는 계면 활성제(예, 9-라우릴 에테르), 지방산(예, 올레산) 및 담즙염(예, 나트륨 글리코콜레이트)을 들 수 있다. 특히 바람직한 침투 강화제는 약 10개 미만의 탄소 길이의 쇄를 갖는 비교적 단쇄 인지질을 포함한다. 아래에서 더욱 상세히 설명하는 생물 활성제에서와 같이, 선택된 증강제 또는 침투 강화제를 다양한 농도로 미립자내로 혼합시키거나 결합시킬 수 있다.

당업자라면, 본 발명의 미립자, 극미립자 또는 천공된 미세구조물이 원하는 물리적 특성 또는 형태를 제공하는 임의의 생물 화합성 물질로 형성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 점에서, 천공된 미세구조물은 표면 상호 작용을 최소화하고 전단 응력을 감소시킴으로써 인력을 완화시키는 소공, 공극, 흠 또는 기타 간극을 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 형태는 응집을 줄이고 분산성을 향상시키는 작용을 한다. 그러나, 이러한 제한을 조건으로, 임의의 생물 화합성 물질 또는 구성을 사용하여 미세구조물 기질을 형성할 수 있다는 것도 이해할 수 있다. 선택된 물질에 대해서는, 미세구조물이 바람직한 양태로서 침투 강화제로서 작용하는 1종 이상의 계면 활성제를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 이 계면 활성제는 약학적 용도에 적합한 인지질 또는 기타 계면 활성제나 양성 친화제를 포함할 것이다. 유사하게, 미세구조물은 1종 이상의 생물 활성제나 생물 제제를 혼합하는 것이 바람직하다. 구성에 있어서는, 본 발명의 선택된 양태는 비록 공극을 포함하거나 천공된 기타 구조도 고려될 수 있지만, 큰 내부 공극을 한정하는 비교적 얇은 다공성 벽을 갖는 분무 건조된, 공동 미세구를 포함한다.

공동 및/또는 다공성의 천공된 미세 구조물을 이용하면 선행 기술의 분말화된 제제 및 분산물을 지배하는 반데르발스 힘과 같은 분자들의 인력을 상당히 줄일 수 있다. 이러한 점에서, 분제 조성물은 일반적으로 흡입 치료를 위한 바람직한 특성을 제공하면서 제제의 유동성에 기여하는 비교적 낮은 용적 밀도를 갖는다. 더욱 구체적으로, 비교적 저밀도의 천공된(또는 다공성) 미세구조물 또는 미립자를 이용하면 입자들간의 인력이 상당히 감소됨으로써 생성된 분말의 유동성을 얻는데 필요한 전단 응력을 감소시킨다. 또한, 비교적 저밀도의 천공된 미세구조물가 흡입 치료에 사용될 경우 우수한 공기 역학적적 수행 능력을 제공한다. 분산물에서는 이러한 분말의 물리적 특성이 안정한 제제를 형성하도록 한다. 또한, 본 발명의 교시에 따른 분산물 성분을 선택함으로써 입자간 인력을 더 감소시켜서 안정성이 강화된 조성물 또는 제제를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태는 천공된 미세구조물 또는 다공성 미립자를 포함하지만, 비교적 비다공성 또는 고형 미립자 또한 본 발명의 교시에 부합하는 분제 또는 분산물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 즉, 비교적 비다공성 또는 고체 미립자의 현탁물을 포함하는 분말 또는 분산물 역시 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다. 이러한 점에서, 이러한 비교적 비다공성 미립자는 미분화된 입자, 분말 입자 또는 미소 결정체를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 "미립자"란 천공된 미세구조물 및 비교적 비다공성 입자를 포함하는 다공도 및/또는 밀도를 갖는 입자들을 포함하는 것으로 광범위하게 해석 및 간주될 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 분말은 적절한 비수성 분산 매체내에서 분산되어 선택된 생물 활성제를 포함하는 안정화된 분산물을 제공할 수 있다. 이러한 분산물은 특히 측량 흡입기, 분무기, 비측용 펌프, 분사병 및 연무기에 특히 유용하다. 본 발명의 또 다른 양태는 직접 점적 기술을 이용하여 폐 또는 비강에 직접적으로 투여할 수 있는 안정화된 분산물을 포함한다. 어떤 경우에는, 특히 바람직한 현탁액는 실온에서 액체인 불화 화합물(즉, 퍼플루오로탄소 또는 불화탄소) 또는 불화된 추진제(즉, 히드로플루오로알칸 또는 클로로플루오로탄소)를 포함한다. 이들의 이로운 습윤성 때문에, 일부 불화 화합물은 입자 분산물을 폐 또는 다른 점막 표면에 더 깊이 전달하여, 전신 전달을 향상시킨다. 뿐만아니라, 이러한 현탁 매체는 무수화되는 경향이 있어서, 혼합된 생물 활성제의 가수분해를 지연시킨다. 마지막으로, 불화 화합물은 일반적으로 정균 작용을 하기 때문에 양립 가능한 제제내의 미생물의 성장 및 그와 관련된 단백질 분해 가능성을 감소시키게 된다.

본 발명의 분말 또는 안정화된 분산물의 전달에 대한 본 발명의 또 다른 측면은 1종 이상의 생물 활성제 또는 생물 제제를 환자에게 투여하는 흡입 장치에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 적합한 흡입 장치의 예로는 분무기, 비측용 펌프, 분사기 또는 분사병, 건조 분말 흡입기, 측량 흡입기 또는 연무기를 들 수 있다. 바람직한 양태에서, 이 흡입 장치는 생물 활성제를 원하는 생리적 위치(예, 점막 표면)에 연무질의 형태로 전달된다. 본 발명의 목적을 위해서, "연무화된"이란 용어는 문맥상의 제한에 따른 다른 지시 사항이 없다면, 미세한 고형 입자 또는 액체 입자의 기체 분산물을 의미하는 것으로 간주된다. 즉, 연무질 또는 연무화된 약제는, 예를 들면 건조 분말 흡입기, 측량 흡입기, 분무기, 분사병 또는 연무기에 의해 생성될 수 있다. 물론, 아래에서 더 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 또한 직접적으로(예, 통상적인 주사 또는 무바늘 주사를 통해), 또는 액체 투약 점적과 같은 기술을 이용하여 전달될 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 점막 표면과 접촉하여(예, 흡입을 통해) 점막 및 전신 면역을 일으킨다.

본 발명의 분말 또는 안정화된 분산물은 생물 활성제를 점막 표면에 투여하는데 특히 적합하지만, 이것을 신체의 어느 위치에 국소 또는 전신 투여하는데도 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 바람직한 양태에서 이 조성물을 위장관, 호흡관, 국소, 근육내, 비경구, 피내, 경피, 복강, 비내, 질, 직장, 귀, 구강, 경구 또는 눈을 포함하여 많은 상이한 경로를 이용하여 투여할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 점에서, 당업자들은 선택된 투여 경로가 대개 생물 활성제의 선택과 피검체가 원하는 반응에 따라 결정될 것이라는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 다른 목적, 특성 및 이점은 하기 본 발명의 바람직한 실시 양태의 상세한 설명을 참조하면 당업자들에게는 쉽게 이해될 것이다.

본 발명은 일반적으로, 선택된 양태에서 면역 활성제를 포함할 수 있는 1종이상의 생물 활성제를 포함하는 미립자 조성물 및 이것의 투여 방법에 관한 것이다. 이러한 점에서, 본 발명은 호흡관, 위장관 또는 비뇨생식기 등을 이용하여 생물 활성제를 국소 전달 및 전신 전달하게 한다. 특히 바람직한 양태에서, 점막 표면으로의 표적 전달을 위해 본 발명의 조성물을 측량 흡입기, 건조 분말 흡입기, 분무기 또는 연무기와 같은 흡입 장치와 함께 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 미세구조물내의 하기 조성물의 기능성 HA 펩티드(인풀루엔자 바이러스 헤마토글루티닌의 110 내지 120 잔기)의 레벨을 그래프로 나타낸 것이다.

도 2는 미세구조물내로 조제된 항원이 T-세포를 활성화시키기 위한 세포내 가공을 필요로 하지 않는다는 것을 나타낸다.

도 3은 비측내로 투여되는 미립자 및 정맥 주사를 이용하여 전달된 HA 펩티드의 혈장 농도를 도식화하여 비교한다.

도 4는 선택된 대조군과 함께, 본 발명에 따른 미립자내로 조제된 인간 IgG의 측정 곡선을 나타낸다.

도 5A 및 도 5B는 IgG로 조제된 미립자 및 HA 펩티드로 조제된 미립자 각각의 방출 역학을 도식적으로 나타낸다.

도 6A 및 도 6B는 조제된 미립자를 이용하여 기관내 및 코 투여 후의 혈장내 IgG의 지속성을 나타낸다.

도 7A 및 도 7B는 본 발명에 따라 조제된 미립자로서 기관내에 투여된 IgG의 전신 및 국소 항체 반응을 각각 나타낸다.

도 8은 IgG 미립자를 마우스의 기관내에 투여한 후 T 세포 반응의 표시인 시토킨의 레벨을 도식화하여 나타낸다.

도 9는 기관내에 투여된 IgG 미립자에 대한 쥐과의 항체 반응을 나타낸다.

도 10A 및 도 10B는 IgG 미립자를 복강내에 투여한 후 각각 7일 및 14일 이 지난 후의 마우스의 항체 역가를 나타낸다.

도 11A, 도 11B 및 도 11C는 각각 미립자로 조제된 바이러스, 바이러스 대조군에 대한 T 세포 반응과 조제 및 비조제된 바이러스의 전염성 역가를 나타낸다.

도 12는 미립자 조제된 생 인플루엔자 바이러스 및 미립자 조제된 사멸 인플루엔자 바이러스를 코 내부에 투여한 지 7일 및 14일 후 이에 대한 쥐과의 항체 반응을 나타낸다.

도 13A, 도 13B 및 도 13C는 각각 대조 항원과 함께 바이러스 미립자 또는 생 바이러스 또는 사멸 바이러스를 기관내 접종한 후 T 세포의 반응을 나타내는 쥐과의 요인들의 레벨을 나타낸다.

도 14A 및 도 14B는 각각 생 바이러스 및 사멸 바이러스를 포함하는 미립자를 기관내에 접종한 마우스의 바이러스 쉐딩 및 체중 변화를 나타낸다.

도 15는 송아지 감마 글로불린을 포함하는 조제된 미세구의 측량 흡입기로부터의 효율적인 전달을 보여주는 시험관내 앤더슨 캐스캐이드 충격기 연구 결과이다.

바람직한 양태의 상세한 설명

A. 서론

본 발명이 많은 상이한 형태로 구체화될 수 있지만, 본 발명의 원리를 예시화하는 특정 구체적 양태가 본 명세서에 개시되고 있다. 본 발명은 구체화된 특정 양태에 의해 한정되는 것이 아니라는 것이 강조되어야 한다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 생물 활성제의 전달에 유리하게 이용될 수 있는 분말 또는 극미립자를 제조하는 방법, 장치 및 조성물을 제공한다. 바람직하게 생물 활성제는 활성 펩티드나 단백질 또는 면역 활성제를 포함한다. 본 발명에 있어서, 면역 활성제는 면역 반응을 일으킬 수 있거나, 기존의 반응을 조절하는데 사용될 수 있는 백신, 면역 글로불린 또는 자가항원과 같은 임의의 분자를 포함할 수 있다. 당업자라면, 본 발명의 분말이 건조 상태(예, DPI, 즉 기체 추진 분말 주입기를 통해) 또는 안정화된 분산물의 형태(예, 분무기, 분사병, MDI, LDI, 무바늘 주입기, 주사기, 비측용 펌프 또는 연무기를 통해)로 생물 활성제를 전달하는데 유리하게 이용될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 특히 바람직한 양태에서, 분말 또는 극미립자는 천공된 미세구조물을 포함하는데, 이는 본 발명에서 개시된 바와 같이, 공극, 소공, 흠, 공동, 공간, 간극, 틈, 천공 또는 구멍을 나타내고, 한정하거나 포함하는 구조 기질를 포함한다. 이러한 천공된 미세구조물 분말은 흡입 치료에 특히 유용하게 하는, 공기 역학적적 특성을 지니고, 추진제 또는 비수성 전달 용기에서 안정화된 분산물을 형성하도록 하는 형태를 보인다. 더욱 일반적으로, 본 발명의 생물 활성 분말을 형성하는 동안 이용되는 비교적 자극이 적은 조건 및 적합한 전달 방법과 관련된 이점은 비교적 부서지기 쉬운 생물 제제를 효과적으로 투여할 수 있게 한다.

특정 이론에 의해 지지되는 것을 않지만, 본 발명의 조성물을 형성, 저장 및 투여하는 데 이용되는 비교적 자극이 적은 방법은 일반적으로 불안정한 제제내에 생물학적 활성을 효과적으로 보유할 수 있게 한다. 이러한 점에서, 바람직한 조성물은 활성 유지를 위해 냉장을 필요로 하지 않는다. 게다가, 본 발명의 분말에 사용하기에 적절한 화합물의 선택 및 선택된 생리적 위치(예, 점막 표면)로의 전달은 혼합된 제제 또는 제제들의 업테이크를 촉진시키는 것은 물론, 이것의 활성을 강화시킬 수 있다. 뿐만아니라, 본 발명의 조성물 및/또는 전달 기술은 선택된 제제를 투여한 후 면역 반응 또는 생활성을 강화시킬 수 있는 예기치 않은 "보조제 효과"를 일으키는 것으로 나타난다. 더 구체적으로, 하기 실시예에서 설명하는 바와 같이, 본 발명은 프로인트 완전 보조제내 항원 투여를 통해 얻을 수 있는 것(즉, 통상적인 약학 조성물보다 몇배 더 높은 정도)과 유사한 면역 반응을 일으키는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 능동 국소 또는 전신 면역화를 유도하거나, 수동 면역, 면역 조절, 호르몬 조절 또는 유전자 치료를 하기 위한 활성 펩티드, 단백질, 유전 물질 또는 병원균 입자(생 또는 불활화이든)의 효과적인 전달을 제공한다.

B. 생물 활성제

광범위한 측면에서, 본 발명의 분말화된 또는 극미립자 조성물은 이러한 분말을 혼합한 분산물을 포함하여 1종 이상의 생물 활성제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 본 발명에서 사용되는, "생물 활성제"란 임의의 활성 펩티드나 단백질, 또는 임의의 면역 활성제를 포함하는 것으로 간주된다. 면역 활성제에 대해서는, 본 발명의 특히 바람직한 양태는 면역 반응을 조절할 수 있도록 고안된 면역 활성제를 포함한다. 본 발명의 교시에 따르면, 피검체의 면역 반응의 조절은 잠재적인 병원균의 감염 또는 외부 항원에 대한 반응을 일으키는 것, 기존의 면역 반응을 촉진하는 것, 국소 또는 전신 수동 면역을 유도하는 것, 자가 면역 반응이나 알러지 반응을 억제하는 것을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, "생물 활성제" 또는 "면역 활성제"란 피검체에서 원하는 생리적 또는 면역 반응을 제공하는 임의의 분자나 유기체, 또는 이들의 유사체, 상응체 또는 유도체를 포함하는 것으로 광범위하게 해석된다. "생물 활성제"란 용어는 문맥상의 제한에 따른 다른 지시 사항이 없다면 "면역 활성제" 및 이것의 등가물을 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 생물 활성제의 예로는 증강제, 보인자 또는 침투 강화제로서 작용할 수 있는 더 작은 분자는 물론 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질 또는 키메릭 단백질, 면역 글로불린; DNA, RNA, 재조합 구성물 및 안티센스 구조물을 포함하는 유전 물질; 바이러스, 파아지, 박테리아 탄수화물 및 박테리아를 포함한 미생물이 있다. 본 발명에 따른 생활성 조성물은 유전자 치료에 이용할 수 있는 백신, 면역 조절제, 이펙터 또는 레플리콘으로 사용할 수 있다.

본 발명의 분말 또는 미립자 조성물은 오직 1종 이상의 생물 활성제(즉, 100% w/w 이하)를 포함할 수 있는 것으로 이해해야 할 것이다. 그러나, 선택된 양태에서, 천공된 미세구조물은 활성에 따라 훨씬 적은 생물 활성제를 혼합할 수 있다. 따라서, 고활성 물질을 위해서는, 미립자, 극미립자 또는 천공된 미세구조물은 약 0.1% w/w 이상의 농도로 포함하는 것이 바람직하지만, 0.001 중량% 만큼의 적은 양으로 혼합할 수도 있다. 본 발명의 다른 양태는 생물 활성제 또는 생물 제제를 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 40% w/w 이상으로 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 분말이 생물 활성제를 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 또는 90% w/w 이상 포함할 것이다. 본 발명의 분말 또는 천공된 미세구조물에 혼합된 생물 활성제의 정확한 양은 실제 사용되는 제제의 선택, 요구량, 투여 방법, 형태에 좌우된다. 당업자들은 본 발명의 교시와 더불어 잘 알려진 약학적 기술을 이용하여 이러한 결정을 할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

약학 제제에 대해서는, 면역 반응을 포함하는 생리적 반응을 일으킬 목적으로 본 발명의 분말 또는 천공된 미세구조물내로 조제할 수 있는 생물 활성제를 본 발명의 범위내에서 속하는 것으로 특별히 간주한다. 본 발명의 교시에 따르면, 선택된 생물 활성제를, 원하는 효능을 제공하고 선택된 생산 기술에 적합한 임의의 형태의 분말 또는 천공된 미세구조물에 관련시키거나 혼합할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "관련시키다" 또는 "관련시키는"이란 용어는 미립자, 극미립자, 구조 기질 또는 천공된 미세구조물이 생물 활성제를 포함, 혼합, 흡착, 흡수할 수 있고, 생물 활성제에 의해 코팅 또는 형성될 수 있다는 것을 의미한다. 필요하다면 이 제제는 염의 형태(즉, 알칼리 금속이나 아민염, 또는 산 부가염으로서) 또는 에스테르 또는 용매 화합물(수화물)로서 사용될 수 있다. 이러한 점에서, 생물 활성제 형태는 화합물의 활성 및/또는 안정성의 최적화 및/또는 현탁액에서의 제제의 용해도 감소 및/또는 입자의 응집을 최소화시키기 위해 선택될 수 있다.

적어도 어느 정도 까지는, 본 발명에 의해 제공되는 이점들은 본 발명의 분말 및 분산물에 의해 제공되는 독특한 조성물, 저장 및 전달의 측면에 있다. 이러한 점에서, 그리고 아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 분말 또는 천공된 미세구조물가 형성될 수 있는 조건은 비교적 자극이 적은 것이다. 즉, 활성 화합물 또는 활성제를 극단적인 물리적 또는 화학적 조건에 적용하지 않고 본 발명에 따라 생물 활성제를 포함하는 미립자를 제조할 수 있다. 이것은 쉽게 분해 또는 불활성화될 수 있는 단백질, 유전 물질 또는 약독화 바이러스와 같은 비교적 큰 거대분자에 있어서 매우 중요하다. 뿐만아니라, 본 발명의 선택된 양태는 비수성 현탁액를 포함하는 비교적 안정한 분산물을 형성함으로써 혼합된 제제의 생물학적 활성을 유지하는 역할도 한다. 현탁 매체(바람직하게는 액체 불화 화합물 또는 불화 화합물 추진제)내의 이러한 활성 분말은 정균 작용을 하고 무수화되는 경향이 있어서, 혼합된 제제의 가수분해 또는 단백질 분해를 억제하게 된다. 이러한 조성물은 오랜 저장 기간에 걸쳐 비교적 높은 활성 수준을 유지하는 것으로 밝혀졌음을 이해할 수 있다. 마지막으로, 놀랍게도, 본 발명의 분말 조성물 및 이것의 전달 기술을 관련된 생물 활성제의 활성을 증강 또는 강화시키는데 적용할 수 있다는 것을 알게 되었다. 이러한 점들을 모두 합하여, 본 발명의 이러한 이점들은 고활성제를 선택된 생리적 위치에 효율적으로 전달하여 이것의 효능을 제공한다.

전술한 조성물에서와 같이, 본 발명의 방법 및 방식은 펩티드, 폴리펩티드, 박테리아성 탄수화물, 바이러스 및 유전 물질과 같은 생물 활성제의 전달에 유용하다. 이러한 점에서, 본 발명은 특히 능동 면역을 위한 백신의 접종(예, 점막 및 전신 백신화), 수동 면역을 위한 면역 글로불린, 자가 면역 질환의 치료를 위한 면역 조절제, 활성 펩티드나 단백질, 및 유전자 치료나 백신화를 위한 이펙터와 발현 벡터에 특히 유용하다. 아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 선택된 제제를 포함하는 분말은 다양한 상이한 수단을 통해 형성될 수 있다. 분말 또는 극미립자는 천공된 미세구조물의 형태이고, 혼합된 생물 활성제의 안정성 및/또는 효능을 강화시키기 위해 첨가 성분을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 선택적으로, 이 분말은 현탁 매체내에서 조제되어서 안정화된 분산물을 제공할 수 있다.

특히 바람직한 종류의 생물 활성제는 바로 아래에서 상세히 설명할 것이다.

B(i). 항원 및 백신(능동 면역용)

본 발명의 교시에 따르면, 특히 바람직한 생물 활성제는 백신을 포함할 것이다. 본 발명의 명세서와 첨부 실시예를 통해 설명되는 것 처럼, 적합한 백신은 불활성화 균 또는 사균(예, 바이러스), 생 약독화 미생물, 파아지; 단백질, 펩티드 또는 탄수화물(예, 박테리아성 탄수화물)과 같은 소단위체 백신; 레플리콘, 바이러스 벡터 및 플라스미드를 포함하는 유전 물질; 및 융합 단백질 또는 키메릭 항체와 같은 재조합 분자를 포함할 수 있다. 어떤 형태의 제제 또는 생물 제제를 선택하는가에 관계없이, 이렇게 얻은 분말화된 조성물을 피검체를 1종 이상의 표적 항원에 대해 면역화시키는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명과 관련된 보조제 효과 또는 강화된 면역은 특히 효과적인 면역화를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 "표적 항원"이란 일반적으로 단백질 또는 펩티드의 일부인 항원을 말하며, 이것에 대해 면역 반응을 일으키는 것이 바람직하다. 이러한 항원은 바이러스, 박테리아, 원생동물, 진균류, 효모 또는 기생성 항원과 같은 병원균에 포함될 수 있거나, 암세포와 같은 세포에 포함될 수 있다. 종양 항원 및 바이러스 항원은 특히 바람직한 표적 항원이다. 유전적 백신의 경우에는, 접종된 유전 물질에 의해 자가 세포가 감염 또는 형질전환된 숙주 세포에 의해 1종 이상의 표적 항원이 발현될 것이다. 역으로, 키메릭 단백질 또는 융합 단백질이나, 사균 또는 약독화된 미생물을 포함하는 단백질 또는 펩티드를 기초로 한 백신의 경우, 표적 항원 또는 항원들은 면역계에 직접적으로 제시된다. 어느 경우에서 든지, 본 발명의 분말 또는 분산물을 이용한 표적 항원의 제시는 원하는 면역 반응을 일으킬 것이다. 흥미롭게도, 생 바이러스 또는 생 바이러스 및 사멸 바이러스의 배합물을 본 발명의 교시에 따라 백신으로 사용했을 때, 피검체에서 특히 활발한 면역 반응이 일어난다는 것을 알게 되었다.

당업자라면, 일반적으로 효과적인 항-바이러스 면역 반응은 세포 매개 반응( 일반적으로 Th1/CTL 세포 반응이 관련됨) 및 B 세포 매개 체액 반응 둘 다를 포함한다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 정제 단백질 또는 사균이 일반적으로 CTL 반응없이 B, Th2 반응을 일으키는 반면, 생 백신은 물론 소단위체 또는 사 백신의 특정 조성물은 CTL 반응이 관련된 B, Th1 반응을 일으킬 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 백신조성물은 접종 후 B, Th1 및 CTL 반응을 포함하는 광범위한 면역 반응을 일으킬 것이다. 그러나, 백신 접종시 생 바이러스에 의한 감염은 받아들이기 어려운 부작용을 초래할 수 있다. 그러므로, 성공적인 백신화 전략의 목표는 심한 역효과를 일으키지 않고, 세포 및 체액 면역 반응 모두를 관여시키는 것이다. 후술하는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 투여 후 이 두가지 형태의 면역을 일으키는 데 사용될 수 있다.

이러한 점에서, 적합한 백신은 표적 항원에 대해 B 세포 반응, T 세포 반응 또는 이들의 복합 반응을 일으키는 임의의 분자, 유기체 또는 화합물을 포함할 수 있다. 이와 같이, 숙주 면역계에 실제로 제시되는(직접적 또는 숙주 세포를 형질전환시킨 후 든지 간에) 물질은 자연 발생적 표적 항원의 유사체, 상응체 또는 유도체이거나 표적 항원을 포함하는 분자일 수 있다. 뿐만아니라, 면역화는 사실상 제시되는 표적 항원의 형태 및 전달 형태에 따라 국소적 또는 전신적일 수 있다. 예를 들면, 특히 바람직한 양태에서, 면역 반응은 사실상 대개 점막(예, 점막 관련 임파구 조직〔MALT〕임파계)에서 일어난다. 전술한 바와 같이, 외부 항원이 국소 수상 세포에 제시되면, T 세포 및 B 세포가 국소 증식 및 성숙되어서 일반적으로 항원의 전신 전달에 의해 생성된 IgG 항체는 물론, IgA 및 IgM 항체를 생성한다. 이러한 국소 면역화, 특히 비측 경로 및 비동에서의 면역화는 인플루엔자 바이러스와 같은 공기중 병원균 및 호흡관 신시티알 바이러스에 의한 감염을 방지하는데 특히 효과적이다.

더욱 일반적으로, 본 발명의 백신 조성물은 많은 병원균 유래의 1종 이상의 표적 항원을 포함할 수 있다. 예를 들면, 표적 항원은 인플루엔자 바이러스, 시토메갈로바이러스, 허피스 바이러스(HSV-I 및 HSV-II 포함), 백시니아 바이러스, 헤파티티스 바이러스(헤파티티스 A, B, C 또는 D를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아님), 바리셀라 바이러스, 로타바이러스, 파필로마 바이러스, 홍역 바이러스, 엡슈타인 바르 바이러스, 콕스색키 바이러스, 폴리오 바이러스, 에테로바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스(HIV-I 또는 HIV-2를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아님), 호흡기 신시티알 바이러스, 루벨라 바이러스, 스트렙토코커스 박테리아(예, 스트렙토코커스 뉴모니아), 스태필로코커스 박테리아(예, 스태필로코커스 오리어스), 헤모필러스 박테리아(예, 헤모필러스 언플루엔자), 리스테리아 박테리아(예, 리스테리아 모노시토게네스), 클랩실라 박테리아, 그람-음성 바실러스 박테리아, 에세리키아 박테리아(예, 에세리키아 콜리), 살모넬라 박테리아(예, 살모넬라 티피무리엄), 비브리오 박테리아(예, 비브리오 콜레라), 여시니아 박테리아(예, 여시니아 페스티스 또는 여시니아 엔테로콜리티커스), 엔테로코커스 박테리아, 나이지리아 박테리아(예, 나이지리아 메닝기티디스), 코리네박테리움 박테리아(예, 코리네박테리움 티프테리아), 클로스트리듐 박테리움(예, 클로스트리듐 테타니), 미코플라즈마(예, 미코플라즈마 튜버쿨로시스), 캔디다 효모, 아스퍼길러스 진균류, 무커 진균류, 톡소플라즈마, 아메바, 말라리아 기생충, 트리파노소말 기생충, 레이시마니알 기생충, 헬민스 등을 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 표적 항원의 구체적인 비제한적 예로는 헤마글루티닌, 핵단백질, M 단백질, F 단백질, HBS 단백질, HIV의 gp 120 단백질, HIV의 nef 단백질 및 리스테리오리신을 들 수 있다.

어떤 형태의 항원이 표적 항원으로 선택되든지 간에, 항원은 하나 이상의 적절한 에피토프를 포함할 것이다. 본 발명에서 사용되는 "적절한 에피토프"란 면역계에 접근 가능한 표적 항원내에 포함된 에피토프를 말한다. 예를 들면, 적절한 에피토프는 미생물이 세포를 침투한 후 가공되거나, 미생물 또는 미생물 단백질의 표면에서 항체에 의해 인식될 수 있다. 바람직하게, 에피토프에 대한 면역 반응은 유리한 효과를 부여한다; 예를 들면, 표적 항원이 바이러스 단백질인 경우, 표적 항원의 적절한 에피토프에 대한 면역 반응은 적어도 부분적으로 바이러스의 전염성 또는 병원성을 중화시킨다. 당업자들은 적절한 에피토프가 B 세포 또는 T 세포 에피토프일 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에서 사용되는 "B 세포 에피토프"란 더 큰 단백질내에 포함된 펩티드 서열을 포함하는, B 세포에 의한 항체 생성을 유발시킬 수 있는 펩티드를 말한다.

예를 들면, 인간 면역결핍증 바이러스("HIV) 타입 1의 막 단백질의 고변화역 3 루프("V3 루프")가 B 세포 에피토프로 알려져 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 공지된 B 세포 에피토프의 다른 예는 면역 우위적인 B 세포 에피토프로 알려진 인플루엔자 HA 1 헤마글루티닌의 B 위치와 같은 인플루엔자 바이러스 종과 관련된 에피토프가 있으며(Li 등, 1992, J. Virol. 66: 399-404)이고, 홍역 바이러스의 F 단백질의 에피토프(잔기 404-414, Parlidos 등, 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2675-2680); 헤파티티스 바이러스 프리-S1 영역(잔기 132-145, Leclerc, 1991, J. Immunol. 147: 3545-3552) 및 아구창 질환 VP1 단백질의 에피토프(잔기 141-160, Clarke 등, 1987, Nature 330: 381-384)를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 사용할 수 있는 또 다른 B 세포 에피토프가 공지되어 있거나, Caton 등의 문헌〔1982, Cell 31: 417-427〕에 기술된 것과 같은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 펩티드는 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "T 세포 에피토프"란 더 큰 단백질내의 펩티드 서열을 포함하는, MHC 자가 항원과 결합되어 T 세포에 의해 인식되면 기능적으로 T 세포를 활성화시키는 펩티드를 말한다. 이러한 점에서, 본 발명은 MHC 클래스 II 자가 항원과 관련해서, 헬퍼 T 세포에 의해 인식됨으로써, Th 세포를 통한 B 세포 항체의 생성을 촉진하는 Th 에피토프를 제공한다.

예를 들면, PR8 종의 인플루엔자 A 헤마글루티닌(HA) 단백질은 아미노산 잔기 110-120 위치에서 Th 에피토프를 포함하는데, 예는 이에 국한되지는 않는다. 공지된 T 세포 에피토프의 다른 예로는 파상풍 독소의 2종의 난교잡 에피토프(Ho 등, 1990, Eur J. Immunol. 20: 477-483); 시토크롬 c의 에피토프(잔기 88-103); 미코박테리아 열충격 단백질의 에피토프(잔기 350-369, Vordermir 등, Eur. J. Immunol. 24: 2061-2067); 달걀 흰자 리소자임의 에피토프(잔기 48-61, Neilsonet 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 7380-7383); 스트렙토코커스 A M 단백질의 에피토프(잔기 308-319, Rossiter 등, 1994, Eur. J. Immunol. 24: 1244-1247) 및 스태필로코커스 뉴클라아제 단백질의 에피토프(잔기 81-100, de Magistris, 1992, Dell 68: 1-20)를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명과 함께 사용할 수 있는 또 다른 Th 에피토프가 공지되어 있거나, 당해 기술 분야에 공지된 방법을 통해 쉽게 확인할 수 있다.

적절한 에피토프의 또 다른 예로는 CTL 에피토프를 들 수 있는데, 이것은 MHC 클래스 I 자가 항원과 관련해서 세포 독성 T 세포에 의해 인식됨으로써 표적 항원을 포함하는 세포의 CTL 매개 세포 분해를 촉진시킨다. 이러한 에피토프의 비제한적인 예로는 아미노산 잔기 147-161과 365-379 각각에 해당하는 인플루엔자 바이러스 핵 단백질(Taylor 등, 1989 Immunogenetics 26: 267; Townsend 등, 1983, Nature 348: 674), LSMV 펩티드(아미노산 잔기 33-41; Zinkernagal 등, 1974, Nature 248: 701-702) 및 아미노산 잔기 257-264에 해당하는 오브알부민 펩티드(Cerbone 등, 1983, J. Exp. Med. 163: 603-612)를 들 수 있다.

유전적 백신의 경우, 투여된 유전 물질에 의해 자가 세포가 감염 또는 형질전환된 숙주 세포는 1종 이상의 표적 항원을 발현할 것이다. 그 후, 발현된 항원은 피검체에서 원하는 면역 반응을 일으킨다. 당업자들은 유전 물질이 나(naked) 분자의 형태(예, DNA 또는 RNA) 또는 바이러스 벡터의 형태로 분말과 결합될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 어느 경우에서 든지, 본 발명에 적합한 핵산은 바람직하게 1종 이상의 적절한 에피토프를 암호화할 것이고, 적절한 에피토프의 발현 및/또는 안정성 및/또는 면역원성을 조절하는 성분을 선택적으로 더 포함할 수 있다.

예를 들면, 유전적 구조물내에서 암호화된 에피토프의 발현을 조절하는 성분으로는 프로모터/인핸서 성분, 전사 개시 위치, 폴리아데닐화 위치, 전자 종지 위치, 리보솜 결합 위치, 번역 개시 코돈, 번역 종지 코돈, 시그날 펩티드 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 구체적인 예로는 시토메갈로바이러스(CMV 또는 SV40 바이러스("SV40"); Montgomery 등, 1993, DNA and Cell Biology 12: 777-783)의 초기 이른 유전자의 프로모터 및 인트론 A 서열을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 선택적으로, 동일한 오픈 리딩 프레임내에서 1종 이상의 에피토프가 발현될 수 있다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 유전적 백신 및 이것의 제조 방법의 예는 국제 특허 공개 제94/21797호(머크 앤드 컴퍼니 및 비칼社), 국제 특허 공개 제97/21687호(Mt. 시나이), 미국 특허 제5,598,466호 및 제5,580,859호, 국제 특허 공개 제90/11092호(비칼社)에 기술되어 있으며, 이들은 모두 본 명세서에 참고 인용한다.

적절한 에피토프의 강화된 안정성 및/또는 면역원성을 제공하기 위해, 더 큰 펩티드 또는 단백질과 관련해서 에피토프를 제시하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 적절한 에피토프는 키메릭 항체 가변 영역에서 또는 융합 단백질의 일부로서 발현될 수 있다. 다른 바람직한 양태에서, 1종 이상의 적절한 에피토프를 포함하는 전장 단백질(예, 바이러스 코트 단백질)을 투여하는 것이 이로울 수 있다. 선택적으로, 면역원성 펩티드 또는 단백질의 배합물 또는 콕테일을 포함하는 분말 또는 천공된 미세구조물을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 점에서, 적절한 에피토프는 같거나 다른 병원균으로부터 유래할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 후자의 경우, 기회주의적인 병원균을 근본적인 질병 유발 물질과 함께 표적화할 수 있다. 광범위한 표적 범위 뿐만아니라, 본 발명의 조성물은 다양한 에피토프 배합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 B 세포 에피토프의 혼합물, T 세포 에피토프의 혼합물 또는 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프의 배합물을 포함하는 핵산 또는 펩티드나 단백질을 포함할 수 있다.

더욱 구체적으로, 1종 이상의 적절한 에피토프를 포함 또는 발현하는 조성물의 투여는 예기치 않은 상승 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 배합물 백신은 특정 병원균(들)에 대해 원하는 면역을 부여한다는 점에서 1개의 적절한 에피토프를 암호화하는 단일 핵산종을 포함하는 조성물보다 훨씬 더 효과적임을 알 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 당업자들은 또한 이러한 상승 효과가 단일 에피토프 백신보다 적은 양을 낮은 빈도로 투여해서 효과적인 면역 예방 또는 면역 치료 반응을 가능하게 할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 뿐만아니라, 이러한 복수 에피토프 백신 조성물을 이용하면 유발된 복수 위치 면역이 종내의 자연적 표현형 변이 또는 특정 병원균에 의한 표적 항원의 급속한 돌연변이에 대해 더욱 저항성을 나타낼 것이므로, 더욱 포괄적인 방어를 제공할 수 있다. 물론, 효과적인 면역은 단일 B 또는 T 세포 에피토프를 암호화하는 백신에 의해서도 이루어질 수 있으며, 이러한 조성물은 분명히 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.

본 발명은 항원 그 자체는 물론, 입자 외피 자체의 부형제 성분을 조작하여 조제된 항원의 면역원성을 강화 또는 변형시키는 것을 가능하게 한다. 예를 들면, 만노스 수용체에 의한 항원의 업테이크가 용이할 경우, 수상 세포에 효과적인 항원 포착이 용이해지고, 따라서 라이소솜 구획으로의 표적화를 향상시키는 것으로 나타났다(Salusto 등, J. Expt. Med. 182: 389-400, 1995). 따라서, 낮은 퍼센트의 만노스 또는 세포상의 수용체에 결합하는 다른 다당류를 미립자내로 혼합시키면 면역원성을 강화시킬 수 있음을 예상할 수 있을 것이다. 또한, 아래에서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, APC 반응을 촉진하는 보인자 또는 시토킨을 이용하면 필요할 경우 면역 반응을 강화 또는 억제시킬 수 있다. 본 발명은 국소 수상 세포 또는 기타 APC로 향하는 점막 또는 다른 표적 전달 위치(예, 경피)내의 국소 면역 반응의 촉진을 증대시키는 보인자를 항원과 함께 공동 조제할 수 있게 한다. 본 발명에서 제공되는 이러한 배합 조성물은 국소 환경내의 APC를 활성화시키고 항원의 업테이크 및 제시를 강화시킴으로써, 결과적인 면역 반응의 효율을 증가시킬 수 있다.

더욱 일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은 피검체를 면역화 또는 백신화시키는데 사용될 경우 강화된 면역 반응을 제공한다. 본 발명의 미립자에 의해 제공되는 "보조제 효과"는 보조제(즉, 알럼 또는 프로인트 완전 보조제)와 함께 투여되는 항원에 의해 일어나는 반응과 유사한 면역 반응을 일으키는데 사용할 수 있다. 당업자들은, 본 발명과는 달리, 이러한 전통적인 보조제가 일반적으로 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수 있으며, 많은 경우에 인간에게 유용하지 않다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 반대로, 본 발명은 잠재적 유독성 보조제를 투여하지 않고, 강화된 면역 반응(즉, 항체 역가에 대한 CTL 레벨과 같은 공지 기술의 이용을 통해 유사한 항원에 의해 유발된 것 보다 더욱 강화된 면역 반응을 확인함)을 일으킬 수 있다. 특정 이론에 의해 뒷받침되지는 않지만, 관찰된 면역 강화는, 적어도 부분적으로, 입자의 구성 또는 형태, 항원 방출 양상 및 입자내에서의 항원 응집의 가능성의 결과라고 여겨진다. 어떤 경우에는, 이러한 효과는 더욱 소량의 항원 및/또는 더욱 낮은 빈도의 접종으로 임상적으로 유용한 면역 반응을 유발시킬 수 있게 한다.

본 발명의 조성물 및 방법에 의해 제공되는 면역 반응은 이러한 보조제 효과에 의해 종래의 접종 기술에 의한 면역 반응에 비해 강화된 것이다. 특히, 본 발명의 조성물에 의해 유발된 면역 반응은 수용 담체에서 용매화 또는 현탁된 동일한 항원의 정맥 투여 또는 복강 투여에 의해 유발된 면역 반응보다 일반적으로 더 크다. 물론, 유발된 면역 반응의 크기는 하기 실시예에 기술된 적합한 방법을 포함하여 당업자에게 공지된 다양한 기술들 중 임의의 하나를 통해 측정할 수 있다. 이러한 비교를 이용하면, 본 발명의 제제는 전술한 선행 기술 방법을 이용한 동일한 항원의 투여에 의해 유발된 반응보다 바람직하게 25%, 50%, 75% 또는 100% 더 큰 면역 반응을 일으킨다. 더욱 바람직하게, 본 발명은 수성 담체내의 항원을 이용하여 얻은 기준선 반응보다 2, 3, 4 또는 5배 이상 강화된 반응을 일으킨다. 더욱 바람직한 양태에서, 본 발명의 제제 및 방법은 기준선 반응보다 6, 7, 8, 9 또는 심지어 10배 이상 강화된 면역 반응을 일으킬 것이다. 더욱 바람직한 다른 양태는 기준선 보다 20, 30, 40, 50배 또는 심지어 자승배 이상 강화된 반응을 일으킨다. 당업자들은 본 발명의 미립자의 이러한 신규하고 이전에는 예기치 못했던 특성들이 피검체에서 원하는 면역 반응을 일으키는 데 매우 효과적으로 작용한다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

전술한 보조제 효과 뿐만아니라, 본 발명의 교시에 따르면 다른 기작 또한 면역 반응의 강화에 기여할 수 있다. 예를 들면, 놀랍게도, 생 바이러스 및 사멸 바이러스의 배합물은 사멸 바이러스가 단독으로 유발하는 것 보다 훨씬 더 강한 반응을 일으킬 수 있다는 것을 알게 되었다. 더욱 구체적으로, 바람직한 양태에서, 미립자 제조시에, 어느 정도 죽거나 불활성화된 약독화된 바이러스를 이용하여 분말을 조제할 수 있다. 하기 실시예를 통해 증명되는 것 처럼, 이러한 생 바이러스 및 사멸 바이러스의 혼합물은 놀라울 정도로 강한 즉, 강화된 면역 반응을 일으키는 것으로 나타난다. 뿐만아니라, 본 발명의 교시에 따르면, 특정 바이러스 또는 바이러스 혼합물은 자연 발생적인 불활성화 또는 약독화된 바이러스를 포함할 수 있으며, 하나 이상의 외부 항원을 발현하도록 조작될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 생 바이러스를 조제하는 대안적인 방법은 입자 기질내에 바이러스 수용체를 조제하여, 조작 후(즉, 분무 건조 후) 특정 바이러스가 입자에 결합되게 하는 것에 관한 것이다. 현재, 다양한 세포 바이러스 수용체가 잘 정의되어 있으며, 예를 들면 레트로바이러스 수용체로서 작용할 수 있는 프로락틴 수용체, CCR5, HIV의 세포 수용체, 폴리오 바이러스 수용체, HSV1에 결합하는 IgG Fc 영역 및 인플루엔자 바이러스에 결합하는 수용체가 있다.

당업자들은 또한 선택된 항원 또는 항원의 형태(바이러스, 펩티드, 유전 물질 등)에 관계없이, 피검체의 효과적인 면역은 한가지 이상의 접종을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명에서 사용되는 "면역화시키다" 또는 "면역화" 또는 이와 관련된 용어는 표적 항원 또는 에피토프에 대한 실질적인 면역 반응(항원 또는 이펙터 CTL과 같은 세포 면역으로 이루어짐)을 일으킬 수 있는 능력을 말한다. 이러한 용어는 완전 방어적인 면역의 유발을 요구하지는 않으며, 실질적으로 기준선 이상으로 생성되는 방어적 면역 반응을 요구한다. 예를 들면, 본 발명의 방법을 적용한 후, 포유류의 표적 항원에 대한 세포 및/또는 체액 면역 반응이 향상된 경우, 이 포유류는 표적 항원에 대해 면역화되었다고 간주할 수 있다. B 세포 및 T 세포 반응 모두의 강화를 증명하는 분석법은 잘 알려져 있으며, 당업자들은 이를 쉽게 수행할 수 있다. 바람직하게, 면역화는 표적 항원을 발현하는 병원균에 의해 유발 또는 야기되는 질병에 대한 저항력을 증가시킨다.

유사하게, 본 발명에서 사용되는 "접종"이란 용어는, 본 발명에 따르면, 적절한 에피토프를 포함하거나 적절한 에피토프를 생성 또는 발현할 수 있는 1종 이상의 백신을 포함하는 조성물을 투여 또는 유입하는 것을 말한다. 효과적인 면역 반응은 단일 접종에 의해 유도될 수 있지만, 피검체의 효과적인 면역화는 복수 접종, 즉 한차례 이상의 추가 접종을 포함할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 원하는 면역 예방 효과를 얻기 위해서, 1회, 2회, 3회, 4회 또는 5회의 접종을 포함할 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이 투여된 백신은 바람직하게는 점막 표면에 접촉 및/또는 흡수될 수 있을 것이다. 특히 바람직한 양태에서, 점막 표면은 구강 또는 비강 경로나 폐기도와 관련될 것이다. 당업자들은 또한 본 발명의 백신 조성물(즉, 분말 또는 분산물)을 신생아(0 내지 6개월), 유아(6개월 내지 2세), 어린이(2세 내지 13세) 또는 어른(13세 이상)에게 접종하는데 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

B(ii). 면역 글로불린(수동 면역 치료)

본 발명의 방법 및 조성물은 국소 및 전신 능동 면역을 유발시키는 효과적인 수단을 제공하지만, 이들은 또한 국소 또는 전신 수동 면역을 유발시키는 데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 분말 및 미립자는 면역 글로불린 또는 이들의 단편이나 부분을 투여하여, 전염 또는 질병에 대한 빠른 예방 또는 치료를 수행하는 데 사용될 수 있다. 투여된 면역 글로불린은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있으며, 표적 병원균상의 1종 이상의 항원을 이해할 것이다. 바람직하게, 인식된 항원 또는 항원들은 1종 이상의 비교적 보존된 에피토프를 포함할 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 투여된 조성물은 중화용 항체, 치료용 항체 또는 예방용 항체 또는 이들의 배합물을 포함할 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 투여된 조성물은 1종 이상의 모노클로날 항체 또는 면역 반응성 단편들을 포함할 것이다.

투여 후, 활성 면역 글로불린 또는 면역 글로불린들은 전달 위치에서 작용하거나, 전신 순환으로 들어갈 수 있다. 투여 위치에 잔존하는 항체는 처리된 위치(즉, 점막 표면)에 접촉하는 임의의 표적 전염성 물질(예, 공기중 바이러스)에 재빨리 결합하여, 후속되는 전염을 방지하고 미생물을 제거할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 바람직한 양태에 의해 제공되는 비교적 높은 레벨의 순환 항체는 혈류로부터 표적 병원균을 재빨리 제거하여 전염과 관련된 증후를 제거 또는 적어도 개선시킬 것이다. 물론, 피검체의 일생동안 지속될 수 있는 능동 면역과는 달리, 수동 면역은 전달된 면역 글로불린이 순환계에 잔류하는 동안만 지속되는 비교적 일시적인 현상임을 인식할 수 있을 것이다.

표적 병원균상의 항원 또는 항원들을 인식하는 전술한 면역 글로불린 또는 이들의 면역 반응성 단편을 이용하여 피검체에 원하는 면역을 부여할 수 있다. 특정 병원균 및/또는 항원 및/또는 에피토프에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 제공할 수 있는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 실제적으로 투여된 항체의 형태에 대해서는, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함하는 다른 종류의 항체들도 그러하 듯이, 천연 항체 및 조작된 항체 모두 본 발명의 교시에 따라 적합하다는 것을 이해할 수 있다. 유사하게, F(ab')₂, Fab 또는 Fv를 포함하는 면역 글로불린의 면역 반응성 단편 또는 도메인을 원하는 방어를 제공하는데 사용할 수 있다. 조작된 항체에 대해서는, 인간화된 구조물(즉, 키메릭 항체)이 특히 바람직하다. 이러한 면역글로불린은 일반적으로 쥐과 항체의 항원 결합 상보성 결정역(CDR)을 포함하지만, 이 분자의 나머지 부분은 이종으로 인식되지 않는 인간 항체 서열을 포함한다. 예를 들면, Jones 등의 문헌〔Nature, 321: 522-525(1986)〕을 참조할 수 있으며, 이것은 본 명세서에서 참고 인용한다. 인간 폴리클로날 IgG가 일반적으로 피검체에 의해 외부 물질로 인식되지 않기 때문에, 이러한 항체를 저빈도로 투여한다면 원하지 않는 부작용을 일으키지 않고, 체내에서 빨리 제거되지 않는 경향이 있다.

수동 면역은 쉽게 전염되는 병원균, 특히 공기 또는 수중의 병원균에 의한 전염의 기회를 방지 또는 감소시키는데 특히 효과적이다. 이와 같이, 적절한 면역 글로불린을 포함하는 본 발명의 분말 및 분산물은 인플루엔자 또는 호흡기 신시티알 바이러스와 같은 호흡기 바이러스 및 병원균에 대해 특히 효과적이다. 예를 들면, 액체 불화탄소 매체내의 면역 글로불린을 지닌 천공된 미세구조물을 포함하는 안정화된 분산물을 분무기 또는 분사병을 통해 비측 경로에 투여할 수 있을 것이다. 필요한 경우 쉽게 투여할 수 있는 이 조성물은 감기 바이러스(오르소믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 리노바이러스)와 같은 표적 병원균에 대한 국소 및 전신 수동 면역을 제공할 것이다. 유사하게, 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 비브리로 콜레라와 같은 수중 병원균에 대한 방어를 위해 쉽게 투여할 수 있다. 본 발명에서 개시된 수동 면역은 또한 광견병 바이러스, 간염(A, B, C) 바이러스, HIV 및 클로스트리디움 테타니를 포함하는 다양한 유기체(이에 국한되는 것은 아니다)에 적어도 약간의 방어 능력을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 당업자라면, 본 발명의 조성물에 의한 수동 면역을 유발시킬 수 있는 기타 전염성 물질을 쉽게 확인할 수 있다.

B(iii). 종양 항원

또 다른 양태에서, 표적 항원은 종양 항원일 수 있다. 당업자들은 종양 항원이 흔히 종양이 유래한 조직의 형태에 한정되거나, 악성 변이 과정 동안 돌연변이되는 세포 단백질 유래의 펩티드 단편이라는 것을 이해할 수 있을 것이다. 다른 종양 항원은 흔히 종양 세포에 의해 비정상적으로 발현되거나, 전사 에러, 종양 세포 특유의 돌연변이에 기인하는 RNA 프로세싱으로 인해 발생하는 "신규한(neo)" 항원이다. 선택적으로, 정상 단백질의 번역후 변경(예, 글리코실화)에서의 변화가 그때까지는 면역계에 의해 정상적으로는 인식되지 않는 숨겨진(잠복) 에피토프(예, 뮤신, MUC1의 경우가 이러하다)의 노출을 도울 수 있다. 종양 세포와 관련된 B 세포 에피토프는 종양 세포의 표면에서 발현되며, 특이적 항체에 의해 인식된다. 대조적으로, T 세포 에피토프는 두가지 형태가 있는데, 종양 관련 항원 유래의 MHC 클래스 I-제한 펩티드인 CTL 에피토프와 종양 항원 유래의 MHC 클래스 II-제한 펩티드인 Th 에피토프가 그것이다. Th 에피토프가 주로 항원 제시 세포(APC)에 의해 CD4⁺T 세포에 제시되는 반면, CTL 에피토프는 종양 세포는 물론, APC에 의해 제시되어 종양 특이적 CD8⁺T 세포에 의해 인식된다. 종양 항원의 예로는 배아암종 항원("CEA"), 흑색종 관련 항원, 알파 페토단백질, 파필로마 바이러스 항원, 엡슈타인 바르 항원, MUC 1, p53 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 몇몇 다른 종양 세포가 자가 세포 독성 T 임파구 세포에 의해 인식된다고 보고되었으며, 이것은 Boon, T. 등의 문헌〔J. Exp. Med., 183:725-729, 1996〕, Disis, M.L. 등의 문헌〔 Curr. Opin. Immunol. 8:637-642, 1996〕, Robbins, P.F. 등의 문헌〔 Curr. Opin. Immunol. 8:628-636, 1996〕 Salgaller 등의 문헌 〔J. Surg. Oncol. 68:122-138, 1998〕 에 기술되어 있으며, 이들은 본 명세서에서 참고 인용한다.

B(iv). 면역 조절

자가 면역 질환은 조절 또는 이펙터 역할을 하는 다른 면역 세포 아유형은 물론, 자가 반응성 T 및 B 세포에 의해 매개된다. 기관 특이적 자가 에피토프를 인식하는 T 세포가 당뇨병 유형 I, 다발성 경화증(MS) 또는 류마티즘성 관절염(RA)와 같은 자가 면역 질환의 발병의 주요 요인인 것으로 생각된다. 체내의 특정 위치에 제시된 항원을 인식하는 CD4+ 및, 특정 경우에는, CD8+ T 세포는 조직을 침투하여 다양한 형태의 세포를 파괴시키고 염증을 지속시킨다. IL-2, IFN-, TNF- 및 LT-를 생성하는 CD4+ Th1 세포는 병원성으로 간주되는 반면, IL-4, IL-10, IL-5, IL-13 및 IL-9를 생성하는 CD4+ Th2 세포는 자가 면역에 대해 비병원성이고, 특정 환경에서는 질환을 억제시킬 수 있다. 뿐만아니라, 점막의 항원에 노출에 의해 TGF- 및 IL-10을 분비하도록 유도된 Th3 세포는 점막 유도 내성의 중요한 매개체로 생각된다.

자가 면역 질환을 방지 또는 억제하는 전략으로서, 자가 반응성 T 세포는 우수한 치료상의 표적을 제공한다. 자가 면역 질환을 일으키는 병원성 자가 반응성 T 세포를 불활성화시키는 몇가지 수단(일반적으로 "내성"이라 하고, 반드시 "삭제"를 의미하는 것은 아니다)이 있는데, (1) 높은 레벨의 항원에 장기간 노출시켜서 병원성 세포를 직접적으로 무력하게 만드는 것; (2) 비전문 APC와 관련된 항원 또는 특정 조절 인자에 노출시켜서 병원성 T 세포의 기능을 무력화시키는 것; 및 (3) Th2/Th3 표현형의 항원 특이적 Th 억제 세포를 발병 위치로 이동하게 하여 병원성 T 세포의 기능을 억제하도록 유도하는 것이 그것이다.

놀랍게도, 본 발명에 따르면,이 내성은 흡입 치료의 이용을 통해 유발될 수 있다는 것을 알게 되었다. 호흡관는 면역 내성 유도의 표적 위치로서 두배의 이점을 지닌다. 첫째로, 호흡관는 복잡한 항원의 국소 및 전신 전달을 가능하게 하는 비공격적 경로이며, 둘째로, 점막의 면역이 투여된 항원에 대한 Th2/Th3 억제 세포를 포함하기 때문이다. 이러한 항원은 자가 항원 전체(재조합 또는 정제된 것), 항원 단편들(당해 기술 분야에 공지된 분자 생물학 또는 생화학적 기술을 통해 얻은 것) 또는 에피토프에 한정된 펩티드일 수 있다. 다른 양태에서, 이들은 바이러스 성분, 파아지, 키메릭 항체, 융합 단백질, 레플리콘, 박테리아로서 전달될 수 있거나, 핵산을 기초로 한 벡터 또는 바이러스 벡터를 통해 혼합될 수 있다. 이들은 면역 글로불린과 같은 분자 자체, 또는 체세포상의 수용체의 천연 또는 합성 리간드내로 혼합될 수 있다. 이들은 분리된 각각의 성분 또는 혼합물로서 투여될 수 있다. 당뇨병 유형 I의 예로는 GAD65(글루탐산 디카르복실라제 65-Baekkeskov 등, Nature 1990, 347:151), 인슐린(Palmer 등, Science 1983, 222:1337), ICA512/IA-2(섬 세포 항원 512; Rabin 등, J. Immunol. 1994, 152:3183)와 같은 펩티드 및 항원이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. MS의 경우에는, MBP(마이엘린 염기 단백질, Steinman 등, 1995, Mol. Med. Today, 1:79; Warren 등, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11061), PLP. 트랜스아돌라제, 2',3' 시클릭 뉴클레오티드 3' 포스포디에스테라제(CNP), MOG 및 MAG(Steinman L., 1995, Nature, 375: 739)와 같은 단백질 및 펩티드가 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 자가 면역 질환 뿐만아니라, 알러지원에 의해 유발된 면역 반응을 하향 조절하는데 사용될 수 있다.

B(v). 활성 펩티드 및 단백질

특정 펩티드 및 단백질은 외부 항원 또는 자가 항원에 대한 면역 반응을 조절, 상향 조절 또는 하향 조절하는 능력을 지닌다고 알려져 있다. 이러한 펩티드 또는 단백질은 내생 수용체와 결합하거나, 내생 인자의 리간드-수용체 결합을 방해함으로써 특정 과정을 활성 또는 억제시킬 수 있다. 이러한 단백질 또는 펩티드의 예로는 자가 면역 억제를 일으키는 면역 조절 기능을 하는 시토킨이 있으며, 인터페론-, IL-4, IL-10, IL-13, IL-9의 천연형, 또는 다른 분자와 부착, 혼합 또는 복합체를 이룬 단편 형태가 그 예이다. 미생물 또는 종양 세포에 대한 면역을 증가시키는 면역 활성제로 작용할 수 있는 다른 시토킨에는 IL-12, IL-2, 인터페론-, 인터페론-, TNF-, TNF-, 임파성 독소 및 GM-CSF가 있다. 예를 들면, GC-MSF, IFN-α, IL-2, IL-12 또는 TNF-α의 동시 투여는 면역 반응 및 항원 제시 능력을 강화시킨다는 것이 증명되었다. 그러나, 많은 경우, 이러한 항원의 전신 전달은 받아들일 수 없는 부작용을 야기시키기 때문에, 이러한 다기능 인자의 표적 전달에 모든 노력을 기울이게 되었다. 본 발명은 이롭게도 특정 항원 또는 항원들과 보인자의 공동 조성물이 국소 수상 세포나 다른 APC로 향하는 점막 또는 다른 표적 전달 위치(예, 경피 또는 피내)내에서의 국소 면역 반응을 촉진시킬 수 있게 한다. 본 발명의 이러한 배합 조성물은 국소 환경내에서의 APC의 활성화를 용이하게 하고 항원의 업테이크 및 제시를 강화시킴으로써, 결과적으로 면역 반응의 효율을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 단백질 또는 펩티드는 임파구 세포의 모집을 증가, 조절 또는 억제할 수 있는 천연형 또는 단편, 구성물이나 다른 분자들과의 복합체의 케모킨을 포함한다. 예를 들면, 에오탁신-1, 에오탁신-2, TARC, MIP-3b, SLC는 Th2 세포, MIC, IP-10, MIP-1, MIP-1의 모집을 매개하는 것으로 보이며, RANTES는 Th1 세포의 모집을 매개하는 것으로 추정된다(Sallusto 등, 1998, J. Exp. Med., 187:875; Ward 등, 1998, Immunity, 9:1). 유사하게, 천연형 또는 단편들, 재조합 구조물이나 다른 분자들과의 복합체의 시토킨 또는 케모킨 수용체는 특정 임파구 세포의 모집 또는 활성화를 억제시킬 수 있다. 진행중인 Th1 반응을 억제시킬 수 있는 시토킨 및 케모킨 수용체의 예로는 IL-12 수용체, IFN- 수용체, IL-2 수용체, TNF- 수용체, CXCR3 또는 CCR5를 들 수 있다. 진행중인 Th2 반응을 억제시킬 수 있는 시토킨 및 케모킨 수용체의 예로는 IL-4 수용체, IL-13 수용체, IL-9 수용체, IL-10 수용체, CCR3, CCR4 또는 CCR7이 있다. 물론, 이에 적합한 화합물은 시토킨, 케모킨 또는 이들의 수용체에 국한되는 것은 아니고, 인테그린 및 귀소 수용체와 같은 다른 리간드 또는 수용체(천연형, 단편, 구성물 또는 다른 분자와의 복합체 형태)를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 이러한 모든 종류의 화합물을 조제하여 호흡관를 통해 국소적 또는 전신적으로 투여함으로써, 면역 반응을 강화, 억제 또는 조절할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 천공된 미세구조물은, 필요한 경우, 2종 이상의 활성 성분의 배합물을 포함할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이 물질은 단일 종류의 천공 된 미세구조물내의 배합물로서, 또는 다른 종류의 천공된 미세구조물로서 개별적으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 2종 이상의 활성 또는 생물 활성 물질을 단일 공급 예제제에 혼합하여 분무 건조시켜서 복수개의 생물 활성제를 포함하는 단일 종류의 미세구조물을 제공할 수 있다. 역으로, 각각의 물질을 분리된 예제제에 첨가하여 독립적으로 분무 건조시켜서 상이한 조성을 갖는 여러 종류의 미세구조물을 제공할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 이러한 각각의 종류의 미세구조물을 현탁 매체 또는 건조 분말 분배 구획에 원하는 비율로 첨가한 다음, 연무질 전달 장치에 장착시킬 수 있다.

전술한 것을 기초로 하여, 당업자들은 다양한 생물 활성제가 본 발명의 분말에 혼합될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 상기 바람직한 생물 활성제의 목록은 단지 예에 불과하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 당업자들은 또한 조성물을 위한 적절한 양의 생물 활성제 및 투여 시기를 전술한 정보에 따라 부적절한 실험없이 결정할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

C. 분말 조성물

전술한 바와 같이, 본 발명은 다양한 생물 활성제를 효과적으로 전달하는데 이용될 수 있다. 미립자는 생물 활성제만으로 형성될 수 있지만, 이것들은 1종 이상의 첨가 물질을 포함하는 것이 바람직하고, 특정 양태에서는, 흡착 강화제, 증강제, 부형제 또는 구조 성분을 포함할 수 있다. 더욱 일반적으로, 미립자(즉, 구조 기질)는 임의 혼합된 활성제와 화합성인 물리적 및 화학적 특성을 지닌 물질로 형성 또는 포함할 수 있다. 다양한 물질을 분말을 형성하는데 이용할 수 있지만, 특히 바람직한 약학적 양태에서, 미립자는 인지질과 또는 불화된 계면 활성제와 같은 계면 활성제에 관련되거나 포함할 수 있다. 반드시 요구되는 것은 아니지만, 적합한 계면 활성제의 혼합은 분말의 유동성을 향상시키고, 연무질 효율을 증가시키고, 분산 안정성을 향상시키고, 현탁액의 제조를 용이하게 할 수 있다. 뿐만아니라, 선택된 계면 활성제는 또한 흡착 강화제로서 작용하여 선택된 물질의 업테이크를 증가시켜서 생활성을 향상시킨다. 물론, 본 발명의 분말을 전통적인 비계면활성 부형제와 1종 이상의 혼합된 생물 활성제를 이용하여 형성할 수도 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 분말은 선택적으로 1종 이상의 계면 활성제를 포함하거나 병용될 수 있다. 본 발명의 교시에 따르면, 이 화합물은 혼합된 생물 활성제를 안정화시켜서 비수성 매체에 현탁된 미립자를 안정화시키는 것을 돕거나 표적 위치에서의 이 물질의 업테이크를 증가시킨다. 본 발명의 미립자와 관련된 이러한 계면 활성제 뿐만아니라, 미립자가 현탁 매체 액체층내에서 조제된 경우 혼화할 수 있는 계면 활성제를 선택적으로 배합할 수 있다. 당업자들은 계면 활성제의 사용이 본 발명을 실시하는데 필수적이지는 않지만 분산 안정성, 분말 유동성을 더욱 증가시키고, 조제 과정을 단순화시키거나 전달 효율을 증가시킬 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 물론, 액체층내의 1종 이상 및 천공된 미세구조물에 관련된 1종 이상을 포함하는 계면 활성제 배합물은 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다. "병용 또는 포함하는"이란, 미립자 또는 천공된 미세구조물이 계면 활성제를 혼합, 흡수, 흡착하고, 이것에 의해 코팅되거나 형성된 것을 의미한다.

광범위한 의미에서, 본 발명에 사용하기에 적절한 계면 활성제는 천공된 미세구조물의 형성을 돕고, 강화된 현탁 안정성, 향상된 분말 분산성 또는 감소된 입자 응집을 제공하는 임의의 화합물 또는 조성물을 포함한다. 계면 활성제는 단일 화합물 또는 공동 계면 활성제에서와 같이 화합물의 배합물을 포함할 수 있다. 포화 및 비포화된 지질, 비이온 세정제, 비이온 블록 공중합체, 이온 계면 활성제 및 이들의 배합물로 이루어진 군에서 선택된 비불화된 계면 활성제가 특히 바람직하다. 안정화된 분산물을 포함하는 양태에서는, 이러한 비불화된 계면 활성제는 현탁 매체에서 비교적 불용성인 것이 바람직할 것이다. 전술한 계면 활성제는 물론, 적절한 불화된 계면 활성제는 본 발명의 교시에 따라 양립 가능하고, 원하는 제제를 만드는데 사용할 수 있다.

천연 및 합성원으로부터의 인지질을 포함하는 지질은 특히 본 발명에 사용하기에 적합하며, 다양한 농도로 미립자 또는 구조 기질를 형성하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 적합한 지질은 약 40℃ 이상에서 겔에서 액체 결정상으로 전이되는 것을 포함한다. 혼합된 지질은 비교적 장쇄(즉, C₁₆내지 C₂₂) 포화 지질인 것이 바람직하며, 인지질을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 안정화된 제제에 유용한 인지질의 예로는 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테로일포스파티딜콜린, 디아라키도일포스파티딜콜린, 디베헤노일포스파티딜콜린, 단쇄 포스파티딜콜린, 장쇄 포화 포스파티딜에탄올아민, 장쇄 포화 포스파티딜세린, 장쇄 포화 포스파티딜글리세롤, 장쇄 포화 포스파티딜이노지톨, 당지질, 갱글리오사이드 GM1, 스핑고마이엘린, 포스파티드산, 카디올리핀; 폴리에틸렌 글리콜, 키틴, 히알루론산 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 중합체 쇄를 포함하는 지질; 설폰화된 단당류, 이당류, 및 다당류; 팔미트산, 스테아르산 및 올레산과 같은 지방산; 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트가 있다.

적합한 비이온 세정제로는 솔비탄 트리올리에이트(스판(등록상표명) 85), 솔비탄 세스퀴올리에이트, 솔비탄 모노올리에이트, 솔비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노라우레이트 및 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올리에이트를 포함하는 솔비탄 에스테르, 올레일 폴리옥시에틸렌(2) 에테르, 스테아릴 폴리옥시에틸렌(2) 에테르, 라우릴 폴리옥시에틸렌(4) 에테르, 글리세롤 에스테르 및 자당 에스테르를 들 수 있다. 적합한 기타 비이온성 세정제는 본 명세서에서 참고 인용하는 문헌〔McCutcheon's Emulsifiers and Detergents: 맥퍼블리싱社, 글렌 록, 뉴 저지〕을 통해 쉽게 확인할 수 있다. 바람직한 블록 공중합체는 폴록사머 188(플로로닉(등록상표명) F-68), 폴록사머 407(플루로닉(등록상표명) F-127) 및 폴록사머 338을 포함하는 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시플로필렌의 디블록 및 트리블록 공중합체를 포함한다. 나트륨 설포숙시네이트와 같은 이온성 계면 활성제와 지방산 비누도 이용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 미세구조물은 올레산 또는 이것의 알칼리염을 포함할 수 있다. 이들의 우수한 생물화합성 특징 때문에, 인지질 및 인지질과 폴록사머의 배합물은 본 발명의 약학적 양태에 사용하기에 특히 적합하다.

RNA 또는 DNA를 전달하는 데, 전술한 계면 활성제는 물론, 양이온 계면 활성제 또는 지질을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 적합한 양이온 지질의 예는 DOTMA, N-〔1-(2,3-디올레일옥시)프로필〕-N,N,N-트리에틸암모늄 클로라이드; DOTAP, 1,2-디올레일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판; 및 DOTB, 1,2-디올레일-3-(4'-트리메틸암모니오)부타노일-sn-글리세롤을 포함한다. 폴리리신 및 폴리아르기닌과 같은 다가 양이온 아미노산 역시 고려될 수 있다.

전술한 계면 활성제는 물론, 광범위한 계면 활성제를 선택적으로 본 발명과 함께 사용할 수 있다는 것 또한 이해할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 최적 계면 활성제 또는 이들의 배합물은 부적절한 실험을 필요로 하지 않는 경험적 연구를 통해 쉽게 결정할 수 있다. 마지막으로, 아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 미립자 또는 구조 기질를 포함하는 계면 활성제 또한 천공된 미세구조물을 형성하는 동안에 사용되는 수중 유형 유제 전구체(즉, 분무 건조 공급 원액)의 형성에 유용할 것이다.

선행 기술의 조성물과는 달리, 비교적 높은 레벨의 계면 활성제 또는 생물화합성 막 형성 물질(예, 인지질)의 혼합은 본 발명의 분말 분산성을 향상시키고, 현탁 안정성을 증가시키고, 분말 응집을 감소시키는데 사용될 수 있다. 즉, 중량 대 중량을 기준으로, 미립자 또는 천공된 미세구조물의 구조 기질은 비교적 높은 레벨의 계면 활성제를 포함할 수 있다. 이러한 점에서, 미립자 바람직하게 약 1%, 5%, 10%, 15%, 18% 또는 20% w/w 이상 계면 활성제를 포함할 수 있을 것이다. 미립자 또는 미세구조물이 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% w/w 이상 계면 활성제를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 또 다른 예의 양태는 계면 활성제 또는 계면 활성제들이 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% w/w 이상 존재하는 미립자를 포함한다. 특정 양태에서, 분말은 실질적으로 인지질과 같은 계면 활성제를 100% w/w 포함한다. 당업자들은 이러한 경우 미립자 또는 구조 기질의 나머지 부분(이용 가능한 부분)은 생물 활성제, 부형제 또는 기타 첨가제를 포함할 것이라는 것을 이해할 수 있을 것이다.

후술하는 바와 같이, 계면 활성제는 임의의 형태의 미립자내에 혼합될 수 있다. 즉, 전술한 계면 활성제 레벨이 천공된 미세구조물에 이용되는 것이 바람직하지만, 이것은 비교적 비공성 또는 실질적으로 고체인 미립자를 포함하는 분말 또는 안정화된 분산물을 제공하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 선택된 양태가 높은 레벨의 계면 활성제에 결합된 천공된 미세구조물을 포함하는 반면, 동일한 계면 활성제 농도의 비교적 저공성 미립자를 이용하여 본 발명에 적합한 분말을 제조할 수 있다. 이러한 미립자들은 약 5% w/w 이상의 비교적 높은 레벨로 계면 활성제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 점에서, 이러한 양태는 특별히 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 미립자는 선택적으로 합성 또는 천연 중합체 또는 이들의 배합물을 포함한다. 이러한 측면에서 유용한 중합체는 폴리락티드, 폴리락티드-코-글리콜리드, 시클로덱스트린, 폴리아크릴레이트, 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 폴리안하이드리드, 폴리락탐, 폴리비닐 피롤리돈, 단당류, 이당류 또는 다당류(덱스트란, 전분, 키틴, 키토산 등), 히알루론산, 단백질(알부민, 콜라겐, 젤라틴 등)을 포함한다. 미립자의 제제에 유용하다고 인정되는 중합체 수지의 예로는 스티렌-부타디엔, 스티렌-이소프렌, 스티렌-아크릴로니트릴, 에틸렌-비닐 아세테이트, 에틸렌-아크릴레이트, 에틸렌-아크릴산, 에틸렌-메틸아크릴레이트, 에틸렌-에틸 아크릴레이트, 비닐-메틸 메타크릴레이트, 아크릴산-메틸 메타크릴레이트 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트가 있다. 당업자라면, 적절한 중합체를 선택함으로써 미립자의 전달 효율 및/또는 분산물의 안정성을 활성제 또는 생물 활성제의 효력을 최적화하도록 조절할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

전술한 중합체 물질 및 계면 활성제 외에도, 미립자에 다양한 부형제를 혼합하거나 첨가하여 구조물, 바람직한 양태에서는 천공된 미세구조물(즉, 유액 입자와 같은 미세구)을 제공할 수 있다. 이러한 점에서, 선택성 용매 추출과 같은 제조후 기술을 이용하여 경질 성분을 제거할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 적합한 부형제로는 다당류, 이당류 및 다당류를 포함하는 탄수화물을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들면, 덱스트로스(무수 및 모노히드레이트), 갈락토오스, 만니톨, D-만노스, 솔비톨, 소르보스 등과 같은 단당류; 유당, 맥아당, 자당, 트레할로스 등과 같은 이당류; 라피노스 등과 같은 삼당류; 및 전분(히드록시에틸전분), 시클로덱스트린 및 말토덱스트린과 같은 기타 탄수화물이 있다. 아미노산 또한 적합한 부형제이며, 글리신이 바람직하다. 탄수화물 및 아미노산의 혼합물 또한 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주한다. 무기염(예, 염화나트륨, 염화칼슘 등), 유기염(예, 나트륨 시트레이트, 나트륨 아스코르베이트, 마그네슘 글루코네이트, 나트륨 글루코네이트, 트로메타민 히드로클로라이드 등) 및 완충액의 함유물 또한 고려된다. 염 및 암모늄 카보네이트, 암모늄 아세테이트, 암모늄 클로라이드 또는 캠포와 같은 유기 고체 함유물도 고려된다.

전술한 화합물과 함께, 미세구 조성물에 다른 부형제를 첨가하여 입자의 경도, 생산율, 전달 효율 및 침적, 외피 수명 및 환자의 수용성을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 선택적 부형제는 착색제, 미각 차단제, 완충액, 흡습제, 항산화제 및 화학적 안정제를 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 전술한 바와 같이, 미립자는 관련 생물 활성제의 업테이크를 증강, 유도 또는 조절할 수 있는 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 미립자는 미립자를 표적 위치에 있는 세포에 관련된 분자에 우선적으로 결합하게 하는 항체, 보인자, 수용체, 리간드 및 기질과 같은 표적화 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 미립자는 점막 세포 수용체를 표적화하는 항체 및 면역활성 화합물을 포함하도록 형성될 수 있다. 이러한 표적화 분자는 표적 점막 위치의 생물 활성 미립자의 농도를 증가시켜서 임의의 국소 면역 반응을 더욱 강화시킬 것이다. 점막 또는 다른 표적 세포의 표면에서 우선적으로 발현되는 수용체를 향한 리간드 또한 원하는 위치에서의 미립자의 결합을 증가시키는데 사용할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

또 다른 바람직한 양태에는 접촉 지점에서의 잔류 시간을 연장시키거나 점막의 침투를 강화시키는 전하를 띤 물질을 포함하거나 이것으로 코팅될 수 있는 천공된 미세구조물을 포함한다. 예를 들면, 양이온 전하를 형성된 미립자와 유전 물질과 같은 음전하의 생물 활성제를 결합시키는데 사용할 수 있는 반면, 음이온 전하는 점막 접착을 향상시킨다고 알려져 있다. 이러한 전하는 폴리아크릴산, 폴리리신, 폴리락트산 및 키토산과 같은 다 음이온 또는 다 양이온 물질의 결합 또는 혼합을 통해 작용할 수 있다.

D. 분말 형태

당업자라면, 원하는 안정성 및 전달 특성을 제공하는 한 다양한 조성, 구성,형태의 분말 또는 미립자를 본 발명에 따라 사용할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 점에서, 다른 양태(예, DPI 투여)에서는 비교적 다공성인 공기 역학적적 광 천공된 미세구조물가 바람직하지만, 비교적 조밀한 고체 미립자 또는 분말을 몇몇 용도 (예, 공기총 또는 바늘이 없는 주입기)를 통한 안정화된 분산물의 피내 투여에 사용하는 것이 유리하다. 따라서, 본 발명은 바람직한 양태의 관점에서 아래에서 기술되지만, 특정 입자 조성, 구성 또는 형태에 국한되는 것이 아니라는 점이 강조되어야 한다. 오히려, 미립자 특성(전하, 밀도, 조성 등)의 선택은 대개 투여 형태, 표적된 전달 위치 및 생물 활성제의 선택을 기초로 한다.

미세화되고 분말화된 미립자를 포함하는 다양한 미립자 구성물을 본 발명의 교시에 따라 사용할 수 있지만, 본 발명은 건조 입자간의 응집력을 감소시키는 독특한 방법 및 조성물을 제공함으로써, 미립자의 응집을 최소화하여 전달 효율을 높일 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 선택된 제제는 효과적으로 연무화되고, 균일하게 전달되어 폐 또는 비측 경로에 깊이 침투할 수 있는 유동성이 큰 건조 분말을 제공한다. 뿐만아니라, 선택된 분말 구성 및 형태를 비수성 현택 매체와 혼합할 경우 비교적 안정한 분산물을 제공한다는 것을 알게 되었다. 어느 경우에서 든지, 투여 후 놀라울 정도로 인후 침적을 감소시키도록 본 발명의 미립자를 조제할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 특히 바람직한 양태는 구조 기질을 포함하는 다공성 또는 천공된 미세구조물의 형태로 분말 또는 미립자을 혼합시킨다. 본 명세서에서 사용되는 "구조 기질" 또는 "미세구조물 기질"이란 원하는 특성을 제공하는 복수개의 공극, 틈, 공동, 흠, 소공, 구멍, 균열 등을 한정하는 천공된 미세구조물을 형성하는 임의의 고체 물질을 의미하는 것과 동일하다고 간주된다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 선택된 양태에서, 구조 기질에 의해 한정되는 천공된 미세구조물는 1종 이상의 계면 활성제를 혼합시킨 분무 건조된 다공성 미세구를 포함한다. 분산 안정성 또는 전달 효율을 더욱 증가시키기 위해서 기질 성분을 변경시킴으로써, 구조 기질의 밀도를 조정할 수 있다는 것 또한 이해할 것이다.

미립자 또는 천공된 미세구조물의 절대 형상(형태와는 반대되는 의미)은 일반적으로 중요하지 않으며, 원하는 특성을 제공하는 전반적인 구성이 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다. 따라서, 바람직한 양태는 미세구에 가까운 형상을 포함할 수 있다. 그러나, 붕괴, 변형 또는 파열된 미립자 또한 적합할 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명의 특히 바람직한 양태는 분무 건조된 다공성 미세구를 포함한다는 것을 또한 이해할 것이다. 어떤 경우에는 본 발명의 천공된 미세구조물의 분말은 현탁 안정성의 증가, 향상된 분산성, 우수한 시료화 특성, 담체 입자의 제거 및 강화된 공기 역학적을 포함하는 여러가지 이점을 제공하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

분산성, 분산 안정성을 증가시키고, 투여 후 분포를 최적화하기 위해서는 미립자 또는 천공된 미세구조물의 평균 기하적적 입자 크기가 약 0.5 내지 50 ㎛인 것이 바람직하고 1 내지 30 ㎛인 것이 더욱 바람직하다. 밸브 또는 작은 구멍이 이용될 경우, 큰 입자는 응집되거나 분산액으로부터 분리되는 경향이 있어서 장치를 막을 가능성이 있기 때문에 큰 입자(즉, 50 ㎛를 초과하는 것)를 사용하는 것은 바람직하지 않을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특히 바람직한 양태에서는 천공된 미세구조물의 평균 기하적 입자 크기(또는 직경)가 20 ㎛ 미만 또는 10 ㎛ 이하이다. 평균 기하적 직경이 약 7 ㎛ 또는 5 ㎛ 미만인 것이 더욱 바람직하고, 약 4 ㎛ 또는 2.5 ㎛ 미만인 것이 더욱 더 바람직하다. 다른 바람직한 양태는 천공된 미세구조물의 평균 기하적 직경이 약 1 ㎛와 5 ㎛ 사이인 제제를 포함할 것이다. 특히 바람직한 양태에서는 천공된 미세구조물가 직경이 약 1 내지 10 ㎛ 또는 1 내지 5 ㎛이고, 외피 두께가 약 0.1 ㎛ 내지 약 0.5 ㎛인 건조된 공동의, 다공성 미세구 외피를 포함할 것이다. 분산물 및 구조 기질 성분의 미립자 농도를 선택된 입자 크기의 전달 특성을 최대로 활용하도록 조정할 수 있다는 것이 본 발명의 특별한 이점이다.

본 명세서를 통해 기술한 바와 같이, 미세구조물의 다공성은 분산성(예, DPI내) 또는 분산 안정성(예, MDI, 제트 총 또는 연무기 사용시)을 성립하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 점에서, 천공된 미세구조물의 평균 다공도는 최근 영상화 기술과 결부된 전자 현미경을 통해 측정할 수 있다. 더욱 구체적으로, 천공된 미세구조물의 대표적 시료의 전자 현미경 사진을 입수하여 디지탈 방식으로 분석하여 제제의 다공성을 정량할 수 있다. 이러한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 부적절한 실험을 거치지 않고 수행할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해서는, 미립자 또는 천공된 미세구조물의 평균 다공도(즉, 내부 및/또는 중심 공극에 노출되는 입자 표면적의 백분율)는 약 0.5% 내지 약 80% 범위일 수 있다. 더욱 바람직한 양태에서는, 평균 다공도는 약 2% 내지 약 40%의 범위이다. 선택된 생산 변수을 기준으로 하여, 평균 다공도는 미세구조물 표면적의 약 2%, 5%, 10%, 20% 또는 30% 이상일 수 있다. 다른 양태에서 미세 구조의 평균 다공성은 약 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상일 수 있다. 구멍 그 자체에 대해서는, 일반적으로 평균 구멍 크기가 5 nm 내지 약 40 nm이고, 약 20 nm내지 약 200 nm의 범위인 것이 더욱 바람직하다. 특히 바람직한 양태에서는, 평균 구멍 크기가 약 50 nm 내지 약 100 nm의 범위이다. 아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 구멍 크기 및 다공성이 혼합된 성분 및 생산 변수의 주의 깊은 선택에 의해 긴밀하게 조절될 수 있다는 것이 본 발명의 중요한 이점이다.

이러한 점에서, 미립자 또는 천공된 미세구조물의 입자 형태 및/또는 공동의 구성 또한 본 발명의 건조 분말 조성물의 분산성 또는 응집성에 중요한 역할을 한다. 즉, 미세 분말의 부착 응집 특성은 일반적으로 건조 입자간에 존재하는 반데르발스 힘, 정전기적 인력 및 액체 가교력을 감소시킴으로써 극복할 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 교시에 따르면, 습도 및 전하의 조절은 물론, 입자 형태 및 밀도를 조작하여 향상된 분말 분산성을 제공할 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 본 발명의 바람직한 양태는 압자간의 표면 접촉을 감소시키는 소공, 공극, 공동, 흠 또는 기타 간극을 지닌 천공된 미세구조물을 포함한다. 또한, 본 발명의 교시에 따른 인지질 및 불화된 발포제와 같은 계면 활성제를 이용하여 수분 함량은 물론, 전하 및 정전기력을 완화시킴으로써 분말의 유동성을 향상시킬 수 있다.

가장 미세한 분말(예, ＜ 5 ㎛)은 분말의 전달, 연무화 및/또는 포장을 시도할 때 문제가 될 수 있는 열악한 분산성을 나타낸다. 이러한 점에서, 입자의 인력을 조절하는 주요 힘은 일반적으로 원거리 및 근거리 힘으로 분류될 수 있다. 원거리 힘은 중력 및 정전기력을 포함하며, 여기서의 상호 작용은 분리 거리의 제곱 또는 입자의 직경에 따라 다양하다. 건조 분말에 작용하는 중요한 근거리 힘은 반데르발스 상호 작용, 수소 결합 및 액체 가교력을 포함한다. 후자의 두가지 근거리 힘은 입자간의 접촉이 이미 존재할 경우 발생한다는 점에서 다른 힘과 다르다. 본 발명에 기술된 대로 천공된 미세구조물을 이용하면 이러한 인력을 실질적으로 완화 또는 감소시킬 수 있다는 것이 본 발명의 주요한 이점이다.

당업자라면, 반데르발스(VDW) 인력이 근거리에서 발생하고, 적어도 부분적으로, 상호작용하는 입자간의 표면 접촉에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 두개의 입자가 서로 가까워질 때, VDW 힘은 접촉 면적의 증가에 따라 증가한다. 두개의 건조 입자에 대한, VDW 상호 작용력의 크기, F⁰ _vdw는 하기 식을 이용하여 계산할 수 있다.

상기 식 중, ħ는 플랑크 상수, ω는 각진동수, d₀는 응착력이 최대일 때의 거리, r₁및 r₂는 상호작용하는 두 입자간의 반경이다. 따라서, 건조 분말에 대한 VDW 힘의 크기와 강도를 줄이는 한가지 방법은 입자간 접촉 면적을 감소시키는 것이라는 것을 이해할 수 있을 것이다. d₀의 크기가 이러한 접촉 면적을 반영하는 것이라는 것을 인식하는 것이 중요하다. 입자가 완전한 구일 경우, 두개의 대립체간의 접촉 면적이 최소가 된다. 또한, 입자가 매우 다공성인 경우, 접촉 면적은 더욱 감소한다. 따라서, 본 발명의 천공된 미세구조물는 입자간 접촉 및 이에 해당하는 VWD 인력을 감소시키는 역할을 한다. 이러한 VDW 힘의 감소는 기하적 입자 직경의 증가보다는 대부분 본 발명의 독특한 분말 입자 형태의 결과라는 것을 인식하는 것이 중요하다. 이러한 점에서, 본 발명의 특히 바람직한 양태는 비교적 적은 VWD 인력을 나타내는 평균 또는 작은 미립자(예, 평균 기하적 직경 ＜ 10 ㎛)를 지닌 분말을 제공한다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

또한, 전술한 바와 같이, 분말에 영향을 미치는 정전기력은 두 입자 모두 또는 어느 하나가 전기적으로 전하를 띨 경우 발생한다. 이러한 현상은 전하의 유사성 또는 비유사성에 따라 입자간의 인력 또는 척력을 일으킬 것이다. 가장 간단한 경우, 쿨롱의 법칙을 이용하여 전기적 전하를 설명할 수 있다. 입자간의 정전기력을 조절 또는 감소시키는 한가지 방법은 두 입자 모두 또는 어느 하나가 부전도성 표면을 갖는 것이다. 따라서, 천공된 미세구조물 분말이 비교적 부전도성인 부형제, 계면 활성제 또는 활성제를 포함한다면, 입자에 발생된 임의의 전하는 표면 전체에 고르지 않게 분포될 것이다. 결과적으로, 증가된 전하의 보유는 물질의 저항력에 의해 지배되기 때문에, 부전도성 성분을 포함하는 분말의 전하 반감기는 비교적 단축된다. 저항성 또는 부전도성 성분은 효과적인 전자 공여체 또는 수용체로서 작용할 수 없는 물질이다.

본 명세서에 참고 인용하는 Derjaguin 등의 문헌 〔Muller, V.M., Yushchenko, V.S. 및 Derjaguin, B.V., J. Colloid Interface Sci. 1980, 77, 115-119〕은 전자를 수용 또는 공여할 수 있는 능력에 따라 나열한 분자기의 목록을 제공한다.

공여체: -NH₂＞ -OH ＞ -OR ＞ -COOR ＞ -CH₃＞ -C₆H₅＞

-할로겐 ＞ -COOH ＞ -CO ＞ -CN ＞ 수용체:

본 발명은 비교적 비전도성의 물질을 이용하여 본 발명의 분말내의 정전기적 효과를 감소시킨다. 상기 순위를 이용하면, 바람직한 비전도성 물질은 할로겐화된 및/또는 수소화된 성분을 포함할 것이다. 인지질 및 불화된 발포제(분무 건조된 분말내에 어느 정도 함유될 수 있다)와 같은 물질은 이들이 입자 전하에 저항성을 제공할 수 있으므로 바람직하다. 입자내의 잔류 발포제(예, 불화 화합물)의 보유는, 비교적 적은 레벨로 존재한다 하더라도, 일반적으로 분무 건조 및 집진 장치 분리 중에 제공되는 것 처럼, 미립자 또는 천공된 미세구조물의 전하를 감소시킬수 있다. 일반적인 정전기 이론 및 본 발명의 교시를 근거로 하면, 당업자들은 부적절한 실험을 거치지 않고 본 발명의 분말의 정전기력을 감소시키는 첨가 물질을 확인할 수 있을 것이다. 이러한 점에서, 고도로 전하를 띠는 물질은 역 전하를 띠는 화합물(예, 양이온 지질에 핵산을 결합시키는 화합물)로의 단순한 pH 조정 또는 킬레이트화를 통해 정전기적으로 변형 및 조절될 수 있다. 또한, 필요한 경우, 에스테르화 및 충전 기술을 이용하여 정전기력을 조작하고 최소화시킬 수 있다.

전술한 놀라운 이점들 외에도, 본 발명은 또한 수소 및 액체 결합을 완화 또는 감소시킨다. 당업자들에게 공지된 바와 같이, 수소 결합 및 액체 가교 결합은 분말에 의해 흡수된 수분으로부터 발생한다. 일반적으로, 더 높은 습도는 친수성 표면에 대한 더 높은 입자간 힘을 생성시킨다. 이것은 유당과 같은 비교적 친수성 화합물을 사용하는 경향이 있는 선행 기술의 흡입 치료용 약학 조성물에 있어서 심각한 문제점이다. 그러나, 본 발명의 교시에 따르면, 흡착된 물로 인해 생긴 응집력은 접촉 표면의 소수성을 증가시킴으로써 조절 또는 감소시킬 수 있다. 입자 소수성의 증가는 부형제의 선택 및/또는 유화된 베드를 이용하는 것과 같은 제조 후 분무 건조 코팅 기술의 이용을 통해 얻을 수 있다는 것을 당업자들은 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 바람직한 부형제는 인지질, 지방산 비누 및 콜레스테롤과 같은 소수성 계면 활성제를 포함한다. 본 발명의 교시에 따르면, 당업자들은 부적절한 실험을 거치지 않고 유사한 바람직한 특성을 나타내는 물질을 확인할 수 있을 것이다.

건조 분말로서 사용되든지 비수성 현탁액에 혼합되어 사용되든지 간에, 미립자 또는 천공된 미세구조물은 "건조" 상태로 제공하는 것이 바람직할 것이다. 이렇게 하면 미립자는 실온에서 저장하는 동안 분말이 화학적 및 물리적으로 안정하게 유지되고 쉽게 분산될 수 있는 수분 함량을 포함할 것이다. 이와 같이, 미립자의 수분 함량은 일반적으로 6 중량% 이하, 바람직하게는 3 중량% 이하이다. 어떤 경우에는 수분 함량이 1 중량% 만큼 낮다. 물론, 수분 함량은, 적어도 부분적으로, 조성물에 의해 결정되고 이용하는 공정 조건, 예를 들면 입구 온도, 공급 농도, 공급 속도 및 발포제 형태, 농도 및 후건조에 의해 조절된다.

당업자에게 공지된 바와 같이, 정지 각도 또는 전단 지수와 같은 방법을 건조 분말의 유동 특성을 측정하는데 사용할 수 있다. 정지 각도는 분말 원주를 평평한 면에 부을 때 형성되는 각으로 정의한다. 정지 각도가 45 °내지 20°인 분말이 바람직하며 적합한 분말 유동을 나타낸다. 더욱 구체적으로, 정지 각도가 33°내지 20°사이인 분말은 비교적 낮은 전단 응력으로 유동하며, 특히 흡입 치료(예, DPI)용 약학 제제에 유용하다. 정지 각도보다 측정 시간이 더 걸리지만, 전단 지수는 더 믿을만하고 측정이 용이하다. 당업자들은 본 명세서에서 참고 인용하는 Amidon 및 Houghton이 기술한 실험 절차(G.E. Amidon 및 M.E. Houghton, Pharm. Manuf., 2, 20 1985)가 본 발명의 전단 지수를 측정하는 데 사용할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 역시, 본 명세서에서 참고 인용하는 S. Kocova 및 N. Pipel의 문헌 〔J. Pharm. Pharmacol. 8, 33-55, 1973〕에 기술된 바와 같이, 수율 스트레스, 효과적인 내부 마찰각, 장력 및 특이적 응집력과 같은 분말 변수로부터 전단 지수를 측정할 수 있다. 본 발명에서는, 전단 지수가 약 0.98 이하인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 조성물, 방법 및 장치에 사용되는 분말은 전단 지수가 약 1.1 이하이다. 특히 바람직한 양태에서는, 전단 지수가 약 1.3 이하, 또는 약 1.5 이하이다. 물론, 원하는 위치에 활성제 또는 생물 활성제를 효과적으로 침적시킨다면, 다른 전단 지수를 갖는 분말을 사용할 수 있다.

또한, 분말의 유동 특성이 용적 밀도 측정치와 밀접한 관련이 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 점에서, 통상적인 선행 기술의 의견(C. F. Harwood, J. Pharm, Sci., 60, 161-163, 1971)은 용적 밀도의 증가는 물질의 전단 지수에 의해 예상되는 것 처럼, 향상된 유동 특성과 관련있다고 간주한다. 이와는 반대로, 놀랍게도, 본 발명의 천공된 미세구조물에서는 비교적 낮은 용적 밀도를 갖는 분말이 우수한 유동 특성을 나타낸다는 것을 알게 되었다. 즉, 본 발명의 공동의 다공성 분말은 실질적으로 구멍이 없는 분말에 비해 우수한 유동 특성을 나타냈다. 이러한 목적을 위해, 특히 바람직한 유동 특성을 나타내는 용적 밀도가 0.5 g/cm³이하인 분말을 제공하는 것이 가능하다는 것을 알게 되었다. 더욱 놀랍게도, 용적 밀도가 0.3 g/cm³이하, 약 0.1 g/cm³이하 또는 0.05 g/cm³이하인 우수한 유동 특성을 나타내는 천공된 미세구조물 분말을 제공하는 것이 가능하다는 것을 알게 되었다. 우수한 유동 능력을 갖는 저용적 밀도 분말을 생산하는 능력 또한 본 발명의 신규하고 예기치 않은 특징임을 강조한다.

본 발명의 분말을 DPI와 함께 사용할 경우 이러한 저용적 밀도가 특히 유익하다. 구체적으로, 아주 낮은 용적 밀도를 갖는 분말 조성물을 제공함으로써, 본 발명은 건조 분말 흡입 장치에 사용하는 데 상업적으로 적합한 최소한의 충전 중량으로 감소시킨다. 즉, DPI용으로 고안된 대부분의 단위 투여 용기는 고정된 부피 또는 중량 측정 기술을 이용하여 충전된다. 많은 선행 기술 조성물과는 대조적으로, 본 발명은 생물 활성제 및 첨가물 또는 증량제가 전체 흡입된 입자를 채우는 분말을 제공한다. 매우 낮은 용적 밀도를 갖는 입자를 제공함으로써, 단위 투여 용기로 충전될 수 있는 최소한의 분말 질량이 감소되며, 이는 담체 입자의 필요성을 제거한다. 즉, 본 발명의 비교적 낮은 용적 밀도를 갖는 분말은 담체 입자를 이용하지 않고 비교적 소량의 약학적 화합물을 재현적으로 투여할 수 있게 한다. 뿐만아니라, 담체 입자의 제거는 인후 침적을 감소시켜서, 선행 기술 조성물의 큰 유당 입자가 입자의 크기로 인해 인후 및 상부 기도와 충돌하기 때문에 생기는 "구역질" 증상을 완화시키는 작용을 한다.

천공된 미세구조물 분말에 의해 제공되는 인력(예, 반데르발스 힘, 정전기력, 수소 결합 및 액체 가교력 등)의 감소 및 우수한 유동성은 특히 흡입 치료(예, DPI, MDI, 연무기와 같은 흡입 장치를 이용한)용 제제에 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 유동 능력과 함께, 천공된 또는 다공성 및/또는 공동 구조의 미세구조물은 또한 방출시 분말의 결과적인 연무질 특성에도 중요한 역할을 한다. 이러한 현상은 MDI 또는 연무기의 경우에서와 같은 현탁액으로서 연무화된 미립자 또는 천공된 미세구조물 또는 DPI의 경우에서와 같은 건조 형태의 천공된 미세구조물의 전달에서 사실로 나타난다. 이러한 점에서, 천공된 구조 및 비교적 높은 표면적의 분산된 미립자는 흡입하는 동안의 기체 유동에 따라 비슷한 크기의 비천공된 입자보다 더 멀리 더 쉽게 전달될 수 있다.

더욱 구체적으로는, 이들의 고 다공도 때문에, 입자의 밀도가 1.0 g/cm³보다 훨씬 낮고, 일반적으로 0.5 g/cm³, 더욱 일반적으로는 0.1 g/cm³및 0.01 g/cm³만큼 낮다. 기하적 입자 크기와는 달리, 천공된 미세구조물의 공기 역학적적 입자 크기인 d_aer은 실질적으로 입자 밀도, ρ: d_aer= d_aerρ(여기서, d_aer는 기하적 직경이다)에 의존한다. 입자 밀도가 0.1 g/cm³인 경우 d_aer는 대개 d_aer보다 3배 적을 것이며, 이는 폐의 말초 영역에 입자의 침적을 증가시키고 그에 따라 인후의 침적을 감소시킬 것이다. 이러한 점에서, 천공된 미세구조물의 평균 공기 역학적 적 직경은 약 5 ㎛ 미만이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 3 ㎛ 미만, 그리고 특히 바람직한 양태에서는 약 2㎛ 미만이다. 이러한 입자의 분포는 DPI, MDI 또는 연무기 중 어느 것을 통해 투여하든지 간에, 생물 활성제를 폐에 깊이 침적시킬 것이다.

하기 실시예에서 기술되는 바와 같이, 본 발명의 연무질 조성물의 입자 크기의 분포는 예를 들면 캐스캐이드 충격과 같은 또는 타임 오브 플라이트 분석법과 같은 종래의 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 뿐만아니라, 흡입 장치로부터 방출된 양의 측정은 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 파마코피아 방법(Pharmacopeial Previews, 22(1006) 3065)에 따라 수행하였다. 이러한 기술 및 이와 관련된 기술을 통해 폐에 효과적으로 침적될 것 같은 미립자에 해당하는 연무질의 "미립자 분획"을 측정할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "미립자 분획"이란 DPI, MDI 또는 연무기의 마우스피스로부터 8단계 앤더슨 캐스캐이드 충격기의 2 내지 7 플레이트로의 작용당 전달되는 활성 약제의 총량의 백분율을 말한다. 이러한 측정치를 기준으로 하면, 본 발명의 조성물은 바람직하게 천공된 미세구조물(w/w)의 약 20 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 90 중량%, 더욱 더 바람직하게는 약 30 내지 80 중량%의 미립자 분획을 나타낼 것이다. 선택된 양태에서 본 발명은 약 30 중량%, 40 중량%, 50 중량%, 60 중량%, 70 중량%, 80 중량% 또는 90 중량% 이상 미립자 분획을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 선행 기술 조성물과 비교했을 때, 본 발명의 조성물은 충격기 입구 및 플레이트 0 및 1에서의 비교적 낮은 침적률을 나타낸다. 이러한 부품 위로의 침적은 사람 인후에서의 침적과 관련이 있다. 더욱 구체적으로, 시판되는 대부분의 MDI 및 DPI는 총량의 약 40 내지 70 중량%를 인후에 침적시키는 반면, 본 발명의 조성물이 일반적으로 약 20 중량% 이하로 침적시킨다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태는 약 40 중량%, 35 중량%, 30 중량%, 25 중량%, 20 중량%, 15 중량% 또는 10 중량% 이하의 인후 침적이 일어나도록 조정하였다. 당업자들은 본 발명에 의해 제공되는 인후 침적의 상당한 감소가 인후 염증과 같은 국소 부작용의 감소로 이어진다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의해 제공되는 이로운 침적 양상에 대해서, MDI 추진제는 일반적으로 현탁된 입자를 인후 후부를 향해 고속으로 장치 밖으로 방출시킨다는 것이 잘 알려져 있다. 선행 기술의 조성물은 일반적으로 큰 입자 및/또는 응집체를 많은 비율로 포함하기 때문에, 방출된 양의 2/3 이상이 인후와 충돌할 것이다. 또한, 종래의 분말 제제의 바람직하지 않은 전달 양상 또한 DPI 장치내에서 발생하는 것과 같은 저속 입자의 조건하에서 나타난다. 일반적으로 이러한 문제는 응집되기 쉬운 고체의 조밀한 입자를 연무화시킬 때 일어난다. 그러나, 전술한 바와 같이, 본 발명의 안정화된 분산물의 신규하고 예기치 않은 특성은 놀랍게도 DPI, MDI 분무기 또는 연무기와 같은 흡입 장치를 통해 투여한 후 놀라울 정도로 인후 침적을 감소시킨다.

특정 이론에 의해 뒷받침되지는 않지만, 본 발명의 인후 침적의 감소는 입자 응집의 감소 및 혼합된 미세구조물 공동 및/또는 다공성 형태에 의한 것으로 보인다. 즉, 분산된 미세구조물의 공동 및 다공성 특성은 공동/다공성 휘플공이 야구공 보다 더 빨리 감속되는 것 처럼, 추진제 흐름(또는 DPI의 경우 기체 흐름)내에서의 입자의 속도를 감소시킨다. 따라서, 비교적 천천히 이동하는 입자들은 인후 후부에 충돌 및 부착되기보다, 환자에 의해 흡입되기 쉽다. 뿐만아니라, 고도로 다공성인 입자의 성질은 천공된 미세구조물내의 추진제가 인후에 충돌하기 전에 재빨리 떨어져서 입자의 밀도를 감소시키게 한다. 따라서, 실질적으로 높은 비율로 투여된 생물 활성제는 효과적으로 흡수될 수 있는 폐 기도에 침적된다.

E. 분말 형성

전술한 바와 같이, 다양한 성분들이 본 발명의 미립자에 결합 또는 혼합될 수 있다. 유사하게, 여러가지 기술을 통해 원하는 형태(예, 천공된 또는 공동/다공성 구성), 분산성 및 밀도를 갖는 미립자를 제공할 수 있다. 기타 방법들 중에서, 분무 건조, 진공 건조, 용매 추출, 유화, 동결 건조 및 이들의 혼합 방법을 통해 본 발명에 적합한 미립자를 제조할 수 있다. 이러한 기술들 중 많은 것들의 기본 개념은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 교시에 따르면 부적절한 실험을 거치지 않고 이를 적용하여 원하는 구성 및/또는 밀도를 갖는 입자를 제조할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

몇가지 절차가 일반적으로 본 발명에 적용 가능하지만, 특히 바람직한 양태는 일반적으로 분무 건조에 의해 형성된 미립자 또는 천공된 미세구조물을 포함할 것이다. 잘 알려진 바와 같이, 분무 건조는 액체 공급액을 건조된 미립자 형태로 전환시키는 일단계 공정이다. 약학적으로 응용의 경우에도, 흡입을 포함한 다양한 투여 경로용의 분말화된 물질을 제공하기 위해 분무 건조가 사용되어 왔다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 문헌 〔M. Sacchetti 및 M.M. Van Oort in: Inhalation Aerosols: Physical and Biological Basis for Theraphy, A.J. Hickey, ed. Marcel Dekkar, New York, 1996〕을 참조할 수 있으며, 이는 본 명세서에 참고 인용한다.

일반적으로, 분무 건조는 고도로 분산화된 액체와 충분한 부피의 고온 공기를 모아서 증발시키는 단계와 액체 소적을 건조시키는 단계로 이루어진다. 분무 건조,즉 공급(즉, 공급 원액)되는 제제로는 선택된 분무 건조 장치를 이용하여 분무화될 수 있는 임의의 용액, 미정제 현탁액, 현탁액, 콜로이드성 분산액 또는 페이스트가 가능하다. 바람직한 양태에서는, 공급 원액은 유화액, 역 유화액, 미세유화액, 복수 유화액, 미립자 분산액 또는 현탁액과 같은 콜로이드성 물질을 포함할 것이다. 일반적으로 공급액을 여과된 따뜻한 기류로 분사하여 용매를 증발시키고 건조된 생성물은 수집기로 운송한다. 사용한 공기는 용매와 함께 배출시킨다. 당업자들은 원하는 생성물을 제조하기 위해 몇몇 다른 형태의 장치를 이용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 부치사 또는 니로사가 제조한 시판되는 분무 건조기를 이용하면 원하는 크기, 형태 및 밀도를 갖는 입자를 효과적으로 생산할 것이다.

이러한 분무 건조기, 특히 연무기는 특정 용도, 즉 2중 노즐 기술을 이용한 2종 용액의 동시 분사를 위해 변형 또는 제조될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱 구체적으로는 수중 유형 유제를 제1 노즐로부터 분사할 수 있고, 만니톨과 같은 항점착제를 포함하는 용액을 제2 노즐로부터 분사할 수 있다. 다른 경우에는, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 펌프를 이용하여 상품화된 노즐를 통해 공급 용액을 주입하는 것이 바람직할 수 있다. 원하는 형태 및/또는 조성물을 포함하는 미세구조물을 제조할 수 있다면, 장치의 선택은 그다지 중요하지 않다는 것을, 본 발명의 교시에 따르면 당업자들은 쉽게 이해할 것이다.

이렇게 얻은 분무 건조된 분말은 일반적으로 구에 가까운 형태이고 크기가 거의 일정하며 중공성이기도 하지만 혼합된 약제 및 분무 건조 조건에 따라 형태가 어느 정도 불규칙적일 수 있다. 어떤 경우에는, 제조시 증량제(즉, 충전제)를 사용하면, 미립자 또는 천공된 미세구조물의 분산 안정성 및 분산성이 향상되는 것으로 나타난다. 특히 바람직한 양태는 분산층 또는 연속층으로서 증량제를 함유하는 유화액을 포함할 수 있다. 증량제는 계면 활성제를 이용하여 분산시키는 것이 바람직한데, 예를 들면 약 5000 내지 15,000 psi의 압력하에 시판되는 미세유화제를 사용하는 것이다. 이러한 공정은 일반적으로 수성 연속층내에 분산된 물과 불혼화성인 충전제의 미크론 이하의 소적을 포함하는, 바람직하게 혼합된 계면 활성제에 의해 안정화된 유화액을 형성시킨다. 이러한 기술 및 기타 기술을 이용한 이러한 유화액의 제조는 일반적이며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 충전제로는 분무 건조 과정 중에 증발하여, 선택된 양태에서는 비교적 공동, 다공성 공기 역학적적 광 미세구를 남게하는 불화된 화합물(예, 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로옥틸 브로마이드, 퍼플루오로데칼린, 퍼플루오로부틸 에탄)이 바람직하다. 아래에서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, 다른 적합한 액체 충전제로는 비불화된 오일, 클로로포름, 프레온, 에틸 아세테이트, 알코올 및 탄화수소가 있다. 질소 및 이산화탄소 기체 또한 적합한 충전제로 간주된다.

전술한 화합물 뿐만아니라, 감압하에서 제조 후 단계에서의 승화에 의해 제거될 수 있는 무기 및 유기 물질 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다. 이러한 승화성 화합물은 분무 건조 공급액내에서 미세화된 결정으로 용해되거나 분산될 수 있으며, 암모늄 카보네이트 및 캠포가 그 예이다. 본 발명에 적합한 다른 화합물은 공급액에 분산될 수 있고 그 상태에서 제조될 수 있는 강화 고체 구조물을 포함한다. 그런 다음, 이 구조물은 초기의 입자를 생성시킨 후, 제조 후 용매 추출 단계를 통해 추출된다. 예를 들면, 유액 입자를 분산시킨 다음, 다른 막 형성 화합물과 함께 건조시켜서 적합한 용매로 추출시킬 수 있다.

전술한 바와 같이 충전제를 이용하여 미립자를 제조하는 것이 바람직하지만, 일부 경우에는 충전제를 첨가하지 않고 약제의 수성 분산물 및/또는 부형제 및 계면 활성제를 직접 분무 건조시키는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 경우에는, 공동의 비교적 다공성인 미립자를 형성할 수 있는 공정 조건(예, 증가된 온도)을 통해 조성물을 제조할 수 있다. 또한, 이러한 약제는 특수한 물리화학적 특성(예, 고결정성, 증가된 녹는점, 표면 활성 등)을 지닐 수 있어서 이러한 기술에 사용하기에 특히 적합하다.

충전제를 사용할 경우, 결과적인 미립자의 다공성 및 분산성의 정도는, 적어도 부분적으로, 충전제의 성질, 공급액의 농도(예, 유화액으로서) 및 분무 건조 조건에 의존하는 것으로 보인다. 다공성 및 현탁액에서의 분산성에 대해서는, 놀랍게도, 이전까지 충전제로 고려하지 않았던 화합물을 사용하여 특히 바람직한 특성을 갖는 천공된 미세 구조물을 제조할 수 있다는 것을 알게 되었다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 이러한 신규하고 예기치 않은 측면을 통해, 비교적 끓는점이 높은 불화된 화합물(즉, 약 40℃ 이상)을 사용하여 특히 다공성인 미립자를 생산할 수 있다는 것을 알게 되었다. 이러한 천공된 미세구조물는 특히 흡입 치료에 적합하다. 이러한 점에서, 끓는점이 약 40℃, 50℃, 60 ℃, 70℃, 80℃, 90℃ 또는 95℃ 이상인 불화된 또는 부분적으로 불화된 발포제를 사용하는 것이 가능하다. 끓는점이 물보다 높은, 즉 100℃ 이상인 발포제(예, 퍼플루브론, 퍼플루오로데칼린)를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 0.3 ㎛ 이하의 평균 가중 입자 직경을 갖는 안정한 유화액 분산물의 제조를 용이하게 하는, 비교적 물에 대한 용해도가 낮은( ＞10^-6M) 발포제를 사용하는 것이 바람직하다.

전술한 바와 같이, 이러한 발포제는 분무 건조전에 유화된 공급 원액에 혼합되는 것이 바람직하다. 본 발명의 목적을 위해서, 이러한 공급 원액은 또한 1종 이상의 생물 활성제, 1종 이상의 계면 활성제 또는 1종 이상의 부형제를 포함하는 것이 바람직하다. 물론, 상기 성분들의 배합물 또한 본 발명의 범위내에 속하는 것이다. 끓는점이 높은( ＞100℃) 불화된 충전제가 본 발명의 바람직한 양태를 이루지만, 유사한 끓는점(＞100℃)을 갖는 비불화된 발포제 또한 적합한 미립자를 제공하는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 비불화된 발포제의 예는 하기 화학식을 포함한다:

R¹-X-R²또는 R¹-X

상기 식 중, R¹또는 R²는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 방향족, 시클릭 또는 이들의 배합물이며, X는 탄소, 황, 질소, 할로겐, 인, 산소 및 이들의 배합물을 포함하는 임의의 군이다.

본 발명이 임의의 방식에 의해 제한 되는 것은 아니지만, 분무 건조 동안에 수성 공급 성분이 증발함에 따라, 입자 표면에 얇은 껍질을 남게 된다고 추정할 때, 분무 건조의 초기 과정 의 결과로 형성된 얻은 입자 벽 또는 껍질은 수백개의 유화액 소적(약 200 내지 300 nm)으로서 끓는점이 높은 발포제를 포획하는 것으로 보인다. 건조 과정이 진행됨에 따라, 입자의 내부 압력은 증가하게 됨으로써, 적어도 혼합된 발포제의 일부를 증발시키고 비교적 얇은 껍질을 통과하게 한다. 이러한 배출 또는 기체의 방출은 분명히 미세구조내에 구멍 또는 다른 흠을 형성시킨다. 동시에 남아있는 미립자 성분(약간의 발포제를 포함할 수 있음)은 입자가 경화됨에 따라 내부에서 표면으로 이동하게 된다. 이러한 이동은 건조 과정 동안 증가된 내부 점도에 의해 일어난 질량 전이에 대한 증가된 저항력의 결과로서 분명히 천천히 일어난다. 일단 이동이 끝나면, 입자는 경화되어서, 공극, 구멍, 결함, 공동, 공간, 간극, 틈, 천공 또는 소공을 남기게 된다. 구멍 또는 결함의 수와 이들의 크기 및 결과적인 막 두께는 대개 조성물 및/ 또는 선택된 발포제의 성질(예, 끓는점), 유화액에서의 발포제의 농도, 총 고체 농도 및 분무 건조 조건에 의존한다. 전술한 바와 같이, 이러한 천공된 입자 형태는, 적어도 부분적으로, 분말 분산성, 현탁 안정성 및 공기 역학적을 향상시키는 것으로 나타난다.

놀랍게도, 이렇게 비교적 높은 끓는점의 발포제의 상당양은 분무 건조된 생성물에 잔류한다는 것을 알게 되었다. 즉, 전술한 분무 건조된 미립자는 1 중량%, 3 중량%, 5 중량%, 10 중량%, 20 중량%, 30 중량% 또는 40 중량%의 잔류 발포제를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 이러한 잔류 발포제에 의해 야기되는 증가된 입자 밀도의 결과로서 더 높은 수율로 생산할 수 있다. 잔류 불화된 발포제는 미립자의 표면 특성을 변화시켜서 공정 과정 동안 입자의 응집을 감소시키고 나아가서 분산 안정성을 증가시킨다는 것을 당업자들은 이해할 수 있을 것이다. 분말내의 잔류 불화 발포제는 또한 장벽을 만들거나 제조 과정 동안 발생하는 인력(예, 정전기력)을 완화시킴으로써 입자간의 응집력을 감소시킬 수 있다. 응집력의 이러한 감소는 본 발명의 미세구조물을 건조 분말 흡입기와 함께 사용할 경우 특히 이익이 될 수 있다.

또한, 잔류 발포제의 양은 공정 조건(예를 들면, 출구 온도), 발포제 농도 또는 끓는점에 의해 조절될 수 있다. 출구 온도가 끓는점 이상이면, 발포제는 입자로부터 방출되어 생산율은 감소된다. 바람직한 출구 온도는 일반적으로 발포제의 끓는점보다 낮은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100℃로 조절될 것이다. 출구 온도와 끓는점간의 온도차가 50 내지 150℃의 범위인 것이 더욱 바람직할 것이다. 당업자라면, 선택된 활성제 및/또는 부형제에 적합한 공정 조건(예, 출구 온도)의 범위를 먼저 확인함으로써 입자 다공도, 생산율, 정전기력 및 분산성을 최적화할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그런 다음,온도차가 20 이상 150℃ 이하인 최대 출구 온도를 이용하여 바람직한 발포제를 선택할 수 있다. 어떤 경우에는, 온도차가 이 범위를 벗어날 수 있는데, 예를 들면, 임계 초과의 조건하에서 또는 동결 건조 기술을 이용하여 미립자를 제조할 경우가 그러하다. 당업자들은 또한 부적절한 실험을 거치지 않고 본 발명의 실시예에서 기술된 방법과 유사한 방법을 이용하여 바람직한 발포제 농도를 결정할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

잔류 발포제가 유용하게 사용될 수도 있지만, 특정 양태에서는, 건조 분무된 생성물로부터 발포제를 실질적으로 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 점에서, 잔류 발포제는 제조 후 증발 단계를 통해 진공 오븐내에서 쉽게 제거될 수 있다. 뿐만아니라, 이러한 제조 후 기술은 미립자내의 천공을 제공하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 진공하에서 형성된 미립자로부터 제거될 수 있는 생물 활성제 및 부형제를 분무 건조시킴으로써 구멍을 만들 수 있다.

어떤 경우에는, 공급 원액의 일반적인 발포제 농도는 2% 내지 5% v/v 사이이고, 약 10% 내지 45% v/v 사이인 것이 더욱 바람직하다. 다른 양태에서는 발포제의 농도가 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% v/v 이상인 것이 바람직하다. 그러나 다른 공급원 유화액은 선택된 화합물을 35%, 40%, 45% 또는 50% v/v로 포함할 수 있다.

바람직한 양태에서, 공급시 사용되는 발포제의 농도를 확인하는 또 다른 방법은 전구체 또는 공급 유화액내에 발포제의 농도 대 안정화 계면 활성제(예, 포스파티딜콜린, 즉 PC)의 농도 비로서 제공하는 것이다. 불화탄소 발포제(예, 퍼플루오로옥틸 브로마이드)의 경우를 예로 들어 설명하면, 이 비율을 PFC/PC비라고 한다. 더욱 일반적으로, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위에서, 다른 적합한 발포제 및/또는 계면 활성제로 예시 화합물을 대체할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 어떤 경우에든지, 일반적인 PFC/PC 비가 약 1 내지 약 60이며, 약 10 내지 약 50인 것이 더욱 바람직하다. 바람직한 양태에서는 이 비율이 일반적으로 약 5, 10, 20, 25, 30, 40 또는 50 이상이다. 더 높은 PFC/PC 비를 사용하면 더 공동, 다공성 성질의 구조물을 만들 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱 구체적으로, 약 4.8을 초과하는 PFC/PC 비율을 이용하는 방법들은 본 발명의 건조 분말 조성물 및 분산물에 특히 적합한 구조물을 제공할 수 있다.

비교적 끓는점이 높은 발포제가 본 발명의 바람직한 일 양태이지만, 다른 발포제 또는 증량제 또한 본 발명에 적합한 미세구조물을 제공하는 데 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이와 같이, 발포제는 원하는 미세구조물을 생산하기 위한 공급액내에 혼합될 수 있는 임의의 휘발성 물질을 포함할 수 있다. 이 발포제는 초기 건조 과정 또는 진공 건조 또는 용매 추출과 같은 제조 후 단계 동안에 제거될 수 있다. 적절한 발포제는 다음을 포함한다:

1. 용액을 포화시키는데 사용되는 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 알코올과 같은 수용액과 혼화가능한 끓는점이 낮은(100℃ 이하)용해된 물질.

2. 승압에서 사용되는 이산화탄소나 질소와 같은 기체, 또는 프레온, CFC, HFA, PFC, HFC, HFB, 플루오로알칸 및 탄화수소와 같은 기체.

3. 일반적으로 하기 화학식으로 이루어진 본 발명에 사용하기에 적합한 비혼화성의 끓는점이 낮은(100℃ 이하) 액체의 유화액:

R¹-X-R²또는 R¹-X

상기 식 중, R¹또는 R²는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐 방향족, 시클릭 또는 이들의 배합물이고, X는 탄소, 황, 질소, 할로겐, 인, 산소 및 이들의 배합물을 포함하는 임의의 기이다.

4. 제조 후 단계에서 감압하에 승화를 통해 제거할 수 있는 암모늄염, 캠포 등과 같은 용해 또는 분산된 염 또는 유기 물질.

5. 제조 후 용매 추출 단계를 이용하여 초기의 입자 생성 후에 추출할 수 있는 분산된 고체.

끓는점이 낮은 증량제는 일반적으로 계면 활성제 용액의 약 1% 내지 40% v/v의 양으로 공급 원액에 첨가한다. 약 15% v/v 증량제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 분무 건조된 분말을 생산하다는 것을 알게 되었다.

최종적으로 선택되는 증량제의 형태에 관계없이, 본 발명에 적합한 미립자는 뷔치 미니 분무 건조기(모델 B-191, 스위스)와 같은 시판되는 기기를 이용하여 생산할 수 있다. 당업자들이 이해하는 바와 같이, 분무 건조기의 입구 온도 및 출구 온도는 원하는 입자 크기를 제공하고, 혼합된 생물 활성제의 활성을 유지하도록 조절될 수 있다. 이러한 점에서, 입구 및 출구 온도는 공급 원액의 조성물의 성분 및 공급 원액의 조성의 용해 특성에 따라 조절할 수 있다. 따라서, 공급물의 조성 및 원하는 미립자 특성에 따라 입구 온도는 60℃ 내지 170℃ 사이, 출구 온도는 약 40 ℃내지 120℃ 사이일 수 있다. 입구 온도가 90℃ 내지 120℃, 출구 온도가 60℃ 내지 90℃ 인 것이 더욱 바람직할 것이다. 분무 건조 장치에 이용되는 유속은 일반적으로 약 3 ml/분 내지 약 15 ml/분일 것이다. 분무기 기류 속도는 25 l/분 내지 약 50 l/분 사이에서 다양할 것이다. 시판되는 분무 건조기는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 특정 분산물에 적합한 설치는 첨부되는 예를 참조하여 표준 실험 테스트를 통해 쉽게 결정할 수 있다.

극미립자가 불화된 발포제를 이용하여 유화액의 형태로 형성되는 것이 바람직하지만, 비불화된 오일을 사용하여 미세구조물과 절충하지 않고 생물 활성제의 용적을 증가시킬 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 경우에, 비불화된 오일의 선택은 활성제 또는 생물 활성제의 용해도, 물에 대한 용해도, 끓는점 및 인화점을 기초로 한다. 생물 활성제를 오일에 용해시킨 다음, 공급액에 유화시킨다. 바람직하게 오일은 선택된 제제에 대한 실질적인 가용성, 물에 대한 낮은 용해도(＜ 10^-3M), 물 보다 높은 끓는점 및 건조 출구 온도보다 높은 인화점을 지닐 것이다. 가용성을 증가시키기 위해서 비불화된 오일에 계면 활성제 및 용매 보조제를 첨가하는 것 또한 본 발명의 범위에 속하는 것이다.

특히 바람직한 양태에서, 비불화된 오일을 수성 조성물에서의 제한된 용해도를 갖는 생물 활성제를 용해시키는 데 사용할 수 있다. 비불화된 오일을 사용하는 것은 소수성 펩티드 및 단백질의 용적을 증가시키는데 특히 유용하다. 이러한 화합물을 용해시키는 오일 또는 오일 혼합물은 굴절 지수가 1.36 및 1.41의 범위인 것(예, 에틸 부티레이트, 부틸 카보네이트, 디부틸 에테르)이 바람직하다. 뿐만아니라, 온도와 압력 같은 공정 조건을 선택된 제제의 가용성을 높이도록 조절할 수 있다. 제제의 용적을 최대화하기 위해 적절한 오일 또는 오일 혼합물 및 공정 조건을 선택하는 것은 본 발명의 교시에 따르면 당업자들이 인식하는 범위의 것이고, 부적절한 실험을 거치지 않고 수행할 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 양태는 인지질과 같은 계면 활성제 및 1종 이상의 생물 활성제를 포함하는 분무 건조된 제제를 포함한다. 다른 양태는 임의의 선택된 계면 활성제 외에도, 탄수화물(즉, 포도당, 유당 또는 전분)과 같은 친수성 부위를 포함하는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 점에서, 다양한 전분 및 전분 유도체가 본 발명에 사용하기에 특히 적합하다. 다른 선택적인 성분으로는 통상의 점도 변형제, 포스페이트 완충액 또는 기타 통상적인 생물화합성 완충액과 같은 완충액, 또는 산이나 염기와 같은 pH 조정제, 및 삼투압제(등장성, 고삼투압 또는 저삼투압을 제공하는 것)를 포함할 수 있다. 적절한 염의 예로는 나트륨 포스페이트(1염기 및 2염기 모두), 염화나트륨, 칼슘 포스페이트, 염화칼슘 및 기타 생리학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.

어느 성분이 선택되든지 간에, 미립자 제조의 첫 단계는 일반적으로 공급 원액 제조를 포함한다. 선택된 약제를 물에 용해시켜서 농축액을 만드는 것이 바람직하다. 또한, 특히 불수용성 제제의 경우, 약제는 유화액내에서 직접적으로 분산될 수 있다. 대안으로, 약제를 고체 미립자 분산물 형태로 혼합할 수 있다. 사용되는 활성제 또는 생물 활성제의 농도는 최종 분말에서 요구되는 제제의 양 및 이용되는 전달 장치의 성능(예, MDI 또는 DPI의 경우 미세 입자 투여)에 의존한다. 필요한 경우, 폴록사머 188 또는 스판 80과 같은 보조 계면 활성제를 이러한 첨가 용액에 분산시킬 수 있다. 추가적으로, 설탕 및 전분과 같은 부형제를 첨가할 수도 있다.

선택된 양태에서는 그 후, 분리된 용기에서 수중 유형 유제를 형성시킨다. 사용되는 오일은 장쇄 포화 인지질과 같은 계면 활성제를 이용하여 유화시킨 불화탄소(예, 퍼플루오로옥틸 브로마이드, 퍼플루오로데칼린)가 바람직하다. 예를 들면, 적합한 고전단 기계 혼합기(예, 울트라-투락스 모델 T-25 혼합기)를 이용하여 8000 rpm으로 2 내지 5분 동안 1 g의 인지질을 150 g의 고온 증류수(예, 60℃)내에 균질화시킬 수 있다. 혼합하는 동안 일반적으로 5 내지 25 g의 불화탄소를 분산된 계면 활성제 용액에 적가한다. 예를 들면, 이 유화액을 50 내지 80℃를 유지하면서 12,000 내지 18,000 psi로 5회에 거쳐 통과시켜서 가공할 수 있다.

그런 다음, 생물 활성제 용액 및 퍼플루오로탄소 유화액을 모아서 분무 건조기에 공급할 수 있다. 유화액이 수성 연속층을 포함하는 것이 바람직하기 때문에, 일반적으로 두가지 제제가 혼합될 수 있을 것이다. 본 발명의 목적을 위해서 생물 활성제를 독립적으로 용해시키지만, 다른 양태에서는, 활성제 또는 생물 활성제를 유화액에 직접적으로 용해(또는 분산화)시킬 수 있다. 이러한 경우에는, 활성제 유화액 또는 생물 활성제 유화액은 별개의 약제를 혼합하지 않고 간단히 분무 건조된다.

어떤 경우에든지, 원하는 입자 크기 및 결과적인 건조 미세구조물의 생산율로 생산하기 위해 제조자의 지시에 따라 입구 온도 및 출구 온도, 공급 속도, 분무화 압력, 건조 공기의 유속 및 분사구 형태와 같은 공정 조건을 조절할 수 있다. 조절 예는 다음과 같다: 입구 온도: 60℃ 내지 170℃ ; 공기 입구 온도: 40℃ 내지 120℃ ; 공급 속도: 3 ml 내지 약 15 ml/분; 및 흡출 공기 흐름: 300 L/ml, 분무화 기류 속도: 25 내지 50 L/분. 적절한 장치 및 공정 조건의 선택은 본 발명의 교시에 따르면 당업자들이 인식하는 범위의 것이며, 부적절한 실험을 거치지 않고 수행할 수 있다. 어떤 경우에든지, 이러한 방법 및 이와 실질적으로 동일한 방법을 이용하면 폐로의 연무질 침적에 적절한 입자 직경을 갖는 공동 다공성의 공기 역학적적 광 미세구를 제조할 수 있다. 공동 및 다공성인 미세구조물은 거의 벌집 또는 거품의 형상을 하고 있다. 특히 바람직한 양태에서는, 천공된 미세구조물이 공동, 다공성의 건조된 미세구를 포함한다.

분무 건조법과 함께 동결 건조를 통해 본 발명에 유용한 천공된 미세구조물을 생성할 수 있다. 당업자라면, 동결 건조는 물이 동결된 조성물로부터 승화되는 동결 건조되는 과정이라는 것을 이해할 것이다. 동결 건조 과정과 관련된 특별한 이점은 수용액에서 비교적 불안정한 생물 제제 및 기타 약제를 온도를 증가시키지 않고 건조시켜서(이로써 불리한 열의 영향을 제거한다), 안정성 문제가 거의 없는 건조 상태로 저장이 가능하다는 것이다. 본 발명에 있어서, 이러한 기술은 펩티드, 단백질, 유전 물질 및 기타 천연 및 합성 거대 분자를 생리학적 활성을 손실시키지 않고 미립자 또는 천공된 미세구조물로 혼합시키는데 특히 적합하다. 동결 건조된 미립자를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 교시에 따르면 부적절한 실험을 거치지 않고 적합한 미세구조물을 제조할 수 있다. 미세 거품과 같은 구조를 포함하는 동결 건조된 고체를 당해 기술 분야에 공지된 기술을 이용하여 미세화시켜서 평균 직경이 5 ㎛ 또는 10 ㎛ 이하인 입자를 제조할 수 있다. 따라서, 동결 건조 과정이 원하는 특성을 지닌 미세구조물을 제조하는 데 사용되는 한, 이것은 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.

전술한 기술 외에도, 본 발명의 미립자 및 천공된 미세구조물은 또한 막 형성 물질을 포함하는 공급액(유화액이든 수용액이든)을 감압하에서 가열된 오일(예, 퍼플루브론 또는 기타 끓는점이 높은 FC) 저장기에 재빨리 첨가하는 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 공급액의 수분 및 휘발성 용매는 빨리 끓어 증발한다. 이러한 공정은 튀밥 또는 팝콘과 유사하게 막 형성 물질로부터 천공된 구조를 제조하는데 사용될 수 있다. 벽 형성 물질은 가열된 오일내에서 불용성인 것이 바람직하다. 이렇게 얻은 입자를 여과 기술을 이용하여 가열된 오일로부터 분리한 다음, 진공하에서 건조시킬 수 있다.

추가적으로, 본 발명의 미립자 또는 천공된 미세구조물은 또한 2중 유화액 방법을 이용하여 형성시킬 수 있다. 2중 유화액 방법에서는, 약제를 먼저 초음파 분해 또는 균질화를 통해 유기 용매(예, 메틸렌 클로라이드)에 용해된 중합체내로 분산시킨다. 그 후, 폴리비닐알코올과 같은 유화제를 포함하는 연속수성층내에서 복수 유화액을 형성시킴으로써 이러한 1차 유화액을 안정화시킨다. 그런 다음, 통상적인 기술 및 장치를 이용한 증발 또는 추출을 통해 유기 용매를 제거한다. 그 후, 이렇게 얻은 미립자를 사용전에 세정, 여과, 건조시키거나, 이들을 본 발명에 따른 적절한 현탁액과 혼합한다.

F. 투여

최종적으로 선택되는 미립자 제조 방법이 무엇이든지 간에, 이렇게 얻은 분말은 분말 형태 또는 비수성 현탁 매체를 포함하는 분산물로서 효과적으로 사용될 수 있게 하는 많은 이로운 특성을 지닌다. 특히 바람직한 양태에서, 생활성 조성물은, 이것이 건조 형태이든 분산물이든지 간에, 흡입 치료를 통해 호흡관(즉, 폐 및/또는 비측 경로)의 점막 표면에 투여된다. 이러한 투여는 MDI, DPI, 연무기, 비측용 펌프, 분무기, 분사병을 이용하거나, 소적의 형태로 직접 점적함으로써 수행될 수 있다. 그러나, 흡입 치료가 본 발명에 가장 적합하지만, 다른 형태의 투여 방법 및/또는 투여 경로 또한 유용하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

이러한 점에서, 본 발명의 분말 및 안정화된 분산물은 체내의 어느 위치에 국소적 또는 전신적으로 화합물을 투여하는데 사용될 수도 있다. 따라서, 바람직한 양태에서는, 이 제제를 국소, 근육내, 경피, 복강, 비측, 폐, 구강, 질, 직장, 귀, 경구 또는 눈을 포함하는 많은 다른 경로를 통해 전달할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직한 표적 위치는, 예를 들면 위장관, 비뇨생식기 또는 호흡관일 수 있다. 더욱 일반적으로는, 본 발명의 안정화된 분산물을 국소적으로 또는 체내 강에 투여함으로써 제제를 전달하는 데 사용할 수 있다. 바람직한 양태에서 체내 강은 복강, 공동, 직강, 요도, 위, 비강, 질, 이도, 구강, 볼 및 늑막으로 이루어진 군에서 선택된다. 당업자들은 선택된 투여 경로가 대개 생물 활성제의 선택 및 피검체에서의 원하는 반응에 의해 결정되다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 분말 또는 안정화된 분산물의 전달에 관한 본 발명의 또 다른 측면은 1종 이상의 생물 활성제 또는 생물 제제를 환자에게 투여하는 장치에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 적합한 흡입 장치의 예로는 분무기, 비측용 펌프, 분사기 또는 분사병, 건조 분말 흡입기, 측량 흡입기 또는 연무기를 들 수 있다. 바람직한 양태에서, 이러한 흡입 장치는 연무질의 형태로 생물 활성제를 원하는 생리학적 위치(예, 점막 표면)에 전달할 것이다. 본 발명의 목적을 위해서, "연무화된"이란, 문맥상의 제한에 의한 다른 지시 사항이 없는 한, 미세 고체 또는 액체 입자의 기체화 현탁액을 의미하는 것으로 간주한다. 즉, 연무질 또는 연무화된 약제는 건조 분말 흡입기, 측량 흡입기, 분무기, 분사병 또는 연무기 등에 의해 생성될 수 있다. 물론, 아래에서 상세히 기술하는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 또한 직접적으로 (예, 통상적인 주사 또는 무바늘 주사)또는 액체 투약 점적과 같은 기술을 이용하여 전달할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 분말 또는 분산물을 포함하는 무바늘 주사(예, 압축 기체총)에 관한 것이다.

F. 건조 분말 흡입기

흡입 치료에 대해서는, 당업자들은 본 발명의 분말, 특히 천공된 미세구조물을 포함하는 분말이 DPI에 특히 유용하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 통상적인 DPI, 즉 건조 분말 흡입기는 분말화된 조성물 및 미리 결정한 양의 약제가 단독으로 또는 유당 담체 입자와 혼합된 상태로 흡입을 위한 건조 분말의 미세한 안개 또는 연무질로서 전달되는 장치를 포함한다. 유용한 DPI 약제는 일반적으로 크기가 0.5 내지 20 ㎛인 독립적인 입자로 쉽게 분산되도록 조제된다. 이 분말은 흡입을 통해 또는 압축 공기와 같은 약간의 외부 전달력을 통해 전달된다. DPI 조성물은 일반적으로 단독 투여 단위로 포장되거나, 약제를 장치에 수동 전달하는 복수 투여량을 측정할 수 있는 저장기 장치를 이용한다.

DPI는 일반적으로 이용되는 투약 전달 장치를 기준으로 분류된다. 이러한 점에서, DPI의 주요한 두가지 형태는 단위 투약 전달 장치 및 대량 저장기 전달 장치이다. 본 명세서에서 사용되는 "저장기"란 포괄적인 의미로 사용될 것이며, 문맥상의 제한에 의한 다른 지시 사항이 없는한 두 장치 모두를 포함하는 것으로 간주한다. 어떤 경우에 든지, 단위 투약 전달 장치는 단일 단위로서 장치에 전달되는 분말 조성물의 투여량을 요구한다. 이러한 장치를 이용할 경우, 조성물은 습기 방지를 위해 호일로 포장되거나 발포제 스트립에 넣을 수 있는 투약용 웰에 미리 채워진다. 다른 단위 투약 포장은 경젤라틴 캡슐을 포함한다. DPI용으로 고안된 대부분의 단위 투약 용기는 고정된 부피 기술을 이용하여 충전한다. 결과적으로, 분말 유동 능력 및 용적 밀도에 의해 지배되는 단위 포장내로 측정 가능한 최소량에 대한 물리적인 제한(여기서는 밀도)이 존재한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 분말은 선행 기술의 담체 제제에 관련된 많은 문제점들을 제거한다. 즉, 본 발명에 개시된 것과 같은 입자 크기, 공기 역학적, 형태 및 밀도, 습도 및 전하를 조절함으로써 DPI 성능을 향상시킬 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명은 약제 및 첨가제 또는 증량제가 바람직하게 천공된 미세구조물과 관련되거나 포함하는 조성물을 제공한다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 바람직한 조성물은 일반적으로 용적 밀도가 0.1 g/cm³미만 및 종종 0.05 g/cm³미만인 분말을 생산한다. 용적 밀도가 통상적인 DPI 조성물보다 낮은 분말을 제공하는 것이 훨씬 적은 양의 선택된 생물 활성제를 단위 투약 용기에 채우거나 DPI를 기초로 한 저장기를 통해 측량하게 한다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 소량을 효과적으로 측정할 수 있는 능력은 호르몬과 같은 비교적 강력한 생물 활성제의 경우 중요하다. 뿐만아니라, 담체 입자에 결합하지 않고 입자를 효과적으로 전달할 수 있는 능력은 생성물 조제, 충전을 간단하게 하고, 원하지 않는 부작용을 감소시킨다.

본 발명의 분말은 비교적 다량의 생물 활성제를 단독으로 투여할 경우 특히 효과적이다. 선행 기술의 조성물과는 달리, 분말화된 조성물은 효과적인 충전 및 전달을 위해 증량제의 사용을 필요로하지 않기 때문에, 중량 기준으로 더 많은 생물 활성제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 한번에 약 10 mg의 생물 활성제를 전달하는데 사용될 수 있다는 것이 중요하다. 이러한 이점들은 수동 면역화를 위한 면역 조절제 또는 항체 등을 전달할 경우 특히 중요하다. 물론, 본 발명이 특별히 DPI의 사용에 관한 것이지만, 이러한 동일한 이점은 분산물 조성물 및 MDI, 비측용 펌프 및 무바늘 주사와 같은 다른 투여 형태에도 동일하게 적용된다.

전술한 이점을 외에도, 본 발명의 바람직한 양태는 특히 DPI에 사용하기에 효과적이게 하는 바람직한 공기 역학적적 특성을 나타낸다. 더욱 구체적으로, 천공된 구조 및 비교적 표면적이 넓은 극미립자는 비슷한 크기의 비교적 비천공된 입자보다 흡입하는 동안 기체의 흐름에 따라 더 쉽게 더 멀리 전달될 수 있게 한다. 이러한 고다공성 및 저밀도 때문에, DPI를 이용한 천공된 미세구조물의 투여는 비측 경로내의 점막 표면 및 폐의 말초 영역과 같은 표적 위치에의 입자의 침적을 증가시키고, 그에 따라 인후의 침적이 줄어든다. 이러한 입자의 분포를 이용하면 전신 투여에 바람직한 투여된 제제의 깊은 폐 침적을 증가시킨다. 뿐만아니라, 선행 기술의 DPI 제제를 실질적으로 향상시킨 본 발명의 저밀도, 고다공성 분말은 바람직하게 담체 입자의 필요성을 제거한다.

F(ii). 안정화된 분산물

건조 분말 구조물에서 사용하는 것 외에도, 안정화된 분산물을 제공하기 위해 본 발명의 분말을 현탁 매체에 혼합하여 사용할 수 있다. 안정화된 분산물은 비수성 현탁 매체를 포함하는 것이 바람직하다. 이 중에서도 특히, 안정화된 분산물은 MDI, 분무기 또는 분사병, 비측용 펌프, 무바늘 주사기, 연무기 또는 액체 투약 점적(LDI 기술)을 이용하여 환자의 폐 기도에 생물 활성제를 효과적으로 전달한다.

당업자라면, 본 발명의 분산물 또는 현탁액의 강화된 안정성은 현탁된 입자들 간의 반데르발스 힘을 완화시키고, 현탁액과 입자들간의 밀도차를 감소시킴으로써 이루어진다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 교시에 따르면, 현탁액 안정성의 증가는 천공된 미세구조물을 조작하여 적합한 현탁 매체에 분산시킴으로써 이루어질 수 있다. 전술한 바와 같이, 천공된 미세구조물은 유동 현탁 매체가 미립자의 경계를 자유롭게 투과하거나 침투할 수 있게 하는 구멍, 공극, 공동, 흠 또는 기타 간극을 포함한다. 특히 바람직한 양태는 공동, 다공성인, 거의 벌집 또는 거품과 같은 형상의 천공된 미세구조물을 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 천공된 미세구조물은 공동의, 다공성 분무 건조된 미세구를 포함한다. 물론, 다른 양태에서도 강화된 안정성은 비교적 비다공성, 고체 미립자를 포함하여 미립자 성분(예, 계면활성제)의 선택을 통해 이루어질 수 있다.

천공된 미세구조물을 현탁 매체(예, 히드로플루오로알칸 추진제 또는 액체 불화탄소)에 위치시키면, 현탁 매체는 입자를 침투하여, 연속적이고 분산된 층이 구별되지 않는 "균일분산액"을 만들게 된다. 한정된 또는 "가상의" 입자(즉, 극미립자 기질에 의해 둘러싸인 부피를 포함)는 이들이 현탁된 매체의 거의 대부분을 차지하게 되고, 입자 응집(침전) 추진력은 감소된다. 추가적으로, 한정된 입자와 연속층간의 밀도차는 미세구조로 매체를 채움으로써 감소되어, 입자 크림화 또는 침전을 효과적으로 감소시킨다. 이와 같이, 본 발명의 미립자 및 안정화된 분산물은 특히 많은 연무화 기술, 예를 들면 MDI, 분사병을 이용한 분무화, 비측용 펌프, 연무화 등에 적합하다. 뿐만아니라, 안정화된 분산물은 액체 투약 점적, 무바늘 주사, 통상적인 주사 및 국소 도포를 포함하는 다른 투여 경로에도 적합하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

선행 기술의 조성물과는 달리, 본 발명의 바람직한 현탁액은 입자간의 척력을 증가시키지 않고, 오히려 입자간의 인력을 감소시키도록 고안된다. 이러한 점에서, 비수성 매체의 주요 응집 추진력은 반데르발스 힘이라는 것을 이해할 수 있을 것이다. 전술한 바와 같이, VDW 힘은 양자 역학 유래의 힘으로, 파동 쌍극자(즉, 유도된 쌍극자-유도된 쌍극자 상호 작용)간의 인력으로 간주할 수 있다. 분산력은 매우 근거리적이며, 원자간의 거리의 6배의 크기이다. 두개의 거시적 물체가 적로 접근할 경우, 원자간의 분산력의 합은 증가한다. 결과적인 힘은 상당히 원거리적이며, 상호작용하는 물체의 기하적학에 의존한다.

더욱 구체적으로, 두개의 구 입자의 경우, VDW 힘의 크기, 즉 V_A의 크기는 하기식에 의해 어림잡을 수 있다.

상기 식 중, A_eff는 입자와 매체의 성질을 나타내는 유효 하마커 상수이고, H₀는 입자간의 거리이며, R₁및 R₂는 구 입자 1 및 2의 반경이다. 유효 하마커 상수는 분산된 입자와 현탁 매체의 극성 차이에 비례한다:

상기 식 중, A_SM및 A_PART는 각각 현탁액과 입자에 대한 하마커 상수이다. 현탁된 입자와 분산 매체의 성질이 유사해지면, A_SM및 A_PART의 크기는 비슷해지고, A_eff및 V_A는 더 작아진다. 즉, 현탁액과 관련된 하마커 상수와 분산 입자와 관련된 하마커 상수간의 차이를 감소시킴으로써, 유효 하마커 상수(및 이에 대응하는 반데르 발스 인력)가 감소될 수 있다.

하마커 상수의 차이를 감소시키는 한가지 방법은 전술한 바와 같이 연속층 및 분산층이 실질적으로 구별되지 않는 "균일분산액"을 만드는 것이다. 유효 하마커 상수를 감소시키기 위한 입자의 형태를 찾는 것 외에도, 구조 기질(천공된 미세구조물을 한정하는)의 성분을 바람직하게 선택하여 하마커 상수가 선택된 현탁액의 하마커 상수와 비교적 가깝게 하는 것이다. 이러한 점에서, 분산액 성분의 화합성을 결정하고 제제의 안정성 지수를 높이기 위해 현탁 매체와 미립자 성분의 하마커 상수의 실제 값을 이용할 수 있다. 대안으로, 측정 가능한 하마커 상수와 일치하지만 더욱 식별이 용이한 특징적인 물리적 값을 이용하여 비교적 양립가능한 미립자 또는 천공된 미세구조물과 현탁 매체를 선택할 수 있다.

이러한 점에서, 많은 화합물의 굴절 지수값은 대응하는 하마커 상수로 측정되는 경향이 있다. 따라서, 쉽게 측정가능한 굴절 지수값을 이용하여 현탁 매체와 입자 부형제의 배합물이 비교적 낮은 유효 하마커 상수와 관련된 안정성을 갖는 분산액을 제공할 것인가에 대한 매우 우수한 지수를 제공할 수 있다. 화합물의 굴절 지수가 광범위하게 이용되거나 쉽게 도출되기 때문에, 이러한 값을 이용하면 부적절한 실험 없이 본 발명에 따른 안정화된 조성물의 형성할 수 있다. 단지 설명을 위한 목적으로, 본 발명의 분산물에 적합한 몇가지 화합물의 굴절 지수를 하기 표 1에 기재한다.

화합물	굴절 지수
HFA-134a	1.172
HFA-227	1.223
CFC-12	1.287
CFC-114	1.288
PFOB	1.305
만니톨	1.333
에탄올	1.361
n-옥탄	1.397
DMPC	1.43
플루로닉 F-68	1.43
자당	1.538
히드록시에틸전분	1.54
염화나트륨	1.544

상기 언급한 적합한 분산물 성분과 일관되게, 당업자들은 굴절 지수차가 약 0.5 미만인 성분으로 이루어진 분산물의 형성이 바람직하다는 것을 이해할 것이다. 즉, 현탁 매체의 굴절 지수가 입자 또는 천공된 미세구조물과 관련된 굴절 지수의 약 0.5 내에 드는 것이 바람직할 것이다. 현탁 매체 및 입자의 굴절 지수는 직접적으로 측정하거나 각각의 개별층의 주요 성분의 굴절 지수를 이용하여 추정할 수 있다. 미립자 또는 천공된 미세구조물의 경우, 주성분은 중량 백분율을 기준으로 결정할 수 있다. 현탁 매체의 경우, 주성분은 일반적으로 부피 백분율 기준으로 도출된다. 본 발명의 특정 양태에서, 굴절 지수 차이값이 약 0.45, 약 0.4, 약 0.35 또는 약 0.3 미만인 것이 바람직하다. 더 낮은 굴절 지수 미분값이 더 큰 분산 안정성을 의미한다면, 특히 바람직한 양태는 약 0.28, 약 0.25, 약 0.2, 약 0.15 또는 약 0.1의 지수 차이값을 포함한다. 당업자들은 본 발명에 따라 부적절한 실험 없이 특히 적합한 부형제가 어느 것인지 결정할 수 있을 것임을 제시한다. 바람직한 부형제의 최종 선택은 생물화합성, 조절 상태, 제조의 용이성, 비용을 포함하는 다른 요인들에 의해서도 영향을 받는다.

전술한 바와 같이, 천공된 및/또는 공동의 미세구조물을 이용하여 입자와 연속층간의 밀도차를 감소시켜서, 현탁 매체의 대부분이 입자 부피로 이루어지게 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "입자 부피"란 혼합된 공동/다공성 입자(이들이 고체, 즉 입자 경계에 의해 한정되는 부피일 경우)에 의해 치환되는 현탁 매체의 부피를 말한다. 전술한 바와 같이, 이를 설명하면, 이러한 유체 충전된 미립자 부피는 "가상 입자"로서 간주될 수 있다. 바람직하게, 생물 활성제/부형제 외피 또는 기질의 평균 부피(즉, 천공된 미세구조에 의해 실질적으로 치환되는 매체의 부피)는 평균 입자 부피의 약 80% 미만(또는 실질적 입자의 80% 미만)을 포함한다. 미립자 기질은 평균 입자 부피의 약 50%, 40%, 30% 또는 20% 미만으로 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 외피/기질의 평균 부피가 평균 입자 부피의 약 10%, 5%, 3% 또는 1% 미만으로 포함하는 것이 더욱 더 바람직하다. 당업자라면, 이러한 기질 또는 외피 부피는 이것이 포함된 현탁 매체에 의해 대부분 결정되는 가상 입자 밀도에 일반적으로 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 이해할 것이다.

이러한 미세구조물의 사용은 반데르발스 인력을 실질적으로 제거함으로써 가상 입자의 실제 밀도가 현탁 매체의 밀도에 근접하게 한다. 뿐만아니라, 전술한 바와 같이, 미립자 기질의 성분은, 가능한한 다른 것들도 많이 고려하여, 현탁 매체의 밀도에 근접되도록 선택하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서, 가상 입자와 현탁 매체는 약 0.6 g/cm³미만의 밀도 차이값을 가질 것이다. 즉, 가상 입자의 평균 밀도는 현탁 매체의 약 0.6 g/cm³내에 속할 것이다. 더욱 바람직하게, 가상 입자의 평균 밀도는 선택된 현탁 매체의 0.5, 0.4, 0.3 또는 0.2 g/cm³내에 속하는 것이다. 더욱 더 바람직한 양태는 밀도차가 약 0.1, 0.05, 0.01 또는 0.005 g/cm³미만인 것이다.

전술한 이점들 외에도, 본 발명의 미립자를 사용하면 현탁액내에 더 맣은 부피의 입자 분획을 포함하는 분산물을 형성할 수 있다. 밀폐 포장에 가까운 부피 분획인 선행 기술의 분산물의 조성물은 일반적으로 분산 점성과 탄성이 급격히 증가하게 된다. 이러한 형태의 유동성은 MDI 또는 연무기에 사용하기에 적절하지 않다. 당업자라면, 입자의 부피 분획이 명백한 입자의 부피(즉, 입자 부피) 대 장치의 전체 부피의 비로 정의될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 단순한 입방체내에서의 입자는 0.52의 최고 포장 분획에 달하는 반면, 면 중심 입방/육방정계에 가까운 포장 구성에서는 약 0.74의 최고 포장 분획에 달한다. 구가 아닌 입자 또는 다분산 장치의 경우, 도출된 값이 다르다. 따라서, 최대 포장 분획은 흔히 주어진 장치의 실험적인 변수로 간주된다.

여기서, 놀랍게도 본 발명의 바람직한 미립자는 밀폐 포장에 가까운 높은 부피 분율에서도 원하지 않는 점성 및 탄성을 나타내지 않는다는 것을 알게 되었다. 이와는 대조적으로, 고체 미립자를 포함하는 유사한 현탁액과 비교할 경우, 이들은 유동이 자유롭고, 거의 또는 전혀 수율 스트레스가 없는 저점도의 현탁액으로서 존재한다. 본 발명의 현탁액의 저점도는, 적어도 상당 부분, 유체 충전된 공동, 다공성 입자간의 비교적 약한 반데르발스 힘에 기인하는 것으로 생각된다. 이와 같이, 선택된 양태에서는 본 발명의 분산물의 부피 분율이 약 0.3 이상이다. 다른 양태는 밀폐된 포장 조건에 가까운 높은 값인, 0.3 내지 약 0.5 또는 0.5 내지 약 0.8의 포장 값을 가질 수 있다. 뿐만아니라, 부피 분율이 밀폐 포장에 가까워지면, 입자 침전이 자연적을 감소하는 경향이 있기 때문에, 비교적 농축된 분산물의 형성이 조성물의 안정성을 더 증가시킬 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물이 비교적 농축된 현탁액을 형성하는데 사용될 수 있지만, 훨씬 저용량 포장에도 안정화 요소가 동등하게 작용하여, 이러한 분산물이 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다. 이러한 점에서, 저용량 분획을 포함하는 분산물은 선행 기술을 이용하여 안정화시키기가 매우 어렵다. 역으로, 본 발명의 생물 활성제를 포함하는 혼합된 입자의 분산물은 저용량 분획에서도 특히 안정하다. 따라서, 본 발명은 안정화된 분산물, 특히 호흡기 분산물이 0.3 미만의 부피 분율로 형성되고 이용될 수 있게 한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 부피 분율이 약 0.0001 내지 0.3이고, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.01이다. 또 다른 바람직한 양내는 부피 분율이 약 0.01 내지 약 0.1인 부피 분율을 갖는 안정화된 분산물을 포함한다.

본 발명의 천공된 미세구조물은 또한 미세화된 생물 활성제의 희석 현탁액을 안정화하는데도 사용될 수 있다. 이러한 양태에서, 천공된 미세구조물은 현탁액 내 입자의 부피 분율을 증가시키기 위해 첨가되어서, 크림화 또는 침전에 대한 현탁액 안정성을 증가시킨다. 또한, 이러한 양태에서, 혼합된 미세구조물은 미세화된 약제 입자의 가까운 접근(응집)을 막는 역할도 한다. 이러한 양태에서 천공된 미세구조물이 생물 활성제를 반드시 포함하는 것은 아니라는 것을 이해할 수 있을 것이다. 오히려, 이것은 계면 활성제를 포함하는 다양한 부형제만으로 제조될 수 있다.

당업자라면, 본 발명의 안정화된 현탁액 또는 분산물을 특정 현탁 매체내의 미세구조물의 분산을 통해 제조한 다음, 용기 또는 저장기에 위치시킬 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 점에서, 충분한 양의 성분들을 단순히 혼합하여 최종적으로 원하는 분산물 농도로 제조함으로써 본 발명의 안정화된 제제를 생산할 수 있다. 미세구조물은 역학 에너지 없이 쉽게 분산되지만, 분산을 돕기 위해서 역학 에너지(예, 초음파 분해의 도움)를 적용하는 것도 고려될 수 있다. 대안으로, 이 성분들을 단순히 현탁 또는 다른 형태의 교반을 통해 혼합할 수 있다. 이러한 공정은 현탁액 안정성에 미치는 습기의 역효과를 피하기 위해 무수 조건하에서 수행하는 것이 바람직하다. 일단 분산물이 형성되면, 이 분산물은 응집 및 침전에 대해 저항력이 증가한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 분산물은 바람직하게 안정화된다. 광범위한 의미에서, "안정화된 분산물"이란 생물 활성제의 효과적인 전달을 위해 요구되는 정도로 응집, 응결 또는 크림화에 대한 저항적인 분산물을 말한다. 뿐만아니라, 개시된 분산물 및 분말이 실온에서 안정하여 활성을 유지하기 위해 냉장 또는 냉동시킬 필요가 없다는 것이 본 발명의 중요한 이점이다. 보관 수명을 연장시키는 것 외에도, 이러한 현저한 온도 안정성은 운반 및 투여를 상당히 간단하게 한다.

당업자라면, 특정 분산액의 안정성을 측정하는 데 사용될 수 있는 몇가지 방법들이 있다는 것을 이해하겠지만, 본 발명의 목적에 바람직한 방법은 동력 광침전법을 이용하여 크림화 또는 침전 시간을 측정하는 것을 포함한다. 바람직한 방법은 현탁된 입자를 원심 분리력에 적용시켜서 시간의 함수로서 현탁액의 흡광도를 측정하는 것을 포함한다. 당업자라면, 부적절한 실험을 수행하지 않고 특정 현탁액에 대한 절차를 적용할 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 위해서, 크림화 시간은 현탁된 약제 입자가 현탁 매체 부피의 1/2로 크림화되는 데 걸리는 시간으로 정의한다. 유사하게, 침전 시간은 미립자가 액체 매체 부피의 1/2로 침전되는데 걸리는 시간으로 정의될 수 있다. 전술한 광침전 기술 외에도, 제제의 크림화 시간을 측정하는 비교적 단순한 방법은 밀폐된 유리병내의 미립자 현탁액을 제공하는 것이다. 이 병을 교반 또는 진탕시켜서 비교적 균질의 분산물을 만든 다음, 치워 두고 적절한 기구를 이용하거나 또는 육안으로 관찰한다. 그후, 현탁된 미립자가 현탁 매체 부피의 1/2로 크림화되는 데 걸리는 시간(즉, 현탁 매체의 최고 절반까지 오르는 데 걸리는 시간) 또는 부피의 1/2 로 침전하는데 걸리는 시간(즉, 매체의 바닥 1/2로 침전되는 데 걸리는 시간)을 기록한다. 크림화 시간이 1분 이상인 현탁 조성물이 바람직하며 적절한 안정성을 나타낸다. 크림화되는데 걸리는 시간이 1, 2, 5, 10, 15, 20 또는 30분 이상인 안정화된 분산물이더욱 바람직하다. 특히 바람직한 양태에서, 안정화된 분산물의 크림화 시간이 1, 1.5, 2, 2.5 또는 3 시간이다. 실질적으로 침전 시간이 동일한 것이 적합한 분산물이라는 표시가 된다.

또한, 다른 성분들도 본 발명의 안전화된 분산물내에 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 최대 수명을 지니고 투여가 용이한 안정화된 분산물로 미세하게 조절하기 위해 삼투압제, 안정화제, 킬레이트제, 완충액, 점도 조절제, 염 및 설탕을 첨가할 수 있다. 이러한 성분들은 현탁 매체에 직접 첨가하거나, 천공된 미세구조물과 결합 또는 혼합된 형태로 첨가될 수 있다. 멸균성, 등장성, 생물화합성과 같은 것을 고려하여 통상적인 첨가제를 본 발명의 조성물에 첨가할 수 있다. 당업자라면 이러한 물질의 사용법을 이해할 것이고, 이러한 물질의 구체적인 양, 비율 및 형태를 부적절한 실험없이 실험적으로 결정할 수 있다.

F(iii). 측량 흡입기

전술한 바와 같이, 안정화된 분산물은 측량 흡입기와 같은 연무화를 통해 환자의 코 또는 폐 기도로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 안정화된 제제의 사용은 전술한 표적 위치에 우수한 투약 재현성 및 향상된 침적을 제공한다. MDI는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 부적절한 실험 없이 청구된 분산물을 투여하는 데 사용할 수 있다. 안정화된 분산물 및 본 발명과 함께 사용하기에 적합하게 개발되었고, 개발될 수 있는 다른 형태의 향상을 포함하는 것 외에, 호흡 활성화된 MDI도 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주한다.

MDI 용기는 일반적으로 사용되는 추진제의 증기 압력을 견딜 수 있는 용기 또는 저장기를 포함하는데, 예를 들면 플라스틱 또는 플라스틱 코팅된 유리병, 또는 바람직하게는 선택적으로 양극 처리, 래커칠 및/또는 플라스틱 코팅될 수 있는 알루미늄캔 등과 같은 금속캔으로서, 여기서 용기는 측정 밸브로 밀폐되어 있다. 측정 밸브는 작용당 측정된 양의 조성물을 전달하도록 고안된다. 이 밸브는 밸브를 통해서 추진제가 새는 것을 막기 위해 개스켓을 혼합한다. 개스켓은 적절한 탄력을 지닌 물질, 예를 들면 저밀도 폴리에틸렌, 클로로부틸, 흑백 부타디엔-아크릴로니트릴 고무, 부틸 고무 및 네오프렌을 포함할 수 있다. 적절한 밸브는 연무질 산업분야에 잘 알려져 있는 제조업자에 의해 시판되는 데, 예를 들면 발로이스, 프랑스(예, DF10, DF30, DF31/50 ACT, DF60), 백스팍 plc, LTK(예, BK300, BK356) 및 3M-네오테크닉사, LIK(예, 스프레이미서)가 있다.

각각의 충전된 캔을 사용하기 전에 적합한 통로 장치 또는 작동기에 편리하게 장착하여 환자의 폐 또는 구강 또는 비강으로 약제를 투여하기 위한 측량 흡입기를 형성한다. 적합한 통로 장치는, 예를 들면 밸브 작동기 및 원통형 통로 또는 원추형의 통로를 포함하는 데, 이 통로를 통해서 충전된 캔으로부터 약제가 측정 밸브(예, 마우스피스 작동기)를 통해 환자의 코 또는 입으로 전달된다. 측량 흡입기는 작동당 고정된 단위 투약량의 약제를 투여하도록 고안되는데, 예를 들면 작동당 10 내지 5000 ㎍의 생물 활성제이다. 일반적으로, 단일 장전 캔은 수십 또는 수백의 투약량을 제공한다.

추진제로서 작용하는 적절한 증기압을 지닌 임의의 생물화합성 현탁 매체를 MDI에 사용할 수 있다는 것이 본 발명의 이점이다. 특히 바람직한 현탁 매체는 측량 흡입기에 사용하기에 적합한 것이다. 즉, 측정 밸브의 활성화와 이에 관련된 압력이 방출되면 이들은 연무질을 형성할 수 있다. 일반적으로, 선택된 현탁 매체는 생물 활성제를 포함하는 현탁된 천공된 미세구조물이라는 점에서 생물화합성(즉, 비교적 비독성)이고 비반응성이어야 한다. 현탁 매체는 천공된 미세구조물내에 혼합된 임의의 성분의 실질적인 용매로서 작용하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명의 선택된 양태는 불화탄소(다른 할로겐으로 치환된 것을 포함함), 히드로플루오로알칸, 퍼플루오로탄소, 탄화수소, 알코올, 에테르 또는 이들의 배합물로 이루어진 군에서 선택된다. 현탁 매체는 특이적 특성을 부여하기 위해 선택된 다양한 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 MDI 현탁 매체내에 사용하기에 특히 적합한 추진제는 실온의 압력하에서 액화될 수 있는 추진제 기체로서 흡입 또는 국소 사용시 안전하고 독소가 없고 부작용이 없는 것이다. 이러한 점에서, 적합한 추진제는 측량 흡입기가 작동하면 효과적으로 연무질을 형성할 수 있는 충분한 증기압을 갖는 탄화수소, 불화탄소, 수소 함유 불화탄소 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 추진제는 일반적으로 히드로플루오로알칸, 즉 HFA라고 불리는 것이 특히 바람직하다. 적합한 추진제의 예로는 단쇄 탄화수소, CH₂CIF, CCl₂F₂CHCIF, CF₃CHClF, CHF₂CClF₂, CHCIFCHF₂, CF₃CH₂CL 및 CCLF₂CH₃와 같은 C_1-4수소 함유 클로로플루오로탄소; CHF₂CHF₂, CF₃CH₂F, CHF₂CH₃및 CF₃CHFCF₃와 같은 C_1-4수소 함유 불화탄소(예, HFA); 및 CF₃CF₃, CF₃CF₂CF₃와 같은 퍼플루오로탄소를 포함한다. 단독 퍼플루오로탄소 또는 수소 함유 불화탄소를 추진제로 사용하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 추진제로는 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(CF₃CH₂F)(HFA-134a) 및 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로-n-프로판(CF₃CHFCF₃)(HFA-227), 퍼플루오로에탄, 모노클로로디플루오로메탄, 1,1-디플루오로에탄 및 이들의 배합물이 있다. 이 조성물은 성층권 오존을 고갈시키는 성분을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 특히, 이 조성물은 CCl₃F, CCl₂F₂및 CF₃CCl₃과 같은 클로로플루오로탄소가 실질적으로 없는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 양태가 환경 친화적인 현탁 매체를 포함하지만, 전통적인 클로로플루오로탄소 및 치환된 불화된 화합물 또한 본 발명의 교시에 따르면 현탁 매체로서 사용할 수 있다. 이러한 점에서, FC-11(CCl₃F), FC-11B(CBrCl₂F), FC-11B2(CBr₂ClF), FC12B2(CF₂Br₂), FC21(CHCl₂F), FC21B1(CHBrClF), FC-21B2(CHBr₂F), FC-31B1(CH₂BrF), FC113A(CCl₃CF₃), FC-122(CClF₂CHCl₂), FC-123(CF₃CHCl₂), FC-132(CHClFCHClF), FC-133(CHClFCHF₂), FC-141(CH₂ClCHClF), FC-141B(CCl₂FCH₃), FC-142(CHF₂CH₂Cl), FC-151(CH₂FCH₂Cl), FC-152(CH₂FCH₂F), FC-1112(CClF=CClF), FC-1121(CHCl=CFCl) 및 FC-1131(CHCl=CHF)는 모두 환경적인 문제를 일으킬 수 있지만 본 발명에 교시에 따른 적합한 물질이다. 이와 같이, 이 화합물들 각각을 단독으로 또는 다른 화합물(즉, 휘발성이 적은 불화탄소)과 혼합하여 사용하여 본 발명에 따른 안정화된 호흡기 분산물을 생성할 수 있다.

F(iv). 연무기

전술한 양태에 따르면, 본 발명의 안정화된 분산물은 또한 연무화된 약제를 제조하여 이것이 필요한 경우 환자의 폐 기도를 통해 투여할 수 있게 하기 위해 연무기와 함께 사용될 수 있다. 연무기는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 부적절한 실험을 거치지 않고 청구된 분산물을 투여하는 데 쉽게 이용할 수 있다. 다른 형태의 향상이 개발되었고, 개발될 수 있는 것을 포함하는 것 외에도, 호흡 활성화된 연무기 또한 안정화된 분산물 및 본 발명에 적합하고 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.

연무기는 연무질을 형성함으로써, 즉 대량 액체를 흡입가능한 기체내의 소적으로 전환시킴으로써 작동한다. 여기서, 투여된(바람직하게는 폐 기도) 연무화된 약제는 생물 활성제를 포함하는 천공된 미세구조물과 관련된 현탁 매체의 소적을 포함한다. 이러한 양태에서, 본 발명의 안정화된 분산물은 일반적으로 연무기에 조작적으로 연결된 액체 저장기내에 위치한다. 제공되는 제제의 구체적 부피, 저장기를 채우는 수단 등은 대개 개개의 연무기의 선택에 좌우되며, 이는 당업자의 인지 범위내에 속한다. 물론, 본 발명은 단일 투약 연무기 및 복수 투약 연무기에 모두 적합하다.

본 발명은 바람직하게 불화된 화합물(즉, 불화 화합물, 불화탄소 또는 퍼플루오로탄소)를 포함하는 현탁 매체내의 안정화된 분산물을 제공함으로써 상술한 문제 및 기타 문제를 극복한다. 본 발명의 특히 바람직한 양태는 실온에서 액체인 불화 화합물을 포함한다. 전술한 바와 같이, 연속층으로서든 현탁 매체로서든지 간에 이러한 화합물을 사용하면 선행 기술의 액체 흡입 제제보다 많은 이점을 얻게 된다. 이러한 점에서, 많은 불화 화합물은 폐에서의 안정성 및 생물화합성이 증명되어 있다. 또한, 수성 현탁액과는 대조적으로, 폐 투여 후의 기체 교환을 부정적인 영향을 주지 않는다. 대조적으로, 이것은 실제적으로 기체 교환을 향상시킬 수 있으며, 독특한 습윤성 때문에 폐에 더 깊이 연무화된 입자 흐름을 전달함으로써 원하는 약학적 화합물의 전신 전달을 향상시킨다. 또한, 비교적 비반응성인 불화 화합물의 성질은 혼합된 생물 활성제의 분해(단백질 분해 또는 가수분해에 의함)를 지연시키는 작용을 한다.

어떤 경우에 든지, 연무기에 의한 연무질은 일반적으로 증가된 소적 표면적을 제공하기 위해, 어떤 경우에는, 분무화 또는 연무화된 약제의 운송을 위해 에너지의 공급을 필요로 한다. 연무화의 일반적인 형태는 유동액을 노즐로부터 분사시켜서 소적이 형성되도록 하는 것이다. 연무화된 투여에 대해서는, 폐내로 깊숙히 전달될 수 있을 정도로 작은 소적을 제공하기 위해서 일반적으로 추가적인 에너지가 필요하다. 따라서, 고속 기류 또는 압전기 결정에 의해 제공되는 것과 같은 추가적인 에너지가 요구된다. 일반적인 연무기의 두가지 형태는 제트 연무기와 초음파 연무기이며, 분무 과정 동안 액체에 추가적인 에너지를 적용하는 전술한 방법에 의존한다.

전신 순환계를 향한 연무화를 통한 생물 활성제의 폐 전달에 대해서는 최근 연구가 측정 용액이라고도 불리는 휴대용 초음파 연무기를 이용하는 것에 집중되었다. 이러한 장치는 일반적으로 단일 거환 연무기로 알려져 있으며, 1회 또는 2회의 흡입으로 폐 깊숙히 전달되기에 효과적인 입자 크기로 수용액내의 단일 거환을 연무화시킨다. 이 장치들은 3개의 광범위한 종류로 나뉜다. 첫번째 종류는 Mutterlein 등의 문헌〔J. Aerosol Med. 1988; 1:231〕에 기술된 것과 같은 순수한 압전기적 단일 거환 연무기를 포함한다. 또 다른 종류로는, 미국 특허 제3,812,854호에 기술된 것과 같은 미세통로 압출성형 단일 거환 연무기를 통해 원하는 연무질을 생성할 수 있다. 마지막으로, 세번째 종류는 순환 가압 단일 거환 연무기를 기술하고 있는 Robertson 등의 특허(국제 특허 공개 제92/11050호)에 개시된 장치를 포함한다. 상기 참조 문헌 각각은 모두 본 명세서에서 참고 인용한다. 대부분의 장치는 수동으로 조작되지만, 흡입 작동되는 장치도 일부 존재한다. 호흡 가동되는 장치는 장치가 환자가 회로를 통해 흡입하는 것을 감지할 경우 연무질을 방출함으로써 작동한다. 호흡 작동된 연무기는 또한 환자를 위한 호흡 기체를 포함하는 기류로 연무질을 방출하기 위해 통풍 회로상의 라인내에 위치될 수 있다.

사용되는 연무기의 형태와 관계없이, 생물화합성의 비수성 화합물을 현탁 매체로서 사용할 수 있다는 것이 본 발명의 이점이다. 바람직하게, 에너지를 적용하면 이것들은 연무질을 형성할 수 있다. 일반적으로, 선택된 현탁 매체는 생물 활성제를 포함하는 현탁된 천공된 미세구조물에 대해 생물화합성(즉, 비교적 비독성) 및 비반응성이어야 한다. 바람직한 양태는 불화 화합물, 불화탄소(다른 할로겐으로 치환된 것 포함), 퍼플루오로탄소, 불화탄소/탄화수소 디블록, 탄화수소, 알코올, 에테르 또는 이들의 배합물로 이루어진 군에서 선택된 현택 매체를 포함한다. 이러한 현탁 매체 특수한 특성을 나타내기 위해 선택된 다양한 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 교시에 다르면, 현탁 매체는 탄화수소, 불화탄소 또는 탄화수소/불화탄소 디블록을 포함하는 많은 다른 화합물 중의 1종 이상을 포함한다. 일반적으로 간주되는 탄화수소 또는 고도로 불화되거나 퍼플루오르화된 화합물은 직쇄, 간쇄나 고리, 포화되거나 불포화된 화합물일 수 있다. 이러한 불화 화합물 및 탄화수소의 통상적인 구조적 유도체 또한 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다. 이러한 완전 또는 부분적 불화된 화합물의 화합물을 포함하는 선택된 양태는 하나 이상의 헤테로 원자 및/또는 브롬이나 염소 원자를 포함할 수 있다. 바람직하게, 이러한 불화 화합물은 2 내지 16개의 탄소 원자를 포함하며, 시클릭 또는 폴리시클릭 퍼플루오로알칸, 비스(퍼플루오로알킬)알켄, 퍼플루오로에테르, 퍼플루오로아민, 퍼플루오로알킬 브로마이드 및 디클로로옥탄과 같은 퍼플루오로알킬 클로라이드를 포함하는 데, 이에 국한되는 것은 아니다. 현탁 매체에 사용하기에 특히 바람직한 불화 화합물은 퍼플루오로옥틸 브로마이드 C₈F₁₇Br(PFOB 또는 퍼플루브론), 디클로로플루오로옥탄 C₈F₁₆Cl₂및 히드로플루오로알칸 퍼플루오로옥틸 에탄 C₈F₁₇C₂H₅(PFOE)을 포함할 수 있다. 다른 양태에 대해서는, 현탁 매체로서 퍼플루오로헥산 또는 퍼플루오로펜탄을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

더욱 일반적으로, 본 발명에서의 사용에 간주되는 불화 화합물은 일반적으로 할로겐화된 불화 화합물(즉, C_nF_2n+1X, XC_nF_2nX, 여기서 n=2-10, X=Br, Cl, I) 및 특히 1-브로모-F-부탄 n-C₄F₉Br, 1-브로모-F-헥산(n-C₆F₁₃Br), 1-브로모-F-헵탄(n-C₇F₁₅Br), 1,4-디브로모-F-부탄 및 1,6-디브로모-F-헥산을 포함한다. 기타 유용한 브롬화된 불화 화합물은 미국 특허 제3,975,512호에 개시되어 있으며, 본 명세서에서 참고 인용한다. 퍼플루오로옥틸 클로라이드(n-C₈F₁₇Cl), 1,8-디클로로-F-옥탄(n-ClC₈F₁₆Cl), 1,6-디클로로-F-헥산(n-ClC₆F₁₂Cl) 및 1,4-디클로로-F-부탄(n-ClC₄F₈Cl)과 같은 염소 치환체를 갖는 불화 화합물 또한 바람직하다.

불화탄소, 불화탄소-탄화수소 화합물 및 에스테르, 티오에테르 및 아민과 같은 다른 결합기를 포함하는 할로겐화된 불화 화합물 또한 본 발명의 현탁 매체로서 사용하기에 적합하다. 예를 들면, 일반적인 구조식, C_nF2_n+1OC_mF2_m+1또는 C_nF2_n+1CH=CHC_mF_2m+1(예, C₄F₉CH=CHC₄F₉(F-44E), i-C₃F₉CH=CHC₆F₁₃(F-i36E) 및 C₆F₁₃CH=CHC₆F₁₃(F-66E))(여기서, n 및 m은 같거나 다르고, n 및 m은 약 2 내지 12의 정수이다)을 갖는 화합물이 본 발명의 교시에 따라 적합하다. 유용한 불화 화합물 탄화수소 디블록 및 트리블록 화합물은 일반적인 구조식이 C_nF_2n+1-C_mH_2m+1및 C_nF_2n+1C_mH_2m+1(여기서, n은 2 내지 12; m은 2 내지 16 또는 C_pH_2p+1-C_nF_2n-C_mH_2m+1, 여기서 p는 1 내지 12, m는 1 내지 12 및 n은 1 내지 12)인 화합물을 포함한다. 이러한 형태의 바람직한 화합물은 C₈F₁₇C₂H₅, C₆F₁₃C₁₀H₂₁, C₈F₁₇C₈H₁₇, C₆F₁₃CH=CHC₆H₁₃및 C₈F₁₇CH-CHC₁₀H₂₁을 포함한다. C_nF_2n+1O-C_mF_2mOC_pH_2p+1(여기서 n, m 및 p는 1 내지 12이다)는 물론, 치환 에테르 또는 폴리에테르(즉, XC_nF_2nOC_mF_2mX, XCFOC_nF_2nOCF₂X, 여기서 n 및 m은 1 내지 4이고, X는 Br, Cl 또는 I) 및 불화 화합물-탄화수소 에테르 디블록 또는 트리블록(즉, C_nF_2n+1-O-C_mH_2m+1, 여기서 n은 2 내지 10; m은 2 내지 16 또는 C_pH_2p+1-O-C_nF_2n-O-C_mH_2m+1, 여기서 p는 2 내지 12, m은 1 내지 12이고, n은 2 내지 12이다) 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 출원에 따라, 퍼플루오로알킬화된 에테르 또는 폴리에테르도 청구된 분산액에 적합할 수 있다.

C₁₀F₁₈(F-데칼린 또는 퍼플루오로데칼린), 퍼플루오로퍼히드로페난트렌, 퍼플루오로테트라메틸시클로헥산(AP-144) 및 퍼플루오로 n-부틸데칼린과 같은 폴리시클릭 및 시클릭 불화 화합물 역시 본 발명의 범위내에 든다. 추가적인 유용한 불화 화합물은 F-트리프로필아민("FTPA") 및 F-트리부틸아민("FTBA"), F-4-메틸옥타히드로퀴놀리진("FMOQ"), F-N-메틸-데카히드로이소퀴놀린("FMIQ"), F-N-메틸데카히드로퀴놀린("FHQ), F-N-시클로헥실피롤리딘("FCHP") 및 F-2-부틸테트라히드로퓨란("FC-75" 또는 "FC-77")과 같은 퍼플루오르화된 아민을 포함한다. 불화 화합물로 유용한 또 다른 화합물로는 퍼플루오로펜탄트렌, 퍼플루오로메틸데칼린, 퍼플루오로디메틸에틸시클로헥산, 퍼플루오로디메틸데칼린, 퍼플루오로디에틸데칼린, 퍼플루오로메틸아다만탄, 퍼플루오로디메틸아다만탄을 들 수 있다. 퍼플루오로옥틸 히드라이드와 같은 비불소 치환체를 갖는 다른 불화 화합물 및 다른 수의 탄소 원자를 갖는 유사한 화합물 또한 유용하다. 당업자들은 다른 다양하게 변형된 불화 화합물이 본 발명에서 사용되는 불화 화합물의 광범위한 정의내에 들고 본 발명에 사용하기에 적합하는 것을 이해할 것이다. 이러한 이유로, 전술한 화합물 각각은 단독으로, 또는 다른 화합물과 함께 사용되어 본 발명의 안정화된 분산물을 형성할 수 있다.

현탁 매체로서 유용할 수 있는 추가적인 불화탄소 또는 불화된 화합물 종류의 예로는 플루오로헵탄, 플루오로시클로헵탄, 플루오로메틸시클로헵탄, 플루오로헥산, 플루오로시클로헥산, 플루오로펜탄, 플루오로시클로펜탄, 플루오로메틸시클로펜탄, 플루오로디메틸시클로펜탄, 플루오로메틸시클로부탄, 플루오로디메틸시클로부탄, 플루오로트리메틸시클로부탄, 플루오로부탄, 플루오로시클로보탄, 플루오로프로판, 플루오로에테르, 플루오로폴리에테르 및 플루오로트리에틸아민을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 화합물들은 일반적으로 환경 친화적이며, 생물학적으로 비반응성이다.

에너지를 적용하면 연무질을 생산할 수 있는 액체는 연무기와 함께 사용될 수 있지만, 선택된 현탁 매체는 약 5 대기압 미만의 증기압을 갖는 것이 바람직하고, 약 2 대기압 미만이 더욱 바람직할 것이다. 다른 언급이 없다면, 본 발명에서 기술하는 모든 증기압은 약 25℃에서 측정된다. 다른 양태에서, 바람직한 현탁 매체 화합물의 증기압은 약 5 토르 내지 약 760 토르, 더욱 바람직한 화합물의 증기압은 약 8 토르 내지 약 600 토르이지만, 더욱 더 바람직한 화합물의 증기압은 약 10 내지 약 350 토르이다. 이러한 현탁 매체는 압축된 공기 연무기, 초음파 연무기 또는 기계적 분무기와 함께 사용하여 효과적인 환기 치료를 할 수 있다. 또한, 더욱 휘발성이 강한 화합물을 더 낮은 증기압의 화합물과 혼합하여 분산된 생물 활성제의 안정성을 더욱 향상시키고 생체 이용률을 더욱 강화시킬 수 있는 특정 물리적 특성을 갖는 현탁 매체를 제공할 수 있다.

연무기에 관한 본 발명의 다른 양태는 주변 조건(즉, 1 기압)하에 선택된 온도에서 끓는 현탁 매체를 포함할 것이다. 예를 들면, 바람직한 양태는 0℃ 이상, 5℃ 이상, 10 ℃ 이상, 15℃ 이상 또는 20 ℃ 이상에서 끓는 현탁 매체를 포함할 것이다. 다른 양태에서, 이 현탁 매체 화합물은 25℃ 이상 또는 30℃ 이상에서 끓을 수 있다. 또 다른 양태에서, 선택된 현탁 매체는 인간 체온(즉, 37℃ ) 이상, 45 ℃ 이상, 55℃ , 65℃ , 75℃ , 85℃ 또는 100 ℃ 이상에서 끓을 수 있다.

F(v). 직접 투여

본 발명의 안정화된 분산물을 MDI 및 연무기와 함께 다양한 투여 경로를 이용하여 다양한 표적 위치로 생물 활성제를 투여할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 조성물을 액체 투약 점적(LDI) 기술과 함께 폐에 직접적으로 전달할 수 있다. 대안으로, 안정화된 분산물은 비측용 펌프, 분사병 또는 분무기를 이용하여 비측 경로내의 점막 표면에 효과적으로 전달할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 분산물을 통상적인 주사를 이용하거나 또는 압축 기체를 이용한 무바늘 주사를 통해 표적 위치(예, 근육내 또는 피내)에 투여할 수 있었다. 후자의 경우는 무바늘 접종의 경우 특히 바람직하다. 또 다른 양태는 눈이나 귀 또는 더욱 바람직하게는 점막 표면, 예를 들면 비뇨생식기나 위장관내의 점막 표면과 같은 표적 위치로 분산물을 국소 전달하는 것에 관한 것이다. 이러한 기술은 혼합된 생물 활성제의 침투를 강화시키기 위해 이오노포레시스를 추가로 이용할 수 있다. 어떤 경우에는, 안정화된 분산물은 혼합된 제제의 활성을 보존하면서 우수한 투약 재현성을 제공한다.

당업자들은 전술한 전달 기술에 적합한 현탁 매체가 연무기와 함께 사용하는 상기 언급한 현탁 매체와 유사하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 즉, 안정화된 분산물은 불화 화합물, 불화탄소(다른 할로겐으로 치환된 것을 포함), 퍼플루오로탄소, 불화탄소/탄화수소 디블록, 탄화수소, 알코올, 에테르 또는 이들의 배합물로 이루어진 군에서 선택된 현탁 매체를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 목적을 위해서 이러한 전달 기술에 적합한 현탁 매체는 연무기에 사용한다고 전술한 것과 동일할 것이다. 특히 바람직한 양태에서, 선택된 현탁 매체는 주변 조건하에서 액체인 불화 화합물을 포함할 것이다.

액체 투약 점적은 안정화된 분산물을 폐에 직접 투여하는 것과 관련된다는 것을 추가로 이해할 것이다. 이러한 점에서, 생물 활성 화합물을 폐로 직접 투여하는 것은 폐 환부의 나쁜 혈관 순환이 정맥 약제 전달의 효과를 감소시키는 질환의 치료에 특히 효과적이다. LDI에 대해서는, 안정화된 분산물을 부분적 액체 환기 또는 총 액체 환기와 함께 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 투여전, 중 또는 후에 생리학적으로 허용가능한 기체(예, 산화 질소 또는 산소)의 치료적 유효량을 약학적 미세분산물내로 주입하는 것을 추가로 포함한다.

LDI에 대해서는, 본 발명은 폐 전달 도관을 이용하여 폐로 투여할 수 있다. 당업자들은 본 발명에서 사용되는 "폐 전달 도관"이 폐내로 액체를 점적 또는 투여하기 위한 임의의 장치나 기구 또는 이들의 부품을 포함하는 것으로 광범위하게 간주될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 점에서, 폐 전달 도관 또는 전달 도관은 본 발명의 분산물을 이것을 필요로 하는 환자의 하나 이상의 폐 기도 부위에 투여 또는 점적할 수 있는 임의의 구경, 루멘, 도뇨관, 튜브, 도관, 주사기, 작동기, 마우스피스, 기관내관 또는 기관지경을 의미하는 것으로 간주될 것이다. 전달 도관은 액체 통풍기 또는 기체 통풍기이거나 관련된 것일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특히 바람직한 양태에서, 전달 도관은 기관내경 또는 기관지경을 포함할 것이다.

안정화된 분산물은 환자의 폐의 잔재 기능에 따라 투여할 수 있지만, 선택된 양태는 훨씬 더 적은 부피(예, 밀리리터 또는 그 이하)의 폐 투여를 포함할 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 처리할 질환에 따라, 투여될 부피는 1, 3, 5 10, 20, 50, 100, 200 또는 500 밀리리터일 수 있다. 바람직한 양태에서, 액체 부피는 0.25 또는 0.5 퍼센트 FRC이다. 특히 바람직한 양태에서는, 액체 부피가 0.1 퍼센트 FRC 이하이다. 안정화된 분산물을 비교적 적은 부피의 폐에 투여하면, 현탁 매체(특히 불화 화합물)의 습윤성 및 분산성이 폐로 생물 활성제를 고르게 분산시킬 수 있을 것이라는 것을 이해할 것이다. 그러나, 다른 양태에서, 0.5, 0.75 또는 0.9 퍼센트 FRC 이상의 부피에 현탁물을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 불론, 적어도 몇몇 불화 화합물이 지닌 특수한 습윤성 및 분산성이 비측 경로와 같은 다른 점막 표면에 투여하기에 특히 적합하게 한다.

당업자들은 본 발명의 분말 및 안정화된 분산물이 멸균된, 미리 포장된 형태 또는 키트 형태로 의사 또는 기타 헬스 캐어 전문가에서 편리하게 공급될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱 구체적으로, 이 조성물은 안정한 분말 또는 환자에게 즉석해서 투여할 수 있는 예비 형성된 분산물로서 제공될 수 있다. 역으로, 이것들은 즉석해서 혼합할 수 있는 분리된 형태로서 제공될 수 있다. 즉석해서 사용할 수 있는 형태로 제공될 경우, 분말 또는 분산물은 복수 사용 용기 또는 저장기는 물론 단일 사용 용기 또는 저장기로 포장될 수 있다. 어느 경우에든지, 용기 또는 저장기는 선택된 흡입 또는 투여 장치와 함께 사용할 수 있으며, 본 발명에 기술된대로사용될 수 있다. 개개의 성분으로서 제공될 경우(예, 분말화된 미세구 및 순수 현탁 매체로서), 사용하기 전 어느 때라도 지시하는 대로 용기내의 내용물을 간단히 배합함으로써 안정화된 제제를 제조할 수 있다. 추가적으로, 이러한 키트는 많은 즉석 혼합 또는 미리 포장된 투약 단위를 포함하기 때문에 사용자가 필요한 경우 투여할 수 있다.

하기 실시예를 참조하면 전술한 설명이 더욱 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 단지 본 발명의 대표적인 바람직한 실시 방법일 뿐이며, 어떤 방식으로든지 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해 또는 해석되어서는 안된다.

I. 분무 건조에 의한 HA 펩티드 공동 다공성 입자의 제조

하기 조건하에서 B-191 미니 스프레이-드라이어(비치, 플라빌, 스위스)를 이용한 분무 건조 기술을 통해 공동 다공성 HA 110-120 펩티드(인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 아미노산 잔기 110-120개)를 제조하였다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 51℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 L/시간. 공급물은 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 제제 A 및 B를 혼합하여 제조하였다. 입자의 퇴적을 돕기 위해서 집진 장치의 출구에 150 망 스테인레스 강철 막을 위치시켰다.

제제 A: 탈이온수 5g에 HA 110-120 펩티드(카이론사, 에머리빌, CA) 18 mg 및 히드록시에틸 전분(아지노모토, 일본) 1 mg을 용해시켰다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 물중의 불화탄소 유화액을 다음과 같이 제조하였다. 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여 8000 rpm으로 2 내지 5분 동안(온도 = 60 내지 70℃) 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루드비히샤펜, 독일) 0.3 g을 고온 탈이온수(온도 = 50 내지 60℃) 33 g내에 균질화시켰다. 혼합하는 동안 퍼플루브론(퍼플루오로옥틸 브로마이드: 아토켐, 파리, 프랑스) 8 g을 적가하였다. 여기에 불화탄소를 첨가한 후, 이 유화액을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그런 다음, 이렇게 하여 얻은 미정제 유화액을 18,000 psi의 고압 균질기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 B의 8분의 1을 분리하여 제제 A에 첨가하였다. 이렇게 얻은 HA 펩티드/퍼플루브론 유화액 공급 용액을 전술한 조건하에서 분무 건조기에 공급하였다. 집진 장치에 퇴적된 분말을 체로 거른 후 퍼플루브론을 이용하여 세정하여 수집기에 모았다. 이어서, 퍼플루브론중의 HA 현탁액을 -60℃에서 동결 건조시켰다. 유리 유동 백색 분말을 얻었다.

II. HA 펩티드를 함유하는 공동 다공성 입자의 시험관내 활성

풀모스피어(HA-Pul)내의 HA 펩티드와 순수 HA 펩티드의 항원 제시 세포를 활성화시키는 기능을 비교하였다. 실시예 I의 HA 펩티드 풀모스피어를 5 mg/ml 농도의 멸균 PBS(조성물 중량/부피)로 처리하였다. 이렇게 한 HA-Pul-PBS 용액의 연속 희석액을 완전 RPMI-10% FCS중의 M12 항원 제시 세포(1 x 10⁴/웰) 및 HA 특이적 TcH(2 x 10⁴/웰)를 포함하는 마이크로웰에 첨가하였다. TcH 세포주는 IL-2 프로모터(IL-2/-gal)에 의해 조절되는 리포터 유전자를 포함한다.

37℃에서 12 시간 동안 배양한 후에, 마이크로웰 플레이트를 윈심분리하고, 4℃에서 5분 동안 세포를 파라포름알데히드-글루타르알데히드로 고정시킨 다음 PBS로 세정하고, X-gal 기질을 밤새도록 첨가하였다. 활성화된 TcH 수/500 세포/웰을 광학 현미경을 이용하여 측정하였다. 세포 총수를 청세포의 백분율로 곱하여 활성화된 TcH 총수/웰을 계산하였다. 도 1에 도시된 결과는 조성물내의 활성 펩티드의 존재를 증명한다. 표준 활성화 곡선(HA 염수)과의 비교는 활성 펩티드의 농도가 약 5%(wt/wt)이고, 이는 역상 HPLC 측정치와 일치한다는 것을 보여주었다.

III. HA 펩티드 풀모스피어 작용 기작

T 세포 에피토프 HA 110-120(HA-Pul)을 함유하는 풀모스피어 미립자의 내부화 및 작용 요건을 관찰하였다. 퍼플루브론에 현탁된 HA-Pul(500 nM/웰 HA 110-120 펩티드)을 공기중에서 건조시키고, 완전 RPMI-10% FCS중의 특이적 TcH 세포의 존재하에 비고정 또는 파라포름알데히드로 고정된 M12 항원 제시 세포(APC)와 배양시켜서, 비슷한 농도의 PBS에 현탁된 HA-Pul 및 순수한 HA 펩티드와 비교하였다. 세포내 작용을 요구하지 않는 자당-정제된 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스(15 g/ml)을 양성 대조군으로 사용하였다. 음성 대조군은 NP 147-155 펩티드 조성물, 비조성물 NP 펩티드 및 무관성 바이러스를 포함하였다. 실시예 II에 기술된 세포수와 배양 조건을 따라 수행한 다음, 세포를 고정시켜서 X-gal 기질에 노출시켰다. 이 결과는 활성화된 TcH의 백분율로 나타내었다.

도 2는 고정 및 비고정된 APC가 순수 HA 펩티드 및 HA-Pul에 제시할 수 있었다는 것을 보여준다. 대조적으로, 생 APC만이 바이러스 내용물로부터의 HA 펩티드를 제시할 수 있었다. 게다가, B/Lee 바이러스는 물론 조성물 또는 순수 NP 펩티드는 특이적 TcH를 활성화시키지 않았다. 오히려, HA-펩티드는 풀모스피어로부터 쉽게 방출되어서 M12 APC 상의 MHC 클래스 II 분자(I-E^d)에 결합하여 TCR을 끌어들여 TcH를 활성화시킨다. 이 작용 단계는 PBS 또는 퍼플루브론내에서 전달된 HA-Pul은 물론 순수 HA 펩티드에서도 관찰되었다. 뿐만아니라, 이 결과는 퍼플루브론내에서 안정화된 풀모스피어 HA 110-120 펩티드 조성물이 이것의 면역원성을 보유한다는 것을 증명한다.

IV. 분무 건조에 의한 형광 표지된 공동 다공성 HA 펩티드 입자의 제조

하기 조건하에서 B-191 미니 스프레이-드라이어(뷔치, 플라빌, 스위스)를 이용한 분무 건조 기술을 통해 공동 다공성 HA-플루오로세인 110-120 펩티드/텍사스 레드 DHPE 입자를 제조하였다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 51℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 L/시간. 공급물은 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 용액 A 및 B를 혼합하여 제조하였다. 입자의 퇴적을 돕기 위해서 집진 장치의 출구에 150 메쉬 스테인레스 강철 막을 위치시켰다.

제제 A: 탈이온수 5 g에 HA-플루오로세인 110-120 펩티드(카이론사, 에머리빌, CA) 20 mg 및 히드록시에틸 전분(아지노모토, 일본) 1 mg을 용해시켰다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 물중의 불화탄소 유화액을 다음과 같이 제조하였다. 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루드비히샤펜, 독일) 0.3 g, 형광 염료 0.3 mg, 텍사스 레드 DHPE(몰리큘러 프로브즈, 유진, OR, 3 mg)를 먼저 클로로포름에 용해시켰다. 그 후, 부치 로토뱁(Buchi RotoVap)을 이용하여 클로로포름을 제거하였다. 이어서, E100-3/텍사스 레드 DHPE 박막을 33 ml의 고온 탈이온수(60 내지 70℃)내에 분산시켰다. 그런 다음, 이 계면 활성제를 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여 10,000 rpm으로 약 2분 동안(온도 = 50 내지 60℃) 수성층내에서 더 가공하였다. 혼합하는 동안 퍼플루브론(아토켐, 파리, 프랑스) 8 g을 적가하였다. 여기에 불화탄소를 첨가한 후, 이 유화액을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그런 다음, 이렇게 하여 얻은 미정제 유화액을 18,000 psi의 고압 균질기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 B의 8분의 1을 분리하여 제제 A에 첨가하였다. 이렇게 얻은 HA 플루오로세인 펩티드/텍사스 레드 DHPE/퍼플루브론 유화액 공급 용액을 전술한 조건하에서 분무 건조기에 공급하였다. 집진 장치에 퇴적된 분말을 체로 거른 후 퍼플루브론을 이용하여 세정하여 수집기에 모았다. 이어서, 퍼플루브론중의 HA 현탁액을 -60℃에서 동결 건조시켰다. 유리 유동 형공 암갈색 분말을 얻었다.

V. 형광 표지된 HA 풀모스피어의 생체 이용률

실시예 IV와 같이 제조한 플루오로세인-HA 펩티드(20% wt/wt) 풀모스피어(f-HA-Pul)를 포함하는 조성물을 퍼플루브론에 현탁시켰다. 메토페인으로 마취시킨 마우스의 비측 내부에 70 g의 펩티드 투여량에 상응하는 70 ℓ부피의 퍼플루브론내의 f-HA-Pul을 투여하였다. 안구 채혈을 통해 헤파린 처리된 튜브에 혈액 시료를 모아서, 혈장을 분리하고 형광계를 이용하여 펩티드의 농도를 측정하였다. 대조군에는, 70 ℓ의 멸균 염수중의 70 g의 f-HA 펩티드를 정맥 투여하였다(모든 군의 n=4).

도 3은 시간에 따른 f-HA 펩티드의 혈청 농도를 나타낸다. 비측 내로 전달된 f-HA 펩티드의 절대 생체 이용률은 약 5%였으며, T_max는 20분 후였다. 이러한 두가지 투여 경로의 약물동력학 프로필은 서로 달랐으며, 정맥 투여시에는 계속적인 대수 감소, 비측내 투여시에는 일시적 증가에 이은 지수 감소를 나타냈다. f-HA는 소변으로 배출 제거되었으며(데이타는 기재하지 않음), 모두 제거되는 데 6 시간이 걸렸다.

VI. 분무 건조에 의한 인간 IgG 중공의 다공성 입자의 제조

하기 조건하에서 B-191 미니 스프레이 드라이어(뷔치, 플라빌, 스위스)를 이용한 분무 건조 기술을 통해 공동 다공성 인간 IgG 입자를 제조하였다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 61℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 L/시간. 공급물은 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 용액 A 및 B를 혼합하여 제조하였다.

제제 A: 일반 염수(박스터, 시카고, IL) 2g에 인간 IgG(시그마 케미칼스. 세인트 루이스, MD) 55 mg 및 히드록시에틸 전분(아지노모토, 일본) 3.2 mg을 용해시켰다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 물중의 불화탄소 유화액을 다음과 같이 제조하였다. 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여 8000 rpm으로 2분 내지 5분 동안(온도 = 60 내지 70℃) 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루드비히샤펜, 독일) 0.415 g을 고온 탈이온수(온도 = 50 내지 60℃) 40.3 g내에 균질화시켰다. 혼합하는 동안 퍼플루브론(아토켐, 파리, 프랑스) 5.2 g을 적가하였다. 불화탄소를 첨가한 후, 이 유화액을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그런 다음, 이렇게 하여 얻은 미정제 유화액을 18,000 psi의 고압 균질기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 B의 8분의 1을 분리하여 제제 A에 첨가하였다. 이렇게 얻은 IgG/퍼플루브론 유화액 공급 용액을 전술한 조건하에서 분무 건조기에 공급하였다. 집진 장치에 퇴적된 분말을 체로 거른 후 퍼플루브론을 이용하여 세정하여 수집기에 모았다. 이어서, 퍼블루론중의 HA 현탁액을 -60℃에서 동결 건조시켰다. 유리 유동 백색 분말을 얻었다. 타임-오브-플라이트 분석법(에어로자이저, 암허스트 프로세스 인스트러먼츠, 암허스트, MA)을 통해 측정하였을때, 공동 다공성 IgG 입자의 부피-가중 평균 공기 역학적적 직경은 2.373±1.88 ㎛이었다.

VII. 폴리클로날 인간 IgG 풀모스피어의 시험관내 활성

포착 hlgG ELISA를 이용하여 실시예 VI의 폴리클로날 인간 IgG 풀모스피어 조성물의 특성을 관찰하였다. 퍼플루브론중의 5 mg/ml의 hlgG-Pul 현탁액을 제조하여 피펫으로 웰에 옮기고 공기중에서 건조시켰다. 건조된 hlgG-Pul에 PBS를 첨가하고 밤새도록 배양하였다. 수화된 hlgG-Pul 용액을 희석시켜서 코팅 완충액(1:1000으로 희석, 시그마 이뮤노케미칼)중의 마우스 항-인간 k 쇄 모노클로날 항체로 코팅된 ELISA 플레이트로 옮긴 다음, 15% 염소 혈청을 함유하는 PBS로 실온에서 2 시간 동안 블로킹시켰다. 이 웰을 세정하고, 염소 항-인간 IgG 알칼린 포스파타제 접합체(15% 염소 혈청, 0.05% Tween을 함유하는 PBS로 1:1000 희석)를 첨가한 다음, pNPP 기질을 첨가하여 발색 반응시켰다. 자동 플레이트 계측기를 이용하여 405 nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 염수중의 hlgG(표준) 및 공(blank) 풀모스피어를 대조군으로 이용하여, 지질이 분석에 미치는 영향을 배제하였다. 공 풀무스피어는 인지질과 전분만을 포함하였다.

도 4는 hlgG-Pul, hlgG 및 hlgG + 공 풀모스피어에 대한 측정 곡선을 나타낸다. hlgG-Pul 조성물은 약 20 중량%의 hlgG를 포함하는 것으로 측정되었다. 또한, hlgG-Pul은 k 경쇄 및 중쇄 에피토프의 발현을 유지하였다.

VIII. 풀모스피어 조성물으로부터의 HA 110-120 펩티드 및 인간 IgG의 분해 역학

0.2 ㎛ 직경의 여과지를 장착하고 24-웰 세포 배양 플레이트를 갖춘 분해 챔버를 이용하여 풀모스피어로부터의 항원 및 hlgG 방출 역학을 측정하였다. 실시예 I 및 실시예 IV의 풀모스피어 분말 약 3 mg을 분해 챔버의 하부에 위치시키고, 동시에 멸균 PBS(1.3 ml/웰)에 노출시켰다. 37℃에서 이 플레이트를 수평 교반기(30 RPM) 위에 놓고, 호흡 패턴을 시뮬레이트하였다. 상부로부터 25 ㎕의 시료를 모아서, hlgG의 경우에는 포착 ELISA(도 5A), 플루오로세인-표지된 HA 펩티드 조성물(f-HA)의 경우에는 생물학적 정량(도 5B)을 통해 분석하였다. f-HA의 결과는 형광계를 통해 독립적으로 확인하였다(데이타는 기재하지 않음). hlgG 및 HA 펩티드 풀모스피어 조성물의 분해 역학을 이들 각각의 수성 대조군과 비교하였다.

도 5A 및 5B에 도시된 결과는 백분율 방출로 표시하였다. HA 펩티드 조성물의 경우에는 급속 확산-통제된 방출이 관찰되었으며, 수성 대조군과 차이를 보이지 않았다. 완전 분해는 2 시간 내에 일어났다. 대조적으로, hlgG 조성물에서는 저속 부식 -통제된 역학이 관찰되었다. 완전 분해에는 6 시간 이상 소요되었으며, 수성 IgG 대조군은 1 시간이 소요되었다. 본 발명의 결과는 풀모스피어로부터의 분해 역학이 적어도 부분적으로는 조성물 화합물의 분자량(각각 1.4 kDa 및 150 kDa)에 의존한다는 것을 증명한다. 또한, 친수성 또는 소수성의 차이도 이와 유사한 영향을 미칠 수 있다는 것이 이해할 수 있을 것이다.

IX. hlgG 풀모스피어의 생체 이용률

실시예 VI로부터의 인간 IgG 풀모스피어(hlgG-Pul)를 케타민/크실라진으로 마취시킨 마우스의 기관내(20 ℓ의 퍼플루브론중의 20 g의 hlgG)로, 또는 메토판으로 마취시킨 마우스의 비측 경로(70 ㎕의 퍼플루브론중의 70 g의 hlgG)를 통해 투여하였다. 멸균 PBS중의 동일 부피의 hlgG를 대조군에 정맥 투여하였다. 다양한 시간 간격으로 마우스로부터 채혈하여, 모든 군(n=3)에서 포착 ELISA를 통해 hlgG의 혈청 농도를 측정하였다. 정맥 투여 군과 비교했을때의 혈청 농도-시간 곡선(AUC)하의 면적으로부터 절대 생체 이용률을 결정하였다. AUC 값은 사다리꼴 규칙을 이용하여 계산하였다.

혈장 hlgG 농도 곡선은 도 6A(기관내) 및 6B(비측내)에 도시되어 있다. hlgG-Pul의 생체 이용률은 기관내 전달의 경우 27%, 비측내 투여의 경우 1.5%였다. 두 경우 모두에서, T_max는 약 2일 후에 나타났다. 웨스턴 블로팅을 수행하여 호흡관를 통해 전달된 후의 순환 hlgG의 분자량은 순수 hlgG의 분자량과 차이가 없다는 것을 알았다. hlgG는 14일 이상 순환하는 것으로 관찰되었다.

X. 기관 경로를 통해 전달된 hlgG 풀모스피어에 대한 항체 반응

퍼플루브론에 현탁된 실시예 IV로부터의 hlgG-풀모스피어(hlgG-Pul)를 기관내 투여(hlgG 20 g 투여)를 통해 처리한 마우스의 혈액 및 기관 폐포 세정(BAL)의 체액 반응을 관찰하였다. 또한, 하기 대조군으로 마우스를 처리하였다: 염수중의 20 ㎍ hlgG의 기관내 투여, 염수중의 100 ㎍ hlgG의 정맥 투여 및 기관내 투여, 프로인트 완전 보조제(CFA)중의 100 ㎍의 피하 투여, 그리고 염수의 기관내 투여. 각 군은 3중으로 처리하였다. 혈액 및 BAL은 면역 2주 후에 채취하였다.

hlgG 또는 0.1% BSA로 코팅된 ELISA 플레이트를 이용하여 항-hlgG 마우스 IgG의 역가를 측정하였다. 웰을 PBS-15% 염소 혈청으로 블로킹하고 다양한 희석 혈청 또는 BAL을 이용하여 2 시간 동안 배양하였다. 세척 후, 염소 항-마우스 IgG 알칼린 포스파타제 접합체, 이어서 pNPP 기질을 첨가하여 발색 반응시켰다. 자동 플레이트 계측기를 이용하여 550 nm에서 흡광도(OD)를 분석하였으며, 이 결과를 혈청 IgG의 경우에는 종말점 희석 역가로서(도 7A), BAL IgG의 경우에는 평균 OD로서(도 7B) 나타냈다.

염수중의 hlgG를 투여한 투여량/경로 대조군과 비교했을때, 이 결과는 기관내 경로를 통해 hlgG-Pul을 처리한 마우스에서 증가된 전신 및 국소 체액 반응을 보여준다. 뿐만아니라, 기관내 또는 정맥 경로를 통해 염수중의 hlgG 고투여량을 투여한 마우스와 비교했을때도 이 반응은 촉진되었다. 혈청 항체의 역가는 CFA중의 hlgG로 피하 접종한 마우스에서 관찰한 것과 유사하였다. 흥미롭게도, 체액 반응은 전신 생체 이용률과는 상호 관련이 없었으며(데이타는 기재하지 않음), 이는 국소 면역이 관계한다는 것을 암시한다.

XI. 기관 경로를 통해 전달된 hlgG 풀모스피어에 대한 T 세포의 반응

퍼플루브론에 현탁된 실시예 VI로부터의 hlgG-풀모스피어(hlgG-Pul)로 기관 경로를 통해 면역화시킨 마우스의 비장에서 유도된 T 세포 면역 레벨을 관찰하였다. 비장을 단일 세포 현탁액이 되게 분리하여, 저장성 완충액으로 처리하여 적혈구를 제거하였다. 비장 세포가 4 x 10⁶세포/ml이 되도록 완전 RPMI-10% FCS에 재현탁시킨 다음, 6 g/ml의 hlgG의 존재하에 24 웰의 평평한 바닥 플레이트(1 ml/웰)에서 배양하였다. 72 시간 동안 배양한 후, 상청액을 모아서 ELISA(바이오소스 인터내셔널, 카마릴로-CA) IL-2, IFN-4 및 IL-4의 농도를 측정하였다.

이 결과를 각 군의 마우스 개체들의 시토킨 농도의 평균값으로서 나타냈고, hlgG 염수 대조군과 비교했을때 hlgG-Pul로 면역화된 마우스에서 3종 시토킨 모두 의 생산이 촉진되었다. hlgG-Pul 처리군의 비장 T 세포에 의한 시토킨 생산을 염수중의 hlgG를 정맥 투여한 경우 관찰되는 것과 비교하였다. 이 결과는 폐에서 초회 항원 자극을 받은 기억 T 세포의 전신적 이동을 강하게 뒷받침해준다.

XII. 비측 경로를 통해 전달된 hlgG 풀모스피어에 대한 항체 반응

퍼플루브론에 현탁 또는 염수에 용해된 실시예 VI로부터의 풀모스피어(hlgG-Pul) 조성물을 비측내 점적(20 g)을 통해 hlgG를 전달 받은 마우스의 체액 반응을 관찰하였다. 면역 후, 다양한 시간 간격마다 혈청을 모아서, 실시예 X에서 기술한 ELISA 절차를 이용하여 hlgG 특이적 마우스 IgG의 역가를 측정하였다. 이 결과(도 9)는 평균 종말점 역가로서 나타냈으며, 염수 대조군과 비교했을때, hlgG-Pul을 처리한 마우스에서 시작 역학이 더 빠르고, 정도가 더 크고, 개체간의 면역 반응 재현율이 더 낮다는 것을 보여주었다.

XIII. 복강 경로를 통해 전달된 hlgG 풀모스피어에 대한 항체 반응

퍼플루브론에 현탁된 실시예 VI로부터의 hlgG-풀모스피어(hlgG-Pul)를 복강(i.p.) 경로를 통해 처리한(hlgG 100 g 투여) 마우스의 체액 반응을 관찰하였다. 또한, 마우스를 하기 대조 용액중의 100 ㎍ hlgG로 복강내 처리되었다: 염수, 복막 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 리포좀 염수 용액(+ ml lip), 단막 DPPC 리포좀 염수 용액(+ ul lip) 및 공 풀모스피어 염수 용액(+ 공 Pul). 또한 hlgG가 없는 공 풀모스피어 용액을 추가 대조군으로 분석하였다. ml lip(〉10 ㎛) 및 ul lip(90 nm)의 입자 중간 직경을 레이저광 분산 기술을 이용하여 측정하였다. 각 군은 3중으로 실시하였다. 7일 및 14일 경과 후, 혈청에서의 IgG 체액 면역 반응을 실시예 X에 기술된 것과 동일한 ELISA 기술을 이용하여 측정하였다.

이 결과를 종말점 역가의 평균으로 표시하였고, hlgG-Pul을 접종한 마우스의 항체 역가가 일관되게 증가한다는 것을 보여주었다. 더욱 구체적으로, 도 10A 및 도 10B는 각각 7일 및 14일 후의 종말점 역가를 나타낸다. 공 Pul에 첨가된 hlgG는 염수중의 hlgG와 유사하게 역가를 유도하였다. 뿐만아니라, hlgG에 DPPC 리포좀 조성물 중 하나를 첨가한 것은 hlgG-Pul에서 관찰된 증가된 면역을 복구시키지 않았다. 따라서, 이러한 결과는 (1) 촉진된 면역 hlgG-Pul은 경로 의존적 현상이 아니고(실시예 X 및 XII 참조); (2) hlgG-Pul 조성물은 hlgG의 촉진된 면역원성을 위한 전제 조건이며; (3) DPPC 또는 기타 Pul 성분은 독립적인 보조제 효과를 지니지 않는다는 것을 증명한다. 또한, 이러한 결과는 hlgG-Pul에 의해 면역을 촉진시키는데 다른 요인들 뿐만아니라 전달 경로가 중요하다는 것을 보여준다.

XIV. 분무 건조에 의한 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 공동 다공성 입자의 제조

8개의 구조 단백질 복합체 및 8개의 음전하 RNA 단편들을 포함하는 비교적 복잡한 막을 지닌 바이러스를 포함하는 공동 다공성 인플루엔자 바이러스(A/WSN/32 H1N1)를 하기 조건하에서 B-191 미니 스프레이 드라이어(뷔치, 플라비, 스위스)를 이용한 분무 건조 기술을 통해 성공적으로 미립자내로 혼입시켰다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 51℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 L/시간. 공급물은 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 제제 A 및 B를 혼합하여 제조하였다. 제조전, 바이러스는 살아 있었고, 자당-구배 원심분리를 통해 정제하였다.

제제 A: 히드록시에틸 전분(아지모모토, 일본) 1 mg을 달아서 염수중에 0.6 mg의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 튜브에 옮겼다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 물중의 불화탄소를 다음과 같이 제조하였다. 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루드비히샤펜, 독일) 0.111 g을 20 g의 고온 탈염수(온도 = 50 내지 60℃)에 옮겨서 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여 8000 rpm에서 2 내지 5분 동안 균질화시켰다. 혼합하는 동안 4.4 g의 퍼플루부론(아토켐, 파리, 프랑스)를 적가하였다. 여기에, 불화탄소를 첨가한 후, 이 유화액을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그런 다음, 이렇게 하여 얻은 미정제 유화액을 18,000 psi의 고압 균질기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 B의 8분의 1을 분리하여 제제 A에 첨가하였다. 이렇게 얻은 인플루엔자 바이러스/퍼플루브론 유화액 공급 용액을 전술한 조건하에서 분무 건조기에 공급하였다. 집진 장치에 퇴적된 분말 및 여과막은 퍼플루브론을 이용하여 세정하여 수집기에 모았다. 이어서, 퍼블루론중의 인플루엔자 바이러스 현탁액을 -60℃에서 동결 건조시켰다. 유리 유동 백색 분말을 얻었다.

XV. 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어의 시험관내 활성

하기 기술을 이용하여 생 바이러스 항원의 분무 건조된 입자로의 혼입을 관찰하였다: 실시예 XIV로부터의 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어(WSN-Pul)를 멸균 PBS에서 5 mg/ml이 되도록 40℃에서 6 시간 동안 용해시켰다. 그 후, 수화된 WSN-Pul을 다양한 농도로 희석시켜서 96 웰 플레이트에서 비고정 또는 파라포름알데히드 고정된 M12 항원 제시 세포(APC)와 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 항원을 첨가한 후, APC를 세척하고 TcH와 4 시간 동안 배양하였다. 포름알데히드글루타르알데히드 고정된 세포를 X-gal 기질과 배양한 다음, 양성 세포 수를 측정하였다.

이 결과를 활성화된 TcH의 백분율로 나타냈다(도 11A). 다양한 농도의 자당 정제된 생 WSN 바이러스를 대조군으로 이용하였다(도 11B). WSN-Pul 조성물은 약 5 중량%의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 것으로 측정되었다. 비고정된 APC만이 바이러스를 활성화시켰으며, 이는 항원이 분해되지 않았다는 것을 나타낸다. 전염성 바이러스의 역가를 MDCK(Madine Darby kindney carcinoma cells; 매딘 다비 신장 암세포) 분석을 통해 측정하였고(도 11C), 이는 총 바이러스의 약 1%가 여전히 허용 세포를 전염시키고 복제할 수 있다는 것을 보여주었다. 이러한 결과들은 모두 비교적 큰 인플루엔자 바이러스 항원이 풀모스피어 분말내에 성공적으로 혼입된다는 것을 증명한다.

XVI. 비측 경로를 통해 전달된 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어에 대한 항체 반응

5 g의 바이러스 및 2 x 10³TCID₅₀의 생 바이러스(생 바이러스 양에 대응하는 총 항원의 1%)를 함유하는 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어(WSN-Pul) 조성물을 BALB/c 마우스의 비측내부에 접종한 후, WSN 바이러스에 대한 바이러스 특이적 IgG 항체 반응의 유도를 관찰하였다. 대조군의 마우스는 2 x 10³TCID₅₀생 바이러스(총 바이러스의 0.05 g에 해당) 또는 자외선 사멸 WSN 바이러스(5 g)로 면역화시켰다. hlgG를 처리한 마우스로부터의 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다. 하기 ELISA 기술을 이용하여 혈청내의 항체 반응을 측정하였다: 코팅 완충액내의 자당 정제된 WSN 바이러스로 웰을 코팅하고, 비포유류 단백질(세라블록)으로 블로킹시킨 다음, 혈청 시료의 연속 희석액과 함께 배양하였다. 이 시료를 세척하고, 비오틴 접합된 래트 항 마우스 mAb, 스트랩타비딘-알칼린 포스파타제 및 pNPP 기질을 첨가하여 발색 반응시켰다. 이 결과를 역 종말점 역가의 기하적학적 평균으로서 나타냈다. 접종군당 마우스의 수는 3이었다.

도 12에 도시된 결과는 7일 및 14일 후에 WSN-Pul 또는 염수내의 생 WSN 바이러스(WSN/lo)로 면역화된 마우스에서의 고역가 IgG 항체 유도를 보여준다. 이와는 대조적으로, 염수내 사멸 바이러스로 면역화된 마우스에서는 소량의 특이적 IgG 역가만이 관찰되었다.

XVII. 비측 경로를 통해 전달된 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어에 대한 T 세포의 반응

T 세포의 반응을 바이러스 및 실시예 XVI에서 기술한 대로 면역시킨 마우스의 임파구의 에피토프-특이적 시토킨의 생산 측면에서 관찰하였다. 5 g의 바이러스 및 2 x 10³TCID₅₀의 생 바이러스(생 바이러스 양에 대응하는 총 항원의 1%)를 함유하는 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어(WSN-Pul)조성물을 BALB/c 마우스의 비측내부에 접종한 후, T 세포 반응의 유도를 측정하였다. 대조군의 마우스는 2 x 10³TCID₅₀생 바이러스(총 바이러스의 0.05 g에 해당) 또는 자외선 사멸된 WSN 바이러스(5 g)로 면역화시켰다. 시험에 사용된 항원은 자당 정제된 WSN 바이러스, HA 110-120 펩티드 및 NP 147-155 펩티드였다. 미처리 염수군을 대조군에 포함시켰다.

면역화 10일 후, 피콜 구배 원심분리를 통해 혈액으로부터 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 분리하였다. 다양한 수의 반응 세포를 니트로셀룰로오스/항-IFN 또는 항-IL-4(파밍엔) ELISPOT 플레이트(밀리포어)에서 3 x 10⁵세포/웰이 되게 하여 완전 RPMI-10% FCS내에서 배양하였다. 자극 세포(미토미신 처리된 비장 세포, 5 x 10⁵/웰), 항원 및 인간 rIL-2(20 U/ml)을 첨가하고, 이 플레이트를 48 시간 동안 공동 배양하였다. 그런 다음, 이 세포를 PBS-0.05% Tween으로 세척하고, 항-시토킨 항체(파밍엔)과 밤새도록 배양시킨 다음, HRP-스트렙타비딘 접합체, 이어서 불용성 기질(벡터 래보라토리즈)를 첨가하여 발색 반응시켰다. 이 반응을 물로 중단시키고, 웰을 공기 중에서 건조시킨 다음, 입체 현미경을 이용하여 스폿을 계측하였다.

백그라운드 시그날을 뺀 후, 이 결과를 IFN-4 또는 IL-4/10⁶PBMC을 생산하는 특이적 세포의 빈도로서 나타내었다. 백그라운드는 재현적으로 6/10⁶이하였다. 각군의 마우스로부터 PBMC를 모았다. 도 13A, 13B 및 13C에 표시된 결과는 WSN-Pul 및 WSN 바이러스에 의한 백신화는 일반적으로 IFN-4 및 IL-4를 생산하는 HA-특이적 T 세포, NP-특이적 T 세포 및 WSN 특이적 T 세포를 유도시킨다는 것을 보여준다. 이와는 대조적으로, 사멸 바이러스에 의한 면역화는 주로 IL-4 생산 T 세포를 유도하였다. 또한, 사멸 바이러스에 의한 면역화는 NP 147-155 펩티드에 특이적인 IL-4 생산 Tc2 세포의 촉진된 하부 집단을 유도시켰다. 이러한 데이타는 생 대조 바이러스 및 조성물 바이러스(즉, 생 바이러스 및 사멸 바이러스 포함)에 의해 일어난 T 세포 반응이 일반적인 종래의 백신에 해당하는 사멸 바이러스 대조군에 의해 일어난 반응보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다.

XVIII. 비측 경로를 통해 전달된 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어로 면역화된 마우스의 전염 시도에 대한 방어

실시예 XVII에 기술된 대로 면역화된 마우스를 비측 경로를 통해 1.2 x 10⁶인플루엔자 바이러스로 면역화 시킨지 3주 후에 전염원에 노출시켰다. 전염원에 노출시킨지 4일 후, 바이러스 방출 및 체중 변화에 대한 방어 능력을 결정하였다. 이 결과는 도 14A 및 14B에 도시되어 있다. MDCK 분석을 통해 생 바이러스를 적정함으로써 비측 세정에서의 바이러스 역가를 결정하였다. 이 결과는 인플루엔자 바이러스 A/WSN/32(H1N1) 풀모스피어(WSN-Pul) 또는 대조 생 WSN 바이러스로 미리 면역화시킨 마우스에서는 전염 바이러스가 존재하지 않음을 보여 주었다(도 14A). 자외선 사 WSN 바이러스로 면역화된 마우스 또는 비면역화된 마우스는 코 세정에서 유의적인 인플루엔자 바이러스 역가를 나타냈다. 뿐만아니라, WSN-Pul 또는 WSN 바이러스(적은 양의 생 바이러스)로 면역화된 마우스는 전염원에 노출된 후에도 체중을 유지하였다(도 14B). 반면에 비면역화된 마우스 및 자외선 사멸 WSN 바이러스로 면역화된 마우스는 심한 체중 감소를 나타내다가 죽었다(7일 까지 각군의 2/3가 죽음). 이러한 결과는 WSN-Pul이 점막 전달되면 효과적인 백신화 효력을 발휘할 수 있다는 것을 보여준다.

XIX. 분무 건조에 의한 TA7 레트로바이러스 공동 다공성 입자의 제조

하기 조건하에서 B-191 미니 스프레이-드라이어(뷔치, 플라빌, 스위스)을 이용한 분무 건조 기술을 통해 공동 다공성 TA7 레트로바이러스 입자를 제조하였다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 61℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 L/시간. 공급물을 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 용액 A 및 B를 혼합하여 제조하였다.

제제 A: 탈이온수 2 g에 1 mg의 TA7 레트로바이러스를 용해시켰다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 물중의 불화탄소 유화액을 다음과 같이 제조하였다. 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여, 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루드비히샤펜, 독일)0.3 g을 16.5 g의 고온 탈이온수(온도 = 50 내지 60℃)에 8,000 rpm으로 약 2 내지 5분 동안(온도 = 60 내지 70℃) 균질화시켰다. 혼합하는 동안 8.0 g의 퍼플루부론(아토켐, 파리, 프랑스)를 적가하였다. 여기에 불화탄소를 첨가한 후, 이 유화액을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그런 다음, 이렇게 얻은 미정제 유화액을 18,000 psi의 고압 균질기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 B의 8분의 1을 분리하여 제제 A에 첨가하였다. 이렇게 한 TA7 레트로바이러스/퍼플루브론 유화액 공급 용액을 전술한 조건하에서 분무 건조기에 공급하였다. 집진 장치에 퇴적된 분말을 체로 거른 후 퍼플루브론을 이용하여 세정하여 수집기에 모았다. 이어서, 퍼블루론중의 TA7 레트로바이러스 현탁액을 -60℃에서 동결 건조시켰다. 유리 유동 백색 분말을 얻었다.

XX. TA7 레트로바이러스 분무 건조된 입자의 시험관내 활성

실시예 XIX에서 제조한 분무 건조된 입자로 TA7 레트로바이러스를 혼입한 후, 이것의 활성을 관찰하였다. 분무 건조된 TA7 레트로바이러스 입자를 염수에 용해시킨 다음, 1 시간 동안 Hela 세포에 적용하였다. 마지막 접종 후 24 시간이 지나면, β-gal을 이용하여 형질전환 발현을 하는 세포를 분석하였다. 공 입자와 분무 건조된 TA7 레트로바이러스 I 입자간에 차이점이 관찰되지 않았다. 이 결과는 비교적 크고 복잡한 TA7 레트로바이러스가 활성의 손실없이 분무 건조된 입자에 효과적으로 혼입될 수 있다는 것을 증명한다.

XXI. 분무 건조에 의한 소 감마 글로불린 공동 다공성 입자의 제조

하기 조건하에서 B-191 미니 스프레이-드라이어(뷔치, 플라빌, 스위스)을 이용한 분무 건조 기술을 통해 공동 다공성 소 감마 글로불린(BGG) 입자를 제조하였다: 흡출: 100%, 입구 온도: 85℃; 출구 온도: 61℃; 공급 펌프: 10%; 질소 흐름: 800 L/시간. 공급물은 분무 건조를 수행하기 바로 직전에 두가지 용액 A 및 B를 혼합하여 제조하였다.

제제 A: 0.2% 염수 용액 21 g에 0.6 g의 BGG(캘바이오켐 샌 디에고, CA), 0.42 g의 락토오스(시그마 케미칼스, 세인트 루이스, MO) 및 25 mg의 플루로닉 F-68(NF 등급)(바스프, 파시파니, NY)를 용해시켰다.

제제 B: 인지질에 의해 안정화된 물중의 불화탄소 유화액을 다음과 같이 제조하였다. 울트라-투락스 혼합기(모델 T-25)를 이용하여 인지질(EPC-100-3)(리포이드 KG, 루드비히샤펜, 독일) 1.02 g을 30 g의 고온 탈이온수(온도 = 50 내지 60℃)에 8,000 rpm으로 약 2 내지 5분 동안(온도 = 60 내지 70℃) 균질화시켰다. 혼합하는 동안 35 g의 F-데칼린(에어 프러덕츠, 알렌타운, PA)을 적가하였다. 여기에 불화탄소를 첨가한 후, 이 유화액을 4분 이상 동안 혼합하였다. 그런 다음, 이렇게 얻은 미정제 유화액을 18,000 psi의 고압 균질기(아베스틴, 오타와, 캐나다)에 5차례 통과시켰다.

제제 A와 제제 B를 합하여 전술한 조건하의 분무 건조기에 공급하였다. 유리 유동 백색 분말을 집진 장치에 모았다. 타임-오브-플라이트 분석법(에어로자이저, 암허스트 프로세스 인스트러먼츠, 암허스트, MA)을 통해 측정하였을때, 공동 다공성 입자의 부피-가중 평균 공기 역학적 직경은 1.27 ±1.42 ㎛였다.

XXII. 소 감마 글로불린 MDI 조성물의 앤더슨 캐스캐이드 임팩터 결과

실시예 XXI에 따라 제조한 BGG 공동 다공성 입자로 제조된 측량 투여 흡입기(MDI)의 흡입 특성을 앤더슨 캐스캐이드 임팩터를 이용하여 측정하였다. 공동 다공성 BGG 입자 83 mg을 달아서 10 ml 알루미늄 캔에 넣고, 질소 흐름하의 진공 오븐에서 40℃로 3 내지 4 시간 동안 건조시켰다. 이 캔을 DF31/50act 50 I 밸브(밸로이스 오브 아메리카, 그리니치, CT)를 이용하여 주름잡아 봉하고 9.64 g의 HFA-134a(듀퐁, 윌밍톤, DE) 추진체로 채워서 캔 전체에 압력을 가했다.

장치를 발동시켜서, 61%의 미립자 분획 및 68㎍ 의 미립자 투여량을 관찰하였다(도 15). 이 실시예는 BGG와 같은 비교적 큰 생물 활성제가 조성물화될 수 있고, MDI로부터 효과적으로 전달될 수 있다는 것을 설명한다.

당업자들은 또한 본 발명의 정신 또는 주요 특성을 벗어나지 않는한 본 발명의 다른 특정 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 전술한 설명은 단지 본 발명의 실시 양태만을 개시한 것이고, 본 발명의 범위내에서 다른 변형이 고려될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에서 상세히 기술한 특정 양태에 국한되는 것은 아니다. 오히려, 첨부된 청구 범위를 본 발명의 범위 및 내용의 표시로서 참고해야 한다.

Claims (50)

1. 피검체의 면역계를 조절하는, 1종 이상의 면역 활성제에 결합된 복수개의 미립자를 포함하는 약제를 제조하는 데 사용되는 면역 활성제의 용도.
2. 제1항에 있어서, 미립자가 천공된 미세구조물을 포함하는 것이 특징인 용도.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미립자가 계면 활성제를 포함하는 것이 특징인 용도.
4. 제3항에 있어서, 계면 활성제가 인지질, 비이온성 세정제, 비이온성 블록 공중합체, 이온성 계면 활성제, 생물화합성 불화된 계면 활성제 및 이들의 배합물로 이루어진 군에서 선택된 계면 활성제인 것이 특징인 용도.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 계면 활성제가 인지질인 것이 특징인 용도.
6. 제5항에 있어서, 인지질이 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티틸콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테로일포스파티딜콜린, 디베헤노일포스파티딜콜린, 디아라키도일포스파티딜콜린 및 이들의 배합물로 이루어진 군에서 선택된 것인 것이 특징인 용도.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미립자가 비수성 현탁 매체내에 분산된 것이 특징인 용도.
8. 제7항에 있어서, 비수성 현탁 매체가 히드로플루오로알칸, 불화탄소, 퍼플루오로탄소, 불화탄소/탄화수소 디블록, 탄화수소, 알코올, 에테르 또는 이들의 배합물로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 포함하는 것이 특징인 용도.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 비수성 현탁 매체가 액체 불화 화합물 및 히드로플루오로알칸 추진제로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 포함하는 것이 특징인 용도.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미립자의 평균 공기 역학적 직경이 0.5 내지 5 ㎛ 사이인 것이 특징인 용도.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미립자의 평균 기하적 직경이 약 5 ㎛ 미만인 것이 특징인 용도.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역 활성제가 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물; DNA, RNA 및 안티센스 구조물을 포함하는 유전 물질; 그리고 바이러스, 파아지 및 박테리아를 포함하는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 용도.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역 활성제가 백신을 포함하는 것이 특징인 용도.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피검체의 면역계의 조절이 외부 항원 또는 병원균 입자에 대한 면역 반응을 일으키는 것, 국소 또는 전신 수동 면역을 유도하는 것, 면역 반응을 자극하거나 면역 반응을 하항 조절하는 것을 포함하는 것이 특징인 용도.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 국소, 근육내, 경피, 피내, 복강, 비측, 폐, 질, 직장, 귀, 입 또는 눈으로의 투여를 이용하여 약제를 전달하는 것이 특징인 용도.
16. 피검체에서 면역 반응을 일으키기 위해 1종 이상의 면역 활성제에 결합된 복수개의 미립자를 포함하고 피검체의 호흡기로 전달되는 흡입용 백신의 제조에 사용되는 면역 활성제의 용도.
17. 제16항에 있어서, 미립자가 천공된 미세구조물을 포함하는 것이 특징인 용도.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 미립자가 계면 활성제를 포함하는 것이 특징인 용도.
19. 제16항 내지 제18항에 있어서, 면역 활성제가 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물; DNA, RNA 및 안티센스 구조물을 포함하는 유전 물질; 그리고 바이러스, 파아지 및 박테리아를 포함하는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 용도.
20. 제16항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 백신이 분무 건조 흡입기를 이용하여 투여되는 것이 특징인 용도.
21. 제16항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미립자가 비수성 현탁 매체내에 분산된 것이 특징인 용도.
22. 제21항에 있어서, 비수성 현탁 매체가 액체 불화 화합물 및 히드로플루오로알칸 추진제로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 포함하는 것이 특징인 용도.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 측량 흡입기, 연무기, 분무기, 비측용 펌프, 분사병을 이용하거나, 소적 형태로 직접 점적하는 법을 통해 백신을 투여하는 것이 특징인 용도.
24. 제16항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미립자의 평균 공기 역학적 직경이 0.5 내지 5 ㎛ 사이인 것이 특징인 용도.
25. 제16항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미립자의 평균 기하적 직경이 약 5 ㎛ 미만인 것이 특징인 용도.
26. 제16항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유발된 면역 반응이 점막 면역을 포함하는 것이 특징인 용도.
27. 1종 이상의 생물 활성제에 결합된 복수개의 미립자를 포함하고, 투여시 피검체의 면역계를 조절하는 분말 및 이 분말을 포함하는 저장기를 구비한 투여 장치를 포함하는 생물 활성제를 피검체에 투여하는 장치.
28. 제27항에 있어서, 투여 장치가 건조 분말 흡입기 또는 분말 주입기를 포함하는 것이 특징인 장치.
29. 제27항에 있어서, 미립자가 비수성 현탁 매체내에 분산된 것이 특징인 장치.
30. 제29항에 있어서, 비수성 현탁 매체가 액체 불화 화합물 및 히드로플루오로알칸 추진제로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 포함하는 것이 특징인 장치.
31. 제29항에 있어서, 투여 장치가 측량 흡입기, 분무기, 분사병, 연무기, 비측용 펌프, 점적기 또는 무바늘 주입기를 포함하는 것이 특징인 장치.
32. 제27항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미립자가 천공된 미세구조물을 포함하는 것이 특징인 장치.
33. 제27항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미립자가 계면 활성제를 포함하는 것이 특징인 장치.
34. 제33항에 있어서, 계면 활성제가 인지질, 비이온성 세정제, 비이온성 블록 공중합체, 이온성 계면 활성제, 생물화합성 불화된 계면 활성제 및 이들의 배합물로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 장치.
35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 계면 활성제가 인지질인 것이 특징인 장치.
36. 제27항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미립자의 평균 기하적 직경이 약 5 ㎛ 미만인 것이 특징인 장치.
37. 제27항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생물 활성제가 면역 활성제를 포함하는 것이 특징인 장치.
38. 제27항에 있어서, 면역 활성제가 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물; DNA, RNA 및 안티센스 구조물을 포함하는 유전 물질; 그리고 바이러스, 파아지 및 박테리아를 포함하는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 장치.
39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 면역 활성제가 백신을 포함하는 것이 특징인 장치.
40. 1종 이상의 면역 활성제에 결합된 복수개의 천공된 미세구조물을 포함하고, 이 천공된 미세구조물의 용적 밀도가 약 0.5g/cm³미만이며, 이를 필요로 하는 피검체의 면역 반응을 조절하는 조성물.
41. 제40항에 있어서, 천공된 미세구조물이 계면 활성제를 포함하는 것이 특징인 조성물.
42. 제41항에 있어서, 계면 활성제가 인지질, 비이온성 세정제, 비이온성 블록 공중합체, 이온성 계면 활성제, 생물화합성 불화된 계면 활성제 및 이들의 배합물로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 조성물.
43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 계면 활성제가 인지질인 것이 특징인 조성물.
44. 제40항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미립자의 평균 기하적 직경이 약 5 ㎛ 미만인 것이 특징인 조성물.
45. 제40항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, 천공된 미세구조물의 평균 공기 역학적 직경이 0.5 내지 5㎛ 사이인 것이 특징인 조성물.
46. 제40항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 천공된 미세구조물이 공동의 다공성 미세구를 포함하는 것이 특징인 조성물.
47. 제40항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역 활성제가 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물; DNA, RNA 및 안티센스 구조물을 포함하는 유전 물질; 그리고 바이러스, 파아지 및 박테리아를 포함하는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 조성물.
48. 제40항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 천공된 미세구조물이 비수성 현탁 매체에 분산되어 있는 것이 특징인 조성물.
49. 피검체내에서 강화된 면역 반응을 제공하는, 1종 이상의 면역 활성제에 결합된 복수개의 미립자를 포함하고 수성 담체내의 유사한 면역 활성제에 비해 강화된 면역 반응을 일으키는 약제를 제조하는 데 사용되는 생물 활성제의 용도.
50. 제49항에 있어서, 생물 활성제가 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물; DNA, RNA 및 안티센스 구조물을 포함하는 유전 물질; 그리고 바이러스, 파아지와 박테리아를 포함하는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 용도.