TWI386220B - 真菌免疫刺激組合物及其用途 - Google Patents

Description

真菌免疫刺激組合物及其用途 【相關申請案】

本申請案請求序列編號60/727,047，申請日期2005年十月十四日美國暫時申請案之益處，其所有內容均在此特別合併作為參考。

本揭露範圍所屬領域為免疫學與細胞生物學。

免疫系統由許多互相依賴的細胞型態所組成，共同保護身體避免細菌，寄生蟲，真菌，病毒的感染以及腫瘤細胞的生長。許多這些細胞型態具有特殊的功能。

舉例來說，樹突狀細胞在引起初級免疫反應時，藉由捕捉並呈現抗原至負責製造抗體的適應性免疫系統細胞(如B細胞)，扮演一種樞紐的角色。此外，這些細胞型態都分泌重要類別的小分子免疫刺激蛋白，如細胞激素或趨化激素。

樹突狀細胞及B細胞的活性，在廣大範圍的人類疾病中是妥協的或不夠的。因此，對於在免疫系統中增加這些細胞族群或增強其活性之組合物的需求持續存在。

靈芝種(Ganoderma species)(一群藥用真菌)為在此領域所熟知。靈芝(Ganoderma lucidum)(Reishi或Ling-Zhi)因其促進良好健康，長生不老，以及延年益壽之功效被用於傳統中醫(TCM)(Shiao,M.S.,K.R.Lee,L.J.Lin,and C.T.Wang.in Food Phytochemicals for Cancer Prevention II：Teas,Spices,and Herbs.C.T.Ho,T.Osawa,M.T.Huang,and R.T.Rosen,eds.American Chemical Society,Washington DC,1994,p.342-354)。靈芝萃取物已被用於作為抗腫瘤及免疫調節劑。(Sone,Y.,R.Okuda,N.Wada,E.Kishida,and A.Misaki.in Agric.Biol.Chem.1985 49：2641-2653；Wang S.-Y.,Hsu M.-L.and Hsu H.,Int.J.Cancer 1997 70,pp.699-705；Vetvicka V.,Thornton B.P.and Ross G.D.,J.Clin.Invest.1996 98,pp.50-61；Van Stri jp J.A.G.,Russel D.G.,Tuomanen E.,Brown E.J.and Wright S.D.,J.Immunol.1993 151,pp.3324-3336；Muller A.,Rice P.J.,Ensley H.E.,Coogan P.S.,Kalbfleisch J.H.,Kelley J.L.,Love E.J.,Portera C.A.,Ha T.,Browder I.W.and Williams D.L.,J.Immunol.1996 156,pp.3418-3425；Lee,S.S.,Y.H.Wei,C.F.Chen,S.Y.Wang,and K.Y.Chen.Int.J.Chin.Med.1995 6：1-12.)一種含有岩藻糖之靈芝萃取物醣蛋白區份被Wong等人(專利號WO 2006/44616，公開日期為2006年4月27日)發現對於刺激發炎性細胞激素的表現或調節單核球細胞的分化非常有用，其所揭露已全部在此合併作為參考。

在一方面，藉由將CD14⁺單核球細胞與包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物接觸，本發明提供了一種增加樹突狀細胞成熟之方法。

另一方面，藉由給予一有效量的包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物，本發明提供了一種增加受試者體內免疫球蛋白(如IgG或IgM)產生之方法。

另一方面，本發明提供了一種增加受試者對一抗原之免疫反應之方法。該方法包括將CD14⁺單核球細胞與該抗原及包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物接觸。該接觸可在體外(例如使用富含CD14⁺細胞的細胞族群)或體內(例如藉由相同或不同途徑，給予包含CD14⁺單核球細胞的受試者該抗原及該組合物)實施。此外，與該抗原及該組合物在體外接觸之CD14⁺單核球細胞，其後可被轉移至受試者中。在一實施例中，該抗原來自病原體。舉例來說，合適的病原體包括，但不限於，可導致白喉，破傷風，百日咳，小兒麻痺，b型嗜血桿菌感染症，肝炎，肺炎，腦膜炎，中耳炎，流行性感冒，禽流感，水痘，麻疹，或德國麻疹之病原體。該抗原也可能為表現於癌細胞者。

又另一方面，本發明提供了一種增加一受試者生產一細胞激素或趨化激素之方法。該方法涉及給予受試者包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物。舉例來說，但不限制，該細胞激素或趨化激素可能為IL-1 α,IL-1 β,IL-3,IL-6,IL-7,IL-8,IL-10,IL 12p40,IL 12p70,IFN-K,TNF-α，嗜酸性細胞趨化素(Eotaxin),IP-10,MCP-1,MIP-1 α，或RANTES。

另一方面，藉由將樹突狀細胞與包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物接觸，本發明提供了一種增加樹突狀細胞生產一細胞激素或趨化激素之方法。舉例來說，該細胞激素或趨化激素可能為IL-1 α,IL-1 β,IL-3,IL-6,IL-7,IL-8,IL-10,IL 12p40,IL 12p70,IFN-K,TNF-α，嗜酸性細胞趨化素(Eotaxin),IP-10,MCP-1,MIP-1 α，或RANTES。該樹突狀細胞可在體內或體外與該包含一含有岩藻糖之醣蛋白區份接觸。

另一方面，藉由將細胞與包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物接觸，本發明提供了一種增加人類CD19⁺細胞生產一細胞激素或趨化激素之 方法。舉例來說，但不限制，該細胞激素可為IL-6,IL-8，及MIP-1 α。該CD19⁺細胞可在體內或體外與該含有岩藻糖之醣蛋白區份接觸。

在本發明方法的某些實施中，一細胞族群與一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物在體外接觸，且該細胞隨後轉移至被認定需要之受試者中。在本發明方法的其他實施中，藉由給予受試者該組合物，一群在受試者中的細胞，特別是人類受試者，在體內與該含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物接觸。

本發明中之方法可用於預防或治療。

另一方面，藉由給予病患包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物，本發明提供了一種治療免疫缺陷疾病患者的方法。可以本發明揭露之方法治療之免疫缺陷疾病包括但不限於常見多變型免疫缺陷(CVID)。

另一方面，本發明提供了一種增加受試者對疫苗的免疫反應之方法，該方法包含在給予疫苗之前，之間，或之後，給予受試者包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物。在一實施例中，該疫苗設計為預防感染性疾病，包括但不限於，三合一疫苗(DPT)，小兒麻痺疫苗，b型嗜血桿菌疫苗(HIB)，肝炎疫苗，禽流感疫苗，肺炎雙球菌以及流行性感冒疫苗。在另一實施例中，該疫苗為癌症治療之治療性疫苗。在此等實施例中，該含有岩藻糖之醣蛋白區份作為佐劑之用。

又一方面，本發明提供了一種增加抗原呈現細胞(APC)在免疫系統中呈現腫瘤抗原的能力之方法，該方法包含：將該抗原呈現細胞與包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物接觸；並將抗原呈現細胞與至少一種腫瘤抗原接觸。

另一方面，本發明提供了一種免疫刺激組合物，其包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份以及至少一種抗原，合適之抗原包括，但不限於，來自下列任一者的抗原：破傷風毒素，流行性感冒病毒血液凝集素分子，癌細胞抗原，白喉毒素，HIV gp120抗原，IgA蛋白酶，胰島素胜肽B，馬鈴薯粉狀瘡痂病菌(Spongospora subterranea)抗原，弧菌(vibriose)抗原，沙門氏菌抗原，肺炎雙球菌抗原，呼吸融合病毒抗原，嗜血流行性感冒病毒外膜蛋白，幽門螺旋桿菌尿素酶，腦膜炎雙球菌纖毛蛋白，以及淋病雙球菌纖毛蛋白。該免疫刺激組合物可進一步包含一種或多種賦形劑或載體，包括但不限於：界面活性劑，吸收促進劑，吸水性聚合物，抑制酵素分解之物質，醇類，有機溶劑，油，pH值-控制劑，助溶劑，安定劑，HLB-控制劑，黏性控制劑，防腐劑，滲透壓控制劑，推進劑，空氣置換，水，以及其混合物。

該術語「含有岩藻糖之醣蛋白區份」係指一靈芝萃取物的構成部分，其包括至少一種多醣以及包含岩薻糖基團的醣肽。

本文中該含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份也可稱為「靈芝萃取物」或，有時為「Reishi萃取物」，「Reishi萃取物F3」，靈芝可溶於水萃取物，「Reishi區份F3」，「Reishi-F3」，「F3」，「EORP」，或「該萃取物」。

該術語「醣蛋白」或「醣肽」係指任何長度及空間結構的蛋白質，其與糖單位共價接合，或經由絲胺酸或蘇胺酸O-糖基化的羥基鍵結，或透過天門冬醯胺酸(N-糖基化)或其部分的醯胺NH₂鍵結。該術語「多醣」係指任何長度及空間結構的聚合物，其包含分支及不分支鏈上以醣苷鍵結的單醣基 團。

該術語「萃取物」係指從已知物質中將活性成分移出所獲得的濃縮製備物；當活性成分包括在一溶劑中，可藉由蒸發所有或接近所有溶劑而將活性成分移出，並調整殘餘的團塊或粉末至規定之標準；萃取物通常製備為三種形式，半流體或糖漿，丸狀或固體，以及乾燥粉末。

該術語「靈芝」係指真菌靈芝或Reishi，取自其之任何組織，部位或區份，以及其任何製備物，包括均質物，懸浮物，濾液，過濾剩餘物質及溶液。

該術語「製備物」係指從一已知物質起始處理，製造，或混合之組合物，該術語「濃縮製備物」係指與已知物質中之相同比例關係比較，相對非活性成分之質量或體積，或相對全部組合物之質量或體積，具有增加活性成分質量或體積比例之製備物。

該術語「區份」係指一物質中一種可分離的成分。

在某些實施例中，該含有岩藻糖之醣蛋白區份包含在靈芝的一種區份中(在此也顯示為F3，區份3，Reishi多醣萃取物(EORP)，GL(PS)_Wu，或Wu)，該區份在波長625nm時具有約1.8 O.D.之光吸收，係由靈芝溶於水的萃取物(Reishi粗萃取物)中以實例一，二及三中所示範的實驗流程鑑定及分離。

區份3包括一含有岩藻糖之醣蛋白區份，其包含末端岩藻糖基團。該術語「末端岩藻糖基團」係指醣鏈的岩藻糖基團接近醣鏈游離末端的區域。區份3中該含有岩藻糖之醣蛋白區份，也包括以α-1,2-岩藻糖苷及α-3,4-岩藻糖苷鍵結的岩藻糖基團。

除了岩藻糖基團外，區份3中該含有岩藻糖之醣蛋白區份也包含葡萄糖， 甘露糖，N-乙醯葡萄糖胺，木糖，以及鼠李糖，如以實例一與實例二中所示範之實驗流程建立。

區份3中該含有岩藻糖之醣蛋白區份也包括一胺基酸組成物，如以實例一中所示範之實驗流程建立。然而，在不影響與區份3中該含有岩藻糖之醣蛋白區份相關活性之情況下，區份3中該胺基酸組成物可被明顯地改變。

Reishi區份3可以包含下列步驟之流程獲得：將一靈芝植物組織均質化及/或提供一已均質化之靈芝植物組織；萃取該均質化之靈芝植物組織；以及過濾該萃取後的均質化植物組織，以形成一種或多種區份，該等區份包含一具有岩藻糖基團的醣類組成物。以上述流程形成之該等區份可以蛋白酶處理。

該術語「萃取」係指任何適當之流程或步驟，以從已知物質開始，提供萃取物；在此領域具通常知識者可根據不同變數而決定此等步驟，包括該物質及從該物質移出之活性成分；示範流程包括根據該物質中成份在不同溶劑中的不同溶解度而進行之處理。該均質化植物組織之萃取可以任何適當之流程或步驟實行，以從該均質化之植物組織中，提供一包括含有岩藻糖之醣蛋白或含有岩藻糖之多醣組成物之靈芝萃取物；舉例來說，一個適當之流程包括以鹼水溶液(如0.1N NaOH)處理該均質化植物組織一段預定時間以形成一粗萃取物。

該術語「過濾」係指任何使一物質中之一成份(如一活性成分)與該物質中其他成份(如不純物質)分離的適當流程；在此領域具通常知識者可根據不同變數而決定此等步驟，包括該物質，該活性成分以及該物質中的非活性成分；示範過濾流程包括透析與膠體過濾層析。過濾該萃取後的均質化植物組織可藉由將粗萃取物以諸如膠體過濾層析進行過濾而實行，如利用 Saphacry S-500管柱，並以水溶液沖提，以形成一種或多種區份。在一實施例中，該水溶液為約pH 7.0的緩衝液，例如Tris緩衝溶液。

在其他實施例中，該含有岩藻糖之醣蛋白區份包括在區份F3的區份中(在此也統稱為精細區份)，在此鑑別為F3G1，F3G2，F3G3，以及F3G2的精細區份F3G2H1與F3G2H2。該等精細區份以實例二中所示範的流程，從區份3分離出來。因此，該術語「含有岩藻糖之醣蛋白」不單指F3區份，而是亦指其中的任何精細區份，以及任何F3與精細區份的組合，或任何精細區份的組合。

不同之精細區份可藉由相對吸光能力來區別。F3G1在480 nm時具有約0.4 O.D.的吸光值，F3G2在480 nm時具有約0.1 O.D.的吸光值；F3G2H1在480 nm時具有約0.10 O.D.的吸光值，且F3G2H2在480 nm時具有約0.5 O.D.的吸光值，如以實例二中所示範之實驗流程建立。

本文中F3及該精細區份也統稱為區份。

包含在精細區份中的該含有岩藻糖之醣蛋白區份亦可在岩藻糖以外包含其他糖類，如葡萄糖與甘露糖，半乳糖，N-乙醯葡萄糖胺，以及木糖，如以實例二中所示範之實驗流程建立(特別見表IV)。

該精細區份F3G1，F3G2以及F3G3可藉由分配區份3而獲得。該術語「分配」係指任何可將一物質分為兩種或多種成份的適當流程或步驟；在此領域具通常知識者可根據不同變數而決定此等步驟，包括該物質，以及被分配的成分。分配區份3可藉由過濾區份3，(舉例來說，以陰離子交換如Diaion-WA30陰離子交換，或以膠狀過濾層析，如TSK HW-75管柱)，並從過濾之區份3分離該精細區份F3G1，F3G2與F3G3(舉例來說，以鹼性溶液沖提，例如至少包括氯化鈉)而實施。

F3G2的精細區份F3G2H1與F3G2H2可藉由將F3G2進一步分配而得到。舉例來說，F3G2的分配可以過濾精細區份F3G2(如，以膠狀過濾層析，如，在TSK HW-75管柱上)，並從過濾之精細區份F3G2分離該精細區份F3G2H1與F3G2H2(如以一水溶液沖提該過濾之精細區份F3G2)而實施。

以上所述之獲得精細區份的流程示範實施例在實例二中說明。

該術語化合物的「有效量」為該化合物最基本達到，或較佳情況下，理想地達到所希望效果所需的至少最小量。該術語「一有效量」係指對接受處理的受試者賦予一特定預防或治療效用(如增加細胞激素產生，增加免疫球蛋白產生，或增加對一抗原的免疫反應)所需要含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份的量。在特定方法中所使用之含有岩藻糖之醣蛋白區份的有效量可由在此領域具通常知識者根據閱讀本發明，特別是實施例段落，並根據遭遇之特殊情況(如濃度，細胞型態與數量，等等)而輕易地決定，而不需要過度之實驗。

如在此領域具通常知識者可了解，根據欲引發的特定免疫效用(例如增加免疫球蛋白M的產生)，免疫病況的嚴重性，受試者的一般健康情形與年齡，先前接受的治療，給予途徑，使用之賦形劑，以及與其他預防及治療方式合併使用的可能性，有效劑量將會各異。

含有有效量的含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份的活性組合物可經由腸外，口服，鼻腔，直腸，局部，或口腔途徑給予。本文中該術語「腸外」係指皮下，皮內，靜脈內，肌肉內，關節內，動脈內，滑液囊內，胸骨內，膜內，或傷口內注射，以及任何適當的注入技術。

醫藥組合物中的載體必須為「可接受」，意為與組合物中活性成分相容(若能穩定活性成分更佳)，且不能對接受治療之受試者有害。可利用一種或多 種助溶劑作為賦形劑進行輸送。其他載體的例子包括膠質氧化矽，硬脂酸鎂，纖維素，烷基硫酸鹽，以及食品及化妝品級黃色10號(D&C Yellow #10)。

該術語「給予」係指任何適用於使一化合物(尤其是含有岩藻糖之醣蛋白區份)與細胞接觸的流程或步驟，其中該術語「接觸」或「使其接觸」係指將該化合物，特別是含有岩藻糖之醣蛋白區份，與細胞放置在一個共同的空間關係，使該化合物與細胞間的生物反應可以進行；該術語「生物反應」係指一化合物，特別是含有岩藻糖之醣蛋白區份，可藉此過程控制，影響或在其他方面影響細胞的正常功能及/或存活；在此領域具通常知識者可根據許多不同變數，包括細胞型態，接觸係發生在體外，體內，或活體外，來判斷此等實施步驟。給予含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份的可接受步驟包括個別劑量大小，劑量次數，給予劑量的頻率，以及給予模式，如體內之局部給予，部位給予，或口服給予，體外共置及測試，或活體外給予，如，給予分離之樹突狀細胞，該等步驟可由在此領域具通常知識者根據閱讀本發明所揭露之內容，特別是實施例而決定。

「抗原」為可被免疫系統辨認並產生免疫反應的任何分子。該術語「抗原」應包括一包含一種或多種刺激宿主免疫系統產生全身性，細胞性及/或分泌性免疫反應的抗原決定部位之分子。本發明中該抗原可為抗原的次單位，以及死亡的，減弱的或失去活性的細菌，病毒，原生動物，真菌，寄生蟲或其他微生物。該抗原可為，舉例來說，一種蛋白質，胜肽，多醣，脂質，或DNA抗原。合適的抗原可來自於，舉例來說，巴斯德桿菌屬(Pasteurella)，放線桿菌屬(Actinobacillus)，披衣菌屬(Chlamydia)，莫拉菌屬(Moraxella)，奈瑟菌屬(Neisseria)，鏈球菌屬(Streptococcus)，嗜血桿菌屬(Haemophilus)，沙門氏桿菌屬(Salmonella) 以及艾美屬球蟲(Eimeria species)，以及輪狀病毒(rotaviruses)，疱疹病毒(herpes viruses)(如BHV-1，EHV-1)，假性狂犬病毒(PRV)，細小病毒(parvovirus)，狂犬病毒(rabiesvirus)，流行性感冒病毒(influenza viruses)，副流行性感冒病毒(parainfluenza viruses)，肝炎病毒(hepatitis viruses)，人類免疫缺陷病毒(HIV)，小RNA病毒(picornaviruses)，腫瘤抗原，荷爾蒙，荷爾蒙類似物以及其他相似物質。

在本文中所使用，對於一特定抗原的「免疫反應」，應包括對該抗原產生分泌性，細胞性，體液性或抗體中介反應(或全身性反應(generalized response))。在接受免疫之宿主中，該反應之顯示可包括產生抗體(如IgA，IgD，IgE，IgG或IgM抗體)，B及/或T淋巴球之增生，刺激可辨認抗原呈現細胞的毒殺性T淋巴球，T細胞族群的擴展以及增強導致免疫系統細胞分化，活化或生長的訊息。

一般來說，本發明中給予佐劑將導致或造成對一感興趣之抗原的增強免疫反應。從文意中，「增強」應該係指相較於佐劑不存在時，佐劑存在時，對該抗原的免疫反應在量上較多及/或在質上較好。比較佐劑是否存在時的免疫反應可依例行方法實行，如以包含佐劑，抗原及合適對照組之調配物的放射免疫法或ELISA比較抗體效價。該增強之免疫反應可能是對個體免疫系統的直接作用之結果(如刺激T或B細胞以增加對抗原的反應)，或可為由於抗原在黏膜上有更有利的呈現所產生者(如提供更佳的黏膜附著性，讓抗原與黏膜之間有更長時間的接觸，或增強抗原穿過黏膜的吸收，舉例來說，增加黏膜的通透性)。

本發明中「佐劑」可用來描述增強對一抗原的免疫反應的佐劑。在一特殊實施例中，該佐劑為一黏膜佐劑。舉例來說，該佐劑可用於一組合物中， 以免疫哺乳類對抗特殊病原體或抗原次單位，或引發對特定抗原的免疫反應。

該術語「細胞性免疫反應」表示特定的毒殺性T細胞免疫力，為一種產生毒殺性CD8-陽性T細胞及CD4-陽性輔助T細胞的結果，導致腫瘤細胞或受到病原體攻擊的細胞被消滅。

該詞句「全身性免疫反應」表示產生選擇性辨認抗原的免疫球蛋白，並接續地與其他系統如補體，ADCC(抗體依賴性毒殺作用)或巨嗜作用，共同造成這些腫瘤細胞或受到病原體攻擊的細胞被消滅。

本發明提供許多在體外或體內，藉由暴露在一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份下，引發特定免疫系統細胞族群功能之免疫刺激性變化的方法。該等方法可用於治療許多如以下敘述的免疫疾病或病況。

本文中該含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份包含一具有以α1,2-岩藻糖苷鍵結的末端岩藻糖基團之多醣或醣肽。細節可見參考如Wang et al.(2002)Biorganic & Medicinal Chemistry 10：1057-1062。可用於製備該含有岩藻糖之醣蛋白區份的非限制性實例述於實施例一至三。

該含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份可引發細胞型態專一性的免疫刺激功效。因此，在本發明方法的某些應用，包含該含有岩藻糖之醣蛋白區份的組合物可在體外施用於經分離之富含細胞型態的族群，如CD14⁺單核球細胞族群，來自其中的樹突狀細胞族群，或CD19⁺單核球細胞族群。富含細胞型態之族群為具有細胞型態專一性表面蛋白質標記物的類似表現之細胞(亦即相同「免疫表型」)，在此族群中比不富含此細胞形態的族群佔有較多比例，如相對於做為富含流程起始材料的細胞族群。

來自週邊血液中的富含特定細胞型態族群可根據任何在此領域所熟知的 標準方法獲得。在非限制性的實施例中，其從一哺乳類(如人類或小鼠)之週邊全血樣本中先製備出白血球衣(Buffy coat)。該白血球衣可以標準流程，如在低速離心全血(如200 x g)，並接著收集所得之上層而獲得。異源單核球細胞族群可藉著使白血球衣對抗Ficoll-Paque plus(Amersham Bioscience)密度梯度離心(如在400 x g離心30-40分鐘)，並接著收集所形成的介面層而獲得。

特定細胞型態的富含族群可藉由許多標準技術，從異源單核球細胞製備中分離而得。富含特定細胞型態的族群可依據免疫表型被輕易地分離。

舉例來說，富含CD14⁺單核球細胞的族群或富含CD19⁺B細胞的族群可藉由將異源單核球細胞族群分別和與抗CD14抗體或抗CD19抗體結合的磁微珠共同培育而取得。其後，藉由提供一磁場，將與磁珠結合的細胞從未結合的細胞中分離出來，此為稱作磁性激活細胞分選(magnetic activated cell sorting)(MACS)之技術，以獲得富含表現感興趣標誌的細胞族群。有關MACS技術的細節述於如美國專利6,471,860中。MACS系統為可獲得之商品，如自Miltenyi Biotech GmbH(www.miltenyibiotech.com)。

其他分選細胞以及分析特定細胞族群是否存在的技術為已知的，例如螢光激活細胞分選(fluorescece activated cell sorting)(FACS)或流式細胞分析技術(flow cytometry)。見如Norkin et al.,Exp.Cell.Res.266(2)：229-38(2001)；Handbook of Flow Cytometry Methods,J.Paul Robinson(Editor)Wiley(1993)；以及Guide To Flow Cytometry Methods,W.McLean,Grogan James,M.Collins.,Marcel Dekker,Inc,New York,(1990)。

有時為了在體內引起對受試者中的CD14⁺單核球細胞以及CD19⁺單核球細胞之特定細胞型態的功效，可給予一受試者包含該含有岩藻糖之醣蛋白區份的組合物。

在一方面，本發明提供了一種藉由將CD14⁺單核球細胞與包含該含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份的組合物接觸，以增加樹突狀細胞成熟的方法。該萃取物也能增加樹突狀細胞與CD19⁺ B細胞兩者之許多細胞激素或趨化激素產生。除此之外，該含有岩藻糖之醣蛋白區份也能刺激CD19⁺ B細胞產生IgG及IgM。

該接觸可在體外(如利用一富含CD14⁺細胞的細胞族群)或在體內(如給予一受試者該含有岩藻糖之醣蛋白區份的組合物)實行。

應用於CD14⁺單核球細胞的含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份可增強CD14⁺細胞分化為樹突狀細胞，並增加該所得之樹突狀細胞的成熟與存活。CD14⁺單核球細胞可表現細胞表面標誌CD14與CD86。然而，當這些細胞分化為成熟的樹突狀細胞時，CD14表現量就減少，而CD1a，CD40，CD80，以及CD83的表現量增加。換句話說，該分化及成熟的細胞與CD14⁺單核球細胞有不同的「免疫表型」。

現提供說明前述方法的體外實施之非限制性實例。特定言之，藉由將CD14⁺細胞從第一天起培養在添加10%胎牛血清，GM-CSF(1000 U/mL)，以及IL-4(50 ng/mL)的RPMI 1640培養液中，一富含CD14⁺單核球細胞的族群可分化為成熟樹突狀細胞。六天後將該含有岩藻糖之醣蛋白區份以1-100 μ g/mL(如10 μ g)的濃度加入培養的細胞族群中24小時。有時該CD14⁺族群可在開始時於存在含有岩藻糖之醣蛋白之萃取物，但不存在GM-CSF及IL-4的情形下培養。所得之成熟樹突狀細胞族群可被轉移進入(如藉由直接注射進入血流中) 一被認定需要增加成熟樹突狀細胞族群的受試者中(如已進行免疫抑制治療的個體)。較佳情況下，但非專有者，該被轉移進入受試者之細胞族群為來自自體。

自CD14⁺單核球細胞面對免疫表型上的改變而成為樹突狀細胞之成熟過程可用許多已建立之技術測試，如以下詳細敘述的FACS。不論所使用的特殊技術為何，大致上都依賴對抗各個相關之細胞型態專一性標誌的特殊單株或多株抗體而決定或篩選一免疫表型，例如CD1a，CD14，CD19，CD40，CD83，以及CD86。對抗這些蛋白質的抗體是可獲得之商品，例如來自Abcam^®,Inc.(Cambridge,MA；www.abcam.com)。

FACS在量性決定一細胞族群於不同時間所存在的免疫表型上特別有用(例如在CD14⁺細胞的分化過程中)。

一般來說，在流式細胞分析技術中，使經對抗細胞表面標記之螢光標定抗體標定之細胞，在鞘液包圍下通過一個纖細的流動室，以使細胞以單列流動。藉由流體動力聚焦之方式，使該流中的個別細胞一次一個地以光束照射(如雷射光束)，並即時測量來自該等細胞的散射光或螢光強度，例如該等細胞之光資訊指標(light information indicative)，以分析該等細胞。這種流式細胞分析技術的優點為可在高速且準確性佳的情形下分析大量細胞。

流式細胞儀為在此領域所熟知且可獲得之商品，如自Beckman Coulter以及Becton,Dickinson and Company。

熟練的操作者將可明瞭許多在基本流式細胞分析技術系統之外可執行的變異及/或增加部分，例如提供操作者額外的及/或不同的分析能力。更進一步，熟練的操作者將可明瞭流式細胞分析技術可自動化操作，且流式細 胞儀可作為大型自動化系統的一部分，例如一高速篩選系統而提供。

在含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份存在下，CD14⁺細胞成為成熟樹突狀細胞之分化作用的特徵也為較大部分的分化細胞族群緊密附著於培養基質，且細胞形狀較為延長。此種細胞外形之形態變化可輕易地以明視野光學顯微鏡技術觀察(如相位差或微分干涉差(DIC)顯微鏡)。

另一方面，本發明提供了一種增加受試者對抗原的免疫反應之方法。該方法包括將一包含CD14⁺單核球細胞的細胞族群與該抗原及包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份的組合物接觸。該接觸可在體外(如一富含CD14⁺細胞的細胞族群)或體內(如以相同或分開途徑，將該抗原與該組合物給予包含CD14⁺單核球細胞之受試者)實行。在一實施例中，如以上所述，使該CD14⁺單核球細胞在含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份存在下培養一段足以容許樹突狀細胞成熟之時間。在該培養期後，接著將樹突狀細胞(亦即，包括表現該抗原的樹突狀細胞)轉移至受試者中，藉此增加對該抗原的免疫反應。在一實施例中，該抗原來自於病原體。相關的病原體包括，但不限於，導致白喉，破傷風，百日咳，小兒麻痺，b型嗜血桿菌感染症，肝炎，肺炎，腦膜炎，中耳炎，流行性感冒，禽流感，水痘，麻疹，或德國麻疹的病原體。該所選擇之抗原也可為在癌細胞中比類似細胞譜系的非癌細胞中以較高量存在者。如上所註明，該含有岩藻糖之醣蛋白區份可協助CD14⁺細胞分化為樹突狀細胞，並增強樹突狀細胞的成熟及存活。不受限於理論或假設，一般認為在一抗原存在下，加強樹突狀細胞的成熟可促進成熟樹突狀細胞之抗原呈現功能，並藉此增強對該呈現抗原的免疫力。

另一方面，本發明提供了一種藉由將該細胞與包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份的組合物接觸，以增加在人類CD19⁺細胞中之細胞激素或趨化激 素產生的方法。舉例來說，不用作限制，該細胞激素可能是IL-6,IL-8，或MIP-1 α。該CD19⁺細胞可在體內或體外(如利用一富含CD19⁺細胞的細胞族群)與該含有岩藻糖的醣蛋白接觸。

另一方面，本發明提供了一種藉由將該樹突狀細胞與包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份的組合物接觸，以增加在一樹突狀細胞中之細胞激素或趨化激素產生的方法。舉例來說，該細胞激素或趨化激素可能是IL-1 α，IL-1 β，IL-3，IL-6，IL-7，IL-8，IL-I0，IL 12p40，IL 12p70，IFN-K，TNF-α，嗜酸性細胞趨化素(Eotaxin)，IP-10，MCP-1，MIP-1 α，或RANTES。該樹突狀細胞可在體內或體外(如利用一富含樹突狀細胞的細胞族群)與該含有岩藻糖的醣蛋白接觸。

如以上所揭露，細胞族群可在體內及/或體外與包含該含有岩藻糖的醣蛋白區份的組合物接觸。舉例來說，一富含CD19⁺細胞的細胞族群可在體外與該含有岩藻糖的醣蛋白區份接觸，之後輸液進入被認定為需要增加從CD19⁺ B細胞產生的細胞激素或趨化激素的受試者，以及被認定為需要增加細胞激素或趨化激素含量，以及增加從CD19⁺ B細胞產生免疫球蛋白的受試者

許多決定任何不同細胞激素(如TNF-α，IL-10，IL-1α，IL-1 β，IL-3，IL6，IL-7，IL-8，IP-10，IL-12p40，IL-12p70，以及IFN-K)或趨化激素(如嗜酸性細胞趨化素(Eotaxin)，MIP-1α，以及RANTES)濃度的不同試驗已被詳細建立。基本上，該等不同試驗都利用細胞激素專一性的單株或多株抗體，來標定與定量各個關注之細胞激素。舉例來說，Beadlyte^®多重試驗可用以同時測試存在培養液中的細胞激素濃度(www.upstate.com/features/bead_techlit.asp)。

為了接觸CD19⁺細胞及/或樹突狀細胞，亦可將包含一含有岩藻糖的醣蛋白 區份的組合物直接給予受試者。舉例來說，可將有效量之包含一含有岩藻糖的靈芝醣蛋白區份的組合物給予一被認定為需要增加對於所選抗原的免疫反應之受試者。該抗原及該含有岩藻糖的靈芝醣蛋白區份之有效量可透過該含有岩藻糖的醣蛋白區份對樹突狀細胞成熟的影響，在受試者中引起增加的免疫反應。該含有岩藻糖的靈芝醣蛋白區份及該抗原可一起給予受試者，或在不同時間及/或以不同途徑給予。舉例來說，該有效量之含有岩藻糖的靈芝醣蛋白區份可以口服給予，而該抗原可注射給予。

另一方面，本發明提供了一種在受試者中增加免疫球蛋白(如IgG或IgM)產生的方法。舉例來說，在給予該組合物之前，該受試者可能被認定為患有低丙球血症，常見多變型免疫缺陷，癌症相關免疫缺陷，或免疫功能低下。藉由給予有效量之包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物，受試者中中之免疫球蛋白產生增加。免疫球蛋白(如免疫球蛋白M)的濃度可利用不同的免疫試驗決定，包括，如，競爭性及非競爭性試驗，放射性免疫試驗，生物發光(bioluminescence)以及化學發光(chemiluminescence)試驗，螢光試驗，三明治試驗，墨點法，以及酵素連結試驗(包括ELISA)。每種方法的範圍，靈敏度，準確度，可信賴性，專一性以及再現性已被建立。某些免疫試驗的實例詳述於，如Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(2005),11.1-11.3。

又另一方面，本發明提供了一種增加受試者之細胞激素或趨化激素產生的方法。舉例來說，不用於限制，該細胞激素或趨化激素可能是IL-1 α，IL-1 β，IL-3，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-12p40，IL-12p70，IFN-K，TNF-α，嗜酸性細胞趨化素(Eotaxin)，IP-10，MCP-1，MIP-1 α，或RANTES。該方法涉及給予受試者包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物。舉 例來說，該受試者可能被認定為患有慢性骨髓性白血病，或任何其他可藉由增加上述細胞激素及趨化激素的產生而改善之免疫病況。

在本發明另一方面，該含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份係作為一佐劑，以增強對抗原或疫苗的免疫反應。在此等方法中，為了增加對該抗原或疫苗的免疫反應，在給予該疫苗或抗原之前，之間或之後，給予該受試者包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之組合物。在一實施例中，藉由給予該含有岩藻糖之醣蛋白區份與該疫苗或抗原的混合物，該含有岩藻糖之醣蛋白區份與該疫苗或抗原共同給予。在一特定之非限制實施例中，其使用一包含0.01~70% v/v含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份的佐劑。

腸外給予(肌肉內與皮下注射)抗原或疫苗是一種有效的給予途徑。

在一實施例中，該含有岩藻糖之醣蛋白被用作黏膜給予抗原及疫苗的佐劑。黏膜含有眾多的樹突狀細胞，其為優秀的抗原呈現細胞。黏膜也與淋巴器官連接，其稱為黏膜相關淋巴組織，可加強對其他黏膜區域的免疫反應。位於鼻腔黏膜下的微血管廣泛網路以及T細胞與B細胞的高密度特別適合提供快速辨認抗原與提供快速免疫反應。本發明中的組合物可增強抗原在黏膜上的附著性，也增強該抗原透過黏膜之吸收。利用本發明中的組合物可提供引起系統性免疫反應(如IgG相同型抗體)的能力。

本發明中的組合物可調節對抗原的免疫反應；亦即該免疫性或疫苗組合物可在質及/或量上改善接種疫苗之宿主的抗體反應。在以該抗原免疫時，所產生之抗體數目可被增加(如，量之改進)，或者免疫反應的特性可被改變；舉例來說，從Th1反應變為Th2反應(如，質之改進)。

本發明中疫苗組合物的合適抗原包括任何可在接觸該抗原之脊椎動物中產生專一對抗該實體之抗體或細胞免疫反應之分子。可使用一個或多個抗原。該或該等抗原可能來自病原體微生物，包括病毒，細菌，黴漿菌，真菌，原生動物及其它寄生蟲。此外，該或該等抗原可能來自微生物以外的來源，舉例來說，癌細胞或過敏原。該或該等抗原可能是全部或一部分的病原體微生物，或是與該生物相關的全部或一部分的蛋白質，醣蛋白，醣脂質，多醣或脂質多醣。

可為疫苗目的而衍生或製造抗原的病原體微生物為在感染疾病領域所熟知，舉例來說，如列於Medical Microbiology,Second Edition,(1990)J.C.Sherris(ed.),Elsevier Science Publishing Co.,Inc.,New York者。

為對抗疾病的病原體，如細菌，病毒及寄生蟲而進行免疫刺激時，會利用構成該病原體或未知病原體的蛋白質或是衍生自其之蛋白質或胜肽。尤其是不受此等病原體之高一般性突變率影響的蛋白質更適合。已發表的例子包括HPV16/17(人類乳頭瘤病毒；Feltkamp,M.C.et al.,1995,Eur.J.Immunol.25(9),2638-2642)，B型肝炎病毒核心抗原(Vitiello,A.et al.,1995,J.Clin.Inv.95,1,341-349)，伯氏瘧原蟲(Widmann,C.et al.,1992,J.Immunol.Methods 155(1),95-99)，流行性感冒病毒核蛋白及C型肝炎病毒。

該含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份之免疫佐劑活性，無論單獨使用或配合一特殊抗原，可用在此領域所熟知的方法評估，例如ELISA，血凝試驗以及中和試驗。在本文中「免疫佐劑活性」應指在給予該佐劑及抗原的宿主中啟動免疫反應的能力。一般來說佐劑會與抗原一起給予，不是在相同的混 合物中就是在組合物中(國際專利申請公開案號WO 93/05789)，或同時但在不同組合物或調配物中。該抗原可與佐劑結合(如共價結合)或只是與其混合。該佐劑也可在給予抗原之前或隨後給予。佐劑活性包括，但不限於，藉由增加抗原的免疫性，或藉由降低需要產生免疫反應的抗原劑量或含量，而增強對抗原之免疫反應的能力。

在一實施例中，包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份的組合物係被用作佐劑，以增強抗癌治療組合物或疫苗(其係基於腫瘤細胞或腫瘤抗原)的免疫性。合適腫瘤抗原的例子在Robbins,P.F.Rosenberg,S.A.,1996,Journ.Exp.Med.183,1185-92，以及Henderson,R.A.,Finn,O.J.1996,Advances in Immunology 62,217-256所發表之回顧評論文章中提供。

為了達到抗腫瘤的反應，該腫瘤細胞必須表現不存在於正常細胞中的抗原，或是僅以免疫系統可在質上區別正常細胞與腫瘤細胞的程度存在之抗原。第二，免疫系統必須因此被活化，以對此等抗原產生反應。在發展人類腫瘤免疫治療上的其中一個問題就是腫瘤細胞的低抗原性。

一種由組成份T細胞抗原受體，MHC(主要組織相容性複合物)分子以及其配體(其係來自一蛋白質的胜肽片段)所構成之三分子複合體在調節特殊免疫反應中扮演重要角色。人類MHC分子根據國際習慣也稱做HLA(人類白血球抗原)。

通常，退化的或外來的基因產物，例如病毒蛋白質或腫瘤抗原，會在細胞內分解為小胜肽；其中有些構成MHC分子的可能配體。這提供了其被MHC分子呈現以及其後引發細胞性免疫反應的必要條件，雖然該等胜肽如何在細胞中產生為MHC配體尚未被清楚解釋。外來抗原及其片段也可以被構成體液免疫反應的免疫球蛋白辨認，結合及消滅。此對腫瘤抗原而言亦然：以 腫瘤相關抗原MUC1，CEA以及HER2/neu為例，已顯示對這些蛋白質具有專一性的免疫球蛋白可辨認並殺死攜帶該蛋白質的細胞。因此，為了引發對腫瘤抗原的專一體液免疫反應，在其他動物模式或初期臨床試驗中，不同形式的MUC1及CEA被他人用來作為免疫原(如在重組天花病毒載體中；Bronte et al.,J.Immunol.154：5282,1995)。

非惡性的正常體細胞可由免疫系統耐受，若細胞合成了對身體而言為外來的蛋白質，例如因病毒感染的結果，身體會藉由免疫反應而對正常細胞產生反應。MHC分子呈現源自外來蛋白質的外來胜肽。其後，免疫系統認為有某些不良及異己的物質發生在此細胞中。抗原呈現細胞(APC)，包括巨嗜細胞，樹突狀細胞，Langerhans氏細胞，以及B細胞會被活化，產生一種新的專一性免疫力並消滅該細胞。

含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份可因此被用作為一種佐劑，以引起或強化對病原體或抗腫瘤抗原的細胞性及/或體液，最好為系統性，的免疫反應。

又另一方面，本發明提供了一種增強抗原呈現細胞(APC)在免疫系統中呈現腫瘤抗原的能力之方法，該方法包含在抗原呈現細胞載入腫瘤抗原之前，同時，或之後，將抗原呈現細胞與包含一含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份的組合物接觸。在一實施例中，該抗原呈現細胞與該含有岩藻糖之醣蛋白區份及該腫瘤抗原係在體外接觸，並接著導入至具帶有該腫瘤抗原的腫瘤之受試者中。APCs包括樹突狀細胞及巨嗜細胞。該包含一含有岩藻糖之醣蛋白區份的組合物可能允許或增強APC對腫瘤抗原或片段的負載(「轉載(transloading)」)。經過如此吸收的蛋白質或蛋白質片段會被該等細胞處理後，並接著可在MHC中呈現給免疫效應細胞，因此引發或強化免疫反應 (Braciale,T.J.and Braciale,V.L.,1991,Immunol.Today 12,124-129；Kovacsovics Bankowski,M.and Rock,K.L.,1995,Science 267,243-246；York,I.A.and Rock,K.L.,1996,Ann.Rev.Immunol.14,369-396)。

細胞性免疫反應之引發可由偵測抗原專一性CTLs而確認，例如在Current Protocols in Immunology第三章中，或在Blomberg,K.and Ulfstedt,A.C.,1993,J.Immunol.Methods 160：27-34中。另一個細胞性免疫反應存在的指標為，在缺乏T細胞的情況下，在實驗動物中沒有免疫反應產生(其可利用可去除CD4-或CD8-細胞的抗體處理動物而達成)(Current Protocols in Immunology第三章)。細胞性免疫反應也可藉由在經免疫動物中偵測「遲發性過敏」(DTH)反應而顯示。為此目的，將胜肽注射在小鼠的腳掌底部，並測量注射位置的腫脹程度(Grohmann,U.et al.,1995,Eur.J.Immunol.,25,2797-2802；Puccetti,P.,et al.,1995,Eur.J.Immunol.,24,1446-1452)。

由對該生物來說的外來抗原或是由該待治療生物以低濃度表現的抗原所引起的體液免疫反應可藉由偵測血清中的特殊抗體決定。酵素連結免疫試驗(ELISA)為一種在血清中偵測抗體含量的合適方法。利用染色反應，在與用以進行免疫的胜肽結合後，可偵測該特殊抗體。另一種替代方法為西方墨點法。在此方法中，特殊血清抗體與固定在膜上之胜肽結合。結合的抗體最後同樣利用染色反應偵測(兩種方法的參考文獻：Current Protocols in Immunology,Editors：Coligan et al.,1991)。

醫藥組合物

根據另一方面，該含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份可被包括在醫藥組合物中，結合在此領域具通常知識者根據閱讀本發明而可辨識之其他活性成分，載體，載劑，賦形劑或輔助劑。

該醫藥組合物在較佳情況下，包含至少一種醫藥可接受的載體。在此等醫藥組合物中，該含有岩藻糖之醣蛋白形成「活性化合物」，也可稱為「活性劑」。在本文中，該術語「醫藥可接受的載體」包括與醫藥給予相容之溶劑，分散介質，塗料，抗菌及抗真菌劑，等張及延遲吸收劑等等。添加的活性化合物也可合併在該等組合物中。醫藥組合物會被調配為與其所欲之給予途徑相容。

給予途徑的例子包括腸外，如靜脈內，皮內，皮下，口腔(如吸入)，穿皮(局部)，穿黏膜，以及直腸給予。腸外，皮內或皮下應用所使用的溶液或懸浮液可包括以下成分：無菌稀釋劑，例如注射用水，鹽水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑如維他命C或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二銨四乙酸；緩衝劑如醋酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽以及調整張力的試劑如氯化鈉或右旋糖。pH可以酸或鹼調整，如鹽酸或氫氧化鈉。腸外製備物可裝於玻璃或塑膠製之安瓿，可拋棄式針筒或多劑量小瓶中。

本文中「受試者」係指人類與非人類的靈長類(如猩猩，獼猴，狨猿)，家畜(如羊，牛，馬，驢，豬)，寵物(如狗，貓)，實驗動物(如小鼠，兔，大鼠，天竺鼠，倉鼠)，圈養之野生動物(如狐狸，鹿)以及任何其他可受惠於本發明試劑的生物。可受惠於本發明試劑的動物類型並無限制。本發明之最佳受試者為人類。無論受試者為人類或非人類之生物，其都可稱做病患，個體，動物，宿主，或接受者。

適合作為注射用的醫藥組合物包括無菌水溶液(在為水溶性時)或分散液以及可供即時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。靜脈給予時，合適的載體包括生理鹽水，抑菌水，Cremophor EL.TM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。所有情況下，該組合物必須無菌且應為具有可輕易注射性程度的液體。其在製造及保存條件下應維持穩定，且必須防腐對抗微生物的污染作用，如細菌及真菌。該載體可為溶劑或分散介質，其含有，舉例來說，水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，以及液態聚乙二醇等等)，及其適當混合物。舉例來說，利用如卵磷脂的塗劑，利用維持所需顆粒大小(就分散液之情形)，以及利用介面活性劑，可維持適當的流動性。利用不同的抗菌劑及抗真菌劑，舉例來說，對羥基苯甲酸酯類，氯丁醇，苯酚，維他命C，硫柳汞等等。在許多情況下，該組合物中最好包含等張劑，例如糖，多元醇如甘露醣醇，山梨糖醇，氯化鈉。藉由在組合物中包含一延遲吸收的物質，例如單硬脂酸鋁及明膠，可延長注射組合物的吸收。

無菌的可注射溶液可藉由將所需量的活性化合物，並依照需要結合一個或以上列舉成份的組合，併入在適當的溶劑中，接著進行無菌過濾而製備。一般來說，分散液是藉由將活性化合物併入包含基本分散介質與所需以上列舉其他成份的無菌載劑中而製備。就用來製備無菌注射溶液的無菌粉末而言，較好的製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其可由其在先前經無菌過濾的溶液產生活性成分加上任何其他所需成份的粉末。

無菌可注射的組合物可能是溶液或懸浮液，存在於一種無毒性之腸外可接受的稀釋劑或溶劑中，如在1,3-丁二醇中的溶液。可使用之可接受的載劑與溶劑包括甘露醣醇，水，Ringer’s溶液，以及等張氯化鈉溶液。另外， 固定油是一種傳統使用的溶劑或懸浮介質(如合成單-或雙甘油酯)。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物，可用於製備可注射物，天然的醫藥可接受油類亦同，如橄欖油或蓖麻油，特別是其聚氧乙烯型。這些油溶液或懸浮液也可包括長鏈醇類稀釋劑或分散劑，羧甲基纖維素，或類似分散劑。亦可為調配之目的而使用其他普遍使用的介面活性劑，如Tweens或Spans或其他類似的乳化劑，或是普遍用於製造醫藥可接受的固體，液體，或其他劑型的生體可用率增強劑。

口服組合物一般來說包括鈍性的稀釋劑或可食用的載體。為了口服治療給予的目的，該活性化合物可與賦形劑合併並以錠劑，藥片，或膠囊，如明膠膠囊之形式使用。口服組合物也可利用液體載體製備，以作為漱口水。醫藥相容性結合劑，及/或佐劑材料，也可被包含為組合物的一部分。錠劑，藥丸，膠囊，藥片等等可包含任何以下成分，或類似特性的化合物：結合劑如微晶纖維素，黃蓍膠或明膠；賦形劑如澱粉或乳糖，崩解劑如海藻酸，Primogel，或玉米粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑如膠狀二氧化矽；甜味劑如蔗糖或糖精；或調味劑如薄荷，水楊酸甲酯，或柑橘香精。

以吸入方式給予時，該等化合物係從加壓容器或包含合適推進劑(例如二氧化碳之氣體)的分配器，或噴霧器，以氣溶膠噴霧的型式輸送。

系統性的給予亦可能是藉由穿黏膜或穿皮之方式。以穿黏膜或穿皮給予時，其在該調配物中使用適合該待穿透屏障的穿透劑。此等穿透劑為在此領域者所熟知，且包括，舉例來說，就穿黏膜給予而言，清潔劑，膽鹽，以及夫西地酸衍生物。穿黏膜給予可透過使用鼻腔噴霧或栓劑完成。穿皮給予時，該等活性化合物可被調配成在此領域普遍所知的軟膏，油膏，凝膠，或乳霜。該等化合物也可製備為直腸輸送用的栓劑(例如以傳統栓劑基 質如可可脂以及其他甘油脂)或保留灌腸劑形式。

在一實施例中，該等活性化合物係與可保護該化合物不在體內快速消滅的載體一同製備，如控制釋放調配物，包括植入物以及微膠囊輸送系統。可使用生物可分解，生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯，聚酐類，聚乙醇酸，膠原蛋白，聚原酸酯，以及聚乳酸。此等調配物的製備方法對在此領域具通常知識者來說為明顯的。該等材料也可從Alza Corporation與Nova Pharmaceuticals,Inc購得。微脂體懸浮液(包括以對抗細胞專一性抗原之單株抗體而靶向經感染細胞的微脂體)也可作為醫藥可接受的載體。這些可由在此領域具通常知識者已知之方法而製備，舉例來說，如美國專利號4,522,811中所述。

為便於給予與統一劑量，將口服或腸外組合物調配成劑量單位形式是較佳的。在本文中所指的劑量單位形式係指物理上不連續的單位，適用於作為給予待治療受試者的單一劑量；每單位包含經計算以產生所欲治療功效之預定量的活性化合物，並結合所需之醫藥載體。

此等化合物的毒性與治療功效可藉由標準醫藥流程而在細胞培養物或實驗動物中決定，例如，決定LD50(使50%之族群致死的劑量)及ED50(在50%之族群中為治療有效的劑量)。毒性與治療功效間的劑量比例為治療指數，且其可用LD50/ED50比例表示。最好的為具有高治療指數的化合物。儘管可使用具有毒性副作用的化合物，但應注意設計一輸送系統，讓此等化合物靶向受影響組織的位置，以使對未經感染細胞的潛在傷害降至最低，並因此減少副作用。

由細胞培養物分析及動物實驗所獲得的數據可用於調配一範圍的劑量而用於人類。此等化合物的劑量較佳係介於一循環濃度的範圍內，該範圍包 含ED50且含有少量或沒有毒性。該劑量可在此範圍內，根據使用劑型及所利用的給予途徑而變化。對於任何在本發明方法中所使用的化合物，治療功效劑量可從細胞培養試驗初步估計。可在動物模式中調配一劑量，以達到如細胞培養中所決定的循環血漿濃度範圍，該範圍包括IC50(亦即達到一半最大症狀抑制的測試化合物濃度)。這些資訊可用於更準確的決定人類的有效劑量。血漿中的含量可被測量，舉例來說，利用高效液態層析。

如本文中之定義，該活性化合物的治療有效量(亦即有效劑量)可能從每公斤體重約0.001至30 mg。在此領域具通常知識者將可明瞭某些可影響有效治療受試者所需的劑量與時機，其包括但不限於疾病或病症的嚴重性，先前治療，受試者之一般健康及/或年齡，以及其他存在的疾病。

以下的特殊實例僅為示範解釋，並不以任何形式限制本發明其他部分。在無須進一步詳述之情形下，咸信在此領域具通常知識者可根據本文之描述，將本發明利用至其完全範圍。所有本文所引述的參考文獻均以其全文併入本文作為參考。

實例

本發明進一步藉由下列不限制之實例加以敘述。以下實例所使用的材料，方法及統計分析述於Wang et al.,Bioorg.Med.Chem.,10(2002)1057-1062；Hsu et al.,“Extract of Reishi Polysaccharides Induces Cytokine Expression via TLR4-Modulated Protein Kinase Signaling Pathways”,J.Immunol.(2004)173,5989-5999；Chien C.,Chen J.,Chang W.,Tien M.Tsao C.Chang Y.Chang H.,Hsieh J.,Wong C.and Chen S.,Bioorg.Med.Chem.,2004,12,pp.5603-5609；Chen H.,Tsai Y.,Lin S.,Lin C.,Khoo K.,Lin C.and Wong C.,Studies on the immuno-modulating and anti-tumor activities of Ganoderma lucidum(Reishi)polysaccharides,Bioorg.Med.Chem.,2004 vol.12,iss.21,pages 5595-5601，以及Lin et al.,J.Biol.Chem.,281(34)24111-24123,(2006)，其各以其全文併入本文作為參考。實例一至三顯示製備規模的變化，Reishi粗萃取物與F3萃取物之分析，以及進一步的精細區份化技術。

實例一：Reishi萃取物F1、F2、F3、F4、以及F5的製備與分析

Reishi粗萃取物(經過鹼萃取(0.1N NaOH)，中和以及乙醇沉澱而製備)從Pharmanex Co.(CA,USA)取得。含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份的製備及特性述於Wang et al.,Bioorg.Med.Chem.10(2002)1057-1062。較大規模的製備方法述於Lin et al.,J.Biol.Chem.,281(34)24111-24123,(2006)。簡單來說，將28 mg的粗萃取物溶解於2 mL Tris緩衝液中(pH值7.0，0.1N)，以離心去除不溶的材料(7 mg)。以Sephacryl S-500管柱(100×1.6公分)進行膠體過濾層析純化上清液，以0.1N Tris緩衝液(pH值7.0)為沖提液。流速設定為每分鐘0.5 mL，並收集沖出物(每管7.5 mL)。以下列方式集合樣品管，以得到五個區份：區份1：100-130 mL；區份2：130-155 mL；區份3：155-205 mL；區份4：205-220 mL；以及區份5：220-255 mL。

在625 nm具有光學密度(O.D.)為1.8之主要區份稱為區份3。經過層析後，粗萃取物與每個分離之區份再接受蒽酮(anthrone)分析(Somani B.L.,Khanade J.and Sinha R.Anal.Biochem.167(1987),p.327；Jermyn M.A.Anal.Biochem.1975(68),p.332；Halhoul M.N.and Kleinberg I.,Anal.Biochem.1972(50),p.337)，以偵測糖類成分。透析區份 1-5以移除多餘鹽類，並在凍乾後分別得到1.0 mg，6.2 mg，5.3 mg，2.1 mg，以及少於1 mg。

在擴大規模的製備實施例中，Reishi-F3萃取物以類似上述實例一的方法製備。2.1克之過濾並凍乾的Reishi粗萃取物樣品可回收520 mg(產率25%)的Reishi F3萃取物(Lin et al.,2006)。

糖類組成分析：蒽酮比色法

在一系列浸泡於冰水浴的試管內之各1.5 mL的蒽酮(9,10-二氫-9-氧蒽)溶液(0.2克蒽酮溶於100 mL濃硫酸中)中，小心加入1.5 mL的樣品(20-40 μ g/mL的葡萄糖或相當物質)。在所有添加完成後，快速震盪該試管並接著放入冰水浴中。在沸水浴中加熱試管5分鐘之後冷卻；在一小時內，於625 nm，與去離子水比較而讀取光學密度。標準品，空白試劑及未知樣品均以三重複測試，因為可能有其他碳水化合物來源的污染。以光學密度與碳水化合物濃度直接成正比的基礎來進行運算。

糖類組成分析-TMS法

為進行單醣分析，使多醣萃取物/區份以0.5 M甲醇-HCl(Supelco)在80℃下甲醇醇解16小時，以500 μL甲醇，10 μL吡啶(pyridine)以及50 μL乙酐(acetic anhydride)重新-N-乙烯化，之後以Sylon HTP^®三甲基矽化劑(Supelco)在室溫下處理20分鐘，風乾並以正己烷回溶。以連接HP 5973質譜選擇檢出器(Mass Selective Detector)的Hewlett-Packard(HP)Gas Chromatograph 6890進行該等三甲基矽衍生物之GC-MS分析。在不分流注入HP-5MS熔融石英毛細管管柱(30 m×0.25 mm I.D.，HP)之前，將樣品溶解在己烷中。使用氦氣作為載流氣體，使管柱柱頭壓力維持在大約8.2 psi，以產生每分鐘1 mL的穩定流速。使起始烘箱溫度在60℃保持1分鐘，以每分鐘25℃的速度增加至140℃，以每分鐘5℃的速度增加至250°，接著以每分鐘10℃的速度增加至300℃。

粗萃物的碳水化合物組成顯示於表I中，Reishi粗萃物與區份3的碳水化合物組成分別顯示於下列的表I與表II中。

利用脈波安培偵測的高pH值陰離子交換層析(HPAEC/PAD)分析確認在F3中包括含有岩藻糖基團的醣蛋白或多醣。

同時，硫酸/苯酚分析也顯示F3中的整體多醣濃度(85%)高於粗萃取物(60%)。

胺基酸組成分析

根據已經完整建立的方法進行分析(Spachman D.H.,Moore S.and Stein W.H.,Anal.Chem.30(1958),p.1190；Lo,C.-H.；Chiou,S.-H.J.Chromatogr.1990,530,129)。將Reishi粗萃取物的樣品(6 mg)溶解於1 mL的6M HCl與TFA的溶液中(4/1)，並在140℃加熱3小時。將混合液濃 縮以得到一乾燥殘留物，並以100 μL檸檬酸緩衝液溶解。取出一小部分(4 μL)並以胺基酸分析儀(Jeol JLC-6AH)進行組成分析。

所得之Reishi粗萃取物胺基酸組成示於以下表III。

根據胺基酸分析，Reishi粗萃取物包含約15.6%的蛋白質。進一步分析Reishi粗萃取物與Reishi-F3中的蛋白質濃度(利用Lowrey法，以BSA作為標準品)顯示F3包含約10%的蛋白質，而Reishi粗萃取物包含約20%的蛋白質。

F3的碳水化合物組成的進一步分析，包括F3與精細區份之間的碳水化合物組成差異，以及獲得F3精細區份的流程，可見於Chen et al.,Bioorg.Med.Chem.12(2004)5595-5601，其以其全文併入本文作為參考。

實例二：製備及純化Reishi萃取物F3-精細區份化以產生F3G1，F3G2，F3G2H1，以及F3G2H2

Reishi粗萃取物(以鹼萃取(0.1 N NaOH)，中和以及乙醇沉澱製備)從Pharmanex Co.(CA,USA)取得。除非特別指明，所有化學品及試劑均來自Sigma Co.,(St.Louis,MO,USA)。

將100克Reishi粗萃取物溶解於3公升的二次水中，在4℃下攪拌24小時，再離心一小時以去除不溶成分。將所得的溶液在35℃下濃縮為較小體積並進行凍乾，以產生70克的深棕色粉末，取其中2.5克溶解於小體積的Tris緩衝液(pH值7.0,0.1 N)中，再利用Sephacryl S-500管柱(95×2.6 cm)進行膠體過濾層析而純化，以0.1 N的Tris緩衝液為沖提液。流速設定為每分鐘0.6 mL，並將每7.5 mL收集在一試管中。層析後，對各個區份進行如以上實例一所述之蒽酮分析或苯酚-硫酸法，以偵測糖類成分。共收集五個區份(區份1-5)，各都以透析去除多餘的鹽類並凍乾，以產生450 mg之每個區份，特別是F3。

F3進一步注入Diaion-WA30陰離子交換管柱(Cl^-型式，40×3.5 cm)，以0.2及0.8 M NaCl沖提，流速為每分鐘0.5 mL，並將其中兩個區份分別稱為F3G1(以F3為基礎，產率為11%)與F3G2(以F3為基礎，產率為10%)。當以2 M NaOH進一步沖提該管柱時，產生另一區份(F3G3，以F3為基礎，產率為11%)。

以蒽酮比色法及TMS法決定F3G1，F3G2與F3G3的碳水化合物組成。結果示於下表IV。

結果顯示區份3以及精細區份F3G1，F3G2與F3G3皆包含主要成份葡萄糖與甘露糖，以及較少量的其他糖類，包括岩藻糖，N-乙醯葡萄糖胺，木糖，以及鼠李糖。半乳糖的比例在F3G2與F3G3中比其他區份明顯較少。

利用TSK HW-75管柱(130×2.6 cm)進行F3G2的膠體過濾層析，以二次水沖提，流速為每分鐘0.5 mL。收集兩個區份；F3G2H1(以F3G2為基礎，產率為19%)與F3G2H2(以F3G2為基礎，產率為69%)。

有關F3G1、F3G2、F3G3、F3G2H1及F3G2H2組成的進一步指標與取得該等精細區份之流程可見於Chen et al.,Bioorg.Med.Chem.,2004 vol.12,iss.21,pages 5595-5601，其以其全文併入本文。

實例三：Reishi萃取物區份3的製備

靈芝PS粗萃取物(以鹼萃取(0.1 N NaOH)，中和以及乙醇沉澱製備)從Pharmanex(CA)取得。將100克靈芝粗萃取物溶解於3 L的二次水中，並在4℃下攪拌24小時。將該溶液以16,000 g在4℃下離心1小時，再將上清液在35℃下濃縮。接著將該漿狀產物凍乾以得到70克可溶於水的深棕色靈芝萃取物。將該萃取物(2.5克)以Sephacryl S-500管柱(95 2.6公分)區份化，以0.1 N Tris緩衝液(pH 7.0)為沖提液。流速設定為每分鐘0.6 ml，並以每管7.5 ml收集區份。共收集五個區份，再各以透析去除多餘的鹽並凍乾，以得到區份1-5；對各區份如實例一所述以了解其特性。分離該含有岩藻糖的醣蛋白區份(產率20-30%)，即區份3(F3)。

為避免LPS污染，靈芝原料及PS萃取物從生長到收成均以GMP等級從Pharmanex製備，並小心監測可能的細菌污染，以符合美國食品藥物管理局之標準。製備F3的試劑與器具都是無內毒素等級或是以包含50 μ g/mL多黏菌素B(PNB)的PBS清洗並接著以PBS沖洗。利用LAL試驗(Sigma-Aldrich)測量，在25 μ g F3中包含少於1 ng的LPS。另外，某些試劑會例行性以LAL試驗檢查其LPS的污染。

如Wang et al.,Biorg.Med.Chem.10(2002),1057-1062(其以其全文併入本文作為參考)所述進行另一流程。根據Wang et al.,2002所述流程之修改版本，包含直接離心，從顯示額外成份以及F3的Reishi水溶性樣品分離多醣。

簡單來說；將從1克Reishi原始粉末所得的水溶性多醣在4℃下離心1小時(5000 r.p.m.,2800g)，利用MWCO：100K離心過濾，將多醣分離，收集該多醣區份並凍乾以得到172 mg(17%)的F3(F3>100K)。此部分多醣顯示與F3類似的HPLC概況。進一步以Wang et al.,2002所述的生物功能 性試驗分析以此方式產生的F3。舉例來說，以此方式產生的F3在RT-PCR中顯示可自小鼠脾臟細胞產生細胞激素釋放。

實例四：小鼠與人類細胞培養物及試劑

自6-8週C57/B16小鼠(prdm1 ^f/f CD19Cre+或prdm1 ^f/f CD19Cre-)，利用B220微珠(Miltenyi Biotec)，純化小鼠脾臟B細胞，如先前技術所述(Shapiro-Shelef,M.,Lin,K.I.,McHeyzer-Williams,L.J.,Liao,J.,McHeyzer-Williams,M.G.,and Calame,K.(2003)Immunity 19,607-620,Shaffer,A.L.,Shapiro-Shelef,M.,Iwakoshi,N.N.,Lee,A.H.,Qian,S.B.,Zhao,H.,Yu,X.,Yang,L.,Tan,B.K.,Rosenwald,A.,Hurt,E.M.,Petroulakis,E.,Sonenberg,N.,Yewdell,J.W.,Calame,K.,Glimcher,L.H.，以及Staudt,L.M.(2004)Immunity 21,81-93)。將純化的脾臟B細胞(純度大於95%)，培養在含有10%加熱去活化的胎牛血清(FBS)(GIBCO BRL)，青黴素/鏈黴素(100 U/mL)，2 mM L-麩醯胺酸以及50μM2-巰基乙醇的RPMI 1640培養基中(GIBCO BRL)，密度為2×10⁶細胞/mL。以LPS(2.5 μg/mL，自Sigma購得)或Reishi F3(20 μg/mL)在不同時間點刺激細胞。

人類週邊血液單核球細胞(PBMC)係根據製造商建議，以Histopaque-1077(Sigma)分離。人類週邊CD19⁺細胞進一步以CD19微珠(Miltenyi Biotec)純化。將經富集的人類B細胞(純度大於90%)培養在含有10%加熱去活化的胎牛血清(GIBCO BRL)，青黴素/鏈黴素(100 U/mL)，及2 mM L-麩醯胺酸的RPMI 1640培養基(GIBCO BRL)中。將密度2×10⁶細胞/mL的CD19⁺細胞以Reishi-F3(20 μg/mL)或IL-4(100 U/mL，購自PeproTech)加上CD40L(1 μg/mL，購自PeproTech)在指定時間處理。不同的抑制劑包括SB203580、 LY294002、SP600125、PD98059以及NF-κ B抑制劑購自Calbiochem。抗小鼠TLR4(純系HTA125)，抗人類/小鼠TLR2(純系T2.5)，抗人類TLR4/MD-2(純系MTS510)以及相同型對照抗體大鼠IgG2a，均購自eBioscience。相同型對照抗體，例如小鼠IgG1與小鼠IgG2a，購自Sigma。將3T3細胞培養在添加10% FBS與青黴素/鏈黴素(100 U/mL)的DMEM(GIBCO BRL)培養液中。

實例五：ELISA與Beadlyte人類細胞激素偵測

進行酵素連結免疫吸附試驗(ELISAs)時，將培養基以2,000 rpm離心一次，以獲得細胞上清液。接著將上清液以含有1%胎牛血清白蛋白的PBS連續稀釋至以抗小鼠IgM，抗人類IgM或抗人類IgG抗體(Bethyl laboratories,Inc.)包覆的96孔盤中，並靜置在37℃下一小時。後續用以偵測經捕捉之小鼠IgM，人類IgM或人類IgG的流程及方法基本上係依照製造商之建議(Bethyl laboratories,Inc.)，以TMB作為受質。接著將該等培養盤在450 nm以盤視讀器(Molecular Devices)讀取。

利用Luminex xMAP珠陣列進行Beadlyte細胞激素/趨化激素多重試驗(Upstate Cell Signaling Solutions)，偵測以Reishi F3處理的人類週邊B細胞所分泌的多種細胞激素。基本上使用製造商所註明的步驟，並以Luminex^® 100TM儀器偵測。

實例六：流式細胞分析技術

收集B細胞並以PBS清洗一次後，再以添加2%FBS的PBS重新懸浮之，使密度為10⁶細胞/mL。每種染色總共使用10⁵細胞。在一實驗中所使用的抗體為PE-結合之抗小鼠syndecan-1(BD PharMingen)，PE-結合之抗人類CD19(BD PharMingen)，PE-結合之抗人類CD86(eBioscience)。之後細胞以FACScalibur(Becton Dickinson)及CellQuest軟體分析。

實例七：Reishi萃取物F3對樹突狀細胞的功效：DC成熟及活化並釋放細胞激素

含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份，Reishi-F3，在特殊情況下對樹突狀細胞有特殊作用。樹突狀細胞(DCs)為抗原呈現細胞(APC)，藉由捕捉並將抗原轉移至適應性免疫系統之細胞，如T細胞及B細胞，引發初級免疫反應。DCs不只是引起初級免疫反應的關鍵，也對調節T細胞中介性免疫反應很重要。在某些情況下，從Reishi溶於水的萃取物中純化的多醣可誘發DCs成熟與活化並釋放許多細胞激素。這些細胞激素可參與Reishi的生物作用(例如抗發炎，抗癌等)。Reishi萃取物F3基本上如以上所述製備。

樹突狀細胞來自於人類週邊血液單核球細胞，如圖1所示，該圖為製備及引發樹突狀細胞的示意圖。單核球細胞可藉由對抗Ficoll-Paque plus(Amersham Bioscience)密度梯度離心而由白血球衣製備。CD14⁺單核球細胞利用抗-CD14微珠與磁性激活細胞分選系統(MACS)(Miltenyi Biotec)純化。純化後的CD14⁺細胞(純度大於90%)培養在添加10%胎牛血清，1000 U/mL GM-CSF與50 ng/mL IL-4的RPMI 1640培養基中。誘發六天後，加入Reishi F3區份再處理24小時。

細胞表面標誌的免疫表型以FACS分析，結果如圖2所示。圖2顯示在CD14⁺單核球細胞及衍化之樹突狀細胞上染色之一些樹突狀細胞代表性CD標誌的曲線圖。圖2(A)係顯示在誘發第0天製備的CD14⁺單核球細胞(純度大於90%)(黑線代表相同型對照組；灰線代表CD14⁺ MNC)。圖2(B)顯示在預培養誘發六天後，以Reishi多醣萃取物處理細胞時之結果(黑線代表相同型對照組；灰線代表無處理之對照組；中灰與淺灰線代表以Reishi萃取物處理的兩次重複實驗)。

無處理的CD14⁺單核球表現CD14與CD86，但沒有發現其他樹突狀細胞的標誌。在誘發六天後，細胞失去CD14⁺標誌並開始表現包括CD1a，CD40的樹突狀細胞標誌。經過24小時Reishi F3多醣處理後，與無處理之對照組比較，DCs增加CD80，CD83及CD86的表現。另一方面，如果在第一天加入F3，樹突狀細胞的增生會被抑制。

隨著進行Reishi粗萃取物或其衍生物F3之處理，細胞形態大幅改變，如圖3中顯微鏡照片所示。圖3係利用傳統明視野光學顯微鏡，顯示樹突狀細胞以Reishi多醣萃取物處理後的形態改變。在對照組中細胞鬆散地與表面接觸，如圖3(A)，但在實驗組中以較延長之形態緊密附著在培養孔中，如圖3(B)。

為顯示受Reishi-F3影響後之細胞激素分泌概況，收集實驗組與對照組兩者的DC培養基，並在以下實例八中評估。

實例八：Reishi萃取物對產生細胞激素的功效

如上述實例七中所述，決定經Reishi萃取物處理與無處理之樹突狀細胞的細胞激素分泌概況。樹突狀細胞培養基中的細胞激素與趨化激素濃度利用Beadlyte^®人類22-重多重細胞激素偵測系統(Upstate)測量。發現IL-1 α、IL-1 β、IL-3、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IFN-K、TNF-α、嗜酸性細胞趨化素、IP-10、MCP-1、MIP-1 α、或RANTES的濃度在以Reishi萃取物誘發後都明顯增加，如表1所示。表1顯示樹突狀細胞在以含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份處理後，透過商品化可得的Beadlyte細胞激素套組分析所取得之細胞激素分泌概況表。結果顯示22種測試的細胞激素中有16種可被Reishi萃取物明顯誘發。各種細胞激素量的改變，以處理組相對於對照組之測量值增加倍數表示。

使用人類CD19⁺細胞的類似實驗顯示，含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份可明顯增加這些細胞中之IL-6，IL-8及MIP-1 α產生。

實例九：Reishi F3對B淋巴球的功效：Reishi F3誘發小鼠初級脾臟B細胞的漿球性分化

Reishi已在先前顯示可刺激小鼠B淋巴球增生(Shao,B.M.,Dai,H.,Xu,W.,Lin,Z.B.,and Gao,X.M.(2004)Biochem Biophys Res Commun 323,133-141；Zhang,J.,Tang,Q.,Zimmerman-Kordmann,M.,Reutter,W., and Fan,H.(2002)Life Sci 71,623-638)，但尚未正式澄清Reishi是否具有促進漿細胞形成的活性。

在此等實驗中，其使用許多先前發表的步驟(Hsu,H.Y.,Hua,K.F.,Lin,C.C.,Lin,C.H.,Hsu,J.,and Wong,C.H.(2004)J Immunol 173,5989-5999 Wang,Y.Y.,Khoo,K.H.,Chen,S.T.,Lin,C.C.,Wong,C.H.,and Lin,C.H.(2002)Bioorg Med Chem 10,1057-1062 Chen,H.S.,Tsai,Y.F.,Lin,S.,Lin,C.C.,Khoo,K.H.,Lin,C.H.,and Wong,C.H.(2004)Bioorg Med Chem 12,5595-5601)。

使用含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份，Reishi-F3，研究B淋巴球活化的模式。首先測試Reishi F3是否能具有在純化的小鼠B細胞培養中引發抗體分泌的效果。如先前所述(Zhang,J.,Tang,Q.,Zimmerman-Kordmann,M.,Reutter,W.,and Fan,H.(2002)Life Sci 71,623-638)，發現Reishi-F3處理可導致B細胞活化，如活化標誌CD86在細胞表面的表現增加(未顯示數據)，以及在處理三天後，小鼠脾臟B細胞的增生增加(約3.5倍)所示。

Reishi-F3可在小鼠初級脾臟B細胞培養中引起漿球性分化。將已純化的小鼠脾臟B細胞與脂質多醣(t)(2.5 μg/mL)或Reishi F3(20 μg/mL)共同培養。在第三天與第四天取得細胞上清液進行ELISA分析，以決定IgM存在量。很明顯地，如圖4A所示，與無Reishi-F3處理的細胞相比，脾臟B220⁺ B細胞在以Reishi-F3處理三天後，由ELISA開始偵測到劇烈的IgM引發。在第四天可觀察到IgM引發再次增加(圖4A)。先前已發現，以多株裂原脂質多醣(LPS)處理在體外培養的初級小鼠脾臟B細胞會引起大量的增生，接著分化為分泌免疫球蛋白的漿細胞(Sieckmann,D.G.,Asofsky,R.,Mosier,D.E.,Zitron,I.M.,and Paul,W.E.(1978)J.Exp.Med. 147,814-829；Chen-Bettecken,U.,Wecker,E.,and Schimpl,A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 82,7384-7388)。Reishi-F3可在小鼠脾臟B細胞中引發與LPS相當之的IgM分泌(圖4A)。

在以Reishi-F3刺激三天的脾臟B細胞培養中，利用FACS流式細胞分析技術可觀察到漿細胞表面標誌syndecan-1(CD138)之強烈引發。特定言之，如圖4B所示，在以LPS或Reishi F3處理之後第三天，收集初級脾臟B細胞，並對其進行流式細胞分析，以檢視其表面CD138的表現。Reishi-F3(20 μg/mL)可引發漿細胞表面標誌(CD138)的表現提升。在Reishi-F3製備過程中，如先前文獻所述，小心地排除LPS污染的可能性(Hsu,H.Y.,Hua,K.F.,Lin,C.C.,Lin,C.H.,Hsu,J.,and Wong,C.H.(2004)J.Immunol., 173,5989-5999)。在靈芝(Reishi)的起始製備流程中，使用疊氮化鈉以避免細菌生長。NMR分析也顯示LPS與Reishi-F3之間組成的明顯區別(W-B Yang未發表之數據)。這些結果暗示，Reishi F3可能具有促進漿球性分化的功能。

實例十：F3對B淋巴球的功效：Reishi對初級人類週邊B細胞活化的功效。

在從健康捐贈者分離的人類週邊B細胞中，也評估Reishi-F3對其活化及/或分化的功效。以Reishi處理來自週邊血液的已純化人類CD19⁺細胞，並利用流式細胞分析技術，分析不同時間點後B細胞活化標誌CD86的表現。使用經抗-IgM，CD40配體(CD40L)以及IL-4處理的細胞，作為B細胞活化的正向對照組。

結果顯示於圖5中。與無處理的細胞比較，以Reishi-F3處理只導致細胞數在第六天輕微增加(大約10%增加)，而合併CD40L與IL-4處理則導致 細胞數增加50%左右(未顯示數據)。雖然在正向對照組經CD40L加IL-4刺激的B細胞中(圖5A)，發現B細胞活化標誌CD86被明顯引發，在Reishi-F3處理之早期(16小時)或晚期(六天)時間點，週邊B細胞的CD86表現卻沒有顯示明顯的效果(圖5A)。分析另一個活化標誌CD69也發現類似的結果(數據未顯示)。因此，與Reishi F3活化小鼠脾臟B細胞的效果不同，Reishi-F3不能活化人類週邊B淋巴球。

Reishi-F3對刺激週邊B淋巴球產生不同細胞激素或趨化激素的效果以Beadlyte細胞激素/趨化激素多重試驗luminex技術監測。以經Reishi F3，CD40L加IL-4處理或無處理六天的人類CD19⁺ B細胞培養上清液，測試細胞激素及趨化激素表現的陣列。沒有發現Reishi F3對於細胞激素或趨化激素組，如IL-1α、IL-1β、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IP-10、MCP-1、RANTES、以及TNFα之引發(數據未顯示)。

然而，發現Reishi-F3處理可強烈引發IL-6,IL-8以及MIP-1α(圖5B)。IL-8的引發似乎只限於Reishi-F3處理。因此，Reishi-F3不能引起B細胞活化標誌CD86的表現，但似乎可有效引發某些細胞激素或趨化激素分泌；特別是IL-8與MIP-1α。

雖然Reishi-F3沒有活化人類週邊CD19⁺ B細胞(圖5A)，其卻導致人類CD19⁺ B細胞中IgM與IgG之顯著引發(圖6)。圖6顯示ELISA分析中，Reishi F3導致人類CD19⁺ B細胞中明顯的IgM與IgG引發。因此，與其在小鼠脾臟細胞中同時活化B細胞與分化漿細胞的功效不同，Reishi-F3在人類週邊B細胞只能引發Ig分泌。綜合來說，這些結果建議，在分離的人類週邊B細胞中，Reishi具有引發Ig，細胞激素與趨化激素分泌的功能。

按照以上技術，可能有許多修改與變化。前述為本發明較佳實施例之描寫，且其僅作為說明及敘述之用。其並不為徹底性之敘述並因此將本發明限定在所揭露之特定形式。

本發明敘述中所引述的各個及每個著作與參考文獻的揭露，包括任何形成其中一部分的伴隨文獻，都於此在本發明中以其全文併入作為參考。各個著作及參考文獻的引述並不係承認該著作與參考文獻之揭露在任何國家形成先前技術的一部分。

當參照下列之敘述結合所附的圖式時，將更能了解前述之本發明內容特徵及目的。

圖1為流程圖，顯示樹突狀細胞之製備及誘發。

圖2為曲線圖，顯示在CD14⁺單核球細胞及衍化之樹突狀細胞上所染色的一些樹突狀細胞代表性CD標誌。2(A)顯示在誘發第0天所製備之CD14⁺單核球細胞(純度大於90%)(黑線為相同型(isotype)對照組；灰線為CD14⁺ MNC)。2(B)顯示在六天預先誘發培養後，以含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份(Reishi-F3)處理細胞時之結果。(黑線為相同型(isotype)對照組；深灰線為無處理之對照組；中灰線及淺灰線為以含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份處理之兩次重複實驗)。

圖3利用傳統明視野光學顯微鏡，顯示樹突狀細胞以含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份處理後的形態改變。在對照組中細胞鬆散地與表面接觸(A)，但以較延長之形態緊密附著在培養孔中(B)。

圖4顯示含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份(Reishi-F3)在小鼠初級脾臟B細胞培養中引發漿球性分化。(A)使純化的小鼠脾臟B細胞與LPS(2.5 μ g/mL)或含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份(Reishi-F3)(20 μ g/mL)共同培養。在第三天及第四天收集細胞懸浮液供ELISA分析，以決定IgM的數量。Reishi-F3與LPS相似，可引發小鼠脾臟B細胞分泌IgM。(B)在經LPS或Reishi-F3處理後第三天，收集初級脾臟B細胞，並以流式細胞分析檢視表面CD138的表現量。Reishi-F3(20 μ g/mL)引發漿細胞表面標誌(CD138)的表現提升。

圖5顯示Reishi-F3處理使人類週邊B細胞培養中之不同細胞激素或趨化激素的表現增加。(A)與細胞激素處理不同，Reishi-F3處理不能活化人類週邊B細胞。以細胞激素(C：CD40L(1 μ g/mL)加IL-4(100U/mL))，Reishi-F3(F3：20 μ g/mL)處理或不處理(-)分離的人類週邊CD19⁺細胞。在處理16小時或六天後收集細胞，以FACS分析CD86在表面的表現。顯示各培養中陽性細胞之百分比。該等結果為三次培養中的一次。(B)Reishi-F3引發IL-6、IL-8、以及MIP-1 α的產生。純化的人類週邊B細胞以(A)所述處理，並在第六天收集細胞上清液，以偵測一組細胞激素或趨化激素。該等結果為三次獨立培養中的一次；並顯示標準差。

圖6以ELISA顯示Reishi-F3導致人類CD19⁺B細胞中IgM與IgG之明顯誘發。

Claims (4)

1. 一種增加人類CD19⁺B細胞生產細胞激素或趨化激素之醫藥組合物，其包括含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份，其中該細胞激素或趨化激素為IL-6、IL-8或MIP-1 α，且其中含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份係由包含下列步驟之方法製備：(1)將一靈芝(Ganoderma lucidum)植物組織均質化；(2)使用一鹼性水溶液萃取上述經均質化的植物組織以形成一粗萃取物；以及(3)將該粗萃取物以膠體過濾層析處理，並以pH為7的緩衝液沖提出含有岩藻糖之靈芝醣蛋白區份，該區份係含有具有以α1,2-岩藻糖苷鍵結的末端岩藻糖基團之多醣或醣肽。
2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該CD19⁺B細胞來自富含CD19⁺之B細胞族群。
3. 如請求項2之醫藥組合物，其可接觸CD19⁺B細胞以增加生產細胞激素或趨化激素，而該CD19⁺B細胞可被轉移至被認定需要之受試者。
4. 如請求項3之醫藥組合物，其中該受試者也被認定需要CD19⁺B細胞增加產生免疫球蛋白。