JP2010504339A - ヒト組織前駆細胞の接着および分化の、レイシ媒介増強 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、2006年9月21日に出願された米国仮出願第60/846,676号の利益を主張するものであり、その仮出願の開示は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
材料。レイシ粗抽出物(アルカリ抽出(0.1N NaOH)、中和およびエタノール沈澱により調製)を、Pharmanex Co.(CA、USA)から得た。すべての化学薬品および試薬は、記載しない限り、Sigma Co.(81.Louis、MO、USA)から得た。
単核細胞(MNC)を単離するために、各臍帯血(CB)またはヒト末梢血(PB)単位を、リン酸緩衝食塩水(PBS)/2mM EDTAで1:1に希釈し、フィコール−ハイパック溶液に注意深く添加した。2000rpmにて40分間、室温での密度勾配遠心分離の後に、MNCを界面から回収し、PBS/EDTAで2〜3回洗浄した。
2×107PBMNCを、25cm2組織培養フラスコ(Cloning)に、4ml RPMI(Invitrogen)培地中に播種し、37℃にて5%二酸化炭素を含む湿潤雰囲気中で1時間インキュベートした後に、非接着細胞を回収し、接着細胞を、ヒトサイトカインIL−4およびGM−CSF(R&D)を補充した無血清AIM−V培地中で、F3とともに/なしで培養した。7日間の培養期間の間に、PBMNCは樹状細胞の形態に変化した。
CD34+細胞を、磁気細胞分離法(MACS)CD34単離キットを用いて濃縮した。通常、2〜5×105のCD34+細胞が、1×108のMNCから、FACS分析により確認して90〜95%の純度で得られた。マウス間質株化細胞(MS−5)を、CD34+細胞の同時培養のために間質層として用いた。MS−5を、10%FBSおよびPSN抗生物質を補充した低グルコースDMEM中で1週間を超えて培養した。1×104細胞/mLの密度の精製CD34+細胞密度を、2mmol/Lのl−グルタミン、PSN抗生物質、10U/mlの組換えヒトトロンボポエチン(rhTPO;R&D)、50ng/mLの幹細胞因子(SCF;R&D)、50ng/mLのflt3−リガンド(FL;R&D systems、Minneapolis、MN、USA)および10ng/mLのインターロイキン−6(Il−6;R&D systems、Minneapolis、MN、USA)を補充した4mLの無血清EX−VIVO 10培地に再懸濁した。精製CD34+細胞は、MS−5フィーダーとともに、25Tフラスコ中で同時培養される。8日目に、懸濁細胞を、プレートを穏やかに振とうした後に回収した。残りの弱く付着した造血細胞は、各ウェルに3mLのDMEMを加えることにより完全に回収した。細胞および生細胞の総数は、血球計数器を用いて、光学顕微鏡の下でトリパンブルー非染色細胞数を計数することにより概算した。
AD−MSCは、未処理のヒト脂肪吸引物から得て、本明細書に参照により明確に組み込まれるChienら、Bioorganic & Medicinal Chemistry、12巻、5603〜5609頁(2004年)に記載されるようにして培養した。簡単に、未処理の脂肪吸引物を、滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS)で十分に洗浄して、混入破砕物および赤血球細胞を除去した。洗浄した吸引物を、PBS中の0.075%コラゲナーゼ(I型;Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)で、37℃にて30分間、穏やかに混合しながら処理した。コラゲナーゼは、等容量のDMEM/10%胎児ウシ血清(FBS)を用いて不活性化し、下澄物を低速で10分間遠心分離した。細胞の沈殿物をDMEM/10%FBSに再懸濁し、100μmメッシュフィルタを通して濾過して、破砕物を除去した。濾過物を上記で詳述したように遠心分離し、維持培地中に、通常の組織培養プレートに播種した。AD−MSCは、10%FBS(Hyclone)を補充したDMEM−LG(GIBCO)で維持した。AD−MSCは、10%FBS(Hyclone)を補充したDMEM−LG(GIBCO)で維持した。MSCのin vitro分化は、軟骨新生培地で処理した:1%FBS、6.25μg/mlインスリン、10ng/ml TGF−β1(R&D)および50nMアスコルベート−2−ホスフェートを補充したDMEM−LG。軟骨新生分化のために、10μlあたり1〜2×105のより高い細胞密度を、軟骨球体形成のために用いた。培養の間、軟骨細胞を3日目および7日目に計数した。
全細胞RNAを、RNeasy全RNA単離キット(Qiagen)を用いて単離し、cDNAを、SuperScript First−strand Synthesis System(Invitrogen)を用いて逆転写した。特定の遺伝子を、PCRにより、Fast−Run Taq Master Kit(Protech Technology、Taipei、Taiwan)を用いて増幅した。
成人末梢血由来樹状細胞および臍帯血増殖HSCを、特定の表面抗原についてFACSにより特徴決定した。採集した細胞を回収し、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリスリンにコンジュゲートした抗マーカーモノクローナル抗体を用いて、製造者の提案に従って、100μlリン酸緩衝剤中で、室温にて15分間の力価で染色した。細胞表面マーカーは、樹状細胞マーカー(CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86)および造血系マーカー(CD34、CD38、CD133、CXCR4)を含んでいた。細胞を、フローサイトメトリーシステム(FACSCalibur;Becton,Dickinson)を用いて分析した。陽性の細胞を計数し、非染色細胞のシグナルと比較した。
回収したPBMNCを、条件的培地中で7日の間に、樹状細胞に変換した。培養培地は、F3とともに/なしでヒトサイトカインIL−4およびGM−CSF(R&D)を補充したAIM−Vである。細胞により分泌されたサイトカインを、RayBio(商標)ヒトサイトカイン抗体アレイキット(RayBiotech、Norcross、Ga)により検出した。サイトカイン抗体アレイメンブレンを、室温にて30分間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、次いで、2mlの条件的培地をメンブレンとともに1.5時間インキュベートした。メンブレンを、洗浄緩衝剤I、IIを用いて洗浄し、次いで、ビオチンコンジュゲート抗体を、メンブレンに1時間加えた。洗浄の後に、HRPコンジュゲートストレプトアビジンをメンブレンに40分間加え、次いで、X線フィルムをACL試薬により感光させた。画像は、KODAK 1D 3.5ソフトウェアを用いて分析し、次いで、データを標準化してEXCELでグラフを描いた。
F3は、造血単核細胞(MNC)における細胞接着分子(CAM)発現に影響する:
細胞接着分子(CAM)および接着単核細胞の共刺激因子は、真核免疫系細胞および抗癌転移の活性化に重要であることが知られている。この研究において、F3は、サイトカイン(GM−CSF(G)、IL−4(4))の存在にかかわらず、AIM−V(M−V)基本培養培地の下で、培養ディッシュ中のCB−MNC接着を著しく増大させ、細胞形態変化を誘導した(図1、2A〜2E)。
免疫応答を開始する単核細胞である樹状細胞、ならびにIL−4と一緒にした顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)およびマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)は、MNCからDCへの分化転換を相互に制御することが知られている。CB−MNCからDCへの変換に対するF3の影響を調べる際に、本発明者らは、F3が、IスーパーファミリーCAM(N−CAMおよびV−CAM)発現(図3A)を特異的に亢進するが、I−CAMもPE−CAMも亢進しないことを見出した。F3により刺激された接着CB−MNCは、C. M. Chienら(参照により本明細書に明確に組み込まれる)により以前に記載されたように、RPMI基本培地中でより多くのCD83+成熟樹状細胞(DC)を作製する(図3D〜E)だけでなく、AIM−V培地培養条件下の細胞樹状突起の成長が亢進された、より活性な未熟接着DC(CD1a+、CD40+、CD80+およびCD86+)サブセットを生成し得る結果をもたらす(図3B〜3C)。CB−およびPB−MNCは、F3刺激に対して、成熟DC細胞への変換について異なる応答をする。
Sovalat Hら、J. Hematother Stem Cell Res.12巻、473〜489頁(2003年)(参照により明確に本明細書に組み込まれる)は、可動性血液中でのHSCのBM間質細胞への接着の減少は、定常状態の血液、骨髄および臍帯血からのものと比較して、CD34+細胞およびCD34+CD38−プロテオームサブセットの接着分子の下方制御によることを示した。
N−CAMは、神経突起伸長、軸索誘導および遊走にかかわるCNS発達において重要であり、細胞内シグナルカスケードを誘導するシグナル受容体を活性化することが示されている。Fang, J. H. B. Int J. Dev. Bio.43巻:335〜342頁(1999年)(参照により明確に本明細書に組み込まれる)。N−CAM発現も、軟骨新生の初期に骨格濃縮に参加し、軟骨新生を開始する(前軟骨濃縮の形成を媒介する)ことも示されている(Widelitzら、J. Cell. Physiol.156巻:399〜411頁(1993年)(参照により明確に本明細書に組み込まれる)。
Claims (18)
- 細胞表面マーカーの単核細胞発現が少なくとも1%増加するために十分量の精製レイシ抽出物を対象に投与すること
を含む、方法。 - 前記細胞表面マーカーが、VCAMおよび/またはNCAMである、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞表面マーカーが、未熟樹状細胞マーカーからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記未熟樹状細胞マーカーが、CD1a、CD14、CD40、CD80およびCD86からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞表面マーカーが、成熟樹状細胞マーカーからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記成熟樹状細胞マーカーが、CD83からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞表面マーカーが、造血細胞マーカーからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記造血細胞マーカーが、CD34、CD38、CD133およびCXCR4からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞表面マーカーが、B細胞マーカーからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記B細胞マーカーが、CD19からなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記精製レイシが、IL−4およびGM−CSFからなる群より選択される少なくとも1つのサイトカインとともに、対象に同時投与される、請求項3のいずれかに記載の方法。
- 細胞表面マーカーのMSCおよび/またはPLAの発現が少なくとも1%増加するやめに十分量の精製レイシを対象に投与すること
を含む、方法。 - 前記細胞表面マーカーが、BMP−2、アグリカンおよびIL−1からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記精製レイシが、インスリン、TGF−B1および/またはアスコルベート−2−ホスフェートからなる群より選択される少なくとも1つの化合物とともに、対象に同時投与される、請求項12に記載の方法。
- CD34+/CD38−細胞プロテオームの発現を失う、対象のMSCおよび/またはPSA細胞の割合が少なくとも1%減少するために十分量の精製レイシを対象に投与すること
を含む、方法。 - ある量の骨格形成剤と、
ある量のレイシ抽出物と
を含み、移植することができるデバイス。 - ある量の単核細胞をさらに含む、請求項16に記載のデバイス。
- ある量のMSCおよび/またはPLA細胞をさらに含む、請求項16に記載のデバイス。
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