KR20220152142A - 수지상 세포의 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피브로넥틴의 인테그린 결합 도메인 유래 PHSRN, RGD 및 LDV 펩타이드 및 이들 아미노산을 포함하는 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 비장으로부터 분리한 림프조직 유래 초대 수지상 세포의 자가활성화 억제 조성물에 관한 것으로, 림프 조직으로부터 분리한 초대 수지상 세포의 배양 시 피브로넥틴 단백질의 첨가로서 자가활성은 억제하지만 면역활성화 물질에 의하여는 활성이 일어나지 않는 단점을 가지나 펩타이드를 첨가하여 배양한 초대 수지상 세포는 면역자극제에 의하여 활성화가 정상적으로 유도될 수 있는 배양 방법을 제시하는 자가활성화 억제용 펩타이드 조합의 효능에 관한 것이다. 상기 펩타이드 조합으로 배양하면서 활성화된 초대 림프 조직 수지상 세포는 T 세포의 증식을 증강시키며 T 세포와의 공배양 시 인터페론 등의 사이토카인 생성을 유도하는 것을 특징으로 한다. 상기 화합물은 수지상 세포 배양, 수지상 세포 활성화 유도, 및 수지상 세포와의 공배양에 의한 T 세포 증식을 통하여 암, 자가면역 질환, 및 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 림프 조직으로부터 분리된 미성숙 초대 수지상 세포의 배양 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 피브로넥틴(fibronectin) 유래 펩타이드의 조합, 이들 펩타이드들로 구성된 링커 펩타이드에 의하여 활성화를 일으키지 않는 상태를 유지하면서 배양할 수 있는 배양 방법에 관한 것이다.
수지상 세포(Dendritic cells, DCs)는 선천면역 반응과 적응면역 반응 사이의 연관성을 제공하는 항원 제시 세포이다. 수지상 세포는 몸 전체에 널리 분포되어 있으며 비장, 림프절, 점막, 장, 표피 조직에서 여러 아형으로 구분되어 있다. 비장에서 수지상 세포의 아형은 대식세포나 단핵구 유형과는 잘 구분되어 특성화되어 있다.
비활성형의 수지상 세포는 낮은 수준으로 주조직 적합성 복합체 클래스 II (major histocompatibility class-II, MHC-II) 표면 분자와 공동 자극 분자를 표현하며, 염증 유도 사이토카인을 거의 생성하지 않는다. 수지상 세포는 스캐빈저 수용체, 톨게이트 유사 수용체, 만노스 수용체, 등과 같은 패턴 인식 수용체에 의해 병원체를 직접 감지할 수 있으며 탐식 메커니즘을 통해 병원균이나 손상 세포로부터 파생된 유해 신호와 그 주변에서의 항원을 탐식한다. 이들 수용체에 의하여 활성화된 수지상 세포는 항원 흡수능의 감소, MHC-II의 발현 증가, CD80, CD86 및 CD40과 같은 공동 자극 분자 및 화학 수용체인 CCR7의 발현이 증가된 세포형으로 전환되며, 다양한 종류의 사이토카인을 분비하고 림프절로의 이동이 증가하는 것이 특징이다. 이러한 활성화된 수지상 세포는 특정 항원에 대한 T세포 반응을 강력하게 유도한다.
항원을 탐식하고 처리하는 과정은 비활성 수지상 세포에 의하여 이루어진다. 이러한 안정된 수지상 세포의 면역학적 기능을 측정하고 세포치료제로서 이용하는데 있어서의 가장 큰 문제점은 조직 유래 초대 수지상 세포(primary DC)의 분리와 배양에 있다. 세포 배양을 위하여 분리된 초대 수지상 세포는 배양 상태에서 12 시간 이내 비활성형에서 활성형으로 자연 활성화(spontaneous activation)가 일어난다. 자연 활성화된 수지상 세포는 생존 기간이 매우 짧아서 장기간 배양이 불가능하다. 자연 활성화는 배양 조건에서 수지상 세포의 수를 줄이거나 반고체의 겔 등에서 배양할 경우 다소 감소하는 것으로 관찰되어 수지상 세포간의 결합이나 접촉에 의하여 일어난다고 제안되었으나, 구체적으로 어떠한 인자가 관여하는지 또는 비활성형으로 유지하며 배양할 수 있는 기술은 아직 보고된 바 없다.
비장 및 림프절의 3차원적 구조와 세포외 기질은 세포의 상호작용을 조절하고 조직 내 세포간의 응집에도 중요한 역할을 한다. 극소량의 콜라겐만이 림프절의 근위부(paracortical region) 내에 존재하고 비장과 같은 림프 조직에는 주요 세포외 기질로는 피브로넥틴이 발현되어 있으며 라미닌(laminin) 발현은 극히 적다. 사이토카인을 사용하여 단핵구로부터 분화시킨 수지상 세포는 피브로넥틴이나 라미닌으로 코팅한 플레이트에서 배양할 경우 수지상 세포의 형태가 변하고 비활성형으로 유지된다고 보고된 바 있다.
이러한 다양한 기술적인 한계점에 따라, 림프 조직에서 분리한 초대 수지상 세포를 배양하기 보다는 유전체 전환에 의한 형질전환형 수지상 세포주나 전구세포로부터 분화된 수지상 세포를 이용하는 기술 등을 적용하고 있다. 현재까지 가장 일반적인 방법으로서 배양용으로 사용하고 있는 수지상 세포는 골수세포 또는 단핵구에서 분화시킨 수지상 세포로 GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating factor) 및 종양괴사인자 (Tumor necrosis factor, TNF-α)와 같은 염증 인자가 존재하는 상태에서 이들 전구 세포로부터 분화된 세포이다. 따라서 이들 전구세포로부터 분화된 수지상 세포는 골수세포 또는 단핵구의 세포 배양에 의해 유도될 수는 있으나, 체내에서는 염증 상태에서 혈액으로부터 단세포가 조직으로 빠져나가 생체 내에서 나타나는 염증성 수지상 세포에 속한다. 그러나 이 경우 림프절에 존재하는 초대 수지상 세포가 아닌 단핵구로부터 분화되는 과정에서 활성화된 수지상 세포는 배양 상태에서는 자극받지 않은 수지상 세포와는 다르게 비교적 안정적인 기능을 유지할 수 있다. 또한, 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 기반으로 한 세포 배양용 구조물을 이용하여 비장에서 분리한 수지상 세포를 비활성형 상태로 유지하면서 안정적으로 배양할 수 있는 배양방법 및 비활성 수지상 세포의 분석 방법이 보고된 바 있다.
본 발명에서는 면역 조직으로부터 분리한 초대 수지상 세포의 생존을 유지하면서 기능적으로 비활성형의 상태로 존재하여 항원을 탐식하고 면역이나 염증 자극을 받는 경우에는 활성형으로 변할 수 있는 기술을 제공함으로써 생체 내에서 일어날 수 있는 수지상 세포의 면역학적 반응을 배양 상태에서 구현할 수 있다. 이렇게 분리한 초대 수지상 세포는 T 세포의 증식을 유발하거나, T 세포와 공배양하여 사이토카인 분비를 유발하여 암, 바이러스 감염, 자가면역 질환, 장기이식, 알러지, 및 류마티스 관절염 등에서 이들 질환에 대한 면역세포 치료제로서의 개발 가능성이 높다.
본 발명은 림프 조직에서 분리한 초대 수지상 세포를 비활성형으로 유지할 수 있는 특정 펩타이드를 포함하는 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배양방법으로 배양된 수지상 세포와 면역세포를 공배양하는 단계를 포함하는 면역세포의 활성화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 비활성화 상태로 24시간 이상 유지되는 분리된 수지상 세포를 포함하는 수지상 세포 조성물 및 이를 유효 성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 수지상 세포들 사이의 인테그린 결합 부위에 결합하는 피브로넥틴 유래 펩타이드를 포함하는 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열를 포함하고, 길이가 3 내지 11aa인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열 둘 이상이 링커로 연결된 것인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
6. 위 5에 있어서, 상기 링커는 아미노산 G 및 S로 이루어지고, 길이가 2 내지 8aa인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
7. 위 5에 있어서, 상기 링커는 서열번호 8 내지 11 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 것인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
8. 위 5에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
9. 위 1에 있어서, 상기 펩타이드는 처리 대상인 수지상 세포 2 × 105/mL에 대해 200 μg/mL 이상의 농도로 포함되는 수지상 세포의 자가활성화 억제용 조성물.
10. 위 1에 있어서, 상기 수지상 세포는 단핵구, 비장 또는 림프절 유래인 수지상 세포의 활성화 억제용 조성물.
11. 위 1에 있어서, 시험관 내에서(in vitro) 사용되기 위한 수지상 세포의 활성화 억제용 조성물.
12. 분리된 수지상 세포에 위 1 내지 11 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 수지상 세포의 배양 방법.
13. 위 12에 있어서, 상기 조성물이 처리된 수지상 세포에 면역자극제를 처리하여 수지상 세포의 활성화를 유도하는 단계를 더 포함하는, 수지상 세포의 배양 방법.
14. 위 13에 있어서, 상기 면역자극제는 박테리아 제제, CD40 리간드, TNF-α, IL-1β, LPS 및 poly (I:C)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 수지상 세포의 배양 방법.
15. 분리된 수지상 세포에 위 1 내지 11 중 어느 한 항의 조성물을 처리하여 비활성화 상태로 상기 수지상 세포를 배양하는 단계;
상기 수지상 세포를 활성화시키는 단계; 및
상기 활성화된 수지상 세포와 면역세포를 공배양하는 단계를 포함하는 면역세포의 활성화 방법.
16. 위 1 내지 11 중 어느 한 항의 수지상 세포들 사이의 인테그린 결합 부위에 결합하는 피브로넥틴 유래 펩타이드 및 이와 혼합된 수지상 세포를 포함하는 수지상 세포 조성물.
17. 위 16의 세포 조성물을 유효성분으로 포함하는 암, 감염성질환, 만성염증 질환, 또는 자가면역질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
본 발명은 피브로넥틴 단백질 서열 중 세포부착 도메인의 서열을 함유하는 펩타이드 조합을 유효 성분으로 포함하는 수지상 세포 비활성 유지 세포 배양 조성물에 관한 것으로, 비장 및 림프절 등의 림프 조직 유래 수지상 세포의 배양제로서 효능에 관한 것이다. 상기 펩타이드 조합물은 수지상 세포의 비활성을 유지하거나 면역자극제에 의하여 세포의 활성화가 일어나고 T 세포의 증식 및 활성화를 유도함으로써 암, 자가면역 질환 및 염증성 질환의 면역학적 진단 또는 면역세포 치료제를 위한 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가하지 않은 상태에서 배양한 비장 수지상 세포(spleen DC, sDC)의 분포를 공초점 현미경으로 관찰한 결과와 세포 군집 정도(cell clustering)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 펩타이드 혼합물 및 자극제를 첨가하지 않은 상태에서 배양한 비장 수지상 세포에 대한 유세포 분석 결과로서, 수지상 세포의 표면에 시간-의존적으로 MHC-II, CD86, CD80 및 CD40의 발현이 증가됨을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가하지 않은 상태에서 피브로넥틴 또는 라미닌을 첨가하고 배양한 비장 수지상 세포의 분포를 공초점 현미경으로 확한 결과이다.
도 4는 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가하지 않은 상태에서 피브로넥틴 또는 라미닌을 농도별로 첨가하고 6시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포의 표면에서 CD86과 MHC-II이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가하지 않은 상태에서 피브로넥틴 또는 라미닌을 200 μg/mL 농도별로 첨가하고 6시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포의 세포 표면에서 CD86, MHC-II, CD80 및 CD40이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 6은 본 발명에서 사용한 펩타이드의 아미노산 서열 및 펩타이드 종류를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 비장 수지상 세포를 6시간 동안 배양한 후 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 8은 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 6시간 또는 24시간 동안 배양한 후의 비장 수지상 세포의 분포를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 9는 P3를 포함하는 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 비장 수지상 세포를 6시간 동안 배양한 후 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 10은 다양한 조합의 3가지 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 6시간 또는 24 시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포에서 MHC-II, CD86, CD80, 및 CD40이 발현되는 정도를 피브로넥틴을 첨가한 배양 상태와 비교하여 측정한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도11은 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 수지상 세포를 배양하고, CD86 발현을 항체로 형광염색한 후 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 12는 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 배양한 수지상 세포의 배양액에 분비된 TNF-α의 양을 시간별로 측정한 효소면역분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 결과이다.
도 13은 3가지 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 24 시간 동안 배양한 후 분비된 TNF-α의 양을 측정한 ELISA 결과이다.
도 14은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 LPS(lipopolysaccharide)를 첨가/비첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포에서 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 15는 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 PCL(polycaprolactone) 나노섬유 멤브레인에서 면역자극제인 LPS를 첨가/비첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포에서 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 16은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 LPS를 첨가/비첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포에서 분비된 TNF-α 및 IL-12p40 양을 측정한 ELISA 결과이다.
도 17은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 LPS를 첨가/비첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 골수 유래 수지상 세포(bone marrow-derived DC, BMDCs)에서 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 18은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 농도별로 첨가한 배양 플레이트에서 LPS를 첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 골수 유래 수지상 세포에서 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 19는 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 농도별로 첨가한 배양 플레이트에서 LPS를 첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 골수 유래 수지상 세포에서 분비된 TNF-α 및 IL-12p40 양을 측정한 ELISA 결과이다.
도 20은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 poly (I:C)를 첨가하고 24 시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포에서 CD86이 발현되는 정도를 LPS와 비교 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 21은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 LPS 또는 poly (I:C)를 첨가하고 24 시간 동안 배양한 비장 수지상 세포와 이종형 마우스로부터 분리한 후 CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester)로 형광염색한 T세포와의 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)에 의한 T 세포 증식에 대한 유세포 분석 결과이다.
도 22는 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 LPS 또는 poly (I:C)를 첨가하고 24 시간 동안 배양한 비장 수지상 세포와 이종형 마우스로부터 분리한 T세포와의 4일간 공배양 후 분비되는 사이토카인 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 23은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 6 시간 동안 배양한 초대 비장 수지상 세포의 생존율을 7-AAD(7-aminoactinomycin D) 염색을 통한 유세포 분석으로 측정한 결과이다.
도 24는 본 발명의 링커 펩타이드를 첨가하고 배양한 비장 초대 수지상 세포 에서CD86의 발현 정도를 유세포 분석기로 측정한 결과이다.
도 25는 본 발명의 scrambled 링커 펩타이드를 첨가하고 배양한 비장 초대 수지상 세포에서 CD86 발현 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다
도 26은 비장 수지상 세포에 링커 펩타이드를 첨가하고 24 시간 동안 배양한 후 CD86의 발현을 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 27은 링커 펩타이드 혹은 LPS를 첨가하고 비장 초대 수지상 세포를 24 시간 동안 배양한 후 분비되는 종양 괴사 인자(Tumor necrosis factor, TNF-α)의 농도를 측정한 ELISA결과이다.
도 28은 링커 펩타이드로 배양한 후 자가활성화가 일어나지 않는 비장 수지상 세포 혹은 이들 세포를 LPS로 활성화시킨 수지상 세포를 CFSE로 형광염색한 OT-1 T 세포와 4일간 공배양한 후 T세포 증식을 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 29는 링커 펩타이드로 배양한 비장 수지상 세포와 OT-1 T 세포와의 4일간 공배양 후 배양액으로 분비된 인터페론-감마(IFN-γ)와 TNF-α의 농도를 측정한 ELISA결과이다.
도 2는 본 발명의 펩타이드 혼합물 및 자극제를 첨가하지 않은 상태에서 배양한 비장 수지상 세포에 대한 유세포 분석 결과로서, 수지상 세포의 표면에 시간-의존적으로 MHC-II, CD86, CD80 및 CD40의 발현이 증가됨을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가하지 않은 상태에서 피브로넥틴 또는 라미닌을 첨가하고 배양한 비장 수지상 세포의 분포를 공초점 현미경으로 확한 결과이다.
도 4는 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가하지 않은 상태에서 피브로넥틴 또는 라미닌을 농도별로 첨가하고 6시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포의 표면에서 CD86과 MHC-II이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가하지 않은 상태에서 피브로넥틴 또는 라미닌을 200 μg/mL 농도별로 첨가하고 6시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포의 세포 표면에서 CD86, MHC-II, CD80 및 CD40이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 6은 본 발명에서 사용한 펩타이드의 아미노산 서열 및 펩타이드 종류를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 비장 수지상 세포를 6시간 동안 배양한 후 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 8은 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 6시간 또는 24시간 동안 배양한 후의 비장 수지상 세포의 분포를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 9는 P3를 포함하는 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 비장 수지상 세포를 6시간 동안 배양한 후 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 10은 다양한 조합의 3가지 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 6시간 또는 24 시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포에서 MHC-II, CD86, CD80, 및 CD40이 발현되는 정도를 피브로넥틴을 첨가한 배양 상태와 비교하여 측정한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도11은 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 수지상 세포를 배양하고, CD86 발현을 항체로 형광염색한 후 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 12는 본 발명의 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 배양한 수지상 세포의 배양액에 분비된 TNF-α의 양을 시간별로 측정한 효소면역분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 결과이다.
도 13은 3가지 펩타이드 혼합물을 첨가한 상태에서 24 시간 동안 배양한 후 분비된 TNF-α의 양을 측정한 ELISA 결과이다.
도 14은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 LPS(lipopolysaccharide)를 첨가/비첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포에서 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 15는 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 PCL(polycaprolactone) 나노섬유 멤브레인에서 면역자극제인 LPS를 첨가/비첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포에서 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 16은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 LPS를 첨가/비첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포에서 분비된 TNF-α 및 IL-12p40 양을 측정한 ELISA 결과이다.
도 17은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 LPS를 첨가/비첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 골수 유래 수지상 세포(bone marrow-derived DC, BMDCs)에서 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 18은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 농도별로 첨가한 배양 플레이트에서 LPS를 첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 골수 유래 수지상 세포에서 CD86이 발현되는 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 19는 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 농도별로 첨가한 배양 플레이트에서 LPS를 첨가 상태로 24 시간 동안 배양한 후 골수 유래 수지상 세포에서 분비된 TNF-α 및 IL-12p40 양을 측정한 ELISA 결과이다.
도 20은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 poly (I:C)를 첨가하고 24 시간 동안 배양한 후 비장 수지상 세포에서 CD86이 발현되는 정도를 LPS와 비교 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 21은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 LPS 또는 poly (I:C)를 첨가하고 24 시간 동안 배양한 비장 수지상 세포와 이종형 마우스로부터 분리한 후 CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester)로 형광염색한 T세포와의 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)에 의한 T 세포 증식에 대한 유세포 분석 결과이다.
도 22는 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 면역자극제인 LPS 또는 poly (I:C)를 첨가하고 24 시간 동안 배양한 비장 수지상 세포와 이종형 마우스로부터 분리한 T세포와의 4일간 공배양 후 분비되는 사이토카인 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 23은 3가지 펩타이드 혼합물 또는 피브로넥틴을 첨가한 배양 플레이트에서 6 시간 동안 배양한 초대 비장 수지상 세포의 생존율을 7-AAD(7-aminoactinomycin D) 염색을 통한 유세포 분석으로 측정한 결과이다.
도 24는 본 발명의 링커 펩타이드를 첨가하고 배양한 비장 초대 수지상 세포 에서CD86의 발현 정도를 유세포 분석기로 측정한 결과이다.
도 25는 본 발명의 scrambled 링커 펩타이드를 첨가하고 배양한 비장 초대 수지상 세포에서 CD86 발현 정도를 측정한 유세포 분석 결과이다
도 26은 비장 수지상 세포에 링커 펩타이드를 첨가하고 24 시간 동안 배양한 후 CD86의 발현을 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 27은 링커 펩타이드 혹은 LPS를 첨가하고 비장 초대 수지상 세포를 24 시간 동안 배양한 후 분비되는 종양 괴사 인자(Tumor necrosis factor, TNF-α)의 농도를 측정한 ELISA결과이다.
도 28은 링커 펩타이드로 배양한 후 자가활성화가 일어나지 않는 비장 수지상 세포 혹은 이들 세포를 LPS로 활성화시킨 수지상 세포를 CFSE로 형광염색한 OT-1 T 세포와 4일간 공배양한 후 T세포 증식을 측정한 유세포 분석 결과이다.
도 29는 링커 펩타이드로 배양한 비장 수지상 세포와 OT-1 T 세포와의 4일간 공배양 후 배양액으로 분비된 인터페론-감마(IFN-γ)와 TNF-α의 농도를 측정한 ELISA결과이다.
본 발명은 수지상 세포들 사이의 인테그린 결합 부위에 결합하는 피브로넥틴 유래 펩타이드를 포함하는 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물을 제공한다.
수지상 세포(Dendritic cell)는 면역 세포로 병원균 물질을 처리하여 면역계의 다른 세포를 위해 표면에 항원을 표시하는 것으로 항원 전달세포로 기능하므로, 선천성 면역반응과 후천성 면역반응 사이의 매개체로 기능한다. 수지상 세포의 종류는 예를 들면, 단핵구 유래 수지상 세포, 비장 유래 수지상 세포 또는 림프조직 유래 수지상 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
수지상 세포들 사이의 인테그린 결합 부위는 세포-기질, 세포-세포간 결합 및 상호작용에 중요한 역할을 하는 부위일 수 있고, 상기 펩타이드가 그러한 인테그린 결합 부위에 결합하는 경우 세포-세포간 상호작용을 억제하여 세포간 신호전달, 자가 활성화 등이 억제될 수 있다.
상기 피브로넥틴 유래 펩타이드는, 세포외 기질 단백질 중의 하나인 피브로넥틴의 서열 일부로 이루어질 수 있고, 피브로넥틴의 서열 일부 외 다른 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
즉, 본 발명은 피브로넥틴에서 수지상 세포들 사이의 인테그린 결합 부위에 결합하는 부위의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물을 포함한다.
상기 피브로넥틴의 서열은 구체적으로 피브로넥틴을 구성하는 도메인 중 세포 부착 도메인의 서열을 포함할 수 있다.
상기 펩타이드는 RGD(서열번호 1), LDV(서열번호 2) 또는 PHSRN(서열번호 3)를 포함하는 서열로 이루어질 수 있고, 예를 들면 RGD(서열번호 1), LDV(서열번호 2), PHSRN(서열번호 3), KGRGDS(서열번호 4), GRGDS(서열번호 5), GGPEILDVPST(서열번호 6) 또는 EILDVPST(서열번호 7) 일 수 있다.
상기 펩타이드의 길이는 3 내지 11aa일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 펩타이드는 RGD, LDV 또는 PHSRN을 포함하는 아미노산 서열 둘 이상이 링커(linker)로 연결된 것일 수 있다.
상기 링커는 아미노산 G 및 S로 이루어지고, 길이가 2 내지 8aa(amino acid)일 수 있다. 예를 들면, 상기 링커는 GS(서열번호 8), GGGS(서열번호 9), GGGGS(서열번호 10) 또는 GGGSGGGS(서열번호 11)를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 것인 것일 수 있다.
예를 들면, 상기 펩타이드는 PHSRNGSRGDGSLDV(서열번호 12), PHSRNGGGSRGDGGGSLDV(서열번호 13) 또는 PHSRNGGGSGGGSRGDGGGSLDV(서열번호 14)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본원 실시예에서 '링커 펩타이드'는 전술한 것과 같이 복수개의 펩타이드가 링커로 연결된 펩타이드를 의미한다.
상기 조성물은 상기 펩타이드를 이종 이상 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 수지상 세포의 자가 활성화를 억제하기 위하여, 2 × 105/mL 의 수지상 세포에 대해 상기 펩타이드를 특정 농도 이상으로 포함하는 것일 수 있으며, 그 농도는 예를 들면 50 μg/mL 이상, 100 μg/mL 이상, 200 μg/mL 이상, 300 μg/mL 이상, 400 μg/mL 이상 또는 500 μg/mL 이상일 수 있고, 구체적으로는 50 내지 800 μg/mL, 50 내지 500 μg/mL, 100 내지 800 μg/mL, 100 내지 600 μg/mL, 100 내지 500 μg/mL, 100 내지 300 μg/mL, 100 내지 200 μg/mL, 150 내지 250 μg/mL, 200 내지 800 μg/mL, 200 내지 500 μg/mL 또는 300 내지 500 μg/mL일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 수지상 세포-매개 면역 반응을 조절할 수 있으며, 구체적으로는 수지상 세포의 자가 활성화 억제 또는 수지상 세포의 자가의 항원 제시능을 조절할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
수지상 세포의 자가 활성화는 분리된 수지상 세포가 배양 상태에서 12시간 이내 비활성형에서 활성형으로 전환되는 자연 활성화 현상을 의미하는 것으로, 이러한 현상은 수지상 세포 간의 결합이나 접촉에 의하여 발생되는 것으로 보고되어 있다. 상기 활성화된 수지상 세포는 생존 기간이 매우 짧아 장기간 배양이 불가능하다는 단점을 가지므로, 이를 억제하는 것은 항원을 탐식하고 처리할 수 있는 비활성 형태로 분리된 수지상 세포를 배양할 수 있게 한다.
본 발명의 활성화 억제용 조성물은 생체 내(in vivo) 또는 시험관 내에서(in vitro) 사용될 수 있으나, 바람직하게는 시험관 내에서(in vitro) 사용되기 위한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 수지상 세포의 배양방법을 제공한다.
자가 활성화 억제용 조성물은 전술한 바와 같으며, 상기 조성물의 처리 농도 및 처리 시간은 수지상 세포의 자가 활성화를 억제할 수 있다면, 특정 농도 및 시간에 제한되지 않는다. 처리 농도는 예를 들면 세포수 2 × 105/cm 당 50 내지 500 μg/mL, 100 내지 400 μg/mL 또는0 내지 300 μg/mL일 수 있고, 처리 시간은 예를 들면, 2 내지 48시간, 6 내지48시간, 4내지 24시간, 6내지 18시간, 4내지 12시간, 6 내지 8시간 또는 6 내지 24시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 수지상 세포 배양방법은 면역 자극제를 처리하여 수지상 세포의 활성화를 유도하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 면역 자극제는 수지상 세포에 항원을 노출시켜 표면에 항원을 표시하는 세포로 전환되는 것을 유발하는 물질을 말하며, 그 종류는 예를 들면 박테리아 제제, CD40 작용제 TNF-α, IL-1β, LPS 및 poly (I:C)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 수지상 세포의 배양은 폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유로 이루어진 구조체 상에서 3차원으로 배양이 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 면역 세포의 활성화 방법을 제공한다.
면역 세포의 활성화 방법은 분리된 수지상 세포에 상기 조성물을 처리하여 비활성화 상태로 상기 수지상 세포를 배양하는 단계; 상기 수지상 세포를 활성화시키는 단계; 및 상기 활성화된 수지상 세포와 면역 세포를 공배양하는 단계를 포함한다.
상기 면역 세포는 면역 시스템에서 면역 반응에 관여하는 세포로서, 세포 치료제로 이용되는 세포를 의미할 수 있으며, 그 종류는 예를 들면T 세포, B 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 자연 살해 T 세포(NKT 세포), 비만 세포 또는 골수 유래 식세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물을 처리하여 수지상 세포를 비활성화 상태로 배양하는 단계는 수지상 세포의 배양 방법에 전술한 바와 같다.
수지상 세포를 활성화시키는 단계는 비활성 형태의 수지상 세포에 성숙화 인자 또는 면역 자극제를 처리하여 수행될 수 있고, 상기 성숙화 인자 또는 면역 자극제는 수지상 세포의 표면에 MHC-II, CD86, CD80 또는 CD40의 발현이 증가되도록 유도시키는 물질이라면 그 종류에 제한되지 않으며, 예를 들면 박테리아 제제, CD40 작용제 TNF-α, IL-1β, LPS 또는 poly (I:C)일 수 있다.
활성화된 수지상 세포와 면역 세포를 공배양하는 단계는 면역 세포의 증식 및 사이토카인의 분비를 유도하기 위한 것으로, 예를 들면 활성화된 수지상세포 기준 공배양하는 면역 세포수의 비율은 1 내지 50, 4 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 30 또는 15 내지 25일 수 있고, 공배양 시간은 2 내지 144시간, 4 내지 120시간, 12 내지 96시간 또는 24 내지 96시간, 48 내지 96시간 또는 48시간 내지 72시간으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 상기 펩타이드 및 이와 혼합된 수지상 세포를 포함하는 수지상 세포 조성물을 제공한다.
상기 조성물의 수지상 세포는 비활성화 상태를 예를 들면 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상 또는 48시간 이상 유지되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 6 내지 24시간, 6 내지 48시간, 12 내지 48시간 또는 12시간 내지 24시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포 조성물은 전술한 수지상 세포의 활성화 억제용 조성물에 의해 비활성화 상태가 유지된 수지상 세포를 포함하는 것으로, 상기 수지상 세포는 구체적으로는 MHC-II, CD86, CD80 또는 CD40 인자의 발현 증가가 억제된 수지상 세포일 수 있다.
상기 수지상 세포는 자극을 받아 활성화되기 전까지는 생존을 유지하면서 기능적으로 항원을 탐식할 수 있으며, 활성화된 수지상 세포와는 달리 장기간 배양이 가능하여 체외에서 T 세포의 증식을 유발하거나, T 세포와 공배양하여 사이토카인 분비를 촉진하여 다양한 질환에 대한 면역세포 치료제 개발이 가능하다.
또한 본 발명은 상기 수지상 세포 조성물을 유효성분으로 포함하는 암, 세균 및 바이러스 감염성질환, 만성염증질환, 또는 자가면역질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암은 예를 들면, 폐암, 후두암, 위암, 대장/직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 신장암, 상피세포에서 유래하는 암종(carcinoma), 골암, 근육암, 지방암, 결합조직세포에서 유래하는 육종(sarcoma), 백혈병, 림프종, 다발성골수종의 조혈세포에서 유래하는 혈액암, 신경조직에 발생하는 종양, 갑상선암, 결장암, 고환암, 뇌종양, 두경부암, 방광암, 상피암, 선암, 식도암, 중피종, 피부암 또는 흑색종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 감염성 질환은 세균, 스피로헤타, 리케차, 바이러스, 진균 또는 기생충 등의 병원체에 감염되어 유발되는 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 만성염증 질환은 염증이 오랫동안 축적되어 생기는 질환으로, 세포 노화와 변형을 일으키고 면역 반응을 지나치게 활성화시켜 면역 시스템을 교란하는 것으로 알려져 있으며, 그에 따라 비만, 당뇨병과 같은 대사질환 또는 자가면역 질환까지 유발한다고 보고되어 있다.
상기 자가면역 질환은 인체 내부의 면역계가 외부 항원이 아닌 내부의 정상세포를 공격하여 발생하는 질환으로, 예를 들면 류마티스 관절염, 아토피, 루프스, 크론병, 1형 당뇨병, 궤양성 대장염 또는 다발성 경화증 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암, 감염성 질환 또는 면역질환 외에도 면역세포가 치료제로 이용될 수 있는 질환이라면 그 종류에 관계 없이 본 발명의 세포 조성물을 유효성분으로 하여 해당 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물로 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1. 비장 수지상 세포의 분리 및 배양
마우스 비장 수지상 세포는 암컷 C57BL/6 마우스의 비장에 EDTA-BSS (Balanced Salt Solution) 완충액과 콜라게네이즈(collagenase) 용액(100 유닛의 콜라겐아제 타입 IV를 포함하는 DMEM, 로우 글루코즈를 포함하는 배지)을 넣고 수술용 가위로 잘게 자른 다음 6 ml의 콜라게네이즈 처리 용액을 섞고 30분간 배양한다. 분리한 전체 비장 조직을 70 μM 셀 스트레이너(Falcon)를 이용하여 거르고 1800 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 분리한다. 적혈구 용해 완충제(Sigma Aldrich)을 가하여 적혈구를 제거하고 10% 소혈청(fetal bovine serum, FBS)이 들어 있는 RPMI- 1640 배지로 2회 세척한다. 수지상 세포는 CD11c+ 항체가 결합된 마이크로비드로 반응시키고 CD11c Microbeads Ultrapure (MACS, Milteni Biotec사, 미국)를 사용하여 분리하였다.
도 1에서, 비장으로부터 분리한 초대 수지상 세포를 48웰 플레이트에 분주하고 37 ℃와 5% CO2를 유지하는 세포 챔버 하에서 24시간 동안 배양하고 세포가 단일 세포로 분포되거나 모여드는 clustering된 정도를 공초점 현미경(Olympus confocal microscope FV1000, Olympus Corporation; n=5)의 Differential interference contrast (DIC) 이미징으로 관찰하였을 때 배양 시간이 지남에 따라 세포의 응집이 더욱 증가하는 것으로 나타났으며 이러한 현상은 세포수가 2 × 105/cm 보다 1 × 106/cm의 밀도에서 더욱 현저하게 나타났다. 단일 세포와 세포간 뭉쳐져 보이는 cluster의 수는 ImageJ 소프트웨어(NIH, 6 Bethesda)를 사용하여 측정하였다. *는 0 h와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
실시예 2. 유세포 분석기를 이용한 수지상 세포의 활성화 측정
자극을 받지 않은 정상 상태에서 수지상 세포는 MHC-II 및 공동 자극 분자로서 CD80, CD86, 및 CD40과 같은 표현 인자는 발현이 매우 낮은 상태로서 비활성형의 표현형을 가지나 활성화된 수지상 세포는 이들 표지자의 발현이 현저히 증가한다.
도 2에서, 비장에서 분리한 초대 수지상 세포를 배양하였을 때 자가 활성화가 일어나는지 여부를 판단하기 위해 수지상 세포를 24웰 플레이트에 2105/ml로 분주하고 RPMI-1640 배지에서 37 ℃와 5% CO2 조건 하에서 6 시간 동안 배양한 후 유세포 분석기(MACSQuant VYB flow cytometer, Miltenyi Biotec)를 사용하여 수지상 세포의 표면에서 MHC-II, CD86, CD80, 및 CD40의 표현 수준을 분석하였다. 유세포 분석기를 사용하여 측정한 결과는 FlowJo v10 (Tree Star, Ashland)을 사용하여 분석하였다. CD86, CD80, 및 CD40의 발현 정도는 CD11c로 염색된 세포의 퍼센트로 표시하였고 MHC-II의 발현 정도는 형광의 평균형광강도인 mean fluorescence intensity (MFI)로 표시하였다. 결과적으로 수지상 세포 표면에 MHC-II, CD86, CD80, 및 CD40의 발현 정도는 시간 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 3. 피브로넥틴을 첨가한 배지에서 비장 수지상 세포의 배양
도 3에서, RPMI-1640 배지에 200 μg/mL 농도로 피브로넥틴 또는 라미닌을 첨가하고 비장에서 분리한 CD11c+ 초대 수지상 세포를 2 × 105/mL 로 분주하고 6 시간 배양한 후 세포의 분포를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 피브로넥틴을 첨가한 경우 세포의 응집이 현저히 감소하는 것으로 나타남으로써 피브로넥틴이 수지상 세포간의 응집을 저해하는 세포외 기질 인자일 가능성을 제시한다. *는 None과 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
도 4에서, 여러 농도의 피브로넥틴 또는 라미닌을 첨가하고 비장 수지상 세포를 6 시간 동안 배양한 후 CD86이나 MHC-II의 발현 정도를 유세포 분석기로 측정하였을 때 200 μg/mL 농도의 피브로넥틴에 의하여 자가 활성화가 일어나지 않았으며 200 μg/mL 농도 이상의 라미닌에 의하여서는 자가 활성화가 억제되지 않았다. 따라서 본 발명에서는 200 μg/mL 농도의 피브로넥틴이 비장 수지상 세포의 자가 활성화에 가장 효능이 좋은 것으로 나타났다. *는 0 μg/mL 농도와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
도 5에서, 200 μg/mL 농도의 피브로넥틴으로 CD11c+ 비장 수지상 세포를 6 시간 동안 배양하였을 경우 CD86이나 MHC-II의 발현뿐만 아니라 CD80 및 CD40의 발현도 증가되지 않는 것으로 나타났다.
실시예 4. 피브로넥틴 단백질의 아미노산 서열로부터 제작한 펩타이드를 첨가한 배지에서 비장 수지상 세포의 배양
도 6에서, 세포 부착을 매개하는 세포외 기질 단백질 중의 하나인 피브로넥틴 내의 아미노산 염기서열로서는 Arginine-Glycine-Aspartate (Arg-Gly-Asp, RGD) (이하, P1으로 명명, 서열번호 1) 등이 세포막의 인테그린 단백질에 결합하는 부위에 해당하며 그 외 Leu-Asp-Val (LDV, 서열번호 2) (이하, P2으로 명명) 및 Pro-His-Ser-Arg-Asn (PHSRN) (이하, P3으로 명명, 서열번호 3) 염기서열도 같은 역할을 하는 것으로 알려져 있어서 이들 염기서열로 구성된 펩타이드를 ㈜펩트론에 의뢰하여 제작하였다. 피브로넥틴 단백질 내 RGD 등의 모티브는 인테그린과 결합하여 세포-기질, 세포-세포간 결합에 작용한다. RGD 펩타이드 이외 유사 펩타이드로서 Lys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (KGRGDS) (이하, P1-1으로 명명, 서열번호 4), GRGDS (이하, P1-2으로 명명, 서열번호 5), Gly-Gly-Pro-Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr (GGPEILDVPST) (이하, P2-1으로 명명, 서열번호 6), Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr (EILDVPST) (이하, P2-2으로 명명, 서열번호 7)를 제작하여 사용하였다. 대조군으로서, 콜라겐 내의 인테그린 결합 모티브에 해당되는 아미노산 염기서열로서 Gly-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg (GFOGER) (이하, P4으로 명명, 서열번호18)와 라미닌 내의 인테그린 결합 모티브 중의 하나인 아미노산 염기서열로서 Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) (이하, P5으로 명명, 서열번호 19)와 Ile-Lys-Val-Ala-Val (이하, P6으로 명명, 서열번호 20)을 제작하여 사용하였다.
도 7에서, 비장 수지상 세포를 배양할 때 제작된 펩타이드를 각각 200 μg/mL 농도로 첨가하고 6 시간 후에 CD86의 발현 정도를 측정하였다. 각각의 펩타이드를 단독으로 처리하였을 때는 비장 수지상 세포에서 CD86의 발현이 억제되지 않았으나 P1, P1-2, 및 P2-1 펩타이드들을 같이 처리하였을 때 CD86의 발현은 현저히 감소하는 결과를 얻었다. 이들 3 종류의 펩타이드로 세포를 처리하였을 때와 비교하여 2 종류의 펩타이드를 함께 처리하여도 발현이 억제되지는 않았다. *는 P1, P1-2, 및 P2-1 조건과 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
도 8에서, 비장 수지상 세포 배양액 내에 제작된 P3 펩타이드를 200 μg/mL 농도로 하여 P1 (200 μg/mL), P2 (200 μg/mL)와 조합하여 첨가하고 6시간 또는 24시간 동안 배양 하였을 때 세포의 군집 형성은 현저히 억제되었다. 이와 비교하여 콜라겐이나 라미닌 단백질 유래 펩타이드인 P4, P5, 및 P6의 3가지 펩타이드를 동시에 첨가하여도 군집 형성은 저해되지 않는 것으로 나타났으며 라니민 유래 펩타이드인 P5 및 P6을 첨가하여도 억제 현상은 나타나지 않았다. *는 None과 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
도 9에서, 비장 수지상 세포 배양액에 P3 펩타이드와 함께 P1과 P2 및 이들 펩타이드의 아미노산을 함유하는 펩타이드를 3 종류의 조합으로 첨가하고 6시간 동안 배양한 후 CD86의 발현 정도를 유세포 분석기로 측정하였다. P3 (200 μg/mL)를 함유하면서 다른 2 종류의 펩타이드를 각각 200 μg/mL의 농도로 첨가하였을 때 CD86의 발현은 모든 측정에서 현저히 감소하였으며 특히 P1, P2, 및 P3 펩타이드의 첨가나 P1-2, P2-1, 및 P3 펩타이드를 첨가한 경우에는 가장 현저한 억제효과를 나타내었다. 이와 비교하여 P3를 600 μg/mL의 농도로 단독으로 처리하였을 경우에는 억제효과를 나타내지 못하였다. *는 None과 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
도 10에서, 비장 수지상 세포 배양액에 3 종류의 펩타이드를 첨가하고 6시간 또는 24 시간 동안 배양한 경우에 CD86 이외 MHC-II, CD80, 및 CD40의 발현이 억제되는 가를 유세포 분석기로 측정하였을 때 피브로넥틴과 함께 P1, P2 및 P3 펩타이드를 첨가한 경우나 P1-2, P2-1, 및 P3 펩타이드를 첨가한 경우 이들의 발현이 현저히 억제됨을 확인하였다. 이와 비교하여 P4, P5 및 P6 펩타이드를 각각 200 μg/mL의 농도로 첨가하였을 때는 억제 효과는 나타나지 않았으며 라미닌을 단독으로 처리하여도 아무런 영향이 나타나지 않았다. *는 None과 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
실시예 5. 펩타이드를 첨가하고 배양된 비장 수지상 세포에서 CD86의 발현에 대한 형광염색 측정
도 11에서, 비장 수지상 세포(2 × 105/mL)를 배양할 때 제작된 펩타이드를 각각 200 μg/mL 농도로 첨가하고 6 시간 후에 PE-결합 항 CD86 항체(eBioscience)를 사용하여 CD86의 발현 정도를 형광염색한 후 공초점 현미경으로 측정하였다. 초대 비장 수지상 세포를 일정 시간 배양한 후, 세포 내 CD86, 액틴(F-actin) 및 핵 염색을 실시하였다. 엑틴의 발현은 FITC-결합 phalloidin (eBioscience)으로 염색하였고 핵염색은 Hoescht 33342 (Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 이를 위하여 48웰 플레이트에서 배양한 세포를 4% 파라포름알데히드 고정액에 넣은 후, 실온에서 20분 동안 고정하였다.
그 다음 인산완충용액으로 2회 세척 후 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)용액으로 상온에서 5분 동안 침투시키고 인산완충용액으로 2회 세척하였다. 비특이적인 염색을 제거하기 위하여, 0.2% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich)용액으로 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 인산완충용액으로 2회 세척하였다. 그 후 CD86 항체 및 phalloidine을 0.2% 소혈청 알부민 용액에 1:40의 비율로 희석하여 40분 동안 반응시킨 다음, Tris 완충용액으로 3회 세척하여 슬라이드 유리에 올려놓고 세포의 핵 염색을 위한 Hoechst 33342 용액으로 대조 염색하여 덮개 유리를 덮어 봉입한 후 공초점 레이저 현미경(K1 나노스코프)을 이용하여 세포를 관찰하였다.
실시예 6. 배양된 비장 수지상 세포로부터 TNF-α 분비와 펩타이드의 영향
도 12에서, 비장 초대 수지상 세포를 1 × 106/mL로 분주하고 24 시간 동안 배양한 후 배양액에 이들 세포로부터 분비되는 TNF-α의 농도를 측정한 결과 시간 의존적으로 분비가 증가하는 것으로 나타났다. TNF-α의 농도는 ELISA 키트(R&D systems)을 사용하였으며 마이크로플레이트 분석기(Synergy H1, Biotek)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. 그러나 수지상 세포를 2 × 105/mL로 분주하였을 때 CD86의 발현은 증가되나 TNF-α의 분비는 증가하지 않는 것으로 나타났다 (결과 미제출). *는 3 h와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
도 13에서, 비장 초대 수지상 세포를 1 × 106/mL로 분주하고 24 시간 동안 배양하면서 P1, P2 및 P3의 펩타이드를 첨가하거나 P1-2, P2-1, 및 P3 펩타이드를 첨가하였을 때 TNF-α의 분비는 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 또한 피브로넥틴을 첨가하여 배양한 경우에도 배양액에서는 TNF-α는 거의 측정되지 않았으며 P4, P5, 및 P6 펩타이드를 각각 200 μg/mL의 농도로 첨가하였을 때는 TNF-α의 분비는 억제되지 않았다. 따라서 초대 수지상 세포의 활성화는 비록 TNF-α의 분비와는 직접적인 관계는 없는 것으로 보이나 활성화된 세포로부터 분비되는 TNF-α의 양은 피브로넥틴이나 펩타이드 조합에 의하여 효과적으로 억제되는 것으로 보인다. *는 3 h와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
실시예 7. 펩타이드 및 피브로넥틴를 첨가하면서 배양한 비장 수지상 세포의 활성화 유도
도 14에서, 24시간 동안 배양한 비장 초대 수지상 세포의 CD86의 발현 정도는 활성화 유도제인 대장균의 LPS를 1 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 증가하는 CD86의 발현 정도와 유사하게 측정되었으며 자가 활성화가 일어나는 배양 조건에 LPS를 추가하여 처리하여도 CD86의 발현은 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다. 피브로넥틴을 첨가하고 배양한 비장 수지상 세포의 CD86 발현은 1 μg/mL LPS를 처리하였을 경우에도 증가하지 않는 것으로 나타났으나 P1, P2 및 P3의 펩타이드를 첨가하거나 P1-2, P2-1, 및 P3 펩타이드를 첨가하고 배양한 자가 활성화가 억제된 수지상 세포는 LPS의 자극에 의하여 CD86의 발현이 현저히 증가하는 결과를 얻었다. *는 None과 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다. **는 -LPS와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
실시예 8. 나노섬유 멤브레인에서 배양한 비장 수지상 세포의 활성화 정도와 펩타이드 및 LPS의 영향
도 15에서, 폴리카프로락톤(poly-caprolactone, PCL)으로 제조한 나노섬유 멤브레인에서 24시간 동안 배양한 초대 비장 수지상 세포에서도 배양플레이트의 배양 조건에서와 같이 자연 활성화가 일어남으로써 CD86의 발현이 현저히 증가하는 것으로 나타났다. 나노섬유 구조체는 폴리카프로락톤(Sigma, MW 80,000)를 클로로포름 용매에 15% (w/v) 비율로 첨가하고 이 용액(5 ml)을 8 μl/min의 방사속도로 20 cm의 방사거리를 두고 25G 금속주사기를 사용하여 10 KV 상태에서 전기방사기 (Nano-NC)를 사용하여 전기방사법으로 제작하였다. 폴리카프로락톤 나노섬유에서 배양한 비장 수지상 세포의 CD86 발현에 대한 펩타이드 조합 및 LPS의 영향은 도 14에 나타낸 배양 플레이트에서 얻은 결과와 유사한 결과를 보였다. 따라서 나노섬유 멤브레인과 같이 3차원 배양 조건에서도 비장 수지상 세포가 자연 활성화 되는 정도는 2차원 배양과 유사한 양상을 보였다. *는 None과 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다. **는 -LPS와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
실시예 9. 펩타이드 및 피브로넥틴를 첨가하면서 배양한 비장 수지상 세포의 사이토카인 분비 능력
도 16에서, 펩타이드 조합을 첨가한 상태에서 24시간 동안 배양한 비장 초대 수지상 세포를 LPS로 자극하였을 때 염증성 사이토카인 및 Th1-유발 사이토카인이 정상적으로 분비되는가를 측정한 결과를 나타내었다. 펩타이드를 첨가하고 배양한 세포에서는 비활성형을 유지하여 TNF-α 및 IL-12p40의 분비가 거의 측정되지 않았으나 1 μg/mL LPS 처리에 의하여 배양액에는 높은 농도로 측정되었다. 이에 비교하여 피브로넥틴을 첨가하고 배양한 비장 수지상 세포는 LPS로 자극을 주었을 때 이들 사이토카인을 생성하지 못하는 것으로 나타났다. 따라서 피브로넥틴은 비장 수지상 세포의 비활성화는 유지할 수 있지만 자극제에 의한 활성화 작용은 억제하는 단점을 가진고 있다는 것을 알 수 있다. *는 -LPS와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
실시예 10. 골수 유래 수지상 세포의 자극제에 의한 활성화에 대한 펩타이드 및 피브로넥틴의 영향 조사
비장 수지상 세포에서와 비교하여 골수 유래 수지상 세포(bone marrow derived DC, BMDC)를 LPS로 자극하였을 때 펩타이드 조합 및 피브로넥틴의 첨가가 어떠한 영향을 주는가를 측정하였다.
마우스 골수 유래 수지상 세포는 마우스 골수 전구세포로부터 분화시켜서 얻었다. 암컷 C57BL/6 마우스의 대퇴골과 경골을 제거하고 골수는 2% FBS를 함유하는 EDTA:BSS (Balanced Salt Solution) 완충액 10 mL를 사용하여 분리하였다. 적혈구 용해 완충제(Sigma Aldrich)로 적혈구를 제거하고 EDTA: BSS 완충액으로 세척한 후 70 μM 셀 스트레이너(Falcon)를 사용하여 세포를 필터링하였다. 3 × 106/mL의 세포를 6웰 플레이트에 분주하고 인터루킨-4 (20 ng/mL) (JW Creagene)와 GM-CSF (20 ng/mL) (JW Creagene)를 첨가하여 7일간 배양하여 세포 분화를 유도하였다. 분화된 수지상 세포는 CD11c 항체(eBioscience)가 결합된 마이크로비드로 반응시키고 CD11c Microbeads Ultrapure (MACS, Milteni Biotec)를 사용하여 분리한 후 배양하였다.
도 17에서, 2 × 105/mL의 골수 유래 수지상 세포를 24 시간 동안 배양하면서 P1, P2 및 P3의 펩타이드를 각각 200 μg/mL의 농도로 첨가하거나 피브로넥틴을 200 μg/mL의 농도로 첨가하면서 LPS (1 μg/mL)로 세포를 자극시켰을 때 펩타이드가 들어간 경우는 LPS에 의하여 CD86의 발현 증가가 현저하게 나타났으나 피브로넥틴에 의하여는 CD86의 발현이 일어나지 않는 것으로 나타났다.
도 18에서, 골수 유래 수지상 세포를 24 시간 동안 배양하면서 피브로넥틴을 농도별로 투여하였을 때 50 μg/mL의 농도에서부터 LPS (1 μg/mL)에 의한 CD86 발현의 증가가 억제되는 것으로 나타났다. *는 0 μg/mL 농도와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
도 19에서, 골수 유래 수지상 세포를 24 시간 동안 배양하면서 피브로넥틴을 농도별로 투여하였을 때 100 μg/mL의 농도에서부터 LPS (1 μg/mL)에 의한 TNF-α 및 IL-12p40의 분비가 억제되는 것으로 나타났다. *는 0 μg/mL 농도와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
도 20에서, 수지상 세포를 포함하는 면역세포 및 염증세포의 Toll-like receptor-4에 결합하는 LPS에 비교하여 구조상 이중나선 RNA와 유사하며 Toll-like receptor-3에 결합하는 면역자극제로 알려진 poly (I:C) (polyinosinic:polycytidylic acid)를 50 μg/mL의 농도로 투여하였을 때 피브로넥틴을 첨가하여 배양한 경우 비장 수지상 세포의 CD86 발현의 증가가 억제되었으나 P1, P2 및 P3의 펩타이드를 각각 200 μg/mL의 농도로 첨가하였을 때는 영향을 받지 않는 결과를 보였다. *는 None과 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
실시예 11. 펩타이드로 배양한 비장 수지상 세포에 의한 T 세포 증식 및 공배양에 의한 사이토카인 분비 증가
활성화된 수지상 세포의 주요 역할은 자극 특성에 따라 항원별 T세포 활성화와 증식을 유도하는 것이므로 배양 후 자가 활성화된 비장 수지상 세포와 펩타이드를 첨가하면서 배양 후 LPS로 활성화시킨 수지상 세포가 혼합 림프구 반응 검사에서 T세포의 증식을 유도할 수 있는 가를 조사하였다. C57B/L6 마우스로부터 분리한 비장 수지상 세포는 24시간 동안 자가 활성화를 시키거나 펩타이드나 피브로넥틴을 첨가하여 배양한 경우는 LPS를 처리하여 세포활성화를 시켰다. Balb/c 마우스의 비장 T세포는 CD4+/CD8+ T세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, 독일)와 MACS 컬럼 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 분리한 후 10 μM CFSE (Molecular Probes; Thermo Fisher Scientific사, 미국)로 염색하였다. 활성화된 수지상 세포와 CFSE로 염색된 T세포를 1:20 비율로 4일 동안 공배양하고 T세포의 증식 정도는 CFSE가 감소되는 세포의 퍼센트로서 측정하였다.
도 21에서, 펩타이드나 피브로넥틴을 처리하지 않은 대조군의 비장 수지상 세포와 비교하였을 때 LPS나 poly (I:C)으로 활성화된 수지상 세포는 공배양한 비장 T세포의 증식을 다소 증가시켰으며 펩타이드로 처리한 후 활성화시킨 비장 수지상 세포도 효과적으로 T세포 증식을 증가시켰다. 그러나 피브로넥틴을 첨가하고 배양한 비장 수지상 세포는 LPS에 의한 활성화가 이루어지지 않아서 T 세포 증식을 유도하지 못하는 결과를 보였다. *는 untreated sDC와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다. 도 22에서, 비장 수지상 세포와 T세포와의 4일간 공배양 후 분비된 사이토카인의 양을 ELISA법으로 측정하였다. 대조군이나 펩타이드를 첨가하여 배양하면서 LPS 및 poly (I:C)로 활성화된 수지상 세포와 T세포의 공배양을 하였을 경우 높은 농도의 인터페론-감마(IFN-γ), TNF-α, IL-6, 및 IL-5를 분비하였지만 피브로넥틴을 첨가한 상태에서 활성화된 비장 수지상 세포와 T세포와의 공배양에서는 이들 사이토카인의 분비가 극히 적었다. *는 untreated sDC와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
실시예 12. 펩타이드로 배양한 비장 수지상 세포의 생존율 증가
수지상 세포는 자가 활성화가 일어나면서 배양 중 세포의 사멸이 급격히 일어나는 특징이 있다. 자가 활성화의 억제와 더불어 수지상 세포의 생존율이 변화하는가를 측정하였다. 세포의 생존율은 7-AAD로 염색한 세포를 배양하면서 이들 형광으로 염색이 되지 않는 세포의 수를 유세포 분석기로 측정하였다.
도 23에서 비장 수지상 세포는 6시간 배양에서 현저히 세포생존율이 감소하지만 P1, P2 및 P3의 펩타이드나 피브로넥틴을 첨가하고 배양한 경우 7-AAD 음성인 생존하는 세포의 수가 현저히 증가하는 것으로 나타났다. *는 untreated sDC와 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 나타내었다.
실시예 13. 배양된 초대 수지상 세포에서 CD86 발현에 대한 3가지 펩타이드로 구성된 링커 펩타이드(linker peptide)의 영향 측정
링커로는 아미노산 링커인 GS와 flexible linker인 GGGSGGGS를 3가지 종류의 펩타이드인 RGD (P1), LDV (P2), 및 PHSRN (P3)의 연결에 사용하여 PHSRNGSRGDGSLDV (LP1으로 명명, 서열번호 12), PHSRNGGGSRGDGGGSLDV (LP2으로 명명, 서열번호 13), PHSRNGGGSGGGSRGDGGGSLDV (LP3으로 명명, 서열번호 14)를 제작하였다. 링커 펩타이드는 Peptron사 (대전, 한국)에 제작을 의뢰하고 구입하였으며 SHIMADZU LCMS-2020으로 제조되었다. 대조군으로서 P1, P2, 및 P3 펩타이드를 구성하는 아미노산의 서열을 뒤섞은 scrambled 펩타이드인 S-P1(서열번호 15), S-P2(서열번호 16), 및 S-P3(서열번호 17)와 이들 scrambled 펩타이드로 구성된 링커 펩타이드 S-LP1(서열번호 21), S-LP2(서열번호 22), S-LP3(서열번호 23)를 제작하여 사용하였다. Scrambled 펩타이드나 scrambled 링커 펩타이드는 원래의 펩타이드와 동일한 아미노산 수, 분자량, 등전점 (isoelctric point) 및 친수성을 가진다. 이들 펩타이드의 서열은 표 1에 표시하였다.
도 24에서 여러 농도의 LP1, LP2 및 LP3을 800 μg/mL 농도 까지 첨가하고 비장 수지상 세포(2 × 105/mL)를 6시간 혹은 24 시간 동안 배양한 후 CD86발현 정도를 유세포 분석기(MACSQuant VYB flow cytometer, Miltenyi Biotec)로 측정하고 측정 결과는 FlowJo v10 (Tree Star, Ashland)을 사용하여 분석하였다. 배양 후 자가활성화에 의하여 증가되는 CD86 발현의 증가는 LP1, LP2 및 LP3에 의하여 농도-의존적으로 억제되었으며 LP3가 가장 큰 자가활성 억제 효과를 보였다. *는 none과 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 가진다.
도 25에서, 비장 초대 수지상 세포를 2 × 105/mL로 분주하고 24 시간 동안 배양하면서 scrambled 펩타이드인 S-LP1, S-LP2 및 S-LP3의 펩타이드를 각각 800 μg/mL 농도로 첨가하였을 때 CD86의 발현의 증가는 억제되지 않았다. 또한, scrambled 펩타이드인 S-P1, S-P2와 S-P3의 펩타이드를 각각 600 μg/mL 농도로 동시에 처리하였을 때에도 CD86의 발현은 감소되지 않았다.
실시예 14. 링커 펩타이드를 첨가하고 배양된 비장 수지상 세포에서 CD86 발현에 대한 형광염색 측정
도 26에서, 비장 수지상 세포(2 × 105/mL)를 48웰 플레이트에 분주하고 링커 펩타이드를 각각 400 μg/mL 농도로 첨가하고 24 시간 동안 배양하였다. 배양액에 LPS를 1 μg/mL을 첨가하여 비장 수지상 세포의 활성화를 유도하였다. 배양한 세포는 4% 파라포름알데히드 고정액에 넣은 후, 실온에서 20분 동안 고정하였다. PE-결합 항 CD86 항체(eBioscience)를 사용하여 형광염색한 후 공초점 현미경(K1 나노스코프, 서울)으로 측정하였다. 세포 내 액틴의 발현은 FITC-결합 phalloidin (eBioscience)으로 염색하였고 핵염색은 Hoescht 33342 (Sigma-Aldrich)로 염색하였다. CD86 항체 및 phalloidin을 0.2% 소혈청 알부민 용액에 1:40의 비율로 희석하여 사용하였다. 배양액에서 비장 수지상 세포만 배양하였을 경우 CD86 발현이 현저히 증가하였으나 피브로넥틴이나 3 가지 종류의 펩타이드를 첨가한 경우와 더불어 링커 펩타이드인 LP1, LP2 및 LP3를 첨가한 경우 CD86을 발현하는 세포는 거의 관찰되지 않았다. LPS 를 첨가한 경우 피브로넥틴이 들어 있는 경우에는 CD86을 발현하는 세포는 거의 측정되지 않았으나 3가지 펩타이드의 조합(P1+P2+P3)이나 링커 펩타이드를 첨가하여 배양한 상태에서는 LPS의 처리에 의하여 CD86을 발현하는 세포의 수가 현저히 증가하였다.
실시예 15. 배양된 비장 수지상 세포로부터 TNF-α 분비에 대한 링커 펩타이드의 영향
도 27에서, 비장 초대 수지상 세포를 2 × 105/mL로 분주하고 24 시간 동안 배양하였을 때 배양액으로 분비되는 TNF-α의 농도 측정에는 ELISA 키트(R&D systems)을 사용하였으며 농도는 마이크로플레이트 분석기(Synergy H1, Biotek)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. 수지상 세포만을 배양하였을 때 TNF-α의 농도는 75 ± 10 pg/mL로 측정되었으며 LPS 자극에 의하여 현저히 증가하였다. 피브로넥틴, 3 가지 종류의 펩타이드 조합(P1+P2+P3), 링커 펩타이드인 LP1, LP2 및 LP3를 첨가한 경우 TNF-α의 분비는 거의 일어나지 않는 것으로 나타났다. LPS를 처리한 경우에는 피브로넥틴과 비교하여 3가지 종류의 펩타이드 조합(P1+P2+P3)과 마찬가지로 링커 펩타이드들이 첨가되어도 TNF-α의 분비는 현저히 증가하였다. *는 none과 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성을 가진다.
실시예 16. 링커 펩타이드로 배양한 비장 수지상 세포에 의한 T 세포 활성화 측정
도 28에서, 배양 시 링커 펩타이드에 의하여 자가활성화가 일어나지 않는 비장 수지상 세포와 이들 세포를 LPS로 활성화시킨 수지상 세포가 T 세포의 증식을 유도할 수 있는 가를 조사하였다. 비장 수지상 세포(2 × 106)는 96웰 플레이트에서 24시간 동안 자가활성화를 시키거나 링커 펩타이드를 첨가하여 자가활성을 억제한 후 LPS로 처리하지 않거나 LPS로서 24 시간 자극을 하였다. 수지상 세포는 10 μM ovalbumin (OVA) 펩타이드 SIINFEKL (InvivoGen, San Diego, California, USA)로 1시간 동안 배양하였다. CD8+ T 세포는 OT-I transgenic 마우스로부터 CD8 T cell isolation kit (Miltenyi Biotec)로서 분리하였으며 10 μM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)로 10분간 형광염색하였다. CD8+ T 세포(1 × 105) 와 OVA 펩타이드를 처리한 DCs (5 × 103)를 1:20 비율로 4일 동안 공배양한 후 T 세포의 증식 정도는 CFSE 형광염색이 음성인 세포의 %로 측정하였다.
자가활성화가 일어난 수지상 세포는 LPS를 처리하지 않은 경우에는 T 세포의 증식을 유도하지 않았다. LPS로 자극시킨 경우 자가활성화된 세포나 피브로넥틴으로 배양한 수지상 세포는 T 세포의 증식을 유도하는 능력이 매우 약하였으나 3가지 펩타이드의 조합이나 링커 펩타이드로 배양한 수지상 세포는 T 세포의 증식을 현저하게 증가시켰다.
도 29에서, T 세포 증식 측정과 같은 조건으로 비장 수지상 세포와 T 세포를 4일간 공배양한 후 배양액으로 분비된 인터페론-감마(IFN-γ)와 TNF-α의 농도를 ELISA법으로 측정하였다. 자가활성화가 된 수지상 세포는 LPS로 자극한 후 T 세포와 공배양을 하였을 경우 2.5 배 정도의 인터페론-감마와 TNF-α를 분비하였지만 3가지 펩타이드 조합을 첨가하여 배양하거나 LP1, LP2, LP3 링커 펩타이드들로 배양한 수지상 세포는 LPS로 자극한 후 T 세포와 공배양을 하였을 때 이들 사이토카인의 분비는 4.5 배 이상의 증가를 보였다. *는 none과 비교하여 P <0.05 이하로서 통계적 유의성이 있다.
<110> NANOFAENTECH CO., Ltd.
AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
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<223> Laminin derived peptide P4
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<220>
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1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Val Asp Leu
20
Claims (17)
- 수지상 세포들 사이의 인테그린 결합 부위에 결합하는 피브로넥틴 유래 펩타이드를 포함하는 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열를 포함하고, 길이가 3 내지 11aa인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열 둘 이상이 링커로 연결된 것인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 링커는 아미노산 G 및 S로 이루어지고, 길이가 2 내지 8aa인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 링커는 서열번호 8 내지 11 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 것인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 수지상 세포의 자가 활성화 억제용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 처리 대상인 수지상 세포 2 × 105/mL에 대해 200 μg/mL 이상의 농도로 포함되는 수지상 세포의 자가활성화 억제용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 수지상 세포는 단핵구, 비장 또는 림프절 유래인 수지상 세포의 활성화 억제용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 시험관 내에서(in vitro) 사용되기 위한 수지상 세포의 활성화 억제용 조성물.
- 분리된 수지상 세포에 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 수지상 세포의 배양 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 조성물이 처리된 수지상 세포에 면역자극제를 처리하여 수지상 세포의 활성화를 유도하는 단계를 더 포함하는, 수지상 세포의 배양 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 면역자극제는 박테리아 제제, CD40 리간드, TNF-α, IL-1β, LPS 및 poly (I:C)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 수지상 세포의 배양 방법.
- 분리된 수지상 세포에 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 조성물을 처리하여 비활성화 상태로 상기 수지상 세포를 배양하는 단계;
상기 수지상 세포를 활성화시키는 단계; 및
상기 활성화된 수지상 세포와 면역세포를 공배양하는 단계를 포함하는 면역세포의 활성화 방법.
- 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 수지상 세포들 사이의 인테그린 결합 부위에 결합하는 피브로넥틴 유래 펩타이드 및 이와 혼합된 수지상 세포를 포함하는 수지상 세포 조성물.
- 청구항 16의 세포 조성물을 유효성분으로 포함하는 암, 감염성질환, 만성염증 질환, 또는 자가면역질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN116426476A (zh) * | 2023-06-08 | 2023-07-14 | 广州正源生物技术有限公司 | 一种脐血dc细胞的培养方法 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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2022
- 2022-04-28 KR KR1020220052836A patent/KR20220152142A/ko unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN116426476A (zh) * | 2023-06-08 | 2023-07-14 | 广州正源生物技术有限公司 | 一种脐血dc细胞的培养方法 |
| CN116426476B (zh) * | 2023-06-08 | 2023-08-29 | 广州正源生物技术有限公司 | 一种脐血dc细胞的培养方法 |
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