CN117203330A - 树突状细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于抑制从脾脏分离的淋巴组织来源的原代树突状细胞的自激活的组合物，所述组合物包含作为活性成分的纤连蛋白的整合素结合结构域衍生的PHSRN、RGD和LDV肽以及含有这些氨基酸的肽，并且涉及肽组合用于抑制自激活的功效，提出了一种培养方法，其中在培养从淋巴细胞分离的原代树突状细胞时，通过添加纤连蛋白而抑制了原代树突状细胞的自激活，但存在的缺点在于原代树突状细胞的激活不是由免疫刺激性物质导致的，而通过添加所述肽来培养的原代树突状细胞的激活可由免疫刺激剂正常诱导。用所述肽组合培养的同时激活的原代淋巴组织树突状细胞在与T细胞共培养的情况下，增强了T细胞的增殖并且诱导了例如干扰素等细胞因子的产生。所述化合物通过树突状细胞培养、诱导树突状细胞激活和借由与树突状细胞共培养的T细胞增殖可有效地用作用于预防或治疗癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病的组合物。

Description

树突状细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及从淋巴组织分离的未成熟原代树突状细胞的培养方法，更具体地，涉及由于纤连蛋白衍生肽的组合和由这些肽构成的接头肽，能够在维持不导致激活的状态的同时培养树突状细胞的培养方法。
背景技术
树突状细胞(DC)是在先天性免疫应答和适应性免疫应答之间提供联系的抗原呈递细胞。树突状细胞广泛分布于全身，并且在脾脏、淋巴结、粘膜、肠和表皮组织中分为多种亚型。在脾脏中，树突状细胞亚型与巨噬细胞和单核细胞类型良好地区分开并且被表征。
未激活的树突状细胞以低水平表达II类主要组织相容性(majorhistocompatibility class-II,MHC-II)表面分子和共刺激分子，并且几乎不产生炎症诱导细胞因子。树突状细胞可通过例如清道夫受体、toll样受体、甘露糖受体等模式识别受体直接检测病原体，并通过吞噬机制对源自病原体或受损细胞的有害信号及其周围的抗原进行吞噬。由这些受体激活的树突状细胞转换为具有降低的抗原摄取能力、增加的MHC-II表达、增加的例如CD80、CD86和CD40等共刺激分子和例如CCR7等化学受体的表达的细胞类型，并且表征为分泌不同类型的细胞因子和增加的向淋巴结的迁移。这些激活的树突状细胞强力诱导对特定抗原的T细胞应答。
抗原吞噬和加工是由未激活的树突状细胞进行的。测量这些稳定的树突状细胞的免疫功能并将其用作细胞治疗剂的最大问题在于组织来源的原代树突状细胞((primaryDC))的分离和培养。用于细胞培养的从淋巴组织分离的DC在培养状态下、在12小时内经历从未激活形式至激活形式的自发激活(spontaneous activation)。由于自然激活的树突状细胞具有非常短的生存期，无法长期培养。当在培养条件下减少树突状细胞的数量或在半固体凝胶等上进行培养时，观察到自激活略微降低，因此提出这样的自激活是通过树突状细胞的组合或其间的接触而发生的。然而，目前尚没有报道与激活相关的特定因子、或者能够使树突状细胞在维持其未激活形式的同时培养的技术。
脾脏和淋巴结的三维结构和细胞外基质调节细胞之间的相互作用，并且在组织中的细胞聚集中发挥重要作用。仅非常少量的胶原蛋白存在于淋巴结的副皮质区，纤连蛋白在例如脾脏等淋巴组织中表达为主要细胞外基质，而层粘连蛋白表达极低。已报道在包被有纤连蛋白或层粘连蛋白的平板上培养使用细胞因子从单核细胞分化的树突状细胞时，所述树突状细胞改变其形状并维持未成熟形式。
由于如上所述的这些各种技术限制，应用了使用通过基因组转换而转换的树突状细胞系或从前体细胞分化的树突状细胞的技术，而不是培养从淋巴细胞分离的原代树突状细胞。目前，作为最常用的方法，用于培养的树突状细胞是从骨髓细胞或单核细胞分化的树突状细胞，它们是在存在例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等炎症因子的情况下从前体细胞分化的细胞。因此，从这些前体细胞分化的树突状细胞可受到骨髓细胞或单核细胞的细胞培养的诱导，但属于炎症性树突状细胞，其中单核细胞在炎症状态下、在体内从血液逃逸至组织，并在体内出现。然而，在这种情况下，与未刺激的树突状细胞不同，在从单核细胞的分化过程中激活的树突状细胞、而不是存在于淋巴结中的原代树突状细胞可以在培养状态中维持相对稳定的功能。此外，已报道使用基于纳米-微米杂化纤维的细胞培养结构、可以以未激活状态稳定培养从脾脏分离的树突状细胞的培养方法，以及未激活树突状细胞的分析方法。
在本发明中，提供了与树突状细胞相关的技术，其中所述细胞以功能上未激活状态存在来吞噬抗原，同时维持从免疫组织分离的原代树突状细胞的存活，并且当进行免疫或炎症刺激时，被改性为激活形式，从而可以在培养状态中实现可能在体内发生的树突状细胞的免疫应答。分离的原代树突状细胞诱导T细胞增殖，或与T细胞共培养以诱导细胞因子分泌。因此，这些树突状细胞具有用于例如癌症、病毒感染、自身免疫性疾病、器官移植、过敏和类风湿性关节炎等疾病的免疫细胞治疗剂的开发的高度可能性。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种树突状细胞的自激活抑制用组合物，所述组合物包含能够将从淋巴细胞分离的原代树突状细胞维持在未激活形式的特定肽。
此外，本发明的另一目的在于提供一种用于激活免疫细胞的方法，所述方法包括将通过上述培养方法培养的树突状细胞与免疫细胞共培养。
此外，本发明的另一目的在于提供一种包含维持在未激活状态24小时以上的分离的树突状细胞的树突状细胞组合物，以及包含上述组合物作为活性成分的用于治疗或预防癌症的药物组合物。
用于解决问题的方案
1.一种树突状细胞的自激活抑制用组合物，所述组合物包含与树突状细胞之间的整合素结合位点结合的纤连蛋白衍生肽。
2.根据上述1所述的组合物，其中所述肽是由包括SEQ ID NOs:1至3中任一者的氨基酸序列组成的肽。
3.根据上述1所述的组合物，其中所述肽具有SEQ ID NOs:1至3中的任一氨基酸序列，并且长度为3至11aa。
4.根据上述1所述的组合物，其中所述肽是选自由SEQ ID NOs:1至7中的任一氨基酸序列组成的组中的至少一个。
5.根据上述1所述的组合物，其中所述肽是其中包括SEQ ID NOs:1至3中任一者的两个以上的氨基酸序列通过接头连接的肽。
6.根据上述5所述的组合物，其中所述接头由氨基酸G和S组成，并且长度为2至8aa。
7.根据上述5所述的组合物，其中所述接头由包括SEQ ID NOs:8至11中任一者的氨基酸序列组成。
8.根据上述5所述的组合物，其中所述肽具有SEQ ID NOs:12至14中的任一氨基酸序列。
9.根据上述1所述的组合物，其中基于2×105/mL的要处理的树突状细胞，以200μg/mL以上的浓度包含所述肽。
10.根据上述1所述的组合物，其中所述树突状细胞源自单核细胞、脾脏或淋巴结。
11.根据上述1所述的组合物，其中所述组合物用于体外用途。
12.一种树突状细胞的培养方法，所述方法包括用根据上述1至11任一项所述的组合物处理分离的树突状细胞。
13.根据上述12所述的方法，所述方法还包括通过用免疫刺激剂对已用所述组合物处理的树突状细胞进行处理来诱导树突状细胞的激活。
14.根据上述13所述的方法，其中所述免疫刺激剂是选自由细菌剂、CD40配体、TNF-α、IL-1β、LPS和poly(I:C)组成的组中的至少一种。
15.一种用于激活免疫细胞的方法，所述方法包括：用根据上述1至11任一项所述的组合物处理分离的树突状细胞并在未激活状态下培养所述树突状细胞；
激活所述树突状细胞；和
将激活的树突状细胞与免疫细胞共培养。
16.一种树突状细胞组合物，所述组合物包含：根据上述1至11任一项中所述的、与树突状细胞之间的整合素结合位点结合的纤连蛋白衍生肽；和与其混合的树突状细胞。
17.一种用于治疗或预防癌症、传染病、慢性炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含根据上述16所述的细胞组合物作为活性成分。
发明的效果
本发明涉及一种用于维持树突状细胞未激活的细胞培养组合物，所述组合物包含作为活性成分的含有纤连蛋白序列中细胞粘附结构域序列的肽组合，并且涉及源自脾脏和例如淋巴结等淋巴组织的树突状细胞作为培养剂的功效。所述肽组合可以维持树突状细胞未激活或通过免疫刺激剂激活细胞，诱导T细胞的增殖和激活，从而可以将所述肽组合有效地用作用于癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病的免疫诊断或用于免疫细胞疗法的组合物。
附图说明
图1显示通过共聚焦显微镜观察在不添加本发明的肽混合物的情况下培养的脾脏树突状细胞(脾脏DC，sDC)的分布和细胞聚类度(degree of cell clustering)的结果。
图2显示在不添加本发明的肽混合物和刺激剂的情况下培养的脾脏树突状细胞的流式细胞术分析结果，其是确认了MHC-II、CD86、CD80和CD40的表达在树突状细胞表面以时间依赖性方式增加的结果。
图3显示通过共聚焦显微镜确认在添加纤连蛋白或层粘连蛋白而不添加本发明的肽混合物后培养的脾脏树突状细胞的分布的结果。
图4显示在添加不同浓度的纤连蛋白或层粘连蛋白而不添加本发明的肽混合物、然后培养6小时后测量脾脏树突状细胞表面上的CD86和MHC-II的表达水平的流式细胞术分析结果。
图5显示添加200μg/mL的浓度的纤连蛋白或层粘连蛋白而不添加本发明的肽混合物、然后培养6小时后测量脾脏树突状细胞的细胞表面的CD86、MHC-II、CD80和CD40的表达水平的流式细胞术分析结果。
图6显示用于本发明的肽的氨基酸序列和肽类型。
图7显示在添加本发明的肽混合物的情况下培养脾脏树突状细胞6小时后测量CD86的表达水平的流式细胞术分析结果。
图8显示通过共聚焦显微镜观察在添加本发明的肽混合物的情况下培养6小时或24小时后脾脏树突状细胞的分布的结果。
图9显示在添加含有P3的肽混合物的情况下培养脾脏树突状细胞6小时后，测量CD86的表达水平的流式细胞术分析结果。
图10显示与添加纤连蛋白的培养状态相比，在添加各种组合的三种肽混合物的情况下培养6小时或24小时后测量脾脏树突状细胞中MHC-II、CD86、CD80和CD40的表达水平的流式细胞术分析结果。
图11显示通过共聚焦显微镜观察在添加本发明的肽混合物的情况下培养树突状细胞、并用抗体对CD86表达进行荧光染色后CD86表达的结果。
图12显示测量在不添加本发明的肽混合物的情况下培养的树突状细胞的培养基中的TNF-α的分泌量随时间的酶联免疫吸附测定(ELISA)结果。
图13显示测量在添加三种肽混合物的情况下培养24小时后测量TNF-α的分泌量的ELISA结果。
图14显示测量在向含有三种混合物或纤连蛋白添加到其中的培养板添加或不添加脂多糖(LPS)作为免疫刺激剂的情况下培养24小时的脾脏树突状细胞中的CD86的表达水平的流式细胞术分析结果。
图15显示测量在向含有肽混合物或纤连蛋白添加到其中的聚己内酯(PCL)纳米纤维膜添加或不添加LPS作为免疫刺激剂的情况下培养24小时的脾脏树突状细胞中的CD86的表达水平的流式细胞术分析结果。
图16显示通过ELISA测量从脾脏树突状细胞分泌的TNF-α和IL-12p40的量的结果，其中所述树突状细胞在向含有三种肽混合物或纤连蛋白添加到其中的培养板添加或不添加LPS作为免疫刺激剂的情况下培养24小时。
图17显示测量在向含有三种肽混合物或纤连蛋白添加到其中的培养板添加或不添加LPS作为免疫刺激剂的情况下培养24小时的骨髓来源DC(BMDC)中的CD86的表达水平的流式细胞术分析结果。
图18显示测量在向含有不同浓度的三种肽混合物或纤连蛋白添加到其中的培养板添加LPS的情况下培养24小时的BMDC中的CD86的表达水平的流式细胞术分析结果。
图19显示测量在向含有不同浓度的三种肽混合物或纤连蛋白添加到其中的培养板添加LPS的情况下培养24小时的BMDC分泌的TNF-α和IL-12p40的量的ELISA结果。
图20显示与LPS相比，测量脾脏树突状细胞中的CD86的表达水平的流式细胞术分析结果，其中所述树突状细胞通过向含有三种肽混合物或纤连蛋白添加到其中的培养板添加poly(I:C)作为免疫刺激剂并将其培养24小时来获得。
图21显示通过从同种异体小鼠分离的脾脏树突状细胞和从同种异体小鼠分离并用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)荧光染色的T细胞的混合物中的混合淋巴细胞反应来进行的T细胞增殖的流式细胞术分析结果，其中所述树突状细胞通过向含有三种肽混合物或纤连蛋白添加到其中的培养板添加LPS或poly(I:C)作为免疫刺激剂并将其培养24小时来获得。
图22显示通过ELISA测量从同种异体小鼠分离的脾脏树突状细胞和T细胞的4天共培养后的细胞因子的分泌量的结果，其中通过向含有三种肽混合物或纤连蛋白添加到其中的培养板添加LPS或poly(I:C)作为免疫刺激剂来获得树突状细胞并将其培养24小时。
图23显示通过7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色、通过流式细胞术测量脾脏原代树突状细胞的存活率的结果，其中在含有三种肽混合物或纤连蛋白添加到其中的培养板中培养所述树突状细胞6小时。
图24显示通过流式细胞术测量脾脏树突状细胞中的CD86的表达水平的结果，其中在向其添加本发明的接头肽后培养所述树突状细胞。
图25显示测量通过向其添加本发明的加扰接头肽来培养的脾脏原代树突状细胞中的CD86的表达水平的流式细胞术分析结果。
图26显示通过共聚焦显微镜确认在将接头肽添加至脾脏树突状细胞并将其培养24小时后的CD86的表达的结果。
图27显示测量在将接头肽或LPS添加至脾脏原代树突状细胞并将其培养24小时后分泌的肿瘤坏死因子(TNF-α)的浓度的ELISA结果。
图28显示将其中在用接头肽培养后不发生自激活的脾脏树突状细胞、或用LPS激活的树突状细胞、以及用CFSE荧光染色的OT-1T细胞共培养4天后，测量T细胞增殖的流式细胞术分析结果。
图29显示测量在将用接头肽培养的脾脏树突状细胞和OT-1T细胞共培养4天后，培养基中分泌的干扰素-γ(IFN-γ)和TNF-α的浓度的ELISA结果。
具体实施方式
本发明提供一种用于在体外抑制树突状细胞的自激活的组合物，所述组合物包含与树突状细胞之间的整合素结合位点结合的纤连蛋白衍生肽。
树突状细胞使用免疫细胞处理致病物质并在表面为免疫系统的其它细胞展示抗原。即，树突状细胞起到抗原呈递细胞的作用，因此，可以起到作为先天性免疫应答和适应性免疫应答之间的调节子的功能。树突状细胞的类型可以是例如单核细胞来源的树突状细胞、脾脏来源的树突状细胞或淋巴组织来源的树突状细胞，但不限于此。
树突状细胞之间的整合素结合位点可为在细胞-基质和细胞-细胞结合和相互作用中发挥重要作用的位点，并且当肽与此类整合素结合位点结合时，细胞-细胞相互作用受到抑制。由此，细胞-至-细胞信号传导和自激活可受到抑制。
纤连蛋白衍生肽可以由一部分的纤连蛋白(细胞外基质蛋白之一)序列组成，并且可以额外地包括除了一部分的纤连蛋白序列以外的氨基酸序列。
即，本发明可包括一种树突状细胞的自激活抑制用组合物，所述组合物包括具有在纤连蛋白中与树突状细胞之间的整合素结合位点结合的位点的氨基酸序列的肽。
纤连蛋白序列可以具体包括构成纤连蛋白的结构域中的细胞粘附结构域序列。
所述肽可以由包括RGD(SEQ ID NO:1)、LDV(SEQ ID NO:2)或PHSRN(SEQ ID NO:3)的序列组成，例如RGD(SEQ ID NO:1)、LDV(SEQ ID NO:2)、PHSRN(SEQ ID NO:3)、KGRGDS(SEQ ID NO:4)、GRGDS(SEQ ID NO:5)、GGPEILDVPST(SEQ ID NO:6)或EILDVPST(SEQ IDNO:7)。
所述肽的长度可为3至11aa，但不限于此。
所述肽可以是其中包括RGD、LDV或PHSRN的两个以上的氨基酸序列通过接头连接的肽。
所述接头由氨基酸G和S构成，长度可为2至8aa(氨基酸)。例如，所述接头可以是由包括GS(SEQ ID NO:8)、GGGS(SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO:10)或GGGSGGGS(SEQ IDNO:11)的氨基酸序列组成的一者。
例如，所述肽可以包括PHSRNGSRGDGSLDV(SEQ ID NO:12)、PHSRNGGGSRGDGGGSLDV(SEQ ID NO:13)或PHSRNGGGSGGGSRGDGGGSLDV(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。
在本实施方案中，‘接头肽’是指其中多条肽通过如上所述的接头连接的肽。
所述组合物可以包括两种以上的肽。
为了抑制树突状细胞的自激活，基于2×105/mL树突状细胞，本发明的组合物可以包含特定浓度以上的肽，并且所述浓度可以是例如50μg/mL以上、100μg/mL以上、200μg/mL以上、300μg/mL以上、400μg/mL以上、或500μg/mL以上，具体地50至800μg/mL、50至500μg/mL、100至800μg/mL、100至600μg/mL、100至500μg/mL、100至300μg/mL、100至200μg/mL、150至250μg/mL、200至800μg/mL、200至500μg/mL或300至500μg/mL，但不限于此。
本发明的组合物可以调节树突状细胞介导的免疫应答，具体地，可以抑制树突状细胞的自激活或调节树突状细胞的自身抗原呈递能力，但不限于此。
树突状细胞的自激活是指分离的树突状细胞在培养状态下的12小时内从未激活形式转换为激活形式的自发激活现象。已报道上述现象是由于树突状细胞之间的结合或接触而发生的。由于激活的树突状细胞具有非常短的存活期以及这些细胞不能长期培养的缺点，克服该问题使得可以培养能够吞噬和加工抗原的未激活形式的分离的树突状细胞。
根据本发明的用于抑制激活的组合物可以在体内或体外使用，但优选用于体外用途。
此外，本发明提供一种树突状细胞的培养方法，所述方法包括用树突状细胞的自激活抑制用组合物进行处理。
用于抑制自激活的组合物与上述相同，所述组合物的处理浓度和处理时间不限于特定浓度和时间，只要可以抑制树突状细胞的自激活即可。处理浓度可为例如每细胞数2×105/mL为50至500μg/mL、100至400μg/mL或0至300μg/mL，处理时间可为例如2至48小时、6至48小时、4至24小时、6至18小时、4至12小时、6至8小时、或6至24小时，但不限于此。
本发明的树突状细胞的培养方法可进一步包括通过用免疫刺激剂进行处理来诱导树突状细胞的激活，其中所述免疫刺激剂是指将抗原暴露给树突状细胞并导致所述细胞转换为在表面上呈递抗原的细胞的物质，其类型可以包括例如细菌制剂、CD40激动剂、TNF-α、IL-1β、LPS和poly(I:C)，但不限于此。
树突状细胞培养可以在由聚己内酯(PCL)纳米纤维构成的膜上进行三维培养，但不限于此。
此外，本发明提供一种用于激活免疫细胞的方法。
用于激活免疫细胞的方法可以包括：用上述组合物处理分离的树突状细胞并在未激活状态培养树突状细胞；激活树突状细胞；和将激活的树突状细胞和免疫细胞共培养。
免疫细胞是免疫系统中参与免疫应答的细胞，并且可以是指用作细胞治疗剂的细胞，其类型可包括例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和自然杀伤T细胞(NKT细胞)、肥大细胞或骨髓来源的吞噬细胞，但不限于此。
通过用组合物进行处理而在未激活状态培养树突状细胞的步骤与上述树突状细胞培养方法中的相同。
激活树突状细胞的步骤可以通过用成熟因子或免疫刺激剂处理未激活形式的树突状细胞而进行，其中对成熟因子或免疫刺激剂的类型没有特别限制，只要是诱导树突状细胞表面的MHC-II、CD86、CD80或CD40的表达增加的物质即可，并且可以包括例如细菌剂、CD40激动剂、TNF-α、IL-1β、LPS或poly(I:C)。
将激活的树突状细胞和免疫细胞共培养的步骤用于诱导免疫细胞的增殖和细胞因子的分泌。例如，以激活的树突状细胞数为基准的共培养的免疫细胞数的比可为1至50、4至30、5至25、10至30或15至25，并且共培养时间可为2至144小时、4至120小时、12至96小时、24至96小时、48至96小时、或48至72小时，但不限于此。
此外，本发明还提供一种树突状细胞组合物，所述树突状细胞组合物包括肽和与其混合的树突状细胞。
所述组合物的树突状细胞可以维持未激活状态例如6小时以上、12小时以上、24小时以上、或48小时以上，优选6至24小时、6至48小时、12至48小时、或12至24小时，但不限于此。
所述细胞组合物可包括通过用于抑制树突状细胞的激活的上述组合物而维持未激活状态的树突状细胞，其中所述树突状细胞可以是在MHC-II、CD86、CD80或CD40的表达增加方面被特异性抑制的树突状细胞。
所述树突状细胞可以在功能上进行抗原的吞噬作用同时维持存活直至它们被刺激和激活，并且与激活的树突状细胞不同，所述树突状细胞可以被长期培养以在体外诱导T细胞的增殖，或可以与T细胞共培养以加速细胞因子分泌，从而能够开发用于各种疾病的免疫细胞疗法。
本发明还提供一种用于治疗或预防癌症、细菌和病毒传染病、慢性炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含树突状细胞组合物作为活性成分。
所述癌症可以是例如肺癌、喉癌、胃癌、结肠/直肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、上皮细胞源性肿瘤(epithelial cell-derived carcinoma)、骨癌、肌肉癌、脂肪癌、结缔组织细胞源性肿瘤、白血病、淋巴瘤、源自多发性骨髓瘤的造血细胞的血液癌症、由神经组织引起的肿瘤、甲状腺癌、结肠癌、睾丸癌、脑肿瘤、头颈癌、膀胱癌、上皮癌、腺癌、食管癌、间皮瘤、皮肤癌或黑色素瘤，但不限于此。
传染病可以是由例如细菌、螺旋体(spirochete)、立克次体(rickettsia)、病毒、真菌或寄生虫等病原体的感染导致的疾病，但不限于此。
慢性炎症性疾病可为由于长时间的炎症的累积而导致的疾病，并且已知通过使细胞老化和转换和过度激活免疫应答而扰乱免疫系统。出于这些原因，已报道该疾病甚至诱导例如肥胖、糖尿病等代谢性疾病或自身免疫性疾病。
自身免疫性疾病是当内部免疫系统攻击内部正常细胞而不是外来抗原时发生的疾病，并且可以包括例如类风湿性关节炎、特应症(atopy)、狼疮(lupus)、克罗恩病、I型糖尿病、溃疡性结肠炎和多发性硬化症等，但不限于此。
除了上述癌症、传染病或免疫性疾病以外，对于可将免疫细胞用作治疗剂的任何疾病，无论其类型，都可以使用将本发明的细胞组合物用作活性成分的用于治疗或预防疾病的药物组合物。
下文中，将借助于实施例详细描述本发明。以下实施例是为了说明本发明。因此，本发明的内容不限于以下实施例。
实施例1.脾脏树突状细胞的分离和培养
如下获得小鼠脾脏树突状细胞：将EDTA-BSS(平衡盐溶液)缓冲液和胶原酶溶液(含有100单位IV型胶原酶的DMEM，含有低葡萄糖的培养基)添加至雌性C57BL/6小鼠的脾脏并用手术剪进行切割，将其与6mL的胶原酶处理溶液混合，并孵育混合物30分钟。使用70μm细胞过滤器(Falcon)过滤分离的完整脾脏组织，然后以1800rpm离心5分钟，由此分离细胞。通过向所述细胞添加红细胞裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)来去除红细胞，并用含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基洗涤两次。树突状细胞与CD11c+抗体结合的微珠反应，并使用CD11c Microbeads Ultrapure(MACS,Milteni Biotec,USA)分离。
图1中，将从脾脏分离的原代树突状细胞分配在48孔板中，并在维持在37℃和5％CO2的细胞室中培养24小时，对其中细胞分散或聚集成单个细胞的聚类度进行评价。当通过共聚焦显微镜(Olympus共聚焦显微镜FV1000,Olympus Corporation；n＝5)的微分干涉对比(Differential interference contrast,DIC)成像观察时，发现细胞的聚集随着培养时间的推移而进一步增加。与2×105/mL的密度相比，这种现象在1×106/mL的密度下更显著地发生。使用ImageJ软件(NIH,Bethesda)测定单个细胞和细胞间簇的数量。*表示与0h相比P<0.05或更少的统计学显著性。
实施例2.使用流式细胞术的树突状细胞的激活的测量
在未刺激的正常的状态下，树突状细胞具有未激活表型，MHC-II和共刺激分子如CD80、CD86和CD40的表达非常低，然而，在激活的树突状细胞中，这些标志物的表达显著增加。
图2中，为了确定在培养从脾脏分离的原代树突状细胞时是否发生自激活，将树突状细胞以2×105/mL分配在24孔板中，在37℃、在5％ CO2条件下在RPMI-1640培养基中培养6小时后，使用流式细胞仪(MACSQuant VYB flow cytometer,Miltenyi Biotec)分析树突状细胞表面的MHC-II、CD86、CD80和CD40的表达水平。使用FlowJo v10(Tree Star,Ashland)对使用流式细胞仪测量的结果进行分析。CD86、CD80和CD40的表达水平显示为用CD11c染色的细胞的百分比，MHC-II的表达水平显示为平均荧光强度(MFI)，即荧光的平均荧光强度。作为结果，树突状细胞表面的MHC-II、CD86、CD80和CD40的表达水平表现出以时间依赖性方式增加。
实施例3.脾脏树突状细胞在含有纤连蛋白添加到其中的培养基中的培养
图3中，在以200μg/mL的浓度将纤连蛋白或层粘连蛋白添加至RPMI-1640培养基后，将从脾脏分离的CD11c+原代树突状细胞以2×105/mL分配在RPMI-1640培养基中并培养6小时，然后使用共聚焦显微镜观察细胞分布。当添加纤连蛋白时，细胞聚集显著减少，这表明了纤连蛋白可能是抑制树突状细胞之间的聚集的细胞外基质因子。星号(*)表示与无(None)相比P<0.05或更少的统计学显著性。
图4中，在添加不同浓度的纤连蛋白或层粘连蛋白并培养脾树突状细胞6小时，然后通过流式细胞术测量CD86或MHC-II的表达水平时，发现200μg/mL的浓度的纤连蛋白不导致发生自激活，并且200μg/mL以上的浓度的层粘连蛋白不抑制自激活。因此，在本发明中，确认了200μg/mL的浓度的纤连蛋白对于脾脏树突状细胞的自激活是最有效的。*表示与0μg/mL浓度相比P<0.05或更少的统计学显著性。
图5中，在用200μg/mL的浓度的纤连蛋白培养CD11c+脾脏树突状细胞6小时时，确认了CD86或MHC-II的表达以及CD80和CD40的表达没有增加。
实施例4.脾脏树突状细胞在添加有由纤连蛋白的氨基酸序列制备的肽的培养基中的培养
图6中，作为纤连蛋白(介导细胞粘附的细胞外基质蛋白之一)中的氨基酸序列，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)(下文中称为P1,SEQ ID NO:1)等对应于与细胞膜的整合素蛋白结合的位点。此外，其它氨基酸序列如Leu-Asp-Val(LDV,SEQ ID NO:2)(下文中称为P2)和Pro-His-Ser-Arg-Asn(PHSRN)(下文中称为P3),SEQ ID NO:3)也已知起到相同的作用。因此，向Peptron Co.,Ltd.(Daejeon,Korea)请求生产由这些核苷酸序列构成的肽。纤连蛋白中例如RGD等基序与整合素结合并作用于细胞-基质和细胞-细胞结合。作为除了RGD肽以外的类似的肽，制备并使用Lys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser(KGRGDS)(下文中称为P1-1,SEQ ID NO:4)、GRGDS(下文中称为P1-2,SEQ ID NO:5)、Gly-Gly-Pro-Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr(GGPEILDVPST)(下文中称为P2-1,SEQ ID NO:6)、Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr(EILDVPST)(下文中称为P2-2,SEQ ID NO:7)。此外，作为对照，制备并使用作为对应于胶原蛋白中的整合素结合基序的氨基酸序列的Gly-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg(GFOGER)(下文中称为P4,SEQ ID NO:18)、以及作为层粘连蛋白中的整合素结合基序之一的氨基酸序列的Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(YIGSR)(下文中称为P5,SEQ ID NO:19)和Ile-Lys-Val-Ala-Val(IKVAV)(下文中称为P6,SEQ ID NO:20)，并用作对照。
图7中，在培养脾树突状细胞时，以200μg/mL的浓度添加每种制备的肽，并在培养后6小时测量CD86的表达水平。当单独使用每种肽进行处理时，CD86的表达在脾脏树突状细胞中未被抑制。然而，在一起使用P1、P1-2和P2-1肽进行处理时，CD86的表达显著减少。与用这三种肽对细胞进行处理时相比，即使在一起使用两种肽进行处理时，也不抑制表达。*表示与P1、P1-2和P2-1条件相比P<0.05或更低的统计学显著性。
图8中，在以200μg/mL的浓度将制备的P3肽与P1(200μg/mL)和P2(200μg/mL)组合添加在脾脏树突状细胞培养基中并培养6小时或24小时时，显著抑制细胞聚类。相比之下，发现即使在同时添加三种肽P4、P5和P6(其为衍生自胶原蛋白或层粘连蛋白的肽)时，也不抑制细胞聚集。此外，即使在添加作为层粘连蛋白衍生的肽的P5和P6，也未出现抑制。*表示与无相比P<0.05或更少的统计学显著性。
图9中，将含有P1和P2的肽和这些肽的氨基酸以及P3肽以三种类型的组合添加至脾树突状细胞培养基，培养6小时后，通过流式细胞术测量CD86的表达水平。当以200μg/mL的浓度分别添加含有P3(200μg/mL)的其它两种肽时，CD86的表达在所有测量中均显著减少。特别地，当添加P1、P2和P3肽或添加P1-2、P2-1和P3肽时，表现出最显著的抑制效果。相比之下，当P3以600μg/mL的浓度单独处理时，没有表现出抑制效果。*表示与无相比P<0.05或更少的统计学显著性。
图10中，在将三种类型的肽添加至脾脏树突状细胞培养基并培养6小时或24小时的情况中，在通过流式细胞术测定是否抑制除了CD86以外的MHC-II、CD80和CD40的表达时，确认了如果添加P1、P2和P3肽以及纤连蛋白或者如果添加P1-2、P2-1和P3肽，其表达被显著抑制。相比之下，当以200μg/mL的浓度分别添加P4、P5和P6肽时，没有观察到抑制效果。此外，即使当层粘连蛋白单独处理时，也没有观察到效果。*表示与无相比P<0.05或更少的统计学显著性。
实施例5.用肽培养的脾脏树突状细胞中CD86的荧光染色的测量
图11中，培养脾脏树突状细胞(2×105/mL)并以200μg/mL的浓度分别添加所制备的肽，6小时后，在荧光染色后，通过共聚焦显微镜测量使用PE缀合的抗CD86抗体(eBioscience)的CD86表达水平。在培养脾脏原代树突状细胞一定时间后，进行细胞内CD86、F-肌动蛋白(F-actin)和核染色。用FITC-缀合的鬼笔环肽(eBioscience)染色肌动蛋白的表达，用Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)进行核染色。为此，将在48孔板中培养的细胞置于4％多聚甲醛固定溶液中，并在室温下固定20分钟。
然后，用磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤两次后，将其在室温下用0.1％ Triton X-100(Sigma-Aldrich)溶液透化5分钟并用磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤两次。为了去除非特异性染色，在室温下用0.2％胎牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)溶液进行反应20分钟后，将其用磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤两次。然后，将抗CD86抗体和鬼笔环肽以1:40的比在0.2％胎牛血清白蛋白溶液中稀释并反应40分钟，用Tris缓冲液洗涤3次，置于载玻片上，然后用Hoechst33342溶液复染色用于进行细胞的核染色。在用盖玻片密封后，使用共聚焦激光显微镜(K1nanoscope)观察细胞。
实施例6.自培养的脾脏树突状细胞的TNF-α分泌和肽的影响
图12中，以1×106/mL分配脾脏原代树突状细胞并培养24小时，然后测量培养基中从这些细胞分泌的TNF-α的浓度。作为结果，确认了分泌以时间依赖性方式增加。使用ELISA试剂盒(R&D systems)和微孔板分析仪(Synergy H1,Biotek)在450nm测量TNF-α的浓度。然而，在以2×105/mL分配树突状细胞时，CD86表达增加，但TNF-α分泌不增加(结果未示出)。*表示与3h相比P<0.05或更少的统计学显著性。
图13中，以1×106/mL分配脾脏原代树突状细胞并培养24小时。在添加P1、P2和P3肽时或在添加P1-2、P2-1和P3肽时，TNF-α的分泌显著降低。此外，即使添加纤连蛋白并培养，培养基中也几乎测量不到TNF-α。此外，在以200μg/mL的浓度分别添加P4、P5和P6肽时，TNF-α的分泌未被抑制。因此，尽管原代树突状细胞的激活被认为与TNF-α的分泌没有直接关系，但从激活的细胞分泌的TNF-α的量被纤连蛋白或肽组合有效压制。*表示与3h相比P<0.05或更少的统计学显著性。
实施例7.在添加肽和纤连蛋白的同时培养的脾脏树突状细胞的激活的诱导
图14中，测量培养24小时的脾脏原代树突状细胞中的CD86的表达水平，与在将大肠杆菌(E.coli)LPS作为激活诱导剂以1μg/mL的浓度用于进行处理时增加的CD86的表达水平类似。此外，确认了即使在用于自激活的培养条件下通过添加LPS来进行处理，CD86的表达没有进一步增加。即使当用1μg/mL LPS进行处理时，在添加纤连蛋白的情况下培养的脾脏树突状细胞中的CD86表达没有增加。然而，在添加P1、P2和P3肽或添加P1-2、P2-1和P3然后进行培养的具有受压制的自激活的树突状细胞中，通过LPS刺激显著增加了CD86的表达。*表示与无相比P<0.05或更少的统计学显著性。**表示与-LPS相比P<0.05或更少的统计学显著性。
实施例8.在纳米纤维膜上培养的脾脏树突状细胞的激活水平以及肽和LPS的影响
图15中，即使在由聚己内酯(PCL)制成的纳米纤维膜上培养24小时的脾脏原代树突状细胞中，发现与在培养板的培养条件中同样地发生自发激活，由此显著增加CD86的表达。如下生产纳米纤维膜：以15％(w/v)的比将聚己内酯(Sigma,MW 80,000)添加至氯仿溶剂，并使用25G金属注射器以8μL/min的旋转速度与20cm的旋转距离注射该溶液(5ml)，然后在10KV使用静电纺丝机(Nano-NC)进行静电纺丝工艺。肽组合和LPS对在聚己内酯纳米纤维中培养的脾脏树突状细胞的CD86表达的影响表现出与在图14中所示的培养板中获得的那些类似的结果。因此，即使在例如纳米纤维膜等三维培养条件下，脾脏树突状细胞的自发激活的程度与二维培养的类似。*表示与无相比P<0.05或更少的统计学显著性。**表示与-LPS相比P<0.05或更少的统计学显著性。
实施例9.在添加肽和纤连蛋白的同时培养的LPS刺激的脾脏树突状细胞的细胞因子分泌能力
图16显示当用LPS刺激在添加肽组合的状态中培养24小时的脾脏原代树突状细胞时是否正常分泌炎性细胞因子和Th1诱导的细胞因子的测量结果。在添加肽的情况下培养的细胞中，在维持未激活形式的同时难以测量TNF-α和IL-12p40的分泌，然而通过用1μg/mLLPS进行处理，在培养基中测量到高浓度。相比之下，发现在用LPS刺激时，在添加纤连蛋白的情况下培养的脾脏树突状细胞不产生这些细胞因子。因此，可以看出尽管纤连蛋白可以维持脾脏树突状细胞的未激活，但具有抑制由刺激剂引起的激活的缺点。*表示与-LPS相比P<0.05或更少的统计学显著性。
实施例10.肽和纤连蛋白对通过刺激剂激活骨髓来源树突状细胞的影响的研究
与脾脏树突状细胞相比，当用LPS刺激骨髓来源DC(BMDC)时，测量肽组合和添加纤连蛋白的影响。
小鼠骨髓来源树突状细胞是通过从小鼠骨髓前体细胞分化而获得的。去除雌性C57BL/6小鼠的股骨和胫骨，使用10mL的含有2％ FBS的EDTA:BSS(平衡盐溶液)缓冲液分离骨髓。用红细胞裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)去除红细胞，用EDTA:BSS缓冲液洗涤，然后使用70μm细胞过滤器(Falcon)过滤细胞。将3×106/mL的细胞分配在6孔板中，添加白细胞介素-4(20ng/mL)(JW Creagene,Korea)和GM-CSF(20ng/mL)(JW Creagene)并培养7天以诱导分化。分化的树突状细胞和与CD11c抗体(eBioscience)结合的微珠反应，使用CD11cMicrobeads Ultrapure(MACS,Milteni Biotec)分离，然后培养。
图17中，在培养2×105/mL的骨髓来源树突状细胞24小时的同时，以200μg/mL的浓度分别添加P1、P2和P3的肽或以200μg/mL的浓度添加纤连蛋白。在用LPS(1μg/mL)刺激细胞时，在添加肽的情况下，LPS显著增加CD86表达，但纤连蛋白不导致发生CD86表达。
图18中，当在培养骨髓来源树突状细胞24小时的同时按浓度施用纤连蛋白时，可以看到50μg/mL的浓度抑制了LPS(1μg/mL)导致的CD86的表达的增加。*表示与0μg/mL浓度相比P<0.05或更少的统计学显著性。
图19中，当在培养骨髓来源树突状细胞24小时的同时按浓度施用纤连蛋白时，可以看到100μg/mL的浓度抑制了LPS(1μg/mL)导致的TNF-α和IL-12p40的分泌。*表示与0μg/mL浓度相比P<0.05或更少的统计学显著性。
图20中，与结合至包括树突状细胞的免疫细胞和炎症细胞的Toll样受体-4的LPS相比，当以50μg/mL的浓度施用poly(I:C)(聚肌苷酸-聚胞苷酸)时，在添加纤连蛋白的情况下培养时，脾脏树突状细胞中的CD86的表达的增加被抑制，所述poly(I:C)在结构方面类似于双链RNA并且已知为与Toll样受体-3结合的免疫刺激剂。然而，在以200μg/mL的浓度添加P1、P2和P3肽的每一种时，获得了未受到影响的结果。*表示与无相比P<0.05或更少的统计学显著性。
实施例11.通过共培养由用肽培养的脾脏树突状细胞导致的T细胞增殖和增加的细胞因子分泌
由于激活的树突状细胞的主要作用是根据刺激性诱导抗原特异性T细胞激活和增殖，通过混合淋巴细胞反应(MLR)试验研究了在添加肽的情况下培养后的自激活的树突状细胞和在添加肽的情况下培养后的用LPS激活的树突状细胞是否可以诱导T细胞增殖。使从C57B/L6小鼠分离的脾脏树突状细胞自激活24小时，否则，在添加肽或纤连蛋白的情况下培养时，用LPS处理细胞并激活。使用CD4+/CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Bergisch-Gladbach,Germany)和MACS柱(Miltenyi Biotec)分离来自Balb/c小鼠的脾脏T细胞，然后进行10μM CFSE染色(Molecular Probes；Thermo Fisher Scientific Inc.,USA)。以1:20的比将激活的树突状细胞和CFSE染色的T细胞共培养4天，以具有降低的CFSE的细胞的百分比来测量T细胞增殖水平。
图21中，与未用肽或纤连蛋白处理的对照的脾脏树突状细胞相比，用LPS或poly(I:C)激活的树突状细胞略微增加共培养的脾脏T细胞的增殖。此外，在用肽处理后激活的脾脏树突状细胞也有效增加T细胞增殖。然而，在添加纤连蛋白的情况下培养的脾脏树突状细胞未被LPS激活，因此不诱导T细胞增殖。*表示与未处理的sDC相比P<0.05或更少的统计学显著性。图22中，通过ELISA法测量将脾脏树突状细胞和T细胞共培养4天后的细胞因子的分泌量。在添加对照或肽的情况下培养的同时用LPS和poly(I:C)激活的树突状细胞和T细胞的共培养的情况中，分泌高浓度的干扰素-γ(IFN-γ)、TNF-α、IL-6和IL-5。然而，在添加纤连蛋白的情况下的激活的脾脏树突状细胞和T细胞的共培养中，这些细胞因子的分泌极其低。*表示与未处理的sDC相比P<0.05或更少的统计学显著性。
实施例12.用肽培养的脾脏树突状细胞的增加的存活率
树突状细胞表征为在发生自激活的同时在培养期间快速的细胞死亡。除了自激活的抑制以外，测量树突状细胞的存活率是否改变。通过用7-AAD染色培养的细胞并测量未由上述荧光物质染色的细胞的数量来确定细胞存活率。
图23中，培养6小时后，脾脏树突状细胞显著降低细胞存活率，但在添加P1、P2和P3肽或纤连蛋白的情况下培养时，7-AAD-阴性存活细胞的数量显著增加。*表示与未处理的sDC相比P<0.05或更少的统计学显著性。
实施例13.由三种肽构成的接头肽对培养的原代树突状细胞中的CD86表达的影响的测量
作为接头，氨基酸接头GS(Gly-Ser)和柔性接头GGGSGGGS用于连接三种类型的肽RGD(P1)、LDV(P2)和PHSRN(P3)，从而产生PHSRNGSRGDGSLDV(命名为LP1,SEQ ID NO:12)、PHSRNGGGSRGDGGGSLDV(命名为LP2,SEQ ID NO:13)、PHSRNGGGSGGGSRGDGGGSLDV(命名为LP3,SEQ ID NO:14)。向Peptron Co.,Ltd.(Daejeon,Korea)请求生产接头肽，并从其购买产品。该产品被制造为SHIMADZULCMS-2020。作为对照，生产和使用作为其中混合了构成P1、P2和P3肽的氨基酸的序列的加扰肽(scrambled peptide)的S-P1(SEQ ID NO:15)、S-P2(SEQ IDNO:16)和S-P3(SEQ ID NO:17)，以及由加扰肽构成的接头肽S-LP1(SEQ ID NO:21)、S-LP2(SEQ ID NO:22)和S-LP3(SEQ ID NO:23)。加扰肽或加扰接头肽具有与原始肽相同的氨基酸数量、分子量、等电点和亲水性。这些肽的序列示于下表1。
[表1]
图24中，添加不同浓度的LP1、LP2和LP3以达到800μg/mL的浓度，培养脾脏树突状细胞(2×105/mL)6小时或24小时，通过流式细胞术(MACSQuant VYB flow cytometer,Miltenyi Biotec)测量CD86表达水平。使用FlowJo v10(Tree Star,Ashland)分析测量结果。LP1、LP2和LP3以浓度依赖性方式抑制了培养后通过自激活而增加的CD86表达的增加，并且LP3显示最大的自激活抑制效果。*表示与无相比P<0.05或更少的统计学显著性。
图25中，当以2×105/mL分配脾脏原代树突状细胞并在以800μg/mL的浓度分别添加加扰肽S-LP1、S-LP2和S-LP3的同时培养24小时时，CD86的表达的增加未被抑制。此外，即使在加扰肽S-P1、S-P2和S-P3分别以600μg/mL的浓度同时处理时，CD86的表达也未减少。
实施例14.对在添加接头肽的情况下培养的脾脏树突状细胞中的CD86表达的荧光染色的测量
图26中，将脾脏树突状细胞(2×105/mL)分配在48孔板中，以400μg/mL的浓度添加接头肽，然后培养24小时。通过向培养基添加1μg/mL的LPS来诱导脾脏树突状细胞的激活。将培养的细胞置于4％多聚甲醛固定溶液并在室温下固定20分钟。在使用PE缀合的抗CD86抗体(eBioscience)进行荧光染色后，用共聚焦显微镜(K1 Nanoscope,Korea)进行测量。用FITC缀合的鬼笔环肽(eBioscience)染色细胞内肌动蛋白表达，用Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)进行核染色。将CD86抗体和鬼笔环肽在0.2％胎牛血清白蛋白溶液中1:40稀释并使用。当仅在培养基中培养脾脏树突状细胞时，CD86表达显著增加。然而，在添加纤连蛋白或三种类型的肽或者在添加接头肽LP1、LP2和LP3的两种情况中，几乎未观察到表达CD86的细胞。此外，当添加LPS时，如果含有纤连蛋白，几乎未测量到表达CD86的细胞。然而，在添加三种类型的肽的组合(P1+P2+P3)或接头肽的情况下进行培养的状态中，通过LPS处理而显著增加表达CD86的细胞的数量。
实施例15.接头肽对培养的脾脏树突状细胞的TNF-α分泌的影响
图27中，ELISA试剂盒(R&D systems)用于测量在以2×105/mL分配脾脏原代树突状细胞并培养24小时时分泌至培养基的TNF-α的浓度。通过微孔板分析仪(Synergy H1,Biotek)在450nm确定浓度。在仅培养树突状细胞时，TNF-α的浓度被测定为75±10pg/mL并且通过LPS刺激而显著增加。在添加纤连蛋白、三种类型的肽的组合(P1+P2+P3)和接头肽LP1、LP2和LP3时，发现难以发生TNF-α分泌。在进行LPS处理的情况中，如三种类型的肽的组合(P1+P2+P3)，即使当添加接头肽时，与添加纤连蛋白相比，TNF-α的分泌显著增加。*表示与无相比P<0.05或更少的统计学显著性。
实施例16.由用接头肽培养的脾脏树突状细胞导致的T细胞激活的测量
图28中，研究了其中在培养期间由接头肽不导致发生自激活的脾脏树突状细胞、和用LPS激活的树突状细胞是否可以诱导T细胞增殖。使脾脏树突状细胞(2×106/mL)在96孔板中自激活24小时，或通过添加接头肽来抑制自激活，然后不用LPS进行处理或用LPS刺激24小时。用10μM卵清蛋白(OVA)肽SIINFEKL(InvivoGen,San Diego,California,USA)培养树突状细胞1小时。使用CD8 T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从OT-I转基因小鼠分离CD8+T细胞，并用10μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行荧光染色10分钟。在以1:20的比将CD8+T细胞(1×105)和用OVA肽处理的DC(5×103)共培养4天后，以对于CFSE荧光染色为阴性的细胞的百分比测量T细胞的增殖水平。
如果不进行LPS处理，已进行自激活的树突状细胞不诱导T细胞增殖。当用LPS进行刺激时，自激活的细胞或用纤连蛋白培养的树突状细胞具有非常弱的诱导T细胞增殖的能力，而用三种肽的组合或接头肽培养的LPS刺激的树突状细胞显著增加T细胞增殖。
图29中，在与用于T细胞增殖测量相同的条件下，在将脾脏树突状细胞和T细胞共培养4天后，通过ELISA测量分泌至培养基中的干扰素-γ(IFN-γ)和TNF-α的浓度。在用LPS刺激后，在与T细胞共培养时，自激活的树突状细胞分泌2.5倍以上的干扰素-γ和TNF-α。另一方面，在用LPS进行刺激并与T细胞共培养时，在添加三种类型的肽的组合的情况下培养的树突状细胞或者用LP1、LP2、LP3接头肽培养的树突状细胞显示4.5倍以上的这些细胞因子的分泌。*为与无相比低于P<0.05，其为统计学显著的。
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<210> 1
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白基序P1
<400> 1
Arg Gly Asp
1
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白基序P2
<400> 2
Leu Asp Val
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白基序P3
<400> 3
Pro His Ser Arg Asn
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白基序样肽P1-1
<400> 4
Lys Gly Arg Gly Asp Ser
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白基序样肽P1-2
<400> 5
Gly Arg Gly Asp Ser
1 5
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白基序样肽P2-1
<400> 6
Gly Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白基序样肽P2-2
<400> 7
Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 8
Gly Ser
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 9
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 11
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽LP1
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Pro His Ser Arg Asn Gly Ser Arg Gly Asp Gly Ser Leu Asp Val
1 5 10 15
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽LP2
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Pro His Ser Arg Asn Gly Gly Gly Ser Arg Gly Asp Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Asp Val
<210> 14
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽LP3
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Gly Gly Gly Ser Leu Asp Val
20
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<220>
<223> 加扰基序S-P1
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1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 加扰基序S-P2
<400> 16
Val Leu Asp
1
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 加扰基序S-P3
<400> 17
Ser Asn Pro Arg His
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白衍生的肽P4
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)
<223> Xaa是指Hyp(羟脯氨酸)
<400> 18
Gly Phe Xaa Gly Glu Arg
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白衍生的肽P5
<400> 19
Tyr Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白衍生的肽P6
<400> 20
Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 加扰接头肽S-LP1
<400> 21
Asn Arg Pro His Ser Gly Ser Asp Arg Gly Gly Ser Val Asp Leu
1 5 10 15
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 加扰接头肽S-LP2
<400> 22
Asn Arg Pro His Ser Gly Gly Gly Ser Asp Arg Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Val Asp Leu
<210> 23
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 加扰接头肽S-LP3
<400> 23
Asn Arg Pro His Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Arg Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Val Asp Leu
20

Claims (17)

1.一种树突状细胞的自激活抑制用组合物，所述组合物包含与树突状细胞之间的整合素结合位点结合的纤连蛋白衍生肽。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肽是由包括SEQ ID NOs:1至3中任一者的氨基酸序列组成的肽。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肽具有SEQ ID NOs:1至3中的任一氨基酸序列，并且长度为3至11aa。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肽是选自由SEQ ID NOs:1至7中的任一氨基酸序列组成的组中的至少一个。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肽是其中包括SEQ ID NOs:1至3中任一者的两个以上的氨基酸序列通过接头连接的肽。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述接头由氨基酸G和S组成，并且长度为2至8aa。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述接头由包括SEQ ID NOs:8至11中任一者的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求5所述的组合物，其中所述肽具有SEQ ID NOs:12至14中的任一氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中基于2×105/mL的要处理的树突状细胞，以200μg/mL以上的浓度包含所述肽。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述树突状细胞源自单核细胞、脾脏或淋巴结。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于体外用途。
12.一种树突状细胞的培养方法，所述方法包括用根据权利要求1至11任一项所述的组合物处理分离的树突状细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括通过用免疫刺激剂对已用所述组合物处理的树突状细胞进行处理来诱导树突状细胞的激活。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述免疫刺激剂是选自由细菌剂、CD40配体、TNF-α、IL-1β、LPS和poly(I:C)组成的组中的至少一种。
15.一种用于激活免疫细胞的方法，所述方法包括：
用根据权利要求1至11任一项所述的组合物处理分离的树突状细胞并在未激活状态培养所述树突状细胞；
激活所述树突状细胞；和
将激活的树突状细胞与免疫细胞共培养。
16.一种树突状细胞组合物，所述组合物包含：
根据权利要求1至11任一项中所述的、与树突状细胞之间的整合素结合位点结合的纤连蛋白衍生肽；和与其混合的树突状细胞。
17.一种用于治疗或预防癌症、传染病、慢性炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求16所述的细胞组合物作为活性成分。
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