CN116426476A

CN116426476A - 一种脐血dc细胞的培养方法

Info

Publication number: CN116426476A
Application number: CN202310670738.8A
Authority: CN
Inventors: 谢佳琦; 卢瑞珊; 高大
Original assignee: Guangzhou Zhengyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Zhengyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-06-08
Filing date: 2023-06-08
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2043-06-08
Also published as: CN116426476B

Abstract

本发明提供了一种脐血DC细胞的培养方法，该方法首先采用羟乙基淀粉和淋巴分离液对脐血进行双提纯，然后添加层粘连蛋白母液对DC细胞进行提取纯化，随后依次使用1640培养基和581培养基，并结合IL‑4、GM‑CSF等细胞因子、脂多糖和蛋白酶抑制剂等对细胞进行刺激增殖、诱导成熟，所获得的细胞数量充足，且表达率较高，抗原递呈能力优异，此外，该培养方法操作简单，可显著提高DC细胞的培养成功率，应用前景良好。

Description

一种脐血DC细胞的培养方法

技术领域

本发明属于再生医学和生物学技术领域，具体涉及一种脐血DC细胞的培养方法。

背景技术

DC细胞（树突状细胞）是迄今为止功能最强大的抗原呈递细胞，因成熟时有许多树状或伪足样突起而得名。DC常被称为“天然佐剂”，已成为抗原传播的天然媒介，具有免疫应答和免疫耐受两种功能，对维持免疫平衡具有重要作用。

树突状细胞是机体内发现的具有最强专职抗原提呈细胞。因其在成熟过程中能伸出大量树突样突起而得名，人体树突状细胞起源于造血干细胞，外周血树突状细胞在数量上不足外周血单个核细胞的1%，它能摄取、加工处理抗原，并能将处理后的抗原递呈给T淋巴细胞。未成熟的树突状细胞具有较强的迁移能力及摄取、加工抗原能力，成熟的树突状细胞能有效激活初始型T淋巴细胞，并能启动、调控并维持免疫应答。在病理条件下，DC的生理功能受到严重影响。在肿瘤微环境中，存在各种作用于D的抑制性细胞因子，导致DC功能异常，进而使肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视。随着对DC生物学知识及其免疫应答机制的深入研究，DC疫苗的发展越来越迅速。DC的递呈能力是其他抗原提呈细胞的100倍；只有DC细胞才能激活幼稚T细胞；DC细胞过继性免疫治疗是目前临床上肿瘤细胞免疫治疗的重要手段。由于外周血中DC细胞含量少(约占淋巴细胞的1%)，体外扩增高效的DC细胞则成为DC细胞治疗的关键问题之一。

许多体外研究均显示IL-4、GM-CSF、TNF-a对促进DC细胞的成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。但经过研究发现，使用上述细胞因子的不同组合在一定程度上可以扩增体外的DC细胞，但是外周血样品年龄、是否化疗等条件直接影响了DC细胞的体外扩增成功与否，说明了现有DC细胞培养体系的稳定性较差。

同时，DC细胞在体外扩增培养时受受供者年龄、身体条件等因素影响较大。此外，现有技术中，自体血来源的DC细胞在体外培养时，添加的细胞因子种类繁多，且细胞扩增效果较差甚至失败，且培养扩增出来的DC细胞生物活性较差。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种脐血DC细胞的培养方法，该方法首创性的使用羟乙基淀粉和淋巴分离液的双提纯方法，以及促进贴壁法，同时使用层粘连蛋白（Laminin）对DC细胞进行提取纯化，有效缩短贴壁培养时间，随后先后采用1640培养基和581培养基，在1640培养基中添加IL-4、GM-CSF、TNF-a、SCF以及AB血浆，在581培养基中结合脂多糖（LPS）和蛋白酶抑制剂对细胞进行刺激增殖、诱导成熟，使获得的DC细胞数量充足且活性高，表达率高、抗原递呈能力优异，从而完成本发明。

本发明在于提供一种脐血DC细胞的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：

步骤1、取脐血，向脐血中添加羟乙基淀粉混匀，沉降分层后吸出上层液体，然后向上层液体添加生理盐水混匀、离心，弃上清液，再向沉淀中添加生理盐水，混匀，得到稀释后的血液；

步骤2、将步骤1得到的稀释后的血液加入淋巴细胞液中，离心后将含有PBMC（外周血中具有单个核的细胞）层液体吸出，然后向PBMC层液体中添加生理盐水后重悬、离心，得到重悬离心后的PBMC层液体；

步骤3、取层粘蛋白母液进行稀释，形成工作液，将工作液与重悬离心后的PBMC层液体置于培养瓶中进行表面处理，离心后弃去上清液，向其中加入无血清1640基础培养基，重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中后置于培养箱中孵育；

步骤4、孵育后，将培养瓶中的悬浮细胞移除，向仅含有贴壁细胞的培养瓶中添加1640培养基、IL-4、GM-CSF、AB血浆进行培养；

步骤5、培养6天后，弃上清液，添加581基础培养基、AB血浆，诱导DC细胞成熟培养。

附图说明

图1示出实施例1中对DC细胞培养第1天，第5天，第7天于倒置显微镜下的形态照片。

具体实施方式

下面将对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。

步骤2、将步骤1得到的稀释后的血液加入淋巴细胞液中，离心后将含有PBMC层（外周血中具有单个核的细胞）液体吸出，然后向PBMC层液体中添加生理盐水后重悬、离心，得到重悬离心后的PBMC层液体；

以下对该步骤进行具体描述和说明。

步骤1、取脐血，向脐血中添加羟乙基淀粉混匀，沉降分层后吸出上层液体，然后向上层液体添加生理盐水混匀、离心，弃上清液，再向沉淀中添加生理盐水，混匀，得到稀释后的血液。

脐血与羟乙基淀粉经混匀后，自然沉降，脐血与羟乙基淀粉的质量比优选为1:1，沉降时间优选20～45min，待上下液面分层，上下液面体积比为1:1。

将析出的上层液体转移至离心管中，方便后续混匀和离心。

第一次添加的生理盐水和上层液体的体积比为（0.8～1.5）：1，优选为1:1。

所述离心转速为1500～2500rpm，优选1700～2000rpm。所述离心时间为5～15min，优选8～12min。

第二次添加的生理盐水与沉淀的体积比为（0.9～1.2）：1，优选1:1。

步骤2、将步骤1得到的稀释后的血液加入淋巴细胞液中，离心后将含有PBMC层液体吸出，然后向PBMC层液体中添加生理盐水后重悬、离心，得到重悬离心后的PBMC层液体。

所述稀释后的血液与淋巴细胞液的体积比为（0.8～1.2）：1，优选1:1。

优选采用一次性移液管或巴氏吸管将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞液中，避免破坏已形成的界面，使稀释后的血液和淋巴细胞液二者之间形成清晰的界面。

第一次离心优选在离心机中进行，离心转速为2500～3500rpm，优选3000rpm。

离心时间为10～20min，优选15min。

第二次离心转速为1500～2000rpm，优选1800rpm。离心时间为2～7min，优选5min。

步骤3、取层粘蛋白母液进行稀释，形成工作液，将工作液与重悬离心后的PBMC层液体置于培养瓶中进行表面处理，离心后弃去上清液，向其中加入无血清1640基础培养基，重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中后置于培养箱中孵育。

本发明中采用层黏连蛋白进行提取纯化，层粘连蛋白有细胞及组织特异性，对于调节细胞功能具有重要作用，具有协助粘附、促进生长、引导迁移、调控分化、维持表型、防止细胞凋亡等优点。通过在DC细胞培养中添加层黏连蛋白可有效缩短DC细胞的贴壁培养时间，提高DC细胞的扩增数量、培养率和存活率。

稀释倍数为5000～15000倍，优选8000～12000倍。

所述表面处理时间为20～60min，优选30～50min。

根据细胞计数结果，所述无血清1640基础培养基的加入量按照不小于2.5×10⁶cells/mL的密度进行添加，优选不小于3.0×10⁶cells/mL的密度进行添加

所述孵育温度为35～38℃，优选37℃。培养箱中二氧化碳的含量优选为5%。

在贴近人体温度的范围内进行贴壁培养，有利于DC细胞的增殖，提高获得DC细胞的活性和数量。

所述孵育时间为1～1.5h，优选1h。本发明通过添加层黏连细胞，可有效缩短DC细胞的贴壁培养时间，提高DC细胞的培养效率。

步骤4、孵育后，将培养瓶中的悬浮细胞移除，向仅含有贴壁细胞的培养瓶中添加1640培养基、IL-4、GM-CSF、AB血浆进行培养。

本发明所述AB血浆通过以下步骤制得：

步骤a、取AB血型的成人外周血经离心分离提取血浆；

步骤b、将提取的血浆于50～60℃水浴20～45min，然后置于离心机中于2000～3000rpm的转速下离心20min，上清液即为制得的AB血浆。

孵育一段时间后，将培养瓶中的悬浮细胞移除至另外的培养瓶中，仅将贴壁细胞保留，贴壁细胞为本发明的目标细胞，然后向含有贴壁细胞的培养瓶中添加1640培养基和其他细胞因子。

所述IL-4的添加量为400～1500U/mL，优选500～1000U/mL。

所述GM-CSF的添加量为400～1500U/mL，优选500～1000U/mL。

所述AB血浆的添加量为培养基总体积的3%～7%，优选添加量为5%。此处的总体积为再次添加1640培养基后的总体积。

在本发明中，还向培养瓶中添加TNF-a和SCF。

优选地，所述TNF-a的添加量为30～120ng/mL，优选50～100ng/mL。

所述SCF的添加量为30～120ng/mL，优选50～100ng/mL。

现有技术常采用1640培养基并结合IL-4、GM-CSF因子作为DC细胞的体外培养体系，本发明对培养体系进行优化改进，先后采用1640培养基和581培养基对脐血来源的DC细胞进行体外扩增培养，解决异基因临床应用的问题，有效解决由于个体差异导致培养失败的问题，通过结合新的培养基581培养基以及IL-4、GM-CSF、TNF-a、SCF等细胞因子的添加，保证各类型的血液样品都能扩增成功，同时采用的IL-4、GM-CSF、TNF-a、SCF等细胞因子的组合，可有效提高DC细胞体外扩增的效率及纯度，使获得的DC细胞数量充足，且获取的DC细胞活性高。

根据本发明，每隔2～3天根据细胞增殖情况补加1640培养基、IL-4、GM-CSF、TNF-a和SCF细胞因子。

所述581基础培养基中包括LPS脂多糖和蛋白酶抑制剂cocktail，优选地，581基础培养基包括100～500μg /mLLPS和蛋白酶抑制剂cocktail。

本步骤中的AB血浆与步骤4中AB血浆的制备方法相同，AB血浆的添加量为培养基总体积的4%～6%，优选5%。

该培养在低氧环境中进行，氧含量为4%～10%，优选5%。

本发明通过在581培养基中添加脂多糖，可对DC细胞诱导成熟培养。通过添加蛋白酶抑制剂cocktail能够抑制蛋白的降解，进一步促进DC细胞功能活化，提高对CD80、CD86、HLA-DR的表达率。

本发明所具有的有益效果：

（1）本发明创造性的采用两种类型的培养基和4种因子联合诱导DC细胞增殖，此外，通过SCF因子的使用，使得一部分的造血干细胞向DC细胞方向分化，起到稳定DC细胞质量的作用；

（2）本发明还采用层黏连蛋白细胞，使得DC细胞贴壁时间从2.5h缩短至1h，有效缩短贴壁培养时间，细胞获取率提高，提取的细胞数量增多、细胞活率高；

（3）本发明不仅可以扩增DC细胞数量，还可全方位提高DC细胞的生物活性，获得的DC细胞对CD80、CD86、HLA-DR的表达率较高，抗原递呈能力优异，同时该方法操作简单，培养效率和成功率高。

实施例

以下通过具体实例进一步阐述本发明，这些实施例仅限于说明本发明，而不用于限制本发明范围。

除AB血浆外，其余采用的细胞因子和培养基等均为市售产品。

实施例1

前期准备工作：将1640培养基、羟乙基淀粉(HES)、淋巴细胞分离液、生理盐水提前置于室温下预热，并将细胞因子置于4℃解冻。用75%乙醇擦试无菌操作台面消毒，将装有脐血的采血袋放入无菌操作台中。

AB血浆制备：取AB血型的成人外周血进行离心分离提取血浆，获取血浆后置于56℃水浴30min；水浴后的血浆转移至离心机中2500rpm离心20min，把上清转移至新的50mL离心管中使用。

（1）用一次性移液管将脐血转移到50 mL离心管中，抽取2 mL血液分装于两个EP（环氧树脂）管中，一个进行细菌、真菌的检测，一个留样。用一次性移液管加入等量羟乙基淀粉，轻柔充分混匀，自然沉降30min左右，待上下液面是1:1时，吸出上层，并转移至50mL的离心管中，加入等量的生理盐水，混合均匀，1800rpm离心10 min；弃上清液；根据沉淀与生理盐水的体积比为1:1，加入等体积的生理盐水后，混匀，得到稀释后的血液。

（2）另取新的50 mL 离心管，用一次性移液管每管加入12.5ml淋巴细胞分离液，用一次性移液管或巴氏吸管将稀释后的血液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面，血液稀释液：淋巴分离液的体积比为1:1。将离心管转移至离心机，于3000rpm离心15min。离心后将含有PBMC层液体吸出，转移至另一支50 mL离心管中。用一次性移液管加生理盐水重悬PBMC至50 mL，1800rpm离心5 min，得到重悬离心后的PBMC层液体。

（3）取层粘连蛋白母液，稀释10000倍形成工作液；取5mL工作液和重悬离心后的PBMC层液体加入至T75的培养瓶中，进行表面处理45min。然后进行离心，离心后弃去上清液，根据细胞计数结果，按照3.0×10⁶cells/mL的密度加入无血清的1640基础培养基，重悬细胞沉淀，随后接种于细胞培养瓶中，放入37℃、5%CO₂培养箱中进行孵育1小时。

（4）细胞贴壁（孵育）1h后，将培养瓶中的悬浮细胞转移到另外的细胞培养瓶中，然后向仅含有贴壁细胞的原培养瓶中添加30mL的1640培养基，并全量补加1000U/mL的IL-4、1000U/mL的GM-CSF、100ng/mL TNF-a、100ng/mL SCF、按培养基总体积的5%添加AB血浆；每隔2-3天根据细胞增殖情况进行补培养基和补因子IL-4、GM-CSF、TNF-a、SCF处理。

（5）第6天，弃去全部上清液，加入含有500μg /mL LPS和500μg /m蛋白酶抑制剂cocktail的581基础培养基，按培养基总体积的5%添加AB血浆，于氧含量为5%的低氧环境中进行培养，诱导DC细胞的成熟。诱导DC细胞成熟培养48h，对DC细胞进行收集及检测。

采用倒置显微镜对DC细胞的形态进行观察：分别于DC细胞培养第1天，第5天，第7天，于倒置显微镜下观察树突状细胞形态的改变，形态变化如图1所示。可以看出，DC细胞在第1天和第5天观察到的DC细胞形态基本为圆形，边缘清晰，胞质明显，第7天加入脂多糖后，DC细胞形态发生变化，体积增大，细胞边缘处出现触角，表明脂多糖的添加可促进DC细胞触角的生长，诱导DC细胞成熟，DC细胞开始出现功能激活等现象。

实验例

实验例1 贴壁培养1h和2.5h后DC细胞获取的数量及活力检测。

按照实施例1的培养方式分别培养1小时和2.5小时，对培养1小时和2.5小时的DC细胞数量、活率进行检测和计算。结果如表1表示：

表1

从表1可以看出，采用本发明实施例1的培养方式，经过1h的贴壁培养，DC细胞的平均获取量可达3.56×10⁶cells，经2.5h的贴壁培养后，DC细胞数量微量提升至3.77×10⁶cells，1h的DC细胞获取率是2.5h细胞获取率的95%左右。可见采用本发明的培养方式通过添加层粘连蛋白母液，不仅大大提高了DC细胞的获取率，且极大缩短了DC细胞的提取培养时间，提升了培养效率。

同时可以看出，通过本发明的培养方式获得的DC细胞活率均在95%以上，表明本发明的提取培养方式对DC细胞的损伤性不大，培养得到的细胞活率较高。

实验例2 DC细胞流式检测

对实施例1中DC细胞成熟前后细胞表型阳性细胞数改变进行检测，结果如表2所示。

表2

从表2可以看出，实施例1在DC细胞培养过程中经过脂多糖（LPS）的诱导，培养得到的DC细胞对CD80、CD86、HLA-DR的表达率分别为33.22%、62.31%和70.32%，DC细胞的表面标记物CD80、CD86、HLA-DR的表达率均明显较高。表明脂多糖能诱导DC细胞成熟及功能活化，同时蛋白酶抑制剂cocktail能够抑制蛋白的降解，进一步促进DC细胞功能活化。

实验例3 DC抗原提呈能力检测

取另一健康成人外周血20 mL按实施例1所示分离方法分离外周血单个核细胞(PBMC) ，取非贴壁细胞即为同种异体淋巴细胞。取实施例1获取的DC细胞，用RPMI 1640培养液悬浮，加入丝裂霉素C25μg /mL，于37℃水浴30 min，RPMI 1640培养液洗涤3次。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液悬浮细胞，分别以1×10⁴/孔加入48孔培养板，每组设3个复孔，每孔再加入同种异体淋巴细胞2×10⁵cells，使其终体积为200μL，另取3孔只加淋巴细胞而不加DC细胞，作为对照，在37℃、5% CO₂培养箱培养4d后，于1000转/min，离心5 min，弃上清，每孔加入MTT液（噻唑蓝溴化四唑）10μL，继续培养1h后，1000转/min，离心5 min，弃上清，每孔加入二甲基亚砜( DMSO) 100μL，在酶标仪上490nm处测出OD值（光吸收值），结果以3孔均值表示，结果如表3所示。

表3

从表3中可以看出，本发明实施例1的检测均值为0.86，表明通过本发明所述方法获得DC细胞的抗原递呈能力优异。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims

1.一种脐血DC细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：

步骤2、将步骤1得到的稀释后的血液加入淋巴细胞液中，离心后将含有PBMC层液体吸出，然后向PBMC层液体中添加生理盐水后重悬、离心，得到重悬离心后的PBMC层液体；

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1中，

第一次添加的生理盐水和上层液体的体积比为（0.8～1.5）：1；

第二次添加的生理盐水与沉淀的体积比为（0.9～1.2）：1。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2中，

所述稀释后的血液与淋巴细胞液的体积比为（0.8～1.2）：1。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤3中，

稀释倍数为5000～15000倍，所述表面处理时间为20～60min。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤3中，

所述孵育温度为35～38℃，所述孵育时间为1～1.5h。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤4中，所述AB血浆通过以下步骤制得：

步骤a、取AB血型的成人外周血经离心分离提取血浆；

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，

所述IL-4的添加量为400～1500U/mL，所述GM-CSF的添加量为400～1500U/mL，所述AB血浆的添加量为培养基总体积的3%～7%。

8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤4中，还向培养瓶中添加TNF-a和SCF，

所述TNF-a的添加量为30～120ng/mL，所述SCF的添加量为30～120ng/mL。

9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤5中，

所述581基础培养基中包括LPS脂多糖和蛋白酶抑制剂cocktail。

10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，

581基础培养基包括100～500μg /mL LPS和100～500μg /mL蛋白酶抑制剂cocktail；

AB血浆的添加量为培养基总体积的4%～6%。