FI119738B - Nukleiinihapon liuosta ja kationisen polymeerin liuosta sisältävä koostumus ja käytöt - Google Patents

Nukleiinihapon liuosta ja kationisen polymeerin liuosta sisältävä koostumus ja käytöt Download PDF

Info

Publication number
FI119738B
FI119738B FI970115A FI970115A FI119738B FI 119738 B FI119738 B FI 119738B FI 970115 A FI970115 A FI 970115A FI 970115 A FI970115 A FI 970115A FI 119738 B FI119738 B FI 119738B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
composition according
nucleic acid
polymer
cells
solution
Prior art date
Application number
FI970115A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI970115A (fi
FI970115A0 (fi
Inventor
Daniel Scherman
Jean-Paul Behr
Otmane Boussif
Barbara Demeneix
Franck Lezoualch
Mojgan Mergny
Original Assignee
Aventis Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9465376&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI119738(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Aventis Pharma Sa filed Critical Aventis Pharma Sa
Publication of FI970115A publication Critical patent/FI970115A/fi
Publication of FI970115A0 publication Critical patent/FI970115A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI119738B publication Critical patent/FI119738B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)

Description

Nukleiinihapon liuosta ja kationisen polymeerin liuosta sisältävä koostumus ja käytöt Tämä keksintö koskee nukleiinihappopohjäisiä vai-5 misteita, niiden valmistusta ja käyttöä. Se koskee erityisesti valmisteita, jotka sisältävät ainakin yhtä nukleiinihappoa ja tiettyjä kationisia polymeerejä ja niiden käyttöä nukleiinihappojen siirtämisessä in vitro soluihin.
Geeniterapiassa korjataan puutos tai anomalla (mu-10 taatlo, poikkeava ekspressio jne ,) tai yärlnistetaan halutun terapeuttisen proteiinin ekspressio lisäämällä geneettistä informaatiota sairaaseen soluun tai elimeeni Tämä geneettinen informaatio voidaan lisätä joko in vitro elimestä irrotettuun soluun, modifioitu solu siirretään sitten takaisin 1.5 organismiin tai suoraan in vivo sopivaan kudokseen. Erilaisia tekniikoita on kuvattu tämän geneettisen informaation siirtämiseksi, niiden joukossa erilaiset transfektioteknii-kat, joissa käytetään DNA- ja DEAE-dekstraanikompleksej a (Pagano et ai., Virol. 1 (1967) 891), DNA- ja tumaprote-20 iihikomplekseja (Kaneda et ai., Science 243 {1989) 375), DNA- ja lipidikomplekseja (Feigner et ai., PNAS 84 (1987) 7413), DNA- ja poly lys i inikomplekse j a, liposome ja (Fraley et äl., J., Biol Chem. 255 (1980) 10431) jne. Juuri äskettäin viruksen käyttö vektorina geenien siirrossa on ilmes-25 tynyt lupaavana vaihtoehtona näille fysikaalis-kemiallisille transfektiotekniikoille. Siksi on testattu erilaisten virusten kykyä infektoida tiettyjä solupopulaatioita.
Erityisesti retroviruksia (RSV, HMS, MMS jne.), HSV-virusta, adenoassosioituneita viruksia ja adenoviruksia.
30 Tähän saakka kehitetyillä menetelmillä ei )cuiteli kään voida ratkaista tyydyttävästi ongelmia, jotka liittyvät geenien siirtoon soluihin ja./tai organismeihin. Erityisesti ongelmia, jotka liittyvät nukleiinihapon tunkeutumiseen soluihin, ei ole kokonaan ratkaistu. Itse asiassa nuk-35 leiinihappojen pölyänioninen luonne estää niiden kulkemisen solumembraanien läpi. Vaikka on osoitettu, että pelkät nuk- l 2 leiinihapot pystyvät kulkemaan tietyntyyppisten solujen plasmamembraanin läpi in vivo (katso etenkin WO-patent-tihakemus nro 90/11 092}, transfektion tehokkuus jää melko heikoksi* Lisäksi pelkillä nukleiinihapoilla on lyhyt puo-5 liintumisaika plasmassa, koska ne hajoavat entsyymien vaikutuksesta ja poistuvat virtsateiden kautta- Siksi jos re-kombinantt iviruks lila voidaan parantaa nulclei inihappo j en siirtymistehokkuutta, niiden käytössä on tiettyjä riskejä, kuten patogeenisuus, transmissio, replikaatio, rekombinaa-10 tio, transformaatio, immunogeenisyys jne. Lisäksi niiden tuottaminen GMP-normien mukaisesti tuottaa tiettyjä vaikeuksia.
Tämä keksintö tarjoaa edullisen ratkaisun erilaisiin ongelmiin. Keksijä on itse asiassa osoittanut, että 15 tietyillä kationisi11a polymeereillä on erityisen edullisia ominaisuuksia siirrettäessä nukleiinihappoja soluihin sekä in vitro että in vivo. Lisäksi näiden polymeerien etuna on helppo saatavuus ja halpa hinta. Keksinnön mukaisilla ka-tionisilla polymeereillä voidaan myös välttää virusvekto-2Q: reiden käyttöön liittyvät hankaluudet (potentiaaliset vaa rat, siirrettävän geenin rajoitettu koko, korkea hinta jne.).
Keksintö koskee erityisesti koostumusta, joka sisältää nukleiinihapon liuosta ja katlohisen polymeerin liu-25 osta, jotka on yhdistetty ja homogenisoitu, jolloin ka-tionisella polymeerillä on yleinen kaava (I) : ;:>McH2)nl· R j m
P
3 j ossa - R vox olla vetyatomi tai ryhmä, jonka kaava on: X(CH2)0.n1 i- Jq ~ n on kokonaisluku 2 - 10; 5 ~ p ja g ovat kokonaislukuja, ja on selvää, että summa p + g on Sellainen, että polymeerin keskimääräinen molekyylipaino on 100 - 107 Da, ja ~ polymeerin ja nukleiinihapon suhteelliset osuudet on valittu niin, että suhde R polymeerin amiinit/nukl e-10 iinihapon fosfaatit on 5 - 30.
On selvää, että kaavassa (I) nm arvo voi vaihdella eri p-yksiköiden rakenteissa. Siksi kaava (1} ryhmittelee homopolymeerit ja heteropolymeerit uudelleen.
Keksintö koskee myös kaavan (I) mukaisten kationis-15 ten polymeerien käyttöä nukleiinihappojen siirtämisessä so luihin .
Vielä aivan erityisesti kaavassa (1) n on 2 - 5. Erityisesti polyetyleeni-imiinin (PEI) ja polypropyleeni-imiinin (PPI) polymeereillä on kerrassaan edullisia ominai-20 suuksia.
Tämän keksinnön toteuttamiseen parhaita polymeerejä ovat ne, joiden molekyylipaino on välillä 103 ja 5.10e, Voidaan mainita esimerkiksi polyetyleeni-imiini, jonka keski- \ määräinen molekyylipaino on 50 000 Da {PEI50K) tai polyety- ; 25 leeni-imiini, jonka keskimääräinen molekyylipaino on l
800 000 Da (PEI80QK). I
Tämän keksinnön piirissä käytettäviä polymeerejä voidaan valmistaa eri tavoilla. Niitä voidaan valmistaa ensinnäkin syntetisoimalla kemiallisesti vastaavasta monomee-30 ristä anionisissa polymex-ointiolosuhteissa (esimerkiksi j etyleeni"imiinin polymerointi) tai pelkistämällä polyami- ! deita, joita on valmistettu polykondensoimalla dihappoja ! 4 diamiinien kanssa, tai vielä pelkistämällä imiineitä, joita on valmistettu polykondensoiraalla dialdehydej ä diamiinien kanssa. Toisaalta joitakin näistä polymeereistä on kaupallisesti saatavana, kuten etenkin PEI5ÖK tai PEX800K, 5 Jotta saataisiin keksinnön koostumuksen optimaali nen vaikutus, polymeerin ja nukleiinihapon suhteelliset osuudet on määritelty mieluiten niin, että molaarinen suhde polymeeri/nukleiinihapon fosfaatit on välillä 0,5 ja 50; erityisesti välillä 5 - 30. Erityisen edullisia tuloksia on 10 saatu käyttämällä 5 - 15 ekvivalenttia polymeerin amiinia nukleiininhapon varausta kohti. Tätä suhdetta voi alan ammattimies soveltaa käytetyn polymeerin, apuaineen läsnäolon (katso jäljempänä), nukleiinihapon, kohdesolun ja käytetyn annostuksen mukaan. Keksinnön mukaisissa koostumuksissa 15 nukleiinihappo voi yhtä hyvin olla deoksiribonukleiinihappo tai ribonukleiinihappo. Kyse voi olla luonnollista alkuperää olevista tai keinotekoisista sekvensseistä ja etenkin genomisen DNA: n., DNA:n, iuRNA:n, tRNArn, rRNArn sekvensseistä, hybridisekvensseistä tai synteettisistä tai puolisyn-20 teettisistä sekvensseistä. Lisäksi nukleiinihappo voi olla kooltaan hyvin vaihteleva öligönukieptidistä kromosomiin asti. Nämä nukleiinihapot voivat olla peräisin ihmisestä, eläimestä, kasvista, bakteerista, viruksesta jne. Niitä voidaan saada millä tahansa alan ammattimiehen tuntemalla 25 tekniikalla ja etenkin geenipankeista seulomalla, kemialli sella synteesillä tai vielä sekamenetelm.il lä, joihin kuuluu geenipankeista seulomalla saatujen sekvenssien kemiallinen tai entsomaattinen modifiointi. Ne voidaan vielä sisällyt- j tää vektoreihin, kuten plasmidivektoreihin.
30 Erityisesti deoksiribonukleiinihappoja koskien ne voivat olla yksöis- tai kaksoiskierteisiä. Näissä deoksiri-bonukleiinihapoissa voi olla terapeuttisia geenejä, trans- i kriptiota tai repiikaatiota sääteleviä sekvenssejä, anti-sens e- sekvenssejä, muiden solukomponenttien sitoutumisalu-35 eitä jne.
i 5
Keksinnön tarkoittamassa mielessä terapeuttisella geenillä tarkoitetaan etenkin kaikkia geenejä, jotka koo-äaavat proteiinituotteita, joilla on terapeuttinen vaiku tus. Mäin koodattu proteiinituote voi olla proteiini, pep~ 5 ti di jne. Tämä proteiinituote voi olla homologinen koh- desolun suhteen (eli tuote, joka normaalisti ekspressoituu kohdesolussa, kun se ei ole mitenkään sairas) . Tässä tapauksessa yhden proteiinin ekspressiolla voidaan esimerkiksi korjata vaillinainen ekspressio solussa tai inaktiivisen 10 tai heikosti aktiivisen proteiinin ekspressio modifikaation avulla tai vielä yliekspressoida mainittua proteiinia. Terapeuttinen geeni voi myös koodata solun proteiinin mutant-tia, jolla on parempi säilyvyys, modifioitu aktiivisuus jne. Proteiinituote voi olla myös heterologinen kohdesolun 15 suhteen. Siinä tapauksessa ekspressoitu proteiini voi esimerkiksi täydentää tai tuoda puuttuvaa aktiivisuutta soluun, jolloin se voi taistella tautia vastaan tai stimuloida immuunivastetta. Terapeuttinen geeni voi myös koodata organismin erittämää proteiinia.
20 Terapeuttisten tuotteiden joukosta voidaan mainita keksinnön tarkoittamassa mielessä erityisesti entsyymit, verituotteet, hormonit, lymfokiinit: interleukiinit, interferonit, TNF jne. (FR 9 203 120) , kasvutekijät, neurotransmit terit tai niiden prekursorit tai synteesientsyymit, kas-25 vutekijät; BDNF, CNTF, MGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, MT5, j HARP/pleiotrofiini jne.; apolipopfoteiinit: ApoAI, ApoAIV,
AppE jne. (FR 93 05 125), dystrofiini tai minidystrofiini (FR 9 111 947), CFTR-proteiini, joka liittyy mukoviskidoo- | siin, tuuinorisuppressorigeeiiit: p53, Rh, RaplA, DCC, k-rev '
30 jne. (FR 93 04 745), geenit, jotka koodaavat koagulaatioon I
liittyviä tekijöitä; Faktori VII, VIII, IX, geenit, jotka osallistuvat DNA:n korjaamiseen, its eraurhageeni t (tyrni-diinikinaasi, sytqSiinideaminaasi) jne.
Terapeuttinen geeni voi olla myös geeni tai an- i 35 tisense-sekvenssi, jonka ekspressio kohdesolussa mahdollis- i taa geenien ekspression tai solunsisäisen mKNA.-n transkrip- 6 tion kontrolloinnin. Tällaisia sekvenssejä voidaan esimerkiksi kopioida kohdesoluun sellulaarisen mRMA-n komplementaarisena ENA-na ja estää näin proteiinin translaatio EP-pa-tentissa nro 140 308 kuvatulla tekniikalla. Kyse voi olla 5 synteettisistä oligonukleotideista, joita on mahdollisesti modifioitu (EP 92 574). Antisense-sekvenssit sisältävät myös sekvenssejä, jotka, koodaavat ribotsyymejä, jotka pystyvät hajottamaan selektiivisesti kohteen RNA:ta (EP 321 201).
Kuten edellä on osoitettu, nukleiinihappo voi myös 1Ö sisältää yhden tai useampia geenejä, jotka koodaavat antigeenistä peptidiä, joka pystyy synnyttämään ihmisessä tai eläimessä immuunivasteen. Tässä erityisessä toteutustavassa keksinnön mukaisella koostumuksella voidaan siis tehdä joko rokotteita tai immuno t erapeuttis ia hoitoja ihmisellä tai 15 eläimellä, etenkin mikro-organismeja, viruksia tai syöpiä vastaan. Kyse voi olla etenkin Epstein Barr-viruksen, HTV-viruksen, hepatiitti B-viruksen (EP 185 573), pseudovesi-kauhuviruksen spesifisistä antigeenisistä peptideistä tai vielä tuumorispesifisistä peptideistä (EP 259 212).
2Ö Nukleiinihappo sisältää myös mieluiten sekvenssejä, joilla voidaan ekspressoida terapeutti s ta geeniä ja/tai geeniä, joka koodaa halutun elimen tai solun antigeenistä peptidiä. Voi olla kyse sekvensseistä, jotka luonnostaan vastaavat halutun geenin ekspressiosta, kun nämä sekvenssit 25 altistuvat toimimaan infektoidussa solussa. Kyse voi olla myös alkuperältään erilaisista sekvensseistä (jotka vastaavat muiden tai jopa synteettisten proteiinien ekspressiosta) . Voi olla kyse etenkin, eukarioottien tai virusten pro-moottorisekvensseistä. Esimerkiksi kyse voi olla promootto-30 risekvensseistä, jotka ovat peräisin sen solun genomista, i joka halutaan infektoidu. Lisäksi voi olla kyse promootio- j risekvensseistä, jotka ovat peräisin viruksen genomista.
Tässä mielessä voidaan mainita esimerkiksi ElA-, MLP-, CMV-, RSV- jne, geenien promoottorit. Lisäksi näitä eks-35 pressiosekvenssejä voidaan modifioida lisäämällä aktivaa- i i 7 tio-, säätelysekvenssejä tai sekvenssejä, joilla saadaan aikaan kudosspesifineh ekspressio.
Toisaalta nukleiinihappo voi myös sisältää erityisesti terapeuttisen geenin edessä signaalisekvenssin, joka 5 ohjaa syntetisoidun terapeuttisen yhdisteen kohdesolun eri-·· tysreiteille. Tämä signaali-sekvenssi voi olla terapeuttisen tuotteen luonnollinen signaalisekvenssi, mutta kyse voi olla myös mistä tahansa muusta, funktionaalisesta signaalise-kvenssistä tai keinotekoisesta signaalisekvenssistä.
10 Toisaalta vielä nukleiinihappo voi sisältöä myös erityisesti terapeuttisen geenin edessä signaalisekvenssin;, joka ohjaa syntetisoidun terapeuttisen yhdisteen haluttuiin solun osaan, kuten tumaan lokalisoivan sekvenssin.
Keksinnön mukaisia koostumuksia voidaan käyttää 15 sellaisenaan tai yhdessä muiden yhdisteiden kanssa. Siten eräässä erityisessä toteutustavassa tämän keksinnön mukaiset koostumukset sisältävät lisäksi apuainetta, joka pystyy yhdistymään polymeeri/nukleiinihappo-kompleksiin ja parantamaan sen transfektiokykyä * Keksijä on itse asiassa osoitta-20 nut, että keksinnön yhdisteiden transfektointikykyä voidaan vielä parantaa, kun läsnä on tiettyjä apuaineita (esimerkiksi lipidejä, proteiineja, lipopolyamiineita, syöteettisiä polymeerejä), jotka pystyvät yhdistymään 1ipopolyami i-ni/nukleiinihappokompleksiin. Kuten tämän hakemuksen esi-25 merkeissä osoitetaan, tämä paraneminen ilmenee yhtä hyvin in vitro kuin in vivo.
Keksinnön koostumuksissa mieluiten käytetyt apuai- \ neet ovat katiönisia lipidejä (joissa on yksi tai useampia i kationisia varauksia polaarisessa osassaan) tai neutraalei-30 ta lipideitä.
Kationisten lipidien kohdalla kyseeseen voivat tulla i erityisesti 1ipopolyamiinit eli mikä tahansa amfifiilinen aine, joka sisältää ainakin yhden hydrofiilisen polyamiini-kohdan ja yhden lipofiilisen kohdan, jotka ovat kovalentti-35 sesti sitoutuneet toisiinsa kemiallisen ketjun välityksellä. ;
Keksinnön piirissä käytettyjen lipopolyamiinien polyamiini- 8 kohta vastaa edullisesti yleistä kaavaa H2N- (- {CH)m-NH-) i-H, jossa m on kokonaisluku, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 2, ja 1 on kokonaisluku, joka on suurempi tai. yhtä suuri kuin 1(; m voi vaihdella kahden amiinin väliin sijoit-5 tuvien erilaisten hiiliryhmien mukaan. Mieluiten m oh välillä 2-6 mainitut luvut mukaan lukien ja 1 on välillä 1 - 5 mainitut luvut mukaan lukien. Vielä aivan erityisesti polyamiinikohtaa edustaa spermiini tai spermiinin analogi, joka on säilyttänyt DMA·n sitomiskykynsä.
10 Lipofiilinen kohta voi olla yksi tai useampi tyy dyttynyt tai tyydyttymätön hiiliketju, kolesteroli, luonnon lipidi tai synteettinen lipidi, joka pystyy muodostamaan lamelli- tai lieksagonaalisia faaseja.
Tämän keksinnön piirissä käytetään edullisesti li-15 popolyamiineifca sellaisina kuin ne määritelty EP-patent-tihakemuksessa nro 394 111. Tämä hakemus kuvaa myös menetelmää, joka olisi käyttökelpoinen valmistettaessa näitä li-popoiyamiinei ta. Erityisen edullisella tavalla keksinnön piirissä käytetään dioktadekyyliamidoglysyylispermiinia 2.0 {DOGS) tai palmitoyylifosfatidyyliatanoliamiini-5-karboksi- spermyyliamidia (DPPES),
Muita erityisen hyviä apuaineita keksinnön mukaisten koostumusten toteuttamiseksi edustavat neutraalit lipidit . Neutraalien lipidien käyttö on erityisen edullista, 25 kun varaussuhde R (amiinit/fosfaatitj on pieni. Erityisesti keksinnön piirissä käytetyt neutraalit lipidit ovat 2 ras-vahappoketjua sisältäviä lipideitä.
Erityisen edullisella tavalla käytetään luonnollisia tai synteettisiä, fysiologisissa olosuhteissa zwitter-30 ionisia tai ionivarauksettornia lipideitä. Siksi voidaan ! erityisesti valita dioleyylifosfatidyylietanoliamiini | (DOPE), oleyylipalmitoyylifosfatiäyylietanoliainiini (POPE), distearoyyli-, -palmitoyyli-, -myristoyylifosfatidyylieta- j noliamiini sekä niiden 1-3 kertaa N-metyloituja johdan-35 naisia; fosfatidyyliglyseroleja, diasyyliglyseroleja, gly- kosyylidiasyyliglyseroleja, serebrosideja (kuten etenkin 9 galakfcoserebrosideja), sfingplipideitä (kuten etenkin s f in-gomyeliinejä) tai vielä asialogangliosideja (kuten etenkin asialoGMl ja GM2).
Näitä erilaisia lipidejä voidaan valmistaa joko 5 synteettisesti tai uuttamalla elimistä (esimerkiksi aivoista) tai kananmunista alan ammattimiehen hyvin tuntemilla klassisilla tekniikoilla. Erityisesti luonnolliset lipidit voidaan uuttaa orgaanisilla liuottimilla (katso myös Leh-ninger, Biochemistry).
10 Keksinnön koostumukset sisältävät mieluiten kati oni s en polymeerin lisäksi edellä mainituissa suhteissa 0,1 - 20 moolia apuainetta 1 moolia kohti nukleiinihapon fosfaattia ja mieluiten 1-5.
Eräässä erityisen edullisessa toteutustavassa tämän 15 keksinnön koostumukset sisältävät tunnisteosan, jonka avulla nukleiinihapon siirtoa voida.an ohjata. Tämä tunnisteosa voi olla ekstrasellulaarinen tunnisteosa, jonka avulla nukleiinihapon siirto voidaan kohdistaa haluttuihin tietyntyyppisiin soluihin tai kudoksiin (tuumorisolut, maksasolut, 20 hematopoieettiset solut jne.). Voi olla kyse myös intrasel-lulaarisesta tunnisteosasta, jonka avulla nukleiinihapon siirto voidaan ohjata haluttuihin solun osiin (mitokondri-ot, tuma jne.),
Aivan erityisesti tunnisteosa on sitoutunut kova-25 lenttis.es ti tai ei - koval ent t i ses t i kaavan (I) mukaiseen po lymeeriin. Sidos voidaan saada aikaan etenkin ioni-interaktiolla ammoniumien kanssa tai polymeerin amiiinien nukleo-fiilisellä hyökkäyksellä tunnisteosaan, joka sisältää nuk-leofobisen ryhmän (halogeeni, tosvlaatti jne.), aktivoidun 30 esterin (hydroksisUkkinimidi jne,) tai vielä isotiosyanaa-tin. Tunnisteosa voi olla myös sitoutunut nukleiinihappoon.
Keksinnön piirissä käyttökelpoisista tunnisteosista voidaan mainita sokerit, peptidit, oligonukleotidit tai lipidit. Mieluiten on kyse sokereista ja./tai peptideistä, ku-35 ten vasta-aineista tai vasta-ainefragmenteista., solujen reseptorien ligandeista tai niiden fragmenteista, reseptoreis- ( 10.
ta tai reseptorien fragmenteista jne. Erityisesti voi olla kyse kasvutekijöiden reseptorien l.igandeista., sytokiinien reseptoreista, sellulaarisista lektiinien reseptoreista tai adhees iopro t ei inien reseptoreista. Voidaan myös mainita 5 trans f erri inin, HDLrien ja LDL:ien reseptorit. Tunnisteosa voi olla myös sokeri, jonka avulla tunnistetaan asialoglyko-proteiinireseptorit tai vielä vasta-aineen Fäb-fragment ti, jonka avulla tunnistetaan immunoglobuliinien Fc-fragmentin reseptori.
10 Keksinnön koostumukset voidaan formuloida ulkoista, ihonalaista, oraalista, rektaalista, vaginaalista, parente-raalista, intranasaalista, suonensisäistä, lihaksensisäistä, subkutaanista, intraökulaarista, transdermistä jne. annostusta varten. Keksinnön farmaseuttiset koostumukset si-15 sältävät mieluiten farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa inj ektiotarkoituksiin etenkin suoraan inj ektoitavaksi haluttuun elimeen tai annosteltavaksi ulkoisesti (iholle ja/tai limakalvolle). Kyse voi olla erityisesti steriileistä isotonisista liuoksista tai kuivista, etenkin lyofili-20 soiduista koostumuksista, jotka steriilin veden tai fysiologisen suolaliuoksen lisäyksellä voidaan rekonstituoida injektoitavaksi liuokseksi. Injektointiin käytetyt nukle-iinihappoannokset sekä annostusten lukumäärä voidaan sovittaa erilaisten tekijöiden mukaan, etenkin annostus tavan, 25 hoidettavan taudin, ekspres s o itävän geenin tai vielä halutun hoidon keston mukaan.
Kuten edellä on esitetty keksinnön koostumuksia voidaan käyttää nukleiinihappojen siirtämiseen soluihin in vitro. Esimerkit osoittavat erityisesti, että keksinnön 30 kationisia polymeerejä voidaan käyttää siirtämään tehokkaalla tavalla nukleiinihappoja lukuisiin erityyppisiin soluihin ja erityisesti tietyntyyppisiin soluihin, jotka on tavallisesti vaikea transfektoida. Testatuista solutyypeistä voidaan mainita etenkin fibroblastic, maksasolut, karsi-35 noomasolut, munuaissolut ja neuronit. Lisäksi jäljempänä esitetyt esimerkit kuvaavat myös keksinnön polymeerien te- il hakkuutta geenien siirrossa in vivo. Keksinnön vektoreilla saadut tulokset ovat selvästi parempia kuin samoissa olosuhteissa muilla transfektiovektorei11a saadut tulokset, ja He osoittavat keksinnön koostumusten paremmat käyttömahdol-5 lisuudet.
Tässä hakemuksessa kuvataan menetelmä hoitaa sairauksia, joissa mainitun sairauden korjaamiseksi annetaan nukleiinihappoa in vivo sekoitettuna kationiseen polymeeriin.
Tämä menetelmä sopii aivan erityisesti sairauksiin, jotka 10 johtuvat proteiini- tai nukleiinihappotuotteen puutteesta, ja annettu nukleiinihappo koodaa mainittua proteiinia tai sisältää mainittua nukleiinihappoa.
Keksinnön farmaseuttiset koostumukset sisältävät siis erityisen edulliset välineet nukleiinihappojen antaini- 15 seksi ja siirtämiseksi in vivo.
Tätä keksintöä kuvataan täydellisemmin seuraavissa esimerkeissä, joita on pidettävä selventävinä eikä rajoittavina .
Kuvioiden tekstit 20 Kuvio 1: PEl8QQKm trans f aktion tehokkuus pH 7:ssä suhteen R (polymeerin amiinit/nukleiinihapon fosfaatit) funktiona.
Kuvio 2: PEI800K:n transfektion tehokkuus pH 6:ssa DNA-määrän funktiona.
25 Kuvio 3: PEl800K:.n transfektion tehokkuus pH 6:ssa suhteen R funktiona.
Kuvio 4: PElSQOKm transfektion tehokkuus pH: n funktiona.
Kuvio 5: PEl80QK:n ja polylysiinin vertailu.
30 Kuvio 6: PEI50K:n sytotoksisuuskoe. :
Kuvio 7: PEl50K:n transfektion tehokkuus apuainei den läsnä ollessa.
Kuvio 8: PEIm tehokkuus HeLa-solujen transfektoin- nissa.
35 Kuvio 9: PEIm tehokkuus maksa- ja munuaissolujen transfektoinnissa.
12
Kuvio 10: PE1:n tehokkuus plasmidisen DNA:n siirtämisessä sikiön neuroneihin.
Kuvio 11: PEItn teholckuus oligonukleotidien siirtämisessä sikiön neuroneihin.
\ 5 Kuvio 12: PEIm tehokkuus DNA:.n siirtämisessä in vivo.
Esimerkki 1
Plasmiäit, joita käytetään, geenien siirtämisessä in vivo 10 Kolmentyyppisiä konstruktioita on käytetty todista maan keksinnön koostumusten aktiivisuus: plasmideja, jotka sisältävät lusiferaasia koodaavan geenin (Luc), plasmideja, jotka sisältävät geenin, joka koodaa β-galaktosidaasia.
(LacZ-geeni), ja plasmideja, jotka sisältävät geenin, joka.
15 koodaa kloramfenikoliasetyylitr&nsferaasia (CAT).
1.1 Plasmidit, jotka sisältävät Luc-geenin PCMV-lue-plasmidi sisältää cytomegaloviruksen (CMV) promoottorin, joka on irrotettu plasmidivektorista pcDNA3 (Invitrogen) katkaisemalla restriktioentsyymeillä Miu I ja 20 Hindi!I, jotka sijoittuvat lusiferaasia koodaavan geenin eteen ja joka on insertoitu MluI- ja HindllX-kohtiin pGL basic Vector -vektorissa (Promega).
pGL2-Luc-plasmidi on kaupallinen (Promgega).
T3RE-Luc-plasmidi sisältää synteettistä Gligonukle-25 otidia, joka vastaa sekvenssiltään kilpirauhashormonin symmetristä vaste-elementtiä (Glass et ai., Cell 56 (1989) 697) .
1.2 Plasmiäit, jotka sisältävät LacZ-geenin
Plasmidi pCMV-fi-Gal (Clontech) sisältää CMV-pro-30 moottorin, joka sijaitsee LacZ-geenin edessä, joka koodaa Escherichia colin β-galaktosidaasia. Vektori pSV-nls LacZ (pAOnlsLacZ) sisältää saman promoottorin, tumalokalisaa-tiosekvenssin (peräin SViÖ-viruksesta), joka sijaitsee LacZ-geenin edessä ja samassa faasissa. Tällä konstruktiol-35 la voidaan ekspressoida nls-fi-galaktosidaasi-fuusioproteii- 13 nia solujen tiimassa (ks. De Luze et ai., PNAS 90 (1993) 7322) .
1.3 Plasmiäit, jotka sisältävät CAT-geenin
Plasmiäit, jotka sisältävät siirtäjägeeninä geenin, \ 5 joka koodaa kloramfenikoliasetyylitransferaasia (CAT) RSV-proraoottorien (pRSV-CAT) ja SV40 (pSV40-CAT) kontrollin alaisena, on julkaistu (Boutill.ier et ai., Prog. Neuro-PhycoPharmacol. et Bi.ol. Psycliiat. 16 (1992) 959; de Luze et ai., PNAS 90 (1993) 7322;.
10 Esimerkki 2
Nukleiinihappojen siirto £ibroblasteihin Tämä esimerkki kuvaa plasmidin pGL2-Luc siirtoa 3T3 - f ibroblas teihin 800 000 Da:n polyetyleeni-imiinin avulla.
15 Koejärjestely: Valmistetaan liuos, jossa on 5,375 μΜ PEI 800 K, ja pH säädetään 7:ään 1 N kioorivetyhappoliuok-sen avulla. Tätä liuosta käytetään geeninsiirtokokeisiin.
Transfektion koejärjestely: 3T3-fibroblastit siir ros tetaan 24 kuopan levyille 24 tuntia ennen transfektiota 20 (50 000 solua/kuoppa) . Ne transfektoidaan 2 pg: 11a pGL2~
Luc-plasmidia kuoppaa kohti seuraavan protokollan mukaisesti: 2 μg plasmidia ja eri tilavuudet 5,375 μΜ PEI 800 K-liuosta (halutussa varausekvivalenttien suhteessa) lai-25 mennetaan erikseen 50 μΐ:aan 150 mM NaCl ja sekoitetaan. 10 minuutin kuluttua molemmat liuokset yhdistetään ja homogenisoidaan . Uuden 10 minuutin inkubaation jälkeen lisätään j 900 μΐ DMEM. Näin saatu liuos homogenisoidaan ja 10 minuutin kuluttua se annostellaan soluille, jotka sitä ennen on 30 pesty DMEM:llä ilman seerumia. 2 tunnin transfektion jälkeen lisätään kuhunkin kuoppaan 100 μΐ FCS (fetaalista va- j sikan seerumia) . Ekspressio pysäytetään 24 tuntia tämän jälkeen.
Lusiferaasin määritys. Tätä varten supernatanttia 35 inkuboidaan puskurin kanssa, joka sisältää lusiferiinia, koentsyymi A:ta ja ATP:tä ja emittoitunut valo (yleensä 10 j 14 sekunnin aikana) mitataan luminometrillä {Wood K. (1990) Ffomega Notes, 28).
Saadut tulokset on esitetty kuviossa 1. Me osoittavat, että plasmidi pGL2-Luc voidaan siirtää EEI:llä tehok-5 kaasti fibroblasteihin. Ne osoittavat myös, että aktiivisuus suhteellisina valoyksiköinä (RLU - "relative light unit") on erityisen hyvä, kun käytetään 5 — 20 ekvivalenttia PEi:n amiineita DNA:n fosfaatteja kohti. Kontrolliko-keessa pelkkä plasmidi antaa noin 100 RLU:n signaalin.
10 Esimerkki 3 DNA tn määrän vaikutus trans f ekt i on tehokkuuteen Tämä esimerkki kuvaa nukleiinihapon määrän vaikutusta siirron tehokkuuteen 3T3 fibroblasteissa PEl800K:lla.
3T3-fibroblastit siirrostetaan 24 kuopan levyille 15 24 tuntia emien transfektiota (50 000 solua/kuoppa). Ne tx'ansfektoidaan kasvavilla määrillä plasmidia pCMV-Luc kuoppaa kohti ja väkiovaraussuhteella (9 ekvivalenttia) edellä kuvatun protokollan mukaisesti. Kahdessa kohdassa käytetty plasmidimäärä 2 pg kuoppaa kohti korvattiin pläs-20 midilla pGEM (PRpMEGA), joka ei sisältänyt tutkittavaa geeniä. 3 tunnin transfektion jälkeen 100 μΐ FCS lisättiin kuhunkin kuoppaan. Ekspressio pysäytettiin 24 tunnin kuluttua.
Saadut tulokset on esitetty kuviossa 2.
25: Transfektion tehokkuus kasvaa käytetyn plasmid.imää- rän mukaan transfektion aikana. Ei-translatoidun kantaja-DNA:n (pGEM) lisäys ei vaikuta transfektioon.
Esimerkki 4
Nukleiinihappojen siirto fibroblasteihin; amiini/ 30 fosfaatti-suhteen vaikutuksen tutkiminen Tämä esimerkki kuvaa nukleiinihappojen siirtoa fibroblas teihin pH 6:ssa keksinnön mukaisen koostumuksen avulla, joka sisältää nukleiinihappoa ja PEI800K eri suhteissa R (amiinit/fosfaatit).
15
Koejärjestely: 'Valmistetaan liuos, jossa on 5,375 μΜ PEI 800 K, ja pH säädetään 6 r een 1 N kloorivetyhappo 1 iuok-sen avulla.: Tätä liuosta käytetään geeninsiirtokokeisiin.
3T3-fibroblastit ympätään 24 kuopan levyille 18 v 5 tuntia ennen transfektiota (50 000 solua/kuoppa). Ne trans-fektoidaan 2 pg:11a pGL2-Luc-plasmidia esimerkissä 2 kuvatun protokollan mukaisesti.
Saadut tulokset on esitetty kuviossa 3. Ne osoittavat:, että keksinnön koostumukset ovat erityisen tehokkaita 10 koko R-suhteiden skaalalla 6 - 22,
Esimerkki 5
Trans f ekt ion tehokkuus pH; n funktiona Tämä esimerkki kuvaa nukleiinihappojen siirtoa fib-.roblas teihin keksinnön mukaisen koostumuksen avulla, joka 15 sisältää nukleiinihappoa ja PEI 800K eri pH-olosuhteissa.
Käytetty protokolla on identtinen esimerkissä käytetyn kanssa. Säädetään pH lisäämällä IN kloorivetyhappoa.
Saadut tulokset on esitetty kuviossa 4. Ne osoittavat, että keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää eri 20 pH:issa ja etenkin fysiologisella pH-alueella (pH 5-8).
Esimerkki € PEIm ja polylysiinin transfektion tehokkuuden vertailu Tämä esimerkki kuvaa vertailevia tuloksia, jotka on 25 saatu keksinnön mukaisella koostumuksella ja toisella kat-ioni.sella polymeerillä, polylysiinillä, nukleiinihappojen siirrossa fibroblasteihin.
Koejärjestely: Tässä kokeessa käytetty polylysiini (PPL) on polylysiini, HBr, jonka keskimääräinen molekyyli-· 30 paino on 50 K. Klorokiinin lopullinen kons entraat io on 100 μΜ. PEI on pH 6:ssa,
Koejärjestely: 3;T3 -f ibroblas ti t ympätään 24 kuopan levyille 18 tuntia ennen trans f ekt iota (50 000 so lua/kuoppa) . Ne transfektoidaan pCMV-Lue-plasmidilla esi-35 merkissä 2 kuvatun protokollan mukaisesti. Nämä solut, jot- i ka on transfektoitu PPL:llä klorokiinin läsnä ollessa, pes- 16 tään 2 tunnin kuluttua ja pannaan kasvatus-nesteeseen, jossa on 10% seerumia. Ekspressio pysäytetään 24 tunnin kuluttua.
Saadut tulokset on esitetty kuviossa 5. Ne osoittavat selvästi, että keksinnön mukaisilla koostumuksilla voi-.
5 daan siirtää nukleiinihappoja fibroblasteihin tehokkuudella, joka on selvästi suurempi kuin entisillä kationisilla polymeerivektorei11a, kuten polylysiinillä.
Esimerkki 7 NIH 3T3 fibroblastien. trans £ ekt ion tehokkuuden ver- 1.0 tailu mx SQKsn ja PEI 800K;n välillä Tämä esimerkki kuvaa näiden kahden PEI-polymeerin (PEI 5ÖK; ja PEI 180K) vertailua ja käyttöä nukleiinihappojen siirrossa soluihin.
Koejärjestely: Solut siirrostetaan 24 tuntia ennen 15 transfektiota 50 000 solulla 16 mmm kuoppaa kohti. Ne transfektoidaan pCMV Luc-plasmidilla, joka on kömpieksoitu PEI:n kanssa, Mplaarinen ekvivalenttisuhde PEI-amiini^/nukleiinihapon fosfaatti vaihtelee 6-45 ekvivalenttiin. Kuhunkin kuoppaan laimennetaan erikseen PEI ja 2 pg DNA:ta 20 50 μΐ:aan NaCl (150 mM) . Sitten liuokset sekoitetaan, sit ten ne homogenisoidaan. 10 minuutin kuluttua tämä tilavuus lisätään soluille. 24 tunnin kuluttua solut hajotetaan, ly-saätti sentrifugoidaan ja supernatantti käytetään lusife-raasi-aktiivisuuden mittaamiseen. Proteiinimääritys suori-25 tetaan tämän supernatantin näytteestä BCA-testillä. LUsife- j raasiäktiivisuus ilmaistaan valoyksikköinä (RLU) /10. sekunnissa hajoamisia/mg proteiinia.
j { 17
Saadut tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa.
R O S ekv. 9 eky. 18 ekv. 45 ekv.
...............................—..........." · 1 ' ........... ..................................... "............... ' ............. \ SEI 50K 7 100 11 0.00 750 000 12 000 000 2 450 000 HLU/lDs/sigr prot ΒΕΙ 8O0K 6 253 200 000 16 700 000 5 .550 000 525 000
HliU/lOs/mg prot Nämä tulokset osoittavat selvästi» että PEI SOK:11a 5 on yhtä edulliset trans f ek to ivat ominaisuudet kuin ΡΕΪ 80OK:11a.
Esimerkki 8 PEIsu syfcotoksisuusfcesti
Halusimme tutkia PEI 50K:n mahdollista sytotoksi-10 suutta NIH3T3-f Ibrobläs teillä., Tähän kokeeseen valitsimme MTT-testin, jolla voidaan arvioida solujen kyky pelkistää MTT tetratsolium MTT formatsaaniksi mitpkondriaalisella entsyymillä, sukkinaat tidehydrogenaasi11a. Transfektiopro-tokolla on sama kuin esimerkissä 7 (DNÄ-määrä kuoppaa kohti i.S pysyy vakiona (2 pg), PEI:n amiinien/PWA:n fosfaattien mo-laaristen ekvalenttien määrä vaihtelee S - 24) . 24 tunnin transfektion jälkeen solut pestään kolme kertaa PBS:llä, inkuboidaan sitten 90 minuuttia 0,05 mg/rnl MTT: ä. Tämän in-kubaation loputtua solujen kasvatusneste poistetaan, solut 20 pestään kolme kertaa PBS:llä, liuotetaan sitten 1 ml:aan 10% SDS 10 minuutin ajan. Näytteiden optinen tiheys luetaan 540 nra:ssä.
Tulokset on esitetty kuviossa 6, Ne osoittavat, että kokeemme olosuhteissa PEI 5OK ei aiheuta merkittävää so-25 lukuolemaa NIH 3T3 fibroblasteissa.
Esimerkki 9
Apuaineen käyttö fcransfektiokyvyn parantamiseksi
Tämä esimerkki kuvaa keksinnön mukaisten koostumus- I
ten käyttöä, jotka, koostumukset sisältävät kationista poly- 18 raeeriä ja apuainetta. Käytetty apuaine on joko neutraali lipidi (DOPE) tai 1 ipopolyamiini (DOGS) .
Koejärjestely: DOPEn lisäys:
Tutkittiin neljää PEI:n amiini/DNA:n fosfaatti mo-5 laaristen ekvivalenttien suhdetta: 6, 9, 18 ja 21. Kuhunkin kuoppaan lisätään 12 nanomoolia DOPEa PEI:n ja DNA:n seokseen. Tätä liuosta käytetään sitten transfektointiin kuten esimerkissä 7 kuvataan.
DOGSin lisäys: Kuhunkin kuoppaan lisätään 4 molaa-10 rista ekvivalenttia DOGSin amiinia/DNA:n fosfaattia (eli 6 nanomoolia DOGSia 6 nanomoolia kohti fosfaattia) PEI-liuokseen ennen DNA:n kompleksointivaihetta. Transfektio suoritetaan sitten kuten esimerkissä 7 kuvataan.
Saadut tulokset on esitetty kuviossa 7. Ne osoitta-15 vat Selvästi, että DOPE;n tai DOGS:n lisäys voi vielä parantaa transfektion ominaisuuksia etenkin PEI: n amii-nit/DNA:n fosfaatit-suhteen pieninä molaarisinä ekvivalaitteina.
Esimerkki 10 20 Geeninsiirto Hela-soluihin Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukaisia koostumuksia voidaan käyttää geenien siirtoon erityyppisissä soluissa ja etenkin kohtusyövän Hela-soluissa.
Koejärjestely: Hela-solut siirrostetaan 24 tuntia 25 ennen trans f ektiota 50 00.0 solulla 16 mm:n kuoppaa kohti.
Ne transfektoidaan pCMV Luc-plasmidilla, joka on komplek-soitu joko PEI:n kanssa tai 1 ipopolyamiinin kanssa (DOGS) .
Tutkitaan neljää PEI 5QK:n tai PEI 18OK:n amiini/DNA:n fosfaatti molaarista ekvivalenttisuhdetta: 6, 9, 18, 21. Lipo-30 polyamiinia käytetään 8 molaarista ekvivalenttia arnii- ! nia/fosfaatti (12 nanomoolia DOGS:a).
Saadut tulokset on esitetty taulukossa 8. Ne osoit- !
tavat selvästi, että keksinnön koostumukset, jotka sisältävät kationista polymeeriä, joka on mahdollisesti sekoitettu 35 apuaineeseen, voivat transfektoidä Hela-soluja paljon te- I
19 hokkaammin kuin entiset systeemit (etenkin 1ipopolyamiini, DOGS)..
Esimerkki 11
Geeninsiirto erityyppisiin soluihin > 5 Tämä esimerkki osoittaa vielä, että keksinnön mu kaisia koostumuksia voidaan käyttää geenien siirtämiseen hyvin erityyppisiin soluihin, kuten fibroblasteihin, koh-tusyövän soluihin, hepasytoomasoluihin ja munuaissoluihin.
Tämä esimerkki kuvaa aivan erityisesti transfektiota 10 HepG2~, K 562-soluihin ja kanin sileiden lihasten primääristen solujen viljelmissä PEIillä, jota on 9 varausekvivalenttia ja pH 6:ssa.
HepG 2-solut siirrostetaan 24 kuopan levyille 24 tuntia ennen transfektiota (50 000 solua kuoppaa kohti), Ne 15 trans fektoidaan pCMV-Luc-plasmidilla esimerkissä 2 kuvatun protokollan mukaisesti. 4 tunnin kuluttua transfektiosta lisätään 100 μΐ FCS-seerumia kuoppaa kohti. Ekspressio pysäytetään 30 tunnin kuluttua.
K 562 -solut siirrostetaan 24 kuopan levyille 20 0,5 ml:aan RPMI-ravintonestettä ilman seerumia tuntia ennen
transfektiota. Ne transfektpidean pGMV-Lue-plasmidillä seu-raavan protokollan mukaan: haluttu plasmidimäärä ja PEI
laimennetaan erikseen 50 μΐ:aan 150 mM NaCl ja sekoitetaan.
1.0 minuutin kuluttua nämä kaksi liuosta yhdistetään ja ho-25 mogenisoidaan. Seuraavien 10 minuutin kuluttua lisätään 400 μΐ RPMI: tä. Näin saatu liuos homogenisoidaan ja 10 minuutin kuluttua se annostellaan soluille. 4 tunnin trans-fektion jälkeen kuoppiin lisätään 100 μΐ FCS-seerumia. Ekspressio pysäytetään 30 tunnin kuluttua.
30 Kanin sileän lihaksen primääriviljelmät v&lmistet- | tiin kuten Fallier-Becker ovat kuvanneet. Solut transfektoidaan sitten joko 1 μρ:11β tai 2 μ:11a PCMV-huc-plas-midiä, joka on kömpi eks o itu PEI: n kanssa (protokollan mukaisesti, joka on kuvattu esimerkissä 7). Dusiferaasin eks-35 pressio pysäytetään 24 tai 48 tunnin kuluttua transfektios-ta.
20
Saadut tulokset on kuvattu kuviossa 9. Ne osoittavat selvästi, että keksinnön mukaisilla koostumuksilla voidaan saada aikaan hyvin erilaisten solutyyppien tehokas transfektio.
5 Esimerkki 12
Plasmidisen DN&jn siirto sikiön neuronien primääri-viljelmiin: biologisen aktiivisuuden osoittaminen
Primääriset neuroniviljelmät on valmistettu kuten Lezoualch et ai, ovat kuvanneet. 36 tunnin kuluttua vil-10 jelmät transfektoitiin 2 pg:lla TRE-Luc-plasmidia (joka sisältää Luc-gecnin, jota säätelee kilpirauhashormonin T3 vastakohtaa) ja 0,5 pg kantaja-DNA:ta kuoppaa kohti.
Tutkittiin kahta koe-olosuhdetta:
- 9 ekvivalenttia amiineita suhteessa fosfaattei-15 hin: 1 pg plasmidia lisättiin 2,28 pitsan PEl8QQK:n 100 mM
vesi1iuosta, pH 7, - 13 ekvivalenttia amiineita. suhteessa fosfaattei-hin: 1 pg plasmidia lisättiin .3,33 pltaan 100 mM PEl800K:n vesiliuosta, pH 7, 20 Ennen kompleksointia plasmidi laimennettiin 50 plrlla 150 xriM NaCl ja PEI 1 aimennettiin myös toiseen 50 pltaan 150 mM NaCl. Sitten liuokset sekoitettiin ja annosteltiin solujen päälle 1 tunnin ajaksi. Sitten transtek-tioliuos poistettiin ja korvattiin tuoreella viljelynes-25 teellä ilman T3 tai sen kanssa (1 nM) , 24 tunnin kuluttua solut hajotettiin, lysaatti sentrifugoitiin ja supernatenttiä käytettiin lusiferaasiaktiivisuuöen määrittämiseen.
Saadut tulokset on esitetty kuviossa 10. Ne osoittavat selvästi, että keksinnön koostumuksilla voidaan siir-30 tää DNA:ta neuronisoluihin ja että näin siirretty DNA on funktionaalista, koska sen aktiivisuus lisääntyy T3;n läsnä i ollessa. Kontrollikoe suoritettiin pelkän plasmidin läsnä j ollessa eikä minkäänlaista lusiferaasiaktiivisuutta havaittu.
21
Esimerkki 13
Antisense oligonukleotidien siirto sikiön neuronien primäarivilj elmään
Kokeet on suoritettu neuronien primääriviljäimissä, 5 jotka on valmistettu kuten esimerkissä 12 kuvataan. 36 tunnin kuluttua viljelmät trans f ek t o i t i in 2 μΜ 18mer antisen-se-oligonukleotidillä (PISTO) , joka oli kompleksoitu 9 amii-niekvivalenti 11a PEl800K:n fosfaatfceihin nähden.
Käytetty DNO oli kohdistettu geeni alueeseen, joka 10 koodasi kilpirauhashormonien alfareseptoria. Sen sekvenssi on seuraava: 5’-GCTGGGCTTCTGTTCCAT-3’ 15 Seuraavia yhdisteitä käytettiin 4 kuoppaan, joissa oli 250 μΐ ravintonestettä: - 8 μΐ 0,25 mM DNO-liuos ta laimennettuna 10 μΐ :aan 150 mM NaCl ja - 20,8 μΐ 12 mM PEI80OK-vesi 1 iuosta pH 7, joka on 20 sitä ennen laimennettu 51,2 ulilla 150 mM NaCl.
Sitten liuokset sekoitettiin ja 20 μΐ seosta annettiin soluille 45 minuutin ajaksi. Sitten transfektioliuos poistettiin ja korvattiin tuoreella kasvatusnesteellä, Sitten solut fiksattiin 4 % paraformaldehydiliuoksessa, huuh-25 deltiin, pantiin Mowioliin ja tutkittiin fluoresenssimikro- I
skoopilla.
Saadut tulokset on esitetty kuviossa 11, Ne osoittavat selvästi, että keksinnön mukaisilla yhdisteillä voidaan siirtää äntisense oligonukleotideja neuronisoluihin. j 30 Kontrollikoe suoritettiin pelkän oligomikleotidin läsnä oi- j lessa, eikä havaittu minkäänlaista fluoresenssia.
Esimerkki 14 i
Keksinnön yhdisteiden käyttö nukleiinihappojen siirtämiseen in vivo vastasyntyneiden hiirten aivoissa 35 Tämä esimerkki kuvaa plasmidin pCMV-Luc siirtoa in | vivo vastasyntyneen hiiren aivoihin. Se osoittaa keksinnön 22 mukaisten yhdisteiden erityisen edulliset ominaisuudet etenkin geeniterapiaan sovellettuna.
30 pg pCMV-LuG-plasmidia (7,5 μΐ kantaliuosta, jonka konsentraatio on 4 ug/ml) laimennettiin 22,5 μΐtaan 5 % 5 steriiliä glukoosia (lopullinen kpnsentraatiö 1 pg/μΐ). Sitten lisättiin 8,5 μί 100 mM ΡΞΙ800Κ (valmistettu veteen ja puskuroitu pH 6,9;ään}. Näin saatu koostumus sisältää siis 9 ekvivalenttia amiinia fosfaattien suhteen.
Seos vorteksoitiin nopeasti, ja sitä käytettiin 10 vastasyntyneiden hiirten aivoihin annettuihin injektioihin..
Tätä varten hiiret Oli nukutettu kylmyydellä (asettamalla alumiinilevylle, joka on kosketuksissa jäähän), sitten 2 pl seosta (2 pg nukleiinihappoa) injektoitiin hiirtä kohti, injektiot suoritettiin aivokuoreen mikromanipulaattorin ja 15 mikroruiskun avulla, jotka oli kytketty mikroelektrodiin...
Aivot poistettiin 48 tuntia myöhemmin, homogenisoitiin, sentrifugoitiin ja supernatanttia käytettiin lusife-raasimääritykseen. Sitä varten supernatanttia inkuboitiin puskurin läsnä ollessa, joka sisälsi lusiferiiniä, koent-20 syymi A:ta ja ATP:tä ja emittoitunut valo (yleensä 10 sekunnin aikana) mitattiin luminometrillä (Wood K. (1990)
Promega Notes, 28).
Saadut tulokset on esitetty kuviossa 12, Ne osoittavat selvästi, että koostumuksilla voidaan siirtää tehok-25 kaasti plasmidia hiiren aivoihin eikä mitään merkittävää lusiferaasikatiivisuutta havaita., kun siirto on suoritettu pelkällä plasmidilla. 1

Claims (30)

1. Koostumus, joka sisältää nukleiinihapon liuosta ja kationisen polymeerin liuosta, jotka on yhdistetty ja 5 homogenisoitu, jolloin kationisella polymeerillä on yleinen kaava (I) : -:Γί,τ R J Ö) P jossa - R voi olla vetyatomi tai ryhmä, jonka kaava on: --(CH2)n-N— Jq 10 - n on kokonaisluku 2-10; - p ja q ovat kokonaislukuja, ja on selvää, että summa p + q on sellainen, että polymeerin keskimääräinen molekyylipaino on 100 - 107 Da, ja 15 - polymeerin ja nukleiinihapon suhteelliset osuudet on valittu niin, että suhde R polymeerin amii- nit/nukleiinihapon fosfaatit on 5 - 30.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että kaavassa (I) n on 2 - 5.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että polymeerin keskimääräinen mo- i lekyylipaino on 103 - 5 x 106 Da. j
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen koos- tumus, tunnettu siitä, että polymeeri valitaan po- j 25 lyetyleeni-imiinistä (PEI) ja polypropyleeni-imiinistä (PPI) ·
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen valmiste, tunnettu siitä, että polymeeri valitaan polyety-leeni-imiinistä, jonka keksimääräinen molekyyylipaino on i i 50 000 (PEI50K), ja polyetyleeni-imiinistä, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 800 000 (PEI800K).
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että suhde R on 5 - 15.
7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää myös yhden tai useamman apuaineen, joka pystyy sitoutumaan polymeeri/nukleiinihappokompleksiin ja parantamaan sen trans-fektiokykyä, kun mainittu apuaine on valittu lipideistä, 10 proteiineista, lipopolyamiineista ja synteettisistä polymeereistä.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että apuaine on kationinen lipidi.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen koostumus, 15 tunnettu siitä, että kationinen lipidi on yksi tai useampi lipopolyamiini.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että lipopolyamiini vastaa yleistä kaavaa H2N-(-(CH)m-NH-) i-H, jossa m on kokonaisluku 2 - 6 ja 20. on kokonaisluku 1 - 5, m voi vaihdella kahden amiinin vä liin sijoittuvien erilaisten hiiliryhmien mukaan.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että lipopolyamiini valitaan diok-tadekyyliamidoglysyylispermiinistä (DOGS) tai palmito- 25 yylifosfatidyylietanoliamiinin 5-karboksispermyyliamidista (DPPES).
12. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että apuaine on yksi tai useampi ; neutraali lipidi.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että neutraali lipidi tai neutraalit lipidit on valittu synteettisistä tai luonnollisista, fysiologisissa olosuhteissa zwitterionisista tai ilman io-nivarausta olevista lipideistä. i
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että neutraali lipidi tai neutraalit lipidit käsittävät 2 rasvahappoketjua.
15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen koostumus, 5 tunnettu siitä, että neutraali lipidi tai neutraa lit lipidit valitaan dioleoyylifosfatidyylietanoliamiinista (DOPE), oleoyylipalmitoyylifosfatidyylietanoliamiinista (POPE) , distearoyyli-, dipalmitoyyli- tai -dimyristoyylifos-fatidyylietanoliamiinista sekä niiden 1-3 kertaa N-mety- 10 loiduista johdannaisista; fosfatidyyliglyseroleja, diasyy- liglyseroleja, glykosyylidiasyyliglyseroleja, serebrosideja (kuten etenkin galaktoserebrosideja), sfingolipideitä (kuten etenkin sfingomyeliinejä) ja asialogangliosideja (kuten etenkin asialoGMl ja GM2).
16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että nukleiinihappo on deoksiribo-nukleiinihappo.
17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että nukleiinihappo on ribonukle- 20 iinihappo.
18. Patenttivaatimuksen 16 tai 17 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että nukleiinihappo on kemiallisesti modifioitu.
19. Patenttivaatimuksen 16 - 18 mukainen koostumus, 25 tunnettu siitä, että nukleiinihappo on antisense- nukleiinihappo.
20. Jonkin patenttivaatimuksen 16 - 19 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että nukleiinihappo sisältää terapeuttisen geenin.
21. Jonkin patenttivaatimuksen 16 - 19 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että nukleiinihappo koodaa antigeenistä proteiinia.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että nukleiinihappo koodaa virusprote- 35 iinia. j i
23. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää 0,1 - 20 molaaris-ta ekvivalenttia apuainetta 1 molaarista ekvivalenttia nukleiinihapon fosfaattia kohti ja mieluiten 1-5.
24. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää myös tunnistuskohdan, joka koostuu sokerista ja/tai peptidistä, kuten vasta-aineesta tai sen fragmentista, solun reseptorin ligandista tai sen fragmentista tai reseptorista tai resep-10 torin fragmentista.
25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että tunnistekohta on sitoutunut kovalenttisesti kaavan (I) mukaiseen polymeeriin.
26. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen 15 koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää myös farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan injektoitavaa for-mulaatiota varten.
27. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää far- 20 maseuttisesti hyväksyttävän kantajan iholle ja/tai limakal voille sivelemistä varten.
28. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 27 mukainen koostumus käytettäväksi lääkkeenä.
29. Jonkin patenttivaatimuksen 1-27 mukainen 25 koostumus käytettäväksi rokotteena.
30. Kationisen polymeerin, kuten se määritellään ' patenttivaatimuksessa 1, käyttö nukleiinihappojen siirtämiseksi in vitro soluihin. i | 1
FI970115A 1994-07-13 1997-01-10 Nukleiinihapon liuosta ja kationisen polymeerin liuosta sisältävä koostumus ja käytöt FI119738B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9408735A FR2722506B1 (fr) 1994-07-13 1994-07-13 Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
FR9408735 1994-07-13
PCT/FR1995/000914 WO1996002655A1 (fr) 1994-07-13 1995-07-07 Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
FR9500914 1995-07-07

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI970115A FI970115A (fi) 1997-01-10
FI970115A0 FI970115A0 (fi) 1997-01-10
FI119738B true FI119738B (fi) 2009-02-27

Family

ID=9465376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI970115A FI119738B (fi) 1994-07-13 1997-01-10 Nukleiinihapon liuosta ja kationisen polymeerin liuosta sisältävä koostumus ja käytöt

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6013240A (fi)
EP (1) EP0770140B1 (fi)
JP (1) JP4275728B2 (fi)
KR (1) KR100424802B1 (fi)
AT (1) ATE367448T1 (fi)
AU (1) AU2930795A (fi)
CA (1) CA2194797C (fi)
DE (1) DE69535540T9 (fi)
DK (1) DK0770140T3 (fi)
ES (1) ES2290952T3 (fi)
FI (1) FI119738B (fi)
FR (1) FR2722506B1 (fi)
IL (1) IL114566A (fi)
MX (1) MX9700270A (fi)
NO (1) NO323110B1 (fi)
PT (1) PT770140E (fi)
WO (1) WO1996002655A1 (fi)
ZA (1) ZA955849B (fi)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
ATE285477T1 (de) * 1995-06-07 2005-01-15 Inex Pharmaceutical Corp Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
FR2739292B1 (fr) * 1995-09-28 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations
GB2324534B (en) * 1996-01-06 2000-05-10 Danbiosyst Uk Composition for delivery of nucleic acid to a cell
DE19746362A1 (de) * 1996-10-23 1998-04-30 Sueddeutsche Kalkstickstoff Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Polymernanopartikel-Nucleinsäure-Konjugaten
ES2392246T3 (es) * 1996-11-12 2012-12-07 The Regents Of The University Of California Preparación de formulaciones estables de complejos de lípido-ácido nucleico para el suministro eficaz in vivo
US6884430B1 (en) * 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
US6489458B2 (en) 1997-03-11 2002-12-03 Regents Of The University Of Minnesota DNA-based transposon system for the introduction of nucleic acid into DNA of a cell
US5912225A (en) 1997-04-14 1999-06-15 Johns Hopkins Univ. School Of Medicine Biodegradable poly (phosphoester-co-desaminotyrosyl L-tyrosine ester) compounds, compositions, articles and methods for making and using the same
US6524613B1 (en) 1997-04-30 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Hepatocellular chimeraplasty
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
US6420176B1 (en) * 1997-09-15 2002-07-16 Genetic Immunity, Llc. Composition for delivering DNA into antigen presenting cells
US20020022034A1 (en) * 1997-09-15 2002-02-21 Julianna Lisziewicz Therapeutic DNA vaccination
DE19743135A1 (de) * 1997-09-30 1999-04-01 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Biologisch verträgliche niedermolekular Polyethylenimine
JP2002518349A (ja) * 1998-06-18 2002-06-25 ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ スクール オブ メディシン 核酸デリバリー用ポリマー
US6916490B1 (en) 1998-07-23 2005-07-12 UAB Research Center Controlled release of bioactive substances
WO2000025748A1 (fr) * 1998-11-02 2000-05-11 Terumo Kabushiki Kaisha Liposomes
US7160682B2 (en) * 1998-11-13 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acid transfer vector for the introduction of nucleic acid into the DNA of a cell
CN1354678A (zh) * 1999-04-02 2002-06-19 研究发展基金会 用于气溶胶传递的聚乙烯亚胺:dna制剂
US6770740B1 (en) 1999-07-13 2004-08-03 The Regents Of The University Of Michigan Crosslinked DNA condensate compositions and gene delivery methods
FR2797402B1 (fr) 1999-07-15 2004-03-12 Biomerieux Stelhys Utilisation d'un polypeptide pour detecter, prevenir ou traiter un etat pathologique associe a une maladie degenerative, neurologique ou autoimmune
DE19960206A1 (de) * 1999-12-14 2001-07-19 Frank Czubayko Komplexierung von RNS mit Polyethyleniminen zur deren Stabilisierung und zellulären Einschleusung
AU782912B2 (en) 1999-12-28 2005-09-08 Association Francaise Contre Les Myopathies Use of lithium (Li+) for the preparation of a composition for transfection of a polynucleotide into a cell and compositions useful in gene therapy
CA2395636A1 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Novartis Ag Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
FR2805271B1 (fr) * 2000-02-18 2002-04-26 Aventis Pharma Sa Procede de preparation de polyalkylenimines fonctionnalises, compositions les contenant et leurs utilisations
DE60115667T2 (de) * 2000-09-05 2006-08-24 Centelion Säureempfindliche verbindungen, deren herstellung und verwendungen
FR2813605B1 (fr) * 2000-09-05 2002-10-18 Aventis Pharma Sa Composes acidosensibles, leur preparation et utilisations
FR2814370B1 (fr) * 2000-09-22 2004-08-20 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'un complexe acide nucleique/pei pour le ciblage de cellules souches du cerveau
DE10145134A1 (de) * 2000-10-09 2002-05-16 Bayer Ag Komplexe zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen
US20040048819A1 (en) * 2000-10-09 2004-03-11 Joachim Simon Complexes for transferring nucleic acids into cells
US20020091242A1 (en) * 2000-10-11 2002-07-11 Michel Bessodes Acid-sensitive compounds, their preparation and uses
JP2004537501A (ja) * 2001-02-01 2004-12-16 ボード　オブ　リージェンツ，　ザ　ユニバーシティ　オブ　テキサス　システム 肺への遺伝子送達のための安定化ポリマーエアロゾル
US6652886B2 (en) 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
WO2002100435A1 (en) * 2001-06-11 2002-12-19 Centre Hospitalier Universitaire De Montreal Compositions and methods for enhancing nucleic acid transfer into cells
CN1599623B (zh) 2001-09-14 2011-05-11 赛托斯生物技术公司 免疫刺激物向病毒样颗粒内的包装:制备方法与用途
EP1448586A4 (en) * 2001-11-02 2006-03-01 Intradigm Corp THERAPEUTIC METHODS FOR NUCLEIC ACID DELIVERY VEHICLES
CN1308643C (zh) 2002-01-17 2007-04-04 阿尔法·拉瓦尔股份公司 包括沉入式蒸发器的壳体
US8227432B2 (en) * 2002-04-22 2012-07-24 Regents Of The University Of Minnesota Transposon system and methods of use
ES2328031T3 (es) 2002-05-24 2009-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Composiciones para distribuir acidos nucleicos a celulas.
WO2004002453A1 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Protiva Biotherapeutics Ltd. Method and apparatus for producing liposomes
US20050196382A1 (en) * 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
EP1537208A1 (en) * 2002-09-13 2005-06-08 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
ES2784011T3 (es) 2002-10-16 2020-09-21 Streck Inc Procedimiento y dispositivo para recoger y preservar las células para su análisis
US7153905B2 (en) * 2003-03-21 2006-12-26 The General Hospital Corporation Hyperbranched dendron and methods of synthesis and use thereof
EP1648519B1 (en) 2003-07-16 2014-10-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering rna
AU2004272646B2 (en) 2003-09-15 2011-11-24 Arbutus Biopharma Corporation Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
JP2007527240A (ja) * 2004-03-01 2007-09-27 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アレルギー性鼻炎および喘息のためのＲＮＡｉベースの治療
EP1730286A4 (en) * 2004-03-04 2007-09-05 Massachusetts Inst Technology ANTICANCER TREATMENT BASED ON DNA
US20060026699A1 (en) * 2004-06-04 2006-02-02 Largaespada David A Methods and compositions for identification of genomic sequences
EP1781593B1 (en) 2004-06-07 2011-12-14 Protiva Biotherapeutics Inc. Cationic lipids and methods of use
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
CA2572439A1 (en) 2004-07-02 2006-01-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Immunostimulatory sirna molecules and uses therefor
WO2007051303A1 (en) 2005-11-02 2007-05-10 Protiva Biotherapeutics, Inc. MODIFIED siRNA MOLECULES AND USES THEREOF
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
WO2009137911A1 (en) * 2008-05-15 2009-11-19 National Research Counsil Of Canada Process, vectors and engineered cell lines for enhanced large-scale transfection
US20080312174A1 (en) * 2007-06-05 2008-12-18 Nitto Denko Corporation Water soluble crosslinked polymers
WO2009036368A2 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Nitto Denko Corporation Drug carriers
EP2047858A1 (en) 2007-10-10 2009-04-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Combination products for treating cancer
DE102007056488A1 (de) 2007-11-22 2009-07-23 Biontex Laboratories Gmbh Steigerung von Transfektionseffizienzen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems
EP2212425A2 (de) 2007-11-22 2010-08-04 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von transfektionsergebnissen nicht-viraler genliefersysteme durch beeinflussung des angeborenen immunsystems
DE102008023913A1 (de) 2008-05-16 2009-11-19 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems
DE102008016275A1 (de) 2008-03-28 2009-11-19 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems
GB0724253D0 (en) 2007-12-12 2008-01-30 Fermentas Uab Transfection reagent
CA2710713C (en) 2007-12-27 2017-09-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
US7687027B2 (en) * 2008-02-27 2010-03-30 Becton, Dickinson And Company Cleaning compositions, methods and materials for reducing nucleic acid contamination
FR2928373B1 (fr) 2008-03-05 2010-12-31 Centre Nat Rech Scient Polymere derive de la polyethylenimine lineaire pour le transfert de gene.
CN102119217B (zh) 2008-04-15 2015-06-03 普洛体维生物治疗公司 用于核酸递送的新型制剂
EP2770057A1 (en) 2008-04-15 2014-08-27 Protiva Biotherapeutics Inc. Silencing of CSN5 gene expression using interfering RNA
ES2475065T3 (es) 2008-10-09 2014-07-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Aminol�pidos mejorados y métodos para la administración de ácidos nucleicos
US20100167271A1 (en) * 2008-12-30 2010-07-01 Streck, Inc. Method for screening blood using a preservative that may be in a substantially solid state form
US11634747B2 (en) * 2009-01-21 2023-04-25 Streck Llc Preservation of fetal nucleic acids in maternal plasma
DE102009006606A1 (de) 2009-01-29 2010-08-05 Philipps-Universität Marburg Nicht-virales Transfektionsmittel
EP3290530B1 (en) 2009-02-18 2020-09-02 Streck Inc. Preservation of cell-free nucleic acids
WO2010125544A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Genetic Immunity Kft. Immunogenic nanomedicine composition and preparation and uses thereof
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
IL292615B2 (en) 2009-07-01 2023-11-01 Protiva Biotherapeutics Inc Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses
US9856456B2 (en) * 2009-10-12 2018-01-02 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Delivery agent
GB0917792D0 (en) 2009-10-12 2009-11-25 Fermentas Uab Delivery agent
EP4089169A1 (en) 2009-10-12 2022-11-16 Larry J. Smith Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro
ES2571104T3 (es) * 2009-11-09 2016-05-24 Streck Inc Estabilización del ARN y extracción del ARN presente en células intactas dentro de una muestra de sangre
EP2549859B1 (en) 2010-03-24 2017-06-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale Primate model from the family Cercopithecidae infected by a HBV strain of human genotype
EP2552460A1 (en) 2010-03-29 2013-02-06 Universite De Strasbourg Polymers for delivering molecules of interest
AU2011268146A1 (en) 2010-06-17 2013-01-10 Actogenix Nv Compositions and methods for treating inflammatory conditions
CA2802463C (en) 2010-06-22 2019-02-26 Dna Therapeutics Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
WO2012151391A2 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Streck, Inc. Inactivated virus compositions and methods of preparing such compositions
WO2013040552A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Georgia Health Sciences University Methods of promoting immune tolerance
EP2780456A1 (en) 2011-11-17 2014-09-24 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Therapeutic rna switches compositions and methods of use
AU2012342355B2 (en) 2011-11-24 2017-10-12 Genethon Scalable lentiviral vector production system compatible with industrial pharmaceutical applications
US9035039B2 (en) 2011-12-22 2015-05-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing SMAD4
DK2858677T3 (da) * 2012-06-08 2020-08-31 Ethris Gmbh Pulmonær levering af messenger rna
CN103059295B (zh) * 2012-09-26 2016-01-13 上海交通大学 疏水修饰的聚乙烯亚胺及其作为蛋白质载体的用途
DK2903652T3 (da) 2012-10-05 2022-07-04 Biontech Delivery Tech Gmbh Hydroxylerede polyaminderivater som transfektionsreagenser
EP4011380A1 (en) 2012-10-08 2022-06-15 BioNTech Delivery Technologies GmbH Carboxylated polyamine derivatives as complexes with rna
DE102012111891A1 (de) * 2012-12-06 2014-06-12 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Verbesserung der Zielfindungskapazität von Stammzellen
ES2938048T3 (es) 2013-07-24 2023-04-04 Streck Llc Composiciones y procedimientos para estabilizar las células tumorales circulantes
EP3068891A1 (en) 2013-11-13 2016-09-21 Aequus Biopharma Inc. Engineered glycoproteins and uses thereof
CA2963271A1 (en) 2014-10-02 2016-04-07 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
EP3034539A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells
US11168351B2 (en) 2015-03-05 2021-11-09 Streck, Inc. Stabilization of nucleic acids in urine
SG10201909209RA (en) 2015-05-05 2019-11-28 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd Nucleic acid-cationic polymer compositions and methods of making and using the same
US20180245074A1 (en) 2015-06-04 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
WO2017019891A2 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
US20170145475A1 (en) 2015-11-20 2017-05-25 Streck, Inc. Single spin process for blood plasma separation and plasma composition including preservative
US10010627B2 (en) 2016-06-03 2018-07-03 International Business Machines Corporation Modified polycationic polymers
WO2018022991A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Streck, Inc. Suspension composition for hematology analysis control
CN110418650A (zh) 2016-11-16 2019-11-05 免疫治疗有限公司 用于治疗过敏的核酸
EP3570814B1 (en) 2017-01-19 2023-11-29 Universiteit Gent Molecular adjuvants for enhanced cytosolic delivery of active agents
US11203629B2 (en) 2017-04-22 2021-12-21 Immunomic Therapeutics, Inc. LAMP constructs
AU2018263923A1 (en) 2017-05-02 2019-10-31 Immunomic Therapeutics, Inc. LAMP (lysosomal associated membrane protein) constructs comprising cancer antigens
WO2019222281A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Immunomic Therapeutics, Inc Improved lamp constructs comprising allergens
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
CA3153850A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Teri Heiland Improved lamp constructs comprising cancer antigens
AU2020385683A1 (en) 2019-11-18 2022-06-30 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant CALR and JAK2 and their uses
US20230024133A1 (en) 2020-07-06 2023-01-26 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
US20230035403A1 (en) 2020-07-06 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Method For Determining Responsiveness To Prostate Cancer Treatment
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
CN112237633B (zh) * 2020-10-22 2023-06-27 林君玉 一种pei/on复合物及其制备方法和用途
CA3200234A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Daryl C. Drummond Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
GB202108176D0 (en) 2021-06-08 2021-07-21 Touchlight Ip Ltd Vector
EP4352238A1 (en) 2021-06-08 2024-04-17 Touchlight IP Limited Lentiviral vector
WO2023201201A1 (en) 2022-04-10 2023-10-19 Immunomic Therapeutics, Inc. Bicistronic lamp constructs comprising immune response enhancing genes and methods of use thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5286634A (en) * 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5283185A (en) * 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
WO1993020090A1 (en) * 1992-04-06 1993-10-14 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Paired-ion oligonucleotides and methods for preparing same
US6172208B1 (en) * 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids

Also Published As

Publication number Publication date
CA2194797C (fr) 2010-03-23
FR2722506A1 (fr) 1996-01-19
JPH10502918A (ja) 1998-03-17
ES2290952T3 (es) 2008-02-16
DE69535540T2 (de) 2008-06-19
IL114566A0 (en) 1995-11-27
EP0770140A1 (fr) 1997-05-02
AU2930795A (en) 1996-02-16
DE69535540T9 (de) 2012-03-15
MX9700270A (es) 1997-05-31
ATE367448T1 (de) 2007-08-15
ZA955849B (en) 1996-02-21
FR2722506B1 (fr) 1996-08-14
DE69535540D1 (de) 2007-08-30
WO1996002655A1 (fr) 1996-02-01
FI970115A (fi) 1997-01-10
IL114566A (en) 2005-08-31
NO970049D0 (no) 1997-01-07
CA2194797A1 (fr) 1996-02-01
KR970704889A (ko) 1997-09-06
EP0770140B1 (fr) 2007-07-18
NO323110B1 (no) 2007-01-02
JP4275728B2 (ja) 2009-06-10
DK0770140T3 (da) 2007-11-19
FI970115A0 (fi) 1997-01-10
US6013240A (en) 2000-01-11
KR100424802B1 (ko) 2004-06-23
NO970049L (no) 1997-01-07
PT770140E (pt) 2007-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI119738B (fi) Nukleiinihapon liuosta ja kationisen polymeerin liuosta sisältävä koostumus ja käytöt
JP4380796B2 (ja) 核酸を含む組成物、調製および使用
AU706643B2 (en) Composition containing nucleic acids, preparation and use
RU2451525C2 (ru) Биоразрушаемые катионные полимеры
US20070219118A1 (en) Therapeutic methods for nucleic acid delivery vehicles
US20130281382A1 (en) Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
AU710170B2 (en) Cationic virosomes as transfer system for genetic material
US20100285111A1 (en) Self-assembling micelle-like nanoparticles for systemic gene delivery
JPH09500136A (ja) 樹枝状体ポリ陽イオンを含む自己集合性ポリヌクレオチド配送系
EP1053024A1 (en) Liposome fusion and delivery vehicle
KR20030009362A (ko) 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법, 이를 함유하는조성물 및 이의 용도
KR19990063814A (ko) 핵산 형질감염용으로 유용한 약학 조성물 및 이의 용도
CN116162132A (zh) 一种用于有效递送核酸的环状多肽载体及其变化形式
AU737314B2 (en) Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same
WO2024041372A1 (zh) 一种用于有效递送核酸的分支链结构多肽载体及其变化形式
MXPA97006016A (en) Composition containing nucleic acids, preparation and use
EP1217990A1 (en) Cationic dosper virosomes
LEI Intrathecal delivery of transgene to promote nerve regeneration
Gao Cationic liposome-and polymer-mediated gene transfer

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 119738

Country of ref document: FI

MA Patent expired