NO323110B1 - Preparat innbefattende en nukleinsyre og kationisk polymer samt anvendelse av polymeren. - Google Patents

Preparat innbefattende en nukleinsyre og kationisk polymer samt anvendelse av polymeren. Download PDF

Info

Publication number
NO323110B1
NO323110B1 NO19970049A NO970049A NO323110B1 NO 323110 B1 NO323110 B1 NO 323110B1 NO 19970049 A NO19970049 A NO 19970049A NO 970049 A NO970049 A NO 970049A NO 323110 B1 NO323110 B1 NO 323110B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
preparation according
nucleic acid
polymer
cells
transfection
Prior art date
Application number
NO19970049A
Other languages
English (en)
Other versions
NO970049D0 (no
NO970049L (no
Inventor
Jean-Paul Behr
Barbara Demeneix
Daniel Scherman
Otmane Boussif
Franck Lezoualch
Mojgan Mergny
Original Assignee
Aventis Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9465376&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO323110(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Aventis Pharma Sa filed Critical Aventis Pharma Sa
Publication of NO970049D0 publication Critical patent/NO970049D0/no
Publication of NO970049L publication Critical patent/NO970049L/no
Publication of NO323110B1 publication Critical patent/NO323110B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse angår preparater på basis av nukleinsyrer og anvendelse av kationiske polymerer. Mer spesielt angår oppfinnelsen preparater omfattende minst en nukleinsyre og visse kationiske polymerer, og deres anvendelse for overføring av nukleinsyrene inn i celler, særlig ved genterapi.
Genterapi består i å korrigere en defekt eller en anomali (mutasjon, feilaktig ekspresjon, og så videre) eller å sikre ekspresjonen av et protein av terapeutisk interesse ved inn-føring av en genetisk informasjon inn i den påvirkede celle eller organ. Denne genetiske informasjon kan innføres enten in vitro i en celle som er hentet fra organet og der den modifiserte celle deretter gjeninnføres i organismen, eller direkte in vivo i det egnede vev. Forskjellige teknikker er beskrevet for overføring av denne genetiske informasjon, blant hvilke man finner forskjellige teknikker for transfeksjon som implikerer DNA-komplekser og DEAE-dekstran (Pagano et al., "J. Virol.", 1 (1967) 891) DNA og nukleære proteiner (Kaneda et al, "Science", 243 (1989) 375), DNA og lipider (Felgner et al., "PNAS" 84 (1987) 7413), DNA og polylysin, anvendelse av liposomer (Fraley et al., "J. Biol. Chem." 255 (1980) 10431) og andre. I den senere tid har anvendelsen av virus som vektorer for overføring av gener kommet som et lovende alternativ ved de fysikokjemiske teknikker for transfeksjon. I denne forbindelse er forskjellige virus testet med henblikk på sin evne til å infisere visse cellulære populasjoner. Særlig gjelder dette retrovirusene (RSV, HMS, MMS, og så videre), HSV-virusen, de adeno-assosierte virus og adenovirusene.
Imidlertid har de teknikker som har vært utviklet til i dag ikke på tilfredsstillende måte løst vanskelighetene i forbindelse med overføring av gener til celler og/eller organismen. Særlig er problemer forbundet med penetrering av nukleinsyren inn i cellene, ikke helt løst. Den polyanioniske art av nukleinsyrene er særlig et hinder for passasjen gjennom cellemembranene. Der det er vist at nakne nukleinsyrer er i stand til å traversere plasmidmembranet til visse typer celler in vivo (se særlig WO 90/11092), er transfeksjonseffektiviten liten. Videre har de nakne nukleinsyrer en meget kort plasmatisk halveringstid på grunn av deres nedbrytning av enzymer og deres eliminering via urinveiene. Selv om således rekombinante virus tillater å forbedre effektiviteten for overføring av nukleinsyrer, presenterer deres anvendelse visse risiki som patogenisitet, transmisjon, replikasjon, rekombinasjon, transformasjon, immuno-genisitet, og så videre. Videre oppviser deres produksjon i henhold til nonnene "Bonne Pratique" visse vanskeligheter.
WO 93/20090 beskriver polyanioniske oligonukleotider som er konjugert til poly-
kationiske polymerer ved hjelp av et bindemiddel.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fordelaktig løsning på disse forskjellige problemer. Foreliggende søkere har vist at visse kationiske polymerer har spesielt fordelaktige egenskaper for overføring av nukleinsyrer inn i celler, både in vitro og in vivo. Videre oppviser polymerene fordelen av å være lett tilgjengelige og å være billige. Anvendelsen av de kationiske polymerer ifølge oppfinnelsen tillater likeledes å unngå de mangler som er forbundet med anvendelsen av virale vektorer (potensielle farer, begrenset størrelse for overført gen, høy pris, og så videre).
Mer spesielt ligger foreliggende oppfinnelse i påvisningen av de transfektante egenskaper for polymerer med formel (I):
der
R er hydrogen eller en gruppe med formelen
der
n er et helt tall mellom 2 og 10 og
p og q er hele tall,
hvor summen p+q er slik at polymerens gjennomsnittlige molekylvekt er ligger mellom 100 og IO<7> Da.
Det skal være klart at verdien av n i formel (I) kan variere mellom de forskjellige deler p. Videre omfatter formel (I) på en gang homopolymerer og heteropolymerer.
Den første gjenstand for oppfinnelsen ligger således i et preparat kjennetegnet ved at det innbefatter minst en oppløsning av en nukleinsyre og en oppløsning av en kationisk polymer i en homogenisert blanding, hvor den kationiske polymeren har følgende formel:
der
- R er hydrogen eller en gruppe med følgende formel:
der
n er et helt tall mellom 2 og 10;
p og q er hele tall;
hvor summen av p+q er slik at polymerens gjennomsnittlige molekylvekt er mellom 100 og 10<7> Da; og
hvor forholdet for polymeramin til nukleinsyrefosfat er mellom 5 og 30.
Oppfinnelsen angår likeledes anvendelsen av kationiske polymerer med formel (I) for overføring av nukleinsyrer inn i celler.
Aller helst er n i formel (I) fra 2 til 5. Særlig oppviser polymerene av polyetylenimin (PEI) og polypropylenimin (PPI) meget fordelaktige egenskaper.
De foretrukne polymerer for gjennomføring av oppfinnelsen er de der molekylvekten ligger mellom 10<3> og 5»IO<6>. Som eksempel kan nevnes polyetylenimin med midlere molekylvekt 50 000 Da (PEI50K) eller polyetylenimin med midlere molekylvekt 800 000 Da (PEI800K).
Polymerene som benyttes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse kan oppnås på forskjellige måter. De kan således syntetiseres kjemisk fra de tilsvarende monomerer under anioniske polymeriseringsbetingelser (for eksempel polymerisering av etylen-imin), eller ved reduksjon av polyamider oppnådd ved polykondensering av disyrer med diaminer, eller også ved reduksjon av iminer oppnådd ved polykondensering av dialde-hyder med diaminer. Videre er et visst antall av disse polymerer tilgjengelige kommersielt, særlig PEI50K og PEI800K.
For å oppnå en optimal effekt for preparatene ifølge oppfinnelsen er de respektive andeler av polymer og nukleinsyre fortrinnsvis bestemt dit hen at molforholdet R = polymere aniiner:nukleinsyrefosfater ligger mellom 5 og 30. Spesielt fordelaktige resultater oppnås ved å benytte 5 til 15 ekvivalenter polymere aminer pr. nukleinsyre-ladning. Dette forhold kan på enkel måte tilpasses av fagmannen som en funksjon av den benyttede polymer, nærværet av et hjelpestoff (se nedenfor), nukleinsyren, målcellen og den benyttede administreirngsmåte.
I preparatene ifølge oppfinnelsen kan nukleinsyren være både en desoksyribonukleinsyre og en ribonukleinsyre. Det kan dreie seg om sekvenser av naturlig eller kunstig opprinnelse og særlig genomisk DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, hybridsekvenser eller syntetiske eller semi-syntetiske sekvenser. Likeledes kan nukleinsyren ha en varierbar størrelse fra oligonukleotid til kromosom. Disse nukleinsyrer kan være av human, animalsk, vegetabilsk, bakteriell, viral eller annen opprinnelse. De kan oppnås på en hvilken som helst måte som er kjent for fagmannen og særlig ved leting i banker, ved kjemisk syntese eller også ved blandede metoder inkludert kjemisk eller enzymatisk modifisering av sekvenser oppnådd ved avsøking av banker. De kan videre innarbeides i vektorer som plasmidiske vektorer.
Hva spesielt angår desoksyribonukleinsyrene, kan de være enkelt- eller dobbeltstrenget. Desoksyribonukleinsyrene kan bære terapeutiske gener, regulatoriske sekvenser for transkripsjon eller replikasjon, anti-retningssekvenser, forbindelsesregioner til andre cellulære preparater, og så videre.
Innenfor rammen av oppfinnelsen mener man med terapeutisk gen et hvilket som helst gen som koder for et proteinprodukt med en terapeutisk virkning. Det således kodede proteinprodukt kan være et protein, et peptid, og så videre. Proteinproduktet kan være homologt vis-å-vis målcellen (det vil si et produkt som normalt uttrykkes i målcellen når denne ikke oppviser noen patologi). I dette tilfeller tillater ekspresjonen av et protein for eksempel å bøte på en utilstrekkelig ekspresjon i cellen eller ekspresjonen av et inaktivt eller lite aktivt protein på grunn av en modifikasjon, eller også å overeksprimere proteinet. Det terapeutiske gen kan også kode for en mutant av et cellulært protein med en øket stabilitet, modifisert aktivitet, og så videre. Proteinproduktet kan likeledes være heterologt vis-å-vis målcellen. I dette tilfellet kan for eksempel det uttrykte protein komplettere eller bøte på en defektiv aktivitet i cellen, tillate den å kjempe mot en patologi eller stimulere en immunrespons. Det terapeutiske gen kan likeledes kodes for et protein som skilles ut i organismen.
Blant de terapeutiske produkter innenfor rammen av oppfinnelsen kan mer spesielt nevnes enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner: interleukiner, interferoner, TNF, og så videre (FR 9203120), vekstfaktorer, neurotransmittorer eller deres forløpere eller synteseenzymer, trofiske faktorer: BDNF, CNTF, NGT, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofin, og så videre; apolipoproteinene: ApoAI, ApoATV, ApoE, og så videre (FR 9305125), dystrofin eller et minidystrofin (FR 9111947), proteinet CFTR forbundet med mucoviskidose, tumorsuppressorgener: p53, Rb, RaplA, DCC, k—rev, og så videre (FR 9304745), gener som koder for faktorer implikert i koaguleringen: faktorene VII, Vin, IX og så videre, gener som intervenerer i reparasjon av DNA, drepergener (thymidinkinase, cytosindeaminase), og så videre.
Det terapeutiske gen kan likeledes være et anti-retningsgen eller en anti-retnings-sekvens, hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollerer ekspresjonen av gener eller transkripsjonen av cellulær mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel transkriberes inn i målcellen til RNA komplementær med cellulær mRNA og således blokkere deres traduksjon til protein, i henhold til den teknikk som er beskrevet i EP 140 308. Det kan også dreie seg om eventuelt modifiserte (EP 92 574), syntetiske oligonukleotider. Anti-retningen omfatter likeledes sekvenser som koder for ribozymer og som er i stand til selektivt å destruere mål-RNA (EP 321 201).
Som antydet ovenfor kan nukleinsyren likeledes omfatte en eller flere gener som koder for et antigenisk peptid, i stand til hos mennesker eller dyr å tilveiebringe en immunrespons. I denne særlige utførelsesform tillater oppfinnelsen således realisering enten av vaksiner eller av immunoterapibehandlinger anvendt på mennesker eller dyr, særlig mot mikroorganismer, virus eller cancere. Det kan særlig dreie seg om antigeniske peptider som er spesifikke for Epstein Barr-virusen, HIV-virusen, hepatitt B-virusen (EP 185 573), pseudo-hundegalskapsvirus, eller også spesifikk for tumorer (EP 259 212).
Fortrinnsvis omfatter nukleinsyren likeledes sekvenser som tillater ekspresjon av det terapeutiske gen og/eller genet som koder for antigenisk peptid i den ønskede celle eller det ønskede organ. Det kan dreie seg om sekvenser som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen når disse sekvenser er i stand til å funksjonere i den infekterte celle. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av forskjellig opprinnelse (ansvarlige for ekspresjonen av andre proteiner, eller sogar syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotersekvenser for eukaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av cellen man ønsker å infisere. På samme måte kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av en virus. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promoterne for genene EIA, MLP, CMV, RSV og så videre. Videre kan disse ekspresjonssekvenser modifiseres ved addisjon av sekvenser for aktivering, regulering eller tillater en vevspesifikk ekspresjon.
Således kan nukleinsyren likeledes og særlig oppstrøms det terapeutiske gen, omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt inn i målcellens sekre-sjons veier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det terapeutiske produkt, men det kan også dreie seg om en hvilken som helst annen funksjonell signalsekvens eller en kunstig signalsekvens.
Videre kan nukleinsyren likeledes, særlig oppstrøms det terapeutiske gen, omfatte en sekvens som styrer det syntetiske, terapeutiske produkt mot et preferensielt cellulært område, for eksempel en sekvens med nukleær lokalisering.
Preparatene ifølge oppfinnelsen kan benyttes som sådanne eller i forbindelse med andre forbindelser. I en særlig foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen omfatter preparatene ifølge oppfinnelsen i tillegg et hjelpestoff som er i stand til assosiasjon til polymer/nukleinsyrekompleks og å forbedre transfeksjonskraften. Foreliggende søkere har vist at transfeksjonskraften for preparatene ifølge oppfinnelsen ytterligere kan forbedre i nærvær av visse hjelpestoffer (for eksempel lipider, proteiner, lipopolyaminer eller syntetiske polymerer), i stand til å assosiere til komplekse polymerennukleinsyre. Som vist i eksemplene i foreliggende søknad manifesteres denne forbedring like godt in vitro som in vivo.
Hjelpestoffene som fortrinnsvis benyttes i preparatene ifølge oppfinnelsen er kationiske lipider (som bærer en eller flere kationiske ladninger i deres polare del) eller nøytrale lipider.
Når det gjelder kationiske lipider, kan det særlig dreie seg om lipopolyaminer, det vil si et hvilket som helst amfifilt molekyl omfattende minst en hydrofil polyaminregion og en lipofil region kovalent bundet seg imellom med en kjemisk gren. Fortrinnsvis svarer polyaminregionen av lipopolyaminene som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen til den generelle formel H2N-(-(CH)m-NH-)i-H der m er et helt tall lik større enn 2 og 1 er et helt tall lik større enn 1, idet m kan variere mellom de forskjellige karbongrupper som befinner seg mellom to aminer. Fortrinnsvis ligger m fra og med 2 til og med 6 og 1 fra og med 1 til og med 5. Ytterligere foretrukket er det at polyaminregionen er repre-sentert ved spermin eller en analog av spermin som har bevart vinningsegenskapene til Det lipofile området kan være en eller flere hydrokarbonkjeder, eventuelt mettede, kolesterol, et naturlig lipid eller et syntetisk lipid som er i stand til å danne lamellære eller heksagonale faser.
Fortrinnsvis benytter man innenfor rammen av oppfinnelsen lipopolyaminer som definert i EP 394 111. Dette dokument beskriver likeledes en fremgangsmåte som kan benyttes for fremstilling av disse lipopolyaminer. På særlig fordelaktig måte benytter man innenfor rammen av oppfinnelsen dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS) eller palmitoylfosfatidyletanolamin-5-karboksyspermylamid (DPPES).
Andre spesielt foretrukne hjelpestoffer for realisering av preparatene ifølge oppfinnelsen representeres av nøytrale lipider. Anvendelsen av nøytrale lipider er særlig fordelaktig når ladningsforholdet R (aminer: fosfater) er lavt. Fortrinnsvis er de nøytrale lipider som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen, lipider med 2 fettkjeder.
På spesielt fordelaktig måte benytter man naturlige eller syntetiske lipider av zwitter-ionisk type eller slike som er berøvet sin ioniske ladning under fysiologiske betingelser. De kan særlig velges blant dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), oleoyl-palmitoylfos-fatidyletanolamin (POPE), di-stearoyl-, -palmitoyl-, -mirystoylfosfatidyletanolamin samt deres 1 til 3 ganger N-metylerte derivater; fosfatidylglycerolene, diacylglycerolene, glykosyldiacylglycerolene, cerebrosidene (som særlig galaktocerebrosidene), sfingolipidene (som særlig sfingomyelinene) eller også asialogangliosidene (som særlig asialoGMl og-GM2).
Disse forskjellige lipider kan oppnås enten ved syntese eller ved ekstrahering fra organer (for eksempel hjernen) eller fra egg, ved velkjente, klassiske teknikker. Særlig kan ekstraheringen av naturlige lipider gjennomføres ved hjelp av organiske opp-løsningsmidler (se likeledes Lehninger, "Biochemistry").
Fortrinnsvis omfatter preparatene ifølge oppfinnelsen, i tillegg til den kationiske polymer innen de ovenfor angitte forhold, 0,1 til 20 molekvivalenter hjelpestoff pr. 1 molarekvivalent nukleinsyrefosfat, særlig 1 til 5 ekvivalenter.
I en spesielt fordelaktig utførelsesform omfatter preparatene ifølge oppfinnelsen et innsiktingselement som tillater å orientere overføringen av nukleinsyren. Dette innsiktingselement kan være et ekstracellulært innsiktingselement som tillater å orientere overføringen av nukleinsyre mot visse cellulære typer eller visse ønskede vev (tumorale celler, hepatiske celler, hematopoietiske celler og så videre). Det kan likeledes dreie seg om en intracellulær innsikting som tillater å orientere overføringen av nukleinsyre mot visse privilegerte, cellulære rom (mitokondrier, kjerner, og så videre).
Fortrinnsvis er innsiktingselementet på kovalent eller ikke-kovalent måte bundet til polymeren med formel (I). Bindingen kan særlig oppnås ved ionisk interaksjon med ammonium, eller ved nukleofilt angrep av aminene på polymeren på målelementer som omfatter en nukleofug gruppe (halogen, tosylat og så videre), en aktivert ester (hydroksysuccinimid, og så videre) eller også et isotiocyanat. Innsiktingselementet kan likeledes være bundet til nukleinsyren.
Blant de innsiktingselementer som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen skal nevnes sukkere, peptider, oligonukleotider eller lipider. Fortrinnsvis dreier det seg om sukkere og/eller peptider som antistoffer eller antistoff-rfagmenter, cellulære reseptor-ligander eller fragmenter av disse, reseptorer eller fragmenter av reseptorer, og så videre. Videre kan det dreie seg om ligander av reseptorer av vekstfaktorer, reseptorer av cytokiner, reseptorer av cellulære lectiner eller reseptorer av addisjonsproteiner. Man kan likeledes nevne reseptorene for transferm, HDL og LDL. Innsiktingselementet kan likeledes være et sukker som tillater å sikte på asialoglykoproteinreseptorene eller også et Fab-fragment av et antistoff som tillater å sikte på reseptoren av fragmentet Fc av immunoglobuliner.
Preparatene ifølge oppfinnelsen kan formuleres med henblikk på topisk, kutan, oral, rektal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokulær, transdermal eller annen administrering. Fortrinnsvis inneholder de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen en farmasøytisk akseptabel bærer for et injiserbart preparat, særlig for en direkte injeksjon i det ønskede organ, eller for topisk administrasjon (på huden og/eller slimhinnen). Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske oppløsninger eller om tørkede preparater, særlig lyofiliserte preparater som ved tilsetning av sterilisert vann eller fysiologisk serum tillater konstituering av injiserbare oppløsninger. De benyttede doser av nukleinsyre for injeksjon samt antallet administreringer kan tilpasses som en funksjon av forskjellige parametere og særlig som funksjon av den benyttede administreringsmåte, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også den tilsiktede varighet av behandlingen.
Som antydet ovenfor kan preparatene ifølge oppfinnelsen benyttes for overføring av nukleinsyrer til celler in vivo, in vitro eller ex vivo. Særlig viser eksemplene at kationiske polymerer ifølge oppfinnelsen kan benyttes for overføring på meget effektiv måte av nukleinsyre i forskjellige celletyper og særlig i visse typer celler som vanligvis er vanskelige å transfektere. Blant typene celler som er utprøvd kan særlig nevnes fibroblaster, hepatiske celler, karsinomer, renale celler og neuroner. Videre illustrerer de nedenfor gitte eksempler også effektiviteten hos polymerene ifølge oppfinnelsen for overføring av gener in vivo. De resultater som oppnås med vektorene ifølge oppfinnelsen er overlegne det som observeres under de samme betingelser med andre trans-feksjonsmidler og viser også de potensialer som utvikles med oppfinnelsens preparater.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer særlig en metode som er spesielt fordelaktig for behandling av sykdommer og som omfatter administrering in vivo av en nukleinsyre i stand til å korrigere sykdommen, forbundet med en kationisk polymer som definert ovenfor. Mer spesielt kan oppfinnelsen anvendes på sykdommer som resulterer i en defekt av et protein- eller nukleinprodukt og den administrerte nukleinsyre koder for dette proteinprodukt eller inneholder nukleinproduktet.
De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen utgjør således spesielt fordelaktige verktøy for administrering og overføring av nukleinsyrer in vivo.
Oppfinnelsen skal beskrives nærmere ved hjelp av de følgende illustrerende eksempler i forbindelse med de vedlagte figurer som viser: Figur 1: Effektiviteten av transfeksjon av PEI800K ved pH 7 som en funksjon av
forholdet R (polymeraminer:nukleinsyrefosfater).
Figur 2: Effektiviteten av transfeksjon PEI800K ved pH 6 som funksjon av
mengden av DNA.
Figur 3: Effektiviteten av transfeksjonen av PEI800K ved pH 6 som en funksjon
av forholdet R.
Figur 4: Effektiviteten av transfeksjonen av PEI800K som en funksjon av pH-verdien.
Figur 5: Sammenligning mellom PEI800K og polylysin.
Figur 6: Cytotoksisitetsprøve for PEI50K.
Figur 7: Effektiviteten av transfeksjonen av PEI50K i nærvær av hjelpestoff.
Figur 8: Effektiviteten av PEI for transfeksjon av HeLa-celler.
Figur 9: Effektiviteten av PEI for transfeksjon av hepatiske og renale celler. Figur 10: Effektivitet av PEI for overføring av plasmidisk DNA i embryonære
neuroner.
Figur 11: Effektivitet av PEI for overføring av oligonukleotider i embryonære
neuroner.
Figur 12: Effektivitet av PEI for overføring av DNA in vivo.
EKSEMPEL 1 - Plasmider som benyttes for overføring av gener in vivo
Det benyttes tre typer konstruksjoner for å påvise aktiviteten for oppfinnelsens preparater: Plasmider som bører genet som koder for luciferase (Lue), plasmider som bærer genet som koder for B-galaktosidase (genet LacZ) og plasmider som omfatter genet som koder for kloramfenikolacetyltransferase (CAT).
1.1 Plasmider som bærer genet Lue
Plasmidet pCMV-luc omfatter promoteren av cytomegalovirus (CMV), ekstrahert fra vektorplasmidet pcDNA3 (Invitrogen) ved kutting med restriksjonsenzymene Mlul og Hindin, beliggende oppstrøms genet som koder for luciferase, innskutt i setene Mlul og Hindlll i vektoren pGL basic vektor (Promega).
Plasmidet pGL2-Luc er av kommersiell opprinnelse (Promega).
Plasmidet T3RE-Luc inneholder et syntetisk oligonukleotid tilsvarende et element for palindromisk respons til thyroidhormonet Glass et al., "Cell", 56 (1989) 697).
1.2 Plasmider omfattende genet LacZ
Plasmidet pCMV-fiGal (Clontech) bærer promoteren CMV anordnet oppstrøms genet LacZ som koder for B-galaktosidase av Escherichia coli. Vektoren pSV-nls LacZ (pAOnlsLacZ) omfatter den samme promoter, en sekvens for nukleær lokalisering (fra virus SV40) lokalisert i fase og oppstrøms LacZ. Denne konstruksjon tillater ekspresjon av fusjonsproteinet nls-B-galaktosidase i cellekjernen (Se de Luze et al., "PNAS", 90
(1993) 7322).
1.3 Plasmider som omfatter genet CAT
Plasmidene som som rapportørgen har genet som koder for kloramfenikolacetyltransferase (CAT) under kontroll av promoterene RSV (pRSV-CAT) og SV40 (pSV40-CAT) er publisert (Boutiller et al., "Prog. Neuro-Phycho Pharmacol." og "Biol. Psychiat." 16 (1992) 959; de Luze et al., "PNAS", 90 (1993) 7322).
EKSEMPEL 2 - Overføring av nukleinsyre i fibroblaster.
Dette eksempel beskriver overføring av plasmidet pGL2-luc i fibroblaster 3T3 ved hjelp av polyetylenimin 800 000 Da.
Protokoll: En oppløsning på 5,375 uM av PEI800K fremstilles og pH-verdien justeres til 7 ved hjelp av en IN saltsyreoppløsning. Denne oppløsning benyttes for forsøkene med overføring av gener.
Transfeksjonsprotokoll: 3T3-fibroblastene podes i en 24 brønners plate i 24 timer før transfeksjon (50 000 celler pr. brønn). De transfekteres med 2 ug plasmid pGL-2Luc pr. brønn i henhold til følgende protokoll: 2 ug av plasmidet og forskjellige volumer av 5,375 uM oppløsningen av PEI800K (som funksjon av det ønskede ekvivalentladningsforhold) fortynnes separat i 50 ul 150 mM NaCl og blandes. Etter 10 minutter blir de to oppløsninger forenes og homogenisert. Etter nye 10 minutter tilsettes 900 ul DMEM. Den således oppnådde oppløsning homogeniseres og etter 10 minutter fordeles den på cellene som på forhånd er skyllet med DMEM-medium uten serium. Etter 2 timer transfeksjon tilsettes 100 ul SVF (føtalt kalveserum) pr. brønn. Ekspresjonen stanses 24 timer senere.
Dosering av luciferase. For dette formål blir superaatanten inkubert i nærvær av en buffer omfattende luciferin, koenzym A og ATP og det avgitte lys (generelt i løpet av 10 sekunder) måles med luminometer (Wood K. (1990) "Promega Notes", 28).
De oppnådde resultater er vist i figur 1. De viser at PEI tillater effektivt å overføres plasmidet pGL2-Luc i fibroblaster. De viser likeledes at aktiviteten i relative lysenheter (RLU = relative lysenheter) er særlig god når man benytter mellom 5 og 20 ekvivalenter aminer av PEI i forhold til fosfater av DNA. I et kontrollforsøk gir plasmidet alene et signal på ca. 100 RLU.
EKSEMPEL 3 - Virkningen av mengden av DNA på transfeksjonseffektiviteten. Dette eksempel beskriver effekten av mengden av nukleinsyre på effektiviteten for overføring i 24 fibroblaster 3T3 av PEI800K.
Fibroblastene 3T3 såes i en 24 brønners plate i 24 timer før transfeksjon (50 000 celler pr. brønn). De transfekteres med økende mengder av plasmid pCMV-Luc pr. brønn og et konstant ladningsforhold lik 9 ekvivalenter, i henhold til den tidligere beskrevne protokoll. To punkter realiseres ved å komplettere mengden av plasmid til 2 ug pr. brønn med plasmid pGEM (Promega) som ikke inneholder det studerte gen. Etter 3 timers transfeksjon tilsettes 100 ul SVF-serum pr. brønn. Ekspresjonen stanses etter 24 timer.
De oppnådde resultater er vist i figur 2.
Transfeksjonseffektiviteten vokser med mengden av plasmid som benyttes under transfeksjonen. Tilsetningen av ikke transkriberte bærer-DNA (pGEM) innvirker ikke på transfeksjonen.
EKSEMPEL 4 - Overføring av nukleinsyre i fibroblaster: Studium av innflytelsen av forholdet aminenfosfater.
Dette eksempel beskriver overføringen av nukleinsyrer i fibroblaster ved pH 6 ved hjelp av et preparat ifølge oppfinnelsen omfattende nukleinsyre og PEI800K i forskjellige forhold R (aminenfosfater).
Protokoll: En oppløsning på 5,375 uM PEI800K prepareres og pH-verdien justeres til 6 ved hjelp av en IN saltsyreoppløsning. Denne oppløsning benyttes for forsøkene på genoverføring.
Fibroblastene 3T3 fordeles over en 24 brønners plate 18 timer før transfeksjon (50 000 celler pr. brønn). De transfekteres med 2 ug plasmid pGL-2-Luc pr. brønn i henhold til den protokoll som ble benyttet i eksempel 2.
De oppnådde resultater er vist i figur 3. De viser at preparatet ifølge oppfinnelsen er særlig effektivt over hele spekteret for forholdet R mellom 6 og 22.
EKSEMPEL 5 - Effektivitet av transfeksjon som funksjon av pH-verdien.
Dette eksempel beskriver overføringen av nukleinsyre i fibroblaster ved hjelp av et preparat ifølge oppfinnelsen omfattende nukleinsyren og PEI800K, under forskjellige pH-verdier.
Den benyttede protokoll er identisk med den som er beskrevet i eksempel 2. pH-verdien justeres ved tilsetning av IN saltsyre.
De oppnådde resultater er vist i figur 4. De viser at preparatene ifølge oppfinnelsen kan benyttes ved forskjellige pH-verdier og særlig i områdene for fysiologisk pH-verdi (pH 5-8).
EKSEMPEL 6 - Sammenligning av effektiviteten av transfeksjon av PEI og polylysin.
Dette eksempel beskriver de sammenligningsresultater som ble oppnådd med et preparat ifølge opprinnelsen og med en annen kationisk polymer, polylysin, for overføring av nukleinsyrer i fibroblaster.
Protokoll: Det polylysin, PLL, som ble benyttet i dette forsøk er polylysin.HBr med midlere molekylvekt 50 K. Sluttkonsentrasjonene av klorokin er 100 uM. PEI befinner seg ved pH 6.
Protokoll: Fibroblastene 3T3 fordeles over en 24 brønners plate 18 timer før transfeksjon (50 000 celler pr. brønn). De transfekteres med plasmidet pCMV-Luc i henhold til den protokoll som er benyttet i eksempel 2. Cellene som er transfektert med PLL i nærvær av klorokin skylles etter 2 timer og bringes i medium med 10 % serum. Ekspresjonen stanses 24 timer senere.
Resultatene som oppnås er vist i figur 5. De viser klart at preparatene ifølge oppfinnelsen tillater å overføre nukleinsyrer i fibroblaster ved en effektivitet som ligger godt over de tidligere kationiske polymere vektorer som polylysin.
EKSEMPEL 7 - Sammenligning av transfeksjonseffektiviteten for fibroblastene NIH 3T3 med PEI50K og PEI800K.
Dette eksempel beskriver anvendelsen og sammenligningen mellom to PEI-polymerer (PEI50K og PEI800K), for overføring av nukleinsyrer i celler.
Protokoll: Cellene fordeles 24 timer før transfeksjon med 50 000 celler pr. brønn på 16 mm. De transfekteres med plasmid pCMV-Luc, kompleksert med PEI. Det molare ekvivalentforholdet PEI-amin:nukleinsyrefosfat varierer fra 6 til 45 ekvivalenter. For hver brønn fortynner man separat med PEI og 2 ug DNA i 50 ul NaCl (150 mM). Oppløsningene blir deretter blandet og så homogenisert. Etter 10 minutter blir dette volum satt til cellene. Etter 24 timer blir cellene lysert, lyseringsoppløsningen sentrifugert og supernatanten benyttet for å bestemme luciferase-aktiviteten. Proteinmengden bestemmes på en aliquot av denne supernatant ved hjelp av BCA-testen. Luciferase-aktiviteten uttrykkes i relative lysenheter (RLU) pr. 10 sekunder integrering pr. mg
protein.
De oppnådde resultater er vist i tabellen nedenfor:
Disse resultater viser klart at PEI50K har transfeksjonsegenskaper som er minst like fordelaktige som PEI800K.
EKSEMPEL 8 - Cytotoksisitetsprøve for PEI.
Man har villet studere den eventuelle toksisitet for PEI50K på fibroblaster NIH 3T3. For dette studium valgte man MTT-testen som tillater å bedømme cellenes kapasitet på å redusere MTT-tetrazoliurn til MTT-formazan ved hjelp av det mikrokondriale enzym, succinatdeshydrogenase. Transfeksjonsprotokollen er den samme som i eksempel 7 (mengden DNA pr. brønn er fast (2 ug), antallet molare ekvivalenter PEI-amin:DNA-fosfat varierer fra 9 til 24). Etter 24 timers transfeksjon blir cellene vasket 3 ganger med PBS og deretter inkubert i 90 minutter med 0,05 mg/ml MTT. Ved slutten av denne inkubering blir cellemediet eliminert, cellene vasket 3 ganger med PBS og deretter oppløst i 1 ml 10 % SDS i 10 minutter. Den optiske densitet for prøvene avleses ved 540 nm.
Resultatene er vist i figur 6. De viser at under betingelsene for dette studium medfører PEI50K ingen signifikant mortalitet for fibroblastene NIH 3T3.
EKSEMPEL 9 - Anvendelse av et hjelpestoff for å forbedre transfeksjonskraften. Dette eksempel beskriver anvendelsen av preparater ifølge oppfinnelsen omfattende en kationisk polymer og et hjelpestoff. Det benyttede hjelpestoff er enten et nøytralt lipid (DOPE) eller et lipopolyamin (DOGS).
Protokoll: Tilsetning av DOPE:
Man studerer 4 molare ekvivalentforhold PEI-amin:DNA-fosfat, nemlig 6, 9,18 og 21.
For hver enhet blir 12 nanomol DOPE satt til blandingen av PEI og DNA. Denne oppløsning blir deretter benyttet for transfeksjon som beskrevet i eksempel 7.
Tilsetning av DOGS:
For hver enhet tilsettes 4 molare ekvivalenter DOGS-amin:DNA-fosfat (det vil si 6 nanomol DOGS pr. 6 nanomol fosfat) til PEI-oppløsningen før kompleksdannelses-trinnet med DNA. Transfeksjonen gjennomføres deretter som beskrevet i eksempel 7.
De oppnådde resultater er vist i figur 7. De viser klart at tilsetningen av DOPE eller DOGS tillater ytterligere å forbedre transfeksjonsegenskapene, særlig for lave molare ekvivalentforhold PEI-amin:DNA-fosfat.
EKSEMPEL 10 - Overføring av gen i HeLa-celler.
Dette eksempel viser at preparatene ifølge oppfinnelsen kan benyttes for overføring av gener til forskjellige celletyper og særlig til uterin karsinomceller HeLa.
Protokoll: HeLa-cellene fordeles 24 timer før transfeksjon med 50 000 celler pr. brønn på 16 mm. De transfekteres deretter med plasmid pCMV-Luc, kompleksdannet enten med PEI eller med lipopolyaminet (DOGS). Det ble studert 4 molare ekvivalentforhold mellom amin av PEI50K eller PEI800K og DNA-fosfat: 6, 9, 18 og 21. Lipopolyaminer benyttes i en mengde av 8 molare aminekvivalenter pr. fosfat (12 nanomol DOGS).
De oppnådde resultater er vist i figur 8. De viser klart at preparatene ifølge oppfinnelsen omfattende en kationisk polymer, eventuelt i forbindelse med hjelpestoff, tillater å transfektere HeLa-cellene på meget mer effektiv måte enn de tidligere systemer (særlig lipopolyamin, DOGS).
EKSEMPEL 11 - Overføring av gener i forskjellige celletyper.
Dette eksempel viser videre at preparatene ifølge oppfinnelsen kan benyttes for over-føring av gener i meget forskjellige celletyper som fibroblaster, uterin karsinomer, hepatocytomer eller nyreceller. Mer spesielt beskriver eksemplet transfeksjon av cellene HepG2, K 562 og primærceller av kanin-glattmuskel med PEI ved 9 ladningsekviva-lenter og ved pH 6.
HepG 2-cellene fordeles i 24 brønner 24 timer før transfeksjon (50 000 celler pr. brønn). De transfekteres med plasmidet pCMV-Luc i henhold til den protokoll som er beskrevet i eksempel 2. Etter 4 timers transfeksjon tilsettes 100 ul SVF-serum pr. brønn.
Ekspresjonen stanses 24 timer senere.
K 562-cellene fordeles i 24 brønner i 0,5 ml RPMI-medium uten serum 1 time før transfeksjon. De transfekteres med plasmidet pCMV-Luc i henhold til følgende protokoll: Den ønskede plasmidmengde og PEI fortynnes separat i 50 ul 150 mM NaCl og blandes. Etter 10 minutter forenes og homogeniseres de to oppløsninger. Etter ytterligere 10 minutter tilsettes 400 ul RPMI. Den således oppnådde oppløsning homogeniseres og etter 10 minutter fordeles den på cellene. Etter 4 timers transfeksjon tilsettes 100 ul SVF-serum pr. brønn. Ekspresjonen stanses 30 timer senere.
Primærkulturene av kanin-glattmuskler prepareres som beskrevet av Fallier-Becker. Cellene transfekteres deretter enten med 1 ug eller med 2 ug av plasmidet pCMV-Luc, kompleksdannet med PEI (i henhold til den protokoll som er beskrevet i eksempel 7). Ekspresjonen av luciferase stanses 24 eller 48 timer etter transfeksjonen.
De oppnådde resultater er vist i figur 9. De viser klart at preparatene ifølge oppfinnelsen tillater effektiv transfeksjon i meget varierte og forskjellige celletyper.
EKSEMPEL 12 - Overføring av plasmidisk DNA i en primærkultur av embryonære neuroner: påvisning av en biologisk aktivitet.
Primærkulturen av neuroner prepareres som beskrevet i Lezoualc'h et al. Etter 36 timer blir kulturene transfektert med 2 jig av plasmidet TRE-Luc (som bærer genet Lue under kontroll av et element for respons på thyroidhormonet T3) og 0,5 ug DNA-bærer pr. brønn.
To forsøksbetingelser studeres:
- 9 ekvivalenter aminer i forhold til fosfater: 1 ug plasmid innføres i 2,28 ul av en vandig oppløsning av 100 mM PEI800K, pH 7; - 13 ekvivalenter aminer i forhold til fosfater: 1 ug plasmid innføres i 3,33 ul av en vandig oppløsning av 100 mM PEI800K, pH 7.
Før kompleksdannelse fortynnes plasmidet i 50 ul 150 mM NaCl og PEI fortynnes også i en andre aliquot på 50 ul 150 mM NaCl. Oppløsningene blandes deretter og bringes på cellene i løpet av 1 time. Transfeksjonsmediet fjernes deretter og erstattes med et frisk kulturmedium, med eller uten T3 (1 nM). Etter 24 timer blir cellene lysert, lyserings-oppløsningen sentrifugert og supernatanten benyttet for bestemmelse av luciferase-
aktiviteten.
De oppnådde resultater er vist i figur 10. De viser klart at preparatene ifølge oppfinnelsen tillater å overføre DNA i neuronale celler og at det således overførte DNA er funksjonelt da aktiviteten forsterkes i nærvær av T3.1 kontrollforsøk som er gjennom-ført i nærvær av kun plasmid, detekteres det overhodet ingen luciferase-aktivitet.
EKSEMPEL 13 - Overføring av anti-retningsoligonukleotider i en primærkultur av embryonære neuroner.
Forsøkene gjennomføres på primærkulturer av neuroner fremstilt som beskrevet i eksempel 12. Etter 36 timer blir kulturene transfektert med 2 uM anti-retnings-18mer oligonukleotid (ODN), kompleksdannet med 9 ekvivalenter aminer i forhold til fosfater av PEI800K.
Det benyttede ODN rettes mot en region av genet som koder for a-reseptoren av thyroidhormoner. Sekvensen er som følger:
For 4 brønner på 250 ul kulturmedium benyttes følgende produkter:
8 fil av en 0,25 mM ODN-oppløsning fortynnet i 10 ul 150 mM NaCl, og
20,8 ul av en vandig 12 mM PEI800K-oppløsning, pH lik 7, på forhånd fortynnet i en andre aliquot på 51,2 ul 150 mM NaCl.
Oppløsningene blandes deretter og 20 ul av blandingen bringes på cellene i 45 minutter. Transfeksjonsmediet fjernes deretter og erstattes med friskt kulturmedium. Cellene fikseres deretter i en oppløsning av 4% paraformaldehyd, skylles, monteres i Mowiol og undersøkes på fluorescens under mikroskop.
De oppnådde resultater er vist i figur 11. De viser klart at preparatene ifølge oppfinnelsen tillater overføring av anti-retningsoligonukleotider i neuronale celler. Kontroll-forsøk viser at ved nærvær kun av oligonukleotidet detekteres overhodet ingen fluorescens.
EKSEMPEL 14 - Anvendelse av preparatene ifølge oppfinnelsen for overføring av nukleinsyrer in vivo, i hjernen av nyfødte mus.
Dette eksempel beskriver overføring av plasmidet pCMV-Luc in vivo i hjernen til nyfødte mus. Det viser de spesielt fordelaktige egenskaper ved preparatene ifølge oppfinnelsen, særlig for genterapeutiske anvendelser. 30 ug av plasmidet pCMV-Luc (7,5 ul i en forrådsoppløsning på 4 ug/ul) fortynnes i 22,5 ul 5 %-ig steril glukose (sluttkonsentrasjonen 1 ug/ul). Til slutt tilsettes 8,5 ul PEI800K 100 mM (fremstilt i vann og bufret til pH 6,9). Det således oppnådde preparat inneholder således 9 ekvivalenter aminer i forhold til fosfater.
Blandingen omrøres hurtig og benyttes for intracerebrale injeksjoner i nyfødte mus. For dette formål anestetiseres musene ved kulde (anbringes på en aluminiumfolie i kontakt med is), hvoretter 2 ul av blandingen (2 ug nukleinsyre) injiseres pr. mus. Injeksjonene gjennomføres i cortex ved hjelp av en mikromanipulator og en mikrosprøyte forbundet med en mikroelektrode.
Hjernen fjernes 48 timer senere, homogeniseres, sentrifugeres, hvoretter supernatanten benyttes for bestemmelse av luciferasen. For dette formål inkuberes supernatanten i nærvær av en buffer omfattende luciferin, koenzym A og ATP, og det avgitte lys (generelt i løpet av 10 sekunder) måles med et luminometer (Wood K. (1990) "Promega Notes", 28).
De oppnådde resultater er vist i figur 12. De viser klart at preparatene tillater effektivt å overføre plasmidet til musehjernen, mens overhodet ingen signifikant luciferase-aktivitet observeres hvis overføringen gjennomføres kun med plasmidet.

Claims (28)

1. Preparat, karakterisert ved at det innbefatter minst en oppløsning av en nukleinsyre og en oppløsning av en kationisk polymer i en homogenisert blanding, hvor den kationiske polymeren har følgende formel: der - R er hydrogen eller en gruppe med følgende formel: der n er et helt tall mellom 2 og 10; p og q er hele tall; hvor summen av p+q er slik at polymerens gjennomsnittlige molekylvekt er mellom 100 og IO<7> Da; og hvor forholdet for polymeramin til nukleinsyrefosfat er mellom 5 og 30.
2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at ni formel (I) er fra 2 til 5.
3. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at polymeren har en midlere molekylvekt mellom 10 og 5*10 .
4. Preparat ifølge kravene 1 til 3, karakterisert ved at polymeren er valgt blant polyetylenimin (PEI) og polypropylenimin (PPI).
5. Preparat ifølge krav 4, karakterisert ved at polymeren er valgt blant polyetyleniminer med midlere molekylvekt 50 000 (PEI50K) og polyetyleniminer med midlere molekylvekt 800 000 (PEI800K).
6. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at de respektive andeler av polymer og nukleinsyre velges slik at forholdet R mellom aminer i polymer og fosfater i nukleinsyrer ligger mellom 5 og 15.
7. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det i tillegg inneholder et eller flere hjelpestoffer i stand til assosiasjon til kompleks polymerrnukleinsyre og å forbedre transfeksjons-evnen.
8. Preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at hjelpestoffet er valgt blant lipider, proteiner, lipopolyaminer og syntetiske polymerer.
9. Preparat ifølge krav 8, karakterisert ved at hjelpestoffet er et kationisk lipid.
10. Preparat ifølge krav 9, karakterisert ved at det kationiske lipid er et eller flere lipopolyaminer.
11. Preparat ifølge krav 10, karakterisert ved at lipopolyaminet tilsvarer den generelle formel H2N—(-(CH)m-NH-)i-H der m er et helt tall mellom 2 og 6, og 1 er et tall mellom 1 og 5, idet m kan variere mellom de forskjellige karbongrupper mellom to aminer.
12. Preparat ifølge krav 11, karakterisert ved at lipopolyaminet er valgt blant dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS) eller palmitoylfosfaitdyletanolamin-5-karboksyspermylamid (DPPES).
13. Preparat ifølge krav 8, karakterisert ved at hjelpestoffet er et eller flere nøytrale lipider.
14. Preparat ifølge krav 13, karakterisert ved at det eller de nøytrale lipider er valgt blant syntetiske eller naturlige lipider, zwitterioniske lipider eller slike som er berøvet den ioniske ladning under fysiologiske betingelser.
15. Preparat ifølge krav 14, karakterisert ved at det eller de nøytrale lipider er lipider med 2 fettkjeder.
16. Preparat ifølge krav 14, karakterisert ved at det eller de nøytrale lipider er valgt blant dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), oleoyl-palmitoylfosfatidyletanolamin (POPE), di-stearoyl-, -palmitoyl-, —mirystoylfosfa-tidyletanolamin samt deres 1 til 3 ganger N—metylerte derivater; fosfatidylglycerolene, diacylglycerolene, glykosyldiacylglycerolene, cerebrosidene (som særlig galaktocerebrosidene), sfingolipidene (som særlig sfingomyelinene) eller også asialogangliosidene (som særlig asialoGMl og —GM2).
17. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at nukleinsyren er en desoksyribonukleinsyre. i
18. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at nukleinsyren er en ribonukleinsyre.
19. Preparat ifølge krav 17 eller 18, karakterisert ved at nukleinsyren er kjemisk modifisert.
20. Preparat ifølge krav 17 til 19, karakterisert ved at nukleinsyren er en anti-retnings.
21. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 17 til 20, karakterisert ved at nukleinsyren omfatter et terapeutisk gen.
22. Preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter 0,1 til 20 molare ekvivalenter hjelpestoff pr. 1 molar ekvivalent fosfater av nukleinsyre, fortrinnsvis 1 til 5 ekvivalenter.
23. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter et innsiktingselement.
24. Preparat ifølge krav 23, karakterisert ved at innsiktingselementet består av et sukker og/eller et peptid som et antistoff eller et fragment av et antistoff, en ligand til cellulær reseptor eller fragment derav eller en reseptor eller et fragment av reseptor.
25. Preparat ifølge krav 23 eller 24, karakterisert ved at innsiktingselementet kovalent er bundet til polymeren med formel (I).
26. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering.
27. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer for applikasjon på huden og/eller slimhinnene.
28. Anvendelse av en kationisk polymer som angitt i krav 1 for overføring av nukleinsyrer inn i celler.
NO19970049A 1994-07-13 1997-01-07 Preparat innbefattende en nukleinsyre og kationisk polymer samt anvendelse av polymeren. NO323110B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9408735A FR2722506B1 (fr) 1994-07-13 1994-07-13 Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
PCT/FR1995/000914 WO1996002655A1 (fr) 1994-07-13 1995-07-07 Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO970049D0 NO970049D0 (no) 1997-01-07
NO970049L NO970049L (no) 1997-01-07
NO323110B1 true NO323110B1 (no) 2007-01-02

Family

ID=9465376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19970049A NO323110B1 (no) 1994-07-13 1997-01-07 Preparat innbefattende en nukleinsyre og kationisk polymer samt anvendelse av polymeren.

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6013240A (no)
EP (1) EP0770140B1 (no)
JP (1) JP4275728B2 (no)
KR (1) KR100424802B1 (no)
AT (1) ATE367448T1 (no)
AU (1) AU2930795A (no)
CA (1) CA2194797C (no)
DE (1) DE69535540T9 (no)
DK (1) DK0770140T3 (no)
ES (1) ES2290952T3 (no)
FI (1) FI119738B (no)
FR (1) FR2722506B1 (no)
IL (1) IL114566A (no)
MX (1) MX9700270A (no)
NO (1) NO323110B1 (no)
PT (1) PT770140E (no)
WO (1) WO1996002655A1 (no)
ZA (1) ZA955849B (no)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
ATE285477T1 (de) * 1995-06-07 2005-01-15 Inex Pharmaceutical Corp Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
FR2739292B1 (fr) * 1995-09-28 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations
GB2324534B (en) * 1996-01-06 2000-05-10 Danbiosyst Uk Composition for delivery of nucleic acid to a cell
DE19746362A1 (de) * 1996-10-23 1998-04-30 Sueddeutsche Kalkstickstoff Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Polymernanopartikel-Nucleinsäure-Konjugaten
ES2392246T3 (es) * 1996-11-12 2012-12-07 The Regents Of The University Of California Preparación de formulaciones estables de complejos de lípido-ácido nucleico para el suministro eficaz in vivo
US6884430B1 (en) * 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
US6489458B2 (en) 1997-03-11 2002-12-03 Regents Of The University Of Minnesota DNA-based transposon system for the introduction of nucleic acid into DNA of a cell
US5912225A (en) 1997-04-14 1999-06-15 Johns Hopkins Univ. School Of Medicine Biodegradable poly (phosphoester-co-desaminotyrosyl L-tyrosine ester) compounds, compositions, articles and methods for making and using the same
US6524613B1 (en) 1997-04-30 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Hepatocellular chimeraplasty
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
US6420176B1 (en) * 1997-09-15 2002-07-16 Genetic Immunity, Llc. Composition for delivering DNA into antigen presenting cells
US20020022034A1 (en) * 1997-09-15 2002-02-21 Julianna Lisziewicz Therapeutic DNA vaccination
DE19743135A1 (de) * 1997-09-30 1999-04-01 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Biologisch verträgliche niedermolekular Polyethylenimine
JP2002518349A (ja) * 1998-06-18 2002-06-25 ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ スクール オブ メディシン 核酸デリバリー用ポリマー
US6916490B1 (en) 1998-07-23 2005-07-12 UAB Research Center Controlled release of bioactive substances
WO2000025748A1 (fr) * 1998-11-02 2000-05-11 Terumo Kabushiki Kaisha Liposomes
US7160682B2 (en) * 1998-11-13 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acid transfer vector for the introduction of nucleic acid into the DNA of a cell
CN1354678A (zh) * 1999-04-02 2002-06-19 研究发展基金会 用于气溶胶传递的聚乙烯亚胺:dna制剂
US6770740B1 (en) 1999-07-13 2004-08-03 The Regents Of The University Of Michigan Crosslinked DNA condensate compositions and gene delivery methods
FR2797402B1 (fr) 1999-07-15 2004-03-12 Biomerieux Stelhys Utilisation d'un polypeptide pour detecter, prevenir ou traiter un etat pathologique associe a une maladie degenerative, neurologique ou autoimmune
DE19960206A1 (de) * 1999-12-14 2001-07-19 Frank Czubayko Komplexierung von RNS mit Polyethyleniminen zur deren Stabilisierung und zellulären Einschleusung
AU782912B2 (en) 1999-12-28 2005-09-08 Association Francaise Contre Les Myopathies Use of lithium (Li+) for the preparation of a composition for transfection of a polynucleotide into a cell and compositions useful in gene therapy
CA2395636A1 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Novartis Ag Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
FR2805271B1 (fr) * 2000-02-18 2002-04-26 Aventis Pharma Sa Procede de preparation de polyalkylenimines fonctionnalises, compositions les contenant et leurs utilisations
DE60115667T2 (de) * 2000-09-05 2006-08-24 Centelion Säureempfindliche verbindungen, deren herstellung und verwendungen
FR2813605B1 (fr) * 2000-09-05 2002-10-18 Aventis Pharma Sa Composes acidosensibles, leur preparation et utilisations
FR2814370B1 (fr) * 2000-09-22 2004-08-20 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'un complexe acide nucleique/pei pour le ciblage de cellules souches du cerveau
DE10145134A1 (de) * 2000-10-09 2002-05-16 Bayer Ag Komplexe zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen
US20040048819A1 (en) * 2000-10-09 2004-03-11 Joachim Simon Complexes for transferring nucleic acids into cells
US20020091242A1 (en) * 2000-10-11 2002-07-11 Michel Bessodes Acid-sensitive compounds, their preparation and uses
JP2004537501A (ja) * 2001-02-01 2004-12-16 ボード　オブ　リージェンツ，　ザ　ユニバーシティ　オブ　テキサス　システム 肺への遺伝子送達のための安定化ポリマーエアロゾル
US6652886B2 (en) 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
WO2002100435A1 (en) * 2001-06-11 2002-12-19 Centre Hospitalier Universitaire De Montreal Compositions and methods for enhancing nucleic acid transfer into cells
CN1599623B (zh) 2001-09-14 2011-05-11 赛托斯生物技术公司 免疫刺激物向病毒样颗粒内的包装:制备方法与用途
EP1448586A4 (en) * 2001-11-02 2006-03-01 Intradigm Corp THERAPEUTIC METHODS FOR NUCLEIC ACID DELIVERY VEHICLES
CN1308643C (zh) 2002-01-17 2007-04-04 阿尔法·拉瓦尔股份公司 包括沉入式蒸发器的壳体
US8227432B2 (en) * 2002-04-22 2012-07-24 Regents Of The University Of Minnesota Transposon system and methods of use
ES2328031T3 (es) 2002-05-24 2009-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Composiciones para distribuir acidos nucleicos a celulas.
WO2004002453A1 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Protiva Biotherapeutics Ltd. Method and apparatus for producing liposomes
US20050196382A1 (en) * 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
EP1537208A1 (en) * 2002-09-13 2005-06-08 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
ES2784011T3 (es) 2002-10-16 2020-09-21 Streck Inc Procedimiento y dispositivo para recoger y preservar las células para su análisis
US7153905B2 (en) * 2003-03-21 2006-12-26 The General Hospital Corporation Hyperbranched dendron and methods of synthesis and use thereof
EP1648519B1 (en) 2003-07-16 2014-10-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering rna
AU2004272646B2 (en) 2003-09-15 2011-11-24 Arbutus Biopharma Corporation Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
JP2007527240A (ja) * 2004-03-01 2007-09-27 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アレルギー性鼻炎および喘息のためのＲＮＡｉベースの治療
EP1730286A4 (en) * 2004-03-04 2007-09-05 Massachusetts Inst Technology ANTICANCER TREATMENT BASED ON DNA
US20060026699A1 (en) * 2004-06-04 2006-02-02 Largaespada David A Methods and compositions for identification of genomic sequences
EP1781593B1 (en) 2004-06-07 2011-12-14 Protiva Biotherapeutics Inc. Cationic lipids and methods of use
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
CA2572439A1 (en) 2004-07-02 2006-01-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Immunostimulatory sirna molecules and uses therefor
WO2007051303A1 (en) 2005-11-02 2007-05-10 Protiva Biotherapeutics, Inc. MODIFIED siRNA MOLECULES AND USES THEREOF
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
WO2009137911A1 (en) * 2008-05-15 2009-11-19 National Research Counsil Of Canada Process, vectors and engineered cell lines for enhanced large-scale transfection
US20080312174A1 (en) * 2007-06-05 2008-12-18 Nitto Denko Corporation Water soluble crosslinked polymers
WO2009036368A2 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Nitto Denko Corporation Drug carriers
EP2047858A1 (en) 2007-10-10 2009-04-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Combination products for treating cancer
DE102007056488A1 (de) 2007-11-22 2009-07-23 Biontex Laboratories Gmbh Steigerung von Transfektionseffizienzen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems
EP2212425A2 (de) 2007-11-22 2010-08-04 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von transfektionsergebnissen nicht-viraler genliefersysteme durch beeinflussung des angeborenen immunsystems
DE102008023913A1 (de) 2008-05-16 2009-11-19 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems
DE102008016275A1 (de) 2008-03-28 2009-11-19 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems
GB0724253D0 (en) 2007-12-12 2008-01-30 Fermentas Uab Transfection reagent
CA2710713C (en) 2007-12-27 2017-09-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
US7687027B2 (en) * 2008-02-27 2010-03-30 Becton, Dickinson And Company Cleaning compositions, methods and materials for reducing nucleic acid contamination
FR2928373B1 (fr) 2008-03-05 2010-12-31 Centre Nat Rech Scient Polymere derive de la polyethylenimine lineaire pour le transfert de gene.
CN102119217B (zh) 2008-04-15 2015-06-03 普洛体维生物治疗公司 用于核酸递送的新型制剂
EP2770057A1 (en) 2008-04-15 2014-08-27 Protiva Biotherapeutics Inc. Silencing of CSN5 gene expression using interfering RNA
ES2475065T3 (es) 2008-10-09 2014-07-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Aminol�pidos mejorados y métodos para la administración de ácidos nucleicos
US20100167271A1 (en) * 2008-12-30 2010-07-01 Streck, Inc. Method for screening blood using a preservative that may be in a substantially solid state form
US11634747B2 (en) * 2009-01-21 2023-04-25 Streck Llc Preservation of fetal nucleic acids in maternal plasma
DE102009006606A1 (de) 2009-01-29 2010-08-05 Philipps-Universität Marburg Nicht-virales Transfektionsmittel
EP3290530B1 (en) 2009-02-18 2020-09-02 Streck Inc. Preservation of cell-free nucleic acids
WO2010125544A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Genetic Immunity Kft. Immunogenic nanomedicine composition and preparation and uses thereof
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
IL292615B2 (en) 2009-07-01 2023-11-01 Protiva Biotherapeutics Inc Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses
US9856456B2 (en) * 2009-10-12 2018-01-02 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Delivery agent
GB0917792D0 (en) 2009-10-12 2009-11-25 Fermentas Uab Delivery agent
EP4089169A1 (en) 2009-10-12 2022-11-16 Larry J. Smith Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro
ES2571104T3 (es) * 2009-11-09 2016-05-24 Streck Inc Estabilización del ARN y extracción del ARN presente en células intactas dentro de una muestra de sangre
EP2549859B1 (en) 2010-03-24 2017-06-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale Primate model from the family Cercopithecidae infected by a HBV strain of human genotype
EP2552460A1 (en) 2010-03-29 2013-02-06 Universite De Strasbourg Polymers for delivering molecules of interest
AU2011268146A1 (en) 2010-06-17 2013-01-10 Actogenix Nv Compositions and methods for treating inflammatory conditions
CA2802463C (en) 2010-06-22 2019-02-26 Dna Therapeutics Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
WO2012151391A2 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Streck, Inc. Inactivated virus compositions and methods of preparing such compositions
WO2013040552A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Georgia Health Sciences University Methods of promoting immune tolerance
EP2780456A1 (en) 2011-11-17 2014-09-24 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Therapeutic rna switches compositions and methods of use
AU2012342355B2 (en) 2011-11-24 2017-10-12 Genethon Scalable lentiviral vector production system compatible with industrial pharmaceutical applications
US9035039B2 (en) 2011-12-22 2015-05-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing SMAD4
DK2858677T3 (da) * 2012-06-08 2020-08-31 Ethris Gmbh Pulmonær levering af messenger rna
CN103059295B (zh) * 2012-09-26 2016-01-13 上海交通大学 疏水修饰的聚乙烯亚胺及其作为蛋白质载体的用途
DK2903652T3 (da) 2012-10-05 2022-07-04 Biontech Delivery Tech Gmbh Hydroxylerede polyaminderivater som transfektionsreagenser
EP4011380A1 (en) 2012-10-08 2022-06-15 BioNTech Delivery Technologies GmbH Carboxylated polyamine derivatives as complexes with rna
DE102012111891A1 (de) * 2012-12-06 2014-06-12 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Verbesserung der Zielfindungskapazität von Stammzellen
ES2938048T3 (es) 2013-07-24 2023-04-04 Streck Llc Composiciones y procedimientos para estabilizar las células tumorales circulantes
EP3068891A1 (en) 2013-11-13 2016-09-21 Aequus Biopharma Inc. Engineered glycoproteins and uses thereof
CA2963271A1 (en) 2014-10-02 2016-04-07 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
EP3034539A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells
US11168351B2 (en) 2015-03-05 2021-11-09 Streck, Inc. Stabilization of nucleic acids in urine
SG10201909209RA (en) 2015-05-05 2019-11-28 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd Nucleic acid-cationic polymer compositions and methods of making and using the same
US20180245074A1 (en) 2015-06-04 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
WO2017019891A2 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
US20170145475A1 (en) 2015-11-20 2017-05-25 Streck, Inc. Single spin process for blood plasma separation and plasma composition including preservative
US10010627B2 (en) 2016-06-03 2018-07-03 International Business Machines Corporation Modified polycationic polymers
WO2018022991A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Streck, Inc. Suspension composition for hematology analysis control
CN110418650A (zh) 2016-11-16 2019-11-05 免疫治疗有限公司 用于治疗过敏的核酸
EP3570814B1 (en) 2017-01-19 2023-11-29 Universiteit Gent Molecular adjuvants for enhanced cytosolic delivery of active agents
US11203629B2 (en) 2017-04-22 2021-12-21 Immunomic Therapeutics, Inc. LAMP constructs
AU2018263923A1 (en) 2017-05-02 2019-10-31 Immunomic Therapeutics, Inc. LAMP (lysosomal associated membrane protein) constructs comprising cancer antigens
WO2019222281A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Immunomic Therapeutics, Inc Improved lamp constructs comprising allergens
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
CA3153850A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Teri Heiland Improved lamp constructs comprising cancer antigens
AU2020385683A1 (en) 2019-11-18 2022-06-30 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant CALR and JAK2 and their uses
US20230024133A1 (en) 2020-07-06 2023-01-26 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
US20230035403A1 (en) 2020-07-06 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Method For Determining Responsiveness To Prostate Cancer Treatment
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
CN112237633B (zh) * 2020-10-22 2023-06-27 林君玉 一种pei/on复合物及其制备方法和用途
CA3200234A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Daryl C. Drummond Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
GB202108176D0 (en) 2021-06-08 2021-07-21 Touchlight Ip Ltd Vector
EP4352238A1 (en) 2021-06-08 2024-04-17 Touchlight IP Limited Lentiviral vector
WO2023201201A1 (en) 2022-04-10 2023-10-19 Immunomic Therapeutics, Inc. Bicistronic lamp constructs comprising immune response enhancing genes and methods of use thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5286634A (en) * 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5283185A (en) * 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
WO1993020090A1 (en) * 1992-04-06 1993-10-14 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Paired-ion oligonucleotides and methods for preparing same
US6172208B1 (en) * 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids

Also Published As

Publication number Publication date
CA2194797C (fr) 2010-03-23
FR2722506A1 (fr) 1996-01-19
JPH10502918A (ja) 1998-03-17
ES2290952T3 (es) 2008-02-16
DE69535540T2 (de) 2008-06-19
IL114566A0 (en) 1995-11-27
EP0770140A1 (fr) 1997-05-02
AU2930795A (en) 1996-02-16
DE69535540T9 (de) 2012-03-15
MX9700270A (es) 1997-05-31
ATE367448T1 (de) 2007-08-15
ZA955849B (en) 1996-02-21
FR2722506B1 (fr) 1996-08-14
DE69535540D1 (de) 2007-08-30
WO1996002655A1 (fr) 1996-02-01
FI119738B (fi) 2009-02-27
FI970115A (fi) 1997-01-10
IL114566A (en) 2005-08-31
NO970049D0 (no) 1997-01-07
CA2194797A1 (fr) 1996-02-01
KR970704889A (ko) 1997-09-06
EP0770140B1 (fr) 2007-07-18
JP4275728B2 (ja) 2009-06-10
DK0770140T3 (da) 2007-11-19
FI970115A0 (fi) 1997-01-10
US6013240A (en) 2000-01-11
KR100424802B1 (ko) 2004-06-23
NO970049L (no) 1997-01-07
PT770140E (pt) 2007-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO323110B1 (no) Preparat innbefattende en nukleinsyre og kationisk polymer samt anvendelse av polymeren.
US6172048B1 (en) Composition containing nucleic acids, preparation and uses
US8211468B2 (en) Endosomolytic polymers
US8217015B2 (en) Endosomolytic polymers
US6200956B1 (en) Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof
US20010044412A1 (en) Compositions and methods for drug delivery using amphiphile binding molecules
US8658150B2 (en) Polymer derived from linear polyethylenimine for gene transfer
AU740392B2 (en) Cationic polymers, complexes associating said cationic polymers with therapeutically active substances comprising at least a negative charge, in particular nucleic acids, and their use in gene therapy
AU720697B2 (en) Pharmaceutical composition which is useful for the transfection of nucleic acids, and uses thereof
MXPA01012802A (es) Copolimeros para el transporte de acidos nucleicos a las celulas.
AU737314B2 (en) Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same
RU2537262C2 (ru) Молекулярные конъюгаты с поликатионным участком и лигандом для доставки в клетку и ядро клетки днк и рнк
WO2001008710A1 (en) Gene expression with covalently modified polynucleotides
MXPA97006016A (en) Composition containing nucleic acids, preparation and use
Kabiru DNA condensation and packaging for potential application in gene therapy
Ning A bioresponsive peptide as a single component gene vector
LEI Intrathecal delivery of transgene to promote nerve regeneration
MXPA98001920A (en) Pharmaceutical composition useful for the transfection of nucleic acids and its u

Legal Events

Date Code Title Description
CREP Change of representative

Representative=s name: EHRNER & DELMAR PATENTBYRA AB, BOX

CREP Change of representative

Representative=s name: ZACCO NORWAY AS, POSTBOKS 2003 VIKA

MK1K Patent expired